CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MEDIANTE LA TÉCNICA DE PCR EN MUESTRAS RECOLECTADAS EN CUATRO COMUNIDADES DEL CANTÓN GENERAL VILLAMIL

“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MEDIANTE LA TÉCNICA DE PCR EN MUESTRAS RECOLECTADAS EN CUATRO COMUNIDADES DEL CANTÓN GENERAL VILLAMIL PLAYAS, PROVINCIA DEL GUAYAS”

Silvia Fernanda Jiménez Yánez

Directora: Dra. María Augusta Chávez M.Sc.Codirector: Ing. Pedro Romero

IMPORTANCIA

Triatoma dimidiata

Rhodnius ecuadoriensis

Panstrongylus geniculatus

Autor/año Lugar Especie vector Parásito encontrado

Villacis & Grijalva, col (2008-2011)

Manabí Rodnius ecuadoriensis Trypanosoma cruzi

Abad-Franch y col (2001) Manabí Panstrongylus howardi Trypanosoma cruzi

Guevara y col (1999) Guayas Triatoma dimidiata Trypanosoma cruzi

Riesgo potencial

Vectores de importancia en Ecuador

Reino Protista Sub Reino Protozoa Orden Kinetoplastida Familia Trypanosomatidae Género Trypanosoma Especie cruzi

PARÁSITO

Protozoario Hemoflagelado

Trypanosoma cruzi

Sección Stercoraria------heces del vector

MARCO TEORICO

CICLO DE VIDA

alargado con un gran núcleo centraldeficiente capacidad de reproducción

penetra e infecta al hospedero

flagelado, alargadono tiene capacidad para dividirse,Invade otras células

sangre circulante del mamífero y en las heces del insecto

división binaria longitudinal.

parte anterior del intestino del insecto medios de cultivo

Sin movimiento;gran núcleo cerca del cinetoplasto a manera de discoreplicación,

por división binaria simple

MARCO TEORICO

Trypanosoma cruziPicadura del vectorMadre al fetoMal manejo de muestrasTransfusiones y trasplantes

Picadura ------- deyecciones del vector

Chagomas o Signo de Romaña

Triatoma dimidiata

endémico Ecuador 15 especies

VECTOR

MARCO TEORICO

RESERVORIOS DEL VECTOR

rocas apiladas, cuevas de murciélagos y agujeros en los arboles ocupados por mamíferos y aves, aéreas de mucha maleza herbácea, dentro de los domicilios que presentan imperfecciones en su construcción

ambiente favorable para su reproducción y alimentación

MARCO TEORICO

EscombrosEscombros

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Métodos directos

90% - 10%

< 60% 90% - 10%

90% - 40% - 100%

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

98%

100%

96%100% - 36%

Caracterizar las cepas de Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, en muestras recolectadas en cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, en la provincia de Guayas.

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Colectar y extraer los triatominos infectados con el parásito Trypanosoma cruzi en las comunidades Barrio Lindo, El Morrón, Cruz Roja y Altamira dentro del cantón General Villamil Playas.

Extraer el ADN de Trypanosoma cruzi, mediante la técnica Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico de las muestras analizadas de triatominos recolectados.

Caracterizar molecularmente a Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, de las muestras de ADN obtenidas del análisis de los insectos triatominos recolectados, para obtener resultados más confiables y específicos.

Comparar la técnica microscópica con la técnica de PCR de las muestras analizadas.

Realizar un estudio complementario de la prevalencia del parásito Trypanosoma cruzi en el vector triatomino en las muestras recolectadas.

HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN

El parásito Trypanosoma cruzi tipo II está presente, de manera significativa y distinta, en todas las muestras de vectores Triatoma dimidiata recolectadas en las cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, provincia del Guayas.

METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS

Cantón Playas - Guayas SNEM

Recolección


Recolección y análisis del material fecal de triatominos

Clasificación Alimentación

Extracción del material fecal

FASE DE LABORATORIO

1,5 mL heces + suero fisiológico estéril3mL heces+ 10 mL LIT

Heces + suero fisiológicoMicroscopía de luz 40X




Reactivos Cantidad

NaCl 7.5g

KCl 0.4g

Triptosa 5g

Sucrosa 2g

Liver infusión 5g

Hemina 20mg

Suero Fetal Bovino 70ml

Estreptomicina (10000 ug/ml) 0.1ml

Penicilina (10000 units/mg) 0.1ml

Gentamicina (10000 ug/ml) 0.1ml

H2O Destilada 1000ml


Titulo

Condiciones de Recoleccion de triatominosTabla de tesis

PORCENTAJE DE TRIATOMINOS INFECTADOS CON Trypanosoma cruzi

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Insectos vectores positivos y = 149

Triatomas total muestreados n = 206

Prevalencia global 72.33%

Nivel de confianza NDC = 95.00%

Distribución normal z = 1.95

Error E = 6.11%

Low L = 66.22%

Up U = 78.44%

Según Autor (2004)


Barrio Lindo El Morrón Altamira Cruz Roja

67 8 9 65

112 11 9 74

59.8% 72.7% 100% 87.8%

Análisis de la prevalencia de Triatominos positivos con microscopia en cada comunidad

NDC 95.00% 95.00% 95.00% 95.00%

Z 1.95 1.95 1.95 1.95

E 143.6% 4.16% 0% 1.17%

L -83.78% -343.5% 100.0% -29.9%

U 203.4% 489.0% 100.0% 205.6%

Barrio ADN prom DE Mín Max

Barrio Lindo 124.516667 93.5805197 30.9 257.3

El Morrón 95.4833333 42.38482826 30.8 155

Atamira 150.266667 55.65072027 63.9 223.1

Cruz Roja 290.057143 299.0857729 37.6 750.4Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil


















Barrio LindoEl Morrón Altamira Cruz Roja

Barrio

-5.2

192.7

390.6

588.5

786.4

AD

N

Título




















-311.85 -118.80 74.24 267.29 460.34

Cuantiles de una Normal(-6.8212E-014,25207)

-311.85

-118.80

74.24

267.29

460.34

Cuantil

es

obse

rvados(

RD

UO

_AD

N) n= 25 r= 0.960 (RDUO_ADN)

Título

Q1 = 63.9

Q2 = 122.1

Q3 = 179.9


Barrio Identificación con primers S35 Y S36

Barrio Lindo 24% (6/25)

El Morrón 24% (6/25)

Altamira 24% (6/25)

Cruz Roja 28% (7/25)

Total 25

6 6 6

7

PCR DE MUESTRAS ANALIZADAS CON S35 Y S36


Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers S35 y S36

Reactivos Concentración final Rx N°22

dNTP Mix 1MgCl2 (25mM) 1

GoTaq 5X Buffer 3Primer 1 (2.5uM) 0,4Primer 2 (2.5uM) 0,4

GoTaq Polymerasa 0,125Agua ultra pura 8,10

ADN 2Volumen final 16

Temperatura Tiempo CiclosDesnaturalización

inicial 95°C5min 1 ciclo

Desnaturalización 95°C

1min

Alineamiento 60°C

1min 30 ciclos

Extensión 72°C

1min

Extensión final 72°C

5min 1 ciclo

4°C Hasta el análisis de los productos

del gel de agarosa


PCR

Amplificación

Muestra Barrio ng/uL

Heces Barrio Lindo 30.9






Heces El Morrón 30.8





Heces El Morrón 155

Heces Altamira 134.2




Heces Altamira 63.9


Heces Cruz Roja 750.4

Heces Cruz Roja 529






CUANTIFICACIÓN DE ADN


ng/u

L

330pb

330pb330pb


Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers TC, TC1 y TC2

Reactivos Concentración final

dNTP Mix 0,125MgCl2 (25mM) 1,25

GoTaq 5X Buffer 2,5Primer 1 (10 uM) 0,125Primer 2 (10 uM) 0,125Primer 3 (10 uM) 0,125

GoTaq Polymerasa 0,05Agua ultra pura 5,7

ADN 2,5Volumen final 12,5

Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalizació

n inicial 94°C5min 1 ciclo

Desnaturalización

94°C

30min

Alineamiento 55°C

30min 30 ciclos

Extensión 72°C

45min

Extensión final 72°C

5min 1 ciclo

4°C Hasta el análisis de los productos

del gel de agarosa


PCR

Amplificación

300pb 300pb

Trypanosoma cruzi Tipo II



ComunidadesMuestras amplificadas con

primers TC, TC1 y TC2Muestras no amplificadas

1. Barrio Lindo 6 0

2. El Morrón 4 2

3. Altamira 0 6

4. Cruz Roja 0 7

Barrios

Secuencia primers Nucleótidos (BLAST)

S35

1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttg gccccaaaag ttgaacgccc ctcccaaaac61 aagaatttcg taattttcgg aaccccttta tgtgtaattt ataccaccta tacctctacc121 ataccaccaa cacaacacta ccatcaagaa tacagaaact atagtatcat caatatcaag181 ataacacact caatgcaatc atacaatgcc ccacagaaca taacattttg tgttgtaaac241 tatatcatta gtatctactc tataaattat tattccggta cccctctcac ctctacatta301 caccaacccc aatcgaaccc ccacctcccc gaaaaattca caaaatcaat aaaataatgt361 acgggggaga tgcatgattt ttggccccaa aagttgaacg cccctcccaa aaccaacatt421 ttctgaaatt ccacatcttt ttcaaccatg ttataccata ccacaatcta ttacccacca481 tccaaccaaa caccaaatta taaaatgtaa ctgaatacat aactacaata acgttaacaa541 atctcatcca caaactcaca ccatgttctc ttacacaatg ttctcaacta catcattata601 attacagaaa atatactata tcctaaagac tcattataat atccaaaacc caccactcca661 cctcccttat attacaccaa ccccaatcga acc


S36

1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttc cgccccaaat ttgaacgccc ctcccaaaac61 cacattttcc gaatcctcat aacccattcc taacccttac acaacattat aagatttatc121 aacaaactat agaataataa agaatatatt gtctaattta tctatacaaa catatcttat181 ctcttatatc atagttaata taatacacct ctacatacta taaacataca taacacctct 241 acaccatatt caattccaaa ttacactaca caccacccta tcctacccac cacattacca 301 cctctatatt acaccaaccc caatcgaacc


TC2

1 acctgcaggc acacgtgtgt gtgtgtatgt atgtgtgtgt gccccaccca cctccggctc61 cttcatgttt gtgtcgtcgc tgcccttgtc tgcgcaagca cggtgtcctg tcgtgtccgt121 ctcgctgctt tgtgttctcg cactccaccg cgtgttttac ggtgttgcct gcgttttttg181 gtgtttttct gcttttttcc cgtcttttgg ctcctcgcac tgaaccgcct gcacacaccg241 ctccgcacgc attagtcgcg tgtgttccgc cccccgacac tttctgtggc gctgatcggg 301 cgactccgcc ag


INFECCIÓN EXPERIMENTAL

RATONES

Los ratones infectados con Trypanosoma cruzi, presentaron parasitemia visible, sin embargo la infección de los ratones no pudo ser confirmada mediante PCR, con primers específicos de Trypanosoma cruzi (300 -450pb), debido a contaminación en la muestra.

MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo líquidos LIT, no presentaron parasitemia visible debido a la falta de asepsia previa a la inoculación, o probablemente la cantidad de heces inoculadas en cada tubo con el medio liquido LIT fue demasiado alta para que los antibióticos realizaran un trabajo eficiente al momento de mantener estéril al medio.

Por lo tanto no se observaron fragmentos de bandas amplificadas para la presencia de Trypanosoma cruzi en el medio de cultivo.


CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se encontró que el 72.33% de vectores analizados tienen a Trypanosoma cruzi presente en las muestras.

El nivel socioeconómico bajo en las comunidades y su forma de vida es un riesgo potencial importante para el continuo desarrollo de la enfermedad.

Con el presente estudio, los métodos de diagnóstico podrán ser más eficientes dando un control casi personalizado a los pacientes.

El sistema de control en el vector podría ser de mayor eficiencia si se toma en cuenta el ciclo biológico del insecto dentro de los reservorios selváticos y domésticos.

Evitar la deforestación, la cual afecta los nichos ecológicos de los vectores, causando cambios en el medio en el que habitan para evitar la migración a espacios domiciliares.

Otra medida de control es la colaboración e intervención de las autoridades locales para que ayuden a crear programas de mejora habitacional en toda la zona endémica para la enfermedad de Chagas.

Control del vector con insecticidas específicos y control a los pobladores

Realizar controles dos veces al año capacitando al grupo de SNEM

Facilitar el equipo necesario para realizar los controles del vector en las distintas poblaciones

Realizar sondeos a las personas mediante técnicas de laboratorio para controlar la enfermedad de Chagas

Dar informes actualizados de estudios recientes para estableces un vinculo entre los investigadores y la enfermedad

Mantener la bioseguridad pertinente en el manejo de material infeccioso para evitar los contagios indirectos

Realizar estudios de caracterización genética para otros tipos de Trypanosomas, ya que se ha demostrado que no solo puede existir una sola clase de Trypanosoma dentro de un vector.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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