CARACTERIZACION FISIOLÓGICA Y MOLECULAR DE LÍNEAS DE TRIGO QUE
EXPRESAN EL TRANSGEN SARK::IPT BAJO ESTRÉS HÍDRICO.
Bases ecofisiológicas y genéticas para mejorar el rendimiento y
la calidad en trigo y cebadaIV Workshop Internacional
28 -29 de Agosto 2013
EEA Balcarce-INTA
Ing. Agr. Antonio Díaz Paleo
EEA Pergamino INTA
Observaciones: Los estreses hídrico y salino aceleran la senescencia de plantas, modificando las relaciones fuente/destino.
Hipótesis: Es posible aumentar la tolerancia de las plantas al estrés abióticoretrasando la senescencia inducida por estrés, aumentando la adaptación de las fuentes y mejorando la relacionesfuente/destino.
Estrategia: Expresión de IPT que pueda mantener niveles óptimos de citoquininas durante el estrés, retrasando la senescencia inducida por estrés y fortaleciendo los destinos.
IPTPromotor inducible pormaduración y estrés
Senescencia citoquininas
mRNA
(isopentenyl transferase)
estrésT. Hajouj, R. Michelis, S. Gepstein. Cloning andcharacterization of a receptor-like protein kinase associatedwith senescence. Plant Physiol. 124: 1305 (2000)
Plantas de tabaco WT y transgénicas que expresan PSARK::IPT después de 15 días de déficit hídrico seguido de 7 días sin
déficit
Control (WT) PSARK::IPT
Rivero et al., PNAS 104, 49, 19631–19636 (2007)
Seedlin
g stage
Ear ly til
lering
Tiller in
g
Late til le
r ing
Booting
2 weeks p
ost flower i
ng
Grain fill in
g
Grains maturation
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
aa
bb
ccdc
Vegetativo Reproductivo
Comienzo Macollaje
Macollaje
Final Macollaje
Emergencia Panoja
2 semanas post floración
Llenado de Granos
Maduración granos• 3 días de déficit hídrico
Expresión de IPT en arroz bajo promotor
SARK
Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J.
Plántula
PSARK::IPT
BS 1DS 2DS 3DS 4DS ReW
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
20
40
60
80
100
120
1405T-WW
8T-WW
5T-WS
8T-WS
a ab bc
aa
aa
aa
aa
ba
a
aab b b b b b
Recup.PSPanicle
Peduncle
Flag lea
f
Second lea
f
Third lea
f
Fourth lea
fRoot
s
2-( ∆
∆∆∆ ∆∆∆
∆CT
)
0
200
400
600
800
1000
1200
14005T-WW
8T-WW
5T-WS
8T-WS
aa aa
a
aa
aa
b
b
bbbbb
ccaaa abbbb bb
Pedúnculo
Hoja Bandera
Tercera hoja
Cuarta hoja Raíz
Segunda hoja Panoja
Riego Pre Antesis Post AntesisControl Estrés Estrés
Mat
eria
Sec
a
R
endi
mie
nto
gran
o
g pl
anta
-1g
plan
ta-1
Rendimiento arroz SARK- ipt bajo estrés
Peleg et al., (2011) Plant Biotechnol. J
Pre-antesis: reducción en la fertilidad de espiguillas y expansión de la panojaPost-antesis: reducción en tamaño/peso de granos y calidad
WT 3
B
A
WT 3
Rendimiento Maní SARK ipt
Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.
Porcentaje de vainas con 4 semillas
Porcentaje de vainas con 3 semillas
(%)
(%)
Qin et al., (2011) Plant Cell Physiol.
A. 2009 Ensayo en secano
38% 37%
57%70%
53%57%
B. 2010 Ensayo en secano
B. 2010 Ensayo bajo riego
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Ren
dim
ient
o g/
plan
ta
Rendimiento ManíSARK ipt
Trigo – Objetivos
• Estudiar los efectos de la expresión heteróloga en trigo de la secuencia SARK::ipt sobre la senescencia y la tolerancia al estrés hídrico.
• Objetivos específicos
� Obtener plantas transgénicas de trigo expresando la secuencia SARK::ipt a
través del método balístico.
�Ensayos de desafío bajo condiciones óptimas y limitadas de riego: caracterización fisiológica y genética de las plantas transgénicas portadoras de SARK::ipt y los controles no transgénicos.
Metodología
�Se transformaron escutelos inmaduros de trigo de la variedad ProINTA Federal (PIF) con el vector pBSIPT mediante un acelerador de microproyectiles tipo Particle Inflow Gun.
�Se obtuvieron 6 eventos de transformación independientes.
Caracterización de los eventos obtenidos
Planta T0 PCR ipt PCR bar Resistencia
a PPT
1 + + +
2 + + -
3 + + +
4 + + +
5 + + -
6 + + +
Caracterización de los eventos obtenidos
a ba b
Progenies TProgenies T11 SARK::SARK::iptipt al final del ensayo al final del ensayo a) riego normal, b) con da) riego normal, b) con dééficit hficit híídricodrico
Evaluación de las progenies bajo déficit hídrico
Progenies T1 al final del período de DH derivadas de los eventos A) 1 B) 2 C) 4
A B C
� por PCR y Southern blots de las progenies de las plantas T1 obtenidas en @ (plantas T2 )y cruzamiento por PIF (retrocruzas) se identificaron plantas T1 homocigotas para los IS del transgen de interés.
Progenies TProgenies T22 SARK::SARK::iptipt
Obtención de líneas homocigotasLínea IS
TR 1 5
TR 2 2
TR 3 1
TR 4 5
TR 5 4
TR 6 1
� TR 1, TR 2, TR 3, TR 4, TR 5 , TR 6 y ProINTA Federal (PIF )
� Dos condiciones de riego
� n=8 plantas por combinación de GxR
� N=112 plantas
EVALUACIÓN BAJO DÉFICIT HÍDRICO DE LAS LÍNEAS
Deficit hídrico y estados fenológicos
40: comienzo del estrés hídrico
64: Antesis. Finalización del estrés.
120: Finalización del llenado de grano. Madurez.
135: Supresión del riego.0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Capa
cida
d de
cam
po (%
)
Días
Deficit hídrico y estados fenológicos
Comienzo de antesis
0
3
6
9
12
15
18
21
24
0
5
10
15
20
25
30
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Horas luz
Tem
pera
tura
(°C
)
DíasTemperatura Horas luz
Efecto del déficit hídricoEn todos los genotipos hubo efectos
significativos del déficit hídrico en las siguientes variables
� chl a, chl b y carotenos
�Peso de planta
�Número de espigas
�Fecha de antesis
�Número de espiguillas por espiga
�Número de granos por espiga
�Número de granos por espiguillas en las 4 espigas principales
�Número de granos totales
�Peso de granos por espiga
�Peso de granos por planta
� Índice de cosecha
Número de granos por planta
Con Estrés
Riego normal
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250 Con Estrés
Riego normal
ab
aa
bcc c c
Peso de granos por planta
0
1
2
3
5
6
7
8
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
Con Estrés
Riego normal
Disminución de
51% 30%
a
bbb
ccc
Indice de cosecha Con estrés
Riego normal
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6PIF
Genotipos
Con Estrés
Riego normal
Disminución de
45% 16%
0
3
6
9
12
15
18
21
24 Asimilación de CO2 (µmol CO2.m-2.s-1)
Periodo anterior al estrés
Con estrés
PI F
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35 Conductancia estomática (mmol H2O.m-2.s-1)
Con estrés
Riego Normal
Riego Normal
Condición:
Genotipos: TR 1
Periodo de estrés
Periodo de recuperación
Variables Fotosintéticas
CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN CE RN
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6Genotipo y condición
Expresión relativa transcriptos ipt –Final del período de estrés
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
(Stephenson et al. 2007)
CE RN CE RN CE RN CE RN
0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición
TR1: expresión relativa de transcriptos ipta través del tiempo
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
CE RN CE RN CE RN CE RN
0d. e. 10d. e. 24d.e. Recup.Momento y condición
TR4: expresión relativa de transcriptos ipt a través del tiempo
CE: con estrésRN: riego normal
Normalizado sobretranscripto TaRP15
CE RN CE RN TR1 TR4
Expresión relativa de transcriptos iptPeríodo de Recuperación
Conclusiones
La expresion de IPT bajo el control transcripcional del promotor SARK demostróaumentar la tolerancia a déficit hídrico inducido bajo condiciones controladas en trigo. El mayor rendimiento de TR1 con respecto a ProINTA FederaI se debería a una capacidad incrementada del ritmo de fotosíntesis bajo condiciones limitantes y a mayor protección de la maquinaria fotosintética que permite mejores eficiencias fotosintéticas una vez superado el estrés. Estos resultados coinciden con otros obtenidos en arroz y tabaco ya publicados.
No se pudo terminar de asociar las variaciones en la expresión cuantitativa de IPT como respuestas de adaptación a variaciones en el ciclo de estrés. Sin embargo se hallaron niveles elevados hacia el final del ciclo en respuesta muy posiblemente a senescencia. Estos “picos” de expresión subrayan la potencialidad del promotor para dirigir de forma autoregulada los aumentos de la transcripción frente a los estímulos del ambiente.
Nuevos Ensayos en Invernáculo TR1, TR4
y ProINTA Federal
Participantes
Ailin Beznec (beca CONICET) Irene Baroli (CONICET-INTA) Paula Faccio (INTA) Gabriela Soto (CONICET-INTA) Berta Llorente (UNLu)Elba Pagano (INTA) Coordinadora PPTCristina Gomez (INTA)Cecilia Decima (INTA)Dalia Lewi (INTA)Eduardo Blumwald (UC – Davis) Antonio Díaz Paleo (INTA) Coord PE233251Sara Ameijeiras (Apoyo técnico Lab)Laura Lima (Apoyo técnico Lab)
Financiamiento
PE AEGR 3425 (2006/9)PE AERG 233251 (2009/12)PN BIO 113024 (2013)
Lugar de Trabajo
Instituto de Genética “E.A. Favret”CICVyA, INTA Castelar