Cinética de La Fermentación Láctica de Suero Ultrafiltrado Con Cultivo Mixtos.revista Tecnica Veterinaria 06082011.Final

7/17/2019 Cinética de La Fermentación Láctica de Suero Ultrafiltrado Con Cultivo Mixtos.revista Tecnica Veterinaria 0608201…

http://slidepdf.com/reader/full/cinetica-de-la-fermentacion-lactica-de-suero-ultrafiltrado-con-cultivo-mixtosrevista 1/15

1

Cinética de la Fermentación Láctica de Suero Ultrafiltrado con Cultivo Mixtos.(Lactobacil lus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacil lus helveticus) .

David Julio Palmar Palmar*; Ronald Roman Romero**; Gisela Paéz1.

Escuela de Ingeniería Química, Laboratorios de Tecnología de Alimentos yFermentaciones Industriales1, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia. Apartado526, Maracaibo. 4001-A, Venezuela, Telf. 0261-4128746, Fax. 0261-7598800.

[email protected]; [email protected]; [email protected]

Resumen

Se estudió la cinética de la fermentación láctica de suero ultrafiltrado con cultivos purosy mixtos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus enrelación 1:1 a condiciones controladas de pH= 5.9 y T= 42 ºC . El suero de leche crudo

y ultrafiltrado fue caracterizado, evaluando sus contenidos de lactosa, nitrógeno, proteína, solidos totales, grasas y pH. El valor de la tasa especifica de crecimientomáxima µmáx=0.4044 ± 0.011 h-1 fue para el cultivo mixto, la constante de crecimientoK S= 7.6289 ± 0.074 Kg/m3, y el rendimiento real YC= 1.3281 (Kg de biomasa

producido/Kg de lactosa consumido) para su mantenimiento. Los modelos deGompertz modificado, ecuación Logístico sencilla, Logístico generalizado por Edwards& Wilke, ecuación de Hanson & Tsao y otros de regresión no lineales se emplearon

para describir la cinética de fermentación del crecimiento de biomasa, consumo desustrato y producción de ácido láctico. Los modelos logístico, Gompertz modificado,modelo logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilke describieronadecuadamente la cinética fermentación del suero ultrafiltrado bajo condiciones de pH

controlado.

Palabras claves: Cultivo por carga, cultivo mixto, suero ultrafiltrado, modelo cinético,modelos de regresión no lineales.

Kinetics of Lactic Fermentation Whey Ultrafiltration with mixed cultures.(Lactobacil lus delbruecki i subsp. bulgaricus y Lactobacil lus helveticus) .

David Julio Palmar Palmar*; Ronald Roman Romero**; Gisela Paéz1.

Escuela de Ingeniería Química, Laboratorios de Tecnología de Alimentos y

Fermentaciones Industriales1, Facultad de Ingeniería, Universidad del Zulia. Apartado526, Maracaibo. 4001-A, Venezuela, Telf. 0261-4128746, Fax. 0261-7598800.

[email protected]; [email protected]; [email protected]

Abstract

It was studied kinetic of the fermentation of whey ultrafiltrate with batch cultures of Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus and Lactobacillus helveticus pure and mixedin the ratio 1:1 batch culture under conditions of controlled pH= 5.9 and T = 42 ºC. Thewhey crude and ultrafiltrate was characterized, and its contents of lactose, nitrogen,

protein, total solid, fat and pH evaluated. The value of the specifies of growth rate

maximum was 0.4044 ± 0.011 h-1

for the mixed culture, the saturation constant K S=7.6289 ± 0,074 Kg/m³ and true yield YC = 1.3221 (kg biomass produced/Kg of lactose



2

consumed for growth) for its maintenance were determined from the culture batchexperiments. The models of modified Gompertz, equation simple Logistic, Logisticgeneralized by Edwards & Wilke, equation of Hanson & Tsao and others of regressionnonlinear were used to describe the kinetic of fermentation of the growth of biomass,substrate consumption and lactic acid production. A logistic, Gompertz Modified and

logistic generalized model proposed by Edwards & Wilke it suitably described thekinetic fermentation of the whey ultrafiltrate under condition of pH controlled.

Key words: batch culture, mixed culture, whey ultrafiltrate, kinetics model, models ofnonlinear regression.

Introducción

En Venezuela existen alrededor de 80 plantas industriales con una producción anualentre 50 y 60.000 toneladas de quesos, principalmente fresco, que proviene casi en su

totalidad de leche de ganado vacuno. Se puede calcular que este volumen de materiasólida genera alrededor de 150.000 toneladas de suero de leche que en su mayoría essuero dulce, una pequeña parte se seca para obtener suero en polvo, otro se añade comocomplemento de dieta en la alimentación de porcinos y bovinos, en otros casos se extraelactosa, la otra se emplea en la industria de alimento, no obstante, no menos del 80 %del suero es desechado [1].

El ácido láctico obtenido por fermentación del suero de leche a través de procesos de bioconversión utilizando bacterias lácticas (Lactobacillus helveticus, Lactobacillusdelbrueckii. subsp.bulgaricus, Lactobacillus casei etc.) pueden llevarse a cabo por dosvías; Cultivo por Carga y Cultivo Continuo. El suero, actuará como sustrato (lactosa)

para producir el ácido láctico se seleccionara el microorganismo capaz de crecer ensuero de leche y fermentar la mayor parte, si no es que toda, la lactosa a ácido láctico[2]. Aunque el suero contiene alrededor del 93% de agua, la composición típica delsuero de leche producido del queso, que damos a continuación, en la Tabla 1, se indicala presencia de valiosos elementos nutritivos [3,4].

En Venezuela anualmente se gasta una gran cantidad de divisas en la adquisición deácido láctico, alrededor de 7.576.321millones de Bolívares Fuertes en el periodo 2000-2008 en pago de importaciones Venezolanas de Ácido Láctico a diversos países

productores tales como: Alemania, México Suiza, USA, Holanda, Colombia, Japón,China, con el fin de utilizarlo en diversos sectores del estado como el médico,

farmacéutico, industrial, universitario entre otros; estas divisas por concepto deimportación del producto podrían ahorrarse obteniendo este ácido por medio de los

procesos biotecnológicos [5,6].

El procesamiento del suero fresco tiene como objetivo extraer de él los componentesvaliosos, es decir, las proteínas y la lactosa. Las técnicas de procesamiento pueden serdivididas en dos grupos: Técnicas de Concentración y Técnicas de Separación, estaúltima consisten en separar directamente de la solución diluida del componente queinteresa. Las principales técnicas de este tipo son la ósmosis inversa, ultrafiltración y

precipitación de proteínas [7].

El uso de membranas en los recientes años ha llegado a ser aceptada y entendida enla industria láctea, membranas como por ejemplo la Ultrafiltración (UF), describe los



3

procesos en los cuales las partículas de tamaño significativamente más grande queestán en el solvente son retenida cuando la solución es hidráulicamente forzadas a travésde una membrana de poros muy fina y Ultra ósmosis (Nanofiltración).

La membrana de ultrafiltración (UF) puede ser mejor descrita como un filtro. Las

membranas de UF fraccionan entre la proteína molecular y la lactosa seguida de agua,cenizas, y la lactosa pasa a través de él mientras reinyecta proteína y grasa. Lasmembranas estándar para sistemas de UF usada en la industria láctea son de

polietersulfano. Las membranas de Ultra osmosis (Nanofiltración), son descritas como barreras formadas de una poliamida soportadas sobre una polietersulfona. Este resultaen una barrera de capa rica en grupos carboxilatos, reinyecta sales y es controlada portamaño y carga iónica. La utilidad de la membrana además de acrecentarsimultáneamente la capacidad de concentrar es la de reinyectar las especies [8,9,10]

Tabla 1. Composición Típica Porcentual Aproximada del Lactosuero [3,4].

Componente

Ácido

láctico.

Proteínas. Lactosa. Cenizas. Lípidos. pH. Agua.

Composición %0.20 0.9 4.9 0.6 0.3

6.6a

5.893.1

En un proceso de fermentación las ecuaciones cinéticas más importantes que debenconocerse son la producción de biomasa, la formación de producto y el consumo desustrato [7]. Esto se logrará por la obtención de datos experimentales a nivel delaboratorio para de este modo ajustar estos datos con las ecuaciones cinéticas propuestaen la literatura. Los modelos pueden ayudar a disminuir la cantidad requerida de tiempode evaluación y costos, además permite un diseño más óptimo y/o eficiente de prueba,

permiten mejorar la cadena de distribución, por ejemplo en la calidad de elaboración dealimentos [11]. Las ecuaciones más frecuentes que se reportan se muestran en la Tabla2. [7].

Un modelo empleado para crecimiento bacterial es el logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11]. El modelo tiene la siguiente fórmula:

it F EXP

M Ci

1 ec. (1)

dónde n

noi t at at aat F .....

2

21 .

Este modelo también puede ser usado para evaluar las velocidades de consumo desubstrato y formación de productos respectivamente. Las velocidades de procesosfueron evaluadas tomando la derivada de Ci, con respecto al tiempo de la siguientemanera:

1

21 .....21

n

ini t nat aa

K

CiCi

dt

dCi

ec. (2)

Un modelo predictivo para curvas de crecimiento empleado satisfactoriamente es la

ecuación modificado de Gompertz sugerido por Zwietering et al [12]. En el cual lacurva de crecimiento es definida como el logaritmo Neperiano del tamaño relativo de la



4

población [Y=LN(N/No) o LN(X/Xo)] como una función del tiempo (t). La ecuaciónmodificada de Gompertz consta de tres parámetros a,b,c que ha sido reparametrizada

para incluir parámetros de contenido biológico como A, µmáx , y λ , para representar

curvas de formas sigmoidales definidas por los datos experimentales.

La máxima velocidad de crecimiento especifica µmáx , es definida como la tangenteen el punto de inflexión, el tiempo de adaptación λ, es definida como el intercepto deleje t con esta tangente; y la asíntota A es igual LN(X/Xo), la cual es máximo valoralcanzado de crecimiento microbiano, utilizando análisis de regresión no linear se puedehallar estos parámetros a partir de la data experimental. La expresión final resulta:

Y = A exp{-exp[(µmáx e(1) /A)(λ – t) +1]} ec. (3)

Tabla 2. Ecuaciones y modelos Cinéticos para la Biomasa, Consumo y Producción [7].

Materiales y Métodos

Microorganismo

Los microorganismos utilizados fueron Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

ATCC 27558 y Lactobacillus helveticus ATCC 8018 . El Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 27558 y el Lactobacillus helveticus ATCC 8018 fueronobtenidos liofilizado de la American Type Culture Collection, Rockville, Md.

Para el cultivo de las bacterias, se reactivaron los microorganismos liofilizados enleche, durante 48 horas a 37°C, de los tubos de reactivación ( 25*150 mm), se tomó 1ml y se transfirió a unos tubos, con 9 ml de un medio de formulación específico paralactobacterias, con la siguiente composición: Leche descremada 100 g/ 1L, jugo detomate 100 mL/ 1L se filtró a través de papel de filtro y se ajustó el pH a 7 se deja todala noche a 10 °C, extracto de levadura 5 g/ 1L y agua destilada hasta completar 1L conel pH ajustado a 7. Se incuba a 37 °C durante 24 hr en los tubos; y se refrigera a 4°C

para su conservación [13,14].



5

Muestras: Suero de Leche

El suero de leche o lactosuero empleado fue suministrado por la empresaVENELACTEOS ubicada en Santa Rosa de Agua en Maracaibo, Edo. Zulia-Venezuela, Proveniente de la etapa inicial de producción de queso blanco prensado de

mano (suero de leche dulce pH = 6.5), y se transportó hasta el laboratorio de Ciencia yTecnología de la Leche de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad delZulia, en un lapso aproximado de 2 horas.

Equipo: Ultrafiltración. Desproteinización y Suplementación del Suero de Leche

Un volumen de 100 litros de suero fue fraccionado en 5 partes iguales para ser procesado en lotes de 20 litros. El módulo fue cebado con 2 litros de sueroaproximadamente. El suero se colocó en el tanque para ser recirculado a unatemperatura de 30 ± 5 ºC. Se utilizó una planta piloto de filtración tangencial divididaen dos procesos en serie; un proceso de ultrafiltración y un proceso de nanofiltración,.

[9].

Fermentación:

Las fermentaciones por carga se realizaron en fiolas de 500 ml de capacidad, en unincubador rotatorio New Brunswick modelo INNOVA 4300 y en el fermentador NewBrunswick modelo Bioflo 4000 con capacidad máxima de 5 litro. Se utilizó 300 ml desuero suplementado, esterilizado en el auto clave a 115 ° C durante 15 minutos, seinoculó el microorganismo en campana de flujo laminar, y se sellan las fiolas con papel

parafinado para garantizar anaerobiosis. La fermentación se llevó a cabo manteniendo latemperatura a 42 °C sin agitación.

En el fermentador se empleó 2.7 litros de suero suplementado, y se esterilizó en elmismo equipo, calentando con vapor a 115 °C durante 15 minutos. Se inocula el cultivoen el fermentador en condiciones asépticas, y se realizó la fermentación sin aireación,con control de pH a 5.9, además controlando la temperatura a 42 °C y agitación de 50 a100 rpm, se empleó Tween 80 como antiespumante en una concentración de 1 g/ L.

Cultivo por Carga

Se realizaron 8 cultivos por cargas y por duplicado a temperatura de 42 °C y pH a5.9 con agitación de 100 rpm, utilizándose Tween 80 como antiespumante en unfermentador New Brunswick, modelo Bioflo 4000 para un volumen de trabajo de 3litro; 0.3 litro corresponde al inóculo. Se midió la concentración de biomasa, lactosa yácido láctico, cada hora hasta alcanzar el máximo crecimiento logarítmico de biomasa a

partir de la hora de inoculación, denominada hora cero (0).

Determinaciones: Métodos de Análisis

A las muestras de suero original, concentrado de proteína y permeados deultrafiltración, se les determinó por triplicado Nitrógeno por el método Kjeldahl [15]. Elcontenido de Proteína se determinó como el porcentaje de nitrógeno multiplicado por el

factor 6.38 [15]. Sólidos totales y cenizas se determinó empleando los método de laA.O.A.C. (calentamiento en estufa y mufla) [15], Grasa por el método volumétrico de



6

Gerber (Gerber-Schneider) [25]. La concentración de biomasa se determinóturbidimétricamente, midiendo la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetromodelo CARY UV – 50 VARIAN (Mulgrave, Victoria, Australia) a una longitud deonda de 490 nm. Relacionando la densidad óptica (D.O) con el peso seco de la biomasa

por unidad de volumen a través de la construcción previa de la curva de calibración

[16].

El contenido de lactosa se determinó utilizando el método espectrocolorimétrico deDubois & Col [17]. (método fenol ácido sulfúrico), empleando un espectrofotómetromodelo CARY UV – 50 VARIAN (Mulgrave, Victoria, Australia) a intervalosconstantes de una hora desde el inicio de la fermentación a una longitud de onda de 490nm. Para la medición se utilizó una curva de calibración [17]. La concentración de ácidoláctico se determinó por cromatografía en fase gaseosa, empleando un cromatógrafoPerkin Elmer, XL Autosystem (Norwalk, USA) provisto con un detector de ionización ala llama (PID) equipado con una columna capilar Carbowax, para ácidos grasos, de 15metro de longitud y 0.25 mm de diámetro. [7,2].

Método para Simulación de Modelos Cinéticos

Los distintos modelos cinéticos disponibles para la fermentación láctica en producción del ácido, biomasa y consumo del sustrato en el sistema por carga fueronanalizados por regresión no lineal empleando un algoritmo modificado de Marquardt[18] y software denominado Curve Expert Versión 1.3 [19].

Resultados y Discusiones

Composición del Suero de Leche

La caracterización promedio del lactósuero empleado en este estudio fue de queso blanco prensado, suero de leche fresco crudo, se presenta en la Tabla 3. El análisis y lacaracterización del suero crudo, indicó que es un suero dulce. Este suero, contiene

proteínas remanentes sin desnaturalizar. La caracterización del suero luego de laultrafiltración y tratamiento térmico ácido arrojó resultados en lactosa, nitrógeno,

proteínas, sólidos totales, cenizas, grasas y pH, temperatura de 35°C mostrados en laTabla 3. Al emplear el proceso de ultrafiltración de esta forma se logró una eficienteremoción de proteína, como en el suero dulce empleado en el estudio de Araujo y col[20].

Al observar y comparar los valores reportados en dicha tabla, muestran que ladesproteinización es más efectiva utilizando el proceso de ultrafiltración tangencial ytratamiento térmico ácido, que los valores reportados por Jakymec y Moran H. [7]

,Urribarri, y Vielma [2], Quintero y Rodríguez [13]. También se observa que los valoresde la Tabla 3 del suero crudo son similares a la composición promedio obtenidos porFaría, García y García [3,4] y así como también por los alcanzados por Muñi [9].

Cultivo por Carga

Las Figuras 1 y 2 muestran el progreso de las fermentaciones de cultivos puros, L.

delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus y sus cultivos mixtos en relación 1:1,respectivamente. Estas Figuras representan el comportamiento de los microorganismosen las fermentaciones de cultivos por cargas en términos de crecimiento y consumo de



7

sustrato observándose que el tiempo de la fase de adaptación de crecimiento tuvo un periodo corto, y fase de crecimiento exponencial de 8 horas promedio a temperatura de42 °C y pH 5.9 controlado. Esto indica una adecuada adaptación de losmicroorganismos al medio. La mayor producción de biomasa se presentó en el cultivode L. helveticus (99,966±0.105 Kg/m3), como se muestra en la Figura 1.

Tabla 3. Caracterización promedio del suero de leche. Materia Prima.

Composición %Suero Crudo. Suero Ultrafiltrado*.

Lactosa (Kg/m ). 64.8818 ± 0.2371 58.94 ± 0.5636

Nitrógeno (%P/V). 0.1395 ± 0.0084 0.0406 ± 0.0027

Proteína (%P/V). 0.8903 ± 0.0538 0.2592 ± 0.0177

Sólidos totales (%P/V). 6.6464 ± 0.0056 3.2731 ± 0.1539

Cenizas (%P/V). 0.5108 ± 0.0028 0.3819 ± 0.01380

Grasa (%P/V). 0.52 ± 0.1347 0.0

pH. 6.55 ± 0.2273 4.53 ± 0.2345

*Resultado obtenido posterior al proceso de ultrafiltración en suero desproteinizado por tratamiento térmico acido, para mejorar la eficiencia de remoción de proteína.

En la Tabla 4 se reportan los valores de velocidad específica de crecimientocalculados a partir del ajuste lineal de la pendiente de biomasa Vs tiempo en la regiónde crecimiento exponencial así como también la biomasa en los bioprocesos por carga.

La máxima velocidad especifica de crecimiento (µmáx) fue de 0,4189±0.214 h-1 parael cultivo puro de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, en suero ultrafiltrado.

Los resultados indican que se obtuvo biomasa de forma satisfactoria utilizando sueroultrafiltrado y suplementado, al igual que estudios en donde solo se varió elmicroorganismo y las variables de operación de los bioprocesos, como en el estudio deBuitrago y Soto [21], donde se logró altos niveles de proteína celular a partir de sueroultrafiltrado diluido.

Tabla 4. Velocidad específica de crecimiento (µ) y biomasa en cultivo por cargade Lactobacillus en suero de leche ultrafiltrado a pH =5.9 y T = 42 °C.

Microorganismo. µmáx(h-1). X(Kg/m3) R 2.

Lactobacillus helveticus. 0.2431 ± 0.119 99.966±0.105 0.9703

Lactobacillus delbrueckii subsp

bulgaricus. 0.4189± 0.214 25.28± 0.85 0.9755

Mezcla(1:1)

L. helveticus/ L. Delbrueckii subsp

bulgaricus.

0.4044 ± 0.011 82.2186± 0.72 0.9891

El comportamiento del crecimiento con respecto al consumo de sustrato puede sercomprendido con el valor de rendimiento YX/S observado para cada cultivo como semuestra en la Tabla 5 junto con los rendimientos de productos YP/S, además de los

valores de concentraciones de ácido láctico en función del tiempo correspondiente lascondiciones utilizadas en el cultivo por carga (a partir de las Figuras 1 y 2).



8

La producción de ácido láctico de cultivos puros se observan en la Figura 3, así comolos cultivos mixtos a partir del suero de leche ultrafiltrado y suplementadoobservándose una mayor de producción de ácido láctico en el cultivo mixto en relación(1:1), con un máximo de 11.9173 Kg/m3, hubo una variación mínima en la producción

en el cultivo puro de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (8,7436± 0.851Kg/m3), con respecto al del Lactobacillus helveticus (8,7940± 0.111 Kg/m3).

Tabla 5. Concentración y Productividad de ácido láctico en cultivo por carga deLactobacillus en suero de leche ultrafiltrado a pH =5.9 y T = 42 °C.

Microorganismo. ConcentraciónAcido

P (Kg/m3)

RendimientoYX/S (Kg/m3.h)

RendimientoYP/S (Kg/m3.h)

Lactobacillus helveticus. 8.7940± 0.1114,9267

0,2012

Lactobacillus delbrueckii subspbulgaricus.

8.7436± 0.851 1,3751 0,3767

L. helveticus/ L.delbrueckii subsp

bulgaricus. Mezcla(1:1)11.9173± 0.562 1,3281 0,1429

Desarrollo de Modelos Cinéticos

La fermentación de la lactosa empleando lactobacteria ( Lactobacillus delbrueckii

susbsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus), sirvió para demostrar el crecimientomicrobiano o producción de biomasa, consumo de sustrato y producción de ácido

láctico. Los resultados experimentales de esta fermentaciones por carga mostradas enlas Figuras 1,2,3 fueron utilizadas también para desarrollar los modelos cinético de lafermentación de los cultivos puros y mixtos empleando la lactosa del suero ultrafiltrado.Para la producción de biomasa de los cultivos puros y mixtos fueron simulados segúnlos modelos cinéticos y matemáticos mostrados en la Tabla 2, además de la deGompertz modificado [12], esto se muestran en las Figuras 4,5 y 6.

Se pudo observar que las ecuaciones o modelos de la Tabla 2, simularon la fase deadaptación, pero no se ajustaron exactamente al comportamiento de la data experimentalen la zona de crecimiento exponencial, la ecuación de Amrane & Prigent [22] presentóuna buena simulación para la producción de biomasa desde la fase de adaptación,crecimiento exponencial, hasta la fase de muerte, a pesar de no tener una buenacorrelación en relación a los datos experimentales, este comportamiento se observó enla Figura 4 para el cultivo de Lactobacillus helveticus.

Para el cultivo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de la Figura 5 se notóque los modelos igualmente simulan el corto periodo de adaptación de la dataexperimental, así como la de crecimiento exponencial, la que presento un mejormodelamiento fue la ecuación logística modificada por Edwards & Wilkes[11]. De lasFiguras 4, 5, 6 se desprende que el modelo con mejor ajuste para la producción de

biomasa fue el de Gompertz Modificado[12], logístico modificado por Edwards &

Wilkes[11] y Logístico sencillo [7] debido al ajuste de regresión no lineal las cualesobtuvieron una alta correlación.



9

La data experimental fue alisada o modelada utilizando también el modelo logísticogeneralizado para la biomasa sugerido por Edwards & Wilkes [11]. Igualmente elmodelo logístico generalizado también fue utilizado para evaluar la utilización desustrato y velocidades de producción de ácido láctico, en las Figuras 7, 8,9 y 10, 11,12respectivamente.

Para los modelos de Consumo de Sustratos, de los cultivos puros de la Figuras 7 y 8,se observó que no modelaron el comportamiento de los datos experimentales, ademásno se obtuvo una buena correlación para el ajuste de dichos modelos con respecto a ladata. Este comportamiento es más notorio en la zona que corresponde a la faseexponencial de los microorganismos, de manera similar se presenta uncomportamiento de dichas modelaciones en la Figura 9 para el cultivo mixto de

Lactobacillus helveticus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

La aplicación del modelo logístico generalizado sugerido por Edwards & Wilkes[11], tiene una alta precisión y una representación próxima a los resultados para evaluarlas velocidades de consumo de sustrato. Esto se observa en las Figuras 7, 8 en cultivos

puros, al igual que en cultivos mixtos Figura 9. En los modelos de producción de ácido

láctico el mejor ajuste a los datos experimentales para el Lactobacillus helveticus fue elde Hanson & Tsao [23] lo que indica una buena correlación, como se muestra en laFigura 10.

A pesar de que en la literatura el modelo mayormente empleado es el de Luedeking& Piret [24] el cual simuló un comportamiento análogo al experimental, no presenta unacorrelación buena con respecto a la de Hanson & Tsao [23]. El de modelo deProducción Sencilla [7] presentó una curva similar a la de Luedeking & Piret [24]. Elmodelo Logístico [7] ajusto en un rango razonable que al final de los datos de

producción de ácido láctico Vs el tiempo cae bruscamente por lo cual ajusta solo en el periodo de producción exponencial. En la cinética de producción de biomasa los

modelos basados en función del modelo de Monod [7], resultaron inadecuados paraexpresar el crecimiento de las lactobacterias, se pudo observar que la linealidad

Figura 2. Consumo de lactosa en cultivo por carga, Lactobacillus helveticus ( L.h) () ; Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus ( L.b) (▲) y cultivosmixtos ( L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC.

Figura 1. Crecimiento en cultivo por carga, Lactobacillus helveticus ( L.h) (); Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus ( L.b) (▲) y cultivos

mixtos ( L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado aH= 5.9 T= 42 ºC.



10

Figura 3. Producción de ácido láctico en cultivo por carga, Lactobacillus helveticus ( L.h) () ; Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus ( L.b) (▲) y cultivosmixtos ( L.h/L.b) (•), en suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC.

t

OOm

t

Om

e X X X

e X X X

predicha por el modelo de Monod [7] ajusta solamente parte de la fase de crecimientode biomasa. Esto indica que no represente completamente la fermentación esto se puedeobservar en las figuras 4,5 y 6.

Los modelos en algunos casos produjeron parámetros erróneos o con valores irreales,en los cultivos sencillos de L. helveticus y L. delbrueckii subsp. bulgaricus, para obteneruna representación gráfica de la cinética de la producción de biomasa en cultivo porcarga en suero ultrafiltrado, los modelos que significativamente produjeron mejor ajusteresultaron el modelo de Gompertz modificado [12], Logístico generalizado propuesto

por Edwards & Wilkes [11] y Logístico sencillo [7], para simular la producción de biomasa presentó unas correlaciones de 0.9986, 0.9987 y 0.9678 respectivamente encultivo mixtos. Se observó prácticamente una fase adaptación corta en el crecimiento de

biomasa en todos los bioprocesos en cultivo carga. A continuación se expresan losresultados de los datos encontrados por la simulación:

Para producción de biomasa cultivos mixtos:

Modelo modificado de Gompertz sugerido por Zwietering et al [12]:

Y= 4,12699*exp{-exp[(0,52553 *e(1) /4,12699)*(0,97511 – t) +1]}

λ = 0,97511389; µmáx =0,52553572 h-1

; A= 4,126964; corr=0.9986

Modelo de Edwards & Wilkes [11]:

CB= M/[1 + EXP(∑i=5i=0ait

i)]

M= Biomasa= 92.0848 Kg/m3; ao=4.7448; a1=-0.6977; a2=5.220X10-2; a3= -8.7323X10-

3; a4=6.6468X10-4; a5=-1.67192X10-5; corr=0.9987

Modelo Logístico [7]:

µmáx =0,4404 h-1 ; Xo= 2.50653 Kg/m3; Xmáx= 82.2186 Kg/m3 ; corr=0.9678

Figura 4.Simulación de curvas de crecimiento de cultivo porcarga de Lactobacillus helveticus ( L.h) en suero de lecheultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuasajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data

experimental ;(□) Monod; () Luedeking & Piret; (○)

Logistico; ( ) Amrane & Prigent; () Edwards & Wilke;() Gompertz Modificado



11

En los modelos de consumo de sustrato, del análisis gráfico se desprende que losmodelos para simular la utilización de sustrato para la conversión de la lactosa a ácidoláctico, el modelo Logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11]

proporcionó una buena descripción de la cinética de consumo y el modelo de Hanson& Tsao [23] en cultivos por carga produjo una correlación de 0.9987 y 0.7892 en este

orden. La concentración inicial de sustrato óptima fue obtenida de los resultadosexperimentales y posteriormente hallados en la simulación a través de los modelos oecuaciones por ensayo y error .

Modelo de Edwards & Wilkes[11] :

CB= M/[1 + EXP(∑i=5i=0ait

i)]

CS= Sustrato; M= 67.8 Kg/m3; ao=88.14; a1=0.72426; a2= -1.3436X10-2; a3=1.5529X10-3; a4=-8.61956X10-4; a5=1.93965X10-5; corr=0.9887

Ecuación de Hanson & Tsao [23].

S= 67,869*EXP(-3,6789X10-2 *2,50456*(EXP(0,325*t)-1))

So=67.869 Kg/m3; µ=0.325h-1; Ks=3.6789X10-2 m3/Kg*h; Xo= 2.504563 Kg/m3 ;corr=0.7892

Para la simulación de la cinética de producción de ácido láctico los modelos que produjeron mejor resultados en cultivo mixtos resulto los modelos Logístico sencillo [7]y Logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes [11] los cuales brindaronuna correlación de 0. 9865 y 0.9887. A continuación se describen las ecuaciones quemejor representan el proceso de fermentación de suero ultrafiltrado: Para producción de

ácido láctico en cultivos mixtos:

Figura 5.Simulación de curvas de crecimiento por carga de Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ( L.b) en suerode leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneascontinuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•)

Data experimental ;(□) Monod; () Luedeking & Piret; (○)

Logistico; ( ) Amrane & Prigent; () Edwards & Wilke;() Gompertz Modificado

Figura6.Simulación de curvas de crecimiento de cultivosmixtos( L.b/L.h) por carga de Lactobacillus delbrueckii

subsp.bulgaricus ( L.b) y Lactobacillus helveticus (L.h) ensuero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneascontinuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2.(•) Data experimental ;(□) Monod; () Luedeking &Piret; (○) Logistico; ( ) Amrane & Prigent; ()Edwards & Wilke; () Gompertz Modificado



12

Modelo de Edwards & Wilkes [11]:

CP= (Po*0.20+Po)/[1 + EXP(∑i=5

i=0aiti)]

CP= Producción de ácido láctico; Po= 2.452399 Kg/m3; ao= 15,492; a1= 0,70856;a2= - 1.4843X10-2; a3= 1.82694X10-3; a4=- 9.93434X10-4; a5=1.928X10-5;corr=0.9887

Modelo Logístico [7].P=[Po*Pmáx*EXP(P’o*t)]/[ Pmáx- Po+ Po*(EXP(P’o*t))] ; P´o = r po / Po (h-1);

r po=(Kg*m

-3

*h

-1

).Po=3,23056 Kg/m3; Pmáx= 11,91735 Kg/m3; P’oavg = 0,2010549 corr=0. 9865

La data experimental alisada o modelada empleando el modelo logísticogeneralizado propuesto por Edwards & Wilkes [11], para evaluar las velocidades de

producción de ácido láctico, fue adecuada para este propósito tanto para los cultivos puros como para el cultivo mixto. Esto se observa en las figuras 10,11 en cultivos puros,al igual que en cultivos mixtos figura 12.

Figura 7. Simulación del consumo de sustrato en cultivo porcarga de Lactobacillus helveticus ( L.h) en suero de lecheultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuasajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Data

experimental ;(□) Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh etal.; ( ) Aborhey & Williamson; (○) Edwards & Wilke.

Figura 8. Simulación del consumo de sustrato encultivo por carga de Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus ( L.b) en suero de leche ultrafiltrado a pH=5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas ajustadas a partir delos modelos de la Tabla 2. (•) Data experimental ;(□)Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh et al.; ( )

Aborhey & Williamson; (○) Edwards & Wilke.

Figura 9.Simulación de consumo de sustrato de cultivosmixtos( L.b/L.h) por carga de Lactobacillus delbrueckii

subsp.bulgaricus ( L.b) y Lactobacillus helveticus (L.h) en suerode leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas continuas

ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Dataexperimental ;(□) Monod; (▲) Hanson & Tsao; () Yeh et al.;( ) Aborhe & Williamson; (○) Edwards & Wilke.

Figura 10. Simulación producción de ácido láctico encultivos por carga de Lactobacillus helveticus (L.h) ensuero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC.Líneas continuas ajustadas a partir de los modelos de laTabla 2. (•) Data experimental; () Producción

sencilla; () Luedeking & Piret; (▲) Hanson & Tsao;()Logistico (○) Edwards & Wilke.



13

CONCLUSIÓNES

El suero de leche ultrafiltrado y suplementado es adecuado para la producción deácido láctico utilizando cultivos mixtos de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L.

helveticus obteniéndose valores de rendimiento real YC= 1.3281 (Kg de productos/Kgde lactosa consumido para crecimiento). La producción de ácido láctico en este estudiofue de 11.9173 ± 0.562 Kg/m³ en cultivo mixto de Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus y Lactobacillus helveticus a condiciones controladas de pH= 5.9 y T= 42 ºC.

El consumo de la lactosa fue mayor en el cultivo mixto, esto explica que haya una producción con alto rendimiento en ácido láctico; lo cual no ocurrió en los cultivos puros de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus dondese obtuvo una producción promedio de 8.75 Kg/m³ para ambas especies. La mayor

producción de biomasa fue 99.966 ± 0.105 Kg/m³ en cultivo puro de Lactobacillus

helveticus, mientras que en Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus fue de 25.8 ±0.85 Kg/m³; en cultivo mixto la biomasa producida fue de 82.2186 ± 0.72 Kg/m³ , estecomportamiento de concentraciones finales de biomasa determina en cierta forma la

utilización de sustrato por parte de las lactobacterias anaeróbicas.Los modelos que produjeron mejor ajuste para cultivos puros y mixtos en la cinética

fermentación del suero ultrafiltrado bajo condiciones de pH y temperatura controlado para la biomasa resultaron el modelo de Gompertz modificado, Logístico generalizado propuesto por Edwards & Wilkes y Logístico sencillo, para consumo de sustratoresultaron el modelo de Edwards & Wilkes, Hanson & Tsao y para la producción deácido resultaron el modelo de Edward & Wilkes, Logístico, Producción Sencilla

Es de destacar que el suero de leche ultrafiltrado (lactosuero), empleando un procesode Ultrafiltración y Nanofiltración en una Planta Piloto de Filtración Tangencial resulta

un sustrato idóneo para determinar la cinética de fermentación con cultivos lácticos para la producción de ácido láctico.

Figura 11. Simulación producción de ácido láctico en cultivos porcarga de Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ( L.b) ensuero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y T= 42 ºC. Líneas

continuas ajustadas a partir de los modelos de la Tabla 2. (•) Dataexperimental; () Producción sencilla; () Luedeking & Piret;(▲) Hanson & Tsao; ()Logistico (○) Edwards & Wilke.

Figura 12. Simulación producción de ácido láctico encultivos por carga mixtos ( L.b/L.h) de Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus ( L.b) y Lactobacillus

helveticus (L.h) en suero de leche ultrafiltrado a pH= 5.9 y

T= 42 ºC. Líneas continuas ajustadas a partir de losmodelos de la Tabla 2. (•) Data experimental; ()Producción sencilla; () Luedeking & Piret; (▲) Hanson &Tsao; ()Logistico (○) Edwards & Wilke.



14

AGRADECIMIENTO

Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia(CONDES) por el financiamiento de la presente investigación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] HUGGINS R. K., JUAREZ D. J.,(2007) Efecto de la Velocidad de Agitación en laProducción de Ácido Acético a partir de Lactosuero. Trabajo Especial de Grado.Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia.

[2] URRIBARRI, L. VIELMA, A. (1999) "Producción de Ácido Láctico en CultivoContinuo Utilizando L. Helveticus a partir del Suero de Leche". Trabajo Especial deGrado. Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia.

[3] FARIA, J. GARCIA, ALEIDA. GARCIA, AIZA. (2003) “Eficiencia en laconcentración de la proteína de Lactosuero con una Planta Móvil de Ultrafiltarcion y

Nanofiltración” Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XIII, Nº 5, 347-351, 2003.

[4] FARIA, J. GARCIA, ALEIDA. GARCIA, AIZA. (1997) " Efecto de la tecnologíaquesera sobre la composición del suero lacteo". Acta Cientifica Venezolana, 48 (supl.1).

[5] INSTITUTO NACIONAL DE ESTADÍSTICA (INE) (2008) "Anuario de Comerciode Exterior de Venezuela 1999-2003. Tomo II.

[6] CAVILAC (CAMARA VENEZOLANA DE LA INDUSTRIA LACTEA) (2008) LaIndustria Lechera en Venezuela su Evolución 2008. 13ª Edición.

[7] JAKYMEC, M. MORAN, H. (1997) "Producción de Ácido Láctico porFermentación Sumergida." Trabajo Especial de Grado. Facultad de Ingeniería.Universidad del Zulia.

[8] BUTTERWORTH, T.A., D.I.C, WANG AND A.J. SINKEY (1970). "Applicationof ultrafiltration for enzyme retention during continuous enzymatic reaction".BIOTECHNOL.BIOENG. 12 : 615- 631.

[9] MUÑI, A. (2002) "Optimización de los Procesos de Ultrafiltración y Nanofiltraciónen una Planta Piloto de Filtración Tangencial". Trabajo Especial de Grado. Facultad deIngeniería. Universidad del Zulia.

[10] HUTSON TODD A..(1989) RO/UO/UF. "Membrane Technologies for the DairyIndustry". Filtation Engineering Co.Inc.Champlin,MN.USA.

[11] EDWARDS, V.H. & WILKE, C. R.,(1968) "Mathematical Representation of BatchCulture Data" Biotechnol.Bioeng., 10 page 203-32.

[12] ZWIETERING,M.N., JONGENGURGER, I., ROMBOUTS, F.M., AND VAN'T

RIET, K,. (1990) "Modeling of the Bacterial Growth Curve". Appl.Environ.Microbial.Vol 56 No 998 p.1875-188.



15

[13] QUINTERO, H. RODRIGUEZ, M. (1999) "Producción Continua de ProteínaUnicelular (K.fragilis) a partir del Suero de Leche".Trabajo Especial de Grado.Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia.

[14] RAMONES, E; MÁRMOL, Z; RINCÓN M; Y PÁEZ G.(2000). "Producción deÁcido Láctico de un Cultivo Mixto de Lactobacillus helveticus y Lactobacillus bulgaricus en Suero de Leche". Trabajo Especial de PostGrado. Facultad de Ingeniería.Universidad del Zulia.

[15] A. O. A. C. (1990) Official Methods of analysis. 15th edition. Association ofOfficial Analytical Chemists. Arlington, Virginia.

[16] PIRT, S.(1975) " Principles of Microbe and Cell Cultivation". Blackwell ScientificPublications.London.

[17] DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBERS, P. A.; SMITH,F.(1956) “Colorimetric method for determination of sugars and related substances”.Analytical Chemistry. 28(3): 350-356.

[18] LEVENBERG- D.W. MARQUARDT (1963.JUN) .An Algorithm for the Least-Squares Estimation of Nonlinear Parameters. SIAM Journal of Applied Mathematics,11(2):431 – 441.

[19] CURVEEXPERT 1.3 (2009 MARCH) Package for Windows. A Comprensivecurve fitting. [Onine] Disponible en http://s91928265.onlinehome.us/curveexpert/

[20] ARAUJO K., PÁEZ G., MARMOL Z., Y COL (2007) “Efecto de la Concentraciónde la Lactosa sobre la Cinetica de Crecimiento de Kluyveromices Marxianus varMarxianus y la Producción de β-D- galactosidasa”. Revista Técnica de La Facultad deIngenieria del Zulia 30(1) 64-73.

[21] BUITRAGO G. G., SOTO A. L.R., (2006) “Producción Continua de ProteínaCelular de Kluyveromices Marxianus var Marxianus. A partir de Lactosuero Diluido”.Trabajo Especial de Grado. Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia.

[22] AMRANE A & PRIGENT.R. (1994) "Mathematical Model for Lactic Acid

Production from Lactose in Batch Culture. Model development and Simulation" J.Chem, Tech. Biotechnol.60. P: 241-246.

[23] HANSON, T.P. & TSAO, G.T. (1972) " Kinetic Studies of the Lactic AcidFermentation in Batch and Continuous Cultures" Biotechnology and Bioengineering,Vol., XIV, Pag. 233-252.

[24] LUEDEKING R., PIRET E.L., (1959) " A Kinetic Study of the Lactic AcidFermentation . Bath Process at Controlled pH" J.Biochem.Microbiol.Technol. Eng. 1,Page 393-412.

[25] GERBER-SCHNEIDER Metódo Volumétrico. «Association of analytical chemists(AOAC) recommends Gerber test», 2002-07.

http://s91928265.onlinehome.us/curveexpert/




Documents

Cinética de La Fermentación Láctica de Suero Ultrafiltrado Con Cultivo Mixtos.revista Tecnica Veterinaria 06082011.Final