CITRATO INTERACCIONA CON FRUCTOSA 1,6 BISFOSFATASA EN …

Profesor PatrocinanteDr. Juan Carlos Slebe Tajmuch

Instituto de BioquımicaFacultad de Ciencias

CITRATO INTERACCIONA CON FRUCTOSA 1,6BISFOSFATASA EN LA INTERFAZ C1-C4 CON EFECTOS

CONTROVERTIDOS SOBRE LA ACTIVIDADCATALITICA.

STEPHAN NICOLAS SCHOTT VERDUGO

Tesis de Grado presentada como par-te de los requisitos para optar al TıtuloProfesional de Bioquımico

VALDIVIA-CHILE2014

Agradecimientos

Siempre es difıcil realizar los agradeciemientos; nunca se agradece a la gente suficiente, que-

dando alguien en la memoria. Desearıa agradecer primeramente al Dr. Juan Carlos Slebe, por per-

mitirme realizar mi proyecto en su laboratorio, apoyarme y siempre tener disponibilidad para la

discusion. Al Dr. Joel Asenjo, por ensenarme, entregarme su amistad y tener tiempo para todas mis

dudas; se que fueron muchas. A la Dra. Heide Ludwig, por siempre recibirme y realizar crıticas

constructivas. A mis companeros de laboratorio, companeros de carrera y a Mauricio Hernandez,

con quienes compartı jornadas de trabajo, discusion, camaraderıa y amistad. A mis amigos Israel

Giacaman y Cristian Parga, con quienes compartimos los buenos y a veces malos momentos a lo

largo de la carrera. Al Dr. Carlos Bustos, por recibirme al comienzo de mi carrera y permitirme tra-

bajar desde temprano en su laboratorio. A los funcionarios, trabajadores y profesores del Instituto

de Bioquımica, quienes en general tienen disposicion a ayudar a quien lo necesita.

Gracias a mis amigos de ”la patota”, algunos con quienes he compartido lo que llevo de vida:

Chancho, Chapa, Chascon, Fena, Fone, Nacho, Pancho, Patroni, Pelao, Schild, Yolo y Wichi. A

Francisca, por compartir conmigo estos anos y con su carino hacer mas feliz y llevadero el trans-

curso del tiempo. Finalmente, pero por nada menos importante, a mi familia: mi padre Eduardo, mi

madre Anny y mi hermano Edu, por apoyarme y nunca cuestionar mi desarrollo como estudiante.

Esta tesis fue realizada en el Instituto de Bioquımica y Microbiologıa con financiamiento otor-

gado por CONICYT en el marco del proyecto FONDECYT 1090740.

A quienes amo y definen lo que soy

Eso es el comienzo del conocimiento:

el descubrimiento de algo que no

comprendemos

Dios Emperador de Dune

FRANK HERBERT

Indice general

1.. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

2.. Introduccion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

3.. Materiales y metodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.1. Materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.1.1. Reactivos e insumos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.1.2. Equipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.2. Metodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.2.1. Analisis de union in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.2.2. Extraccion Miniprep de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.2.3. Transformacion de bacterias competentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.2.4. Ensayos de digestion de DNA por endonucleasas de restriccion . . . . . . . 17

3.2.5. Mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

3.2.6. Induccion de expresion proteica y proceso de purificacion de las proteınas

recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.2.7. Cuantificacion de proteinas por ensayo Bradford . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.2.8. Medicion de actividad enzimatica fructosa 1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa . 21

3.2.9. Determinacion de constantes cineticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.2.10. Ensayo de inactivacion enzimatica por temperatura . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2.11. Ensayos de dialisis al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

i

Indice general ii

3.2.12. Generacion de figuras y representaciones graficas de estructuras moleculares 24

4.. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.1. Validacion del correcto funcionamiento del software de docking para el sistema

FBPasa y citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.2. Analisis in silico de la union de citrato a FBPasa de rinon de cerdo . . . . . . . . . . 32

4.3. Mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.4. Expresion y purificacion de FBPasa recombinante tipo silvestre y mutantes K42A

y E192A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.5. Caracterizacion cinetica de las enzimas purificadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.5.1. Efectos de comenzar la reaccion con sustrato o con enzima y activacion por

la adicion de EDTA o citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.5.2. Inactivacion enzimatica por temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.5.3. Curvas de saturacion por sustrato de la enzimas silvestre y mutantes . . . . . 48

4.5.4. Curvas de activacion por Magnesio (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.5.5. Curvas de inhibicion por AMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.5.6. Activacion de la actividad enzimatica de FBPasa por adicion de citrato. . . . 54

4.5.7. Ensayos de dialisis al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

5.. Discusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

6.. Bibliografıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Indice de figuras

1. Tetramero de FBPasa tipo 1 de Sus scrofa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2. Sitio de union de citrato en FBPasa de E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3. Estimacion del tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en ensayos de dialisis

al equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4. Docking de citrato en cristal de FBPasa de E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5. Sitio de union de citrato en FBPasa de rinon de cerdo determinado por docking . . . 35

6. Representacion ”LigPlot+” de las interacciones de citrato con FBPasa de rinon de

cerdo segun lo determinado por ensayo de docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

7. Alineamiento de secuencias obtenidas por mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . 41

8. Cromatogramas del proceso de purificacion de la enzima FBPasa K42A . . . . . . . 43

9. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes de las frac-

ciones del proceso de purificacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

10. Efectos de comenzar la reaccion con enzima o con sustrato y activacion al agregar

EDTA o citrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

11. Inactivacion enzimatica por incubacion a distintas temperaturas . . . . . . . . . . . . 49

12. Curvas de actividad enzimatica de las enzimas tipo silvestre y mutantes a distintas

concentraciones de sustrato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

13. Curvas de activacion por Magnesio (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

14. Curvas de inhibicion por AMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

iii

Indice de figuras iv

15. Curvas de activacion de FBPasa tipo silvestre y mutantes K42A y E192A por citrato 56

16. Curva de activacion de la enzima tipo silvestre por EDTA . . . . . . . . . . . . . . . 57

17. Ensayos de union por dialisis al equilibrio de citrato para FBPasa tipo silvestre y

mutantes K42A y E192A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

18. Ensayos de dialisis al equilibrio de mutante E192A a distintas concentraciones de

citrato total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

19. Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

20. Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 mostrando ubicacion de citrato

determinado por cristalografıa y por docking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

21. Efecto de la concentracion de citrato sobre la intensidad de fluorescencia de la

mutante de rinon de cerdo F16W . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

22. Activacion e inhibicion de enzimas por zinc (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

Indice de tablas

I. Partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida . . . . . . . . . . . . . . 14

II. Registro entregado por Vina al realizar calculo de docking en FBPasa de E. coli

PDB=2OWZ con citrato como ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

III. Desviaciones cuadraticas medias de las distintas poses de citrato obtenidas por Vina

respecto a la ubicacion obtenida por cristalografıa en PDB=2OWZ . . . . . . . . . . 29

IV. Registro entregado por Vina al realizar calculo en FBPasa de rinon de cerdo tipo

silvestre PDB=1EYI con citrato como ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

V. Tabla de purificacion de enzima tipo silvestre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

VI. Parametros cineticos para la enzima silvestre y mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . 55

VII. Parametros cineticos reportados para las enzimas tipo silvestre y mutantes K42A y

E192A por Lu et al., 1996 y 1997 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

v

Lista de abreviaturas

CM FF Carboximetil sefarosa Fast Flow

EDTA acido etilendiaminotetraacetico

Fru-1,6-P2 D-fructosa 1,6-bisfosfato

Fru-2,6-P2 D-fructosa 2,6-bisfosfato

FBPasa fructosa 1,6-bisfosfatasa

FBPasa tipo 1 FBPasa hepatica

G6PD glucosa 6-fosfato deshidrogenasa

IPTG isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido

LB Lysogeny broth o medio de lisogenia

mRNA acido ribonucleico mensajero

PDB Protein Data Bank

PFK 6-fosfofructoquinasa

PGI glucosa 6-fosfato isomerasa

PMSF fluoruro de fenilmetilsulfonilo

RMSD ”Root Mean Square Deviation o raız de la desviacion cuadratica media

SOC Super Optimal Broth with Catabolite Repression o medio super optimo

con represion catabolica

Tris tris(hidroximetil)aminometano

U Unidad de actividad enzimatica

wt wild-type o tipo silvestre

vi

1 Resumen

Fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa) es una enzima esencial en la vıa gluconeogenica, siendo

una de las principales responsables de los distintos mecanismos de regulacion que presenta esta

vıa. Desde mediados de los 60’ y principalmente en los 70’ se planteo que en general los quelantes

(entre los que se encontrarıa citrato) son capaces de activar a FBPasa por un mecanismo en el cual

se disminuye la concentracion efectiva de Zn2� en el medio, un potente inhibidor de la enzima.

Estos estudios fueron por lo general realizados con EDTA, debido a la utilizacion de este quelan-

te en las preparaciones de enzima purificada, y no se ahondo en los estudios con otros quelantes.

Recientemente se demostro que FBPasa de E. coli es activada por aniones como citrato y fos-

foenolpiruvato, planteando que esta capacidad se perdio evolutivamente en mamıferos al cambiar

interacciones aminoacıdicas de la interfaz C1-C4, generando una conformacion constitutivamente

activa. En la presente tesis se evaluo computacionalmente la interaccion de citrato con la enzima de

rinon de cerdo, y se generaron mutantes de residuos presentes en la interfaz C1-C4. Se encontraron

diferencias al comenzar las mediciones de actividad enzimatica con enzima o con sustrato, con o

sin citrato o EDTA. A traves de ensayos de union por dialisis al equilibrio se evaluo la interaccion

de citrato con la enzima y las mutantes generadas. Se discute el posible rol de Zn2� en la activacion

de la enzima por adicion de quelantes, ademas del posible rol fisiologico en la regulacion de la

enzima.

1

Summary

Fructose 1,6-biphosphatase (FBPase) is an essential enzyme in the gluconeogenic pathway,

being one of the main responsible for the regulation present in it. Since mid-60’ and mostly in

the 70’ has been raised that, in general, chelating agents (being citrate one of them) are capable

of activating FBPase by a mechanism in which the effective concentration of Zn2�, a potent in-

hibitor of the enzyme, is diminished. This studies were generally performed using EDTA, since

this chelating agent is commonly used in the purification of the enzyme, leaving other chelating

agents aside. It has been shown recently that E. coli’s FBPase is activated by anions like citrate and

phosphoenolpyruvate, proposing that this capability was lost in mammals due to changes in the

C1-C4 interface aminoacidic composition. In this Thesis the interaction of citrate with pig kidney

FBPase was evaluated computationally, and protein mutants of C1-C4 aminoacids were generated.

Differences in starting the enzymatic assays with substrate or enzyme, with or without citrate or

EDTA, were found. The interaction of citrate with the wild-type and mutant enzymes was asses-

sed by using equilibrium dialysis. The possible role of Zn2� in the observed activation and in the

physiological regulation is discussed.

2

2 Introduccion

Generalidades de la enzima fructosa 1,6-bisfosfatasa

Fructosa-1,6-bisfosfatasa (D-fructosa-1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.11; FBPasa) es

una enzima regulatoria esencial en la vıa gluconeogenica, cuya funcion es catalizar la hidrolisis de

fructosa-1,6-bisfosfato en fructosa 6-fosfato y fosfato inorganico. La enzima, que fue descrita en

1942 por Gomori [16], es una enzima altamente distribuida entre distintos organismos y en practi-

camente todos los tejidos [59], y se caracteriza por tener una estructura funcional homotetramerica,

dando lugar a distintas estructuras cuaternarias segun el grado de activacion [23]. La subunidad de

la enzima de rinon de cerdo consta de 337 aminoacidos y tiene una masa aproximada de 37000

Da, presentando una forma tridimensional hexaedrica. En general es una enzima muy conservada

evolutivamente; la enzima de rinon de cerdo tiene una identidad del 90 % respecto a su homologa

en humanos. Aunque con la enzima de Escherichia coli solo presenta un 40 % de identidad y 60 %

de similaridad, la estructura terciaria es altamente homologa (RMSD aproximado de 1,64A entre

estructura de Sus scrofa en conformacion R [1EYI] y su simil de Escherichia coli [2OWZ]).

Dependencia de la actividad catalıtica de cationes divalentes

La actividad catalıtica de la enzima es completamente dependiente de la interaccion de la en-

zima con cationes divalentes, como Mg2�, Zn2�, Mn2� o Co2�, cuyas afinidades siguen la serie de

Irving-Williams [47]. La enzima tiene 3 sitios de union para metales proximos al sitio de union de

sustrato, rodeando el grupo fosfato 1 de este. Los metales estabilizarıan la interaccion del sustrato,

estableciendo un puente entre este y los residuos Asp68, Asp118, Asp121, Glu97 y Glu280. El

3

2. Introduccion 4

residuo 68 de la enzima ademas se encuentra en un lazo denominado lazo 52-72, y serian en parte

los metales divalentes los encargados de estabilizar la interaccion de este lazo con el sitio activo

(denominada conformacion ”enganchada”), permitiendo por tanto la estabilizacion del sustrato y

la actividad catalıtica [7]. De los metales mencionados se cree que principalmente magnesio seria

el involucrado de forma fisiologica, al describirse concentraciones libres alrededor de 1 mM [47].

Adicionalmente al Zn2� se le describe un rol doble, donde en bajas concentraciones (@1 µM) en

presencia de otro cation divalente serıa un potente inhibidor de la enzima al generarse complejos

metal-enzima mixtos, mientras que a concentraciones mas elevadas (A10 µM, en conjunto con 0.1

mM Mg2�) actuaria como el cation catalıtico [3, 4, 41, 47, 48] . La enzima presenta sitios de alta

afinidad por Zn2�, con constantes de disociacion @10 nM y de 30 nM para las enzima de higado de

rata y de conejo ,respectivamente, siendo teoricamente estos los sitios responsables de la presencia

de especies mixtas y por tanto de la inhibicion de la enzima en presencia de otros cationes diva-

lentes [38, 41]. La interaccion de Zn2� no puede ser revertida por concentraciones de Mg2� usadas

comunmente en ensayos cineticos, requiriendose 100 mM de este ultimo para revertir la union de

Zn2� a la enzima [41]. Adicionalmente la enzima une sustrato en ausencia de quelantes, pero es

incapaz de unir sustrato en presencia de 50 mM EDTA [13]. Esto da cabida a que aun en ausencia

de metal agregado la enzima se encuentra con metales unidos en los sitios de alta afinidad, siendo

estos los que permitirıan la union de sustrato; esto sugerirıa que estos sitios de union no solo son

importantes para la catalisis, si no tambien para estabilizar la estructura de la enzima. Es interesante

mencionar que se ha establecido el vinculo entre la inhibicion de enzimas del metabolismo de la

fructosa en cultivos de hepatocitos de rata al ser incubados a distintas concentraciones de Zn2� [11].

2. Introduccion 5

Regulacion de la actividad enzimatica de FBPasa

La enzima cataliza la reaccion contraria a aquella realizada por fosfofructoquinasa (PFK), dan-

do por tanto paso a un ciclo inutil que consume ATP. Esto ultimo se evita por medio de una regula-

cion fina y complementaria de ambas enzimas. El ejemplo mas claro de este sistema es el basado

en adenosın monofosfato (AMP), el cual se mantiene practicamente constante a nivel celular, y

fructosa 2,6-bisfosfato, cuya sıntesis esta regulada de forma hormonal [19]. Ambos compuestos

son capaces tanto de activar a PFK como de inhibir a FBPasa, actuando de forma sinergica para

lograr esta inhibicion. La capacidad inhibitoria de AMP esta dada por la union a un sitio alosterico

ubicado a 28A del sitio activo de la misma subunidad, inhibiendo de forma no competitiva respecto

al sustrato, pero competitiva respecto a cationes divalentes, al adicionalmente provocar el movi-

miento del lazo 52-72 y ”desengancharlo”, impidiendo la estabilizacion de la union de los metales

en el sitio catalıtico [19]. Por el contrario, Fru-2,6-P2 ejerce su accion inhibidora uniendose en el

sitio activo, impidiendo por tanto la catalisis de la reaccion del sustrato [19].

Cada subunidad del homotetramero es denominada desde C1 a C4 segun las manecillas del reloj,

formando un dimero superior C1-C2 y uno inferior C3-C4 (Figura 1). La enzima tiene la particu-

laridad de, al unir AMP, ademas de ”desenganchar” el lazo 52-72, sufrir una rotacion de aproxi-

madamente 15° del homodımero C1-C2 respecto al homodımero C3-C4, desplazando el equilibrio

de un estado R activo a uno T inactivo, siendo por tanto esta modificacion estructural la responsa-

ble de los efectos cineticos (Figura 1) [23]. Es interesante que hasta el momento no se ha descrito

fehacientemente un activador para FBPasa.

El acido cıtrico y su relacion con fructosa 1,6-bisfosfatasa

Adicionalmente al efecto de AMP y Fru-2,6-P2 sobre PFK, se ha demostrado que esta enzima

es inhibida por citrato [37, 39]. El acido citrico es un acido tricarboxılico, cuyos pKa son 2,9, 4,3

2. Introduccion 6

Figura 1: Tetramero de FBPasa tipo 1 de Sus scrofa. Se muestra en gris sustrato unido a su sitio de union,y en verde AMP unido a su correspondiente sitio. Por convencion se denomina a cada monomerodesde C1 hasta C4 siguiendo el orden de las manecillas del reloj. Por cristalografıa se ha observadoque la union de AMP provoca un giro de 15º del dımero superior respecto al inferior, siendo estemovimiento el responsable de la inhibicion de la enzima.(PDB=1EYI)

2. Introduccion 7

y 5,6; esto implica que de forma fisiologica se encuentra principalmente como anion citrato. Una

de las funciones mas conocidas de este compuesto esta relacionada con la generacion de energıa

en el ciclo de Krebs (razon por la cual es tambien llamado ciclo del acido cıtrico o de los acidos

tricarboxılicos); adicionalmente el citrato participa en la sıntesis de acidos grasos, tanto por la

activacion de la ruta de sıntesis, como por actuar como intermediario en el transporte de acetil-CoA

desde la mitocondria al citoplasma [35]. Las concentraciones de citrato en cultivos de hepatocitos

de rata son aproximadamente 10 veces mayores en el interior de la mitocondria respecto al citosol;

la concentracion citosolica varia entre aproximadamente 0,2 y 1,2 mM segun el medio de cultivo

utilizado [45]. Esto ultimo se acompana de reportes de oscilaciones en celulas β-pancreaticas de las

concentraciones de citrato, lo que permitirıa actuar como ”marcapasos” de la glicolisis, que de por

si tiene caracterısticas oscilatorias, al inhibir a PFK [30, 50]. Respecto a citrato, en la decada de los

70 hubieron variadas publicaciones que trataban de dar cuenta de su posible efecto sobre FBPasa,

en conjunto con el fenomeno observado al utilizar otros quelantes como EDTA e histidina, entre

otros.

En 1965, Underwood y Newsholme informaban que para FBPasa de hıgado de rata, una serie de

intermediarios metabolicos, entre los que se encontraba citrato, no ejercıan accion sobre la enzima

[52]. Fu y Kemp, en cambio, muestran en 1973 que la isoforma muscular de conejo es activada por

citrato, ademas de EDTA, creatina y fosfato inorganico [15]. Tanto Rosenberg et al. como Van Tol et

al. postularon en 1972 y 1973 respectivamente que la enzima es activada alostericamente por EDTA

[43, 53]. Nimmo y Tipton mostraron en 1975 que EDTA no interacciona con la enzima utilizando el

metodo de filtracion en gel de Hummel y Dreyer, ademas de demostrar que los efectos activadores

observados al utilizar EDTA pueden ser replicados al incubar una solucion de la enzima con una

resina quelante como lo es Chelex-100 [36]. En 1976 Tejwani et al. informaron que en la enzima

de hıgado de rata los efectos activadores de EDTA y los quelantes en general son probablemente

2. Introduccion 8

causados por eliminacion de trazas de metales inhibidores como Zn2�, habiendose adicionalmente

demostrado por el mismo grupo que EDTA e histidina no interaccionan directamente con la enzima,

utilizando tambien el metodo de filtracion en gel de Hummel-Dreyer [48, 49]. En 1978 Benkovic et

al. demostraron por espectroscopıa de absorcion atomica que efectivamente la enzima se inhibe con

concentraciones micromolares de Zn2�, apoyando la idea de eliminacion de metales pesados por

EDTA [3]. A pesar de esto, no se menciona directamente lo que ocurrirıa con citrato y si su forma

de activar serıa solamente a traves de este mecanismo. En 1990, Adams et al. muestran que para

la enzima muscular humana se observa una mayor activacion por una mezcla de citrato y histidina,

respecto a EDTA solo, lo que se contrapone con la mejor capacidad quelante de este ultimo y por

tanto con la teorıa de la inhibicion por metales pesados de la enzima [1].

En 2007 Hines et al. publicaron como citrato es capaz de activar la enzima de E. coli, postu-

lando un sitio de activacion por aniones, el cual adicionalmente interactua con metabolitos como

fosfoenolpiruvato, malato, fosfoglicerato, entre otros [21]. La activacion de la enzima llega a ser

de un 80 % utilizando concentraciones milimolares tanto de fosfoenolpiruvato, como de citrato,

ademas de antagonizar el efecto inhibitorio de AMP. El sitio descrito por cristalografıa se ubica

en la interfaz entre los dımeros C1-C2 y C3-C4 (Figura 2) planteandose por alineamientos que este

sitio es comun en procariontes, pero no ası en eucariontes. Se sugirio que la enzima eucariotica se

encuentra constitutivamente activa debido a que en teorıa la interaccion entre Glu192 y Lys42 su-

plirıa la interaccion generada en la enzima procarionte con aniones en la interfaz C1-C4 (comparar

izquierda y derecha en Figura 2B) [20].

Herramientas bioinformaticas para evaluar union molecular

En la actualidad existen formas de evaluar la posible union de un ligando a una proteına a traves

de ensayos de dinamica molecular, o de docking (acoplamiento molecular). El primero implica una

2. Introduccion 9

A

B

Figura 2: Sitio de union de citrato en FBPasa de E. coli. A Ubicacion de citrato, ademas de fructosa 2,6-bisfosfato, en el cristal de la enzima de E. coli (PDB: 2QVR). B Residuos aminoacıdicos presentesen el sitio de union de aniones con sulfato unido en la enzima de E. coli (derecha) y el sitioequivalente en la enzima de rinon de cerdo (izquierda). En lıneas punteadas se representan lospuentes de hidrogeno generados entre aminoacidos, sulfato o agua segun corresponda. El esquemadel tetramero indica desde donde se observa la interfaz. Imagenes obtenidas de Hines et al [20, 21].

2. Introduccion 10

alta capacidad de calculo computacional, tiempo de calculo, ademas de conocimiento en los soft-

ware desarrollados para este fin. El docking, por otra parte, es una herramienta que por lo general

es considerablemente mas rapida y sencilla que los calculos basados en dinamica molecular, lo que

ha permitido que sea una de las herramientas mas utilizadas en el ambito del descubrimiento de

interacciones farmacologicas. El objetivo del docking es predecir la estructura del complejo for-

mado por un ligando y su receptor, estimando la fuerza de los enlaces no covalentes formados por

este complejo a traves de calculos computacionales. Este proceso generalmente se puede subdividir

en dos pasos, los cuales implican establecer la interaccion estructural del ligando con el receptor

(generalmente denominado pose), para posteriormente establecer la intensidad de esta interaccion

a traves de una funcion de ”puntuacion” o scoring function. Esta funcion permite generar un ran-

king de las distintas poses, y por tanto predecir la forma de union mas probable. El metodo tiene

desventajas, como generalmente mantener la estructura del receptor rıgida y mantener los estados

de protonacion y distribucion de cargas constante durante el calculo.

En 2009 Trott y Olson publicaron un nuevo software capaz de realizar docking en tiempos muy

reducidos, con resultados reproducibles y con buena capacidad de prediccion [6, 12, 51, 54]. El

software se basa en un sistema de busqueda local iterativa (ILS), realizando una optimizacion local

basada en el metodo cuasi-Newtoniano Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS). De forma bre-

ve, el software, comenzando con una conformacion aleatoria del ligando, genera una perturbacion

estocastica seguida de la optimizacion local.

Problematica e hipotesis de trabajo

En conjunto los datos bibliograficos indican que citrato tiene un efecto activador sobre la enzi-

ma, aunque no queda claro si este efecto es consecuencia de un proceso de activacion directo por

interaccion con la proteına, o indirecto por quelacion de metales inhibidores como Zn2�. Adicional-

2. Introduccion 11

mente resultados preliminares cristalograficos y de variaciones en patrones fluorescentes de nuestro

laboratorio permiten plantear la idea que citrato se une a FBPasa en la interfaz C1-C4, tal como en

E. coli. En base a estos datos preliminares, a la falta de claridad respecto al efecto de citrato en la

literatura y al efecto observado sobre la enzima de E. coli, se postulo la siguiente hipotesis:

” Citrato interacciona con FBPasa de rinon de cerdo en la interfaz C1-C4, con potenciales

efectos en su actividad catalıtica.”

Teniendo en cuenta lo anterior, se planteo como objetivo general establecer si existe interaccion

entre citrato y la enzima de rinon de cerdo. Para esto se planteo como objetivos especıficos:

Establecer por medio de analisis de acoplamiento molecular o docking si esta interaccion es

teoricamente factible, utilizando para esto Autodock Vina en conjunto con otras herramientas

bioinformaticas.

Generar mutantes para los aminoacidos de la interfaz C1-C4, que son potencialmente re-

levantes para la putativa interaccion de la proteına con el ligando, utilizando para esto un

plasmido pET-22 con la secuencia codificante para FBPasa de rinon de cerdo wt generado en

el laboratorio.

Expresar las proteınas mutantes recombinantes en un sistema de expresion basado en E. coli

BL21(DE3).

Realizar ensayos de union del ligando marcado radiactivamente con las proteınas a traves de

dialisis al equilibrio.

3 Materiales y metodos

3.1. Materiales

3.1.1. Reactivos e insumos

Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) de alta pureza y libre de dioxanos, sal disodica

dihidrato de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sulfato de magnesio (MgSO4) heptahi-

drato, tris(hidroximetil)aminometano (Tris), citrato de sodio dihidrato, sulfato de amonio,

cloruro de sodio, acido clorhıdrico 37 %, N, N, N’, N’-trimetiletilendiamina (TEMED), acri-

lamida, bis-acrilamida, Triton X-100, etanol absoluto y metanol fueron obtenidos de Merck

Millipore/Calbiochem.

Isopropanol, glicerol y agarosa fueron obtenidos de Winkler Ltda.

Acido acetico, etanol y metanol grado tecnico fueron obtenidos de TCL.

Pre-mezcla de medio de cultivo LB pH 7 en polvo fue obtenido de MO BIO.

La resina Carboximetil Sefarosa Fast flow y la columna pre-empacada de 5 ml HiTrap Desal-

ting Column fueron obtenidas de GE Healthcare.

El kit de extraccion y purificacion de DNA E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II se obtuvo de

Omega Bio-Tek.

Las filtros para centrifuga Amicon Ultra-4 con un corte de peso molecular de 10 kDa fueron

obtenidos de Merck Millipore.

12

3. Materiales y metodos 13

El reactivo de Bradford Bio-Rad Protein Assay fue obtenido de Bio-Rad.

El kit de mutagenesis sitio-dirigida Quikchange II se obtuvo de Agilent Technologies

Acido cıtrico-[1,15-14C] fue obtenido de Perkin Elmer, Inc.

Las camaras de dialisis al equilibrio Micro-Equilibrium DIALYZER fueron obtenidas de Har-

vard Apparatus

Las membranas de dialisis de celulosa regenerada Spectra/Por-1 fueron obtenidas de Spec-

trum Labs

Las enzimas fosfoglucosa isomerasa y glucosa 6-P deshidrogenasa, adenosina monofosfa-

to, D-fructosa 1,6-bisfosfato sal trisodica octahidrato, β-nicotinamida adenina dinucleotido

hidrato, asi como la resina Cibacron Blue 3GA Agarosa, inmobilizada en agarosa 6 % entre-

cruzada fast-flow fueron obtenidas de Sigma-Alrdich, Inc.

Los partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida fueron sintetizados por In-

tegrated DNA Technologies (Tabla I)

3.1.2. Equipos

Espectrofotometros Agilent 8453 UV-visible Spectroscopy System, Thermo Scientific Evo-

lution 60 y Nanodrop 2000

Sistema de cromatografıa liquida AKTA Prime Plus FPLC

Balanza analıtica Shimadzu AUW220D y balanza Sartorius TE4101.

Centrifugas HITACHI CR-22GII, Sigma 1-14 y 2-16K.

Contador de Centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910.

Sistema cromatografico GE Healthcare AKTAprime plus.


Tabla I: Partidores utilizados para realizar mutagenesis sitio-dirigida

K42A 5’-TGTGCACCGCGGTCGCAGCCATCTCCACCG-3’

K42A antisense 5’-CGGTGGAGATGGCTGCGACCGCGGTGCACA-3’

E192A 5’-CCCGGCCATCGGAGCGTTCATTTTGGTGG-3’

E192A antisense 5’-CCACCAAAATGAACGCTCCGATGGCCGGG-3’


Termociclador Eppendorf MasterCycler personal.

Agitador termorregulado Aosheng Thermo-Shaker MS-100

Incubador con Agitador Termoregulado IKA KS 4000 ic control.

pH-Metro WTW inoLab pH 720.

Multilector de microplacas BioTek Synergy 2.

Sistemas de documentacion Syngene InGenious y Ultra-Lum Omega.

Sistema de electroforesis 1-D Protean-Mini Bio-Rad.

3.2. Metodos

3.2.1. Analisis de union in silico

Para realizar los analisis de union se utilizo el programa Autodock Vina (en adelante Vina),

desarrollado por Trott y Olson (2009) en The Scripps Research Institute. Para realizar los calculos

se utilizo la estructura previamente cristalizada de la enzima en su conformacion activa (R), obte-

nida de la base de datos Protein Data Bank (codigo PDB=1EYI). En el cristal escogido la enzima

fue cocristalizada con fructosa 6-fosfato, fosfato inorganico y magnesio, condiciones similares a

las presentes en los medios utilizados en ensayos de actividad. Se reconstituyo la estructura ho-

motetramerica de la enzima utilizando el software Chimera en su version 1.7, desarrollado por la

Universidad de California, San Francisco (UCSF). Se utilizo una caja de busqueda de aproxima-

damente 167 nanometros cubicos (56Ax 48Ax 62A), con un parametro exhaustiveness de 500 y

con un numero de posiciones de 20. El resto de los parametros se dejaron por defecto. El tamano

de la caja es lo suficientemente amplia como para abarcar una subunidad completa, ademas de las

interfaces C1-C4 como C1-C2. Considerando la naturaleza simetrica de la proteına, este analisis


abarca todos los posibles sitios de union a la enzima. Para generar los archivos PDBQT requeri-

dos por Vina, se utilizo el programa Autodock Tools 1.5.6, tambien desarrollado en The Scripps

Research Institute. La preparacion de la proteına y del ligando fue segun lo recomendado por los

autores. Abreviadamente, a la proteına se le extrajo el agua y los ligandos co-cristalizados, se le

adicionaron hidrogenos, y aquellos no polares fueron tratados de forma implıcita.

3.2.2. Extraccion Miniprep de DNA

Para realizar la extraccion y purificacion de DNA se utilizo E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II

de Omega, segun lo indicado en el manual del fabricante. La pureza y cantidad del DNA obtenido

fue cuantificado utilizando el espectrofotometro NanoDrop 2000 de Thermo Scientific.

3.2.3. Transformacion de bacterias competentes

Se retiraron 100 µL de celulas competentes (E. coli BL21 o JM109) de refrigeracion a -80ºC

y se dejaron reposar en hielo por 5 minutos. Transcurrido el tiempo se le agrego de 1 a 2 µL

(aproximadamente entre 100 ng y 1 µg) de una solucion de DNA de interes, y se agito suavemente,

con cuidado de no aumentar la temperatura de la suspension bacteriana. Se dejo incubar la mezcla

en hielo por 20 minutos. Finalizado el tiempo, la mezcla fue calentada en agitacion a 42ºC por 1

minuto 45 segundos en un agitador termorregulado y se retiro rapidamente, dejando nuevamente

en hielo. Se agrego 1 ml de una solucion esteril de LB y la mezcla se dejo incubar por 1 hora a

37ºC en agitacion. 200 µL de esta solucion fueron sembrados en una placa de LB-Agar 100 µg/ml

Ampicilina, dejando la placa sembrada a 37ºC overnight (12-16 horas).


3.2.4. Ensayos de digestion de DNA por endonucleasas de restriccion

Para realizar los ensayos de digestion se siguieron las instrucciones indicadas por el fabricante,

agregando cantidades suficientes para preparar 10 µL de reaccion, con al menos 800 ng del plasmi-

do a digerir y 10 U de enzima de restriccion, dejando digerir por 1 hora a 37°C. Los resultados

fueron evaluados por electroforesis en geles de agarosa al 1 % con 0.2 µg/ml de bromuro de etidio,

visualizando los fragmentos resultantes en un transiluminador UV.

3.2.5. Mutagenesis sitio-dirigida

Para realizar la mutagenesis sitio-dirigida se utilizo el kit Quikchange II de Agilent Technolo-

gies, segun lo establecido por el fabricante, realizando pequenas modificaciones. Abreviadamente,

se generaron 50 µL de reaccion con 25 ng de plasmido pET-22b FBPasa RC-wt, 125 ng de cada par-

tidor, 2.5 U de DNA-polimerasa PfuUltra HF y 1 µL de mix dNTP y 5 µL de tampon 10X incluidos

en el kit. A las reacciones se les aplico 30 segundos a 95°C, 16 ciclos de 30 segundos a 95°, un mi-

nuto a 55°C y 7 minutos a 68°C, agregando 7 minutos extra a 68°C en el ultimo ciclo para finalizar

la reaccion completamente. A cada reaccion se le agregan 10 U de DpnI, extendiendo la digestion

por una hora a 37°C. Los partidores fueron disenados utilizando la aplicacion web Quikchange Pri-

mer Design de Agilent Technologies (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp),

y utilizando la secuencia del mRNA para FBPasa de rinon de cerdo (NCBI Reference Sequence:

NM 213979.1).

Se transformaron bacterias E. coli JM109 segun el protocolo indicado anteriormente, utilizan-

do medio SOC para crecer las bacterias antes de sembrar en LB-Agar 100 µg/ml Ampicilina. Se

seleccionan colonias individuales para la posterior purificacion del plasmido segun lo indicado an-

teriormente. Se seleccionaron aquellos plasmidios que tuvieran dos sitios de restriccion para la


enzima XhoI, y las mutaciones fueron corroboradas por secuenciamiento, realizado por Macrogen

Inc., utilizando como partidores secuencias universales T7, tanto del promotor como de la secuen-

cia de termino. Los cromatogramas de secuenciamiento fueron evaluados utilizando el software

DNADynamo.

3.2.6. Induccion de expresion proteica y proceso de purificacion de las

proteınas recombinantes

Se seleccionaron 3 colonias de E. coli BL21(DE3) de una placa LB-Agar de bacterias previa-

mente transformadas con el plasmido de interes, y se dejo crecer en overnight (12-16 horas) a 37ºC

en 50 ml de medio LB Tris-HCl 100 mM pH 7.5, 100 µg/ml Ampicilina y 1 % Glucosa. Las bac-

terias fueron recolectadas por centrifugacion a 5000xg por 10 minutos y fueron resuspendidas en

50 ml del mismo medio LB fresco. Se usaron 7 ml del resuspendido bacteriano para inocular cada

uno de 6 matraces con 500 ml de medio LB Tris-HCl 20 mM pH 7,5 ampicilina 100 ug/ml Glucosa

1 % cada uno. Se incubaron los 6 matraces en agitacion (agitacion orbital a 220 rpm) a 25ºC hasta

que se alcanzo una D.O. a 600 nm entre 0.6 y 0.8 (aproximadamente 5 horas). Se le agrego a cada

matraz cantidad suficiente de una solucion stock de IPTG 1M para alcanzar una concentracion de

0,4 mM, y se dejo inducir la expresion bajo agitacion a 16ºC overnight (12-16 horas).

Las bacterias inducidas fueron recolectadas por centrifugacion a 5000xg por 10 minutos, y fue-

ron posteriormente resuspendidas y lisadas en 300 mL de tampon lisis (Tris-HCl 20 mM pH 8,

EDTA 0,1 mM, Triton X-100 1 % y PMSF 1mM; este ultimo es agregado inmediatamente antes

de realizar la lisis a partir de un stock 200 mM en metanol). La solucion se dejo agitando a 4ºC

por al menos 4 horas. Posteriormente se dividio en 2 fracciones de 150 mL, y cada una fue soni-

cada utilizando un sonicador Qsonica Q500 y el tip Nº4220 (12,7 mm de diametro, amplitud de

120 µm, punta reemplazable), aplicando ciclos de 3 segundos “ON” y 5 segundos “OFF” durante


16 minutos (120 ciclos) y un 40 % de amplitud. Una vez sonicada la solucion, se separo el debris

celular por centrifugacion a 15000xg durante 30 minutos. Realizada la centrifugacion se obtuvo

un sobrenadante transparante con aspecto amarillento denominado extracto proteico crudo. A este

extracto se le agrego sulfato de amonio a un 50 % de saturacion a 4ºC y se dejo equilibrar al me-

nos durante una hora. Las proteınas precipitadas son separadas y descartadas por centrifugacion

a 18000xg durante 15 minutos. Al sobrenadante recuperado se le agrego sulfato de amonio hasta

alcanzar una saturacion del 80 % a 4ºC. El precipitado proteico fue recuperado por centrifugacion

a 18000xg por 15 minutos, descartando el sobrenadante. El precipitado fue resuspendido en 20 ml

de tampon fosfato 20 mM (19,25 mM KH2PO4, 0,75 mM Na2HPO4) pH 5,8, EDTA 0,1 mM. La

muestra se dejo dializar durante al menos 3 dıas contra el mismo tampon fosfato a 4°C, cambiando

esta solucion al menos 3 veces. Es importante considerar que el tampon fue preparado a tempera-

tura ambiente, por lo que el pH bajo las condiciones utilizadas es menor. Realizada la dialisis, se

incubo la muestra a 20ºC por 2 horas antes de ser extraıda de la bolsa de dialisis, para que ası el

pH de la muestra fuera 5,8. Se centrifugo a 20000xg por 30 minutos para remover la presencia de

proteınas precipitadas.

La muestra ya dializada fue aplicada en una columna de intercambio cationico carboximetil-

sefarosa Fast Flow (CM FF, 10 cm x 1,6 cm ø). La cromatografıa fue eluıda a 2 ml/min, usando

como fase movil tampon fosfato 20 mM pH 5,8 como tampon de corrida y este mismo tampon con

500 mM NaCl como tampon de elucion. La columna fue lavada utilizando 6 volumenes de columna

de tampon de corrida, aplicando posteriormente una elucion isocratica con 6 volumenes de columna

de 25 % tampon de elucion, para despues generar un gradiente de 6 volumenes de columna desde

un 40 % hasta 100 % de tampon de elucion, terminando con una elucion final de 6 volumenes de

columna de tampon de elucion.

Las fracciones que presentan actividad FBPasa fueron recolectadas y aplicadas en conjunto en


una columna de afinidad Cibacron Blue 3GA Agarosa Fast flow 6 % entrecruzada (22 cm x 1 cm ø).

La cromatografıa fue eluıda, al igual que en el caso de la resina CM FF, a 2 mL/min, usando como

fase movil tampon fosfato 20 mM pH 5,8 como tampon de corrida, mientras que el tampon de

elucion es el tampon de corrida con NaCl 2 M. Primeramente se eluyeron 6 volumenes de columna

de tampon de corrida, para posteriormente aplicar tampon de elucion al 20 % por 6 volumenes de

columna y terminar aplicando 6 volumenes de columna de tampon de elucion. Se fracciona cada

10 ml, y cada 4 ml al cambiar el tampon para eluır a la proteına. Las fracciones con actividad son

recolectadas, obteniendo ası la proteına purificada. La preparacion enzimatica fue almacenada a

4°C en el tampon de elucion, el cual, dado el procedimiento utilizado, presenta concentraciones

cercanas a NaCl 2 M.

El proceso de purificacion fue evaluado en geles de poliacrilamida en condiciones denaturan-

tes, segun lo descrito por Laemmli, utilizando un gel apilador al 5 % y uno separador al 12 % de

acrilamida [26].

3.2.7. Cuantificacion de proteinas por ensayo Bradford

Para la cuantificacion de proteınas se utilizo un sistema de cuantificacion en placas de 96 po-

cillos, similar a lo indicado por el proveedor del reactivo. En breve, se diluyeron muestras en 160

µl, agregando posteriormente 40 µl de reactivo de Bradford, homogeneizando la mezcla y dejando

incubar por al menos 2 minutos. En caso de generarse burbujas, se agregaron 5 µl de etanol en la

superficie de la mezcla. Para generar una curva estandar se utilizaron entre 0,5 y 5 µg totales de

albumina de suero bovino en los 200 µl de mezcla. Las absorbancias fueron evaluadas en un lector

de microplacas BioTek Synergy 2.


3.2.8. Medicion de actividad enzimatica fructosa 1,6-bisfosfato

1-fosfohidrolasa

La medicion de actividad enzimatica FBPasa fue realizada con un ensayo de enzimas acopladas,

el cual consta de fosfoglucosa isomerasa (PGI, Saccharomyces cerevisiae) y glucosa 6-fosfato

deshidrogenasa (G6PD, Leuconostoc mesenteroides) como enzimas auxiliares. Esta ultima reduce

un mol de NAD por cada mol de Fru-1,6-P2 hidrolizado por FBPasa, permitiendo medir la actividad

FBPasa segun la variacion de absorbancia a 340 nm. Esto se esquematiza a continuacion:

D-fructosa 1,6-bisfosfatoFBPasaÐÐÐÐ� D-fructosa 6-fosfato � fosfato inorganico

D-fructosa 6-fosfatoPGIÐÐ� D-glucosa 6-fosfato

D-glucosa 6-fosfato � NADG6PDÐÐÐ� D-6-fosfogluconolactona � NADH

La Unidad de actividad enzimatica se definio como la cantidad de enzima que genera un micromol

de producto por minuto. El mezcla de reaccion base consto de Tris/HCl 20mM pH 7,5, 5 mM

MgSO4, 0.1 mM EDTA, 30 µM Fru-1,6-P2 y 1,2 U de cada enzima auxiliar. La concentracion

de EDTA, sustrato y magnesio variaron en distintos ensayos, segun se especifica mas adelante. El

mezcla, tanto si la reaccion fue comenzada con enzima o con sustrato, se dejo incubar a lo menos

5 minutos a 30ºC previo a iniciar la reaccion. Para realizar los ensayos, el EDTA fue removido de

la enzima purificada por exclusion molecular, utilizando una columna Hi-Trap Desalting Column

como indica el fabricante, o por al menos 4 filtraciones en unidades de filtracion centrifuga Amicon

Ultra-4 realizadas en serie, tambien como indica el proveedor.

Para realizar las caracterizaciones cineticas con proteınas purificadas se agregaron 0,4 µg de

proteına en 500 µl de mezcla de reaccion, cuantificando la concentracion de proteına espectro-


fotometricamente segun su absorbancia a 280 nm, utilizando el coeficiente de extincion 0,755

ml/(mg�cm), segun Marcus y Hubert [31].

3.2.9. Determinacion de constantes cineticas

Los ensayos de activacion por magnesio fueron ajustados a la ecuacion de Hill:

v �Vmax � �Mg2��nKna � �Mg2��n

,donde Vmax corresponde a la velocidad maxima alcanzada al agregar magnesio, Ka corresponde a

la concentracion de Mg2� necesaria para obtener la mitad de la Vmax y n corresponde al coeficiente

de cooperatividad de Hill.

Las curvas de sustrato fueron ajustadas a una ecuacion que da cuenta de la inhibicion por exceso

de sustrato de forma parcialmente no competitiva descrita por Webb [5, 55]:

v �Vmax � �S� � �1 �

β��S�Kss

�Km � �S� � �S�2

Kss

,donde Vmax corresponde a la velocidad maxima, Km corresponde a la concentracion de sustrato

necesaria para obtener la mitad de la Vmax, Kss corresponde a la constante de disociacion del

sustrato del complejo EYS2 y β equivale al factor de inhibicion sobre la kcat.

Las curvas de inhibicion por AMP fueron ajustadas a una ecuacion de Hill modificada por

Taketa y Pogell [46]:

v �Vmax �Kn

i

Kni � �AMP �n

, donde Vmax corresponde a la velocidad maxima (sin AMP), Ki corresponde a la concentracion


de AMP necesaria para inhibir la enzima en un 50 % y n es el coeficiente de Hill. Se dio el caso de

inhibiciones bifasicas, para lo que se utilizo una suma de esta ecuacion:

v �Vmax1 �Kn

i1

Kni1 � �AMP �n �

Vmax2 �Kni2

Kni2 � �AMP �n

, donde el subındice 1 y 2 se aplica a cada fase.

Las regresiones no lineales y las respresentaciones graficas fueron realizadas utilizando el soft-

ware GraphPad Prism 6.

3.2.10. Ensayo de inactivacion enzimatica por temperatura

Para evaluar la estabilidad de las enzimas se realizo un ensayo de inactivacion por temperatura.

Para esto se incubaron alicuotas de proteina a distintas temperaturas por 10 minutos en un ter-

mociclador, para posteriormente evaluar la actividad enzimatica como se describe anteriormente,

comenzando la reaccion con sustrato.

3.2.11. Ensayos de dialisis al equilibrio

Los ensayos de dialisis al equilibrio fueron realizados en camaras Micro-Equilibrium DIALY-

ZER de 250 µl, utilizando membranas de dialisis Spectrapor-1 (corte de peso molecular entre 6 y 8

kDa) cortadas de un tamano acorde a la camara. Las membranas fueron tratadas con EDTA, segun

lo recomendado por el fabricante, y se dejaron equilibrar con tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 NaCl

100 mM. En cada ensayo se agrego 1 µM de citrato-[1,15-14C] 116,4 mCi/mmol considerando el

volumen total en ambas camaras, utilizando como solucion tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,5 NaCl

100 mM, empleando 200 µl de solucion en ambas camaras. Se determino la tasa de dialisis y el

tiempo requerido por el citrato para alcanzar el equilibrio realizando un ensayo control con cantidad


suficiente para 1 mM de citrato total considerando el volumen total en ambas camaras y midiendo

a 0, 1, 3, 5, 7 y 9 horas (Figura 3). Los ensayos de dialisis propiamente tal fueron dejado bajo agita-

cion a 150 rpm a 25ºC durante 14 horas. Se agregaron 200 µl de una solucion de proteına 1 mg/ml

en una de las camaras, previo cambio de tampon a Tris-HCl 20 mM pH 7.5 NaCl 100 mM. En la

otra camara se agrego 200 µl de la solucion tampon con 100 mM NaCl con citrato radiactivo y,

cuando corresponda, citrato no radiactivo y/o otro ligando de interes. Las mediciones de radiactivi-

dad presente tanto en la porcion retenida como la filtrada de la camara de dialisis fueron realizadas

por triplicado utilizando un contador de centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910TR, utilizando 1 ml

de liquido de centelleo y 50 µl de la camara; en todos los casos ambas camaras fueron evaluadas.

3.2.12. Generacion de figuras y representaciones graficas de estructuras

moleculares

Las representaciones de proteinas tridimensionales fueron generadas utilizando el software

UCSF Chimera 1.7 [40]. Para generar representaciones bidimensionales de interacciones intermo-

leculares se utilizo el paquete LigPlot+ [27]. El alineamiento de secuencias fue generado utilizando

el software AlignX, correspondiente al paquete Vector NTI Advance 11.


Horas

CPM/50ml

0 2 4 6 8 10

0

10000

20000

30000

Figura 3: Estimacion del tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en ensayos de dialisis al equili-brio. Las cuentas por minuto fueron evaluadas tal como se describe en el texto. Se muestran lasmediciones de radiactividad en la camara que fue cargada con cıtrato-[1,15-14C] (azul), como deaquella que solamente tiene el dializado (rojo).

4 Resultados

4.1. Validacion del correcto funcionamiento del software de

docking para el sistema FBPasa y citrato

Antes de comenzar a trabajar directamente en la enzima de rinon de cerdo fue importante com-

probar que el software utilizado para hacer los analisis in silico es capaz de realizar el analisis en

una proteına como FBPasa y de replicar la union del ligando en este sistema. Para esto se utilizo el

software computacional Autodock Vina, tal como se describe en Materiales y Metodos. El ensayo

de union se realizo en una reconstruccion del tetramero de FBPasa de E. coli cristalizado por Hi-

nes et al. junto a citrato (PDB=2OWZ) [21]. El registro del calculo, tal como es entregado por el

software, se puede observar en la Tabla II. El software ordena las poses segun la afinidad estimada

por el algoritmo, calculando la raız de las desviaciones cuadraticas medias (RMSD) a partir de la

primera pose entregada. Todas a excepcion de la tercera pose, que resulto en el sitio activo, fueron

ubicadas en la interfaz C1-C4, lo que explica el alto valor de RMSD reportado para la tercera pose.

En la Tabla III se observan los valores de RMSD (RMSD) de las poses obtenidas por Vina

respecto a la posicion establecida cristalograficamente. En la Figura 4 se observa la pose de mayor

afinidad entregada por Vina (pose 1, Tabla II), ademas de la pose con menor RMSD respecto al

cristal 2OWZ (pose 6, Tablas II y III). Se observa que el software predice como sitio de union la

interfaz descrita por Hines, donde la pose 6 tiene un RMSD considerablemente menor a 2 A[21].

El orden de las poses entregado no concuerda con aquella con menor RMSD respecto al resultado

empırico, pero este hecho es frecuente en este tipo de software y analisis, donde el proceso de

26

4. Resultados 27

Tabla II: Registro entregado por Vina al realizar calculo de docking en FBPasa de E. coli PDB=2OWZcon citrato como ligando

Nº Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B.1 (A) RMSD U.B.2 (A)

1 -6,2 0,000 0,000

2 -6,2 5,243 7,076

3 -6,1 30,023 32,095

4 -6,1 1,390 4,429

5 -6,1 5,463 6,479

6 -6,0 5,550 7,263

7 -6,0 1,443 2,095

8 -6,0 5,061 6,239

9 -6,0 5,217 6,761

10 -6,0 1,414 2,210

Continua en la pagina siguiente

1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, considerando factores desimetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, sin considerar factores desimetrıa.

4. Resultados 28

Nº Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B.1 (A) RMSD U.B.2 (A)

11 -6,0 1,483 2,908

12 -6,0 1,601 3,774

13 -5,9 5,481 6,551

14 -5,9 5,272 7,122

15 -5,9 5,534 6,475

16 -5,8 5,251 6,643

17 -5,8 2,088 3,539

18 -5,8 5,319 6,602

19 -5,8 5,293 6,869

20 -5,8 5,460 6,580

1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, considerando factores desimetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural respecto a la primera pose entregada, sin considerar factores desimetrıa.

4. Resultados 29

Tabla III: Desviaciones cuadraticas medias de las distintas poses de citrato obtenidas por Vina respectoa la ubicacion obtenida por cristalografıa en PDB=2OWZ

Nº Pose RMSD1 (A)

1 2,1

2 2,2

3 Q52

4 3,1

5 2,9

6 0,7

7 0,8

8 3,6

9 2,0

10 3,3


1 Corresponde a:

RMSD �

¾d21 � d

22 � d

23 � ...d

2n

n

donde d es la distancia medida entre los atomos equivalentes n de la estructura del cristal yaquella obtenida por docking.2 Corresponde a la pose ubicada en el sitio activo.

4. Resultados 30

Nº Pose RMSD1 (A)

11 1,7

12 1,6

13 1,3

14 3,5

15 1,6

16 3,5

17 2,9

18 2,9

19 2,9

20 2,0

1 Corresponde a:

RMSD �

¾d21 � d

22 � d

23 � ...d

2n

n

donde d es la distancia medida entre los atomos equivalentes n de la estructura del cristal yaquella obtenida por docking.2 Corresponde a la pose ubicada en el sitio activo.

4. Resultados 31

Figura 4: Docking de citrato en cristal de FBPasa de E. coli. Se muestra el sitio de union para citratoen la interfaz C1-C4. En el sitio se representa una superposicion de tres estructuras: en naranja laubicacion de citrato obtenida por cristalografıa, en celeste se muestra la pose con mayor afinidad(pose 1, Tabla II) y en verde aquella con RMSD mas bajo (pose 6, Tablas II y III), estas dos ultimasobtenidas por docking, como se describe en el texto y en las tablas II y III (PDB=2OWZ).

4. Resultados 32

ranking suele presentar falencias [12]. A pesar de esto, la Tabla III muestra que ningun valor, con

excepcion de la pose 3, tiene un RMSD excesivamente alto comparado con el resultado empırico,

dado que todas las poses se ubican aproximadamente en la misma posicion de la interfaz C1-C4

(Figura no mostrada).

4.2. Analisis in silico de la union de citrato a FBPasa de rinon

de cerdo

El ensayo se realizo en una reconstruccion del tetramero de la enzima en su conformacion activa

(codigo PDB=1EYI), a la cual se le eliminaron todos los ligandos unidos, tal como se describe en

materiales y metodos. De las veinte poses obtenidas, tal como se obtuvo en el caso de E. coli,

una pose se encontro en el sitio activo (pose 1, Tabla IV), mientras que las otras diecinueve se

ubicaron en la interfaz C1-C4. En la Tabla IV se muestra el registro generado por Vina para el

analisis, incluyendo constantes de afinidad estimadas por el software. Que la primera pose se

encontrara en el sitio activo explica que todos los valores de RMSD estimados por el programa

fueran cercanos a 30 A, tal como la tercera pose del calculo realizado con la enzima de E. coli.

Considerando que en condiciones catalıticas el sitio activo se encontrara ocupado por el sustrato,

y que este presenta una alta afinidad por este sitio, es razonable considerar que el putativo sitio de

union para citrato se encuentra en la interfaz C1-C4. En la Figura 5 se muestra la pose de mayor

afinidad obtenida en la interfaz C1-C4 por el proceso de docking en el cristal PDB=1EYI (pose 2,

Tabla IV). Adicionalmente se destacan todos los residuos aminoacıdicos que se encuentran a una

distancia menor a 5A de la pose obtenida. En la Figura 6 se muestra un diagrama bidimensional

generado con LigPlot+ de las posibles interacciones no covalentes entre la enzima y el ligando de

la estructura mostrada en la Figura 5.

4. Resultados 33

Tabla IV: Registro entregado por Vina al realizar calculo en FBPasa wt de rinon de cerdo PDB=1EYIcon citrato como ligando

N° Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B1 (A) RMSD U.B.2 (A)

1 -6,3 0,000 0,000

2 -6,2 33,238 34,563

3 -6,2 30,354 31,818

4 -6,1 29,336 31,361

5 -6,1 29,158 31,078

6 -6,1 30,958 33,464

7 -6,1 32,094 33,962

8 -6,1 29,316 30,867

9 -6,1 29,422 31,160

10 -6,0 30,609 31,947


1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural considerando factores de simetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural, sin considerar factores de simetrıa.

4. Resultados 34

N° Pose Afinidad (kcal/mol) RMSD L.B1 (A) RMSD U.B.2 (A)

11 -6,0 31,151 33,449

12 -6,0 34,439 36,600

13 -6,0 31,930 33,093

14 -5,9 29,825 32,278

15 -5,9 31,447 33,623

16 -5,9 29,916 32,195

17 -5,8 31,301 33,682

18 -5,8 30,361 32,345

19 -5,8 31,919 33,206

20 -5,8 31,976 33,880

1 RMSD L.B.: Root Mean Square Deviation Lower Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural considerando factores de simetrıa.2 RMSD U.B.: Root Mean Square Deviation Upper Bound; parametro de medicion de diferen-cias en alineamiento estructural, sin considerar factores de simetrıa.

4. Resultados 35

Figura 5: Sitio de union de citrato en FBPasa de rinon de cerdo determinado por docking.Se muestrael sitio de union de citrato segun lo determinado por docking. Corresponde a la segunda poseobtenida, dado que la primera se ubica en el sitio activo como se discute en el texto (Tabla IV). Semuestra el citrato (naranja) y todos los aminoacidos que presentan atomos a una distancia igual omenor a 5 A alrededor del sitio de union determinado (celeste).

4. Resultados 36

3.01

3.12

2.93

2.84

3.08

3.11

CB

CA

CACOA1

OA2

CBC

OB1

OB2

CG

CGC

OG1

OG2

OHB

N

CA

CO

CB

OG1

CG2

Thr14(D)

N

CA

C

O

CB

CG

CD

OE1

OE2

Glu192(D)

N

CA

C

O

CB

CGCD1

CD2CE1

CE2CZ

Phe193(D)

N

CA

C

O

CB

CG

CD

CE

NZ

Lys42(D)

Leu13(D)

Asn35(D)

N

CAC

O

CBOG1

CG2

Thr39(D)

Cys38(D)

Thr12(D)

Gly191(D)

Figura 6: Representacion ”LigPlot+” de las interacciones de citrato con FBPasa de rinon de cerdosegun lo determinado por ensayo de docking. Se muestran las putativas interacciones no co-valentes generadas entre la pose de citrato y la enzima a partir del calculo de docking. El ligandoubicado en posicion central se representa con enlaces purpura. En lineas discontinuas verdes serepresentan los puentes de hidrogeno y las distancias a las que se encuentran los atomos involu-crados; rodeados por una corona roja se encuentran aquellos atomos involucrados en interaccioneshidrofobicas o no-enlazantes. Cada aminoacido muestra a un costado el nombre de la cadena co-rrespondiente del tetramero, mostrando que en este caso el citrato interacciona preferentementecon una subunidad de la interfaz.

4. Resultados 37

4.3. Mutagenesis sitio-dirigida

Para la realizacion de la mutagenesis se utilizaron partidores apuntados a modificar aminoacidos

putativamente relevantes para la interaccion de citrato considerando el bolsillo identificado en el

analisis in-silico. Basados en la suposicion hecha por Hines et al. y en la composicion de la cavidad

se consideraron de interes los residuos K42 y E192 (Figura 6). Las mutaciones fueron realizadas

al aminoacido alanina, considerando que de existir union en el sitio, esta modificacion apuntarıa

a interrumpir interacciones electroestaticas con el ligando. Por secuenciacion se determino que

ambas mutaciones fueron realizadas correctamente, ademas que la secuencia tipo silvestre usada en

el laboratorio presenta una mutacion silente en el residuo T63 respecto a la secuencia NM 213979.1

publicada en GenBank (posicion 192, Figura 7). Los cromatogramas de secuenciamiento realizados

con el partidor T7 de termino resultaron en cromatogramas mezclados (o mixed chromatogram,

como es descrito por Kommedal et al. [24]); debido probablemente a la amplificacion inespecifica

generada por el partidor al presentar un alineamiento parcial del partidor entre la posicion 487 y

506 del marco de lectura abierto (datos no mostrados). Esto ultimo no impidio pero si dificulto el

analisis de las secuencia anti-sense a partir de los cromatogramas resultantes.

4.4. Expresion y purificacion de FBPasa recombinante tipo

silvestre y mutantes K42A y E192A

Todas las enzimas utilizadas fueron purificadas por un proceso de precipitacion con sulfato de

amonio y por cromatografıas de intercambio cationico Carboximetil sefarosa y una de afinidad a

Cibacron Blue, tal como se describe en Materiales y Metodos. Aunque todas las enzimas fueron

expresadas bajo las mismas condiciones se observo que la mutante E192A se expreso en cantidades

4. Resultados 38

Section 11 4410 20 30(1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACORF mRNA FBPasa (NM_213979) (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa wt (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa K42A (1) ATGACGGACCAGGCGGCCTTCGACACCAATATCGTCACCCTAACFBPasa E192A (1)

Section 245 8850 60 70(45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa wt (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa K42A (45) CCGCTTCGTCATGGAGGAGGGCAGGAAGGCCCGCGGCACCGGCGFBPasa E192A (45)

Section 389 132100 110 120(89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCFBPasa wt (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCGCAGCCFBPasa K42A (89) AGATGACCCAGCTGCTCAACTCGCTGTGCACCGCGGTCAAAGCCFBPasa E192A (89)

Section 4133 176140 150 160(133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa wt (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa K42A (133) ATCTCCACCGCAGTCCGCAAGGCGGGCATCGCGCACCTCTATGGFBPasa E192A (133)

Section 5177 220190 200 210(177) AATTGCTGGCTCCACGAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa wt (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa K42A (177) AATTGCTGGCTCCACAAACGTGACAGGTGATCAAGTGAAGAAGTFBPasa E192A (177)

Section 6221 264230 240 250(221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa wt (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa K42A (221) TGGATGTCCTCTCCAATGACCTGGTTATTAACGTGTTAAAGTCAFBPasa E192A (221)

Figura 7: Descripcion en pagina 41.

4. Resultados 39

Section 7265 308270 280 290(265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa wt (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa K42A (265) TCTTTTGCCACCTGCGTTCTCGTGTCAGAAGAAGATAAAAACGCFBPasa E192A (265)

Section 8309 352320 330 340(309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa wt (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa K42A (309) CATAATAGTAGAACCTGAGAAAAGGGGTAAATACGTGGTCTGTTFBPasa E192A (309)

Section 9353 396360 370 380(353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa wt (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa K42A (353) TTGATCCCCTCGATGGATCGTCGAACATCGACTGCCTTGTGTCCFBPasa E192A (353)

Section 10397 440410 420 430(397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa wt (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa K42A (397) ATTGGAACCATCTTTGGCATCTACAGAAAGAATTCAACTGATGAFBPasa E192A (397)

Section 11441 484450 460 470(441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa wt (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa K42A (441) ACCTTCTGAGAAGGACGCACTGCAGCCAGGCCGGAACCTGGTGGFBPasa E192A (441)

Section 12485 528490 500 510(485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa wt (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa K42A (485) CAGCTGGCTATGCGCTCTATGGCAGTGCCACCATGTTGGTCCTGFBPasa E192A (485)


4. Resultados 40

Section 13529 572540 550 560(529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATORF mRNA FBPasa (NM_213979) (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa wt (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa K42A (529) GCCATGGTGAATGGAGTCAATTGCTTCATGCTGGACCCGGCCATFBPasa E192A (529)

Section 14573 616580 590 600(573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa wt (573) CGGAGAGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa K42A (573) CGGAGCGTTCATTTTGGTGGACAGGGATGTGAAGATCAAAAAAAFBPasa E192A (573)

Section 15617 660630 640 650(617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa wt (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa K42A (617) AGGGGAGCATTTACAGCATCAATGAAGGCTATGCCAAGGAGTTCFBPasa E192A (617)

Section 16661 704670 680 690(661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa wt (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa K42A (661) GACCCTGCCATCACTGAGTATATCCAGAGGAAGAAGTTTCCCCCFBPasa E192A (661)

Section 17705 748710 720 730(705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa wt (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa K42A (705) AGACAACTCAGCCCCCTACGGGGCCAGGTACGTGGGCTCCATGGFBPasa E192A (705)

Section 18749 792760 770 780(749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa wt (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa K42A (749) TGGCCGATGTCCACCGCACGCTGGTCTATGGAGGGATCTTTATGFBPasa E192A (749)


4. Resultados 41

Section 19793 836800 810 820(793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTORF mRNA FBPasa (NM_213979) (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa wt (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa K42A (793) TACCCAGCAAACAAGAAAAGCCCCAAAGGAAAGTTAAGACTGCTFBPasa E192A (793)

Section 20837 880850 860 870(837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGORF mRNA FBPasa (NM_213979) (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa wt (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa K42A (837) ATACGAATGTAACCCGATGGCCTATGTCATGGAGAAGGCAGGAGFBPasa E192A (837)

Section 21881 924890 900 910(881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCORF mRNA FBPasa (NM_213979) (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa wt (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa K42A (881) GACTGGCCACCACTGGGAAGGAAGCTGTGCTGGACATCGTTCCCFBPasa E192A (881)

Section 22925 968930 940 950(925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa wt (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa K42A (925) ACTGACATCCACCAGAGGGCGCCAATCATCTTGGGGTCTCCTGAFBPasa E192A (925)

Section 23969 1012980 990 1000(969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa wt (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa K42A (969) AGACGTGACTGAGCTCTTGGAAATATATCAGAAGCACGCAGCCAFBPasa E192A (969)

Section 2410131017(1013) AGTGAORF mRNA FBPasa (NM_213979) (1013) AGTGAFBPasa wt (1013) AGTGAFBPasa K42A (1013) AGTGAFBPasa E192A (1013)

Figura 7: Alineamiento de secuencias obtenidas por mutagenesis sitio-dirigida. La figura muestra el ali-neamiento de la secuencia del mRNA para FBPasa de Sus scrofa obtenida desde el GenBank(NM 213979), ademas de las secuencias de consenso obtenidas por secuenciamiento a partir delos plasmidios para la enzima tipo silvestre, K42A y E192A. En amarillo se destaca la identidadentre todas las secuencias, en azul se indica la identidad parcial entre un grupo de secuencias,mientras que en blanco las secuencias diferentes.

4. Resultados 42

considerablemente menores (datos no mostrados). Grosso modo se obtuvieron en el sobrenadante

de lisis y sonicacion 1000 unidades para la enzima tipo silvestre, 700 unidades para la mutante

K42A y solo 200 unidades para la enzima E192A, por 3 litros de cultivo.

La Figura 8 muestra los cromatogramas de la purificacion de la mutante K42A representativos

para todas las purificaciones. Una gran cantidad de proteinas y contaminantes no son retenidos en

las columnas utilizadas, principalmente en la columna CM FF, lo que se aprecia como un incremen-

to de la absorbancia a 280 nm en los primeros minutos de la cromatografıa (Figura 8A). Ademas

el lavado con 25 % de tampon de elucion remueve proteinas que interaccionan debilmente bajo las

condiciones utilizadas. La cromatografıa de afinidad utilizando Cibacron Blue 3GA no muestra una

cantidad importante de proteınas contaminantes en el lavado de la columna, pero se observo una

disminucion de proteinas contaminantes por SDS-PAGE (observado al cargar 10 µg de proteina en

geles SDS-PAGE al 12 %, no mostrado), ademas de un incremento en la actividad especıfica (ver

mas abajo). Se puede apreciar en ambos cromatogramas como la elucion de la actividad enzimatica

fructosa 1,6-bisfosfato 1-fosfohidrolasa, y por lo tanto de la enzima, se corresponde con el incre-

mento en la absorbancia del eluıdo. En ambas cromatografıas solo las fracciones que presentaron

actividad enzimatica fueron recolectadas para su uso.

En la Figura 9A se observa un gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes SDS-PAGE

del proceso de purificacion de la enzima tipo silvestre representativo para todas las enzimas. Se

observa claramente como al avanzar en el proceso de purificacion, las bandas correspondientes a

proteınas contaminantes van disminuyendo, mientras que la banda que putativamente corresponde

a FBPasa (�37 kDa) va aumentando en intensidad.

El cambio es visualmente importante despues del primer paso cromatografico en Carboxime-

til sefarosa Fast flow (Carril 6, Post-CM FF). A su vez en la Tabla V se muestra un cuadro de

purificacion de la enzima tipo silvestre representativa del proceso de purificacion para todas las

4. Resultados 43

A

Tiempo (minutos)

Ab

so

rban

cia

(mA

u)

Un

idad

es

En

zim

atic

as

(U/m

l)

0 50 100 150 200 2500

500

1000

1500

2000

0

50

100

150

200

250

%B

uffe

rE

lució

n

0

50

100

Co

nd

ucti

vid

ad

(mS

/cm

)

0

20

40

B

Tiempo (minutos)

Ab

so

rban

cia

(mA

u)

Un

idad

es

En

zim

atic

as

(U/m

l)

0 50 100 150 2000

50

100

150

200

250

0

10

20

30

40

%B

uffe

rE

lució

n

0

50

100

Co

nd

ucti

vid

ad

(mS

/cm

)

0

50

100

150

Figura 8: Cromatogramas del proceso de purificacion de la enzima FBPasa K42A. A Perfil de elucion dela cromatografıa de intercambio cationico en Carboximetil sefarosa Fast Flow. B Perfil de elucionde la cromatografıa de afinidad en Cibacron Blue 3GA Fast Flow. Se obtuvieron cromatogramassimilares tanto para la enzima tipo silvestre como para la mutante E192A. En azul se destaca laabsorbancia a 280 nm, en negro las unidades enzimaticas por ml, en verde el porcentaje del bufferde elucion y en rojo la conductividad. Ambos procedimientos fueron realizados con un flujo de 2ml/min, y recolectando fracciones de la proteına de interes de 4 ml, como se indica en Materialesy Metodos.

4. Resultados 44

A B

Figura 9: Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes de las fracciones delproceso de purificacion. A SDS-PAGE 12 % del proceso de purificacion de la enzima tipo silves-tre, como descrito en Materiales y Metodos. Carriles: S-Estandar de peso molecular, 1-Post-Lisis,2-Post-sonicacion, 3-Post-50 % (NH4)2SO4, 4-Post-80 % (NH4)2SO4, 5-Post-dialisis, 6-Post-CMFF y 7-Post-Cibacron Blue 3GA. En todos los carriles se cargo 10 µg, con excepcion de los carriles6 y 7 donde se cargo 1 µg. Se observa un ensanchamiento del carril 3, posiblemente debido a la altafuerza ionica. B SDS-PAGE 12 % de las proteınas tipo silvestre (1) y mutantes K42A (2) y E192A(3) purificadas. En los tres carriles se cargo 1 µg de proteına.

4. Resultados 45

Tabla V: Tabla de purificacion de enzima tipo silvestre

Actividad

Enzimatica

(U/ml)

Concentracion

de proteinas

(mg/ml)

Actividad

Especıfica

(U/mg)

Volumen

aproximado

(ml)

Rendimiento

( %)

Sobrenadante

de la lisis y

sonicacion

3,55 4,37 0,8 300 100

Corte con

(NH4)2SO4 y

dialisis

17,52 5,59 3,1 35 57,6

Cromatografıa

de intercam-

bio cationico

9,45 0,44 21,3 32 28,4

Cromatografıa

de afinidad

10,92 0,36 30,2 28 28,7

Actividad enzimatica evaluada con 30 µM FBP, 5 mM Mg2SO4, 0,1 mM EDTA ycomenzando la reaccion por adicion de la enzima.

4. Resultados 46

enzimas en cuanto al rendimiento (20 %-30 %). El incremento en la actividad especıfica se condice

con lo observado en los geles de poliacrilamida, siendo el cambio mas notorio en las fracciones

recolectadas despues de la cromatografıa de intercambio cationico. Es interesante hacer notar que

se logro obtener una actividad especıfica de 30 U/mg al utilizar este metodo de purificacion. En la

Figura 9B se muestra las bandas correspondientes a FBPasa tipo silvestre y mutantes despues del

proceso de purificacion.

4.5. Caracterizacion cinetica de las enzimas purificadas

4.5.1. Efectos de comenzar la reaccion con sustrato o con enzima y

activacion por la adicion de EDTA o citrato

Una primera aproximacion fue evaluar los efectos de comenzar la reaccion con enzima o con

sustrato y de los quelantes EDTA y citrato. Si bien es usual comenzar los ensayos de actividad en-

zimatica por la adicion de la enzima, datos preliminares del laboratorio han mostrado diferencias,

especialmente al comenzar la reaccion con sustrato. Por esto es de interes evaluar las diferencias en

la actividad enzimatica observada al comenzar la reaccion de una u otra forma, ademas del efecto

que los quelantes puedan tener sobre este fenomeno. Para esto se realizaron ensayos donde se co-

menzo con enzima o con sustrato, ambos casos sin quelante, con EDTA 0.1 mM o Citrato 1 mM.

En la Figura 10 se observa claramente como la adicion de quelantes provoca una activacion tanto

si se comienza con enzima como con sustrato. Las enzimas mutantes siempre presentan una mayor

actividad al comenzar con enzima; para la enzima tipo silvestre, aunque bajo las distintas condi-

ciones la diferencia entre comenzar con enzima y sustrato es bastante discreta, esto solo ocurre en

ausencia de quelantes, ya que al agregar tanto EDTA como citrato se observa una mayor activi-

4. Resultados 47

A

ActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

-

EDTA0.1mM

Citrato1mM

0

10

20

30

Comienzo con sustrato

Comienzo con enzima

61±10%

81±8%

35±6%

24±6%

B

ActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

-

EDTA0.1mM

Citrato1mM

0

5

10

15

20

102±23%

151±36%

48±8%

25±8%

Comienzo con enzima


CActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

-

EDTA0.1mM

Citrato1mM

0

2

4

6

8

10Comienzo con enzima


99±14%

182±23%

90±14%

45±14%

Figura 10: Efectos de comenzar la reaccion con enzima o con sustrato y activacion al agregar EDTA ocitrato. En los graficos de barra se muestran las actividades de la enzima tipo silvestre (A) y lasmutantes K42A (B) o E192A (C) al comenzar la reaccion con enzima o sustrato, tanto sin quelantecomo con EDTA 0,1 mM o citrato 1 mM. Los valores mostrados son promedios � σ de cuatromediciones. Ademas se muestran los porcentajes de activacion al agregar quelantes respecto avalor sin quelante tanto al comenzar con enzima (rojo) como al comenzar con sustrato (negro).

4. Resultados 48

dad al comenzar con sustrato. El porcentaje de activacion observado al comenzar las reacciones

con sustrato es mayor en las tres enzimas, comparado a la activacion observada al comenzar los

ensayos con la adicion de la enzima. Ademas, en general, se observo un porcentaje de activacion

menor en la enzima tipo silvestre al comparar los ensayos con EDTA o citrato, respecto a aquellos

sin quelante, comparado con las enzimas mutantes. Aunque las actividades son notoriamente dife-

rentes para ambas mutantes, es interesante hacer notar la similitud de la respuesta de ambas a las

distintas condiciones.

4.5.2. Inactivacion enzimatica por temperatura

Tomando como evidencia la bibliografıa (Lu et al. 1996 [29]) y lo observado en el ensayo

anterior, se evaluo la actividad enzimatica depues de incubar la proteina a distintas temperaturas,

como se describe en Materiales y Metodos. En la Figura 11 se observa como las enzimas mutantes

son mas sensibles al incremento en la temperatura comparado con la enzima tipo silvestre. Se

determino que la temperatura necesaria para obtener la mitad de la actividad es de 60ºC para la

enzima tipo silvestre, 49ºC para la mutante E192A y 46ºC para la mutante K42A.

4.5.3. Curvas de saturacion por sustrato de la enzimas silvestre y mutantes

Se realizaron curvas de medicion de actividad utilizando concentraciones de sustrato hasta 1

mM. Los resultados obtenidos se grafican en la Figura 12.

Se comenzo la reaccion para la enzima silvestre con sustrato y para las mutantes con enzima. Se

obtuvieron velocidades maximas aparentes en todos los casos entre 20 y 40 µM de sustrato, eviden-

ciando una clara inhibicion por exceso de sustrato a concentraciones superiores en todos los casos.

A pesar de obtener curvas con aspectos muy similares considerando las diferencias en Vmax de las

distintas enzimas, las regresiones dan cuenta de variaciones en los valores de Km, considerando

4. Resultados 49

Temperatura (°C)

Acti

vid

ad

Rela

tiva

(%)

30 40 50 60 700

50

100

Figura 11: Inactivacion enzimatica por incubacion a distintas temperaturas. El grafico muestra la activi-dad relativa de la enzima tipo silvestre (negro), y mutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Alıcuotasde las enzimas (0.2 mg/ml) fueron incubadas por 10 minutos a las temperaturas indicadas; pos-teriormente 0,4 µg de proteına fueron incubadas por 5 minutos a 30 ºC antes de comenzar lareaccion por adicion de sustrato. Se muestran las actividades de forma relativa a aquella obtenidapor cada enzima a 30ºC. El valor graficado es el promedio �σ de tres mediciones.

4. Resultados 50

[F-1,6-P2] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

1 10 100 10000

10

20

30

Figura 12: Curvas de actividad enzimatica de las enzimas tipo silvestre y mutantes a distintas concen-traciones de sustrato. Se muestra en un grafico semi-logarıtmico los cambios en las actividad delas enzimas tipo silvestre (negro), y mutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Las reacciones de laenzima silvestre fueron comenzadas con sustrato, mientras que aquellas de las enzimas mutantesfueron comenzadas por adicion de la enzima correspondiente; en todos los casos la mezcla con-tenıa 0.1 mM EDTA, 5 mM MgSO4 y Tris-HCl 20 mM pH 7,5, midiendose a 30 ºC. Se muestranlos valores promedio � σ de tres mediciones. Las curvas fueron obtenidas por ajuste a la ecuaciondescrita en Materiales y Metodos utilizando regresion no lineal.

4. Resultados 51

que comunmente se obtienen valores entre 5 y 10 µM para la enzima tipo silvestre; se obtuvieron

valores de 5,7 µM para la mutante E192A, de 16 µM para la mutante K42A y de 18,6 µM para la

enzima tipo silvestre. Se habıa reportado previamente valores para kcat significativamente menores

para ambas mutantes [28, 29]; el valor de kcat para la enzima tipo silvestre fue de 32 s�1, para la

mutante K42A fue de 27 s�1, mientras que para la mutante E192A fue de 9,8 s�1, obteniendose por

tanto solo una diferencia importante para esta ultima mutante respecto a la enzima tipo silvestre.

4.5.4. Curvas de activacion por Magnesio (II)

Como se describio en la Introduccion, la actividad catalıtica de la enzima es dependiente de

la concentracion de cationes divalentes como Magnesio (II). Se realizaron curvas de activacion de

las enzimas a concentraciones crecientes de Mg2�, lo que se puede observar en la Figura 13. No

se observaron cambios importantes en la Ka, obteniendose valores cercanos a 1 mM en todos los

casos. La cooperatividad mostro ligeros cambios, aunque para las tres enzimas el coeficiente de

Hill (nMg2�) fue cercano a 2.

4.5.5. Curvas de inhibicion por AMP

Se ha descrito que para las enzimas utilizadas en esta tesis el unico parametro que se ve afec-

tado, con excepcion de la kcat, son las constantes de inhibicion por AMP [28, 29]. Se realizaron

ensayos sin quelante comenzando la reaccion con sustrato para la enzima silvestre y con enzima

para las enzimas mutantes. La Figura 14 muestra los resultados obtenidos. Se obtuvo un valor

de Ki de 8,2 µM para la enzima tipo silvestre, con un coeficiente de Hill de 1,1. Se observo un

comportamiento bifasico de la mutante K42A, por lo que se ajusto a la ecuacion adecuada como se

indica en Materiales y Metodos. La regresion indica un aumento considerable en los valores de Ki

comparado con la enzima tipo silvestre (23,6 y 1700 µM); la mutante E192A no se inhibio comple-

4. Resultados 52

[MgSO4] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

0 1 2 3 4 50

10

20

30

Figura 13: Curvas de activacion por Magnesio (II). Se muestran los cambios en la actividad enzimaticaa distintas concentraciones de magnesio para la enzima recombinante tipo silvestre (negro), ymutantes K42A (azul) y E192A (rojo). Las reacciones fueron comenzadas con sustrato suficientepara alcanzar una concentracion de 30 µM, en presencia de 0,1 mM EDTA y en tampon Tris-HCl20 mM pH 7,5. Las mediciones son el promedio �σ de 2 mediciones para la enzima silvestre ymutante K42A y 3 mediciones para la mutante E192A.

4. Resultados 53

[AMP] mM

ActividadRelativa(%)

0.1 1 10 100 1000 100000

50

100

150

Figura 14: Curvas de inhibicion por AMP. Se muestran los cambios en la actividad enzimatica a distintasconcentraciones de AMP para la enzima recombinante tipo silvestre (negro), y mutantes K42A(azul) y E192A (rojo). Las reacciones fueron comenzadas con sustrato en el caso de la enzimatipo silvestre, y con enzima para ambas mutantes; no se agrego EDTA en ningun caso. La mezclaconsto de 30 µM sustrato, 5 mM MgSO4, en Tris-HCl 20 mM pH 7,5 a 30ºC. Las mediciones sonel promedio �σ de 3 mediciones.

4. Resultados 54

tamente aun con 100 µM de AMP, lo que da cabida a un comportamiento bifasico. Esto ultimo no

se evaluo debido a las bajas actividades registradas bajo las condiciones experimentales utilizadas,

ajustando la curva a una inhibicion de una sola fase; se obtuvo un valor de 3,3 µM para Ki, con

un coeficiente de Hill de 1,2. Se observo una alta dispersion en los datos obtenidos, probablemente

debido a la ausencia de quelante en la mezcla de reaccion.

En la Tabla VI se muestra un cuadro resumen con los parametros cineticos determinados

en los ensayos con sustrato, magnesio (II) y AMP.

4.5.6. Activacion de la actividad enzimatica de FBPasa por adicion de

citrato.

Se ha descrito que distintos tipos de quelantes son capaces de activar a la enzima, como se

describio en la Introduccion y como se observo en resultados anteriores. Para determinar las con-

centraciones necesarias para observar esta activacion, se realizaron curvas de actividad a concentra-

ciones crecientes de citrato. En la Figura 15 se muestra el resultado al agregar citrato hasta 1 mM

comenzando tanto con sustrato como con enzima, en ausencia de EDTA, dado que al realizar el

ensayo en presencia de EDTA no se aprecia la activacion por citrato (datos no mostrados). Aunque

se observo una clara activacion a 1 mM citrato, respecto a la reaccion sin este, la alta dispersion

de datos no permitio establecer claramente una constante de activacion, que en todos los casos se

estimo B100 µM. Adicionalmente se observo que al comenzar la reaccion con enzima la activacion

fue menor, lo que concuerda con los resultados mostrado previamente.

Como ensayo control se realizo una curva de activacion por adicion de EDTA de la enzima tipo

silvestre, lo que se muestra en la Figura 16. Al igual que en el caso anterior se obtuvo una alta

dispersion de los valores obtenidos, pero se estimo una constante de activacion de 607�258 nM

4. Resultados 55Ta

bla

VI:

Para

met

rosc

inet

icos

para

laen

zim

asi

lves

tre

ym

utan

tes

FBPa

saVmax

(µm

ol/(

min

mg)

)

k cat

(s�1)

Km

(µM

)

Kss

(µM

)

βKiA

MP

(µM

)

n AM

PKa

Mg2

�

(mM

)

n Mg2

�

wt

52,6�

3,6

32,0�

2,2

18,6�

2,1

60,5�

11,0

0,21

8�0,

012

8,2�

0,7

1,1�

0,1

0,98

�0,

032,

5�0,

2

K42

A44

,4�

2,9

27,0�

1,8

16,0�

1,7

41,1�

7,0

0,27

6�0,

016

23,6�

7,1;

1700

�24

9�

1,8�

0,3

1,00

�0,

061,

8�0,

2

E19

2A16

,1�

0,7

9,8�

0,4

5,7�

0,5

59,6�

0,6

0,31

5�0,

013

3,3�

0,3

1,2�

0,1

1,24

�0,

111,

8�0,

2

�C

orre

spon

dea

lase

gund

aco

nsta

nte

inhi

bito

ria,

segu

nlo

desc

rito

enM

ater

iale

sy

Met

odos

.

4. Resultados 56

A

[Citrato] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

0 200 400 600 800 10000

10

20

30

B

[Citrato] mMActividadEspecífica( mmol*min-1*mg-1)

0 200 400 600 800 10000

10

20

30

Figura 15: Curvas de activacion de FBPasa tipo silvestre y mutantes K42A y E192A por citrato. A Cur-va de activacion generada comenzando la reaccion con sustrato. B Curva de activacion generadacomenzando la reaccion con enzima. En el primer caso corresponde al promedio �σ de 2 medicio-nes, en cambio en el segundo caso fueron 4 mediciones. En ambos graficos se muestra lo obtenidotanto para la enzima tipo silvestre (negro), como para las mutantes K42A (azul) y E192A (rojo).No se obtuvieron valores confiables para las constantes de activacion, pero en todos los casos fueB100 µM.

4. Resultados 57

[EDTA] nMActi

vid

ad

Esp

ecíf

ica

( mm

ol*

min

-1*m

g-1

)

0.1 1 10 100 1000 10000 1000000

10

20

30

Figura 16: Curva de activacion de la enzima tipo silvestre por EDTA. Los ensayos se realizaron a con-centraciones crecientes de EDTA hasta 0,1 mM. El grafico se muestra utilizando una escala semi-logarıtmica con el fin de ver el proceso de activacion.

4. Resultados 58

4.5.7. Ensayos de dialisis al equilibrio

Se realizaron ensayos de dialisis al equilibrio utilizando 1 µM de citrato radiactivo considerando

el volumen total de ambas camaras, tal como se indica en Materiales y Metodos. Adicionalmente se

agregaron otros ligandos importantes en la catalisis y que podrıan afectar la union, como son mag-

nesio (II) (5 mM) y Fru-1,6-P2 (30 µM). Los resultados para cada una de las enzimas se muestra

en la Figura 17. La enzima tipo silvestre no mostro ningun tipo de union bajo ninguna de las condi-

ciones probadas. Las mutantes en cambio mostraron diferencias en la radiactividad recuperada de

las distintas camaras, al realizar el ensayo sin adicion de otro ligando, observandose una diferencia

de 4,9 % en el caso de la enzima K42A y de un 10,9 % para la enzima E192A, siendo significativa

esta diferencia segun la prueba t de Student para la mutante E192A (Figura 17C). Considerando lo

anterior se realizo con esta mutante el ensayo a distintas concentraciones de citrato entre 1 µM y

1 mM, manteniendo en 1 µM la concentracion de citrato radiactivo, siempre considerando el vo-

lumen total en ambas camaras (Figura 18A). A concentraciones sobre 10 µM deja de observarse

diferencia entre ambas camaras. Se intento determinar la constante de afinidad utilizando concen-

traciones de ligando entre 0,1 y 5 µM (Figura 18B), pero dada la pequena diferencia en cuentas por

minuto entre camaras, no se logro obtener valores significativos (datos no mostrados).

4. Resultados 59

A

CPMcámara/CPMtotal

MgSO45mM

Fru-1,6-P230mM

Mg2+ +Fru-1,6-P2 -

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B

CPMcámara/CPMtotal

MgSO45mM

Fru-1,6-P230mM

Mg2+ +Fru-1,6-P2 -

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

CPMcámara/CPMtotal

MgSO45mM

Fru-1,6-P230mM

Mg2+ +Fru-1,6-P2 -

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

*

Figura 17: Ensayos de union por dialisis al equilibrio de citrato para FBPasa tipo silvestre y mutantesK42A y E192A. Ensayos de dialisis al equilibrio con las enzimas tipo silvestre (A), y mutantesK42A (B) y E192A (C) En los graficos de barra se representa la razon de las cuentas por minutorecuperadas de la camara con retenido de proteına (negro) y de aquella sin proteına (gris) respectoa la suma total de ambas camaras. Los ensayos se realizaron agregando solo el citrato radioactivoen buffer (-), o agregando ademas magnesio (II), Fru-1,6-P2 o ambos. * representa un t-Studentcon un [email protected] para la diferencia entre las camaras.

4. Resultados 60

A

[Citrato] mM

CPMcámara/CPMtotal

1 10 50 100

1000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B

[Citrato] mM

CPMcámara/CPMtotal

0.1

0.5 1

2.5 5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Figura 18: Ensayos de dialisis al equilibrio de mutante E192A a distintas concentraciones de citratototal. En los graficos de barra se representa la razon de las cuentas por minuto recuperadas de lacamara con retenido de proteına (negro) y de aquella sin proteına (gris) respecto a la suma totalde ambas camaras.

5 Discusion

La enzima fructosa 1,6-bisfosfatasa ha sido ampliamente estudiada desde su descubrimiento por

Gomori [16]. Como se describio anteriormente, los reguladores mas estudiados han sido AMP y

fructosa 2,6-bisfosfato, dejando de lado otros posibles ligandos efectores con importancia fisiologi-

ca [47]. Desde los comienzos del estudio de la enzima se observo que los ensayos in vitro requieren

la presencia de un quelante, de preferencia EDTA, para obtener actividades enzimaticas mayores y

mas estables. De hecho una de las razones que explica la dificultad de detectar la isoforma muscular

fue la ausencia de un quelante en el medio de reaccion, como describieron Krebs y Woodford en

1965 [25], quienes observaron actividades bajas e inestables, atribuidas a la diferencia de concen-

tracion de metales contaminantes. El mecanismo descrito para este fenomeno implica la existencia

de especies mixtas de metales divalentes con la enzima. Al tener Zn2� en conjunto con magnesio,

la actividad catalıtica es menor a la obtenida solo con Mg2� como metal catalıtico. EDTA, aun-

que permite el estudio de los efectos de ligandos sobre la enzima, como AMP y Fru-2,6-P2, es

sintetico, por lo que no refleja las condiciones presentes a nivel celular. Teniendo en cuenta este

contexto se vuelve interesante intentar describir el efecto de activadores y quelantes fisiologicos

como aminoacidos e intermediarios del metabolismo de carbohidratos. De estos, los que tendrıan

mayor implicancia en la quelacion de metales a nivel celular son citrato e histidina; se demostro que

el segundo no interacciona con la enzima, asumiendo que su mecanismo de activacion es exclusi-

vamente por quelacion de metales inhibidores [49], mientras que no se ha reportado si el primero

interacciona o no con la enzima de mamıfero.

61

5. Discusion 62

Ensayos de union molecular in-silico o docking establecen el putativo sitio de union de citrato

en la interfaz C1-C4 tanto en la enzima de E. coli como en la enzima de rinon de cerdo

Con el fin de evaluar si citrato es capaz de interaccionar con la enzima se evaluo de forma

preliminar si a traves de un ensayo in silico se observa la union de citrato en el tetramero de

enzima, teniendo como antecedente que el grupo de Fromm, demostro que citrato activa a FBPasa

de E. coli por interaccion con la interfaz C1-C4 de dicha enzima [21]. Con esto se decidio evaluar

la posibilidad de reproducir este resultado computacionalmente, con el fin de validar el ensayo a

utilizar en la enzima de rinon de cerdo. El resultado mostro ser satisfactorio, obteniendose una

pose con solo 0.7 A de RMSD. Al realizar el mismo ensayo en la enzima de rinon de cerdo, se

observo una pose unida en el sitio activo, y un grupo de poses en la interfaz C1-C4. La union

en el sitio activo no se considero relevante, dada la alta afinidad del sustrato por el sitio. El sitio

de union postulado por el docking presente en la interfaz C1-C4 para la enzima de mamıfero es

estructuralmente equivalente al sitio presente en la enzima de E. coli (comparar Figuras 4 y 5).

Al observar la superficie molecular presente en la interfaz (Figura 19) se observa la presencia de

una cavidad rodeada por los residuos C38, T39, K42, G191, E192 y F193, correspondiente al sitio

de union resultante del docking. Es interesante que el resultado del ensayo de docking contempla

interacciones con los aminoacidos E192 y K42 (Figura 6), los cuales, segun la suposicion hecha

por el grupo de Fromm, permite mantener a la enzima en forma constitutivamente activa.

Adicionalmente a los ensayo de docking, el laboratorio cuenta con resultados cristalograficos

preliminares que indican la interfaz C1-C4 como el sitio de union (Figura 20). Aunque la union ocu-

rre en la interfaz, la molecula de citrato se encuentra interaccionando con los residuos Q32 y N35,

mas alejados del centro del tetramero. Por otra parte, en el putativo sitio determinado por docking

se encontraron moleculas de glicerol, lo que resulta controversial, al no haberse generado el cristal

en presencia de este compuesto, pero si habiendose tratado de forma posterior a la cristalizacion.

5. Discusion 63

Figura 19: Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4. A la izquierda de la Figura se muestra lasuperficie molecular de FBPasa (PDB=1EYI), coloreada segun potencial electroestatico; negativo(rojo) y positivo (azul). Adicionalmente, en el costado superior derecho, se muestra un cortevertical, en el cual se resalta la cavidad presente en la interfaz (trazos verde), y en el costadoinferior derecho se muestra la superficie de contacto entre subunidades (trazos naranja).

5. Discusion 64

Figura 20: Superficie molecular y cavidad de la interfaz C1-C4 mostrando ubicacion de citrato deter-minado por cristalografıa y por docking. En la Figura se muestra la superficie molecular deFBPasa (PDB=1EYI), coloreada segun potencial electroestatico; negativo (rojo) y positivo (azul).En la porcion superior derecha se muestra la ubicacion determinada por cristalografıa, mientrasque en la inferior derecha se muestra la estructura determinada por docking. La molecula de ci-trato se muestra de color naranja, glicerol de color celeste, y los nombres de los residuos que seencuentran a una distancia B a 5 A en verde. Los datos cristalograficos corresponden a datos nopublicados de Adelaida Dıaz, Joel Asenjo, Joan Guinovart y Juan Carlos Slebe.

5. Discusion 65

Existe la posibilidad que citrato haya sido desplazado de forma posterior a su cristalizacion, por

lo que este antecedente no es necesariamente contradictorio con el resultado obtenido por docking

[57].

Expresion, purificacion y caracterizacion de la enzima tipo silvestre y mutantes K42A y

E192A

Tomando en cuenta los datos planteados se expreso y purifico a las enzimas mutantes K42A y

E192A, ambas descritas previamente [28, 29]. Las enzimas se obtuvieron con alta pureza, como se

evidencio por SDS-PAGE (Figura 9). Es usual medir la actividad de FBPasa iniciando la reaccion

por la adicion de la enzima, por lo que una primera aproximacion fue evaluar el efecto de comenzar

las reacciones con enzima o con sustrato, con o sin EDTA 0,1 mM o citrato 1 mM, particularmente

en las enzimas mutantes. En todos los casos, la adicion de EDTA provoco una activacion maxima,

evidenciandose una activacion comparable con la adicion de citrato 1 mM. A su vez, al comparar

los ensayos sin quelante, respecto a aquellos a los que se le agrego EDTA o citrato, la activacion fue

mayor al comenzar la reaccion con sustrato, tanto para la enzima silvestre como para ambas mutan-

tes. Para la enzima tipo silvestre el comenzar la reaccion con enzima o con sustrato mostro ligeras

diferencias: el comenzar la reaccion con sustrato en presencia de EDTA o citrato permitio obtener

los valores de actividad catalıtica mas altos, mientra que en ausencia de ligandos la reaccion inicia-

da con sustrato mostro menor actividad. En el caso de las enzimas mutantes, siempre mostraron una

actividad especıfica mas alta al comenzar la reaccion con enzima. Considerando el posible efecto

de la incubacion de la enzima a 30ºC por 5 minutos en la menor actividad al comenzar la reaccion

con sustrato, y teniendo en cuenta que ambas mutaciones afectan un puente hidrogeno de la interfaz

C1-C4, se evaluo la inactivacion de la enzima por incubacion de la proteına a distintas temperaturas.

Ambas mutantes son claramente mas inestables que la enzima tipo silvestre, lo que puede explicar

5. Discusion 66

en parte la disminucion de actividad al comenzar los ensayos con sustrato. El resultado concuerda

con temperaturas de inactivacion reportadas para otras mutantes del residuo K42 [44].

La caracterizacion cinetica permitio comparar los parametros cineticos con aquellos reportados

previamente (Tabla VII). Ambas enzimas mutantes mostraron kcat menores a la correspondiente

de la enzima tipo silvestre: la mutante K42A evidencio una disminucion de aproximadamente un

septimo, mientras que la mutante E192A mostro un valor al menos 3 veces menor. En contraparte,

Lu et al. observo una disminucion a la mitad de la mutante K42A y de un cuarto para la enzima

E192A. Las Km fueron muy similares para la enzima tipo silvestre y la mutante K42A, y un poco

menor para la mutante E192A, a pesar de la similitud en la forma de todas las curvas obtenidas,

y que en todos los casos se obtuvo el maximo de actividad alrededor de 30 µM de sustrato (ver

Figura 12); a su vez fueron en todos los casos mayores a los valores reportados previamente. Estas

diferencias se pueden ver incrementadas debido a la diferencia en el metodo de regresion utilizado

entre el actual estudio y el reportado por Lu et al.. Los valores para la constante inhibitoria por

exceso de sustrato (Kss) fueron entre 40 y 60 µM, evidenciando ligeras y poco significativas dife-

rencias entre las enzimas; este parametro no habıa sido reportado con anterioridad. La respuesta a

Mg2� fue similar en todos los casos, obteniendo valores de Ka cercanos a 1 y coeficientes de Hill

cercanos a 2.

Uno de los parametros de interes en la enzimas mutantes es la inhibicion por AMP, la cual en

ambos casos se habıa descrito con caracterısticas bifasicas y con una perdida de cooperatividad,

ademas de una perdida de sensibilidad a la inhibicion en el caso de la enzima K42A [28, 29]. El

caracter bifasifco denota la presencia de sitios de alta y baja afinidad por AMP. Los resultados de

inhibicion por AMP obtenidos en esta tesis presentan una alta dispersion, al ser realizados sin la

adicion de EDTA. Se conoce que la enzima tipo silvestre presenta por lo general un coeficiente de

Hill cercano a 2 [5]. En nuestro caso se observo falta de cooperatividad para la enzima tipo silvestre

5. Discusion 67

Tabla VII: Valores reportados previamente para las enzimas tipo silvestre y mutantes K42A y E192Apor Lu et al., 1996 y 1997

FBPasa kcat (s�1) Km (µM) KaMg2� (mM) nMg2� KiAMP (µM) Ref.

wt 21�1 1,4�0,3 0,34 1,8�0,5 2,8 [28, 29]

K42A 10,8�0,5 3,3�0,7 0,64 NR 18;11000� [29]

E192A 15�4 3,3�1,8 0,95 1,4�0,1 1,6�0,1; 17000�17000� [28]

� Corresponde a la segunda constante inhibitoria.NR: Valor no reportado.

5. Discusion 68

y la mutante E192A, mientras que la mutante K42A mostro un valor cercano a 2. No se tiene claro

el porque esta diferencia en la cooperatividad, pero hay que considerar que los ensayo fueron rea-

lizados sin quelante, lo que puede afectar los valores aquı informados. La perdida de inhibicion de

la enzima K42A resulto evidente, ademas de su caracter bifasico. El valor de la segunda constante

inhibitoria mostro una diferencia de un orden de magnitud respecto al valor reportado previamente,

pero aun ası fue en el rango de concentraciones milimolares. Para la enzima mutante E192A la

constante inhibitoria concuerda con lo informado anteriormente; aunque se vieron indicios de un

caracter bifasico, esto no fue evaluado debido a las bajas actividades obtenidas en las condiciones

utilizadas en este estudio. Es importante hacer notar que la actividad de la enzima en la segunda

fase no supera el 10 % segun lo descrito [28]. De hecho es interesante hacer notar el valor de la

constante inhibitoria reportado para la segunda fase, el cual evidencia un error estandar muy alto.

Tomando en cuenta los resultados obtenidos se considero que, excluyendo los parametros de inhi-

bicion por AMP, la kcat y la Km en el caso de la enzima E192A, las enzimas mutantes mostraron

caracterısticas similares a la enzima tipo silvestre.

Activacion de la enzima por citrato; ensayos de dialisis al equilibrio y el aumento de la union

en las enzimas mutantes

En vista de la activacion por citrato observada en los ensayos anteriores, se realizaron curvas

de activacion agregando citrato hasta concentraciones de 1 mM, comenzando las reacciones con

enzima o con sustrato (Figura 15). En concordancia con los resultados anteriores (Figura 10), al

comenzar la reaccion con sustrato se observo una activacion mayor comparado al ensayo realizado

comenzando la reaccion con enzima. Aun cuando el mayor cambio ocurre entre 0 y 100 µM, no se

pudo determinar con certeza una constante de activacion, debido a la alta dispersion de los datos.

Esto se debe probablemente a la presencia de especies mixtas de cationes divalentes y enzima, y

5. Discusion 69

a la menor capacidad respecto a EDTA de citrato de remover Zn2�. Al realizar el mismo analisis

con la enzima tipo silvestre agregando EDTA hasta concentraciones de 100 µM y comenzando con

sustrato, se observo una constante de activacion de aproximadamente 1 µM.

La posible union de citrato a la enzima silvestre y mutantes fue evaluada por dialisis al equili-

brio, de forma similar a lo mostrado previamente en la literatura para fosfofructoquinasa [37]; bajo

las condiciones probadas los ensayos no mostraron union detectable para la enzima tipo silvestre,

pero si al realizar los ensayos con las enzimas mutantes sin ligando, y de forma estadısticamente

significativa para la mutante E192A. Esto en cierta forma concuerda con lo esperado; la remocion

de una carga negativa del putativo sitio de union permitirıa disminuir la repulsion de citrato por la

cavidad, aumentando ası la union. La aparente union a la enzima K42A, aunque no significativa

segun la prueba t de Student, podrıa dar indicios de un factor esterico en la union a la interfaz,

ademas del factor determinado por carga ya descrito. Los resultados obtenidos no permitieron es-

tablecer constantes de disociacion para el ligando, dada las pequenas diferencias de radiactividad

detectadas entre las camaras.

En el laboratorio se habıan realizado anteriormente ensayos de fluorescencia para evaluar la

posible union de citrato a la enzima. Para esto se habıan realizado mutaciones de residuos fenilala-

nina a triptofano, considerando que la enzima silvestre no tiene este ultimo aminoacido, donde la

mutante F16W mostro ser sensible y reflejar cambios en la intensidad de fluorescencia a distintas

concentraciones de citrato (Figura 21). A partir de este ensayo se estimo una constante de disocia-

cion de 2,2�0,5 mM. La enzima utilizada fue purificada utilizando un sistema de purificacion de

Sefarosa-Nickel, al poseer una cola de polihistidina His-Tag; el ensayo fue realizado utilizando la

enzima sin haber cortado el peptido His-Tag, ademas de el medio tener 0.1 mM EDTA. Serıa intere-

sante realizar el ensayo en ausencia de EDTA y del mencionado peptido y observar si se obtiene un

efecto distinto, considerando que se puede estar enmascarando un efecto al ser ambos quelantes.

5. Discusion 70

[Citrato] mM

10

0*(

F-F

0)/

F0

0 5 10

-8

-6

-4

-2

0

Figura 21: Efecto de la concentracion de citrato sobre la intensidad de fluorescencia de la mutante derinon de cerdo F16W. Se grafica el porcentaje de disminucion de la intensidad de fluorescencia alir incrementando la concentracion de citrato. El medio corresponde a un buffer Tris-HCl 20 mMpH 7,5 EDTA 0,1 mM. El ajuste corresponde a una regresion utilizando la ecuacion de Hill. Losresultados corresponden a datos no publicados de Marcos Maureira, Joel Asenjo y Juan CarlosSlebe.

5. Discusion 71

Considerando la alta Kd estimada por fluorescencia, se puede explicar el resultado obtenido por

dialisis al equilibrio con el enzima tipo silvestre. Es posible que de realizar el mismo ensayo con

citrato marcado con una radiactividad especıfica mayor y mayores concentraciones de proteına, la

union seria observable.

En conjunto los datos permiten inferir que probablemente existe union de citrato a la enzima

silvestre, pero que la constante de afinidad es tan baja que no puede ser determinada utilizando

el metodo por dialisis al equilibrio planteado en este estudio. Adicionalmente ambas mutaciones

provocan un aumento en la union del ligando con la enzima, lo que podrıa implicar no solo un efecto

de repulsion por carga de la enzima silvestre, si no tambien un componente esterico en el putativo

sitio. Ademas, al realizar los ensayos en presencia de Fru-1,6-P2 30 µM, de Mg2� 5 mM, o de

ambos, se hizo imperceptible la diferencia de radiactividad entre la camara con proteına y la camara

con dializado. Uno de los motivos que pueden explicar este efecto al agregar el cation divalente,

es la formacion del complejo citrato-Mg2�, lo que podrıa modificar su capacidad de union. El caso

del sustrato es mas complejo; se ha observado que el sustrato modifica las interacciones entre las

subunidades del tetramero [2], lo que podrıa permitir especular respecto a una modificacion del

sitio de union de citrato, y por tanto la disminucion de la union observada.

Aunque se observa union del ligando y activacion de la enzima al aumentar la concentracion

de este, no es posible establecer fehacientemente el vınculo entre el proceso de union y el aumento

en la actividad. La constante de afinidad observada por fluorescencia no se correlaciona con la

activacion evaluada en este estudio; adicionalmente no se ve una activacion importante de la enzima

por citrato en una mezcla de reaccion con 10 µM EDTA (datos no mostrados). No obstante la union

detectada por dialisis al equilibrio en ambas mutantes se correlaciona con un aparente incremento

en el porcentaje de activacion por citrato, comparado con la enzima silvestre. Mas aun, existe

una aparente inconsistencia en la activacion observada por citrato y EDTA, si es que la perdida

5. Discusion 72

de inhibicion por zinc (II) fuese el unico responsable de la activacion observada. El logaritmo de

la constante de formacion para el complejo EDTA-Zn2� es de 16.58 [58], mientras que para el

complejo (citrato)2-Zn2� es de solo 5.9 [22]. Esto implica que EDTA es 1010,68 veces mas afın por

Zn2� de lo que lo es citrato. Aun ası con concentraciones cercanas a 100 µM de citrato se activa a

la enzima de forma comparable al utilizar entre 1 y 10 µM de EDTA (Figuras 10, 15 y 16), pero la

activacion por EDTA siempre es ligeramente superior.

Si el fenomeno de activacion fuese por mera quelacion, uno esperarıa que al aumentar la con-

centracion de citrato se llegase a obtener una activacion equivalente a aquella obtenida por EDTA.

Esto no ocurre, dado que al incrementar la concentracion de ambos quelantes por sobre 1 mM,

se observa una disminucion de la actividad, la cual es mucho mayor en el caso de EDTA. Esto

se puede relacionar con la capacidad para quelar magnesio (II), cation esencial para la actividad

enzimatica; EDTA tiene un logaritmo de constante de formacion de complejo de 8,6 [42], mientras

que el complejo (citrato)2-Mg2� de 4,89 [10]. Al comparar las constantes de formacion de EDTA y

citrato por Zn2� y Mg2� se observa una mayor especificidad de EDTA por Zn2� en comparacion a

citrato por este metal. Esto sugiere que citrato podrıa quelar Mg2� en conjunto a Zn2�, observando-

se una activacion aparente menor debido a la conjunta quelacion del metal catalıtico. Hay que

considerar que el sistema de equilibrios puede ser mucho mas complejo que lo planteado anterior-

mente. Es difıcil realizar calculos basados en las constantes de disociacion de los complejos sin

saber las concentraciones de zinc presentes en todas las soluciones involucradas en los ensayos de

actividad enzimatica, mas aun cuando se evaluo que incluso tampones tratados con agarosa-acido

iminodiacetico (o Chelex-100) tienen concentraciones de Zn2� alrededor de 20 nM [18].

En conjunto los argumentos planteados permiten suponer que la union de citrato en la interfaz

produce efectos adicionales a la activacion de la enzima por remocion de Zn2�. Esta no serıa la

primera vez que se observan inconsistencias en la respuesta de la enzima a citrato que darıan cabida

5. Discusion 73

a la especulacion de efectos adicionales a la quelacion de metales inhibidores; en 1990 Adams et al.

mostraron como una mezcla de histidina y citrato son capaces de activar mas a FBPasa que EDTA,

a pesar que ninguno de estos quelantes es capaz de competir por Zn2� con EDTA [1]. Ademas, en

1976, Tejwani et al. mostraron que a pH 9 el unico quelante capaz de activar a la enzima es citrato

[48]. Es importante hacer notar que a este pH la enzima no serıa inhibida por Zn2�, ya que este

precipitarıa al formarse Zn(OH)2, forma muy poco soluble de este metal [47].

Revision del posible rol fisiologico de Zn2� en la actividad de FBPasa

Se ha planteado con anterioridad que FBPasa puede funcionar como una metaloproteina de

Zn2� in-vivo [47]. Solo recientemente se ha logrado estimar con mas exactitud que la concentracion

libre de Zn2� en el citosol se encuentra en el rango picomolar, aun cuando la concentracion total

se encuentra en el rango micromolar [8, 32]; esto implica que la concentracion de Zn2� libre se

encuentra en el rango de concentraciones en el que el metal actua como un efector negativo para la

enzima y no como el metal catalıtico (@1 µM Zn2�).

En la ultima decada se la ha dado relevancia a las implicancias del Zn2� en posibles procesos

regulatorios a nivel celular, a sus mecanismos de transporte y a su interaccion con diversas proteınas

[9, 32]. De hecho se plantea que fluctuaciones en las concentraciones de Zn2� podrıan regular a

metaloenzimas dependientes de zinc, pero lo que es aun mas interesante, activar a enzimas que son

fuertemente inhibidas por este metal (Figura 22) [32]. Dentro de estos estudios se habla de Zn2�

estatico, el cual se une con un valor de logaritmo de constante de formacion (log Kf ) superior a 10,

fraccion movil de Zn2� con log Kf @10 y de Zn2� libre; citrato, como se menciono anteriormente,

formarıa complejos con Zn2� de la fraccion movil. Tomando en cuenta que las concentraciones

de citrato son oscilatorias, no es irracional pensar que este metabolito podrıa estar controlando por

medio de estos cambios de concentracion la fraccion libre de Zn2�, en conjunto con fluctuaciones de

5. Discusion 74

Figura 22: Activacion e inhibicion de enzimas por zinc (II). En la parte superior se muestra como apoenzi-mas son activadas por la union de zinc (II). Ademas, en la parte inferior se muestra como enzimasque son inhibidas por zinc (II) podrıan ser activadas al disminuir la concentracion libre del cation.Figura tomada del artıculo publicado por Maret, 2013 [32].

5. Discusion 75

otros metabolitos con capacidad quelante como histidina. Sin embargo hay que tener presente que

las constantes inhibitorias descritas para FBPasa son altas, en comparacion con las concentraciones

estimadas de Zn2� libre, presentando una Ki entre 100 y 300 nM [32, 33, 41, 48]. A pesar de esto,

el rol de la inhibicion por Zn2� no necesariamente implica la inhibicion total de la enzima, si no

que puede estar regulando su actividad por medio de la formacion de especies mixtas de enzima-

cationes divalentes.

Se han realizado observaciones interesantes en las dinamicas de union de Zn2� a las proteinas.

En β-lactamasas, el sustrato dimsinuye de forma importante la constante de disociacion de Zn2�

[56]. Ademas, al agregar EDTA a peptidos con capacidad de unir el metal, aumenta en 6 ordenes de

magnitud la velocidad de disociacion de Zn2�, al formar complejos ternarios EDTA-Zn2�-peptido,

permitiendo el rapido intercambio del metal entre especies con capacidad de unirlo (mecanismo

denominado ”quelacion catalıtica”) [17, 34]. Se puede especular que el primer fenomeno es el

responsable de los efectos observados al comenzar las reacciones con enzima o con sustrato en el

presente estudio (Figuras 10 y 15), es decir, que cuando la reaccion es comenzada con enzima, esta

no tiene tiempo suficiente de intercambiar todo el metal con EDTA o citrato antes de interaccionar

con el sustrato, generando especies de enzima con mezclas de metales (Zn2� y Mg2� y por lo

tanto una actividad reducida. En comparacion, al comenzar la reaccion enzimatica con sustrato, la

enzima es incubada por 5 minutos en la mezcla de reaccion, dando un tiempo mas extenso para

remover las trazas presentes. De ser cierto este efecto, podrıa tener implicancias en la capacidad

de la enzima de responder a cambios en las concentraciones de metales, dependiendo si el sitio

catalıtico se encuentra con el sustrato o no. La formacion de complejos ternarios, por otra parte,

pueden dar cabida a distintas velocidades de remocion del metal, dependiendo de la capacidad de

generar el complejo por el quelante mas que de las constantes de equilibrio. Respecto a esto, se han

descrito este tipo de estructuras en cristales, mostrando complejos citrato-Zn2�-proteına [14].

5. Discusion 76

Perspectivas

La evaluacion de los efectos de los quelantes sobre las actividades enzimaticas de metaloenzi-

mas muestra ser mas compleja de lo esperado inicialmente. Serıa interesante evaluar, tomando en

cuenta la informacion y tecnicas actualmente disponibles, los reales efectos de Zn2� sobre FBPasa,

ademas de poder dilucidar la controversia del efecto de citrato en la actividad catalıtica de la enzi-

ma. En 2002, Wommer et al. mostraron en una serie de experimentos como es posible evaluar las

constantes de disociacion y los efectos en las catalisis de β-lactamasas utilizando quelantes, sondas

absorciometricas, un modelo del equilibrio y evaluaciones de las concentraciones de Zn2� en las

soluciones utilizadas [56]. Expermientos de este tipo probablemente permitirıan esclarecer si existe

algun efecto de citrato sobre FBPasa adicional a la quelacion de metales, lo que incluye variaciones

en las velocidades de disociacion de los metales a la enzima.

Nuevos ensayos con la enzima mutante F16W bajo condiciones mas adecuadas tal vez den

resultados mas auspiciosos que los generados por dialisis al equilibrio, al aumentar la capacidad

de deteccion. Es mas, dobles mutantes de la enzima F16W y E192A o K42A permitirıan reevaluar

lo observado en el presente reporte, ademas de poder determinar las constantes de disociacion,

indeterminables bajo el metodo aquı utilizado.

Conclusiones

El efecto en la actividad catalıtica de los quelantes como EDTA, citrato e histidina en FBPasa

han sido estudiados con anterioridad. Aun ası, este parece ser el primer informe que da cuenta de

una interaccion de citrato con una FBPasa hepatica. Las mutaciones de los residuos E192 y K42

a alanina parecen aumentar la union del ligando, lo que podrıa dar cuenta que el sitio de union es

equivalente al observado en E. coli, y aunque la union parece ser fuertemente influenciada por las

cargas de los residuos en la cavidad, podrıa darse un componente esterico no despreciable. La su-

5. Discusion 77

posicion hecha por Hines et al. es congruente con lo observado en esta tesis [21]; se observo union

por dialisis al equilibrio en las enzimas mutantes de los residuos E192 y K42, aun cuando no se

evidencio un incremento en la activacion por citrato en presencia de EDTA, comparado con el efec-

to observado en la enzima de E. coli. La discrepancia entre la activacion y la union de citrato por

la enzima, ademas de las diferencias de activacion entre EDTA y citrato, hace pensar que existen

dos posibilidades: 1) la activacion observada por citrato es a consecuencia de la quelacion de Zn2�,

y la aparente discrepancia entre EDTA y citrato se explica por equilibrios y dinamicas complejas

no evaluadas o 2)citrato es capaz de generar un cambio en la estructura de la enzima, debido a su

union con esta. Se propone reevaluar la union de citrato a la enzima con el sistema de mutantes

mencionadas anteriormente, ademas de evaluar los efectos de Zn2� sobre la actividad catalıtica de

la enzima y sus posibles consecuencias a nivel celular, donde es posible que citrato, junto con otros

quelantes fisiologicos, jueguen un rol. Esto permitirıa discriminar si el efecto de citrato se debe

exclusivamente a la quelacion de este metal o si la union esta involucrada en la activacion, abriendo

posibilidades a mecanismos de regulacion no contemplados con anterioridad.

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