CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/...La separación de las proteínas de la muestra puede ser por su punto isoeléctrico

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1_3 : Western y Southern Blots

Materia de Especialización CEBI_E1

Técnicas de análisis en biotecnología

Módulo I: Moléculas pequeñas.

Módulo II: Macromoléculas.

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Western Blot

Técnicas de Análisis-Macromoléculas

Es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas

en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.

Es utilizado en biología molecular, bioquímica e inmunogenética

para la detección de proteínas en una muestra.

4 PASOS:

1) Utiliza electroforesis en geles de

poliacrilamida. Caso más común: separar

proteínas desnaturalizadas por peso molecular

(SDS PAGE).

2) Las proteínas son transferidas desde el gel

hacia la membrana (generalmente nitrocelulosa),

donde permanecen fijas.


Western Blot


3 y 4) Luego las proteínas son

detectadas utilizando anticuerpos

específicos para dicha proteína.

Esquema


Western Blot


SDS-PAGE:

- Separo los complejos de proteínas en

individuales

- Separo las proteínas por tamaño

Western Blot Análisis:

- Transferencia de las proteínas a una

membrana de nitrocelulosa

- Son más estables y permanentes

- Identifiicación de proteínas por

immunodetección: uso de anticuerpos

especificos contra la proteína de interés

BIORAD ©

Tandem


Western Blot


Las electroforesis más utilizadas

son las que utiliza geles de

poliacrilamida, SDS-PAGE o IEF.

La separación de las proteínas de

la muestra puede ser por su punto

isoeléctrico (pI) o por su peso

molecular (MW).

Por lo tanto el tipo de separación

depende del tratamiento de la

muestra y de la naturaleza del gel.


Western Blot


Preparación de las muestras:

Las muestras deberán ser tratadas según su tipo.

Si fuese de un cultivo o tejido sufrirán pasos de lisis celular y

solubilización de proteínas, centrifugación y filtración si fuese

necesario.

Luego de la extracción se prepara la muestra según la

electroforesis a utilizar.


Western Blot


PASOS WESTERN

a) Preparación del sistema de blotting y transferencia

b) Bloqueo de la membrana (de nitrocelulosa)

c) Incubación con soluciones de anticuerpos

d) Desarrollo de color del blot


Western Blot


Preparación para la

transferencia de las

proteínas a la

membrana (de

nitrocelulosa) Corte del gel

BIORAD ©


Western Blot


Transferencia:

Para hacer accesibles las proteínas a la detección de los

anticuerpos, éstas deberán ser transferidas desde el gel hacia

una membrana. Las más utilizadas son las de nitrocelulosa o

polyvinylidene difluoride (PVDF). Estas son elegidas por su

propiedad de pegado de proteínas no especifico, basado en

interacciones hidrofóbicas e interacción de cargas.

2 métodos generales:

- capilaridad

- electrotransferencia


Western Blot


Electrotransferencia.

Se usa corriente eléctrica para impulsar las proteínas del gel hacia

la membrana. Corren hacia el polo positivo.

El sandwich del gel, membrana y papeles de filtro (o goma espuma)

se coloca entre dos planchas metálicas, conectadas

respectivamente a los polos.


Western Blot


Esquema de la celda

de Trans-Blot

BIORAD ©


Western Blot


Transferencia de

proteínas desde el

gel hacia la

membrana

30 minutes

100V

Buffer para el blotting

1x Tris-glicina con

20% etanol

Co

rrie

nte

elé

ctric

a

BIORAD ©


Western Blot


Preparando la

transferencia

electroforetica

Tips

Se puede adicionar una unidad congelada en el tanque para paliar el aumento de temperatura (Bio-Ice cooling unit)

BIORAD ©

Uso de barra de agitación magnética para mantener la distribución de iones y temperatura


Western Blot


BIORAD ©

https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ

6dBOfs

BIORAD, video completo


Western Blot


Transferencia x capilaridad:

La membrana se coloca sobre el gel y sobre este una pila de

papeles de filtro.

El sandwich formado se sumerge en una solución buffer, que

ingresa por capilaridad, llevándose la proteína a la membrana.

Demora mucho más tiempo que la electrotransferencia

(overnight).

Nota: la nitrocelulosa es mas barata que el PVDF, pero mas frágil.


Western Blot


La uniformidad y eficiencia de transferencia se puede confirmar

con colorantes como el Ponceau S.

Ponceau S es el más comúnmente utilizado por su alta

sensibilidad, rápido teñido (5 min) y su solubilidad en agua lo que

hace mas fácil su posterior desteñido.

Útil para nitrocelulosa, PVDF

(reversible en ambos casos)


Western Blot


Bloqueo

Se debe prevenir la interacción entre el anticuerpo utilizado y la

membrana.

Para ellos, se incuba la membrana con una solución de proteínas

(BSA, leche en polvo descremada-funciona muy bien y es

económica-) que no serán detectadas por el anticuerpo y llenarán

los espacios libres de la membrana evitando que interaccione el

anticuerpo “inespecíficamente” con esta. Esto reduce el “ruido” del

producto final dejando resultados más claros.


Western Blot


Bloqueo

Buffer de bloqueo: BSA 0,1-1% + Tween 20 0,005% - leche en

polvo 3-5% + Tween 20 0,025-0,05%, Caseína, etc. (en buffer TBS

o PBS, que mantiene el correcto pH y fuerza iónica)

Luego del bloqueo se realizan lavados para eliminar el exceso de

proteína de bloqueo. Se realizan con TBS o PBS + Tween 20

0,05%.

TBS: Tris/Borate/saline

PBS: Phosphate/Borate/saline


Western Blot


Detección:

Uso de anticuerpos como herramienta de

diagnóstico

BIORAD ©

Hoy en día hay compañías que se

especializan en proveer

anticuerpos (monoclonales y

policlonales – éstos últimos son los

más usados-) contra una gran

cantidad de proteínas.


Western Blot


BIORAD ©

1) La proteína de interés es enfrentada

contra un anticuerpo especifico

1) Unión de un 2do anticuerpo contra el

primero (no hay necesidad que sea

específico). Posee enzima.

1) Detección por adición de sustrato de la

enzima. Reacción colorimétrica/

quimioluminiscente.

3 pasos:

Proteínas en la membrana


Western Blot


Detección

Los anticuerpos se diluyen en la solución

de bloqueo.

La incubación debe llevar una leve

agitación, la temperatura puede variar,

cuanto mayor sea se incrementará la

unión tanto especifica (señal deseada)

como no especifica (ruido).

Puede dejarse 1 h a T amb, también a

37C; u overnight en heladera, de

preferencia con agitación (tb fciona sin).


Western Blot


Tomada de

http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classe

s/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm


Western Blot



Western Blot


1er anticuerpo: 0,5 - 5 g/ml

2do anticuerpo: dirigido a la porción “especie específico” (Fc) del

anticuerpo primario

Otras opciones: ej. puede estar unido a biotina, o a enzimas tales

como fosfatasa alcalina o peroxidasa

Los más utilizados son los unidos a peroxidasa, con los cuales se

utiliza como sustrato alfa-cloronaftol (más barato y menos

sensible), o reactivos quimioluminiscentes (se revela en una placa

fotográfica)

(ver catálogos)


Western Blot


Resultado: Western Blot

Si el Blot se hizo

desde un gel no teñido

Si el Blot se hizo

desde un gel teñido

Western Blot




Western Blot


Recomendaciones:

Algunos anticuerpos pueden reusarse (entre 1 y 3 veces, y según

como están conservados-buffer, leche-), pero hay que definir según

la técnica.

Agitación constante en las incubaciones, excepto en frío overnight.

Respetar tiempos y lavados. Es importante sacar el exceso de

bloqueo y de anticuerpo para eliminar background.

Nitrocelulosa es mas barata pero mas frágil.

Sensibilidad: 0,1 ng.

No dejar burbujas de aire.


Western Blot


Recomendaciones y aplicaciones:

Identificación de la proteína (criterio de identidad).

Detección de agregados no muy degradados.

Alta concentración de albúmina puede interferir.

No es cuantitativo.

Permite diferenciar entre moléculas de mayor PM y agregados de

la proteína.


Western Blot


Deteccíón de proteína CKK47 por SDS-PAGE y Western Blot


Southern Blot


Similar a la técnica descripta para Western

Se puede hacer tanto para geles de agarosa com poliacrilamida,

pero precaución en el método de transferencia (electrotransferencia

únicamente).

Paso 1:

Como preparar y correr un gel de agarosa

(How to Make and Run an Agarose Gel (DNA Electrophoresis))

http://www.youtube.com/watch?v=2UQIoYhOowM

Paso 2: Procedimiento de Southern

http://www.youtube.com/watch?v=2UQIoYhOowM


Southern Blot


Membranas más comunes: nitrocelulosa (ojo, es frágil), nylon

(positivas o negativas, permiten reuso)

Luego de la transferencia, se debe FIJAR el DNA a la

membrana. Métodos más comunes: irradiación UV (para nylon)

o “cocinado” (nitrocelulosa).

Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001) Nature Publishing Group


Southern Blot


Brown, Current Protocols in Molecular Biology (1999) 2.9.1-2.9.20

Ver capítulo de libro anexo (Brown, Current Protocols in Molecular

Biology (1999) 2.9.1-2.9.20) donde se dan detalles de protocolos

para transferencias en medio ácido o básico según polaridad de

membrana.


Southern Blot


Procedimiento completo Southern blot

http://v.youku.com/v_show/id_XMjYwODM5MTY4.html

http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8


Southern Blot


Revelado más comunes

-Radioactivos: Probe radioactiva – autoradiografia

-No radioactivos: quimioluminiscenica, colorimétrico

(streptoavidina-biotina-enzima).

Los métodos de revelado más comunes no son los mismos que

para Western


Southern Blot


Aplicaciones y selección de membrana

-Nylon retiene fragmentos hasta 50 nucleot, mientras

nitrocelulosa, 500. (Ojo en análisis de fragmentos de DNA

digeridos con enz. restricción)

-Para PCR: mejor nylon, pero se usa nitrocelulosa dada la alta

cantidad de DNA de partida.

Principales aplicaciones:

a) identificación de clones y localización de fragmento más

pequeño conteniendo el gen de interés.

b) Mapeo RFLP (restriction fragment length polymorphism)

(ver detalles en Brown, Encyclopedia of Life Sciences (2001)

Nature Publishing Group)


Otros Blots


Existen los llamados Northern blot y “Eastern blot”.

Northern blot

Se basa en la detección y separación de ARN a partir de geles

de agarosa

(video de muestra del proceso

http://www.dnatube.com/video/2999/Nouthern-Blot)

“Eastern blot”.

Variante (y extensión) del Western blot. Se usa principalmente

para analizar modificaciones post-traduccionales de proteínas

(lipi-, glico-, fosfo-rilaciones). Polémica y no aceptaciones global

del término.



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