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PRACTICA N 2 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

OBJETIVO Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas qumicas de coloracin y precipitacin.

Consultar: Domnguez, X. A., Mtodos de Investigacin Fitoqumica, Ed.Limusa,Mxico, 1973.Captulo 3.

MARCO TERICO

Metabolitos Primarios: Son los productos qumicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lpidos, las protenas y los cidos nucleicos.

Metabolitos Secundarios: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metablicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonmico, estado de vida o tejido presentando una distribucin restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonoma. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patgenos, predadores, cambios trmicos o l umnicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecficos. El metabolismo secundario es una caracterstica fundamental de la especializacin, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la clula pero s para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiolgicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son residuos bioqumicos, es decir, productos de activ idad enzimtica de substratos no apropiados o productos de destoxificacin o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condicin de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosinttica: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides.

Reconocimientos de Metabolitos: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoqumicas preliminares, las cuales son una prueba qumica de caracterizacin consistente en una reaccin qumica que produce alteracin rpida en la

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estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificacin de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formacin de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestacin sensible como el cambio de un color, la formacin de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dndonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.

Reconocimiento de Alcaloides: Los alcaloides son sustancias bsicas que contienen nitrgeno en un anillo heterocclico, son derivados de aminocidos, presentan distribucin taxonmica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un cido org nico.

N

N

CH3

Nicotina

Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgnicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en cidos minerales diluidos.

Reconocimiento de Flavonoides:

O

OH

(+)-Catequina

Los Flavonoides son compuestos polifenlicos con quince tomos de carbono, cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 C3 C6.

Reconocimiento de Cardiotnicos: Una aglicona cardiotnica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C18 y C-19,

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un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactnico - insaturado de cuatro carbonos unido al carbono 17 del ncleo esteroidal.

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O

CH3

OHCH3

OH

O

O

OCH3

OH

OH

Digoxin

Estas agliconas toman el nombre de cardenlidas por presentar acti vidad estimulante sobre el msculo cardiaco, cuando estn en forma de glicsidos.

Reconocimiento de Saponinas: Las saponinas son un grupo de glicsidos solubles en agua, que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensin superficial d el agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrlisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina.

CH3

CH3

OH

O

CH3 OCH3

Diosgenina

La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosdico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.

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Reconocimiento de Cumarinas: Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenlic os y tienen en comn la estructura qumica de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

O O

Reconocimiento de Taninos:

Los taninos son productos de excrecin de muc has plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parsitos. Se encuentran ms comnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Qumicamente los taninos son polmeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en: Taninos Hidrosolubles o Piroglicos: Son steres fcilmente hidrolizables formados por una molcula de azcar (en general glucosa) unida a un nmero variable de molculas de cidos fenlicos (cido glico o su dmero, el cido elgico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledneas.

O

OH

OH

OH

OH

O

COOH

OH OH

OH

c. Glico

c. Elgico

OOH

OH OH

OH

OH

Leucoantocinidina

Flavan 3,4-diol

Leucopelargonidin

Taninos no Hidrosolubles Condensados : Tienen una estructura qumica similar a la de los flavonoides. Por hidrlisis dan azcar y cido elgi co, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrlisis cida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.

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Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides:

CH3

CH3

CH3 CH3

CH3

OH

CH3

Ergosterol

Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17.

Reconocimiento de Quinonas: Las quinonas son dicetonas cclicas insaturadas que por reduccin se convi erten en polifenoles, siendo reversible esta reaccin. Las quinonas derivan su nombre del miembro ms simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidacin del cido qunico.

O

O Antraquinona

Las quinonas, por el sistema aromtico que dan al reducirse se pueden clasificar en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las ms numerosas) y Fenantroquinonas (las menos numerosas).

Reconocimiento de Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores cido base debido al proceso:

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HO-

H+

HO-

H+

O+OH

OH

OH

OH

pH < 3Catin cianina

OOH

OH

OH

O

pH 8.5Base cianina

OOH

OH

O-

O

pH > 11Anin cianina

Pelargonidina

Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucsidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fcil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de slidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado pro otros pigmentos, como la clorofila.

Procedimiento Experimental 1. Recolectar y preparar las muestras frescas

2. Reconocimiento de alcaloides Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Aadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra est en contacto con la solucin cida. Calentar con agitacin al bao mara durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado cido fro. Aadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un estndar de quinina en solucin cida.

3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotnicos En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Aadir un volumen suficiente de alcohol etlico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al bao mara durante unos 5 minutos, con agita cin. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado aadirle un volumen igual de solucin de acetato de plomo al 4% que contenga cido actico al 0.5 %,

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agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotnicos.

a) Ensayo para flavonoides Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Aadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparicin de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biolgica, ensayar con un estndar de rutina o quercetina en solucin acuo -alcohlica.

b) Ensayo para Leucoantocianidinas Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Aadir 1 ml de cido clorhdrico concentrado. Calentar en bao de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparicin de

coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la muestra.

c) Ensayo para Cardiotnicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Aadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solucin A con 1 ml de solucin B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparicin de coloraciones violetas o prpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotnicos en la muestra.

4) Ensayo para saponinas Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formacin de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra.

5) Ensayo para taninos Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. aadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver

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el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Aadir 2 -3 gotas de solucin de cloruro frrico al 10%. La formacin de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparicin de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra.

6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitacin. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgnico. Aadir 1 ml de anhdrido actico. Por la pared del tubo y con mucha precaucin, dejar resbalar 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado. La formacin de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides.

7) Ensayo para Quinonas Ensayo con una fraccin : Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Aadir 1 ml de perxido de hidrgeno al 20% y 1 ml de cido sulfrico al 50%. Calentar la mezcla en un bao de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Aadir 5 ml de tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase tolunica. Trasvasar 2 ml fase tolunica a un tubo de ensayo. Aadirle 1 ml de una solucin de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloracin rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.

Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca ( 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fraccin acuosa.

8. Reconocimiento de Antocianinas En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Aadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullicin durante unos 5 minutos. Filtrar.

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Ensayo En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Aadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Aadir unas 6 gotas de un cido mineral diluido. Observar el color formado. - Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH.

9. Reconociemiento de Cumarinas. En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elstica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullicin el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparicin de una coloracin fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm.

Plantas con alcaloides: Datura sp. (borrachero), hojas y flores. Catharantus roseus (cortejo), hojas. Hojas de tabaco, t. Plantas con flavonoides: Ptalos de rosas rojas y amarillas. Ptalos de lirio africano. Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sbila). Fruto de Solanum quitoense (lulo). Cscara de Dioscorea ssp. (ame). Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantn). Hojas de guayaba T (Thea sinensis ), hojas. Uvas (Vitis vinifera ). Pltano o guineo (Musa ssp.). Agallas de alepo (Querquis ssp. ). Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ). Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya). Aceite de oliva (Olea europeae ). Plantas con cardiotnicos: Azuceno de la habana, hoj as. Plantas con antocianinas: Repollo morado.

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Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Plantas con quinonas: Ruibarbo (rizomas)

6. Reactivos y materiales necesarios por grupo 150 ml HCl al 5% 1 ml perxido de hidrgeno al 20% 50 ml Acetato de plomo al 4% con cido actico al 0.5% 2 ml Urea 10M gotas de FeCl3 al 10% 2 ml de cido sulfrico al 50% 2 ml de solucin NaOH al 5% con amoniaco al 2% R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio. R. gelatina-sal R. Kedde soluciones A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno 2 ml anhdrido actico Acido sulfrico concentrado Acido clorhdrico concentrado 5 papeles de filtro limaduras de magnesio sulfato de sodio anhidro centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos cuchillo.