CÉLULAS TRONCAIS HUMANAS

Xornadas Ciencias para o mundo contemporáneoCentro de Formación e Recursos (CFR) de OurenseOurense, 13 de novembro. 2008

Daniel SoutulloIES Monte da Vila. O Groved.soutullo@terra.es

Guión

1. Xeneralidades sobre o desenvolvemento embrionario

2. As células troncais: definición, tipos e xeitos de obtención

3. Utilidade e problemas das células troncais

4. Bibliografía seleccionada

1ª parte

Xeneralidades sobre o desenvolvemento

embrionario

Proceso de formacióndun embrión humano

Estadios na formación dun embrión humano

EspermatozoidesFecundación Cigoto 4 células

8 células

MórulaBlastociste 1Blastociste 2Blastociste 3

Ovocito

Blastociste humano

Blastocele Trofoectodermo

Masa celular interna

Detalle do interiordun blastociste

Aparato reprodutorfeminino

Desenvolvemento embrionario humano in vivo

Tempo Fase do desenvolvemento Situación

0 Fecundación: unión do ovocito e o espermatozoide. Formación do cigoto Trompas de Falopio

36 horas Embrión de 2 células totipotentes Trompas de Falopio

60 horas Embrión de 4 células totipotentes Trompas de Falopio

3 días Embrión de 6 - 8 células totipotentes Trompas de Falopio

4 días Mórula: 16 células totipotentes Comeza a implantación no útero

6 - 7 días Blastociste: 100 células. As 20 - 30 células da masa celular interna son pluripotentes Útero

14 días O blastociste rematou a implantación. A masa celular interna ten 2.000 células

Útero coa placenta formada

Esquema dafecundación in vitro

Estado de 32 ou 64 células

Desenvolvemento embrionario humano in vitro

Tempo Fase do desenvolvemento

3 - 4 horas Obtención dos ovocitos e fecundación

20 horas Cigoto con 2 pronúcleos

24 - 25 horas Embrión de 2 células totipotentes

38 horas Embrión de 4 células totipotentes

72 horas Mórula de 8 células totipotentes

68 horas Mórula de 16 células totipotentes

5 días Blastociste de 200 - 300 células. As 30 - 34 células da masa celular interna son pluripotentes

Diferenciación celular

Proceso de transformación de células non especializadas (indiferenciadas) en células especializadas dun tecido concreto (diferenciadas), coas características morfolóxicas e funcionais propias dese tecido

Tipos de células indiferenciadas segundo a súa potencialidade

Tipo Características Exemplo

Totipotentes Capacidade de orixinar un individuo completo

Cigoto e blastómeros do embrión de até 16 células

Pluripotentes Capacidade de orixinar todos os tipos celulares do organismo

Células da masa celular interna do blastociste

Multipotentes Capacidade de orixinar soamente algúns tipos celulares

Células da medula ósea formadoras de sangue (hematopoéticas)

Unipotentes Capacidade de orixinar un só tipo celular Células basais do tracto dixestivo

2ª parte

As células troncais:

Definición, tipos e xeitos de obtención

Células nai ou troncais:definición

1. Son células indiferenciadas (non especializadas) con capacidade de autoperpetuarse

2. Poden diferenciarse dando lugar a células de distintos tecidos corporais

Características dascélulas troncais

2

1

Tipos de células troncais

Categoría Tipo Orixe Características

XerminaisBlastómeros? Embrión (de rato) de

até 8 célulasPluripotentes

(totipotentes en orixe)

Embrionarias (ES)Embryonic Stem Cells

Masa celular interna do blastociste Pluripotentes

Somáticas

Adultas (AS)Adult Stem Cells

Tecidos corporais do feto ou do adulto

MultipotentesPluripotentes?

Inducidas (iPS)induced Pluripotent

Stem Cells

Tecidos corporais do feto ou do adulto Pluripotentes

Obtención e usos das células troncais embrionarias (ES)

Tecido óseo

Tecido nervioso

Células sanguíneas

Músculo cardíaco

Células pancreáticasCélulas troncais embrionarias ES

Blastociste

Orixe dos embrións dos que se extraen as células troncais

embrionarias

1. Embrións sobrantes de tratamentos de fecundación in vitro (autorizada)

2. Embrións formados por fecundación in vitro, orixinados expresamente para obter células troncais (prohibida)

3. Embrións obtidos mediante transferencia nuclear (clonación non reprodutiva) (autorizada)

Clonación mediante transferencia nuclear

Doadora de ovocitos

Femia(ou macho)

Células somáticas

Eliminación dos cromosomas

Transplante de núcleos

Desenvolvemento in vitro e

transplante a xestantes

Proxenie caseidéntica entre si e tamén idéntica aos proxenitores

“Enucleación” do ovocito (I)

“Enucleación” do ovocito (II)

Finalidades da clonación

FINALIDADE USOS

Non reprodutiva

Reprodutiva

Terapéutico

Non terapéutico:* Investigación* Experimentación

Esquema da clonaciónnon reprodutiva (terapéutica)

1. “Enucleación” do ovocito2. Transferencia nuclear de

células do paciente e fusión co ovocito

3. Formación dun embrión e cultivo in vitro até a fase de blastociste

4. Extracción das células da masa celular interna do blastociste: cultivo de células troncais pluripotentes (ES)

5. Diferenciación en distintos tecidos corporais

6. Transplante das células diferenciadas do tecido correspondente ao paciente

1

2

3

6

4

5

Ovocito

Célula somática

Transferencia nuclear

Activación Blastociste (64-200 células)

Blastociste(sección)

Diferenciación en distintos tecidos

Masa celular interna

Trofoectodermo

Transplante

Hepatocitos

Neuronas

Fibras cardíacas

Células sanguíneas

Células intestinais

Células pancreáticas

Clonación terapéuticaen ratos (abril de 2002)

1

2

3

6

4

5

Ovocito

Célula da cola

Transferencia nuclear

Activación Blastociste (64-200 células)

Blastociste(sección)

Corrección do xene mutante

Masa celular interna

Trofoectodermo

Transplante

Células troncais pluripotentes embrionarias

RATO MUTANTE

1. “Enucleación” do ovocito2. Transferencia nuclear de

fibroblastos da cola do rato mutante e fusión co ovocito

3. Formación dun embrión e cultivo in vitro até a fase de blastociste

4. Extracción das células da masa celular interna do blastociste: cultivo de células troncais pluripotentes (ES)

5. Corrección do xene mutante mediante recombinación homóloga

6. Diferenciación en células troncais hematopoéticas

7. Transplante das células diferenciadas á medula ósea do rato

Células hematopoéticas

7

Vantaxes e inconvenientes potenciais da clonación terapéutica

Vantaxes

Evítanse os problemas de compatibilidade entre doador e receptor ao procederen as células troncais de embrións clonados a partir do propio paciente

Inconvenientes

Moi baixa eficiencia do método de transferencia nuclear: necesidade dun gran número de ovocitos para a obtención dos embrións clonadosSe a doenza é xenética precísase a previa modificación xénica das células troncais a transplantar

Características das célulastroncais adultas

1. As células troncais adultas están presentes nos tecidos do organismo e serven para a renovación celular do tecido correspondente

2. Son células multipotentes, con capacidade de diferenciación limitada

3. As células hematopoéticas (formadoras de células sanguíneas) da medula ósea son as células troncais adultas máis coñecidas

Procedencia das célulastroncais adultas

Pel

Medula ósea

Células troncais da pel

Células troncais hematopoéticas da medula ósea

3ª parte

Utilidade e problemas das células troncais

Terapia con células troncais:algúns tratamentos potenciais

Diabete tipo I (insulinodependente)Infarto de miocardioEnfermidade de ParkinsonEnfermidade de AlzheimerLesión medularLeucemia

Cuestións polémicas dainvestigación con células troncais

Dous tipos de problemas

Científicos Éticos

Problemas científicos pendentes de resolución

Dificultade de controlar o proceso de transformación das células troncais en células dos tecidos que interesenPotencialidade canceríxena das células troncais pluripotentesControversia sobre as potencialidades das células troncais embrionarias (pluripotentes) fronte ás extraídas de tecidos adultos do organismo (multipotentes)

Vantaxes e inconvenientes das células troncais embrionarias

Vantaxes

Pluripotentes: Moita plasticidadeDoadas de illarDoadas de cultivarInmortais en cultivo

Inconvenientes

Dificultade de controlar a diferenciaciónCapacidade canceríxenaPoden provocar rexeitamento (cando non proceden dunha clonación)No caso de proceder dunha clonación, necesidade de gran cantidade de ovocitosSe proceden dunha clonación e a doenza é xenética precísase a previa modificación xénica das células troncais a transplantarReparos morais pola destrución dos embrións

Vantaxes e inconvenientes das células troncais adultas

Vantaxes

Multipotentes: capacidade de diferenciación (aínda que limitada)Non provocan rexeitamento ao proceder do propio pacienteNon suscitan problemas morais: non requiren o uso de embrións

Inconvenientes

Non semellan ter capacidade pluripotente (pouca plasticidade)Difíciles de illarDifíciles de cultivarCando proceden doutro tecido tenden a fusionarse coas células dos tecidos receptores (transdiferenciación dubidosa)Se a doenza a curar é xenética precísase a previa modificación xénica das células troncais a transplantar

Os autores da reprogramación celular (células inducidas iPS)

Shinza Yamanaka James Thompson

Reprogramación celular:Células inducidas (iPS)

1. Extráense fibroblastos da pel2. Introdúcense neles catro xenes (responsábeis de

factores de transcrición) empregando un retrovirus como vector de transdución

3. Os xenes usados por Yamanaka foron Oct3/4, Sox2, c-Myc e Klf4, mentres que os usados por Thompson foron Oct4, Sox2, Nanog e Lin28

4. O resultado son células inducidas a reprogramarse con características de células indiferenciadas pluripotentes “embrionarias” (células iPS)

5. Pode dirixirse a súa diferenciación posterior a tipos celulares específicos

Obtención e usos das células troncais inducidas (iPS)

Tecido óseo

Tecido nervioso

Células sanguíneas

Músculo cardíaco

Células pancreáticas

Comparación das células ES coas células iPS

Terapia da anemia falciforme con células iPS

1

2

3

6

4

5

7

Vantaxes e inconvenientes das células inducidas (iPS)

Vantaxes

Son pluripotentesNon se precisan embriónsNon se necesitan ovocitos

Inconvenientes

Os mesmos das células embrionarias obtidas mediante transferencia nuclear, agás a necesidade de ovocitos e a destrución de embriónsO uso de retrovirus como vectores de transdución

Vías de investigación con células inducidas (iPS)

Número exacto de xenes que é necesario transducir, que é probabelmente de dous (Oct4 e Sox2)Eliminación do uso de vectores virais e mesmo da propia transdución de xenesUso alternativo de fármacos activadores de xenes propios das células iPSControl da potencialidade canceríxena das células iPS: eliminación do uso do xene tumoral (protooncoxene) c-MycControl preciso da diferenciación en tecidos específicos

Outros métodos na terapia rexenerativa con células troncais

Mostras conservadas de células do cordón umbilicalCultivos de células troncais embrionarias a partir de blastómeros procedentes de embrións de 8 células, sen destruír os embriónsCultivo de material ovárico diferenciado a partir de células troncais pluripotentes, como fonte de ovocitos para transferencia nuclear

Algunhas conclusións

As células troncais teñen unhas grandes potencialidades futuras para o tratamento de doenzas hoxe en día incurábeisÉ probábel que en pouco tempo as células inducidas (iPS) substitúan aos outros tipos de células troncaisMentres tanto é necesario investigar cos tres tipos de células troncais (embrionarias, adultas e inducidas) para coñecer e avaliar mellor as posibilidades de cada tipoÉ plenamente aceptábel o uso dos embrións para investigar con células troncais embrionarias (pluripotentes), incluídos os experimentos de clonación non reprodutiva, xa que de momento supoñen unha alternativa prometedora para o futuro tratamento dalgunhas doenzas gravesAs disposicións legais nunha sociedade democrática e plural deben ser laicas e respectar a pluralidade ideolóxica e ética existente na sociedade

4ª parte

Bibliografía seleccionada

Bibliografía

MARTÍNEZ, Julio Luis (Ed.) (2003), Células troncales humanas. Aspectos científicos, éticos y jurídicos, Bilbao: Universidad Pontificia de Comillas - Editorial Desclée de Brouwer.

Bibliografía

MAYOR ZARAGOZA, Federico e ALONSO BEDATE, Carlos (coords.) (2003), Gen-Ética, Barcelona: Editorial Ariel, S. A.

Bibliografía

SOUTULLO, Daniel (2006), Las células madre, el genoma y las intervenciones genéticas. Ensayos sobre las implicaciones sociales de la biología, Madrid: Talasa Ediciones, S. L.

FIN

Espermatozoideshumanos

Esquema da meiose1ª división meiótica

2ª división meiótica

Interfase Profase I Metafase I Anafase I Telofase I

Telofase II Anafase II Metafase II Profase II

1 célula diploide

4 células haploides

Esquema da ovoxénese

Ovario

Ovogonia Ovocito primario (profase I)

Diploide (2n) Haploide (n)

1ª División meiótica

2ª División meiótica

Óvulo

Ovocito secundario (metafase II)

1º Corpo polar

2º Corpo polar

Antes da maduración(3º mes de xestación)

Despois da maduración incluída a ovulación

No momento da fecundación

Ovocitohumano

Fecundación

Detalle da fecundación (I)

Aumentos: ovocito: x 260 espermatozoide: x 560

Tamaños relativos a escala real

Detalle da fecundación (II)

Detalle da fecundación (III)

Cigoto humano

Pronúcleos masculino e feminino

Embrión humanode 4 células

Blastómeros

Embrión humanode 8 células

Embrión humanoen fase de mórula

Blastociste humanoen formación

Comezo da formación da cavidade interna (blastocele)

Blastociste humanoen expansión

Blastocele en aumento

Blastociste humano

Masa celular interna

Células troncais embrionarias humanas (pluripotentes)

Cultivo de células troncais

Situación dosembrións sobrantes

Consérvanse conxelados en nitróxeno líquido para novos tratamentosHai acumulados máis de 100.000 nas clínicas de reprodución asistidaA Lei (14/2006, de 26 de maio) sobre técnicas de reprodución humana asistida, permite o seu uso para investigación (art. 15)

Situación legal da clonaciónnon reprodutiva

(Lei 14/2007, de 3 de xullo, de Investigación biomédica)

• Artigo 331. Prohíbese a constitución de preembrións e embrións

humanos exclusivamente con fins de experimentación.

2. Permítese a utilización de calquera técnica de obtención de células troncais humanas con fins terapéuticos ou de investigación, que non comporte a creación dun preembrión ou dun embrión exclusivamente con este fin, nos termos definidos nesta Lei, incluída a activación de ovocitos mediante transferencia nuclear.

Conservación de células troncais do cordón umbilical

Separación dun blastómero