PÓSTER TÉCNICO

Caracterización morfológica y cultural de Fusarium culmorum (WG.Smith) Sacc.

F. Sempere, F. Ga rcía, M.P Sanlamarina (Departamento de Biología Vegeta l. Escue la Técnica Supe­rior del Medio Rural y Enología. Universidad Politécnica de Valencia. mpsanlam@bvg.upv.es)

Aunque han aparecido nuevas técnicas analíticas para la determinación de las especies fún­gicas, una herram ienta importantey tradic.on al oara el control micológico es el uso de méto­dos símpies de identificación especifica que se realizaen base al aspecto de las co lon ias y la rnicromorfoiogía en varios medios de cultivo a distintas temperaturas de incubación. El ob­jetivo de este estud io fuecaracterizar morfológicamente y culturalmente al hong o Fusaríum cu/morum aislado a partir de muestras de arroz con un periodo de al macenamiento de nueve meses. Para ello, se procedió a utilizar cuatro medios comun es : POA, MEA, Cz y PSA en los que se se mbró la espec ie en uno y tres puntos respectivamente y se incub ó durante 5 días a 25°C por ser esta la temperatura óptima descrita por variosautores. Parael estudio de las ca racterísticas microscópicas se utilizó la técnica del microcultivo .

INTRODUCCiÓN :

De los genitivos plurales latinos tusus-i (huso , por la forma de las esporas) y cutmus-i (caña) Fusarium sp. comprende una gran diversidad de hongos que están distribuidos portodo el mundo como oportunistas , saprofitos de restos vegetales e importantes patógenos de una gran var­iedad de plantas de diversas condiciones medioambientales (DOOHAN y col., 2003; LOGRIECO y col., 2003). Las clamidosporas son ovales o globosas, intercalares o terminales con paredes lisas o rugosas, formadas individualmente en cadenas o en racimos. Además se caracteriza porsecretar una sustancia hidrófilaencultivos viejos de 2 ó 3 semanas y por la germinación delos macroconidios para producir microconidios aberrantes en fiálides pequeñas. Los macroconidios constituyen una importante fuente de inoculo y se convierten en el suelo en clamidosporas donde pueden sobrevivirdurante muchos años para posteriormente germinar infectando las raíces de las plantas (SITION y col., 1981).

Es de todas las especies del género Fusarium el único que compite bien con las especies deAspergillus y Penicillium (LACEY, 1989). Fusarium culmorum, es considerado como un hongo de campo ya que requiere un alto contenido de humedad en el substrato para su crec­imiento y la síntesisde micotoxinas (> 20 %) pero ocasionalmente se desarrolla en almacén cuando las condiciones le son favorables, es decir, a bajas temperaturas y alta humedad o si el grano hasido secado ínsuficientemente y de forma rápida (LACEY y MAGAN, 1991 ; CARUSO y cot., 1999; LOGRIECO y col., 2003; HOPE y col., 2003). Con independencia de su origen geográfico sus condiciones óptimas de crecimiento son: una temperatura de25°C, una actividad de agua de 0.99 o con un intervalocomprendido entra-s a -14 bars y un pH bajo..(COOK y CHRISTEN , 1976; LACEY y MAGAN , 1991 ; PARRY Y cot. , 1994; BREN­NAN Ycol., 2003). Porotra parte es una especie muy tolerante a las bajas tensiones de O2 y presenta una alta resistencia a la radiación (MA­GAN YLACEY, 1984b; ü'Nau Ycol., 1991). Fusarium culmorum esun importante patógeno deun amplia variedad deplantas, especialmente de cereales , reduciendo la germinación de las semillas, causando enfermedades en la plántulas, la podredumbre del pie y la raízy la fusariosis o scab (HESTBERG y col., 2002; MIEDANER

Ycol., 2004). La fusariosis fue considerada durante muchos años como una enfermedad de importancia secundaria pero debido a su severidad , el aumen­to de su frecuencia de aparición, el impacto que tiene sobre el rendimiento y la calidad del grano y la contaminación de este por micotoxi­nas, actualmente es una de las más importantes enfermedades fúngicas (BAI y col., 1996; LIGGIIT Ycol.,1997; DOOHAN y col.,1999; VISCONTI y col., 2000; VI Ycot., 2001). Es una enfermedad compleja y de infección floral llegando a ser asociada con ella hasta 17 especies fúngicas. Ha sido descrita en todo el mundo siendo F. culmorum predominante en las zonas frías del noroeste de Europa , Canadá y nortede Estados

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Un idos (PARRYy col., 1995; PIRGOZllEV y col., 2003; TAN y col., 2003). Po r ot ra parte , algunos de los agentes de biocontrol descritos para este hongo han sido: Glioeadium sp ., Clonostaehis rosea y Phythium sp. (TEPERI Ycol., 1998; DAVANLOU ycol., 1999; JENS EN yeol.,2ooo). Fusarium eulmorum exhibe una gran diversidad molecular y fenotípica. Agresividad , perfiles y concentrac iones de micotoxinas varían entre aislados (MIEoANER y col. , 1996a; GANG y cot. , 1998; MUTHoMi y col., 2000). La principales micotoxinas que produce son: learalenona (lEA), Deoxinivalenol (DON), Ni­valenol (NIV), Fusarenona-X (FUS), zearalenol (a y a isomeros) (loH) y monoaceli ldeoxini­valenol (3-AcDON , 15-AcDON) (ac-DON) (LOGRIECO y col. , 2003) (Figura 1).

POSICiÓN TAXONÓMICA

Phylum: Ascomycota Clase: Euascoycetes Orden: Hypocereales Familia: Hypocreaceae Género: Fusarium Especie: F. eulmorum

La lea ra lenona tamb ién llamada toxina F-2, es una lactona derivada del ácido resorcílico. Es un contaminante natural de la mayoria de ce­reales como trigo , maíz, cebada , sorgo , etc., ya sea en campo o en almacén . Pero también se ha encontrado en otros alimentos (CHEKOWSKI y col. , 1983;TANAKA Ycol.,1985; UENO ,1985; GONZÁLEZ ycot., 1999; SILVA Ycot.. 2001) . Se caracteriza por ser débilmente fitotóxica y producir hiper­estrogenismo y problemas reproductivos en el ganado yanimales de experimentación (DESJARDlNSycol. , 2001). El nivel máximo admisible os­cila entre 30y 1000 Ilg/Kg de cereales, legumbres y nueces según los países (SANCHIS y col.,2000). OON , NIV yFUS son tricotecenos de tipo Bque poseen una función carbonilo en el carbono 8. Los tricotecenos son ésteres de alcoholes sesquiter­pénicos que contienen un sistema característ ico de anillo tricícl ico junto con el grupo 12,13-epóxido. DON produce diarrea , nauseas, vómitos, cefalalgia , dolor abdominal , anorexia, escalofríos , convulsiones , vértigo; y tiene efectos sobre el sistema inmunitario de los humanos, y en an imales produce rechazo del alimento , vómitos e inmunosupresión (TERAo y col., 1991; BULLERMAN, 1997).

Materiales y métodos

Aislam iento de la especie Laespec ie que sehautilizado eneste trabajo, fue aislada en el laboratorio

de BiologíaVegeta l delaEscuela Técnica Superior de l MedioRural y Enología de muestrasde granosdearroz con unperiodo de almacenamiento de 9meses. La empresa suministradorafueCOPSEMAR.

Paraello se preparóAgar Patata Dextrosa al que se añadió clorafenicol a razón de0,5 gIl paraevitar el crecimiento delevadurasy bacterias.

En unagasa previamente esterilizadasecolocaron50 granosque fueron sumergi­dosenunasolución de hipoclorito sódico al 2%durante 3minutosydespuésse hicieron dos enjuagues sucesivosde la misma duración con agua destiladaestéril.

Posteriormente,secolocaronasépticamente 5granos porplaca yse incubó durante5díasa25°C enoscuridad (Figura 2) .

Finalmente, seprocedióaseparar las diferentes coloniasde lasespecies fúngicas.

Crecim iento in vi/ro de la especie Seobservaron losmohoscrecidos encuatromedios comunes:Agar Pata­

taDextrosa (PDA),AgarExlraclodeMalla (MEA), AgarCzapek-Dox(Cz) yAgar de DextrosaSabouraud (ADS)

Lasiembrase hizo en uno y tres puntos equidistantes conplaca invert ida, yseincubarona25'Cduran te cinco días.

Paralacarac terizaciónmicroscópicaydeb ido aquelamanera deformarse lasesporas y lascaracterísticas dela célula conidiógena sonfundamenta les para la identificaciónde los fusarios, fue necesario emplear la técn ica del microcul­tivo(STEIFERT, 2000). Paraellose depositó un cuadrado de 1cm de lado delos disti ntosmediosempleados sobreunportaobjetos. Se sembró el hongoen los bordesy se co locó el cubreobjetos El conjunto se apoyó sobre una vari lla de vidriodentro de unaplacaPetri en cuyo fondo se había depositado papel de filtroembebido enagua.Todo el material utilizado fue esterilizadopreviamente yel montajeserealizóen condiciones asépticas.

1

CH

JI< I CH,tu.

l,

't--+--R, Radicales de tricotecenos tipo B

DON OH H OH OH R, NIV OH OH OH OH

FUS OH OCOCH3OH OH

Estructura tricotecenos tipo B

Zearalenona 15·acetil-deoxinivalenol

Figura 1. Algunas de las principales micotoxinas producidas por Fusarium eulmorum.

Determinación decaracteres morfológicos y culturales En cada unade las placasseobservaron lossigu ientes caracteres:

Caracteres morfológicos:

1. Característicasdelashitassumergidas:color, presenciaoausenciadesep­tos,diámetro aproximado ycaracteresdistintivosde estructuras especiales si tienen.

2, Grado de desarrollo de las estructu ras de fructificación. 3. Características y disposición de los órganosdefructificación maduros, li­

•bresobien en el substrato, en lasuperf icie oen el micelio aéreo.También es muy importante destacar si existe más de un tipo de estructuradees­porulación .

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A células ap lca les

/'\// /¡; ¿~

t célul as basales en forma de pie

:c ~

Figura 4. Fusarium culmorum: (A)Detalle de macroconidios. (B) Mi· croconidios y macroconidios (x400) (C) Macroconidios y clami­dosporas (x 400) (D) Conidióforos y macroconidios (x 400 CF (con ­traste de fase)) .

4. Co lor, tamañoy forma delos órganosdefructificación, tomando medidas Figura 2. Distintas colonias fúng icascrecidas apartir de los granos

de laspartesesenciales ydisposición enellas de esporas.dearroz sembrados en PDA durante 5 días a 25°C en la oscuridad. 5. Deta lles sobre laestructurade fructificación, tomandomedidasdelaspartes

fundamentalesydisposición enellas delasesporas. 6. Detallescompletos de lasesporas: co lor, forma, tamaño, tab icación ymar­

cas superficiales. ADS 5D ADS70 AOS SD

Caracteres culturales:

1. Grado decrecimiento. Se describe como muy lento, lento,moderado,dis­creto, rápido, etc. En algunasdiagnosisse dan losdiámetrosreales delas

PDA 50 POA 7D POA5D

colonias transcurrido un determinado númerodedías. 2. Color delacolonia y cambios que pueda sufrir. Si es uniforme, porzonas

oenmosaico. Esinte resante anotar también los coloresqueaparecen alrede­dorde las colonias endesarro llo.

3. Colores ycambios quepuedan producirseenel reversodelascolonias. 4. Cambiosdecolor enel medio, tantosi tienen lugar sóloenel área de la

colonia osi se hadifundidoaeste.

5. Texturasuperficia l, ya sea sueltaocompacta, plana, rugosa ocurvada,ater­ciopelada, algodonosa, filamentosa, gelat inosa, etc.

6. Olorsi existe. En general sonmuy difícilesdedescribir.Muchasespecies tienen unolorque podríamos catalogar como "enmohecido".

7. Característ icas del exudado del líquidotranspirante, que se encuentra,ave­ces, en el crecimientoaéreo

Las pr incipales monografías quese hanutilizado para laclasificación del

género Fusar/umson: Booth (1977); GerlachyNiremberg, (1982); Nelson y col. (1983); Burgessy col. (1988); Pitt YHocking (1999); Samson y col. (2000).

Resultados Vdiscusión

EnPDA a25°C lascolonias presentan undiámetrode7.5 a9cm en 4días sien­dodonde se presenta unmayor crecimiento. El micelioaéreo es algodonoso, al principiosuco lor va de blanco aamarilloorosa,volviéndoseocre omarrónro-

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Figura 3. Fusarium culmorum en diferentes medios decultivo a 25°C. Andverso: columna izquierda y derecha . Reverso : columna cen­tral. (3D, 4D, 5D Y7D: 3, 4, 5 Y7 díasde cultivo).

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jizo y fielt roso cuandosehace viejo El reversoy la superficiedel agar, adop­tanuna coloración roja-púrpuraomarrón(Figura3)

En ADSel crecimientoesmuy similar al queseproduceenPDA aunque un poco menos vigorosoydeunatonalidad más intensa.

Lascolonias en MEA presentan undiámetrode4a5 cm,en4días, de as ­pecto atercíopelado. Decolorrojoclaro hastarojopastel , comúnmente conuna capa naranja grisácea hasta marrónamarillenta; reverso marrónamarrón rojizo (Figura3).

Lascolonias crecidas enAgarCzapek, alcanzan undiámetrode5y6cm a loscuatrodías de crecimiento. El micelioaéreo es menosalgodonoso que

enPDA, el colo r del mismo varíadesde entre blancoyamar illo. convi rtiéndose conel tiempo en un naran japálido . El reverso tomaunacol oración amarillo intensoorosa(Figura3)

Los macroconidios normalmente tienen5 septos (aunque podemosen­contrar de 3, 4, 6, 7Y8 septos):3 sepias 26-36 x4-6 pm;4sep ias 30-46x 5-7um;5sepias: 34-50x5-7urn Clamidosporas: 10-14x9 - 1 2~m (Figura4).

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