CARACTERIZACION FISIOLÓGICA Y MOLECULAR DE LÍNEAS DE TRIGO QUE

EXPRESAN EL TRANSGEN SARK::IPT BAJO ESTRÉS HÍDRICO.

Bases ecofisiológicas y genéticas para mejorar el rendimiento y

la calidad en trigo y cebadaIV Workshop Internacional

28 -29 de Agosto 2013

EEA Balcarce-INTA

Ing. Agr. Antonio Díaz Paleo

EEA Pergamino INTA

Observaciones: Los estreses hídrico y salino aceleran la senescencia de plantas, modificando las relaciones fuente/destino.

Hipótesis: Es posible aumentar la tolerancia de las plantas al estrés abióticoretrasando la senescencia inducida por estrés, aumentando la adaptación de las fuentes y mejorando la relacionesfuente/destino.

Estrategia: Expresión de IPT que pueda mantener niveles óptimos de citoquininas durante el estrés, retrasando la senescencia inducida por estrés y fortaleciendo los destinos.

IPTPromotor inducible pormaduración y estrés

Senescencia citoquininas

mRNA

(isopentenyl transferase)

estrésT. Hajouj, R. Michelis, S. Gepstein. Cloning andcharacterization of a receptor-like protein kinase associatedwith senescence. Plant Physiol. 124: 1305 (2000)

Plantas de tabaco WT y transgénicas que expresan PSARK::IPT después de 15 días de déficit hídrico seguido de 7 días sin

déficit

Control (WT) PSARK::IPT

Rivero et al., PNAS 104, 49, 19631–19636 (2007)

Seedlin

g stage

Ear ly til

lering

Tiller in

g

Late til le

r ing

Booting

2 weeks p

ost flower i

ng

Grain fill in

g

Grains maturation

2-( ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆CT

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

aa

bb

ccdc

Vegetativo Reproductivo

Comienzo Macollaje

Macollaje

Final Macollaje

Emergencia Panoja

2 semanas post floración

Llenado de Granos

Maduración granos• 3 días de déficit hídrico

Expresión de IPT en arroz bajo promotor

SARK

Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J.

Plántula

PSARK::IPT

BS 1DS 2DS 3DS 4DS ReW

2-( ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆CT

)

0

20

40

60

80

100

120

1405T-WW

8T-WW

5T-WS

8T-WS

a ab bc

aa

aa

aa

aa

ba

a

aab b b b b b

Recup.PSPanicle

Peduncle

Flag lea

f

Second lea

f

Third lea

f

Fourth lea

fRoot

s

2-( ∆

∆∆∆ ∆∆∆

∆CT

)

0

200

400

600

800

1000

1200

14005T-WW

8T-WW

5T-WS

8T-WS

aa aa

a

aa

aa

b

b

bbbbb

ccaaa abbbb bb

Pedúnculo

Hoja Bandera

Tercera hoja

Cuarta hoja Raíz

Segunda hoja Panoja

Riego Pre Antesis Post AntesisControl Estrés Estrés

Mat

eria

Sec

a

R

endi

mie

nto

gran

o

g pl

anta

-1g

plan

ta-1

Rendimiento arroz SARK- ipt bajo estrés

Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J

Pre-antesis: reducción en la fertilidad de espiguillas y expansión de la panojaPost-antesis: reducción en tamaño/peso de granos y calidad

WT 3

B

A

WT 3

Rendimiento Maní SARK ipt

Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.

Porcentaje de vainas con 4 semillas

Porcentaje de vainas con 3 semillas

(%)

(%)

Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.

A. 2009 Ensayo en secano

38% 37%

57%70%

53%57%

B. 2010 Ensayo en secano

B. 2010 Ensayo bajo riego

Ren

dim

ient

o g/

plan

ta

Ren

dim

ient

o g/

plan

ta

Ren

dim

ient

o g/

plan

ta

Rendimiento ManíSARK ipt

Trigo – Objetivos

• Estudiar los efectos de la expresión heteróloga en trigo de la secuencia SARK::ipt sobre la senescencia y la tolerancia al estrés hídrico.

• Objetivos específicos

� Obtener plantas transgénicas de trigo expresando la secuencia SARK::ipt a

través del método balístico.

�Ensayos de desafío bajo condiciones óptimas y limitadas de riego: caracterización fisiológica y genética de las plantas transgénicas portadoras de SARK::ipt y los controles no transgénicos.

Metodología

�Se transformaron escutelos inmaduros de trigo de la variedad ProINTA Federal (PIF) con el vector pBSIPT mediante un acelerador de microproyectiles tipo Particle Inflow Gun.

�Se obtuvieron 6 eventos de transformación independientes.

Caracterización de los eventos obtenidos

Planta T0 PCR ipt PCR bar Resistencia

a PPT

1 + + +

2 + + -

3 + + +

4 + + +

5 + + -

6 + + +

Caracterización de los eventos obtenidos

a ba b

Progenies TProgenies T11 SARK::SARK::iptipt al final del ensayo al final del ensayo a) riego normal, b) con da) riego normal, b) con dééficit hficit híídricodrico

Evaluación de las progenies bajo déficit hídrico

Progenies T1 al final del período de DH derivadas de los eventos A) 1 B) 2 C) 4

A B C

� por PCR y Southern blots de las progenies de las plantas T1 obtenidas en @ (plantas T2 )y cruzamiento por PIF (retrocruzas) se identificaron plantas T1 homocigotas para los IS del transgen de interés.

Progenies TProgenies T22 SARK::SARK::iptipt

Obtención de líneas homocigotasLínea IS

TR 1 5

TR 2 2

TR 3 1

TR 4 5

TR 5 4

TR 6 1

� TR 1, TR 2, TR 3, TR 4, TR 5 , TR 6 y ProINTA Federal (PIF )

� Dos condiciones de riego

� n=8 plantas por combinación de GxR

� N=112 plantas

EVALUACIÓN BAJO DÉFICIT HÍDRICO DE LAS LÍNEAS

Deficit hídrico y estados fenológicos

40: comienzo del estrés hídrico

64: Antesis. Finalización del estrés.

120: Finalización del llenado de grano. Madurez.

135: Supresión del riego.0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Capa

cida

d de

cam

po (%

)

Días

Deficit hídrico y estados fenológicos

Comienzo de antesis

0

3

6

9

12

15

18

21

24

0

5

10

15

20

25

30

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

Horas luz

Tem

pera

tura

(°C

)

DíasTemperatura Horas luz

Efecto del déficit hídricoEn todos los genotipos hubo efectos

significativos del déficit hídrico en las siguientes variables

� chl a, chl b y carotenos

�Peso de planta

�Número de espigas

�Fecha de antesis

�Número de espiguillas por espiga

�Número de granos por espiga

�Número de granos por espiguillas en las 4 espigas principales

�Número de granos totales

�Peso de granos por espiga

�Peso de granos por planta

� Índice de cosecha

Número de granos por planta

Con Estrés

Riego normal

TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF

Genotipos

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250 Con Estrés

Riego normal

ab

aa

bcc c c

Peso de granos por planta

0

1

2

3

5

6

7

8

TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF

Genotipos

Con Estrés

Riego normal

Disminución de

51% 30%

a

bbb

ccc

Indice de cosecha Con estrés

Riego normal

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF

Genotipos

Con Estrés

Riego normal

Disminución de

45% 16%

0

3

6

9

12

15

18

21

24 Asimilación de CO2 (µmol CO2.m-2.s-1)

Periodo anterior al estrés

Con estrés

PI F

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35 Conductancia estomática (mmol H2O.m-2.s-1)

Con estrés

Riego Normal

Riego Normal

Condición:

Genotipos: TR 1

Periodo de estrés

Periodo de recuperación

Variables Fotosintéticas

CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN

TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6Genotipo y condición

Expresión relativa transcriptos ipt –Final del período de estrés

CE: con estrésRN: riego normal

Normalizado sobretranscripto TaRP15

(Stephenson et al. 2007)

CE RN CE RN CE RN CE RN

0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición

TR1: expresión relativa de transcriptos ipta través del tiempo

CE: con estrésRN: riego normal

Normalizado sobretranscripto TaRP15

CE: con estrésRN: riego normal

Normalizado sobretranscripto TaRP15

CE RN CE RN CE RN CE RN

0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición

TR4: expresión relativa de transcriptos ipt a través del tiempo

CE: con estrésRN: riego normal

Normalizado sobretranscripto TaRP15

CE RN CE RN TR1 TR4

Expresión relativa de transcriptos iptPeríodo de Recuperación

Conclusiones

La expresion de IPT bajo el control transcripcional del promotor SARK demostróaumentar la tolerancia a déficit hídrico inducido bajo condiciones controladas en trigo. El mayor rendimiento de TR1 con respecto a ProINTA FederaI se debería a una capacidad incrementada del ritmo de fotosíntesis bajo condiciones limitantes y a mayor protección de la maquinaria fotosintética que permite mejores eficiencias fotosintéticas una vez superado el estrés. Estos resultados coinciden con otros obtenidos en arroz y tabaco ya publicados.

No se pudo terminar de asociar las variaciones en la expresión cuantitativa de IPT como respuestas de adaptación a variaciones en el ciclo de estrés. Sin embargo se hallaron niveles elevados hacia el final del ciclo en respuesta muy posiblemente a senescencia. Estos “picos” de expresión subrayan la potencialidad del promotor para dirigir de forma autoregulada los aumentos de la transcripción frente a los estímulos del ambiente.

Nuevos Ensayos en Invernáculo TR1, TR4

y ProINTA Federal

Participantes

Ailin Beznec (beca CONICET) Irene Baroli (CONICET-INTA) Paula Faccio (INTA) Gabriela Soto (CONICET-INTA) Berta Llorente (UNLu)Elba Pagano (INTA) Coordinadora PPTCristina Gomez (INTA)Cecilia Decima (INTA)Dalia Lewi (INTA)Eduardo Blumwald (UC – Davis) Antonio Díaz Paleo (INTA) Coord PE233251Sara Ameijeiras (Apoyo técnico Lab)Laura Lima (Apoyo técnico Lab)

Financiamiento

PE AEGR 3425 (2006/9)PE AERG 233251 (2009/12)PN BIO 113024 (2013)

Lugar de Trabajo

Instituto de Genética “E.A. Favret”CICVyA, INTA Castelar