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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES AVANZADOS
DEPARTAMENTO DE ESTUDIOS DE POSGRADO
Desarrollo de recubrimiento mediante proyección
térmica por plasma en base a polvos de HA-nAg
sintetizados mediante métodos verdes.
Tesis de investigación para obtener el grado de
Maestría en Ciencia de los Materiales.
PRESENTA:
Ing. Denisse Alejandra Lozoya Rodríguez
ASESOR:
Dr. Víctor Manuel Orozco Carmona
ASESOR EXTERNO:
Dra. Renata de Lima
(Universidade de Sorocaba, Sorocaba-SP, Brasil)
CHIHUAHUA, CHIH. AGOSTO, 2016
3
AGRADECIMIENTOS.
A CONACyT: por el apoyo otorgado para la realización de mis estudios de
posgrado en esta institución.
A CIMAV: por la facilitación tecnológica, pero sobre todo intelectual.
A mi asesor de tesis: Dr. Víctor Manuel Orozco Carmona, por ayudarme a
abrir puertas en el mundo; a mis compañeros y amigos: Mercedes
Bazaldua, Arnold González, Paola Cárdenas, Karime Carrera, Jonathan
Mendoza, Roberto Gómez, por el apoyo físico, intelectual y psicológico.
Al departamento de Metalurgia e Integridad Estructural, a los técnicos de
los diferentes departamentos, a mis profesores a lo largo de mi maestría.
A mis sinodales, por el tiempo invertido y los consejos dados.
UNISO: a mi co-asesora: Dra. Renata de Lima, por la oportunidad de vivir tan
enriquecedora experiencia, la orientación, pero sobre todo su amistad; a los
nuevos amigos: Tatiane Pasquoto, Mariana Guilger, Tatiane Balbo, Natalia
Bilesky, Angélica Sibaja.
CIQA: al Dr. Antonio Ledezma, por el apoyo incondicional; a los otros nuevos
amigos: Natty Canché, David Zamora.
A MIS PADRES:
Rossy y Jesús Rodríguez, porque sin importar las dificultades ni las
circunstancias (o mi mal humor), siempre están a mi lado. Gracias por todos estos
años de amor, orientación y consejos. Gracias porque, aunque en ocasiones no
nos entendemos, nunca me dejan sola. Gracias por darme esta oportunidad.
“A Dios: A quien le debo todo en esta vida. A él que guía mis pasos y me ha
permitido llegar hasta este punto. Gracias por cada bendición.” - 31 / Enero / 2012
4
CONTENIDO
RESUMEN...................................................................................................... 6
ABSTRACT .................................................................................................... 7
INTRODUCCIÓN. ........................................................................................... 8
CAPITULO I. ................................................................................................... 10
MARCO TEÓRICO. ........................................................................................ 10
1.1 SISTEMA ÓSEO................................................................................ 10
1.1.1 Enfermedades óseas. ............................................................... 11 1.2 LOS BIOMATERIALES. ..................................................................... 14 1.3 RECUBRIMIENTOS DE HA / nAg. .................................................... 18
1.3.1 Hidroxiapatita. ........................................................................... 18 1.3.2 La plata como agente biocida. .................................................. 20
1.3.3 Síntesis verdes. ........................................................................ 22 1.3.4 Recubrimientos de HA/nAg....................................................... 27
1. JUSTIFICACIÓN. ..................................................................................... 29
2. HIPÓTESIS. ............................................................................................. 29
3. OBJETIVO. .............................................................................................. 29
3.1. Objetivos específicos. ........................................................................ 30
CAPITULO II. .................................................................................................. 31
EXTRACCIÓN DE HIDROXIAPATITA BIOLÓGICA. ...................................... 31
2.1 TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN. .............................................. 31 2.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL. ..................................................... 37
2.2.1 Materiales. ................................................................................ 37
2.2.2 Metodología. ............................................................................. 37 2.3 RESULTADOS. ................................................................................. 39
2.3.1 Caracterización de polvos de HA comercial. ............................ 39
2.3.2 Desarrollo y caracterización de polvos de HA obtenidos mediante calcinación de hueso bovino (HA biológica). ............... 44
CAPÍTULO III. ................................................................................................. 78
5 DESARROLLO DE RECUBRIMIENTOS. ....................................................... 78
3.1. INTRODUCCIÓN. .............................................................................. 78 3.2. DESARROLLO EXPERIMENTAL. ..................................................... 79
3.2.1 Materiales. ................................................................................ 79 3.2.2 Metodología. ............................................................................. 79
3.3 CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA DE RECUBRIMIENTOS .......................................................................... Error! Bookmark not defined.
3.4 RESULTADOS. ................................................................................. 82 3.4.1 Recubrimiento de HA biológica. ................................................ 82 3.4.2 Recubrimiento de HA / 1% nAg ................................................ 90
CAPÍTULO IV ................................................................................................. 95
EVALUACIÓN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE RECUBRIMIENTOS. ............. 95
4.1 INTRODUCCIÓN. .............................................................................. 95
4.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL. ..................................................... 97 4.2.1 Materiales. ................................................................................ 97 4.2.2 Metodología. ............................................................................. 97
4.3 RESULTADOS. ................................................................................. 100 4.3.1 Ensayo cometa. ........................................................................ 100
4.3.2 Citometria de imagen. Tali. ....................................................... 101
CAPÍTULO V. ................................................................................................. 103
EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD Y EFICIENCIA ANTIMICROBIANA DE RECUBRIMIENTOS. ................................................................................ 103
5.1 INTRODUCCIÓN. .............................................................................. 103
5.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL. ..................................................... 104 5.2.1 Materiales. ................................................................................ 104
5.2.2 Metodología. ............................................................................. 105 5.3 RESULTADOS. ................................................................................. 106
CAPÍTULO VI ................................................................................................. 109
DISCUSIÓN. ................................................................................................... 109
CAPÍTULO VII ................................................................................................ 116
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.................................................. 116
CONCLUSIONES. ................................................................................... 116 RECOMENDACIONES. ........................................................................... 117
6 REFERENCIAS .............................................................................................. 119
RESUMEN
En la presente tesis se desarrolló un recubrimiento en base a polvos de
Hidroxiapatita extraída de una fuente natural (Hidroxiapatita biológica, HA), y
nanopartículas de plata sintetizadas mediante extracto de nopal (nAg), empleando
la técnica de proyección térmica por plasma (APS, por sus siglas en inglés) sobre
un sustrato de Ti6Al4V. Ambos, el recubrimiento y los polvos fueron
caracterizados, mediante técnicas tales como microscopía electrónica de barrido
(SEM), difracción de rayos X (XRD), espectroscopía por infrarrojo (FT-IR),
espectrometría de emisión por plasma inductivamente acoplado (ICP-OES),
determinación de tamaño de partícula (PSD), análisis de área superficial (Análisis
Brunauer, Emmett y Teller, BET). Se determinó la actividad antibacterial con base
en la inhibición del crecimiento de las bacterias: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus y Pseudomonas aeruginosa. Así mismo se evaluó la biocompatibilidad de
los recubrimientos mediante ensayo cometa y citometría de imagen.
7
ABSTRACT
In the present thesis a coating was developed, based on hydroxyapatite
from a natural source (biological hydroxyapatite, HA) and silver nanoparticles
synthetized by a nopal extract (nAgEN), applied by atmospheric plasma spray
(APS) on a Ti6Al4V substrate (titanium, aluminum, vanadium alloy). Both, the
coating and the powder were characterized with technics like scanning electronic
microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), infrared spectroscopy (FT-IR),
inductively coupled plasma spectroscopy (ICP-OES), particle size distribution
(PSD), superficial area analysis (Brunauer, Emmett y Teller, BET). Antimicrobial
activity was evaluated according to the growing inhibit of Escherichia coli,
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Coating’s biocompatibility
was also evaluated by single cell gel electrophoresis assay and Tali image
citometry.
8
INTRODUCCIÓN.
Las sales de fosfato de calcio (CaP) son el mayor componente mineral en
los huesos y dientes de los vertebrados. Los huesos y otros tejidos calcificados
pueden ser considerados como un composito natural anisotrópico consistentes de
biomateriales embebidos en una matriz proteica, material orgánico y agua. La fase
biomineral, que puede consistir en uno o más tipos de fosfatos de calcio,
constituye entre el 65-70% del hueso, el agua constituye el 5-8% y la fase
orgánica, que en su mayoría es colágeno, el porcentaje restante. Dentro de las
sales de CaP, la HA es la fase cristalina más estable termodinámicamente en el
fluido corporal, así mismo posee la mayor semejanza con la parte mineral del
hueso. Naturalmente ésta se encuentra carbonatada, es decir, deficiente de
calcio, por lo que su relación Ca/P es menor a 1.67 (Mehdi Sadat-Shojai, 2013).
La HA es utilizada en recubrimientos para favorecer la unión de prótesis mediante
su integración al hueso, gracias a la regeneración de fibrillas de colágeno e
hidroxiapatita, formando enlaces entre las nanoporosidades presentes en el
recubrimiento y el tejido óseo de neoformación (Sebastian Bauer, Patrik Schmuki,
Klaus von der Mark, Jung Park, 2012). En la actualidad se han desarrollado
estudios, en los cuales, se han mejorado las propiedades antibacterianas de
recubrimientos de HA mediante la adición de partículas de plata bajo diferentes
procesos, tales como: adición de nAg en Titanio (Ti) por implantación de ion por
plasma (Huiliang Cao, Xuanyong Liu, Fanhao Meng, Paul K. Chu, 2010)
deposición por sedimentación de nAg sobre recubrimientos de HA aplicados por
proyección térmica por plasma (Daniela Ionita, Mihaela Grecu, Camelia
9 Ungureanu, Ioana Demetrescu, 2011), implantación de Ag por plasma con arco
catódico (Sputtering), entre otras (Huiliang Cao, Xuanyong Liu, Fanhao Meng,
Paul K. Chu, 2010). En trabajos previos se logró desarrollar recubrimientos a partir
de un proceso térmico que permitió manejar una integración de las nAg en HA
antes de su aplicación (V. Orozco Carmona, 2014); sin embargo, hasta el
momento, no se ha desarrollado un recubrimiento en el cual, todos sus
componentes sean obtenidos mediante técnicas “verdes”.
La presente tesis está desarrollada en VI capítulos. En el capítulo I se
presenta el marco teórico en el que se fundamentó la investigación, así como la
hipótesis y objetivos que se establecieron para la misma. El capítulo II describe el
proceso de extracción de la HA a partir de huesos bovinos y la caracterización de
los polvos obtenidos. En el capítulo III se muestra como se llevó a cabo la
proyección de polvos para la obtención del recubrimiento y su caracterización.
Dentro del capítulo IV se dan los pormenores de cómo fueron aplicados los
protocolos para la evaluación de biocompatibilidad. El capítulo V detalla el
procedimiento para la evaluación antibacterial del recubrimiento, con base en el
estándar JIS Z2801:2000. Las conclusiones están plasmadas en el capítulo VI,
así como las recomendaciones. Los resultados de cada análisis se encuentran
dentro del capítulo correspondiente.
10
CAPITULO I.
MARCO TEÓRICO.
1.1 SISTEMA ÓSEO.
Los huesos son los órganos del sistema esquelético y el tejido óseo es el
componente estructural de los huesos.
El tejido óseo es una forma especializada de tejido conjuntivo, compuesto
por células y matriz extracelular. La característica que distingue el tejido óseo es
la mineralización de su matriz, cuyo mineral es fosfato de calcio en la forma de
cristales de hidroxiapatita (Michael H. Ross, 2005).
El hueso es un compuesto natural estructurado jerárquicamente
(Figura 1). A nivel microscópico se observan osteonas, las cuales son largas fibras
huecas compuestas de laminillas concéntricas y poros. Las laminillas constan de
fibras, y estas fibras contienen fibrillas. Al nivel estructural de la nanoescala, las
fibras son un composito de mineral de Hidroxiapatita y proteína de colágeno.
Dicha nanoestructura se produce a través de la autoformación que da paso a una
estructura anidada. El entendimiento de las estructuras jerárquicas es básico para
la obtención de materiales para implante que se ajusten a las demandas
estructurales dadas (Sebastian Bauer, Patrik Schmuki, Klaus von der Mark, Jung
Park, 2012).
11
Figura 1. Estructura jerárquica del hueso (Sebastian Bauer, Patrik Schmuki, Klaus von der Mark, Jung Park, 2012).
1.1.1 Enfermedades óseas. Durante la infancia y la adolescencia, el cuerpo agrega huesos nuevos más
rápido de lo que elimina los huesos anteriores. Después de los 20 años de edad,
puede perder huesos más rápido de lo que los produce, lo cual puede terminar en
varios tipos de problemas óseos:
Los tipos de problemas óseos más comunes son:
Osteoporosis, que debilita los huesos y aumenta las probabilidades de
fracturas
Osteogénesis imperfecta, que hace que los huesos sean frágiles y
quebradizos
Escala
Microcristales de HA
Fibrilla de colágeno
Molécula de colágeno Fibras de
colágeno
Conducto de Havers
Osteonas o Sistema Haversiano
Laminilla
Canalículos
Línea de cemento
Laguna con osteocito
12
Enfermedad de Paget, que debilita los huesos.
Los huesos también pueden desarrollar cáncer e infecciones.
Las enfermedades óseas pueden hacer que los huesos
se rompan fácilmente y son producidas por una mala nutrición, factores genéticos
o problemas con la velocidad de crecimiento o regeneración ósea. (CLÍNICA DAM
ESPECIALIDADES MÉDICAS, 20116)
Algunos de estos trastornos en el hueso llevan a un procedimiento
quirúrgico para mejorar las condiciones del paciente, por ejemplo: alineación de
hueso en una fractura, injerto óseo, implante, entre otros.
1.1.1.1 Infecciones postoperatorias.
Se ha reportado que las infecciones relacionadas con implantes juegan un
rol importante como una de las complicaciones clínicas más comunes, las cuales
terminan provocando una falla en la cirugía ortopédica y un incremento en los
costos del cuidado de la salud. Las tasas de infección postoperatorias son: 5%
para casos primarios, 6% para la revisión de casos, y 43% para la revisión de
casos previamente infectados (Yikai Chen, Xuebin Zheng, Youtao Xie, Heng Ji,
Chuanxian Ding, Huiwu Li, Kerong Dai, 2010).
La patogénesis de la infección está relacionada a microorganismos que
crecen en una biopelícula, siendo estos muy difíciles de tratar. Estas infecciones
son clasificadas de acuerdo a su etapa en tres categorías: temprana (menos de
13 dos semanas), retardada (de 2 a 10 semanas), tardía (más de 10 semanas)
(Daniela Ionita, Mihaela Grecu, Camelia Ungureanu, Ioana Demetrescu, 2011).
Con el fin de reducir el riesgo de infección, se recurre a la profilaxis
(inyección de un antibiótico antes de la cirugía, vía intravenosa). Debido a la
limitada irrigación sanguínea en el tejido óseo la distribución del antibiótico en las
áreas infectadas resulta ser pobre. Para reducir las infecciones se aumentan las
concentraciones de antibióticos en la sangre. Sin embargo, demasiados
antibióticos en el sistema sanguíneo durante un largo periodo producen
intoxicación.
Existen antibióticos orgánicos e inorgánicos; los antibióticos orgánicos
forman una biopelícula en la superficie del implante, incrementando así la
resistencia de la bacteria a los antibióticos. Mientras que los inorgánicos son
agentes antimicrobianos que no inducen la resistencia de la bacteria, por lo que
son una excelente opción para un tratamiento antimicrobiano local (Yikai Chen,
Xuebin Zheng, Youtao Xie, Heng Ji, Chuanxian Ding, Huiwu Li, Kerong Dai, 2010).
Las bacterias más frecuentes en infecciones postoperatorias son:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y bacilos Gram negativos
(Dr. Jenaro A. Fernández Valencia.), entre los que destacan Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa.
14
1.2 LOS BIOMATERIALES.
La estructura humana está constituida principalmente por polímeros
(proteínas) y cerámicos (minerales óseos) auto-ensamblables, con trazas de
elementos metálicos que tienen funciones a nivel molecular (Qizhi Chen, 2014).
Hablar de biomateriales implica hablar de materiales capaces de estar en
contacto con tejidos vivos, durante un periodo de tiempo como parte del tejido,
con la finalidad de completar el tejido o de ayudar a mejorar el funcionamiento de
éste, sin afectar el resto del organismo y sin ser afectado por él, a menos que así
se hubiera diseñado (como ocurre con los hilos de sutura para tejidos internos que
están diseñados para ser absorbidos por el organismo) (María Cristina Piña
Barba).
En ciencia de materiales, un biomaterial es definido como “una sustancia
que ha sido diseñada para tomar una forma que, sola o como parte de un sistema
complejo, es usada para dirigir, mediante control de interacciones con
componentes de sistemas vivos, el curso de cualquier procedimiento terapéutico
o diagnóstico”. En otras palabras, un biomaterial es cualquier material
biocompatible, natural o sintético (hecho por el hombre), que es usado para
reemplazar o asistir parte de un órgano o tejido. El prefijo “bio” de biomateriales
hace referencia a “biocompatible”, en lugar de “biológico” o “biomédico” como
normalmente es malentendido (Qizhi Chen, 2014)
La ciencia de los biomateriales es el estudio físico y biológico de materiales
y, su interacción con el ambiente biológico. Tradicionalmente, el mayor desarrollo
15 e investigación ha ido dirigido a la síntesis, optimización, caracterización y
evaluación de biomateriales, así como la interacción biológica entre el receptor y
el material (Buddy D. Ratner, Allan S. Hoffman, Frederick J. Schoen, Jack E.
Lemons, 2004).
Los biomateriales son comúnmente caracterizados como materiales
usados para construir órganos artificiales, dispositivos para rehabilitación o
implantes para reemplazar tejidos corporales (Huiliang Cao, Xuanyong Liu,
Fanhao Meng, Paul K. Chu, 2010).
Debido a que un biomaterial es usado en contacto íntimo con algún tejido
vivo, es esencial que el material implantado no cause ningún efecto dañino.
Williams sugiere que la biocompatibilidad cubre todos los aspectos de función de
un bio-dispositivo, incluida la interacción con células y tejidos con los biomateriales
implantados (Qizhi Chen, 2014). Una definición aprobada por un consejo de
expertos en este campo es: “Biocompatibilidad es la habilidad de un material para
desempeñarse bajo una respuesta apropiada del huésped en una aplicación
específica” (Buddy D. Ratner, Allan S. Hoffman, Frederick J. Schoen, Jack E.
Lemons, 2004).
Los requisitos que debe cumplir un biomaterial son:
1. Ser biocompatible.
2. Ser químicamente estable e inerte.
3. Tener resistencia mecánica adecuada.
4. Tener tiempo de fatiga adecuado.
5. Tener densidad y peso adecuados.
16 6. Tener un diseño de ingeniería perfecto.
7. Y ser relativamente barato, reproducible, fácil de fabricar así como de
procesar para su producción a gran escala.
El éxito de un biomaterial o de un implante depende de 3 factores
principales: propiedades y biocompatibilidad del implante, condiciones de salud
del receptor, y habilidad del cirujano (María Cristina Piña Barba).
Ejemplos de una respuesta apropiada del receptor incluyen la resistencia a
la coagulación de la sangre, resistencia a la colonización bacteriana, y una
recuperación sin complicaciones. Ejemplos de aplicaciones específicas incluyen
membranas de hemodiálisis, las cuales estarán en contacto con la sangre del
paciente durante 3 horas, catéteres para vías urinarias que estarán insertadas
durante una semana, o prótesis de cadera, la cual “será implantada de por vida”.
El concepto general de biocompatibilidad ha sido extendido recientemente
dándole un enfoque más amplio llamado “ingeniería de tejidos”, en el cual,
procesos patofisiológicos in-vitro e in-vivo son empleados para seleccionar
cuidadosamente células, materiales y condiciones metabólicas y biomédicas para
la regeneración de tejidos funcionales.
En la Tabla 1, se enlistan algunas aplicaciones de materiales en el cuerpo,
los cuales incluye muchos materiales que comúnmente son clasificados como
biomateriales. Estos son usados como partes moldeadas o maquinadas,
recubrimientos, fibras, películas, espumas y tejidos.
Tabla 1. Aplicaciones de materiales sintéticos y naturales en la medicina (Buddy D. Ratner, Allan S. Hoffman, Frederick J. Schoen, Jack E. Lemons, 2004)
17
Aplicación Tipos de materiales
Sistema óseo
Reemplazo de articulaciones (cadera,
rodilla)
Titanio, aleación Ti-Al-V, acero
inoxidable, polietileno
Placa ósea para reparación de
fractura
Acero inoxidable, aleación cobalto-
cromo
Cemento para hueso Poli(metil metacrilato)
Reparación de defecto óseo Hidroxiapatita
Tendón y ligamento artificial Teflón, dacron
Implante dental para fijación del diente Titanio, aleación Ti-Al-V, acero
inoxidable, polietileno, alúmina fosfato
de calcio
Sistema cardiovascular
Prótesis de vaso sanguíneo Dracon, teflón, poliuretano
Válvula de corazón Tejido regenerado, acero inoxidable,
carbono
Catéter Caucho de silicón, teflón, poliuretano
Órganos
Corazón artificial Poliuretano
Plantilla para regeneración de piel Composito de silicón- colágeno
Riñón artificial (hemodializador) Celulosa, poliacrilonitrilo
Máquina corazón-pulmón Caucho de silicon
Sentidos
Implante coclear Electrodos de platino
Lentes intraoculares Poli(metil metacrilato), caucho de
silicón, hidrogel
Lentes de contacto Silicón-acrilato, hydrogel
Vendaje corneal Colágeno, hydrogel
Siendo algunos de los dispositivos de mayor aplicación (Buddy D. Ratner,
Allan S. Hoffman, Frederick J. Schoen, Jack E. Lemons, 2004). son:
Prótesis para válvula de corazón.
Prótesis de cadera.
Implantes dentales.
18
Lentes intraoculares.
Dispositivos de asistencia ventricular
Una de las características que juega un papel importante en la microescala
de los materiales para implante es la presencia de porosidad, cavidades o canales
que permitan un crecimiento controlado del tejido hacia el material. Esto no sólo
permite una interconexión entre el material sintético y el tejido del organismo vivo,
también significa un crecimiento interno de vasos sanguíneos (vascularización).
Uno de los mayores retos que se presentan, es que los tejidos vivos tienen
la habilidad de renovarse continuamente mientras que los materiales para
implantes carecen de esta habilidad, por lo que, para lograr un implante exitoso
es necesario combinar los efectos sinérgicos de distintos sistemas de materiales
biomédicos (Sebastian Bauer, Patrik Schmuki, Klaus von der Mark, Jung Park,
2012).
Dentro de los biomateriales más utilizados se encuentra el Titanio y la
Hidroxiapatita.
1.3 RECUBRIMIENTOS DE HA / nAg.
1.3.1 Hidroxiapatita. La Hidroxiapatita forma parte del grupo cerámico de las apatitas. Se ha
probado como hueso artificial en muchas ocasiones, debido a su similitud con el
hueso natural, aun cuando carece de los compuestos orgánicos presentes en él
como son el colágeno y los polisacáridos. La Hidroxiapatita ha sido sintetizada y
19 usada para la manufactura de implantes de diversos tipos (sólidos y porosos) así
como para recubrimientos de otros implantes (Park, 2008).
Se tiene bien documentado que es un material biocompatible y bioactivo.
En los últimos años se han desarrollado diversas rutas para su síntesis. Diversas
investigaciones se han centrado en determinar cómo las propiedades de la HA
pueden ser controladas variando diversos parámetros en los procesos. Debido a
la gran variedad de métodos que existen para su preparación, elegir un
procedimiento puede ser laborioso.
Algunos de los procesos más usados para la síntesis (Mehdi Sadat-Shojai,
2013) son:
Métodos secos:
o Del estado sólido.
o Mecanoquímico.
Métodos húmedos:
o Precipitación química.
o Hidrólisis.
o Sol-gel.
o Hidrotermal.
Procesos de alta temperatura:
o Combustión.
o Pirólisis.
o Síntesis de fuentes biológicas.
o Procedimientos combinados.
20 1.3.2 La plata como agente biocida.
Dentro de los agentes antibacteriales inorgánicos, la plata y los iones de
plata son conocidos por tener efectos inhibidores y bactericidas fuertes, así como
un amplio espectro de actividad antibacterial (Yikai Chen, Xuebin Zheng, Youtao
Xie, Heng Ji, Chuanxian Ding, Huiwu Li, Kerong Dai, 2010).
Por otra parte, aun cuando se sabe que la plata es un gran biocida, el uso
de ésta fue limitado debido a la toxicidad que presentan los iones plata; sin
embargo, la industria de la nanotecnología ha ampliado las posibilidades de su
uso, ya que produce partículas con una gran área superficial, lo que incrementa
la eficiencia pero, más allá de eso, reduce considerablemente la toxicidad.
Las nanopartículas comprenden un tamaño de nanoestructuras formadas
a partir de átomos de plata que están metálicamente unidos. En la escala
nanométrica, las partículas exhiben diferentes propiedades físicas, ópticas y
químicas debido al predominio de la mecánica cuántica.
Un estudio comparativo entre nanopartículas de plata, nitrato de plata y
cloruro de plata reveló que las nanopartículas poseen una potencia antibacterial
mayor que los iones de plata libres. Esto sugiere que las nanopartículas poseen
propiedades antibacteriales intrínsecas que no dependen de la elución de la plata
(Ag+)
Como es bien sabido, su efecto antibacterial abarca muchas especies, las
cuales se muestran en la Tabla 2 (Karla Chaloupka, Yogeshkumar Malam,
Alexander M. Seifalian, 2010).
21 Tabla 2. Compilación de estudios recientes de actividad antibacterial de nAg (Karla Chaloupka, Yogeshkumar Malam, Alexander M. Seifalian, 2010).
Microorganismo evaluado Resultado
E. coli, Vibrio cholera, P.
aeruginosa, Salmonella
typhi
El efecto bactericida de las nanopartículas
depende de su tamaño, siendo las de menor
tamaño agentes más potentes. La morfología
también resulta importante, las nAg
octahedrales o decahedrales tuvieron facetas
reactivas más elevadas.
Enterococcus faecalis, S.
aureus, E. coli, P.
aeruginosa, S. epidermidis,
Enterococcus faecium,
Klebsiella pneumoniae
Diferentes sacáridos fueron utilizados para la
formación de nAg de diferentes tamaños; las de
menor tamaño exhibieron mayor actividad
antibacterial contra diferentes bacterias. Las
concentraciones de inhibición mínimas fueron
1.69-54.00 µg/mL.
E. coli, S. thypi, S. aureus El efecto antibacterial de las nanopartículas fue
dependiente de su dosificación; las nAg fueron
más potentes contra bacterias Gram negativo
(E. coli y S. thypi) que contra bacterias Gram
positivo (S. aureus).
E. coli (4 cepas), Bacillus
suvtilis (3 cepas), S. aureus
(3 cepas)
Algunas cepas de E. coli fueron más
resistentes al efecto bactericida de las nAg que
las cepas de S. aureus, contradiciendo trabajos
anteriores que reportan mayor sensibilidad a la
plata en las bacterias Gram negativas que en las
Gram positivas; se atribuye esto a que los
estudios previos sólo fueron hechos con una
cepa de cada bacteria en lugar de múltiples
cepas.
22 Sin embargo, a pesar de las propiedades únicas de las nanopartículas de
plata como antibacterial, resulta preocupante su potencial de citotoxicidad, el
cómo y qué induce la citotoxicidad es un tema que no se tiene bien entendido.
Se ha sugerido que las nAg, como antibacterial, actúan como caballos de
Troya, entrando en la célula y posteriormente liberando iones plata, lo cual daña
las funciones intracelulares. Sin embargo, Kim et al. han argumentado que la
citotoxicidad de las nAg es ante todo el resultado de un estrés oxidativo e
independiente de la toxicidad de los iones plata. Un mejor entendimiento de éste
es crucial para una evaluación precisa de la citotoxicidad de las nAg (Huiliang
Cao, Xuanyong Liu, Fanhao Meng, Paul K. Chu, 2010).
1.3.3 Síntesis verdes.
1.3.3.1 Obtención de Hidroxiapatita de fuentes naturales.
La HA (Ca10(PO4)6(OH)2) es el principal mineral constituyente en los
huesos y dientes humanos, en general con una relación Ca/P de 1.67. La HA no
sólo es biocompatible, sino también bioactiva. Adicionalmente la HA puede unirse
directamente con el hueso receptor, por lo que es usada en diversas aplicaciones
ortopédicas (Sawittree Rajitanapanich, 2014).
Sin embargo, existen diferencias cuando se compara HA sintética contra
HA biológica, la última presenta una mejor actividad metabólica y mayor respuesta
dinámica al ambiente que la sintética. Por lo que resulta lógico pensar que la HA
biológica presente mejores resultados como implante o material para
recubrimiento (M. Boutinguiza, 2011).
23 Como se mencionó con anterioridad, se han desarrollado diversos métodos
para sintetizar HA mediante diferentes precursores sintéticos, cuya finalidad es
obtener HA de alta pureza y buenas propiedades mecánicas. Sin embargo, estos
pueden ser complicados, tardados y costosos (M. Boutinguiza, 2011). La
estequiometría de la HA preparada bajo éstos métodos carece de la presencia de
trazas de iones, contrario al hueso que es considerado por si solo como HA no
estequiométrica debido a la presencia de iones, lo cual beneficia a la estructura
cristalina. Por otro lado la HA derivada de fuentes naturales y biodesperdicios es
no-estequiométrica debido a las trazas de iones incorporados en la estructura del
cristal, como Fe2+, Mg2+, Si2+ y F-, por lo que el desarrollo de HA procedente de
fuentes naturales, tales como: cáscara de huevo, conchas, escamas de pescado
(Yi-Cheng Huang, Pei-Chi Hsiao, Huey-Jine Chai, 2011), huesos de pescado,
bovino y porcino, entre otros; resulta de gran importancia en el uso de implantes
con características óseas (P. Kamalanathan, S. Ramesh, L.T. Bang, A. Niakan,
C.Y. Tan, J. Purbolaksono, Hari Chandran, W.D. Teng., 2014), puesto que
presentan la ventaja de preservar algunas propiedades del material precursor
como su composición química y estructura (M. Boutinguiza, 2011).
En el 2013, Shih-Ching Wu et al. utilizaron cáscaras de huevo para la
producción, logrando HA nanométrica sin otras fases presentes; sin embargo, sí
la presencia de carbonatos así como Na, Mg y Sr con una nanoestructura
cilíndrica (Shih-Ching Wu, 2013). Mientras en el 2014 Sawittree Rujitanapanich et
al. hicieron uso de la precipitación cuyos precursores fueron polvo de conchas de
24 ostras, HNO3 y (NH4)2HPO2, obteniendo nanocristales de HA (Sawittree
Rajitanapanich, 2014).
La extracción de HA biológica a través de calcinación de bioresiduos
(huesos de pescado, bovino y porcino, así como dientes) ha venido utilizándose
recientemente, debido a la simplicidad que conlleva el método, así como lo
económico del mismo. La calcinación directa del hueso se efectúa con el objetivo
de lograr la descomposición del colágeno y otros compuestos orgánicos (Nasser
A.M. Barakat, Myung Seob Khil, A.M. Omran, Faheem A. Sheikn, Ha Yong Kim.,
2008).
En el 2008, Nasser A.M. Barakat et al. desarrollaron un estudio donde
implementaron tres métodos diferentes (procesamiento con agua suscritica,
hidrólisis hidrotermal alcalina y descomposición térmica) para la extracción de HA
natural a partir de huesos bovinos. Sus resultados reportan que dichos procesos
presentan ventajas de simplicidad en el proceso sobre las técnicas más
convencionales; dentro de los tres procesos empleados, la HA obtenida mediante
descomposición térmica (750°C) presenta mejor morfología, mientras bajo los
otros dos métodos se obtienen tamaños de partícula más pequeños (Nasser A.M.
Barakat, Myung Seob Khil, A.M. Omran, Faheem A. Sheikn, Ha Yong Kim., 2008).
En el 2011, M. Boutinguiza et al. obtuvieron HA a partir de huesos de peces
mediante calcinación a 600 y 950°C. La HA contenía HA carbonatada del tipo B
(similar a la HA humana), así como presencia de elementos como Na, K, Mg y Sr
(M. Boutinguiza, 2011).
25 Para el 2015, W. Khoo, et al. reportaron la obtención de HA a partir de
fémur bovino mediante calcinación a 700, 900 y 1100°C. Sus resultados arrojan
que no existe otra fase en la HA obtenida; sin embargo a los 700°C aún contiene
carbonatos que desaparecen al incrementar la temperatura (W. Khoo, 2015).
1.3.3.2 Obtención de nanopartículas de plata con plantas.
Existen muchas formas para la síntesis de nanopartículas de plata. Estas
incluyen los métodos físicos, químicos y biológicos. Los métodos químicos y
físicos son más numerosos; el problema con estos métodos es que su síntesis es
costosa y pueden absorber sustancias químicas del proceso.
La síntesis de nanopartículas se puede llevar a cabo por dos vías, las
llamadas “top-down” y “bottom-up”. Los métodos “top-down” involucran la
molienda mecánica de un metal, mientras que los métodos “bottom-up” incluyen
la reducción de metales, métodos electroquímicos y la sonodescomposión.
El método más utilizado industrialmente es una reducción de la sal de
AgBF4 por medio de NaBH4 en medio acuoso. Un método electroquímico lleva
acabo la electroreducción de AgNO3 en una solución acuosa en presencia de
polietilenglicol. La sonodescomposición es una reducción sono-química en una
solución acuosa de AgNO3 en una atmósfera controlada de argón-hidrógeno.
Existen también técnicas como síntesis por microondas, descomposición térmica
en solventes orgánicos, síntesis crioquímica (Sukumarahn Prabhu, 2012),
evaporación-condensación, fotoreducción iniciada por UV, ablación láser,
microemulsiones (Kholoud M-M- Abou El-Nour, 2010), entre otras.
26 La síntesis biogénica es útil no sólo por su bajo impacto ambiental,
comparada con algunos métodos fisicoquímicos; sino también porque se puede
usar para producir grandes cantidades de nanopartículas que son libres de
contaminación y, tienen una forma y tamaño bien definido.
La habilidad de reducir los iones metálicos que tienen los extractos de
plantas fue encontrada a comienzos de 1900, sin embargo no se tenía un buen
entendimiento de la naturaleza de los agentes reductores. En vista de su
simplicidad, el uso de plantas vivas, sus extractos o tejidos para la reducción de
las sales a nanopartículas ha captado una atención considerable en los últimos
30 años.
Las biomoléculas presentes en los extractos de plantas pueden ser usadas
para la reducción de iones metálicos a nanopartículas en un proceso de síntesis
verde de un solo paso. Los agentes reductores presentes en las plantas incluyen
varios metabolitos solubles en agua (alcaloides, compuestos fenólicos,
terpenoides) y co-enzimas.
Los procesos donde se usan extractos de plantas son fácilmente
escalables y mucho menos costoso comparado con los procesos microbianos o
con plantas enteras.
Los extractos de plantas actúan tanto como agente reductor como agente
estabilizador. La fuente del extracto de planta es conocida por tener influencia en
las características de las nanopartículas. Esto debido a que los diferentes
extractos contienen diferentes concentraciones y combinaciones de agentes
reductores orgánicos. Normalmente, una bioreducción con extracto de plantas
27 requiere mezclar el extracto acuoso en una solución acuosa de la sal metálica en
cuestión. La reacción ocurre a temperatura ambiente y generalmente se realiza
en unos minutos. Debido a la gran cantidad de diferentes compuestos químicos
presentes, el proceso de bioreducción es relativamente complejo. (Amit Kumar
Mittal, 2013)
La síntesis utilizando microorganismos o plantas elimina el tema de los
residuos químicos y forma nanopartículas más biocompatibles. (A. Abduz Zahir,
2012)
1.3.4 Recubrimientos de HA/nAg. Teniendo como objetivo la prevención de costosas terapias e inclusive la
remoción del implante, es de vital importancia el desarrollo de recubrimientos que
provean simultáneamente una excelente actividad antibacterial así como su
osteointegración (Daniela Ionita, Mihaela Grecu, Camelia Ungureanu, Ioana
Demetrescu, 2011), por lo que, los recubrimientos de HA son ampliamente
utilizados en el ámbito clínico; así mismo, aquellos con nAg ya han sido estudiados
con anterioridad. Se han empleado diferentes métodos de preparación de
recubrimientos HA/nAg, como el Sputtering, intercambio iónico, método sol-gel,
implantación iónica, proyección térmica por plasma, etc. (Yikai Chen, Xuebin
Zheng, Youtao Xie, Heng Ji, Chuanxian Ding, Huiwu Li, Kerong Dai, 2010).
A.A. Yanovska et al. desarrollaron recubrimientos de HA dopados con nAg
sobre sustratos de Ti6Al4V mediante deposición asistida por temperatura
obteniendo recubrimientos uniformes con espesores de 120m. Así mismo
tuvieron efecto bactericida sobre la cepa E. coli (A.A. Yanovskka, 2013).
28 Por otro lado, Yikai Chen et al. desarrollaron recubrimientos de HA con nAg
mediante Vaccum Plasma Spray (VPS), que es una técnica de proyección térmica
por plasma al vacío. Como resultado se obtuvieron recubrimientos con
microfracturas y porosidad, así mismo se sugiere buena bioactividad pues se
propició la formación de apatita en la superficie. Se demostró que la rugosidad
afecta la bioactividad pues acelera la nucleación de apatita (Yikai Chen, Xuebin
Zheng, Youtao Xie, Heng Ji, Chuanxian Ding, Huiwu Li, Kerong Dai, 2010).
29
1. JUSTIFICACIÓN.
El área de biomateriales tiene un gran reto: generación de materiales
óptimos para su desempeño dentro de un sistema biológico. Específicamente, los
implantes para reemplazar piezas óseas buscan tener resistencia mecánica
adecuada, diseño perfecto, promover la osteointegración y prevenir infecciones
bacterianas. Es por ello que, la finalidad de esta investigación es la obtención de
un recubrimiento que cubra dicha demanda, con la ventaja de ser producto de
procesos verdes, con base en: la extracción de Hidroxiapatita de huesos bovinos
mediante un tratamiento térmico, y el uso de nanopartículas de plata sintetizadas
mediante extracto de nopal como agente reductor.
2. HIPÓTESIS.
El desarrollo de un recubrimiento de síntesis totalmente verde (HA-hueso
bovino / nAg-extracto de nopal), presentará las mismas propiedades: actividad
antibacterial y citotoxicidad observadas en recubrimientos de HA-nAg procesados
mediante síntesis química y/o mecánica.
3. OBJETIVO.
Desarrollar y caracterizar un bio-recubrimiento basado en un composito de
HA / nAg (hidroxiapatita extraída de una fuente natural / nanopartículas de plata
soportadas en una matriz de extracto de nopal), aplicado sobre un sustrato de
Ti6Al4V mediante proyección térmica por plasma (APS).
30
3.1. Objetivos específicos.
• Desarrollar polvos de Hidroxiapatita extraída de fuente natural.
• Caracterizar las propiedades de polvos de HA obtenidos, mediante:
• FT-IR, ICP-OES, XRD, SEM, PSD, análisis BET.
• Caracterizar mediante SEM la morfología superficial de recubrimientos:
HA, HA/1%nAg.
• Caracterizar deposición de apatita sobre recubrimiento de HA cuando está
en contacto con solución de fluidos corporales simulados (SBF; simulated
body fluid, por sus siglas en inglés).
• Evaluar biocompatibilidad de recubrimientos HA e HA/1%nAg empleando
los ensayos: electroforesis unicelular (cometa) y citometría de imagen.
• Evaluar actividad y eficiencia antibacterial del recubrimiento HA/1%nAg de
acuerdo a la norma JIS Z2801:2000, en: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus y Pseudomonas aeruginosa.
31
CAPITULO II.
EXTRACCIÓN DE HIDROXIAPATITA BIOLÓGICA.
2.1 TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN.
Dentro de las múltiples alternativas verdes para la obtención de HA, un
proceso bastante simple es el tratamiento térmico de huesos animales. Un
tratamiento previo de los huesos también representa una variable dentro de este
proceso, dependiendo de los objetivos de la investigación o los recursos con los
que cuenta la misma; sin embargo, la base de este proceso es el contacto directo
de los huesos al calor; considerando también el tiempo y la temperatura de
tratamiento como variables del proceso.
Durante la obtención de HA biológica fueron requeridas las siguientes
técnicas de caracterización:
Infrarrojo.
Por más de un centenario esta técnica ha sido apreciada puesto que es de
los pocos análisis no destructivos que brinda información acerca de los enlaces
químicos en el material. La utilidad potencial del IR es función de los enlaces
químicos presentes.
El objetivo básico del IR es determinar cambios en la intensidad del haz de
radiación infrarroja como función de la longitud de onda o frecuencia, antes de
32 interactuar con la muestra; la pieza central del IR es el espectrofotómetro de
infrarrojo, cuya función es dispersar la luz de la gran banda de infrarrojo y medir
su intensidad a cada frecuencia. El cambio en la intensidad, antes y después de
que la radiación interactúe con la muestra es determinada y esta tasa de cambio
contra la frecuencia da como resultado el espectro infrarrojo (C. Richard Brundle,
FTIR. Fourier Transform Infrared Spectroscopy, 1992).
TGA-DSC.
El análisis térmico mide los cambios físicos o químicos en un material como
función de la temperatura. Dos técnicas complementarias comunes en esta
categoría son calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis
termogravimétrico (TGA). Estos métodos son típicamente usados para determinar
las propiedades de materiales. El análisis térmico diferencial (DTA) es un método
similar al DSC, pero se lleva a cabo a mayores temperaturas para metales,
minerales, cerámicos y vidrios.
DSC: La calorimetría diferencial de barrido mide el flujo de calor hacia o
desde la muestra como función de la temperatura y el tiempo. La cantidad de
energía absorbida (endotérmico) o liberada (exotérmico) mientras la muestra sufre
cambios físicos o químicos (fusión, cristalización, curación) es medida en calorías
como función del cambio de temperaturas. Los cambios en la capacidad calorífica
(transición vítrea) también son detectados.
TGA: El análisis termogravimétrico mide continuamente el peso de la
muestra como función de la temperatura y el tiempo. Los cambios de peso
33 observados a temperaturas específicas correlacionan la volatilización de los
componentes de la muestra, descomposición, reacciones de oxidación/reducción,
u otras reacciones o cambios (Materials Evaluation and Engineering, Thermal
Analysis, 2001).
Difracción de rayos x.
La difracción de rayos X (XRD) es una poderosa herramienta utilizada para
la identificación singular de las fases cristalinas presentes en los materiales y para
medir sus propiedades estructurales (estado de formación, tamaño de grano,
epitaxia, composición de fases, orientación preferencial, y defectos en la
estructura) de las fases. La XRD también es utilizada para determinar el espesor
de películas delgadas y multicapas, los arreglos atómicos en materiales amorfos
(incluyendo polímeros) y en las interfaces. Es una prueba no destructiva, lo cual
la hace ideal para estudios in situ (C. Richard Brundle, XRD. X-Ray Difracction,
1992).
Microscopia electrónica de barrido.
La microscopía electrónica de barrido (SEM) es la principal herramienta
elegida para iniciar el estudio de un material. Provee al investigador imágenes
superficiales de alta magnificación. No sólo ofrece información topográfica sino
también de composición química (cuantitativo y cualitativo) de regiones cercanas
a la superficie.
34 Existen tres tipos principales de imágenes obtenidas por un SEM:
electrones secundarios, electrones retrodispersados y mapas elementales
mediante rayos X. Convencionalmente, los electrones secundarios y
retrodispersados son separados de acuerdo a su energía (C. Richard Brundle,
SEM. Scanning Electron Microscopy, 1992).
Los electrones secundarios proveen imágenes de alta resolución de la
morfología superficial. Los electrones retrodispersados proveen imágenes con
contaste como función de la composición elemental, así como morfología
topográfica.
La espectroscopía de energía dispersiva por rayos X (EDS o EDX), es una
técnica de microanálisis químico usada en conjunto con el análisis superficial. La
técnica detecta los rayos X emitidos por la muestra durante el bombardeo de
electrones, caracterizando así su composición elemental (Materials Evaluation
and Engineering, Scanning Electron Microscopy, 2001).
Distribución de tamaño de partícula.
Durante siglos los científicos han tratado de predecir las formas en que las
partículas dispersan y absorben luz. Existen muchas teorías y modelos que se
pueden usar. Una de las teorías usadas más simples es el modelo Fraunhofer.
Este modelo puede predecir el patrón de dispersión que es creado cuando un
sólido opaco de un tamaño conocido y en forma de disco es pasado a través del
haz de un láser.
35 Este modelo es funcional para muchas partículas pero no describe la
dispersión exactamente. Muy pocas partículas tienen forma de disco y muchas
son transparentes. La teoría Mie fue desarrollada para predecir el trayecto de la
luz al ser dispersada por partículas esféricas y se ocupa de la forma en que la luz
atraviesa, o como es absorbida por la partícula. Esta teoría es más precisa pero
asume que se tiene información específica acerca de la partícula, como el índice
de reflexión y su absorción.
La clave dentro de estas teorías es que si se sabe el tamaño de la partícula
y otros detalles de su estructura, se puede predecir de manera muy precisa la
forma en que será dispersada la luz. Cada tamaño de partícula tendrá su propio
patrón de dispersión característico, como una huella digital que no se parece a
ninguna otra partícula de otro tamaño.
El análisis de Distribución de tamaño de partícula funciona al revés a partir
de las teorías antes mencionadas, de manera que usándolas se puede predecir
el tamaño de partícula que creó ese patrón (Ltd., 1997).
Análisis BET.
La adsorción de gases es un análisis comúnmente usado para la medición
de áreas superficiales y porosidad. Esto implica exposición de los materiales
sólidos a materiales gaseosos o vapores a una variedad de condiciones y se
evalúa ya sea el incremento en el peso o el volumen de la muestra. Analizar estos
datos nos provee de información respecto a sus características físicas,
36 incluyendo: densidad (𝜌𝑠), porosidad, volumen total de poro y distribución de
tamaño de poro.
La técnica Brunauer, Emmett y Teller (BET) es uno de los métodos más
comunes para la determinación del área superficial de polvos y materiales
porosos. El nitrógeno es el gas que se emplea generalmente como molécula de
prueba y es expuesto al sólido en cuestión a condiciones de nitrógeno líquido (77
K). El área superficial del sólido es evaluado a partir de la medición de la
capacidad de la monocapa y el conocimiento del área de sección transversal de
la molécula que se está usando como prueba. Que en el caso del nitrógeno, se
toma como 16.2 Å2/molécula (Dr John M. Zielinski, 2013).
ICP-OES.
El plasma de acoplamiento inductivo (ICP) es una fuente de ionización que
junto a un espectrofotómetro de emisión óptico (OES) constituye el equipo de ICP-
OES. En esta técnica, la introducción continua de la muestra líquida y un sistema
de nebulización forma un aerosol que es transportado por el argón a la antorcha
del plasma, acoplado inductivamente por radio frecuencia. En el plasma, debido
las altas temperaturas generadas, los analitos son atomizados e ionizados
generándose los espectros de Emisión atómicos de líneas características. Los
espectros son dispersados por la red de difracción y el detector sensible a la luz
se encarga de medir las intensidades de las líneas. La información es procesada
por el sistema informático. (Laboratorio de Técnicas Instrumentales )
37
2.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL.
2.2.1 Materiales.
Materiales Reactivos
Olla de lento cocimiento. Hueso bovino (Tibia).
Recipientes herméticos. H3PO4.
pH-ímetro.
Dispositivo de aspas.
Horno (Thermolyne F46240CM).
2.2.2 Metodología. En el siguiente apartado se explica cuáles fueron las variables para el
desarrollo y optimización del proceso de extracción de polvos de hidroxiapatita
biológica, así como la caracterización de los polvos obtenidos. De la misma
manera, se realizó la caracterización de polvos de HA comercial para realizar un
comparativo en sus características físico-químicas, sirviéndonos estos resultados
como patrón.
2.2.2.1 Extracción de HA biológica.
A continuación se describe la metodología empleada para la extracción de HA a
partir de hueso bovino:
Manualmente se retiró la mayor cantidad de carne y grasa posible del
hueso. Se colocó en un recipiente de lento cocimiento: 30 minutos a 50 °C,
posteriormente 8 hr a 90°C; con la mínima cantidad de agua (únicamente la
38 necesaria para cubrir los huesos). Se secó y separó la parte dura del hueso de la
parte blanda (médula ósea), y se enfrió a temperatura ambiente.
Los huesos fueron colocados en un recipiente con tapa hermética en el cual
se adicionó H3PO4 en solución, hasta cubrir completamente los huesos,
manteniendo un pH constante de 2.4, durante 8 h. Posteriormente, los huesos se
extrajeron de la solución, dejándose escurrir por 5 minutos.
Para asegurar la eliminación de agua, los huesos se secaron en horno a
250°C durante 2 hr. Posteriormente se dejaron enfriar a temperatura ambiente y
se molieron con un dispositivo de aspas hasta obtener polvo (primera fase de
extracción).
Finalmente, para la extracción de la HA biológica, los polvos obtenidos se
sometieron a las temperaturas y tiempos de procesamiento mostrados en la
Tabla 3. Durante todo el proceso de extracción se realizaron las pruebas de
caracterización mostradas en la Tabla 4. Una vez determinados los polvos de HA
con las mejores características (Ca/P, trazas de iones, fases presentes,
cristalinidad, entre otras), se emplearon para el desarrollo de los recubrimientos.
Tabla 3. Tiempos y temperaturas de exposición para la extracción de HA a partir de hueso bovino.
6 hr 8 hr 12 hr
600°C X X X
750°C X X X
1000°C X X X Tabla 4. Diseño de experimentos para la caracterización de los polvos de
HA biológica.
39
HA comercial
Polvos primera
fase
HA biológica (polvos segunda
fase)
IR X X X
TGA-DSC X
XRD X X X
SEM X X X
PSD X X X
BET X X X
2.3 RESULTADOS.
Con la finalidad de determinar si las características de la HA biológica
procesada en la presente tesis, presenta propiedades similares o superiores a la
HA disponible comercialmente; se caracterizarán en primer plano las propiedades
de la HA comercial, para tales resultados ser considerados como elementos de
referencia.
2.3.1 Caracterización de polvos de HA comercial. El análisis mediante XRD (PANalytical X’Pert PRO) (Figura 2), con base en
la ficha del ICDD 00-074-0565, indica que la muestra identificada como HA
comercial, corresponde al patrón de indexación de la HA.
40
Figura 2. Patrón de XRD de Hidroxiapatita comercial. * HA
El espectro obtenido mediante FT-IR (Perkin Elmer Spectrum 6X (Figura 3)
muestra las bandas características de las vibraciones moleculares de la HA.
Las bandas características del grupo fosfato (PO4-3) se dividen en tres
regiones:
o La primera consiste en tres picos ubicados en 1087, 1014 y 961 cm-
1.
o La segunda región se ve representada en los picos en 631, 598 y
558 cm-1.
o La tercera región es definida por un pico de baja intensidad ubicado
en 475 cm-1.
10 20 30 40 50 60 70
0
2000
4000
6000
8000
10000
****
*
***
*****
****
*
*
*
* ***
******
****
****
*
***
*
*
*
*
*
****
*
**
*
*
*
*
*
*
*
***
*
Inte
nsid
ad
2
HA com
*
41
La banda relacionada a los iones hidroxilo se encuentra en los 3572 cm-1,
con una intensidad muy baja.
Finalmente, en 1472 y 894 cm-1 están presentes bandas de los iones
carbonato.
En el análisis hecho por EDS (HITACHI SU3500) se muestra que se trata
de un compuesto que contiene oxígeno, fósforo, calcio, silicio y magnesio.
Figura 3. a) Espectro IR de Hidroxiapatita comercial. b) Acercamiento a bandas de baja intensidad. c) Acercamiento a bandas de alta intensidad
a)
c)
b)
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
3500 3000 2500 2000 1500
0,02
0,04
1000 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
OH-
PO4
-3
CO3
-2
1472
475
558
598
631
961
1014
1087
3572
894
A b
s
o
r
b
a
n
c
i a
(cm-1)
42 Los resultados por ICP-OES muestran que la hidroxiapatita comercial tiene una
relación de Ca/P de 1.69, el cual es un valor un poco superior al que se maneja
de manera estequiométrica: 1.67. En la Tabla 5 se muestran los porcentajes de
los elementos analizados.
. Tabla 5. Porcentaje de elementos presentes, obtenidos por ICP-OES, en HA comercial.
Ca % P % K % Mg % Na % Si % Ca/P
HA comercial 29,989 17,655 0,022 0,188 0,002 0,215 1,69
La detección de otros compuestos, ya sean otras fases del fosfato o
carbonatos de calcio mediante XRD es muy complejo puesto que la hidroxiapatita
es un compuesto que presenta muchas reflexiones que hacen que la identificación
de otros compuestos o fases sea una tarea complicada. Sin embargo, de acuerdo
a estos resultados preliminares, nos damos cuenta de que dicha hidroxiapatita
Figura 4. EDS (significativo) de HA comercial.
43 comercial no es pura, como aparentemente lo mostraba en el patrón de XRD, ya
que se tiene la presencia de picos en 1472 y 894 cm-1 en el patrón de FT-IR que
indican que se encuentra carbonatada; sin embargo, su concentración resulta tan
pequeña que no fue detectable mediante ICP-OES.
Mediante SEM (HITACHI SU3500) se observó que la morfología superficial
de las partículas de HA comerciales son relativamente irregulares, pero en general
se puede decir que son esféricas. La superficie de las partículas es rugosa y se
observa que tiene poca porosidad (Figura 5).
Figura 5. Morfología superficial de partículas de hidroxiapatita. 10,000 X.
44 El análisis BET indica que dichos polvos tienen muy poca porosidad, por lo
que en su mayoría, la poca área superficial que posee: 0.42 m2/g, se debe al
tamaño de partícula en sí, más allá de su porosidad. Lo anterior se puede observar
en la Figura 6. Según la caracterización realizada para la PSD, se tiene una media
de 52.827 µm, como se puede observar en la Figura 7.
Figura 6. Isoterma BET tipo II - no porosos - de hidroxiapatita comercial.
Figura 7. Distribución de tamaño de partícula. Hidroxiapatita comercial.
2.3.2 Desarrollo y caracterización de polvos de HA obtenidos mediante calcinación de hueso bovino (HA biológica). En el siguiente apartado se presentan los resultados del desarrollo de los
polvos HA biológica y de las pruebas de caracterización realizadas a los mismos.
45 2.3.2.1 Primera fase de extracción: Fragilización de hueso, trituración y
caracterización de polvos obtenidos.
En la literatura se reportan estudios de obtención de HA mediante procesos
térmicos bajo diversas condiciones de trabajo, algunos con tratamientos previos
que ayudan a su extracción. En la presente investigación, se evaluó la efectividad
de una fragilización mediante el uso de H3PO4. En la Figura 8 se muestran los
pasos utilizados para la extracción de HA biológica.
Huesos limpios
Calentar en agua 8h, 90°C
H3PO4
Calentar 2h, 250°C
Triturar hasta polvo
Calcinar 800°C, 6h
Caracterización
24h, pHinicial 2.4
8h, pHcte 2.4
Figura 8. Diagrama para la extracción de la HA biológica.
46 El patrón de XRD corrobora que el hueso (HS) contiene HA (Figura 9) y
aunque el espectro no está bien definido debido a que aún existe gran cantidad
de materia orgánica en la matriz, se logran indexar algunos de los picos más
representativos de la HA (Figura 10). De forma contraria, se puede observar que
la muestra de médula ósea (MDS) es completamente amorfa, según su patrón de
XRD (Figura 9), lo cual indica que se trata de una muestra con alto contenido
orgánico.
Figura 9. Patrón de XRD, comparativo, de la primera fase de extracción de HA contra HA comercial.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
Inte
nsid
a r
ela
tiva
2
MDS
HS
HA com
47
Figura 10. Patrón de XRD de polvos obtenidos en la primera fase de extracción de HA – Hueso. * HA
En la Figura 11 se presentan los espectros obtenidos mediante FT-IR. La
muestra MDS presenta picos relacionados con materia orgánica en 2916, 2850 y
720 cm-1. Así mismo, existe una serie de bandas entre 1741 y 1173 cm.1, las
cuales se relacionan con vibraciones en enlaces entre carbono y oxígeno
(carbonatos). Por otro lado, la muestra HS presenta las bandas del grupo fosfato
(mismas que se presentan en la muestra de HA comercial (Ver Figura 3), sin
embargo, también presenta picos en 2916 y 2850 cm-1 (materia orgánica), así
como los picos del ion carbonato ubicados entre la región 1741-1173 cm-1, y 871
cm-1.
20 30 40 50 60 70 80
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
**
** *
*
**
Inte
nsid
ad
2
HS
*
48
Figura 11. Comparación de espectros IR de polvos de HA comercial con polvos HS y MDS obtenidos en la primera fase de extracción.
Debido al alto contenido de materia orgánica presente en la muestra MDS
su residuo inorgánico es despreciable, siendo este de 0.5928%; mientras que la
muestra HS tiene un residuo inorgánico de 72.13 %, como se puede apreciar en
la gráfica obtenida mediante el análisis termogravimétrico que se muestra en la
Figura 12. En el análisis termogravimétrico-calorimetría de barrido (TGA-DSC) se
aprecia que la materia orgánica comienza a degradarse alrededor de los 250°C y
la estabilización de la muestra se da aproximadamente en 725°C (Figura 13).
4000 3000 2000 1000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
C-H
CO3
-2
720
1173
1741
871
2850
Ab
so
rba
ncia
(cm-1)
HS
MDS
HAcom
2916
49
Figura 12.Pérdida de peso por TGA de los polvos obtenidos en la primera fase de extracción: Hueso y Médula ósea. Atmósfera de aire.
Figura 13. Pérdida de peso y flujo de calor por TGA-DSC de los polvos HS obtenidos en la primera fase de extracción. Atmósfera de aire.
0 200 400 600 800 1000
0
20
40
60
80
100
%P
eso
Temp
HS
MDS
72.1382%
0.5928%
0 200 400 600 800 1000
70
75
80
85
90
95
100
%Peso
Flujo de Calor
Temp
%P
eso
401.8°C
459.4°C
581.5°C
725.0°C
72.13%-50
0
50
100
150
200
250
300
Flu
jo d
e C
alo
r
TGA-DSC Hueso (HS)
354.5°C
50 Con base en lo anterior, se excluye el uso de médula ósea para la obtención
de HA biológica debido a la despreciable cantidad de materia inorgánica que
contiene.
El análisis BET reveló una isoterma del tipo II, denotando la existencia de
mesoporos (Figura 14) que comprenden desde los 27.42 Å hasta 296.29 Å. El
área superficial es de 31.74 m2/g. La gran porosidad que presentada se atribuye
a su alto contenido orgánico.
Figura 14. Isoterma BET tipo IV – mesoporos - de polvos HS
HS presenta una distribución de tamaño de partícula media de 95.884
µm, según la PSD (Figura 15).
51
Figura 15. Distribución de tamaño de partícula. Hueso triturado. HS.
2.1.1.1 Segunda fase de extracción: Calcinación y caracterización de polvos.
En el siguiente apartado se presentan los resultados de las diferentes
técnicas de caracterización a las que fueron sometidos los polvos obtenidos
mediante calcinación. Dicha calcinación se divide en dos etapas, la primera es
una etapa general, para estimar el rango de temperaturas y tiempo en el que la
obtención de HA biológica es más adecuada, cuya matriz es 600, 750, y 1000°C
durante 6, 8 y 12 horas; la segunda es una etapa específica, donde se determinó
la temperatura bajo la cual se realizará la extracción: 800°C. Para esta parte de la
experimentación se utilizó un equipo Thermolyne F46240CM, con una rampa de
calentamiento de 10°C/min.
2.1.1.1.1 Calcinación a 600°C. Visualmente puede observarse que al concluir la etapa de calcinación, los
polvos presentan una superficie blanquecina, mientras debajo de ella el color del
polvo es gris (Figura 16), denotando a simple vista que no se llevó a cabo una
52 calcinación exitosa. Los espectros de XRD indican presencia de HA, sin embargo,
la muestra es amorfa, tal como se observa en la Figura 17.
Figura 16. Polvos obtenidos por calcinación de hueso bovino a 600°C durante 12h.
La caracterización por FT-IR indica que no existe diferencia significativa
entre 6 y 8 h de calcinación. Sin embargo, al aumentar a 12 h, la intensidad de los
picos disminuye, como se muestra en la Figura 18; indicando que se están
perdiendo enlaces pertenecientes a determinada banda, o pico; es decir, que la
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
******* ********
*****
**
***
*
*
*
*
*
**
*
***
Inte
nsid
ad
re
lativa
2
6h
8h
12h
*
*
* * *
*
**
*
*
*
*
*
* * *
**
**** *
* * * * * * ** * * * * * * *
*
* * *
*
**
*
*
*
*
*
* * *
**
**** *
* * * * * * ** * * * * * * *
53 materia se está degradando. Los picos correspondientes a este espectro se
presentan en la Tabla 6.
Figura 17. Patrón de XRD de los polvos obtenidos a 600°C con 6, 8 y 12 h de
exposición. * HA.
Los resultados por ICP-OES muestran que a 600°C se tiene una relación
de Ca/P por encima de la relación estequiométrica que tiene la hidroxiapatita
(1.67) (Tabla 7); esto indica que se tienen más átomos de Ca que P, es decir,
existen más fases en la muestra que debido a lo amorfo de la misma, resulta casi
imposible identificar en este punto. Así mismo se presenta el porcentaje obtenido
de diversos elementos que están presentes en las muestras.
Al tratarse de partículas que inicialmente contienen orgánicos, es de
esperarse que al calcinarse se presente una reducción de tamaño debido a la
pérdida de materia y la sinterización.
Mediante el análisis BET se determinó el área superficial de las muestras.
La Tabla 8 muestra los resultados condensados, en los cuales se observa que la
hidroxiapatita comercial tiene poca porosidad y las muestras calcinadas a 600°C
tienen gran área superficial debida a la gran porosidad que presentan.
Tabla 6. Picos del espectro FT-IR de las muestras calcinadas a 600°C.
600°C
HA com (cm-1) 6 h 8 h 12 h
OH- 3573 3573 3574 3572
CO3-2 1455 1455 1454 1472
54
1416 1416 1415 -
873 873 872 894
PO4-3
1087 1087 1088 1087
1021 1020 1024 1014
962 962 962 961
629 629 631 631
600 600 601 598
561 561 562 558
475 474 477 475
55
4000 3000 2000 1000 0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
4000 3000 2000
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
OH-
PO4
-3
CO3
-2
6h
8h
12h
HAcom
141614553575
475
561600
62996210211087 873
A b
s
o
r
b
a
n
c
i a
(cm-1)
Figura 18. Espectro FT-IR para polvos calcinados a 600°C durante 6, 8 y 12 h de
exposición.
Por otro lado, tenemos la PSD (Tabla 9) donde se observa una reducción
de tamaño de partícula entre el 6 y 13% respecto a la muestra HS. Dicho tamaño
se encuentra dentro del tamaño apropiado para ser empleado en el sistema de
proyección térmica por plasma.
56 Tabla 7. Porcentaje de elementos presentes, obtenidos por ICP-OES, en los polvos calcinados a 600°C.
Ca % K % Mg % Na % P % Si % Ca/P
600°C
6 h 32.959 0.063 0.522 0.945 17.065 0.024 1.93
8 h 33.903 0.060 0.607 1.003 17.023 0.016 1.99
12 h 35.323 0.054 0.521 0.814 16.558 0.026 2.13
Tabla 8. Área superficial de polvos calcinados a 600°C
600°C Área
superficial (m2 /g)
6h 40.11
8h 39.23
12h 32.77
HAcom 0.42
Tabla 9.Distribución de tamaño de partícula. Polvos calcinados a 600°C.
2.1.1.1.2 Calcinación a 750°C. Visualmente los polvos cuya apariencia es de un talco fino, presentan
coloración blanca, como se muestra en la Figura 19.
Los patrones de XRD indexan todos los picos de hidroxiapatita (Figura 20).
600°C Distribución de
tamaño de partícula (media) (µm)
6h 89.3165
8h 89.5805
12h 82.8205
HS 95.884
HAcom 52.824
57
Figura 19. Polvos extraídos por calcinación a 750°C
Al analizar los espectros de FT-IR se observan los picos característicos de
los iones OH-, PO4-3, CO3
-2, así como los de las vibraciones entre carbono e
hidrógeno, es decir, materia orgánica, exclusivamente en la muestra calcinada
durante 6 horas, como lo muestra la Figura 21Error! Reference source not found..
En términos generales, las muestras calcinadas durante 8 y 12 h son las muestras
con mayor similitud a la muestra de HA comercial, pues no contienen materia
orgánica y tienen la presencia de los mismos iones; sin embargo, la muestra de
12 h tiene una disminución en su absorbancia, denotando la degradación de la
muestra, es decir, pérdida de iones. Los picos de dicho espectro se muestran en
la Tabla 10.
La caracterización realizada mediante EDS indica que la muestra contiene
oxígeno, fósforo, calcio, así como sodio y magnesio (Figura 22).
La determinación por ICP-OES muestra que a 750°C se tiene una relación
de Ca/P mayor que 1.67, como lo muestra la Tabla 11; así mismo se presenta el
porcentaje obtenido de diversos elementos que están presentes.
58
Figura 20. Patrones de XRD de polvos calcinados a 750°C a 6, 8 y 12h. * HA
Mediante SEM, se puede observar que la morfología que presentan estos
polvos es bastante irregular, rugosa y con cierta porosidad (Figura 23).
El área superficial disminuye considerablemente (aproximadamente 92%),
estos nos indica que las partículas son menos porosas que las muestras
calcinadas a 600°C, como se muestra en la Tabla 12.
En cuanto al análisis de PSD; las partículas disminuyen un poco su tamaño,
entre el 8 y el 10% de su tamaño original (HS). En la Tabla 13 se presentan los
tamaños de los polvos obtenidos en los diferentes tiempos de exposición.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2
*
*
** *
Inte
nsid
ad
re
lativa
6h
8h
12h
******* ********
*****
**
***
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
** * ******* ************
**
*
***
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*** * ******* ************
**
*
***
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
59
Figura 21. Espectros comparativos de IR de polvos calcinados a 750°C, durante 6, 8 y 12h.
4000 3000 2000 1000 0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
3000 2000
0,02
0,04
1100 1000 900 800 700 600 500
0,2
0,4
0,6
0,8
6h
8h
12h
HAcom
1458
14121552285029253573
473562
599
62996210181087
OH-
PO4
-3
CO3
-2
C-H
1412
A b
s
o
r
b
a
n
c
i a
(cm-1)
60
Tabla 10. Picos del espectro FT-IR de las muestras calcinadas a 750°C.
750°C
HA com (cm-1)
Ion 6 h 8 h 12 h
OH- 3573 3573 3573 3572
CO3-2
1552 1552 1552 -
1458 1458 1458 1472
1412 1412 1412 -
880 880 880 894
PO4-3
1087 1087 1087 1087
1018 1019 1020 1014
962 962 962 961
629 629 630 631
599 599 599 598
562 562 561 558
473 474 471 475
C-H 2925 - - -
2850 - - -
61
Figura 22. EDS (significativo) de HA biológica, obtenida bajo calcinación a 750°C durante 6 h.
Tabla 11. Porcentaje de elementos presentes, obtenidos por ICP-OES, en los polvos calcinados a 750°C.
Ca % K % Mg % Na % P % Si % Ca/P
750°C
6 h 35.668 0.041 0.568 0.818 17.786 0.017 2.005
8 h 35.592 0.039 0.576 0.821 17.357 0.008 2.050
12 h 36.369 0.028 0.583 0.811 17.744 0.015 2.049
62
Figura 23. Morfología superficial de partículas de HA. a) 500 X. b) 1000 X. c) 10,000 X.
Tabla 12. Área superficial de polvos calcinados a 750°C durante 6, 8 y 12h.
750°C Área
superficial (m2/g)
6h 2.77
8h 2.79
12h 3.11
HAcom 0.42
a) b)
c)
63
Tabla 13. Distribución de tamaño de partícula de polvos calcinados a 750°C durante 6, 8 y 12 h.
2.1.1.1.3 Calcinación a 1000°C. Al concluir la etapa de calcinación, los polvos son blancos y se encuentran
en lo que parece el comienzo de sinterización, ya que salen del crisol como una
sola pieza (Figura 24); sin embargo al someterlos a una presión baja se obtiene
el polvo fácilmente.
Las reflexiones de los espectros de XRD están bien definidas, indicando
cristales grandes (Figura 25). Se observa la presencia de HA, así como la de CaO
(óxido de calcio); siendo este último un compuesto de cuidado pues, se tiene
conocimiento de que dentro de los biocerámicos, el CaO es el más soluble de
todos; por lo que altas concentraciones de este puede generar fallas en los
recubrimientos, causadas por: delaminado, disolución, despostillamiento, entre
otras (Heimann, 2013). El óxido de calcio fue indexado con la ficha 00-075-0264.
750°C Distribución de
tamaño de partícula (µm)
6h 87.9835
8h 86.7465
12h 88.127
HS 95.884
HAcom 52.824
64 En la caracterización realizada por FT-IR se aprecia como las bandas de
PO4-3 disminuyen drásticamente su absorbancia, así como el pico de OH-, y las
bandas de CO3-2 desaparecen (Figura 26). Indicando que se presenta una
degradación del material, debido a que las altas temperaturas promueven la
liberación de los iones fosfato e hidroxilo así como la descomposición del
carbonato en CO2, la cual ocurre entre 750 y 1100°C. Los picos del espectro se
presentan en la Tabla 14.
Figura 24. Polvos obtenidos por calcinación de hueso bovino a 1000°C.
La caracterización realizada mediante EDS indica que la muestra contiene
oxígeno, fósforo, calcio, así como sodio y magnesio (Figura 27).
La determinación por ICP-OES indica que a 1000°C se tiene una relación
de Ca/P menor que las anteriores; sin embargo mayor a la estequiométrica de la
HA, exceptuando la muestra calcinada durante 12 h, como lo muestra la Tabla 15,
así mismo se presenta el porcentaje obtenido de diversos elementos que están
presentes en las muestras.
La morfología que presentan estos polvos es irregular. La superficie de las
partículas es rugosa y se observa que su porosidad es poca (Figura 28).
65 En los resultados obtenidos mediante análisis BET se observa que el área
superficial ha disminuido hasta casi igualar la presentada por la hidroxiapatita
comercial, por lo que, de las tres temperaturas, ésta es la que logra una mayor
similitud en cuanto a sus propiedades superficiales (Tabla 16).
Figura 25. Patrones de XRD de los polvos obtenidos bajo calcinación a 1000°C.
En el análisis de PSD se observa que al calcinarse a 1000°C, la HA
disminuye considerablemente su tamaño, de un 22 a un 25%, respecto a la
materia prima (HS), como se puede observar en la Tabla 17.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
*
*
*
°
° *
*
2
Inte
nsid
ad
re
lativa
6h
8h
12h
*** * ******* *********
***
**
*
***
*
**
*
*
*
***
*
*
*
*
*** * ******* *********
***
**
*
***
*
**
*
*
*
***
*
*
*
*
* *** * ******* *********
***
**
*
***
*
**
*
*
*
***
*
*
*
*
°
66
Figura 26. Espectros de IR de polvos obtenidos bajo calcinación a 1000°C durante 6, 8 y 12h.
4000 3000 2000 1000 0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
4000 3000 2000
-0,010,000,010,020,030,040,050,06
1100 1000 900 800 700 600 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
OH-
PO4
-3
6h
8h
12h
HAcom
3573
476564
599
6309611022
A b
o
r
b
a
n
c
i a
(cm-1)
1088
67 Tabla 14. Picos del espectro FT-IR de las muestras calcinadas a 1000°C
1000°C
HA com (cm-1)
Ion 6 h 8 h 12 h
OH- 3573 3574 3574 3574
PO4-3
1088 1088 1089 1087
1022 1022 1022 1014
961 961 961 961
630 630 630 631
599 599 599 598
564 565 563 558
476 476 477 475
CO3-2
- - - 1472
- - - 894
Figura 27. EDS (significativo) de HA biológica, obtenida bajo calcinación a 1000°C durante 6 h.
68 Tabla 15. Porcentaje de elementos presentes, obtenidos por ICP-OES, en los polvos calcinados a 1000°C.
Ca % K % Mg % Na % P % Si % Ca/P
1000°C
6 h 34.724 0.037 0.579 0.724 17.767 0.004 1.954
8 h 31.303 0.032 0.553 0.644 17.579 0.020 1.780
12 h 29,72
0.075 0.575 0.042 18,77 0,01 1,583
Figura 28. Morfología superficial de partículas de HA biológica, calcinada a 1000°C durante 6 h. a) 1,000 X. b) 10,000 X. c) 10,000 X.
a) b)
c)
69
Tabla 16. Área superficial de polvos calcinados a 1000°C durante 6, 8 y 12h.
1000°C Área
superficial (m2/g)
6h 0.49
8h 0.35
12h 0.39
HAcom 0.42
Tabla 17. Distribución de tamaño de partícula. Polvos calcinados a 1000°C.
2.1.1.2 Determinación de los parámetros de extracción.
Para un mejor entendimiento del comportamiento de la HA biológica
obtenida bajo las condiciones trabajadas, a continuación se presenta un resumen
de las características principales que se obtuvieron:
Mediante XRD se observó que a 600°C la HA se encuentra amorfa
(Ver Figura 17), a 750°C se definen perfectamente todos los picos
de HA (Ver Figura 20) y a 1000°C se tienen picos más afilados y
delgados, asociado a un aumento en el tamaño del cristal; además
se tiene la presencia de CaO (Ver Figura 25). En un estudio
1000°C Distribución de
tamaño de partícula (µm)
6h 74.11
8h 71.84
12h 72.05
HS 95.884
HAcom 52.824
70 realizado por Achariya Rakngarm et al. se muestra que la baja
cristalinidad está relacionada con una alta bioactividad (Achariya
Rakngarm Nimkerdphol, 2014).
FT-IR mostró que a 600°C; excluyendo la muestra de 12 h, la cual
presenta baja concentración en todos sus iones; las muestras tienen
alta concentración de carbonatos y baja concentración de iones
fosfato, con referencia en la HA comercial (Ver Figura 18). A 750°C,
la muestra de 6 h contiene materia orgánica y la muestra de 12 baja
sus concentraciones de iones; mientras que la muestra a 8 h tiene
concentraciones muy similares a la HA comercial (Ver Figura 21).
Por último, a 1000°C, se tiene nula presencia de carbonatos a costa
de la degradación de la HA pues la concentración en todos los iones
es muy baja (Ver Figura 26).
La caracterización realizada por EDS muestra, aparte de Ca y P, la
existencia de otros elementos: Mg, Na y Si; mientras que por ICP-
EOS se observa que en todas las temperaturas de experimentación
se tiene la presencia de manera similar de iones Na, K, Mg, Si (); sin
embargo, existe una variación en la relación Ca/P con respecto a la
temperatura; observando que a 1000°C dicha relación es
aproximada a la observada en la estructura ósea (Ca/P: 1.65-1.67)
(Ver Tabla 15).
La morfología de los polvos es irregular, independiente de las
temperaturas y los tiempos a los que fueron sometidos.
71
Se observó que el área superficial va disminuyendo con respecto al
incremento en la temperatura de exposición. Encontrándose el área
superficial de la HA comercial entre los valores obtenidos a 750 y
1000°C, tal como lo muestra la Figura 30.
El rango de tamaño idóneo para trabajar con el equipo de
proyección térmica por plasma es de 30-150µm. Se encontró que
entre 750 y 1000°C el tamaño de partícula es el adecuado para ser
utilizado.
Figura 29. Concentración de iones en polvos calcinados a 750 y 1000°C.
K Mg Na Si
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
6h/750°C
8h/750°C
12h/750°C
6h/1000°C
8h/1000°C
12h/1000°C
Co
nce
ntr
ació
n (
%)
72
Figura 30. Área superficial de polvos de HA biológica, obtenidos bajo diferentes condiciones de calcinación.
Por todo lo anterior, se concluye que el rango para la obtención de polvos
de HA biológica con las propiedades óptimas se encuentra entre 750 y 1000°C.
El hecho de que a 1000°C exista CaO indica que entre menos temperatura sea la
que se aumente (partiendo de 750°C), es mejor, pues se reduce la posibilidad de
la generación de otras fases en los polvos; es decir, la degradación de la HA; por
lo que 800°C fue la temperatura seleccionada. Así mismo, considerando que
cuando se mantiene un proceso isotérmico, y sólo se varía el tiempo de
calcinación se tiene un efecto similar al del aumento de temperatura, se decide
calcinar durante 6 h.
6h 8h 12h HA com
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Áre
a s
up
erf
icia
l (m
2)
Tiempo de calcinación
600°C
750°C
1000°C
HA com
73 Los resultados obtenidos bajo esas condiciones se presentan a
continuación:
El espectro de XRD muestra resultados muy similares a la muestra
calcinada a 1000°C durante 6 h; es decir, que el proceso térmico ha producido HA
natural, así como un pico apenas perceptible en 37.46° asociado a CaO, como lo
muestra la Figura 31.
El espectro de FT-IR presenta los picos característicos de los iones OH-,
PO4-3, CO3
-2 (Figura 32). Las absorbancias obtenidas son buenas, aunque de
menor magnitud que la hidroxiapatita comercial; sin embargo mantienen una
buena relación entre sí. Los picos de dicho espectro se muestran en la Tabla 18.
La caracterización realizada mediante EDS indica que la muestra contiene
oxígeno, fósforo, calcio, así como sodio y magnesio Figura 3.
Según la caracterización mediante ICP-OES, se tiene una relación de Ca/P
por debajo de la estequiométrica correspondiente a la HA, como lo muestra la
Tabla 19 en la misma tabla se presenta el porcentaje obtenido de diversos
elementos que están presentes; los cuales, de manera general, se encuentran en
el rango medio de los obtenidos en las diversas temperaturas del proceso térmico
utilizado para la extracción.
74
Figura 311. Espectro de XRD de polvos obtenidos bajo calcinación a 800°C. * HA, ° CaO.
La morfología que presentan los polvos es irregular. La superficie de las
partículas es rugosa y se observa que su porosidad es poca (Figura 334).
Mediante análisis BET se obtiene que el área superficial es 1.87 m2/gr; cuyo
resultado es el más cercano de todos los obtenidos con anterioridad al área
superficial de la HA comercial (0.42 m2/gr) (exceptuando los resultados a 1000°C).
10 20 30 40 50 60 70 80
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
*
Inte
nsid
ad
2
*
*
**
°*
*
** *
*****
**
***** *
*
*
**
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
75
Figura 322. Espectro FT-IR de polvos calcinados a 800°C, durante 6 h.
El tamaño de partícula de los polvos que fueron calcinados durante 6 h a
800°C tiene una reducción aproximadamente del 14% respecto a HS. Se
muestran los resultados en la Tabla 20.
4000 3000 2000 1000 0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
3000 2000
0,02
0,04
1200 1100 1000 900 800 700 600 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
OH-
PO4
-3
CO3
-2
800°C
HAcom
3572 1550
1457
1411
(cm-1)
A b
s
o
r
b
a
n
c
i a
476563
599
63088096210191087
76 Tabla 18. Picos espectro FT-IR de las muestras calcinadas a 800°C durante 6 h.
Figura 33. EDS (significativo) de HA biológica, obtenida bajo calcinación a 800°C durante 6 h.
800°C
HA com (cm-1)
Ion 6 h
OH- 3572 3572
CO3-2
1550 -
1457 1472
1411 -
880 894
PO4-3
1087 1087
1019 1014
962 961
630 631
599 598
563 558
476 475
77 Tabla 19. Porcentaje de elementos presentes, obtenidos por ICP-OES, en
los polvos calcinados a 800°C.
Ca % K % Mg % Na % P % Si % Ca/P
800°C 6 h 29.385 0.049 0.534 0.821 17.724 0.013 1.657
Tabla 20. Distribución de tamaño de partícula. Polvos calcinados a 800°C durante 6h.
Figura 334. Morfología superficial de partículas de HA biológica, calcinada a 800°C durante 6 h. a) 1,000 X. b) 10,000 X. c) 10,000 X.
800°C Distribución de
tamaño de partícula (µm)
6h 82.016
HS 95.884
HAcom 52.824
a)
b)
c)
78
CAPÍTULO III.
DESARROLLO DE RECUBRIMIENTOS.
3.1. INTRODUCCIÓN.
En general, la ventaja que presentan los recubrimientos es que dos
materiales que naturalmente son incompatibles, mejoran sus propiedades de
manera sinérgica, y se logra desempeño del material como uno. Generalmente la
fuerza mecánica y la resistencia a la fractura son proveídas por el sustrato,
mientras que el recubrimiento brinda protección contra los procesos de
degradación del medio ambiente como son: desgaste, corrosión, erosión, y
ataques térmicos y biológicos.
El uso de recubrimientos brinda las siguientes ventajas:
Ventajas técnicas: creación de nuevos materiales (compositos) con
aumento en las propiedades sinérgicas, o propiedades funcionales
completamente diferentes.
Ventajas económicas: materiales en bulk sumamente caros como el
acero inoxidable o súper-aleaciones pueden ser reemplazados por
delgadas capas de un material diferente.
Existen diferentes métodos de deposición física por vapor (PVD, por sus
siglas en inglés) para la aplicación de recubrimientos, entre los que destacan:
Evaporación, sputtering y ablación por láser.
79 En el desarrollo de esta tesis la proyección de los recubrimientos se realizó
mediante la técnica de Proyección Térmica por Plasma, la cual es la más versátil
dentro de los procesos térmicos de proyección y cuyos fundamentos son los
siguientes:
Un arco es formado entre dos electrodos dentro del gas de formación de
plasma, el cual normalmente consiste en una mezcla de argón/hidrógeno o
argón/helio. Mientras el gas de plasma es calentado por el arco, este se expande
y acelera a través de una boquilla, obteniendo velocidades por encima de mach
2. La temperatura en la zona de arco se aproxima a los 20,000 K (TST. Fisher
Barton Company, 2016).
3.2. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
3.2.1 Materiales.
Materiales Reactivos
Piezas Ti6Al4V
(15.97 mm diámetro, 5 mm alto).
HA biológica.
Equipo de proyección térmica por
plasma (APS) (Praxair Surface
Technologies 3710).
nAg (Matriz extracto de nopal).
Agitador mecánico.
3.2.2 Metodología. Debido a que la presente tesis es continuación de una investigación
previamente realizada por el mismo equipo de trabajo, se tomaron bases de la
misma para determinar los recubrimientos a aplicar, los cuales, sólo fueron de dos
80 tipos: Hidroxiapatita biológica y una mezcla de Hidroxiapatita biológica con 1% de
nanopartículas de plata soportadas en una matriz de extracto de nopal. Lo
anterior, debido a que bajo las pruebas realizadas en los anteriores recubrimientos
con diferentes concentraciones de nAg, se demostró que la concentración más
baja posible que resultaba efectiva (99% de eficiencia antibacterial sin presentar
problemas de citotoxicidad) era 1% de nAg (V. Orozco Carmona, 2014).
Los polvos de HA/nAg fueron procesados de la siguiente manera para
obtener el recubrimiento deseado:
Se emplearon nAg soportadas en una matriz de extracto de nopal,
con una concentración de 13% p/p; de acuerdo al análisis realizado
por espectroscopía de absorción atómica.
Los polvos de HA biológica se tamizaron en un tamiz de 200 mallas
(75 µm). Los polvos retenidos en el tamiz (>75 µm), los cuales tienen
una distribución de partícula media de 119.75µm, fueron los
empleados para el desarrollo del recubrimiento, ya que se observó
que dichas partículas permitieron un buen desempeño del proceso
sin generar un problema de taponamiento durante su proyección.
La HA biológica se mezcló con 1% nAg y se sometió a agitación a
60 rpm durante 1 hr, para homogeneizar. Es importante mencionar
que los polvos de la mezcla de HA con nAg no presentaron problema
de aglomeración, debido a que la matriz de extracto de nopal en el
cual vienen soportadas las nanopartículas sirve como dispersante,
81 por lo que sólo se realizó la mezcla de los polvos y se procedió a
hacer la proyección.
Los recubrimientos fueron aplicados sobre pastillas cilíndricas de
Ti6Al4V de 15.97 mm (previamente preparados superficialmente
mediante un proceso de granallado con alúmina) mediante
Proyección Térmica por Plasma (APS: Atmospheric Plasma Spray)
bajo los siguientes parámetros: 600 A, 55 psi gas primario (Ar), 110
psi gas secundario (He) y una distancia de aplicación de 50 mm (V.
Orozco Carmona, 2014)
Una vez obtenidos los recubrimientos, estos se caracterizaron bajo
diferentes técnicas. En la Tabla 21 se muestra a qué tipo de caracterización fueron
sometidos cada uno de ellos.
Tabla 21. Diseño de análisis para la caracterización de los recubrimientos aplicados.
Sustrato
HA biológica
1% nAgEN+HA Superficial Transversal
SEM Imagen X X X
Mapeo elemental
X X X
Deposición de apatita
X
82
3.3 RESULTADOS.
A continuación se presentan los resultados de las diversas técnicas de
caracterización empleadas en los recubrimientos HA/nAg desarrollados mediante
proyección térmica por plasma.
3.3.1 Recubrimiento de HA biológica.
La morfología de los recubrimientos es irregular, con elevado grado de
rugosidad (Figura 35 a). Al observar la muestra a mayores aumentos (5,000 X) se
aprecia que presenta fracturas típicas de un recubrimiento cerámico (Figura 36 b,
c). A los 10,000 X se tienen tanto zonas rugosas, como zonas más lisas (Figura
35 d, e). El análisis realizado mediante EDS indica que el recubrimiento cuenta
con una relación de Ca/P de 2.02 en promedio. También se tiene la presencia de
Na y Mg, como lo indica la Figura 356.
83
Figura 345. Imágenes de recubrimiento de HA biológica, tomadas mediante SEM.
Con la finalidad de observar si existe deposición de apatita en el
recubrimiento de HA biológica, éste fue expuesto a una solución de fluidos
corporales simulados, SBF (Simulated Body Fluid), cuyo contenido son sales
presentes en el cuerpo y su función, como su nombre lo dice, es simular el fluido
corporal para observar de manera in vitro la interacción entre dicha solución y el
recubrimiento. Los tiempos de contacto fueron: 1, 3, 12, 24 hr; así como 3, 7, 14
b) a)
c) d)
e)
84 y 30 días. Al finalizar la exposición en la solución SBF, las probetas fueron
analizadas por SEM mediante electrones secundarios, así como EDS. A
continuación se presentan los resultados obtenidos.
Figura 356. EDS representativo del recubrimiento de HA biológica.
1 hora de contacto (Figura 367 a, b): Se analizaron diversas zonas de la
muestra, de manera puntual, área específica y general. De manera
genérica, la muestra presenta una superficie irregular con relieves y micro-
fracturas. En el análisis por EDS se determinó que la relación Ca/P en
promedio, es fue 1.73.
85
3 horas de contacto (Figura 367 c, d): Las áreas analizadas fueron de
manera puntual, área determinada y general. La muestra presenta una
superficie irregular con textura y pequeñas micro-fracturas. El análisis por
EDS indicó que la relación Ca/P en promedio, es fue 2.12.
12 horas de contacto (Figura 367 e, f): Se realizó análisis en áreas
específicas, así como de forma área general. La muestra presenta una
superficie irregular con relieves y micro-fracturas. En el análisis por EDS se
determinó que la relación Ca/P, en promedio es de 1.57. De manera visual
es más evidente que está ocurriendo un cambio superficial debido a la
deposición de apatita.
24 horas de contacto (Figura 378 a, b): Los análisis fueron en zona puntual,
área específica y general. La muestra presenta una superficie más
homogénea, con aparente depósito de apatita en sus micro-fracturas
(zonas blanquecinas). En el análisis por EDS se determinó que la relación
Ca/P, en promedio es de 1.55. Se destaca que en el área hay un depósito
de apatita, la relación de Ca/P es de 1.53, mientras que donde no se tiene
depósito aparente, fue de 1.47.
3 días de contacto (Figura 378 c, d): Se analizaron diversas zonas de la
muestra, de manera puntual y general. La muestra presenta una superficie
86 más homogénea y micro-fracturas, algunas con deposición de apatita, así
como la aparición de pequeños fragmentos en forma de agujas (rod). El
análisis por EDS determinó que la relación Ca/P en promedio, fue de 1.55.
7 días de contacto (Figura 378 e, f): Las zonas analizadas fueron áreas
específicas y área general. La superficie es de apariencia más lisa, con
pocos relieves y se incrementó la aparición de fragmentos. La presencia de
fracturas es consistente. El resultado de la relación de Ca/P realizado
mediante EDS fue de 1.53, en promedio.
14 días de contacto (Figura 393839 a, b): Fueron analizadas áreas
específicas, así como el área general. La superficie de estas muestras es
más lisa, con fracturas de mayor longitud, disminuye notoriamente la
presencia de fragmentos y el tono de gris es más uniforme, relacionando
esto con una mayor homogeneidad. El resultado de EDS indicó que la
relación promedio de Ca/P fue de 1.45.
30 días de contacto (Figura 393839 c, d): Se analizaron áreas específicas
y un área general. Presenta una superficie de apariencia más homogénea
con pequeños relieves en formas circulares, conserva la presencia de
grietas aunque en menor cantidad. La relación de Ca/P en promedio fue de
1.48, según los EDS obtenidos.
87 La variación en la relación Ca/P en la superficie del recubrimiento al
pasar del tiempo, así como el cambio de su textura; indican claramente que
se está llevando a cabo una deposición. Una relación mayor a 1.6 se debe
a la presencia otras fases de HA con altos contenidos de Ca y menor
concentración de P (TCP, TTCP, CaO). Mientras que una relación menor a
1.6 es debida a una mayor concentración de P (P2O5). Según estudios
realizados por Achariya Rakngarm Nimkerdphol et al., otras fases
presentes, como lo son: TCP, TTCP, CaO, desaparecen con el tiempo,
pues son más solubles; mientras que la HA es muy estable en las
condiciones a las que trabaja el cuerpo humano. Además, otros
compuestos que se pueden formar por la disolución de las fases presentes,
terminan en la precipitación de HA; como es el ejemplo de CaO, que al
estar en una SBF forma Ca(OH)2 que a su vez es hidrolizado hasta formar
HA (Achariya Rakngarm Nimkerdphol, 2014).
88
Figura 367. Deposición de apatita en recubrimiento de HA biológica. a), b) 1 h. c), d) 3 h. e), f) 12 h de contacto. Imágenes tomadas mediante SEM para el
análisis de EDS.
a) b)
c) d)
e) f)
89
Figura 378. Deposición de apatita en recubrimiento de HA biológica. a), b) 24 h. c), d) 3 días. e), f) 7 días de contacto. Imágenes tomadas mediante SEM para el
análisis por EDS
a) b)
c) d)
e) f)
90
Figura 3938. Deposición de apatita en recubrimiento de HA biológica. a), b) 14 días. c), d) 1 mes de contacto. Imágenes tomadas mediante SEM para el
análisis por EDS.
3.3.2 Recubrimiento de HA / 1% nAg
La superficie en este recubrimiento tiene mucha textura, conformada por
pequeñas protuberancias que van dando lugar a la formación de poros (Figura
390 a, b, d). Así mismo se presentan micro fracturas (círculos azules, Figura 390
c, e, f). En las Figura 390 d, f, h se observa la presencia de Ag (círculos rojos).
Según la Figura 41 (b, c, d, e), en la sección transversal del recubrimiento
se observa que se tiene una buena distribución de la plata, la cual se conserva de
a) b)
c) d)
91 orden nanométrico. Así mismo existen fracturas, aglomeraciones y porosidad,
atribuible al gran choque térmico que sufren los recubrimientos una vez que son
depositados. El espesor medio del recubrimiento es de 217.33µm (Figura 41 a).
En los mapeos elementales superficiales se muestra como se encuentra la
distribución de los elementos presentes en los recubrimientos. La Figura 412
contiene 3 mapeos. En el mapeo elemental a) se observa como el Ca y el P se
concentran juntos, mientras el Mg se concentra donde hay un déficit de Ca y P.
Se observa que las nAg se encuentran dispersas en la superficie presentando
pequeñas aglomeraciones. En el mapeo elemental b) se muestra, de igual forma,
el Ca y el P concentrados en una misma zona, contrario al Mg. En este mapeo se
tiene la presencia de Na, mostrándose homogéneo. También existe presencia de
nAg sobre el área. El mapeo elemental c) muestra una superficie con una
presencia homogénea de todos los elementos, exceptuando las nAg que no se
encuentran presentes en esta área.
92
Figura 390 Imagen recubrimiento HA biológica con nAg, mediante SEM.
a) b)
c) d)
e) f)
g) h)
93
Figura 401. Imágenes de recubrimiento de HA biológica con nAg en sección transversal, tomadas mediante SEM.
a)
b) c)
d) e)
94
Figura 412. Mapeo elemental. HA biológica con 1% de nAg
a) b) c)
95
CAPÍTULO IV
EVALUACIÓN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE
RECUBRIMIENTOS.
4.1 INTRODUCCIÓN.
Para que un biomaterial realmente sea acreedor al término, debe pasar una
serie de pruebas de biocompatibilidad. Existen diversos análisis y en diferentes
etapas (in vitro, in vivo, in situ), los cuales consisten en poner en contacto los
materiales con los organismos pertinentes.
Dentro de la etapa in vitro, en el cual se trabaja únicamente con células,
existen diversos ensayos a los que pueden ser sometidos los materiales; siendo
el ensayo cometa uno de los más utilizados.
Ensayo cometa.
También se le conoce como técnica de electroforesis unicelular o
electroforesis por microgel. Fue introducida por Östling y Johanson para la
detección de daños en el ADN inducidos por radiaciones. Desde su desarrollo, se
han realizado modificaciones en la metodología; sin embargo, el método alcalino,
desarrollado por Singh et al. (Narendra P. Singh, 1988), que permite la
desnaturalización del ADN, es el que se ha convertido en el más usado.
96 Este ensayo puede ser usado en diferentes estudios, como: toxicología
genética, biomonitoreo, eco-genotoxicología, epidemiología molecular,
nutrigenómica, estudios de reparación del sistema de ADN, evaluación de
genotoxicidad de nanomateriales, evaluación de la integridad del ADN en las
células madre mesenquimales y espermatozoides.
El ensayo cometa puede ser realizado con cualquier célula eucariota in
vivo, in vitro o ex vivo, incluido tejido vegetal como Allium cepa. Otra de las
ventajas de esta técnica es su bajo costo y tiempo, ya que el protocolo se lleva a
cabo en menos de 24 h (Rodrigo Pinheiro Araldi, 2015).
Citometría de imagen. Tali
Es un ensayo de mesa de 3 canales (campo claro, fluorescencia verde,
fluorescencia roja) que usa los principios de la óptica el análisis de imagen para
realizar dicho ensayo para células en suspensión. Es compatible con una amplia
variedad de células eucariotas.
La información que se obtiene de este análisis es:
Viabilidad: determina el número y proporción de células viables y
muertas.
Apoptosis: Distingue entre poblaciones de células en apoptosis,
muertas y vivas, cuenta las células en cada población y calcula un
estimado.
GFP/RFP: cuenta y calcula los montos relativos en una muestra de
células expresando GFP o RFP (o inclusive teñidas con un poco de
97 verde o rojo fluorescente), así como células sin teñir ni fluorescencia
(Invitrogen by Life Technologies TM, 2011).
4.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.2.1 Materiales.
Ensayo Materiales Reactivos
Pozillos. Solución fijadora.
Porta muestras. Agua desionizada
Cubre objetos.
Microscopio óptico.
Electroforesis Cuba para electroforesis. MC3T3 (Osteoblastos).
unicelular Tubos eppendorf. Solución de lisis.
(Cometa). Solución de
electroforesis.
Solución neutralizadora.
Solución de parada.
Citometría de Tubos eppendorf. MC3T3 (Osteoblastos).
Imagen Tubos para centrífuga. Kit de apoptosis Tali.
(Tali). Centrifugadora.
Equipo Tali.
4.2.2 Metodología. Las bases para las pruebas de biocompatibilidad que se desarrollaron en
la presente tesis fueron citotoxicidad y genotoxicidad. Los protocolos de los
ensayos realizados se describen a continuación.
98 4.2.2.1 Ensayo cometa.
Preparación de porta muestras.
Se utilizaron porta muestras nuevos que fueron colocados en un
congelador durante 30 min., aproximadamente.
Se colocó agarosa en un baño maría a 60°C, una vez que se alcanzó la
temperatura se traspasó a un recipiente cilíndrico que fue conservado dentro de
un baño maría. Los porta muestras fueron retirados del congelador y se les retiró
el exceso de humedad con un trozo de papel para después sumergirse en la
agarosa de manera vertical, al sacarlos de la agarosa se les retira la agarosa de
la parte inferior con papel, es importante que esto sea efectuado de manera
horizontal pues la agarosa no debe escurrir; en esa posición se colocaron en una
charola y se dejaron secar a temperatura ambiente por 24 h.
Contacto celular.
Las células (MC3T3, osteoblastos) fueron puestas en contacto con el
material durante 24, 48 y 72 h. Posteriormente se tomó una muestra del medio de
contacto que se mezcló con agarosa y se colocó sobre un porta muestras que fue
cubierto por un cubre objetos. Todos los porta muestras fueron refrigerados por
aproximadamente 10 mins para que la agarosa solidificara. Una vez transcurrido
este tiempo, se deslizaron los cubre objetos para retirarlos y proceder a poner en
contacto los porta muestras en una solución de lisis en refrigeración durante 1 h.
Electroforesis.
99 Se preparó la solución de electroforesis (solución tampón) y refrigeró para
conseguir una temperatura de 4°C.
Los porta muestras fueron retirados de la solución de lisis al concluir el
tiempo de contacto y fueron sumergidos en una solución neutralizadora durante 5
min. Posteriormente se colocaron los porta muestras en la cuba de electroforesis
y se cubrieron con solución tampón, dejando reposar por 20 min. Concluido este
tiempo, se procedió a programar la fuente para llevar a cabo la electroforesis, bajo
las siguientes condiciones de trabajo: 22 V, 300 mA, 20 min. Los porta muestras
fueron retirados y sumergidos nuevamente en la solución neutralizadora por 5 min.
Se dejaron secar durante 24 h a temperatura ambiente.
Coloración.
Los porta muestras fueron enjuagados dos veces con agua destilada y
secados a temperatura ambiente durante 24 h. Posteriormente fueron sumergidos
en solución fijadora durante 10 min y enjuagados con agua destilada tres veces,
se dejaron secar a temperatura ambiente durante 24 h. Al día siguiente los porta
muestras se hidrataron en agua destilada durante 5 min y fueron sometidos a
coloración con plata durante 35 min. Para terminar la coloración, se sumergieron
los porta muestras en una solución de parada por 5 min y se lavaron 3 veces con
agua destilada. Por último se dejaron secar a temperatura ambiente durante 24 h.
Posteriormente se procedió a realizar el conteo.
4.2.2.2 Citometría de imagen. Tali.
El tratamiento fue realizado con 1100 µL de MC3T3 (Osteoblastos).
(alrededor de 106 células), los cuales fueron expuestos a los recubrimientos en
100 cuestión durante 24, 48 y 72 h. Después del tratamiento el contenido fue
transferido a tubos de 2 mL, centrifugado a 1500 rpm por 5 min, el sobrenadante
fue descartado.
El material restante se suspendió con 100 µL del reactivo C, enseguida
fueron adicionados 5 µL del reactivo A, nuevamente se suspendió y se mantuvo
en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. Al concluir este periodo,
el material fue centrifugado nuevamente a 1500 rpm durante 5 min, el
sobrenadante fue removido y se adicionaron 100 µL del reactivo C más 1 µL del
reactivo B. La solución se mantuvo durante 5 min a temperatura ambiente.
Se tomaron 25 µL de la solución y fueron colocados en un portaobjetos
especial para realizar la lectura por el equipo Tali.
Kit de apoptosis Tali.
Reactivo A: Annexin V Alexa Fluor® 488
Reactivo B: Tali™ Propidium Iodide (PI)
Reactivo C: Annexin binding buffer (ABB)
4.3 RESULTADOS.
4.3.1 Ensayo cometa. Los resultados referentes a los daños del ADN sufridos por la célula en la
presencia del material, indican que éste no interfirió en el material genético de las
101 células óseas. La pequeña diferencia observada no es significativa (p<0,05)
(Figura 43).
Figura 43. Resultados de daños al ADN, evaluados con MC3T3.
4.3.2 Citometria de imagen. Tali. Los resultados del análisis de viabilidad celular medidos en 24, 48 y 72 h
muestran que las células óseas MC3T3 no presentan mayor crecimiento que el
control, indicando un mantenimiento celular adecuado, es decir, sin crecimientos
exacerbados (Figura 44).
Así mismo, se determinó que inicialmente ocurren mayor número de
muertes por apoptósis (24 h); después de ese periodo el comportamiento se
acerca al control. (Figura 45), mostrando un periodo de adaptación de la célula a
la presencia del biomaterial.
Índ
ice
re
lati
vo
102
Figura 44. Resultados de viabilidad celular, evaluado con MC3T3.
Figura 45. Resultados obtenidos por citometría de imagen Tali, evaluado con MC3T3.
% d
e d
istr
ibu
ció
n c
elu
lar
Índ
ice
re
lati
vo
103
CAPÍTULO V.
EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD Y EFICIENCIA
ANTIMICROBIANA DE RECUBRIMIENTOS.
5.1 INTRODUCCIÓN.
La norma japonesa JIS Z2801:2000, ha sido estandarizada para evaluar la
eficiencia antibacterial en productos antibacteriales, por lo que especifica los
métodos de pruebas antibacteriales.
Para un mayor entendimiento, existen 5 definiciones que resultan
esenciales:
Antibacterial: Las condiciones inhiben el crecimiento de la bacteria en la
superficie de los productos.
Acabado antibacterial: Acabado final para una eficiencia antibacterial.
Producto antibacterial: Productos tratados con un acabado antibacterial.
Valor de la actividad antibacteriana: Este valor muestra la diferencia en
el valor logarítmico de células viables entre un producto antibacterial y uno
sin tratamiento después de la inoculación e incubación de la bacteria.
Eficiencia antibacterial: Es la eficiencia de los productos antibacteriales
juzgado desde el valor de la actividad antibacteriana.
104 El valor de la actividad antibacterial obtenido mediante los métodos de
prueba de esta norma no debe ser menor a 2.0 para que el producto sea
considerado eficiente.
Esta metodología experimental puede ser aplicada a productos textiles,
plásticos, metales y cerámicos.
En la norma se basan en el uso de dos tipos de bacterias para los análisis:
Staphylococcus aureus
Escherichia coli (Standard, 2001)
5.2 DESARROLLO EXPERIMENTAL.
5.2.1 Materiales.
Materiales Reactivos
Piezas Ti6Al4V recubiertas: HA/nAg. E. coli (ATCC 25922).
Incubadora-Agitador, New Brunswik
Scientific CO., Inc, Series 25 S. aureus (ATCC 27853).
Incubadora, Lab-line, Imperial II. P. aeruginosa (ATCC 6538P).
Centrífugadora. Caldo/Agar Soya Tripticasa.
Tubos para centrífuga. Solución fisiológica.
Cajas Petri. TTC (Cloruro de Trifeniltetrazolio).
Frascos pequeños (10mL).
Estereoscopio.
105 5.2.2 Metodología.
Las cepas se encontraban liofilizadas o en glicerol. Para hacer la
propagación de la cepa se prepararon 50mL de caldo de Soya Tripticasa estéril y
se dejó en agitación (Incubadora-Agitador, New Brunswik Scientific CO., Inc,
Series 25) constante, a una temperatura de 37°C durante 24hrs.
Una vez cumplido este tiempo se recuperó la biomasa por centrifugación
bajo las siguientes condiciones: 14000 RPM, 15min, a 20°C. Recuperada la
biomasa, esta se suspendió en 50mL de Caldo Soya Tripticasa 1/500. De esta
suspensión se partió para hacer las diluciones necesarias para el conteo de UFC
por mL de caldo.
Las diluciones se prepararon con 9mL de solución fisiológica (NaCl al
0.85%) estéril y fueron sembradas en Agar Soya Tripticasa con 1mL de TTC
(Cloruro de Trifeniltetrazolio) por cada 100mL de agar, para que las colonias se
tiñeran y fuera más fácil el conteo. Se incubó (Incubadora, Lab-line, Imperial II)
durante 24hrs a una temperatura de 37°C.
Con base en las UFC obtenidas, se calculó el volumen necesario para
preparar una suspensión que en 1mL contuviera 250,000 UFC, para que al diluirla
en 4mL de solución 1/500 se tuvieran aproximadamente 50,000 UFC/mL.
Se realizó el conteo de esta suspensión para verificar los cálculos de UFC
realizados. En frascos de cristal estériles se agregó 1mL de suspensión de la cepa
y 4mL de solución 1/500 (teóricamente se tenían 250,000 UFC en 5mL). Se
colocaron las piezas con la cara del recubrimiento hacia arriba, se tapó con
algodón para asegurar la respiración.
106 Para realizar el recuento de UFC en las piezas en T0 se prepararon una
serie de diluciones (directa a 10-7). Posteriormente se incubó durante 24hrs a
37°C. Se realizó el conteo de UFC.
Las piezas correspondientes a T24 se dejaron en incubación bajo las
siguientes condiciones: 24hrs, 37°C, humedad relativa del 90%. Una vez que
transcurrieron las 24hrs, se prepararon las diluciones para realizar el recuento de
UFC correspondiente a las piezas de T24. Posteriormente se incubó durante 24hrs
a 37°C. Se realizó conteo de UFC.
Finalmente se determinó la actividad y eficiencia antibacterial de los
recubrimientos
5.3 RESULTADOS.
La evaluación de la actividad y efectividad antimicrobiana expone,
primeramente, la susceptibilidad de las bacterias al material al que fueron
expuestas; así como la capacidad bactericida que posee dicho material.
Los resultados para la determinación de la actividad antibacterial se
calculan con la fórmula logarítmica correspondiente al estándar JIS Z2801:2000
(Ec. 1), la cual establece que para que un material sea considerado como un
antibacterial eficiente debe tener un valor de actividad antimicrobiana mínimo de
2; para un mayor entendimiento se calculó el porcentaje de inhibición que
representa dicho valor de actividad antibacterial, siendo este del 99%, es decir,
debe tener una eficiencia del 99%.
107
R = log𝐵
𝐴− log
𝐶
𝐴= log
𝐵
𝐶 (Ec. 1)
Dónde:
R: Valor de actividad antimicrobiana
A: Número de células viables del positivo a T0
B: Número de células viables del positivo a T24
C: Número de células viables del recubrimiento antibacterial a T24
(Standard, 2001)
Las tres cepas evaluadas mostraron mínima actividad microbiana frente al
recubrimiento de HA con 1%nAg, como lo muestran las gráficas de la Figura 426,
puesto que su crecimiento siempre fue, por mucho, menor al blanco; mientras el
recubrimiento presentó un valor de actividad antibacterial mayor a 2, es decir una
eficiencia superior al 99%, como se condensa en la Tabla 22.
Tabla 22. Actividad antibacterial y porcentaje de eficiencia del recubrimiento HA/nAg.
Actividad
antibacterial Eficiencia
antibacterial
Staphylococcus Aureus
5 99.999%
Pseudomonas Aeruginosa
5 99.999%
Escherichia Coli 8 99.999%
108
Figura 426. Unidades formadoras de colonia después de 24 h de contacto. a) S. aureus. b) P. aeruginosa. c) E. coli.
Positivo HA/nAg
0
1
2
3
4
5
6
7
8U
nid
ad
es F
orm
ad
ora
s d
e C
olo
nia
[L
og
]
Staphylococcus Aureus
Positivo HA/nAg
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Un
ida
de
s F
orm
ad
ora
s d
e C
olo
nia
[L
og
]
Pseudomona Aeroginosa
Positivo HA/nAg
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Un
ida
de
s F
orm
ad
ora
s d
e C
olo
nia
[L
og
]
Escherichia Coli
a) b)
c)
109
CAPÍTULO VI
DISCUSIÓN.
La extracción de HA de huesos bovinos es una línea cada vez más investigada.
El método más sencillo es la calcinación; sin embargo para obtener los polvos se
necesita de un pre-tratamiento del hueso con la finalidad de crear fragilidad para
la obtención de polvo que pueda someterse al tratamiento térmico, que a
diferencia de Mihailescu et al., los cuales dieron un tratamiento alcalino con
hipoclorito de sodio al 1% durante 14 días (Natalia Mihailescu, 2015), y Nasser et
al. quienes realizaron un método de secado en horno a 160°C durante 48 h para
lograr la fragilización del hueso (Nasser A.M. Barakat, Myung Seob Khil, A.M.
Omran, Faheem A. Sheikn, Ha Yong Kim., 2008); en el presente trabajo de
investigación, basándonos en el hecho de que es el colágeno lo que proporciona
las características elásticas al hueso, se optó por la utilización de una solución de
ácido fosfórico (H3PO4) con pH bajo (2.4) y un breve tratamiento térmico para
conseguir la desnaturalización de la proteína. Inicialmente el proceso tomaba
alrededor de 26 h, debido a que la solución de H3PO4 era vertida y se dejaba
actuar sin adiciones durante 24 h, por lo que su pH fue incrementándose al pasar
el tiempo; más dos horas en el horno a 250°C, con la finalidad de secar el hueso
y concluir la fragilización. Hasta este punto se consiguió una reducción de tiempo
de aproximadamente 13 días contra el método de hipoclorito de sodio (método
establecido por Mihailescu et. al.) y 24 h en comparación con el secado (método
establecido por Nasser et. al.). Sin embargo se logró reducir 16 h más el propio
110 proceso al mantener el pH del H3PO4 constante, durante 8 h; es decir, nuestro
proceso de fragilización tiene una duración aproximada de 10 h.
Se demostró mediante las técnicas de caracterización realizadas (XRD, FT-
IR, ICP-OES, SEM, BET, PSD) que los polvos que presentan las características
adecuadas (Ca/P = 1.65-1.67, existencia de iones: Na, K, Mg, Si, y fases
cristalinas: HA en su mayoría, con pequeña presencia de CaO) se obtienen a los
800°C con 6 h de calcinación (ver 2.1.1.2). Sin embargo, se tamizaron los polvos
a 200 mallas, debido a que el equipo de proyección térmica por plasma se
obstruye a causa de la existencia de partículas extremadamente pequeñas que
tienden a aglomerarse formando partículas más grandes a las que el equipo tiene
capacidad de operar (30-150 µm). Para la proyección del recubrimiento de HA/nAg
ambos polvos fueron agitados mecánicamente, no siendo requerido el tamizado;
por lo que se demostró que el extracto de nopal tiene una capacidad dispersante
no sólo después sino antes del proceso de aplicación por plasma pues, al ser
colocados los polvos en el equipo, este no se obstruyó. La agitación mecánica es
un paso de suma importancia, pues es ahí donde se genera un producto que
puede ser utilizado fácilmente, sin necesidad de proyectar capas diferentes, como
Cong Fu et al., que depositan dos capas (una de HA y otra de plata) mediante una
técnica electroquímica (Cong Fu, 2016); o la utilización de más de dos reactivos
para lograr la deposición, como es el caso de Yajing Yan et al., que utilizan
Ca(NO3)2, NH4H2PO4, y AgNO3, para lograr la deposición (Yajing Yan, 2015).
Antes de realizar la proyección, los polvos de HA tienen una relación Ca/P
de 1.65; después de ser proyectados esta es de 2.02, indicando que existe una
111 modificación en su composición química, muy probablemente debida a la
generación de otras fases por la alta temperatura a la que es sometida dentro del
plasma (la cual es de 2200°C aproximadamente). Heimann explica los cuatro
pasos en los que se lleva a cabo la degradación de la HA debida a la temperatura,
siendo el último paso la obtención de CaO y P2O5, los cuales se producen entre
los 1300 y 1600°C (Heimann, 2013). Es por ello que se considera que el aumento
en la relación Ca/P es debida a la presencia de CaO. La presencia de CaO es
algo que, en términos generales, trata de evitarse pues, dentro de los
biocerámicos este es el más soluble, siendo relacionado con fallas mecánicas; sin
embargo, de acuerdo con Achariya Rakngarm Nimkerdphol et al., cuando está en
contacto con una solución SBF el CaO se hidroliza hasta llegar a carbonato de
calcio (CaCO3) o HA (Achariya Rakngarm Nimkerdphol, 2014); por lo que
concentraciones bajas de CaO pueden fácilmente terminar en precipitaciones de
HA. Es por ello que en la caracterización realizada mediante SEM a las piezas
que estuvieron sumergidas en SBF, se puede observar que la superficie del
recubrimiento se va modificando tanto en su morfología como en su composición
química, pues a través de EDS se observó que la relación de Ca/P va cambiando
con el tiempo. Los resultados también muestran que la superficie modificada
presenta microfracturas, las cuales son típicas de este tipo de materiales, ya que
se trata de un cerámico a altas temperaturas que al concluir la proyección es
expuesto a un gradiente de temperatura muy grande generándose este tipo de
defectos superficiales, los cuales son deseables para la aplicación que se le dará
pues se busca que exista una integración entre el hueso y la prótesis para así
112 prescindir de los cementos como el polimetilmetacrilato (PMMA) para la fijación
de implantes.
Como se mencionó anteriormente, el extracto de nopal presentó un efecto
dispersante cuando se homogeneizaron ambos polvos; este mismo
comportamiento se presenta durante la proyección de los polvos HA/nAg; se trata
de un material orgánico que al estar en contacto con temperaturas tan altas,
simplemente combustiona sin dejar residuos, por lo que promueve una buena
distribución de nAg sobre la superficie. La generación de aglomerados es
inherente al proceso, la ventaja es que, en este caso se presentan dentro de un
rango de tamaño entre 1-10 m aproximadamente, de los cuales muy pocos
superan los 5 m. V. Orozco Carmona presenta unos resultados de tamaños de
aglomerado del mismo orden (1-10 m) (V. Orozco Carmona, 2014); sin embargo,
se observa mejor distribución en el recubrimiento desarrollado con las nAg
soportadas en extracto de nopal (Figura 437). El mapeo elemental realizado
corrobora la dispersión de Ag que existe, así como la de las trazas de elementos
presentes en la HA, provenientes del hueso: Na, K, Si, Mg (como lo muestra la
Figura 412).
Figura 437. Distribución de plata en el recubrimiento. a) HA/nAg comerciales. b) HA
biológica/nAg matriz extracto de nopal
113
Los resultados de citotoxicidad y genotoxicidad muestran que inicialmente
existe un mayor índice de muerte celular; sin embargo, este puede deberse al
estrés inicial que las células muestran causado por el contacto directo con
biomateriales, comportamiento que es comúnmente observado bajo condiciones
reales de pruebas in vitro. Así mismo, podemos observar que al paso del tiempo
los resultados van comportándose similar al control, indicando que no existe
interferencia del biomaterial en estudio, puesto que las células presentan el mismo
comportamiento en presencia o ausencia del recubrimiento de HA/nAg. Los
resultados del ensayo cometa indican que el recubrimiento HA/nAg no genera
daños al material genético. En general, el material HA/nAg responde de una
manera semejante al control cuando los estudios son realizados con células óseas
de mamíferos, indicando un excelente comportamiento para la utilización
propuesta. Con base en los resultados obtenidos en estudios anteriores, por este
equipo de trabajo (V. Orozco Carmona, 2014), podemos comparar y determinar
que el periodo de adaptación de las células toma mayor tiempo cuando el
biomaterial es HA comercial, como lo muestra la Figura 48; pues después de 24
horas, las células en contacto con la muestra recubierta con HA comercial e HA
comercial con 1%nAg, aunque incrementan su valor de viabilidad, no se
comportan similar al control, como lo hace la HA biológica y la HA biológica con
1%nAg (Ver Figura 44).
114
En el estándar japonés JIS Z2801:2000 se estipula que para que un
material sea considerado como antibacterial debe tener como mínimo un valor de
2 en su actividad antibacterial; el recubrimiento desarrollado en este estudio
presentó valores muy por encima del valor mínimo en las tres bacterias probadas
(E. coli, S. aureus, P. aeruginosa), obteniendo un 99.99% de eficiencia
antibacterial. Resultados similares ya han sido reportados en la literatura; sin
embargo, como se mencionó anteriormente, se trata de recubrimientos
desarrollados mediante técnica de capas; es decir, una capa de HA y una capa
de plata, la cual puede ser depositada a través de nanopartículas, blancos
(targets) o soluciones iónicas de plata dependiendo de la técnica de deposición
elegida (Cong Fu, 2016). Con base en los resultados obtenidos en el 2014 (Figura
49), con HA comercial, se corrobora que la E. coli es la bacteria con mayor
actividad antimicrobial en contacto con nanopartículas de plata, pues en todos los
casos se presenta un valor antibacterial mayor que en comparación con las otras
Figura 48. Viabilidad celular relativa, evaluada con HA comercial (V. Orozco Carmona, 2014).
115 bacterias; también se demuestra que el uso de nAg obtenidas mediante extracto
de nopal presentan un mejor desempeño antibacterial; que si bien en términos del
estándar, ambas nanopartículas (comerciales y sintetizadas con extracto de
nopal) cumplen con el valor mínimo de actividad antibacterial, los mayores valores
se presentan con las muestras que contienen nanopartículas de plata sintetizadas
mediante extracto de nopal.
Figura 49. Actividad antibacterial, evaluada con recubrimientos de HA y nAg comerciales (V. Orozco Carmona, 2014).
116
CAPÍTULO VII
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.
CONCLUSIONES.
El uso de una solución de H3PO4 con pH 2.4 constante, ayuda en la
fragilización del hueso, así mismo, logra una reducción de 16 horas en dicho
proceso.
Los parámetros de extracción óptimos para la preservación de las
propiedades naturales de la HA (preservación de Ca, P, K, Mg, Na, Si) fueron
800°C durante 6 horas.
La previa agitación de los polvos HA y nAg y el uso del equipo de
proyección térmica por plasma (APS) para la aplicación de los recubrimientos
permitió el manejo de la materia prima como un solo producto.
La presencia del extracto de nopal en los polvos tiene un efecto
dispersante, mejorando la distribución de las nAg sobre la superficie del
recubrimiento.
La mínima presencia de CaO promueve la deposición de apatita sobre el
recubrimiento.
Los recubrimientos de HA/nAg presentaron un buen desempeño de
acuerdo a las pruebas de biocompatibilidad, demostrando que el uso de 1% de
117 nAg no genera daño significativo al ADN, ni afecta el ritmo natural de crecimiento
de las células óseas.
La actividad antibacterial del recubrimiento HA/nAg fue óptima; obteniendo
una eficiencia superior al 99%; es decir, el recubrimiento inhibe el crecimiento de
las bacterias S. aureus, P. aeruginosa, E. coli.
RECOMENDACIONES.
Dado que este estudio es el comienzo de una investigación acerca de la
producción y optimización de biomateriales obtenidos mediante métodos menos
dañinos para el medio ambiente (métodos verdes), se recomienda realizar los
siguientes estudios:
Análisis de liberación de los iones: Ca, Ag, Na, Mg, K; en una
solución simulada de fluidos corporales (SBF) para observar su
comportamiento a través del tiempo.
Pruebas electroquímicas en solución simulada de fluidos corporales
para determinar la degradación del recubrimiento.
Determinar las propiedades mecánicas de los recubrimientos
mediante pruebas de adherencia, dureza, módulo de Young,
resistencia a la fatiga.
118
Realizar extracciones de HA a partir de huesos de otros animales
con fin de comparar sus propiedades químicas, biológicas y
mecánicas, como recubrimiento.
Realizar pruebas in vitro con células cancerígenas para observar si
existe afectación en el crecimiento.
119
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