CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE …portal.facyt.uc.edu.ve/faraute/volumenes/vol2-1/ArmandoA... · 2008. 11. 6. · Aplicaciones de la Espectroscopia

CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE SUSTANCIAS HÚMICAS DE COMPOSTS: UNA REVISIÓN.

ARMADO, ARNALDO

Postgrado en Biotecnología de Microorganismos, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.

Departamento de Química, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

e-mail: [email protected]

Resumen Se presenta una revisión de las aplicaciones de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) en la caracterización de sustancias húmicas (SH) de composts. Se muestra una reseña de los principios básicos de la espectroscopía de RMN en una y dos dimensiones, y su aplicación en el estudio de sustancias húmicas. Luego se describen algunos trabajos de aplicación en la caracterización de compost y enmiendas orgánicas, realizados en las variantes de la RMN como lo son RMN de protones (1H-RMN), de carbono-13 (13C-RMN), de fósforo-31(31P-RMN) y nitrógeno-15 (15N-RMN). Por ultimo, se plantea un ejemplo detallado de un análisis comparativo entre los ácidos húmicos (AH) y ácidos fúlvicos (AF) de un compost, donde se empleó la espectroscopia de RMN de protones (1H-RMN) y de carbono-13 (13C-RMN), en una y dos dimensiones. Esta revisión pone en relieve la importancia de la RMN para la determinación de la estructura de sustancias húmicas en compost. Palabras claves: Resonancia magnética nuclear (RMN), sustancias húmicas (SH), compost. Abstract A review of nuclear magnetic resonance (MNR) spectroscopy applications at humic substances (HS) characterization is presented. A review of NMR

spectroscopy principles in one and two dimensions, and their applications into study of humic substances is showed. After, some researches about applications on compost characterization and organic emends, realized in various kind of NMR like proton (1H-NMR), carbon-13 (13C-NMR), phosphoro-31 (31P-NMR) and nitrogen-15 (15N-NMR), are described. At end, a detailed example of comparative analysis between humic acid (HA) and fulvic acid (FA) of compost are presented, where proton (1H-NMR) and carbon (13C-NMR) NMR spectroscopy, on one and two dimensions, are employed. This review put in relief the NMR importance for humic substances structure determination in compost.

Keywords: Nuclear magnetic resonance (NMR), humic substances (HS), compost. Introducción Una vez que las distintas sustancias orgánicas de Compost han sido aisladas, es necesario caracterizarlas, es decir, distinguir entre su composición y estructura. En este aspecto, la espectroscopia ha hecho un aporte importante. Las técnicas espectroscópicas pueden ayudar a determinar que grupos funcionales están presentes, hasta proporcionar modelos estructurales de las sustancias presentes en los composts. Además, pueden conllevar a definir alguno de los parámetros de madurez y estabilidad de las enmiendas orgánicas,

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pero una sola técnica no permite conocer toda la información necesaria para discernir en los procesos de la degradación de la materia orgánica (Chefetz y col, 1996). Entre las técnicas espectroscópicas usadas para determinar la estabilidad y madurez de una enmienda está la Resonancia Magnética Nuclear (RMN), en sus variantes como RMN de protones (1H-RMN), de carbono 13 (13C-RMN), de fósforo 31 (31P-RMN) y de nitrógeno 15 (15N-RMN). En los últimos años algunos investigadores han realizado trabajos donde analizan las estructuras de las sustancias húmicas tanto de suelo como de compost mediante estas técnicas espectroscópicas, en esta revisión se pretende recopilar la información más importante como una herramienta para futuras investigaciones en el área. Cabe destacar que las referencias bibliográficas relacionadas con el análisis espectroscópico de las sustancias húmicas de suelo son abundantes, no así en cuanto a Compost. Resonancia magnética nuclear: Principios En presencia de un fuerte campo magnético las energías de los núcleos de ciertos elementos se dividen en dos o más niveles cuánticos como consecuencia de las propiedades magnéticas de estas partículas. Pueden provocarse transmisiones entre los niveles de energía inducidos magnéticamente por la absorción de radiación electromagnética de frecuencia apropiada, de igual modo que transiciones electrónicas son causadas por la absorción de radiación ultravioleta o visible (Skoog y West, 1994). Dado que el objetivo de este trabajo no es plantear los fundamentos de la RMN, bastará con enumerar los conceptos de spin nuclear I y el momento angular P

asociado, su cuantización (en magnitud y en orientación respecto al campo magnético B0), su relación con el momento magnético µ (de la forma µ= γ P), que introduce la constante magnetogírica γ como característica de cada isótopo, y la frecuencia de Larmor, ν0, a la que precesionan los spins, y que lleva a la expresión

ν0= γ B0 / 2π que para el protón, 1H, cuya constante magnetogírica vale γH= 26.75 x 107 rad T-

1 s-1, operando con un campo magnético BB0= 2.35 T (23500 gauss), da una frecuencia de Larmor de 100.00 MHz, dentro del intervalo de la radiofrecuencia. Como es sabido, la irradiación de la muestra, por medio de radiación electromagnética polarizada circularmente en el plano perpendicular a B0B y cuya frecuencia sea precisamente la de Larmor, lleva a la resonancia del sistema, produciéndose transiciones entre los niveles energéticos. La detección de la absorción de esta radiofrecuencia en un espectrómetro RMN no es inmediata, ya que las cantidades de energía involucradas (hν0) son muy pequeñas, alrededor de unas pocas milicalorías por mol. Así, a causa del pequeño valor de las energías involucradas, la RMN es una técnica espectroscópica de muy baja sensibilidad. En condiciones óptimas, en un espectrómetro moderno de alto campo magnético, se requiere un mínimo de 1015 spins de una determinada especie isotópica para poder detectar señales útiles en un período de una hora. A pesar de estas limitaciones, la RMN es la técnica más ampliamente utilizada en investigaciones estructurales o dinámicas de compuestos químicos en fase condensada, tanto desde el punto de vista de los físicos como, en especial, del de los químicos, y más recientemente de los

Caracterización espectroscópica por esonancia magnética nuclear de sustancias húmicas de composts: Una revisión

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biólogos o los médicos. A diferencia de otras técnicas de investigación estructural, la RMN no se limita al caso de pequeñas moléculas de bajo peso molecular y alta simetría, sino que proporciona datos precisos y muy útiles incluso con biopolímeros de peso molecular relativamente elevado (proteínas), sin requerir la previa cristalización de la muestra (Sánchez, 2003) Esta gran utilidad de la RMN se puede describir usando las palabras de Richard R. Ernst, Premio Nóbel de Química 1991: “Los sistemas de spins nucleares presentan características singulares que los predestinan para el estudio de las moléculas: 1) Los núcleos atómicos empleados como sensores se encuentran perfectamente localizados, con diámetros de unos pocos femtometros, y pueden proporcionar información sobre la situación de su entorno inmediato, haciendo así posible una exploración muy detallada de las moléculas y de la materia. 2) La energía de interacción de los sensores con el entorno es pequeñísima, inferior a 0.2 J mol-1, equivalente a la energía térmica a 30 mK. De este modo, la observación y la medición de propiedades moleculares se pueden realizar prácticamente sin perturbaciones. No obstante, las interacciones presentan una elevada sensibilidad respecto del entorno local. 3) La información sobre la estructura de las moléculas puede obtenerse a partir de las interacciones entre pares de núcleos. Así, las interacciones magnéticas dipolo-dipolo proporcionan información sobre las distancias internucleares. Por su parte, los acoplamientos escalares J permiten la determinación de ángulos de torsión.” Este conjunto de propiedades es el que ha hecho que la RMN sea hoy una herramienta imprescindible en todos los

laboratorios de química preparativa y de bioquímica estructural o dinámica. En otro contexto, los instrumentos de imagen por RMN son también imprescindibles en los hospitales. Pero para llegar a la situación actual ha sido preciso superar las dificultades asociadas a la baja sensibilidad característica de la RMN (Sánchez, 2003). Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear en el estudio de Compost (enmiendas orgánicas) La espectroscopía de resonancia magnética nuclear en las ultimas décadas, ha proporcionado la clave para hacerse una idea de los detalles estructurales de las sustancias húmicas (Preston, 1996). Es una técnica que permite analizar los diferentes componentes de la materia orgánica de un suelo, enmienda o cualquier material orgánico. Un espectro de RMN puede proporcionar “huellas dactilares” de carbono o hidrógeno según sea el caso en diversas muestras orgánicas, los cuales permiten elucidar los compuestos orgánicos y sus mezclas (Schnitzer y col., 1993; Simpson, 2001). La espectroscopia de RMN, al igual que otras técnicas no destructivas, como la espectroscopía de Infrarrojo con transformada de Furier (IR-TF), puede ser usada para evaluar las transformaciones de la materia orgánica en compost y su madurez, porque permite estimar los cambios durante el compostaje en el contenido de alifáticos, carbohidratos, aromáticos, fragmentos fenólicos y concentración de grupos carboxílicos (Chen e Inbar, 1993). La polidispersidad y heterogeneidad estructural de las sustancias húmicas (SH) inducen efectos específicos en los parámetros claves de la RMN como el desplazamiento químico δ, constante de acoplamiento J, amplitud A, y el ancho

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del pico de resonancia a la mitad de la altura Δν1/2. La heterogeneidad de las SH causa solapamiento de los picos de resonancia en sus espectros de RMN, resultando en señales bastante anchas. Las variaciones en el tamaño del agregado, forma (conformación molecular), carga y las interacciones mutuas de las moléculas húmicas afectan los tiempos de relajación T1 y T2 de la RMN. Moléculas y agregados de gran tamaño y fuertes interacciones interagregados inducen una movilidad segmental baja entre las moléculas húmicas y conduce a un tiempo de relajación longitudinal lento (T1) y transversal rápido (Bovey y Mirau, 1996). Los efectos en la resonancia disminuyen la intensidad A y aumentan el ancho medio del pico Δν1/2, lo que provoca que sea difícil reconocerlo claramente. La relajación diferencial dentro de la matriz húmica polidispersa interfiere con el análisis cuantitativo, el cual está basado en la determinación de la posición de los picos de resonancia y su intensidad, tanto en RMN de una dimensión como de dos dimensiones. La extensa duración de los experimentos de RMN en dos dimensiones, hace a esta técnica más susceptible de los efectos de variación de los tiempos de relajación (T1 y T2). Debido al extensivo solapamiento de las señales y el rápido tiempo de relajación, la constante de acoplamiento no es comúnmente usada para el análisis de sustancias húmicas en RMN unidimensional. En su lugar, usualmente se realiza el cálculo de integrales parciales de acuerdo a regiones ordinarias de las subestructuras húmicas (Bortiatynsky y col., 1996; Preston, 1996). La espectroscopía de RMN en dos dimensiones ofrece muchas ventajas en el análisis de la compleja estructura de

sustancias húmicas. Un aumento en la dispersión de la señal en la frecuencia en dos dimensiones reduce en forma considerable el solapamiento de picos de resonancia, especialmente en los espectros de RMN de correlación heteronuclear con alta propagación de frecuencia en la dimensión F1 (eje de frecuencia vertical en los espectros de RNM en dos dimensiones) (Croasmun y Carlson, 1996; Cavanagh y col., 1996). Adicionalmente, los experimentos de RMN bidimensional actúan como filtros que acentúan formas específicas de enlace. Así, espectros que correlacionan enlaces simples, como espectros heteronucleares de cohesión de quantum simples (en inglés “heteronuclear single quantum coherence”, HSQC) y espectros heteronucleares de correlación de quantum múltiple (en inglés “heteronuclear multiple quantum correlation”, HMQC) muestran exclusivamente pares de enlaces de átomos de carbono e hidrógeno, mientras que patrones de espectroscopía de correlación homonuclear (en inglés “homonuclear correlated spectroscopy”, COSY) exhiben solo acoplamientos protón-protón geminales (dos enlaces) y vecinales (tres enlaces). La sensibilidad de la detección de protones por espectros de RMN bidimensional en general es mucho mayor que en los espectros RMN en una dimensión de cualquier núcleo (Hertkorn y col., 2002). El cruce de picos en los espectros de RMN en dos dimensiones indica un intervalo de conectividades definido por el tipo de experimento de RMN realizado, permitiendo investigar las interacciones de enlaces, relaciones espaciales, y cambios químicos (Croasmun y Carlson, 1996; Cavanagh y col., 1996; Hertkorn y col., 2001).



Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN) en el estudio de Composts Hernández y col. (1990) estudian las estructuras de los ácidos húmicos (AH) de lodos residuales, a través de la espectroscopia de 1H-RMN, consiguiendo un mayor contenido de grupos metilénicos (-CH2-) en las cadenas alquílicas respecto a los AH del suelo, así como señales de proteínas, grupos aromáticos y carbohidratos. Zambrano (2005), evaluó los ácidos húmicos (AH) de diferentes enmiendas orgánicas (gallinazas, estiércol de vacuno, estiércol de chivo, lodo residual, cachaza y vermicompost) por medio de resonancia magnética de protones (1H-RMN) y reporta similitudes y diferencias espectrales entre los diferentes tipos de enmiendas estudiadas. Específicamente, reporta similitudes entre estiércol de vacuno y chivo, y diferencias de éstos en comparación con gallinaza. Las señales observadas en los espectros son atribuidas a diferentes grupos funcionales:

En el intervalo de 0,1 a 1,6 ppm se encuentran estructuras alifáticas de grupos metilo y metilenos (CH3-C-, -CH2-C-, -CH2-[C=C]).

Protones de grupos metilenos y metinos en carbonos alfa de anillos aromáticos, carboxílicos y grupos carbonilos, de 1,6 a 3,0 ppm.

Protones en carbono de grupos metilo, metileno o metino enlazados directamente a oxígeno o nitrógeno, incluyendo carbohidratos y protones de aminoácidos, especialmente en estiércol de vacuno y caprino, en el intervalo de 3,3 a 5,5 ppm.

Protones unidos a carbonos insaturados y protones aromáticos de 5,5 a 9,0 ppm; dentro de este

intervalo, de 6,5 a 7,5 ppm se observa también señales de protones de sustituciones aromáticas tipo fenoles.

Además, Zambrano (2005) señala que la naturaleza y origen de las enmiendas orgánicas, afectan fuertemente la composición y tipo de grupos funcionales de los ácidos húmicos. Sin embargo, a excepción de las gallinazas, y en menor proporción el lodo residual, los AH estudiados presentan un fuerte carácter aromático e instauraciones en cadenas ramificadas, alquílicas y arílicas, así mismo, reporta la presencia de grupos carbonilos y ácidos carboxílicos. Encontró además que solo el estiércol de vacuno presenta señales de posibles grupos aminos. Zambrano recomienda en su trabajo, que en futuras investigaciones se caractericen los AH de las enmiendas estudiadas por espectroscopia de resonancia magnética de carbono 13 (13C-RMN) así como por espectroscopia de masas acoplada a gases y espectroscopia de resonancia espín electrón de tal manera de elucidar posibles grupos funcionales y/o fragmentos de los ácidos húmicos con mayor exactitud. Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbono-13 (13C-RMN) en el estudio de Composts Inbar y col. (1991) evaluaron la calidad y madurez de un compost obtenido a partir de residuos sólidos de una fabrica de vinos entre los 0 y 160 días, utilizando espectroscopia de 13C-RMN. Esta técnica les permitió evaluar la materia orgánica en las diferentes etapas del proceso, consiguiendo señales asociadas a la presencia de alcoholes alifáticos, carbohidratos y polisacáridos. Por otra parte, encontraron que la incorporación de semillas aumenta la aromaticidad, los

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ácidos grasos y disminuye los grupos carboxilos (-COOH); la piel de la uva aumenta la aromaticidad y grupos -COOH y la mezcla de piel y semilla incrementa la aromaticidad, los grupos metoxi (-OCH3) provenientes de la lignina y grupos –COOH. Schnitzer y col. (1993) estudian la biomadurez de diferentes compost, haciendo uso de la 13C-RMN y pirólisis con espectroscopía de masa. Por medio de la 13C-RMN, comprobaron los resultados obtenidos por espectroscopía de masa, consiguiendo que, entre 0 y 59 días, disminuye el C alifático, incrementa el C aromático, no encontraron cambios significativos en el contenido de carbohidratos y aumentó la cantidad de aminoácidos y O alquílicos en todos los casos. Chefetz y col, (1996) caracterizaron la materia orgánica de un compost de desechos sólidos municipales y definen parámetros de madurez del producto. Con el uso de espectroscopía de 13C-RMN se consiguió un incremento de la aromaticidad hasta los 90 días, aumento de grupos -COOH y oxidrilos (-OH) fenólicos entre 0 y 132 días y lógicamente, disminución de los grupos alquílicos. Además, encontraron un aumento de O alquílicos hasta 34 días, seguida de una disminución significativa hasta los 132 días. Chefetz y col, (1998) reportan que por medio de espectroscopía de 13C-RMN, los espectros de la materia orgánica disuelta de un compost de sólidos municipales, revelan un aumento en los niveles de estructuras aromáticas con el tiempo de compostaje, y concluyen que los niveles de materia orgánica disuelta constantes observados durante el curado y las fases de maduración, representan un estado en el cual la composición química del compost cambia continuamente.

Dria y col. (2002) realizaron una serie de experimentos, con el objeto de evaluar la calidad de los espectros de 13C-RMN en estado sólido obtenidos con espectrofotómetros de alto campo, evaluando los espectros a diferentes condiciones. Los resultados obtenidos por estos autores, demostraron el poder de aplicación de las técnicas modernas de RMN en estado sólido a fuertes campos magnéticos altos. Con estas técnicas, de alta calidad, espectros semicuantitativos pueden ser producidos rápidamente, permitiendo la aplicación de esta técnica a muchas muestras ambientalmente relevantes, especialmente cuando la cantidad se limitada. Entre muchos otros trabajos que reportan la espectroscopia de 13C-RMN para la caracterización de sustancias húmicas y materia orgánica en composts, podemos citar:

Simpson y col. (2002) “Mejoramiento en espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional de sustancias húmicas”. Concluyen que las mejoras obtenidas pueden ayudar a las actuales estrategias de caracterización de sustancias húmicas en suelos, sedimentos y agua.

Chefetz y col. (2002) realizan el estudio de cómo determinar componentes de ácidos húmicos de suelos y compost por modificaciones químicas, 13C-RMN, pirólisis, y por cromatografía de gases termoquimiolítica acoplada a espectrometría de masas.

Smernik y col. (2003a) realizan la caracterización de materia orgánica de lodos residuales usando 13C-RMN en estado sólido. Sus resultados muestran que la materia orgánica del lodo



es significativamente diferente a la materia orgánica de suelos, lo que puede tener implicaciones en la aplicación de este lodo en suelos agrícolas.

Smernik y col. (2003b) estudiando diferentes lodos residuales, por dos técnicas de 13C-RMN, encuentran que la naturaleza heterogénea de la materia orgánica del lodo tiene implicaciones en la aplicación en suelos, ya que tienen diferentes velocidades de descomposición.

Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de fósforo-31 (31P-RMN) en el estudio de Composts Turner (2004) desarrolló y optimizó un procedimiento para la caracterización de P en estiércol de animales (pollos, cerdos y ganado vacuno) basado en una extracción alcalina y espectroscopía de resonancia magnética nuclear de fósforo-31 (31P-RMN) en solución. En el estudio realizado, debido a la baja concentración de iones paramagnéticos en el extracto de todos los estiércoles, fue necesario un largo tiempo de retraso (>5 s) para el análisis cuantitativo por spectroscopía de 31P-RMN en solución. Los estiércoles estudiados contenían ortofosfato inorgánico, monoésteres y diésteres de ortofosfato, y polifosfatos inorgánicos, pero los resultados fueron influenciados marcadamente por la concentración de hidróxido de sodio presente en la solución extractora, afectando tanto la resolución del espectro como la composición aparente de P en los extractos. Con los resultados obtenidos concluyen que las condiciones óptimas de extracción dependen del tipo de estiércol y los objetivos del estudio. McDowell y Stewart (2005) usaron fraccionamiento secuencial y

espectroscopia de resonancia magnética nuclear de fósforo-31 (31P-RMN) para determinar las formas de P en estiércol fresco y secado al aire (simulando condiciones de campo), de animales de pastoreo (ganado vacuno, ciervos y ovejas). Los espectros de 31P-RMN del extracto confirmaron los resultados obtenidos por el fraccionamiento secuencial, detectando una baja concentración de monoésteres (9 a 19% de fósforo total en el extracto) de los cuales el fitato es el principal componente. Los datos de 31P-RMN también mostraron que los cambios de concentración del fósforo orgánico con el secado del estiércol, puede ser debido a degradación de diésteres. Los datos indican decrecimiento en la biodisponibilidad de fósforo en los estiércoles de ganado vacuno, ciervos y ovejas con el secado y la necesidad de considerar este efecto con respecto al retorno del fósforo para la fertilidad del suelo. Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de nitrógeno-15 (15N-RMN) en el estudio de Suelos y Composts Thorn y Mikita (2000) trataron sustancias húmicas de suelo y sedimentos acuáticos con nitrito de sodio marcado con nitrógeno-15 (Na15NO2) y analizaron extractos de las sustancias húmicas por espectoscopía de 15N-RMN y 13C-RMN en fase líquida; también trataron dos compost con Na15NO2 y fueron analizados por 15N-RMN en estado sólido. Los análisis de 15N-RMN confirmaron que los sitios de sustrato para la nitrosación en ácidos húmicos son C aromáticos, C metilénicos activos y N. Los autores concluyen que la combinación potencial de reacciones de amoniaco, hidroxilamina, amino ácidos y NO2

- con sustancias húmicas, el camino

A. Armado


abiótico para la formación de trazas de N gaseoso en suelos puede ser compleja; no obstante, la aplicación de 15N-RMN en conjunto con espectrometría de masas de radio isótopos de alta resolución puede proporcionar un camino para elucidar este mecanismo con muchos detalles. Knicker y col. (2001) estudiaron un suelo contaminado con 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) al cual le adicionaron TNT marcado con 14C y 15N y fue sometido a un tratamiento ligero de remediación anaeróbico-aeróbico, subsecuentemente fue analizado por radioconteo y por espectroscopía de 15N-RMN en estado sólido. Los resultados obtenidos demostraron que el tratamiento aeróbico-anaeróbico del suelo representa una estrategia eficiente para la inmovilización de TNT reducido en suelos. Knicker y col. (2002) estudiaron la formación de compuestos orgánicos heteroatómicos de nitrógeno en residuos de una planta vascular después de un largo período de humificación, utilizando espectroscopía 15N-RMN en estado sólido. Los resultados obtenidos por estos autores, dan un primer indicio que la “peatification” (puede ser traducido como descomposición o compostaje de los residuos de la planta) es un paso importante en la formación de compuestos heteroatómicos de N. Aplicaciones de la Espectroscopia de resonancia magnética nuclear en dos dimensiones: Un ejemplo (Adaptado de Hertkorn y col., 2002) Hertkorn y col. (2002) realizaron un estudio comparativo de la estructura parcial de ácidos húmicos (AH) y ácidos fúlvicos (AF) de un compost usando espectroscopia de resonancia magnética nuclear de una y dos dimensiones. En esta investigación se señala que, los espectros de RMN unidimensional (ver Figura 1)

proporcionan contenidos semi-cuantitativos de los constituyentes húmicos con una resolución limitada en detalles estructurales; sin embargo cuando se suplementan con la información disponible de espectros de RMN bidimensional homo- y heteronucleares se dispone de una asignación de subestructuras húmicas más confiable. Este trabajo, muestra un ejemplo de análisis comparativo entre los AH y AF de un compost con el uso de la espectroscopia de RMN de protones y carbono-13 en una y dos dimensiones. Se reporta que, del análisis detallado del desplazamiento químico del protón en la región que normalmente es atribuida a carbohidratos muestra contribuciones considerables de aminoácidos, amino y desoxy azúcares, y cadenas alifáticas altamente oxidadas de longitud intermedia. Los espectros de 1H-RMN de AF y AH (ver Figura 1a) a simple vista son muy parecidos. Ambos exhiben prominentes resonancias en la región de carbohidratos, de 3,1 a 4,6 ppm (ver Tabla 1), y en general, las señales dentro de esta región, son bastante similares con una aparente menor ancho de banda en el caso de los AF. En la región (1,95 a 3,1 ppm) de alifáticos funcionalizados (protones de grupos funcionales unidos a cadenas alifáticas) son obvias las diferencias en la resonancia para cada espectro. La pronunciada señal observada en la región de aromáticos para AF (6,77 ppm) está presente también para el espectro de AH, pero fuertemente atenuada. La integración del espectro de 1H-RMN de los AF y AH para cada región específica de proporciona la cantidad de protones no intercambiables como se muestra en la Tabla 1.



(a) (b) Figura 1. Espectros (a) de resonancia magnética nuclear de protones (1H-RMN) y (b) de carbono-13 (13C-RMN) de ácidos fúlvicos (arriba) y ácidos húmicos (abajo) de un Compost. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002) Cerca de 25% de los protones no-intercambiables para AH están presentes en grupos alifáticos no sustituidos, mientras que en AF este valor es solo de 14%. En general, aromáticos menos sustituidos y carbohidratos, parecen ser los constituyentes principales de los AF, mientras que en los AH predominan los alifáticos no sustituidos. Esto es confirmado por los espectros de 13C-

RMN de AF y AH (Figura 1b). En ellos se observa que los AH muestran una alta fracción de resonancia para carbonos puramente alifáticos (δ< 50 ppm) y mayor resolución de los picos. Sin embargo al ver los resultados de la integración (ver Tabla 2) muestran un contenido relativo de carbonos aromáticos para AH de 1,15 respecto al de AF, que en el espectro de 1H-RMN esta relación es de 0,85. Esto implica que el grado de sustitución de aromáticos en AF es un cuarto menor que en los AH. De la distribución de la intensidad del espectro de 1H-RMN se puede deducir que los fenoles (y posiblemente anillos heterocíclicos de cinco átomos) en AF están en promedio menos sustituidos. Tabla 1. Distribución de hidrógenos no-intercambiables entre los diferentes grupos estructurales de ácidos fúlvicos (AF) y ácidos húmicos (AH) de un compost determinados por medio del espectro 1H-RMN unidimensional. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002)

Proporción de H en los grupos

estructurales Intervalo de

δ (1H)

Grupo Funcional Asignado AF AH

ppm % 10.0 a 6.0 6.0 a 4.7 4.6 a 3.1 3.1 a 1.95 1.95 a 0.5

Car-H acetal CHnO Cf-CHnCal-CHn

18.2 4.5

45.0 18.1 14.2

15.6 6.8

35.6 17.1 24.9

Los espectros de la espectroscopía de RMN de correlación (COSY) de los AF muestran un número mayor de picos cruzados que el de los AH (ver Figura 2). Con pocas excepciones todos los picos presentes en el COSY de AH también se ven en el de AF. La mayoría de la intensidad total de los picos cruzados se

A. Armado


observan en las regiones de desplazamiento químico indicado en la Tabla 3. La intensidad de los picos cruzados en el espectro de COSY por unidad de masa en la muestra de AF, es considerablemente mayor que para AH. En los espectros de la espectroscopía de RMN de total correlación (TOCSY) de AF y AH se observa un número mayor de picos cruzados que en sus respectivos espectros de COSY (Figura 2, Tabla 4). Además de los espectros y tablas aquí mostrados, en el trabajo de Hertkorn y col. (2002), presentan los espectros de espectroscopía heteronuclear de cohesión de quantum simples (HSQC) y realizan un análisis comparativo entre todos los espectros de RMN en dos dimensiones realizados por ellos. Tabla 2. Distribución de cantidad de carbono de los principales grupos estructurales de ácidos fúlvicos (AF) y ácidos húmicos (AH) de un compost determinados por medio del espectro 13C-RMN unidimensional. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002)

Proporción de C en grupo

estructural

Intervalo de δ (13C)

Grupo Funcional Asignado AF AH

ppm % 220-187 187-167 167-145 145-108 108-90 90-47 47-0

C=O (C=O)-X- Car-O,N Car-C,H O-CO

O(Nf)-CHnCHn

5.9 14.2 8.6 25.3 8.4 27.4 10.2

3.8 10.8 10.1 28.7 8.4 22.2 16.0

Figura 2. Espectros de resonancia magnética nuclear de correlación (COSY) (arriba) y RMN de total correlación (TOCSY) (abajo: τmix= 70 ms) de los AF (izquierda) y AH (derecha) con las secciones de desplazamiento químico indicadas en la Tabla 3 (COSY) y 4 (TOCSY). Por razones de claridad solo se muestra un conjunto de recuadros (con excepción de BT); un recuadro en los espectros de TOCSY indica que los puntos dentro de éste tienen idéntico desplazamiento químico. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002) Los autores señalan que el análisis combinado de varios espectros de RMN bidimensional, proporciona una resolución superior de los detalles estructurales cuando se compara con un análisis exhaustivo de espectros de RMN unidimensional solamente. Además, concluyen que, la muy buena resolución de los detalles estructurales por el análisis combinado de todos los espectros de RMN, muestra que el efecto del procedimiento de fraccionamiento en la composición y estructura química de materiales húmicos es muy significante.



Tabla 3. Regiones de desplazamiento químico en el espectro de RMN de espectroscopía de correlación (COSY) de los AF y AH de un compost. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002)

Región F2 F1 Asignación Constituyente

Ppm AC

BBC

CC

DC

EC

FC

4.4-3.0

3.2-1.8

4.5-3.0

5.0-4.4

5.6-4.8

8.5-6.3

1.4-1.0

3.2-1.8

4.5-3.0

4.4-1.8

4.4-3.0

8.5-6.3

-C-CH-CH-O-

-Cf-CH-CfH-C-

-CH(O)-CH(O)-

-CH(O)-CH-Cf

-O-CH(O)H-CH

-CarH-CarH-

Desoxy azúcar, éter, éster. Alifáticos intrafuncionales, β a heteroátomos. Carbohidratos sin C anomérico. Alifáticos funcionalizados unidos a un heteroátomo. Carbohidratos con C anomérico. Protones orto en anillos aromáticos

Tabla 4. Regiones de desplazamiento químico en el espectro de RMN de espectroscopía de total correlación (TOCSY) de los AF y AH de un compost. (Adaptado de Hertkorn y col., 2002)

Región F2 F1 Asignación Constituyente Ppm

AT

BBT

CT

DT

ET

FT

GT

2.3-0.5

4.4-3.0

4.5-3.2

4.5-3.0

4.4-1.0

5.6-4.8

8.5-6.3

2.3-0.5

1.4-1.0

3.0-1.4

4.5-3.0

4.8-4.0

4.4-3.0

8.5-6.3

-CHn -CHn-CHn-CHm

-O-CH-CH-C-

-N,O-CH-CH-CHf-

-CH(O)-CH-(O)

-(C=O)NH-CH-CH-Cf

-O-CH(O)-CH(O)-

-CarH-CarH-

Cadenas alifáticas Internas (m=1-3;n=1-2) Desoxy azúcares, éteres, ésteres Alifáticos funcionales con un heteroátomo. Carbohidratos sin C anomérico. Alifáti. funcionalizados unidos a heteroátomo. Carbohidratos con C anomérico. Protones orto en anillos aromáticos.

Conclusiones

Al finalizar la presente revisión, no hay dudas acerca de la importancia que tiene en la actualidad, la aplicación de las

técnicas espectroscópicas de resonancia magnética nuclear (RMN) en la elucidación de la estructura de las sustancias húmicas (SH), tanto del suelo como de compost. Por una parte, la RMN en una dimensión, con el estudio de espectros de 1H-RMN y 13C-RMN nos permite tener idea de los grupos funcionales que podrían estar presentes en las SH. Además, los espectros de 31P-RMN y 15N-RMN nos permiten estudiar la biodisponibilidad de fósforo y nitrógeno para las plantas, conocer las formas orgánicas de estos elementos presentes en las SH, y realizar estudios de las modificaciones que puedan sufrir sustancias (orgánicas o inorgánicas) que contengan estos elementos al ser incorporadas al suelo o a compost. Por otra parte, la espectroscopía de RMN en dos dimensiones, ofrece inmejorables condiciones para obtener estructuras húmicas muy confiables, debido a la variedad de espectros que pueden obtenerse, entre ellos COSY, TOCSY, HSQC y HMQC.

Agradecimientos

Dr. Jorge Paolini, Centro de Ecología, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).

Dr. Froilán Contreras y Dr. Pablo García, Postgrado en Biotecnología de Microorganismos, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.

Departamento de Química, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

CNU-OPSU, Proyecto Alma Mater, Programa para la Formación de Doctores.

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A. Armado


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A. Armado


http://www.uam.es/otros/germn/images/01Historia_RMN.pdf

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