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Identificación de microorganismos a través de la prueba de citrato el cual como indicador te el color amarillo si ha producto de oxigeno liberado por estos microrganismos
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PRUEBAS BIOQUIMICAS
MESA:3
•MEDINA HURCAYA MARILI•JEREMIAS NINAMANGO RAQUEL .•PARIONA CAHUANA JUDITH
INTRODUCCIÒN
Nuestro propósito es que conozcan las pruebas bioquímicas que se utilizan en el área de bacteriología y de igual forma conocer sus características de cada una de ella en cada medio de cultivo según la prueba. Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permite identificar distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
GRAM + GRAM -
Coagulasa Ornitina. Movilidad, lisina
Oxidasa Fermentación de carbohidratos
Catalasa Producción de acido sulfhídrico
Citrato
Urea
Fermentación con producción de gas
Indol
RM( Rojo de metilo)
VP( Vogas Proskaver)
CITRATOEsta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
EN ESTA PRÁCTICA USAREMOS COMO MUESTRA, EL INTESTINO DELGADO DEL POLLO.ANALIZAREMOS LA PRESENCIA DE BACTERIAS QUE PUEDEN CRECER CON NUTRIENTES PRESENTES EN EL CITRATO.
ASIMISMO ESTUDIAREMOS QUE BACTERIAS NO PUEDEN CRECER EN EL CULTIVO DE Simmons.
PROCEDIMIENTO
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH.
ESPECIFICACIONES
El Agar Citrato de Simmons es un medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad de utilizar el citrato. Este medio es recomendado para el estudio de enterobacterias a partir de muestras clínicas, de agua y alimentos.
Fosfato Diásido de Amonio 1g Sulfato de Magnesio 0.2g Fosfato Dipotásico 1g. Azul de Bromotimol 0.08g Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriológico 15.0 Citrato de Sodio 2.0 pH 6.9 ± 0.2
MÉTODO: ( preparar 5,64 g del medio en 200 ml de agua
purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa
disolución y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
Procedimiento: 1. tomar una muestra de la pared interna del intestino del pollo.
2. Sembrar por estría sólo la superficie inclinada del medio.
3. Incubar los tubos a 35 ± 2°C durante 24 - 48 hrs.
Una reacción positiva se observa por el crecimiento en el medio con un intenso color azul. Una reacciónnegativa es indicada por la ausencia, o pobre crecimiento sin cambio de color en el medio que permanece verde.
FUNDAMENTO:Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer con citrato como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente de nitrógeno, provocando la alcalinización del medio.El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH.Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con el metabolismo del citrato, generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del mismo de verde a azul
TECNICAInocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo del intestino delgado del pollo. Incubar a 37 grados C por 24 horas a mas.c
INTERPRETACION
El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato . La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.
ALGUNAS BACTERIAS QUE PEDEN PERMANECER EN EL INTESTINO DELGADO DEL POLLO
Salmonella bacteria que está propagada en los
intestinos de las aves, reptiles y mamíferos
E. coli
Alimentos implicados: Carne de res cruda o poco cocinada. Productos frescos crudos. Leche cruda. Jugos de fruta sin pasteurizar. Agua contaminada o sin un adecuado tratamiento de potablización. Recomendaciones: Cocinar de forma adecuada.
Campylobacter jejuni
Alimentos implicados: Carne de pollo cruda o poco cocinada. Leche sin pasteurizar. Agua sin un adecuado tratamiento de potabilización o contaminada. Pescado crudo o poco cocinado. Recomendaciones: Cocinar de forma adecuada la carne de pollo. Evitar contaminación cruzada, es
Staphylococcus aureus
Alimentos implicados: Alimentos cocinados ricos en proteínas: jamón cocido, carne de ave. Productos de pastelería (sobre todo los rellenos de crema). Productos lácteos. Ensaladas. Recomendaciones: Imprescindible una buena praxis higiénica, es una bacteria resistente a las bacterias.
Shigella
Alimentos implicados: Productos lácteos. Carne de res y de pollo. Ensaladas. Frutas y verduras crudas. Ostras crudas. Agua no potabilizada o contaminada. Recomendaciones: Evitar consumir alimentos crudos o poco cocinados. Mantener los productos crudos en refrigeración
Listeria monocytogenes Alimentos implicados: Alimentos refrigerados
(se multiplica de forma rápida durante el almacenamiento de los alimentos a una temperaturas de refrigeración). Alimentos listos para consumir a base de carne de res, pollo o pescado. Leche cruda. Quesos blandos.
RESULT
ADOS
RESULTADO POSITIVO
CUANDO EL COLOR SE
VUELVE A AZUL
CUANDO EXISTE UN CRECIMIENTO
INCLUSO SIN HABER CAMBIO DE
COLOR
El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de sodio y de transportadores como citrato permeasas.La citritasa actúa sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimaticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
METABOLISMO
pH alcalino:
pH alcalino: 2𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜→𝑎𝑐𝑒𝑡𝑜 í 𝑛𝑎+2𝐶𝑂2
𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜→𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜+ 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜
REACCIONES
𝐶𝑖𝑡 −𝑁𝑎+¿ citritasa
→𝑐𝑖𝑡+𝑁 𝑎+¿+𝑂𝐻−¿ ¿
Falsos positivos. •.
•Cualquier remanente de glucosa o de otros (proteínas) nutrientes en el medio del citrato puede dar un resultado falso positivo
. •.•Cuando el inoculo es demasiado grande, los compuestos orgánicos preformados dentro de las paredes celulares de las bacteria moribundas pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno como para producir un resultado falso positivo
•Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos•Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.
INTERPRETACIÓN
El desarrollo de un color azul intenso indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos.
La utilización de ácidos orgánicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatos y bicarbonatos alcalinos.
MICROORGANISMOS QUE DAN POSITIVO EN ESTA PRUEBA
ESPECIES DE:
CITRATOARIZONA
CITROBACTERENTEROBACTER
KLESBSIELLASEERRATIA LICUEFATIENS
PSEUDOMAMONAS CEEPACIA
PH Los productos del metabolismo del citrato
dependen del pH del medio. A un pH alto (alcalino) se producen más acetato y formato y disminuye la producción de lactato y co2. A un pH por encima de 7 no existe producción de lactato y los productos son:
A un pH acido los principales productos del metabolismo del citrato son acetilmetilcarbinol (acetoina) y lactato. Sin tener en cuenta los productos finales producidos, el primer paso metabólico en la fermentación del citrato produce piruvato. La degradación del piruvato depende entonces del pH del medio.
• pH acido:
MEDIO CON SULFURO DE CITRATO DE CHRISTENSEN.
ph 6.7 2 Indicador de ph: rojo de metilo Preparación:Pesar la cantidad con precisión.Agregar agua destilada.Calentar suavemente la solución.Método de esterilización: autoclave 121°c por 15 min.Dejar enfriar para poner en los tubos de ensayo.Distribuir alrededor de 4 a 5 mL en cada tubo Dejar que el medio se solidifique en posición inclinada.Estriar en los tubos con sumo cuidado.Incubar a 35°C por cuatro días con las tapas flojas (la reacción requiere de oxigeno) Resultado:Positivo: rosa-rojo Negativo: ausencia de crecimiento y ningún cambio de color (crema)
RESULTADO NEGATIVO
La prueba sale Negativa: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
MICROORGANISMOS DONDE LA PRUEBA NOS SALE NEGATIVA
MICROORGANISMO CITRATO COLOR DE MUESTRA
E.coli Negativo Verde
S. flexneri Negativo Verde
Salmonella typhi Negativo Verde
Salmonella paratyphi Negativo Verde
