UNIVERSIDAD NACIONAL DE UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLLOTRUJILLLO

E.A.P.:E.A.P.:CIENCIAS BIOLOGICASCIENCIAS BIOLOGICAS

CULTIVO DE CALLOS, CÉLULAS Y CULTIVO DE CALLOS, CÉLULAS Y OBTENCIÓN DE METABOLITOS OBTENCIÓN DE METABOLITOS

SECUNDARIOSSECUNDARIOS

Dr. Eloy López MedinaDr. Eloy López Medina

segundoeloy@yahoo.essegundoeloy@yahoo.es

20072007

CALLOSCALLOS DefiniciónDefinición.. Crecimiento desordenado de células a Crecimiento desordenado de células a partir de un tejido aislado de la planta en un medio de partir de un tejido aislado de la planta en un medio de cultivo en presencia de determinados reguladores de cultivo en presencia de determinados reguladores de crecimiento (2,4-D).crecimiento (2,4-D). Masas de células desdiferenciadas que crecen Masas de células desdiferenciadas que crecen desorganizadamente lo cual probablemente genera desorganizadamente lo cual probablemente genera considerable variación.considerable variación.ClasesClases::CompactoCompacto. Caracterizado por su apariencia . Caracterizado por su apariencia maciza.maciza.FriableFriable. Las células que lo forman se encuentran . Las células que lo forman se encuentran relacionadas entre si de manera laxa, fácilmente relacionadas entre si de manera laxa, fácilmente desmoronable.desmoronable.

ESTABLECIMIENTOESTABLECIMIENTO

Factores que influyenFactores que influyen:: Material inicial :Especie, estado Material inicial :Especie, estado

sanitario, edad , parte de la planta.sanitario, edad , parte de la planta. Tamaño de explante.Tamaño de explante. Esterilización.Esterilización. Fenolización.Fenolización. Medio de Cultivo.Medio de Cultivo. Tipo y concentración de hormona.Tipo y concentración de hormona. Temperatura.Temperatura. Luz.Luz.

EXPLANTES POSIBLESEXPLANTES POSIBLES

MeristemosMeristemos Hojas primordialesHojas primordiales Yemas lateralesYemas laterales FloresFlores Tejidos de inflorescenciasTejidos de inflorescencias AnterasAnteras RaícesRaíces Células Células Embrioides.Embrioides.

CULTIVO DE CELULASCULTIVO DE CELULAS

SUSPENSIONES CELULARESSUSPENSIONES CELULARES::

“ “Técnica del cultivo de tejidos de mas Técnica del cultivo de tejidos de mas intensa aplicación en los últimos años, intensa aplicación en los últimos años, para propagar y mantener células para propagar y mantener células vegetales, están conformadas por células vegetales, están conformadas por células libres o agregados celulares, iniciadas a libres o agregados celulares, iniciadas a partir de fragmentos de callos, en cultivos partir de fragmentos de callos, en cultivos líquidos permanentemente agitados líquidos permanentemente agitados durante la incubación”.durante la incubación”.

CARACTERISTICASCARACTERISTICAS

Pared celular de naturaleza celulósica.Pared celular de naturaleza celulósica. Diámetro de 20-150 um y longitud de 100-Diámetro de 20-150 um y longitud de 100-

200 um.200 um. 10-100x tan grande como bacterias y 10-100x tan grande como bacterias y

hongos.hongos. Gran densidad y estructura no uniforme.Gran densidad y estructura no uniforme. Sensibilidad diferencial.Sensibilidad diferencial.

MEDIO DE CULTIVOMEDIO DE CULTIVO

IniciaciónIniciación La cantidad mínima de callo friable que se La cantidad mínima de callo friable que se

necesita para iniciar una suspensión celular necesita para iniciar una suspensión celular es por lo general de 2 a 3 g/100 ml.es por lo general de 2 a 3 g/100 ml.

Iniciar con 1/5 del volumen, 8’-150 rpm., Iniciar con 1/5 del volumen, 8’-150 rpm., irradiancia continua y 25irradiancia continua y 25oo C de temperatura. C de temperatura.

Subcultivos cada semana, diluciones desde Subcultivos cada semana, diluciones desde 1/1…1/5, volumen final l/3 del total.1/1…1/5, volumen final l/3 del total.

SISTEMAS DE CULTIVOSISTEMAS DE CULTIVO

Según Szabados et al.Según Szabados et al.Cultivos CerradosCultivos Cerrados. Las células producidas . Las células producidas permanecen en el medio hasta la fase permanecen en el medio hasta la fase estacionaria.estacionaria.Cultivos Continuos CerradosCultivos Continuos Cerrados. Alimentado . Alimentado con cultivo fresco y retirado el cultivo usado, con cultivo fresco y retirado el cultivo usado, sin células.sin células.Cultivos continuos ACultivos continuos Abiertosbiertos. Se . Se diferencia del anterior, por que en este sistema diferencia del anterior, por que en este sistema también se retiran células.también se retiran células.

Según Endress(1994). Según Endress(1994). Proceso Discontinuo, “Batch Process” o Proceso Discontinuo, “Batch Process” o

“Batch Culture“Batch Culture”.”. No se agrega medio nuevo No se agrega medio nuevo ni se remueve masa celular. ni se remueve masa celular.

Sistemas CerradosSistemas Cerrados. La composición del . La composición del medio de cultivo cambia continuamente, mas medio de cultivo cambia continuamente, mas no las suspensiones celulares. no las suspensiones celulares.

Sistemas AbiertosSistemas Abiertos. Ambos componentes son . Ambos componentes son cambiados, tenemos:cambiados, tenemos:

Sistemas abiertos Semi-continuoSistemas abiertos Semi-continuo

El material celular es removido y el medio de El material celular es removido y el medio de cultivo usado reemplazado a intervalos cultivo usado reemplazado a intervalos regulares. Mantener cultivo en fase regulares. Mantener cultivo en fase exponencial.exponencial.

Sistemas Abiertos ContinuosSistemas Abiertos Continuos

Medio de cultivo fresco es incorporado, en Medio de cultivo fresco es incorporado, en tanto que cantidades equivalentes de medio tanto que cantidades equivalentes de medio de cultivo usado es retirado con parte de de cultivo usado es retirado con parte de células. células.

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTOMEDICIÓN DEL CRECIMIENTO

Peso Fresco.Peso Fresco. Peso Seco.Peso Seco. Volumen Celular.Volumen Celular. Número de células.Número de células. Índice mitótico. IM = Células en Índice mitótico. IM = Células en

mitosis/total de células x 100.mitosis/total de células x 100. pH. Mayores niveles de pH en la fase pH. Mayores niveles de pH en la fase

estacionaria.estacionaria.

DESARROLLODESARROLLO

Fases:Fases: Retraso, incubación, reposo o LagRetraso, incubación, reposo o Lag..

Entre la iniciación y máxima tasa de Entre la iniciación y máxima tasa de división.división.

Aceleración, exponencial o logarítmicaAceleración, exponencial o logarítmica..

Máxima tasa de división celular y la máxima Máxima tasa de división celular y la máxima concentración celular. Peso seco K.concentración celular. Peso seco K.

Fase Lineal o Linear.Fase Lineal o Linear.

Entre la tasa máxima de crecimiento y la Entre la tasa máxima de crecimiento y la completamente reducida capacidad de completamente reducida capacidad de síntesis de proteínas.síntesis de proteínas.

Fase EstacionariaFase Estacionaria..

Número de células permanece constante, Número de células permanece constante, mostrándose altamente vacuoladas, frágiles mostrándose altamente vacuoladas, frágiles y con estructuras orgánicas diferenciadas.y con estructuras orgánicas diferenciadas.

SINCRONIZACIÓNSINCRONIZACIÓN

Cuando la mayoría de sus células se Cuando la mayoría de sus células se encuentran en una determinada fase del ciclo encuentran en una determinada fase del ciclo celular. Se alcanza a través de:celular. Se alcanza a través de:Incorporación de Productos qIncorporación de Productos químicosuímicos. . Para bloquear síntesis de ADN y detener ciclo Para bloquear síntesis de ADN y detener ciclo celular. 5AU (5-aminouracilo), Colchicina.celular. 5AU (5-aminouracilo), Colchicina.Supresión de NutrientesSupresión de Nutrientes. Propiciar que . Propiciar que célula se detenga en fase Gcélula se detenga en fase G11, al agregar el , al agregar el nutriente, se alcanza la sincronización. nutriente, se alcanza la sincronización. Nitratos, Fosfatos, hormonas, etc.Nitratos, Fosfatos, hormonas, etc.

APLICACIONESAPLICACIONES

Estudios sobre el Ciclo CelularEstudios sobre el Ciclo Celular.. Determinar diferentes índices en una Determinar diferentes índices en una población de células. Timidina radiactiva, población de células. Timidina radiactiva, cafeína, hormonas vegetales. etc.cafeína, hormonas vegetales. etc.

Estudios Fisiológicos y BioquímicosEstudios Fisiológicos y Bioquímicos. . Determinación de los niveles de absorción Determinación de los niveles de absorción de nutrientes, al utilizar medios de cultivo de nutrientes, al utilizar medios de cultivo sintéticos completamente definidos.sintéticos completamente definidos.

SELECCIÓN SELECCIÓN in vitroin vitro

Procedimiento en el cual células y tejidos Procedimiento en el cual células y tejidos cultivados cultivados in vitroin vitro, son sometidos a una , son sometidos a una determinada presión de selección con la determinada presión de selección con la finalidad de seleccionar líneas celulares finalidad de seleccionar líneas celulares que exhiban tolerancia o resistencia al que exhiban tolerancia o resistencia al factor de presión ejercido.factor de presión ejercido.

Puede aplicarse a poblaciones Puede aplicarse a poblaciones inicialmente homogéneas, híbridos inicialmente homogéneas, híbridos somáticos, o células transformadas. somáticos, o células transformadas.

SISTEMAS DE CULTIVOSSISTEMAS DE CULTIVOS

Selección por ResistenciaSelección por Resistencia: Células cultivadas : Células cultivadas bajo presión del factor: Enfermedades, bajo presión del factor: Enfermedades, herbicidas, stress, etc.herbicidas, stress, etc.

Selección VisualSelección Visual. Si puede ser visualmente . Si puede ser visualmente identificadas; antocianinas clorofilas.identificadas; antocianinas clorofilas.

Selección ContrariaSelección Contraria. Ciertas drogas matan . Ciertas drogas matan solamente a células en división. Mutantes solamente a células en división. Mutantes autotróficos o mutantes letal condicionales. autotróficos o mutantes letal condicionales.

SELECCIÓN SELECCIÓN in vitro in vitro DE DE GENOTIPOS SUPERIORESGENOTIPOS SUPERIORES

Tolerancia a Metales Pesados: Al, Mn, Cu, Tolerancia a Metales Pesados: Al, Mn, Cu, Zn.Zn.

Tolerancia a Herbicidas: Picloram, Paraquat, Tolerancia a Herbicidas: Picloram, Paraquat, Triazinas, etc.Triazinas, etc.

Tolerancia a Salinidad. Tolerancia a Salinidad. Tolerancia a Sequía.Tolerancia a Sequía. Tolerancia a Temperaturas Extremas. Tolerancia a Temperaturas Extremas.

METABOLITOS SECUNDARIOSMETABOLITOS SECUNDARIOS

Productos del metabolismo especial, Productos del metabolismo especial, biosintetizados a partir de metabolitos biosintetizados a partir de metabolitos primarios, tienen una distribución restringida primarios, tienen una distribución restringida a ciertas plantas y microorganismos e a ciertas plantas y microorganismos e incluso a una familia, género, especie o incluso a una familia, género, especie o variedad.variedad.

Tenemos: alcaloides, lignanos, terpenoides, Tenemos: alcaloides, lignanos, terpenoides, flavonoides, etc. flavonoides, etc.

Funciones:Funciones: Protección: carotenos a la clorofila; Protección: carotenos a la clorofila; Alcaloides hojas de café; Alcaloides hojas de café; Atracción: polinizadores y simbiontes, etc. Atracción: polinizadores y simbiontes, etc. Acumulación. Está en función de la Acumulación. Está en función de la

capacidad que exhiba la célula de capacidad que exhiba la célula de sintetizarlos, almacenarlos y sintetizarlos, almacenarlos y metabolizarlos.metabolizarlos.

CONDICIONES DE PRODUCCIONCONDICIONES DE PRODUCCION

Internas: Clase de inóculo y pre-cultivo. Selección de líneas celulares. Medio Basal: Reducción de fosfatos,

incremento de ciertos metabolitos, nitrógeno acelera producción de metabolitos, cobre esencial como cofactor.

Fuentes de Carbono. Hormonas Vegetales. Intermediarios y Precursores..

Externas:Externas: TemperaturaTemperatura Frecuencia de AgitaciónFrecuencia de Agitación ContenedoresContenedores Luz: Luz: Directamente, Controlando la Directamente, Controlando la

concentración del producto, Acumulación concentración del producto, Acumulación de nicotina.de nicotina.

Permeabilidad de la membrana. Permeabilidad de la membrana. Reacciones enzimáticas. Reacciones enzimáticas.

PRODUCCION A GRAN ESCALAPRODUCCION A GRAN ESCALA

Inmovilización de célulasInmovilización de células. Mediante:. Mediante: Cama Fluidiza. De movimiento lento respecto Cama Fluidiza. De movimiento lento respecto

al medio de cultivo.al medio de cultivo. Cama fijada. Permanece estacionario. Cama fijada. Permanece estacionario.

VentajaVentajass:: Crecimiento lento, por tanto, acumulación de Crecimiento lento, por tanto, acumulación de

metabolitos.metabolitos. Cambio fácil del medio de cultivo.Cambio fácil del medio de cultivo. No afecta condiciones ni viabilidad de células.No afecta condiciones ni viabilidad de células.

Permeabilización.Permeabilización. Inducción a la célula a Inducción a la célula a eliminar los metabolitos secundarios al medio eliminar los metabolitos secundarios al medio de cultivo. Mediante sulfóxido de dimetilo de cultivo. Mediante sulfóxido de dimetilo DMSO entre otros.DMSO entre otros.

Biorreactores o FermentadoresBiorreactores o Fermentadores. . Contenedores especiales utilizados para Contenedores especiales utilizados para cultivar células a gran escala. Se deberá cultivar células a gran escala. Se deberá tener en cuenta:tener en cuenta:

Tamaño de células: 10 o 100 veces mas Tamaño de células: 10 o 100 veces mas grandes que microorganismo.grandes que microorganismo.

Evitar turbulencia en el medio para no destruir Evitar turbulencia en el medio para no destruir vacuola celular.vacuola celular.

Lento crecimiento celular. Días o semanas, Lento crecimiento celular. Días o semanas, facilitando infecciones del cultivo. facilitando infecciones del cultivo.

ElicitaciónElicitación. Formación de fitoalexinas.. Formación de fitoalexinas.

Fitoalexinas.Fitoalexinas. Son metabolitos secundarios Son metabolitos secundarios de bajo peso molecular, con amplia de bajo peso molecular, con amplia actividad fungitóxica, y antimicrobiana actividad fungitóxica, y antimicrobiana formada a partir de precursores en una formada a partir de precursores en una célula hospedera inducida por factores célula hospedera inducida por factores bióticos o abióticos. Y que en bajas bióticos o abióticos. Y que en bajas concentraciones inhiben el crecimiento de concentraciones inhiben el crecimiento de bacterias y hongos en las plantas bacterias y hongos en las plantas infectadas. infectadas.

Biotransformación de Precursores.Biotransformación de Precursores. Permite la síntesis de compuestos así Permite la síntesis de compuestos así como la elucidación de las vías como la elucidación de las vías biosintéticas. biosintéticas.

Transformación de:Transformación de: Codeinona en codeína (Codeinona en codeína (Papaver Papaver

somniferum).somniferum). Cannabidiol en cannabielsoína Cannabidiol en cannabielsoína

((Cannabis sativaCannabis sativa ). ). Digitoxina en digoxina (Digitoxina en digoxina (Digitalis lanata).Digitalis lanata).