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UNIVERSIDAD DE CORDOBA
EFECTO DE LA GRASA DE LA DIETA SOBRE EL PERFIL PROTEÓMICO Y LA EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO SUBCUTÁNEO DE LA
REGIÓN ABDOMINAL Y EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE PACIENTES CON SÍNDROME METABÓLICO
Patricia Judhit Peña Orihuela
TESIS DOCTORAL 2014
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
EFECTO DE LA GRASA DE LA DIETA SOBRE EL PERFIL PROTEÓMICO Y LA EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO SUBCUTÁNEO DE LA
REGIÓN ABDOMINAL Y EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE PACIENTES CON SÍNDROME METABÓLICO
Patricia Judhit Peña Orihuela
TESIS DOCTORAL 2014
TITULO: Efecto de la grasa de la dieta sobre el perfil proteómico y la expresióngénica en tejido adiposo subcutáneo de la región abdominal y encélulas mononucleares de pacientes con síndrome metabólico
AUTOR: Patricia Judhit Peña Orihuela
© Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2014 Campus de RabanalesCtra. Nacional IV, Km. 396 A14071 Córdoba
www.uco.es/[email protected]
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
Departamento de Medicina
EFECTO DE LA GRASA DE LA DIETA SOBRE EL PERFIL PROTEÓMICO Y
LA EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO SUBCUTÁNEO DE LA
REGIÓN ABDOMINAL Y EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE PACIENTES
CON SÍNDROME METABÓLICO
Trabajo presentado por
Patricia Judhit Peña Orihuela
Licenciada en Nutrición, para optar al grado de
Doctor
Dirigido por
Prof. Dr. José López Miranda
Dr. Antonio Camargo García
Córdoba - España, 2014
Portada:
“OBESITY, BEYOND THE NEWS”
The Beyond the News campaign
2008
FRANCE 24 - French international news channel
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. José López Miranda que ha creído en mí, y ha dirigido mi tesis doctoral de
manera impecable, que junto con el Dr. Francisco Pérez Jiménez, me han aceptado
en su prestigioso grupo de investigación.
Al Dr. Antonio Camargo, que ha co-dirigido mi tesis doctoral empleando su
valioso tiempo para la elaboración de este trabajo.
Al Dr. Oriol Rangel, que me ha ayudado con la mejor de las predisposiciones en la
parte experimental de esta tesis doctoral.
Al Ministerio de Educación, que ha valorado mi formación profesional al
concederme la beca FPU, con la que se me permitió llevar a cabo la tesis.
A mis compañeros del laboratorio experimental, que me tuvieron tanta paciencia
ya que vengo de una carrera con formación clínica, y me enseñaron las técnicas de
laboratorio y aportaron mucho a mi formación en investigación básica. Gracias
Cristina y María José, ustedes marcaron mis primeros pasos en el grupo, a Quico,
Elena, Lore, Charo, Las Cármenes: Marín, Ruiz y Haro, a las de arriba: Puri,
Gracia y Vane, Pilar Gómez y Bego. Un especial agradecimiento a Vanessa
Hernández por haber sido mi ángel de la guarda e igualmente a Paco Conde, a
ambos por ayudarme con los Western Blot.
Especialmente, a mi querido Paraguay, que me dejó partir en busca de nuevos
horizontes.
Y por sobre todo a Dios, por su infinita bondad y amor, por haberme permitido
llegar hasta el día de hoy y haberme dado salud para lograr mis objetivos.
DEDICADA A:
A mi esposo Rafa, mi otra mitad. Quien me brinda una sonrisa cada día y me da
ánimos, apoyo moral y por sobretodo comprensión en los momentos difíciles.
Gracias a ti, puedo superar el mayor de los sacrificios que he hecho jamás: estar
lejos de mis padres y mi tierra.
A mi mami adorada, mi mejor amiga. Quien cree en mí y desde pequeña me
enseñó valores y me dio ejemplos de amor, respeto, honestidad, tolerancia, lealtad,
perseverancia, gratitud y sacrificio.
A mi papá quien me enseñó que si te dedicas 100% a estudiar y a cultivarte, todo
tiene sus frutos y tus méritos te ayudan a salir adelante y a conseguir lo que te
propongas.
A mi hermano Nelson que nos regaló lo mejor de él: mi ahijado Leo.
Especialmente a mi querida abuela Claudia. Tata, sé que estás velando por mí cada
día.
A mi familia política Nati, Rafa, Inma, Guillermo, mama Conchi y tita Anita,
quienes me han acogido con mucho cariño como a una hija, hermana y nieta.
A los amigos de toda Latinoamérica que invadieron la UCO y permanecen hasta
hoy como amigos de esos entrañables e inolvidables: Eliana, Ire, Rodrigo, Oscal,
Maru, Aleyda, Leslie, Vane, Marian, Miguel, Dany, Mara, César, Paloma,
Francieli y Natalia.
“Si no conozco una cosa, la investigaré”
Louis Pasteur.
“El camino del progreso no es ni rápido ni fácil”
Marie Curie.
“Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un esfuerzo
total es una victoria completa”
Mahatma Gandhi.
ÍNDICE
Índice
i
ABREVIATURAS
I. RESUMEN
II. INTRODUCCIÓN 1
1. ESTRÉS OXIDATIVO 3
1.1. Definición 3
1.2. Causas del estrés oxidativo 3
1.3. Sistema de defensa antioxidante 10
2. SÍNDROME METABÓLICO 19
2.1. Definición 19
2.2. Criterios diagnósticos 20
2.3. Epidemiología 23
2.4. Etiología y patogénesis 25
2.5. Síndrome Metabólico y disfunción del tejido adiposo, inflamación de
bajo grado y estrés oxidativo 29
2.6. Síndrome Metabólico y co-morbilidades asociadas 34
3. DIETA Y ESTADO POSTPRANDIAL 42
3.1. Importancia del estado postprandial 42
3.2. Dieta y estrés oxidativo postprandial 43
III. HIPÓTESIS 47
IV. OBJETIVOS 51
V. DISEÑO Y METODOLOGÍA 55
1. POBLACIÓN DE ESTUDIO 57
1.1. Cálculo del tamaño muestral 57
1.2. Criterios de inclusión 58
1.3. Criterios de exclusión 58
2. DISEÑO EXPERIMENTAL DEL ESTUDIO 59
2.1. Estudio de intervención dietética 59
2.2. Estudio del postprandio 63
Índice
ii
3. DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS 65
3.1. Extracciones sanguíneas 65
3.2. Aislamiento del plasma 65
3.3. Análisis lipídico 65
3.4. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) 66
3.5. Obtención de muestras de tejido adiposo 67
3.6. Análisis de la expresión génica mediante qRT-PCR semicuantitativa
en tiempo real mediante la plataforma OpenArray Real-Time PCR
(Applied Biosystems) 69
3.7. Análisis Proteómico Bidimensional (2D-PAGE) 71
3.8. Validación de experimentos por Western Blot 74
3.9. Análisis estadístico 76
VI. RESULTADOS 79
1. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES 81
2. EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO. EFECTO DEL
CONSUMO A LARGO PLAZO DE CUATRO MODELOS DE DIETAS
CON DIFERENTE CANTIDAD Y TIPO DE GRASA 81
2.1. Efecto de la dieta en la expresión génica de las subunidades de la
NADPH-oxidasa en tejido adiposo 82
2.2. Efecto de la dieta en la expresión de genes relacionados con el sistema
de defensa antioxidante en tejido adiposo 84
2.3. Expresión génica postprandial de las subunidades de la NADPH-
oxidasa en tejido adiposo 87
2.4. Expresión postprandial de genes relacionados con el sistema de
defensa antioxidante en tejido adiposo 89
3. EFECTO DEL CONSUMO A LARGO PLAZO DE CUATRO
MODELOS DE DIETAS CON DIFERENTE CANTIDAD Y TIPO DE
GRASA EVALUADO MEDIANTE EL ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE
PERIFÉRICA COMO MODELO CELULAR IN VIVO 93
Índice
iii
3.1. Efecto de la dieta en la expresión génica de las subunidades de la
NADPH-oxidasa en CMSP 94
3.2. Efecto de la dieta en la expresión de genes del sistema de defensa
antioxidante en CMSP 96
3.3. Expresión génica postprandial de las subunidades de la NADPH-
oxidasa en CMSP 99
3.4. Expresión postprandial de genes del sistema de defensa antioxidante
en CMSP 101
3.5. Niveles de la proteína de NFE2L2 en células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) mediante Western Blot 104
4. CORRELACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN CMSP,
TEJIDO ADIPOSO Y LOS PARÁMETROS Y BIOMARCADORES DE
ESTRÉS OXIDATIVO PLASMÁTICOS EN ESTADO POSTPRANDIAL 106
4.1. Análisis de correlación entre la expresión génica en CMSP con los
biomarcadores de estrés oxidativo y los parámetros plasmáticos lipídicos
en estado postprandial 106
4.2. Análisis de correlación entre la expresión génica postprandial en
CMSP y en Tejido adiposo 109
5. EFECTO DEL TIPO DE GRASA EN EL PROTEOMA
POSTPRANDIAL DE CMSP MEDIANTE PROTEÓMICA 2-D 110
5.1. Análisis del efecto de la grasa en la dieta en el proteoma 110
5.2. Validación de los resultados obtenidos por proteómica 2-D, mediante
Western blot 115
5.3. Análisis de las rutas afectadas por el tipo de grasa en la comida
ingerida 117
VII. DISCUSIÓN 121
VIII. CONCLUSIONES 143
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 147
X. ANEXOS 169
Abreviaturas
ABREVIATURAS
ADN: Acido desoxirribonucleico
AHA: Asociación Americana del Corazón
ARE: Elemento de respuesta antioxidante
ATGL: Lipasa triglicérido adiposa
ATP: Adenosín trifosfato
ATPIII: Tercer informe del panel de expertos del programa de Educación
Nacional sobre colesterol
BAT: Tejido adiposo marrón
CAT: Catalasa
DHA: Ácido docosahexaenoico
DMT2: Diabetes mellitus tipo 2
ECV: Enfermedad Cardiovascular
EDTA: Ácido etilamino-tetracético
EPA: Ácido eicosapentaenoico
FDA: US Food and Drug Administration
GPx: Glutatión peroxidasa
GSH: Glutatión reducido
GSR: Glutatión reductasa
GSSG: Glutatión oxidado
HDL: Lipoproteínas de alta densidad
HMUFA: Alta en ácidos grasos monoinsaturados
HOSO: Cápsula de aceite de girasol alto oleico
HSFA: Alta en ácidos grasos saturados
IDF: Federación Internacional de Diabetes
IL: Interleuquina
IMC: Índice de masa corporal
KEAP1: Proteína represora-1 asociada a ECH
Abreviaturas
LDL: Lipoproteínas de baja densidad
LFHCC n-3: Baja en grasa, alta en hidratos de carbono complejos y suplementada
con ácidos grasos poliinsaturados n-3 de cadena larga y de origen marino
LFHCC: Baja en grasa, alta en hidratos de carbono complejos y suplementada
con placebo
LPOs: Lipoperóxidos
LPS: Lipopolisacáridos
Marinol TM C-38: Concentrado natural de aceite de pescado con alto contenido
en ácido docosahexaenoico y ácido eicosapentaenoico
MESYAS: Metabolic Syndrome in Active Subjects
MUFA: Ácidos grasos monoinsaturados
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NFE2L2: Factor 2 asociado al factor nuclear eritroide 2 (Nrf2)
NF-kB: Factor de transcripción nuclear kappa B
NHLBI: Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. Declaración
Científica
NOS: Óxido nítrico sintasa
OMS: Organización Mundial de la Salud
PKA: Proteína quinasa A
PPARγ: Receptor activado proliferador del peroxisoma
PUFA n-3: ácidos grasos poliinsaturados n-3 de cadena larga y de origen marino
RCS: Especies reactivas de cloro
RNS: Especies reactivas de nitrógeno
ROS: Especies reactivas de oxígeno
SAFA: Ácidos grasos saturados
SMet: Síndrome Metabólico
SOD: Superóxido dismutasa
SREBP1: Proteína de unión a elementos de respuesta a esteroles
TG: Triglicéridos
Abreviaturas
TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa
TXN: Tiorredoxina
TXNRD1: Tiorredoxina reductasa 1
v/v: volumen/volumen
VCT: Valor calórico total
WAT: Tejido adiposo blanco
I. RESUMEN
Resumen
Introducción: La etiología del Síndrome Metabólico (SMet) es
probablemente consecuencia de una compleja interacción entre factores genéticos
y ambientales. De entre los factores ambientales destaca la dieta y en particular el
tipo de grasa. En un estudio previo, se observó que el consumo de una dieta rica en
grasas monoinsaturadas reduce el estrés oxidativo postprandial en pacientes con
SMet. Por otra parte, se ha propuesto que el estrés oxidativo es generado en el
tejido adiposo y se considera el factor más importante relacionado con el
desarrollo del SMet, el cual se caracteriza por un estado inflamatorio crónico y
elevados niveles de ROS generadas en el tejido adiposo lo que conduce a un estrés
oxidativo sistémico, dando lugar al desarrollo de resistencia a la insulina, diabetes
y aterosclerosis. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) han sido
ampliamente estudiadas ya que modifican su expresión génica en respuesta a
estímulos como la dieta y factores metabólicos que reflejan lo que ocurre a nivel
sistémico, pero hasta el momento no se ha estudiado el efecto de la dieta sobre el
estrés oxidativo en tejido adiposo humano, por lo que es fundamental estudiar los
cambios que se producen en la expresión génica y en el proteoma, tras el consumo
de cuatro modelos de dieta en ayunas y en estado postprandial.
Hipótesis: Nos planteamos el hecho de que la cantidad y tipo de grasa de
la dieta podrían modular el perfil de expresión de genes implicados en la
formación de especies reactivas de oxígeno y en la defensa antioxidante en tejido
adiposo y en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con
Síndrome Metabólico, y así influir en el grado de estrés oxidativo a nivel
sistémico.
Objetivo principal: Determinar el efecto del consumo a largo plazo de
cuatro modelos de dieta con diferente cantidad y tipo de grasa (HMUFA (20%
MUFA), HSFA (16% SFA), LFHCC (6% PUFA) y LFHCC n-3 (6% PUFA y 1.24
g/d de PUFA n-3 de cadena larga y origen marino) tanto en ayunas como en estado
postprandial en la expresión génica (niveles de ARNm) de las subunidades que
Resumen
conforman el complejo generador del anión superóxido, NADPH-oxidasa en tejido
adiposo subcutáneo de pacientes con SMet.
Objetivos secundarios:
1. Estudiar el efecto del consumo a largo plazo de cuatro modelos de dieta
con diferente cantidad y tipo de grasa en la expresión génica en ayunas y en estado
postprandial de enzimas relacionadas con el sistema de defensa antioxidante:
SOD1 y SOD2, CAT, GSR, GPx1, GPx3 y GPx4, TXN, TXNRD1, el factor de
transcripción NFE2L2 y KEAP1, en tejido adiposo de pacientes con SMet.
2. Estudiar el efecto del consumo a largo plazo de cuatro modelos de dieta en
la expresión génica de las subunidades del complejo generador del anión
superóxido, NADPH-oxidasa y el factor de transcripción PU.1, así como la
expresión de genes relacionados con el sistema de defensa antioxidante: SOD1 y
SOD2, CAT, GSR, GPx1, GPx4, TXN, TXNRD1 y el factor de transcripción
NFE2L2, tanto en ayunas como en estado postprandial en células mononucleares
de sangre periférica con el objetivo de establecer efectos diferenciales en cada tipo
celular.
3. Analizar la relación entre la expresión génica tanto en tejido adiposo como
en células mononucleares de sangre periférica de los genes relacionados con el
estrés oxidativo y los parámetros lipídicos y biomarcadores plasmáticos de estrés
oxidativo.
4. Identificar las proteínas de respuesta rápida al tipo de grasa ingerida en la
dieta, mediante cambios en el proteoma de CMSP aisladas de pacientes con SMet,
en respuesta a la ingesta aguda de cuatro comidas con diferente tipo de grasa.
Población, diseño y metodología: El estudio con diseño aleatorizado se
llevó a cabo con un grupo de 75 pacientes con SMet del estudio LIPGENE, los
cuales fueron asignados para recibir una de las cuatro dietas durante 12 semanas:
(A) dieta HSFA, rica en grasas saturadas con 38% de energía a expensas de grasa
(de las cuales 16% HSFA); (B) dieta HMUFA, rica en grasas monoinsaturadas con
38% de energía a expensas de grasa (de las cuales 20% MUFA); (C) dieta
Resumen
LFHCC, pobre en grasa y rica en hidratos de carbono complejos con 28% de
energía a expensas de grasa (de las cuales 6% PUFA) y (D) dieta LFHCC n-3,
pobre en grasa y rica en hidratos de carbono complejos y suplementada con 1.24
g/d PUFA n-3 de origen marino y 28% de energía a expensas de grasa (de las
cuales 6% PUFA). Al inicio y tras el periodo de intervención dietética, los
pacientes consumieron una comida grasa de similar composición que la dieta a la
que habían sido asignados. Antes y después de la intervención dietética se les
realizaron extracciones sanguíneas en ayunas, a las 2 y las 4 horas de la ingesta de
la comida grasa, además se tomaron muestras de tejido adiposo subcutáneo a un
subgrupo de 39 pacientes en estado de ayunas y a las 4 horas de la comida grasa.
Se determinó la expresión de los genes relacionados con el estrés oxidativo, tales
como el factor de transcripción PU.1 y las subunidades de la NADPH-oxidasa
(gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
y p40phox
), así como los genes implicados en la
defensa antioxidante (NFE2L2, KEAP1, SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx3, GPx4,
GSR, TXN y TXNRD1), el análisis se llevó a cabo por PCR a tiempo real en T.A.
subcutáneo y CMSP de pacientes con SMet. Además, se llevó a cabo el análisis
proteómico comparativo del proteoma de CMSP de pacientes con SMet, mediante
electroforesis en geles 2-D de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de CMSP
en ayunas y a las 4 horas de la ingesta de una comida grasa.
Resultados: En tejido adiposo y en CMSP, se observó un incremento en
la expresión de las subunidades de la NADPH-oxidasa y los genes antioxidantes
en ayunas, independientemente de la cantidad y tipo de grasa de la dieta. En tejido
adiposo, se observó que la ingesta de la comida HSFA aumentó los niveles
postprandiales del ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa gp91phox
y
p67phox
, así como también de los niveles del ARNm de CAT, GPXs y TXNRD1
(todas con valor P<0,05), en comparación con la ingesta de las comidas HMUFA,
LFHCC Y LFHCC n-3. Igualmente, los niveles postprandiales del ARNm de
KEAP1 aumentaron tras la ingesta de la comida HSFA, en comparación con la
ingesta de las comidas HMUFA (P = 0,007) y LFHCC n-3 (P = 0,001).
Resumen
En CMSP, los niveles postprandiales del ARNm de gp91phox
(P<0.001), p22phox
(P=0.005), p47phox
(P=0.001) y p40phox
(P<0.001), además de los genes
antioxidantes SOD1 SOD2, GSR, GPX1, GPX4, TXN, TXNRD1 y NFE2L2 (todas
con valor P<0,05), aumentaron a las 2 horas de la ingesta de la comida HSFA. Sin
embargo, no se observaron cambios en los niveles de ARNm de estos genes con
las demás dietas. En el análisis comparativo del proteoma, la ingesta de la comida
HSFA aumentó la respuesta postprandial de las proteínas relacionadas con el
estrés oxidativo (HSPA1A, PDIA3 y PSME1) y con el daño al ADN (SMC6),
mientras que la ingesta de la comida HMUFA causó la sobreexpresión de las
proteínas HSPA1A y PDIA3. La ingesta de la comida LFHCC n-3 redujo la
cantidad de proteína relacionada con la beta-oxidación peroxisomal ECH1.
Conclusiones: Los resultados obtenidos sugieren que la ingesta de una
dieta rica en grasas saturadas (SFA) produce un aumento del estrés oxidativo, el
cual está generado principalmente en el tejido adiposo, lo que aumenta la respuesta
antioxidante de las CMSP en comparación con una dieta rica en grasa
monoinsaturada (MUFA) y que la sustitución de SFA por MUFA puede ser una
estrategia dietética eficaz para reducir el estrés oxidativo en pacientes con SMet y
sus consecuencias fisiopatológicas.
II. INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1. ESTRÉS OXIDATIVO
1.1. Definición
El estrés oxidativo se define como el desequilibrio entre la producción de
especies reactivas de oxígeno (ROS) , y su eliminación por mecanismos de
defensa conocidos como sistemas antioxidantes [1]. Las consecuencias del estrés
oxidativo incluyen el daño celular, lo que implica daño al ADN, a lípidos,
proteínas, carbohidratos, etc. El daño oxidativo, en particular al ADN, puede
desencadenar la muerte celular por apoptosis o necrosis. Además, el estrés
oxidativo se asocia con mecanismos patológicos de numerosas enfermedades tales
como la aterosclerosis, cáncer, diabetes mellitus, enfermedades inflamatorias, así
como también con el proceso de envejecimiento [1, 2].
1.2. Causas del estrés oxidativo
1.2.1. Especies reactivas de oxígeno
Las especies reactivas se clasifican en “radicales libres” y “no radicales”.
Entre las especies reactivas se encuentran las de oxiígeno (ROS), las especies
reactivas de nitrógeno (RNS), y las especies reactivas de cloro (RCS) [2], (en la
Tabla 1 se presentan algunas de las especies reactivas más conocidas). Las
especies reactivas pueden dañar al ADN, lípidos, proteínas y carbohidratos
ocasionando daño ya sea por oxidación o nitración [2, 3].
Las ROS han sido relacionadas con el desarrollo de numerosas
enfermedades, tales como cáncer, diabetes, enfermedades inflamatorias, entre
otras [1, 2], sin embargo, son necesarias para llevar a cabo ciertas funciones
fisiológicas del organismo como la fagocitosis, la proliferación celular, adaptación
muscular al ejercicio y la regulación de transducción de señales [4-7].
El daño oxidativo no siempre es causado por un aumento en la producción
incrementada de ROS, sino que puede deberse también a algún defecto en el
proceso de eliminación de las especies reactivas por parte del sistema de defensa
antioxidante. Además, el impacto del estrés oxidativo depende del tipo de especie
Introducción
4
reactiva, así como del sitio y la intensidad de su producción, del período de acción
de la especie reactiva, así como de la actividad de los antioxidantes, y de los
sistemas de defensa y reparación celular [1, 2, 6].
Tabla 1. Especies reactivas (adaptación de Halliwell B. et al. [2] )
Radicales libres No radicales
Especies reactivas de oxígeno (ROS)
Superóxido, O2•− Peróxido de hidrógeno, H2O2
Hidroxilo, OH• Oxigeno singulete,
1O2
Hidroperoxilo, HO2• Peróxido orgánico, ROOH
Peroxilo, RO2•
Alcoxilo, RO
•
Carbonato, CO3•−
Dióxido de carbono, CO2
•−
Especies reactivas de cloro (RCS)
Cloro atómico, Cl• Ácido hipocloroso HOCl
c
Cloruro de nitrilo, NO2Cl
e
Especies reactivas de nitrógeno (RNS)
Oxido nítrico, NO• Ácido nitroso, HNO2
Dióxido de nitrógeno, NO2• Anión nitroxilo, NO‾
Peroxinitrito, ONOO
−d
Ácido Peroxinitroso, ONOOH
d
La especie reactiva de oxígeno más reactiva es el radical hidroxilo (OH•),
el cual es capaz de reaccionar con casi todo tipo de moléculas biológicas [2, 3]. Un
ejemplo de esta reactividad es la peroxidación lipídica, iniciada por un radical OH•
en la que se extrae un átomo de hidrógeno de la cadena del ácido graso (LH),
quedando un átomo de carbono con hidrógeno bis-alilico (_H H
_) (reacción 1).
El radical L•
reacciona con el O2 para generar un radical lipoperóxido (LOO•)
(reacción 2), y su vez el LOO• reacciona con otro ácido graso y así genera otro
radical L
• y un radical lipohidroperóxido (LOOH)
(reacción 3), de esta manera la
cadena se propaga generando más especies reactivas.
Introducción
5
(1) LH + OH• L
• + H2O
(2) L• + O2 LOO
•
(3) LOO• + LH L
• + LOOH
Otras especies reactivas no radicales como el ácido peroxinitroso
(ONOOH) y ácido hipocloroso (HOCl), parecen reaccionar preferentemente con
las proteinas [5]. Varios estudios apuntan hacia la implicacion de ROS y RNS en
las modificaciones oxidativas de lípidos y proteínas en las diferentes etapas de la
lesión aterosclerótica [5, 8, 9]. Cualquier factor que ocasione estrés oxidativo
puede promover la oxidación proteica, ya sea por disminución en la eficiencia de
los antioxidantes, aumento en la producción de ROS o aumento en la
susceptibilidad de las proteínas para ser oxidadas [10]. No obstante, las proteínas
mal plegadas o péptidos incompletos por errores en la traducción, son los blancos
más susceptibles para la oxidación [8, 9], de manera tal que sufren modificaciones
y forman grupos carbonilo, los cuales se utilizan para evaluar el grado oxidativo
en los sistemas biológicos [10, 11]. Dependiendo de las ROS a las que se
expongan las proteínas, la oxidación puede ser específica (oxidación catalizada por
un metal que reacciona con H2O2, dando como resulado la formación de radical
hidroxilo) o inespecífica (por radiación produciendo oxígeno singlete), además la
oxidación puede ser reversible (Glutationilación o S-nitrosilación) o irreversible
(carbonilación, formación de enlaces proteína-proteína, ruptura de enlaces
peptídicos y nitración). La generación de grupos carbonilo se realiza por oxidación
directa de aminoácidos (prolina, lisina, arginina y treonina) con ROS [10, 12].
Una de las principales fuentes generadoras de ROS y por lo tanto desencadenante
de estrés oxidativo en muchas células y tejidos es el complejo enzimático
NADPH-oxidasa que se activa respondiendo a diversos estímulos generando anión
superóxido (O2•−
) [5, 13].
Introducción
6
1.2.2. Fuentes generadoras de ROS
i) Respiración mitocondrial
La mitocondria es la encargada del metabolismo aerobio, donde la energía
que proviene de los alimentos se convierte en energía útil en forma de ATP. Como
resultado del flujo de electrones a través de la cadena de transporte mitocondrial,
aproximadamente el 1-2% del oxígeno molecular consumido, puede convertirse en
O2•−
como subproducto de la respiración aeróbica [14].
El anión superóxido del complejo III es liberado tanto en la matriz
mitocondrial, donde la enzima SOD2 cataliza la dismutación de O2•−
a oxígeno
molecular y H2O2 [15], como en el espacio intermembrana donde de manera
similar actúa la SOD1 [14, 16]. El H2O2, a su vez, es eliminado (reducido a H2O)
por la GPxs, CAT o peroxiredoxinas o en su defecto se descompone para generar
el radical hidroxilo (OH•) altamente reactivo, a través de la reacción de Fenton
(H2O2 con metales de transición como el hierro). De esta manera, a través de la
respiración mitocondrial se forman las especies reactivas O2•−
, H2O2 y OH• [3, 17].
La producción de ROS por la mitocondria está relacionada con procesos de
envejecimiento y en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas [15], así
como en el inicio de la lesión aterosclerótica [5].
ii) NADPH-oxidasa
La NADPH-oxidasa es un complejo enzimático localizado en la
membrana plasmática de las células fagocíticas (neutrófilos, eosinófilos,
monocitos y macrófagos), de manera que las ROS generadas por esta enzima son
utilizadas para eliminar bacterias y microorganismos invasores que representan
una amenaza para la célula. No obstante, estudios recientes han demostrado que
esta enzima también se encuentra en células no fagocíticas [18, 19]. Este complejo
enzimático cataliza la producción de anión superóxido (O2•−
), de tal manera que,
reduce el oxígeno molecular, utilizando NADPH como donador de electrones
(reacción 4), y generando anión superóxido (O2•−
), que a su vez por dismutación
Introducción
7
del O2•−
genera productos secundarios que incluyen otras especies reactivas como
por ejemplo, el peróxido de hidrógeno (H2O2) (reacción 5) [5, 20, 21].
(4) 2 O2 + NADPH 2 O2- + NADP
+ + H
+
(5) 2 O2- + 2 H
+ O2 + H2O2
El complejo enzimático NADPH-oxidasa consta de dos subunidades
ancladas a la membrana que son la gp91phox
y p22phox
, formando el heterodímero
falvocitocromo b558, y las subunidades citoplasmáticas, tales como la p67phox
,
p47phox
y p40phox
, además de una proteína G (Figura 1). Este complejo enzimático
se activa mediante la fosforilación de p47phox
, lo que provoca su posterior
migración hacia la membrana [5, 20, 21] y su transcripción está regulada por el
factor de transcripción PU.1, el cual cumple una función promotora de la
subunidad p47phox
[22, 23]. La subunidad p22phox
se encuentra en membrana, junto
con gp91phox
que tiene una cola en el citoplasma. Cuando el complejo enzimático
NADPH-oxidasa se activa, la subunidad p47phox
se fosforila e interacciona con la
subunidad gp91phox
, dando lugar a la producción de O2•−
(reacción 4); proceso
involucrado en la defensa y señalización de la célula (Figura 1).
Figura 1. Activación del complejo enzimático NADPH-oxidasa (Adaptación de Assari T
[24]).
p40phoxp47phox
RacGTP
O2
p2
2ph
ox
Rac1
gp91phox
p40phoxp47phox
SOD2
H2O2
NADPH NADP+ + 2 H+
2O2-
p2
2ph
ox
Rac1 RacGTP
gp91phox
Citoplasma
Membrana celular
Introducción
8
En un principio se pensó que la subunidad p67phox
era una proteína
accesoria, aunque ahora se sabe que es necesaria para el ensamblaje y activación
del complejo enzimático NADPH-oxidasa. A concentraciones suficientemente
altas de p67phox
, la producción de superóxido tiene lugar en ausencia de p47phox
[5,
21].
La NADPH-oxidasa puede ser activada y regulada por agonistas de los
receptores acoplados a proteínas G, tales como angiotensina II y endotelina I,
además de factores de crecimiento como la trombina y el factor de crecimiento
endotelio-vascular (VEGF), TNFα, hiperglucemia, hiperinsulinemia, NEFAs
elevados, lípidos oxidados, entre otros [25]. En células adiposas, el incremento de
ácidos grasos libres activa la NADPH-oxidasa estimulando la producción de ROS,
lo mismo ocurre en modelos de ratones obesos diabéticos y no diabéticos [26]. En
niños con aterosclerosis prematura, la subunidad gp91phox
puede tener un papel
patogénico en los cambios funcionales y anatómicos de la pared arterial [27].
iii) Xantina oxidasa
La xantino oxidasa es una flavoproteína que contiene molibdeno, hierro y
azufre (del inglés iron sulfur molybdenum flavoprotein). Esta enzima existe en dos
formas funcionalmente distintas: la xantina deshidrogenasa NAD+ -dependiente
que produce NADPH y urato; y puede ser transformada en xantina oxidasa,
oxígeno dependiente que genera O2•−
y/o H2O2 y urato [5, 28]. La xantino oxidasa
está presente en altas concentraciones en las células endoteliales de los capilares y
sinusoides, además es una fuente importante de O2•−
, especialmente en las zonas
de las lesiones ateroscleróticas [2]. Tras la oxidación de xantino o hipoxantino a
ácido úrico, se genera H2O2. A pH fisiológico, el ácido úrico pierde un protón
dando lugar a la formación de urato, cuyos niveles elevados provocan la gota [3,
5].
Introducción
9
iv) Óxido nítrico sintasa (NOS)
Esta enzima cataliza la oxidación de L-arginina a L-citrulina y el NO•
(potente vasodilatador) [5]. Existen tres isoformas de NOS: la isoforma neuronal
(nNOS/NOS1), la inducible (iNOS/NOS2) y la endotelial (eNOS/NOS3). En el
sistema cardiovascular, la eNOS es la más relevante ya que está presente en las
células endoteliales donde se expresa de manera constitutiva y sintetiza NO•
durante cortos periodos de tiempo en respuesta a un estímulo [5, 29]. En ciertas
circunstancias, eNOS puede desacoplarse debido a la falta de cofactores como la
tetrahidrobiopterina y producir O2•−
en vez de NO•
[29, 30]. Además, la
biodisponibilidad reducida de NO• como resultado del desacople de NOS, ha sido
relacionado con patologías cardiovasculares como disfunción endotelial,
cardiomiopatía, aterosclerosis, hipertensión y diabetes [30].
v) Lipoxigenasa
Las lipoxigenasas son una familia de dioxigenasas, cuya función es
catalizar la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados mediante dioxigenación
estéreo-específica dando como resultado la formación de eicosanoides [5, 17].
Estos hidroperóxidos de ácidos grasos biológicamente activos, tales como
prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos son metabolitos del ácido
araquidónico y ácidos grasos similares que actúan como traductores de señales
involucrados en la respuesta inflamatoria, permeabilidad vascular, cáncer,
enfermedad cardiovascular y renal, desórdenes degenerativos y SMet [5, 17, 31].
En resumen, las ROS cumplen funciones fisiológicas ya sea como
traductor de señales, defensa ante agentes que pueden dañar a la célula o
simplemente con el fin de eliminar productos de desecho de la célula; sin embargo
elevados niveles de ROS producen daño oxidativo.
Introducción
10
1.3. Sistema de defensa antioxidante
Una molécula antioxidante, tiene la función de proteger a una célula diana
del daño oxidativo. Como se ha descrito en el apartado anterior, el estrés oxidativo
puede dañar y alterar a los lípidos, las proteínas, el ADN, etc. El sistema de
defensa antioxidante está constituido por enzimas con actividad antioxidante que
detoxifican las ROS, y por tanto, reducen el daño oxidativo, y cuyo objetivo
fundamental es mantener el equilibrio oxidante/antioxidante.
1.3.1. Superóxido dismutasa (SOD)
Las superóxido dismutasas son la primera línea de defensa antioxidante
contra las ROS, específicamente contra en anión superóxido (O2•−
). Son una
familia de enzimas que catalizan la dismutación del O2•−
a peróxido de hidrógeno
(H2O2) y oxígeno (O2) [32] (Figura 2). La isoforma SOD1 o CuZn-SOD se
localiza en el citosol y su expresión aumenta en respuesta a estímulos tales como
H2O2, O3, oxido nítrico, ácido araquidónico, metales pesados, rayos UVB y X y
choques térmicos, entre otros [32, 33]. La otra isoforma SOD2 o Mn-SOD se
localiza en la mitocondria, y su expresión es modulada por citoquinas tales como
IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α, IFN-γ y por lipopolisacáridos (LPS) [33]. La producción
de la enzima superóxido dismutasa aumenta tras la activación del complejo
enzimático NADPH-oxidasa en las células inflamatorias y en respuesta a la
producción de xantina oxidasa tras la isquemia [34].
1.3.2. Catalasa (CAT)
Esta enzima se halla en casi todos los organismos vivos expuestos a
oxígeno y cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno
molecular (reacción 7) [5] (Figura 2).
(7) 2 H2O2 2 H2O + O2
La catalasa también elimina los peróxidos orgánicos y utiliza el H2O2 para
oxidar toxinas incluyendo fenoles, ácido fórmico, formaldehido y alcoholes [35].
Esta enzima además protege a la hemoglobina del H2O2 generado en los eritrocitos
Introducción
11
y además de sus funciones antioxidantes, está implicada en procesos de
inflamación, apoptosis, envejecimiento y cáncer [36].
1.3.3. Glutatión peroxidasa (GPx)
Estas peroxidasas son una familia de cuatro isoenzimas que catalizan la
reducción de H2O2 o hidroperóxidos orgánicos a agua o a los correspondientes
alcoholes, utilizando glutatión reducido (GSH) [37, 38] (Figura 2). Existen tres
isoenzimas GPxs dependientes de selenio, entre las que se incluyen: GPx1, GPx2
y GPx3. El fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa 4 (PHGPx4), incorpora
cisteína en su sitio catalítico en vez de selenio. Estas isoenzimas se distribuyen
ampliamente en los compartimientos subcelulares, así como también en los
diferentes tejidos; como es el caso de GPx1 que se localiza en el citosol, el núcleo
y la mitocondria; además se encuentra en los glóbulos rojos, hígado, pulmón y
riñón; la isoenzima GPx2 se localiza en el citosol y núcleo, y está distribuido en el
tracto gastrointestinal; mientras que GPx3 es una proteína secretada que se localiza
también en el citosol, además está presente en plasma, así como en diferentes
tejidos tales como riñón, pulmón, epidídimo, conducto deferente, placenta,
vesícula seminal, corazón y músculo [38, 39]; GPx1 y GPx3 se expresan también
en tejido adiposo [37]; el GPx4 fosfolipídico (PHGPx4), se localiza en el citosol,
el núcleo, la mitocondria, está unido a las membranas y además está presente en el
desarrollo de las glándulas mamarias [38]. GPx4 tiene un papel importante en las
células de cáncer de mama, ya que cumple la importante función de combatir el
estrés oxidativo generado por el metabolismo de ácidos grasos poliinsaturados
[40]. Además, GPx4 puede actuar con sustratos lipofílicos tales como fosfolípidos
peroxidados y colesterol reduciéndolos a compuestos de hidróxido [38, 39].
Introducción
12
1.3.4. Glutatión reductasa (GSR)
La glutatión reductasa es una flavoproteína homodimérica que cataliza la
reacción que transforma el glutation oxidado (GSSG) a su forma reducida (GSH),
a expensas de la donación de equivalentes reductores por parte de la nicotinamida-
adenina-dinucleótido-fosfato (NADPH) (reacción 8), y de esta manera se
mantienen elevados los niveles de GSH para proteger a las células del daño
oxidativo y procesos de envejecimiento [41, 42] (Figura 2).
(8) GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP
+
1.3.5. Sistema Tiorredoxina
Es un sistema oxidorreductasa ubicuo con función antioxidante y de
regulación redox. Este sistema, se compone de las proteínas tiorredoxina (TXN) y
tiorredoxina reductasa (TXNRD1), además de la enzima NADPH. La TXN es una
proteína que se encuentra en el citoplasma y es responsable de mantener las
proteínas en su estado reducido [43]. Para la actividad redox de TXN, son claves
los residuos de cisteína en la posición 32 y 35 (Cis32 y Cis35), separados por dos
aminoácidos (Gli-Pro). A través de TXNRD1, una oxidorreductasa dependiente de
NADPH se transfieren los electrones al sitio activo de la TXN oxidada (disulfuro -
S2) y ésta se reduce (ditiol [-(SH)2]). Luego se transfieren los equivalentes
reductores a los grupos disulfuro de las proteínas diana y la TXN se oxida de
nuevo [44, 45] (Figura 2). Como parte de la función de defensa antioxidante, el
incremento en la expresión de TXN es indicativo de la reducción de proteínas
intracelulares y otras biomoléculas. Las proteínas diana sobre las que actúa
tiorredoxina son los factores de transcripción p53 y NF-kB, además la
ribonucleótido reductasa y la proteína disulfuro isomerasa. El H2O2 y los
lipoperóxidos pueden ser reducidos directamente por TXNRD1 como vía
enzimática alternativa a GPx4 [44].
Introducción
13
1.3.6. Mecanismos moleculares de la vía Keap1/NFE2L2. Keap1 como
regulador del factor de transcripción NFE2L2.
Keap1 es un regulador negativo de NFE2L2, siendo considerado al
complejo Keap1/NFE2L2 como el sensor central de estrés oxidativo en la célula,
el cual media las señales de estrés oxidativo e induce la expresión de las proteínas
antioxidantes y enzimas de fase II [46]. En condiciones normales (ausencia de
estrés), NFE2L2 es retenido y regulado por Keap1 en el citoplasma, donde
NFE2L2 es ubiquitinado por el complejo Cul3-Keap1 ubiquitin ligasa, por lo que
NFE2L2 es degradado rápidamente por el proteosoma [46-48], ver Figura 2. La
alteración del estado redox, la presencia de estrés oxidativo o electrofílico, e
incluso la presencia de antioxidantes inician el proceso por el que Keap1 libera a
NFE2L2, el cual migra al núcleo [46, 48]. Una vez en el núcleo, NFE2L2 se une al
elemento de respuesta antioxidante (ARE, por sus siglas en inglés) y activa la
transcripción de genes que controlan la expresión de proteínas antioxidantes
encargadas de la detoxificación y eliminación de ROS y electrolitos [47, 48]. Los
genes con función antioxidante, cuya expresión es inducida por la vía
transcripcional NFE2L2-ARE incluyen a las enzimas superóxido dismutasa
(SOD1 y SOD2), catalasa [27], glutatión peroxidasa (GPx1, GPx3 y GPx1),
tioredoxina (TXN) y tioredoxina reductase 1 (TXNRD1) [49]. Por lo tanto, la
activación de NFE2L2 es esencial para una adecuada respuesta al estrés oxidativo.
El estrés oxidativo produce daño al ADN y neoplasia debido al incremento
en la producción de oxígeno reactivo y especies tiol que interactúan con moléculas
intracelulares [50]. Para contrarrestar la agresión oxidativa, las células también
inducen la expresión de enzimas de fase I y fase II, las cuales reducen los
electrolitos reactivos y detoxifican de agentes carcinógenos. La regulación de estas
enzimas es mediada por el elemento de respuesta antioxidante (ARE), el cual
requiere el factor de transcripción NFE2L2 para responder al estrés oxidativo [47,
51]. Las enzimas de fase I están encargadas del metabolismo de fármacos. El
fármaco es activado o inactivado por uno de los tres tipos de modificaciones
Introducción
14
químicas irreversibles, tales como la oxidación (xantina oxidasa, citocromo P-450,
flavina momooxigenasa, alcohol deshidrogenasa y aldehído deshidrogenasa),
reducción (citocromo P-450), o hidrólisis (esterasa y amidasa) [52]. Las enzimas
de fase II son la glutatión S-transferasa (GSTP1) que conjuga electrófilos
hidrofóbicos con ROS y RNS con GSH; la flavoproteína NADPH: quinona
oxidoreductasa 1 (NQO1) que reduce quinonas con dos electrones promoviendo su
detoxificación; y hemo oxygenasa 1 que participa en el catabolismo de los grupo
hemo [46].
En condiciones normales, la vía transcripcional NFE2L2-ARE son
responsables de la expresión constitutiva de genes en estado basal para mantener
la homeostasis redox celular debido a la constante generación de ROS por el
metabolismo aeróbico [48].
Figura 2. Representación esquemática del sistema de defensa antioxidante de la célula ante un estímulo.
ANTIOXIDANTES
NADPH-oxidasa activada
NADP+ NADPH
GPx
2GSH GSSG + 2H2O
GSR
SOD2
CAT
2H2O + O2
Citosol
SOD CAT GPx TXN TXNRD1
ARE
Núcleo
NFE2L2
Keap1
Keap1
2O22O2
-
p2
2p
ho
x
Rac 1A Rac2GTP
gp91phox
p40phoxp67phox
p47phox
NFE2L2
ROS/RNS
electrófilos
Enzimas de fase II
ROS
TXN ox. TXN red.TrxR
NADP+ NADPH
NADPH NADP+
Protein-S2Protein-SH2
H2O2 + O2
Introducción
16
1.3.7. Antioxidantes ingeridos en la dieta
Los antioxidantes exógenos, es decir, los aportados por los nutrientes de la
dieta, ayudan a reducir los efectos adversos de las especies reactivas en el
organismo. Son clásicamente conocidas las propiedades antioxidantes de las
vitaminas E y C, así como también algunos fitoquímicos como los carotenoides,
polifenoles y flavonoides, además de los minerales selenio y cinc. En este
apartado, nos centraremos en los antioxidantes comúnmente aportados por la dieta
mediterránea.
La vitamina E, es un antioxidante liposoluble muy importante en el
sistema de defensa antioxidante de la célula, el cual se obtiene de la dieta. Las
fuentes de vitamina E son los aceites vegetales, cereales, legumbres, frutos secos y
productos de origen animal (pescado, carne, leche y huevo), y además es frecuente
encontrarla en alimentos procesados utilizados generalmente para proteger de la
oxidación a las grasas insaturadas del alimento. La vitamina E estabiliza la
membrana y previene su oxidación, inhibe la peroxidación de lípidos y la
oxidación de colesterol-LDL [34]. Su ingesta está implicada en la prevención de
enfermedad cardiovascular [34], así como en la preeclampsia, sin embargo se
recomienda su consumo controlado durante el embarazo [53].
Otra de las vitaminas con función antioxidante es la vitamina C o ácido
ascórbico, la cual es hidrosoluble y actúa como agente reductor (donador de
electrones). El ácido ascórbico protege al colesterol-LDL de la oxidación ex vivo y
se cree que podría funcionar de manera similar en nuestro organismo. La vitamina
C promueve la absorción de hierro soluble no-hemo posiblemente por quelación o
manteniendo simplemente el hierro en su forma reducida (Fe2+
). Las frutas y
vegetales son fuente excelente de ácido ascórbico, particularmente las frutas
cítricas y los zumos de ellas, además de otras frutas tales como melón, cerezas,
kiwi, mango, papaya, fresa, tangelo, sandía y tomate. De entre los vegetales como
fuente de vitamina C, podemos citar la col, brócoli, coles de Bruselas, brotes de
Introducción
17
soja, coliflor, col rizada, pimientos rojos y verdes, guisantes, tomates y patatas
[34].
Los carotenoides son un grupo de antioxidantes liposolubles que también
protegen a los lípidos de la peroxidación. Estos carotenoides son el licopeno, α-
caroteno, β-caroteno, luteína, etc. Y los podemos encontrar en frutas y vegetales
de color rojo y naranja, tales como las zanahorias, albaricoques, ciruelas y
vegetales de hojas verdes como la espinaca y la col rizada [34, 54].
Los compuestos fenólicos donan el hidrógeno del grupo hidroxilo (-OH) a
las especies reactivas, las cuales se convierten en no reactivas. Donando el
hidrógeno, el compuesto fenólico se convierte en un radical libre no reactivo
debido al electrón desapareado del átomo de oxígeno trasladado de la estructura de
anillo aromático, aumentando así su estabilidad [34, 55]. Los compuestos
fenólicos del vino incluyen los ácidos fenólicos, quercetina, catequinas y
resveratrol [55], con propiedades antioxidantes. [56]. Por otro lado, los principales
compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva son hidroxitirosol, tirosol y la
oleuropeina. Es importante destacar que el aceite de oliva representa la principal
fuente de grasa de la Dieta Mediterránea y aporta importantes beneficios para la
salud [57, 58].
Los minerales selenio y cinc están implicados en la protección del
organismo contra el estrés oxidativo. El selenio forma parte de enzimas
antioxidantes como la TXNRD1 y GPxs. El selenio se distribuye ampliamente en
los grupos de alimentos como los pescados de mar y de agua dulce, carne, huevos,
cereales, productos lácteos, frutas y vegetales. El cinc forma parte de enzimas que
participan en el metabolismo de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos
nucleicos, además se encuentra combinado con cobre o magnesio en la isoforma
SOD citoplasmática o mitocondrial, respectivamente encargada de la dismutación
de O2-. La carne magra, cereales de grano entero y las leguminosas proveen altas
concentraciones de cinc [34].
Introducción
18
Se han demostrado que la escasa incidencia de arterosclerosis, enfermedad
cardiovascular y ciertos tipos de cáncer son posiblemente debido al valor
antioxidante de la dieta mediterránea, la cual es rica en vegetales, cereales, frutas,
pescado, leche, vino y sobretodo aceite de oliva, que es la principal fuente de grasa
de la dieta mediterránea.
La Dieta Mediterránea, por lo tanto reúne todas las características de una
“dieta antioxidante”.
Introducción
19
2. SÍNDROME METABÓLICO
2.1. Definición
Según la definición de la ATP III (National Cholesterol Education
Program´s Adult Treatment Panel III) el Síndrome Metabólico (SMet) es un
conjunto de desórdenes metabólicos y vasculares que incrementan la posibilidad
de sufrir enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2 [59-61].
Los componentes del SMet identificados por la ATP III incluyen:
Obesidad abdominal
La grasa abdominal es un tejido heterogéneo que se compone de varios
compartimientos que incluyen la grasa subcutánea, intraperitoneal (visceral) y
retroperitoneal. La circunferencia de cintura utilizada como marcador de grasa
abdominal, se correlaciona con la grasa abdominal total determinada por
tomografía computarizada [62]. La obesidad abdominal se define por el aumento
del perímetro de cintura. En hombres, se considera obesidad abdominal cuando el
perímetro de la cintura supera los 102 cm y en mujeres cuando supera los 88 cm.
Las consecuencias fisiopatológicas de la obesidad abdominal radican en el hecho
de que la expansión del tejido adiposo y la disfunción del adipocito provocan
alteraciones en la secreción de adipoquinas y citoquinas, las cuales contribuyen al
desarrollo de resistencia a la insulina y SMet [63-66].
Dislipidemia aterogénica
Se manifiesta por los elevados niveles plasmáticos de triglicéridos (≥150
mg/dL) y bajas concentraciones de colesterol-HDL (<40 mg/dL en hombres y <50
mg/dL en mujeres). Los triglicéridos elevados y las concentraciones bajas de HDL
están relacionados de forma independiente con un mayor riesgo de enfermedad
cardiovascular. Además, se considera que los factores genéticos y ambientales son
los responsables de las bajas concentraciones de colesterol-HDL y de los
triglicéridos aumentados [59-61, 67, 68].
Introducción
20
Hipertensión arterial
La hipertensión arterial es la fuerza que la sangre ejerce contra las paredes
de las arterias, la cual es lo suficientemente alta, como para llegar a causar
problemas de salud, tales como enfermedades cardiovasculares. Según criterios de
la ATPIII para el diagnóstico del SMet, una presión arterial mayor a 130/85 mm
de Hg es considerada hipertensión [59]. La razón por la que la hipertensión arterial
está incluida entre los criterios diagnósticos del SMet, es debido a que la reducción
de la presión sanguínea por debajo de 130/85 reduce la probabilidad de un evento
cardiovascular en pacientes diabéticos o con otros factores de riesgo
cardiovascular [59-61, 67, 68].
Niveles de glucosa elevados en sangre
La glucosa medida en ayunas con un valor ≥110 mg/dL por lo general es
un indicador de resistencia a la insulina, y a menudo está acompañada por otros
componentes del SMet. Además, un porcentaje de las personas con glucemia basal
alterada desarrollará la diabetes tipo 2 con el tiempo [59-61, 67-69].
Aunque, el panel ATP III no considera adecuada la determinación
rutinaria de la resistencia a la insulina y el estado pro-inflamatorio o protrombótico
para el diagnóstico del SMet, éstos generalmente son aceptados como
características presentes en este síndrome. Por otra parte, ensayos clínicos
demuestran que la modificación de tres de los componentes característicos del
SMet, tales como dislipidemia aterogénica, hipertensión y estado protrombótico,
reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular [59].
2.2. Criterios diagnósticos
Los criterios diagnósticos han cambiado durante la última década. En
1998, la Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoció la resistencia a la
insulina como la principal causa de SMet [70]. Más tarde, se observó el papel
crítico de la obesidad abdominal, la cual es considerada como uno de los más
importantes entre los criterios diagnósticos establecidos desde el año 2001 por la
Introducción
21
ATP III, los cuales están representados en la Tabla 2 [59, 69]. Cabe destacar, que
en la mayoría de los estudios epidemiológicos se utilizan los criterios de la ATP
III. Por otra parte, la Federación Internacional de Diabetes (IDF) y la declaración
científica de la Asociación Americana del Corazón/Instituto Nacional del Corazón,
los Pulmones y la Sangre (AHA/NHLBI), no llegaban a un acuerdo respecto a la
circunferencia de cintura.
En 2009 fue publicada en una declaración provisional conjunta en el que
participaron diferentes organismos tales como la “Federación Internacional de
Diabetes. Grupo de Trabajo sobre Epidemiología y Prevención”, el “Instituto
Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre”, la “Asociación Americana del
Corazón”, la “Federación Mundial del Corazón”, la “Sociedad Internacional de
Arterosclerosis” y la “Asociación Internacional para el Estudio de la Obesidad”,
donde básicamente el documento armoniza los criterios diagnósticos del SMet de
la IDF y se reflejan en la Tabla 2. En el documento de la IDF se establecen varios
puntos de corte para la circunferencia de cintura según la población de estudio
(Tabla 3) [60].
La presencia de tres de los cinco componentes del SMet, definidos por la
ATPIII constituye un diagnóstico de Síndrome Metabólico [60, 69].
La inactividad física, la obesidad y las dietas hipercalóricas ricas en ácidos grasos
saturados y colesterol, así como el tabaquismo le preceden a los factores de riesgo
citados anteriormente [61, 68].
Introducción
22
Tabla 2. Criterios diagnósticos para el Síndrome Metabólico. La presencia de 3 de los 5
criterios diagnósticos de la ATPIII o IDF constituye un diagnóstico de Síndrome
Metabólico.
Medición
Clínica
WHO (1998) ATPIII (2001) IDF (2005)
Resistencia a la
Insulina
IG/IGA/DMT2/
sensibilidad a la
glucosa disminuida
- -
Circunferencia
de cintura
IMC>30 kg/m2
ICC: hombres >0,90
y mujeres >0,85
CC: hombre ≥102
cm y mujeres ≥88
cm
Específica según la
población (Tabla 3)
Lipemia TG≥150 mg/dL y/o
c-HDL <35 mg/dL
en hombres y <39
mg/dL en mujeres
TG≥150 mg/dL
c-HDL <40
mg/dL en hombres
y <50 mg/dL en
mujeres
TG≥150 mg/dL
c-HDL <40 mg/dL
en hombres y <50
mg/dL en mujeres (incluye medicación)
Presión arterial ≥140/90 mm Hg ≥130/85 mm Hg ≥130/85 mm Hg (incluye medicación
antihipertensiva)
Glucosa IG/IGA, o DMT2 ≥110 mg/d L (incluye diabetes)
≥100 mg/d L (incluye tto.
hipoglucemiante)
Otros Microalbuminuria
DMT2: Diabetes Mellitus Tipo 2.
IG: Intolerancia a la glucosa.
IGA: Glucosa alterada en ayunas.
IMC: Índice de masa corporal.
ICC, Índice cintura/cadera.
CC: Circunferencia de Cintura.
TG: Triglicéridos.
c-HDL: Lipoproteína de alta densidad.
Introducción
23
Tabla 3. Puntos de corte para la circunferencia de cintura según el tipo de población [60].
Circunferencia de cintura. Umbral para la obesidad
abdominal
Población Hombres Mujeres
Origen Europeo ≥94 cm ≥80 cm
Caucásico ≥94 cm (riesgo alto)
≥102 cm (riesgo muy alto)
≥80 cm (riesgo aumentado)
≥88 cm (riesgo muy alto)
Estados Unidos ≥102 cm ≥88 cm
Canadá ≥102 cm ≥88 cm
Europa ≥102 cm ≥88 cm
Asia (incluyendo Japón) ≥90 cm ≥80 cm
Asiáticos ≥90 cm ≥80 cm
Japoneses ≥85 cm ≥90 cm
China ≥85 cm ≥90 cm
Oriente Medio,
Mediterráneo ≥94 cm ≥80 cm
Africanos Sub-Saharianos ≥94 cm ≥80 cm
Centro y Sur de América ≥90 cm ≥80 cm
2.3. Epidemiología
El SMet es un problema de salud pública relacionado estrechamente con el
estilo de vida occidental [67].
Los principales factores de riesgo de mortalidad en el mundo son los
componentes del SMet, entre los que se incluyen la hipertensión, responsable del
13% de muertes en el mundo, la hiperglucemia responsable del 6%, la inactividad
física 6%, y el sobrepeso y la obesidad responsables del 5% de las muertes en el
mundo [71]. Cabe destacar, que a nivel mundial, el sobrepeso y la obesidad causan
más muertes que la desnutrición [71], lo que puede deberse a los cambios que ha
sufrido el estilo de vida respecto a la dieta y a la inactividad física. La OMS estima
que en 2005 había más de 1 millón de personas con sobrepeso (IMC≥25) y más de
300 millones de obesos (IMC≥30). Según fuentes de la OMS, se espera que para el
2015 tengamos en el mundo 1,5 millones de personas con sobrepeso [71].
Introducción
24
Entre los criterios diagnósticos para el desarrollo del SMet, publicado en
el documento World Health Statistic 2012 de la OMS, se destaca la alta
prevalencia de hipertensión en hombres y mujeres africanos (38,1% y 35,5%,
respectivamente), mientras que entre los americanos la prevalencia en hombres es
de 26,3% y en mujeres es 19,7% y en los europeos 33,1% y 25,6%,
respectivamente. El documento de la OMS también señala una alta prevalencia de
hiperglucemia en hombres americanos (11,5%) a diferencia de los hombres
africanos (8,3%), europeos (9,6%) y asiáticos (9,9%) [72].
La prevalencia de SMet aumenta con la edad en la población mundial [67].
En Europa, la prevalencia de SMet en hombres de 20-39 años es del 10,7%, 33%
entre los 40-59 años y 39,7% en mayores de 60 años, mientras que en mujeres es
de 18%, 30,6% y 46,1%, respectivamente [73]. En un estudio comparativo de
pacientes con o sin cardiopatía isquémica, el 41,1% de los pacientes que habían
sufrido un infarto de miocardio, se les había diagnosticado SMet antes del evento
cardiovascular [74].
Datos aportados por la Encuesta Nutricional de Canarias, que incluyó 578
adultos con edades entre 18 y 74 años, demostró que la prevalencia de SMet en
hombres y mujeres es del 24,4% [75].
El Registro Nacional de SMet (Registro MESYAS: Metabolic Syndrome
in Active Subjects) analizó una amplia muestra española [76], en la cual se
incluyeron personas laboralmente activas. En los primeros resultados se observó
que, entre los 7.256 trabajadores incluidos en el estudio en aquel momento, la
prevalencia de SMet era del 10,2%, superior en varones (8,7%) que en mujeres
(3,0%). Además, se concluyó que todos los componentes del SMet son
significativamente más prevalentes en los varones, excepto el criterio de valores
bajos de lipoproteínas de alta densidad (HDL), que es prevalente en las mujeres.
La prevalencia del SMet aumenta de forma paralela a la edad; por debajo de los 60
años es más prevalente en los varones, diferencia que no se observa por encima de
esta edad [76].
Introducción
25
En cuanto a los países en vías de desarrollo, la prevalencia del SMet en
China es del 13,3%, en Irán del 30% y en México del 22% [77]. La prevalencia de
SMet en países de América Latina es del 24,9%, más frecuente en mujeres
(25,3%) que en hombres (23,2%). El grupo de edad más afectado es el de los
mayores de 50 años y los componentes del SMet más frecuentes fueron los niveles
bajos de colesterol-HDL (62,9%) y la obesidad abdominal (45,8%) [78].
En la era de la globalización, los cambios que se han producido en cuanto
al tipo de trabajo, transporte, ocio, alimentación y desarrollo económico han
promovido el sedentarismo y por consiguiente el sobrepeso y la obesidad. Es
importante, y urgente, establecer estrategias sanitarias que prevengan la emergente
epidemia mundial de SMet. Además se deben reducir los riesgos de enfermedad
cardiovascular y diabetes con cambios en el estilo de vida, como aumento de la
actividad física o pérdida de peso, a fin de reducir los índices de fallecimiento y
discapacidad en países en vías de desarrollo como consecuencia del SMet [72, 77].
2.4. Etiología y patogénesis
La etiología del SMet es en gran medida desconocida, aunque
probablemente sea la consecuencia de una compleja interacción entre factores
genéticos y ambientales, de entre los cuales, destaca la dieta y sobretodo el tipo de
grasa [69, 79]. Algunas personas están genéticamente predispuestas a desarrollar
desórdenes metabólicos, y en éstas personas, los factores adquiridos por el
ambiente (inactividad física y exceso de grasa corporal) favorecen por
consiguiente, el desarrollo de resistencia a la insulina y síndrome metabólico [59].
La obesidad juega un papel central y causal en el síndrome metabólico
[80-82]. La interacción entre los genes y el ambiente nos hace pensar que el
desarrollo del Síndrome Metabólico es el resultado de un desequilibrio entre la
información genética de supervivencia de nuestros antepasados y la influencia del
estilo de vida actual caracterizada por la escasa actividad física y una alimentación
hipercalórica. Esta interacción genes-ambiente pueden ser aclaradas por dos
Introducción
26
hipótesis: la del “genotipo ahorrador” y la del “fenotipo ahorrador” que se
explican a continuación.
La “hipótesis del genotipo ahorrador” explica el mecanismo como una
rápida y masiva liberación de insulina después de una comida abundante, que
minimizaba la hiperglucemia y la glucosuria, permitiendo de ese modo un mayor
depósito de energía. De esa manera, aquellos individuos capaces de almacenar más
energía estaban mejor preparados para sobrevivir en los períodos de escasez. Por
lo tanto, los individuos portadores de estos genes "ahorradores" tenían ventajas
selectivas en cuanto a adaptación, y además los transmitían a su descendencia.
Actualmente, y dado que los genes no cambian con rapidez, estos genes
“ahorradores” representan una desventaja y, de él derivan las enfermedades
metabólicas crónicas como la diabetes tipo 2, la obesidad abdominal, las
enfermedades cardiovasculares, etc. Todo esto, como consecuencia de la
disponibilidad continua y excesiva de todo tipo de alimentos en la actualidad [67,
83].
Por su parte, la “hipótesis del fenotipo ahorrador” o teoría de Barker
propone que si un feto crece en condiciones de malnutrición, resulta en el
desarrollo de adaptaciones que producen cambios estructurales, fisiológicos y
metabólicos para maximizar las oportunidades de supervivencia postnatal en
condiciones de escasez de alimentos. Si este individuo recibe una alimentación
normal o excesiva en el periodo postnatal, esas adaptaciones van en detrimento de
la salud del individuo a lo largo de su vida predisponiéndolo a cambios en el
metabolismo de la glucosa/insulina desarrollando posteriormente diabetes tipo 2 y
Síndrome Metabólico en la edad adulta [67, 84].
Los modelos dietéticos actuales en todo el mundo están dejando de lado la
cultura culinaria autóctona y adoptan patrones occidentales con un aumento en el
consumo de carnes, productos lácteos enteros y pastelería industrial, que son
alimentos ricos en grasas saturadas y azúcares simples. La mayoría de las
recomendaciones dietéticas para la prevención y el tratamiento de enfermedades
Introducción
27
cardiovasculares, obesidad, y/o diabetes residen en la reducción de la ingesta de
ácidos grasos saturados con el objetivo de disminuir los niveles de colesterol-LDL
y triglicéridos. En ambas hipótesis, la dieta, como factor ambiental, desempeña un
importante papel en la etiología del SMet.
Varios son los componentes de la dieta que se han relacionado con el
riesgo de desarrollar SMet, en particular la cantidad y el tipo de grasa de la dieta
[85].
De entre los factores que contribuyen al desarrollo del SMet, los hábitos
dietéticos juegan un papel primordial. En 2006 la Asociación Americana del
Corazón (AHA) publica las “Recomendaciones sobre dieta y estilo de vida” como
un guía para reducir el riesgo de SMet, donde recomiendan limitar el consumo de
grasa saturada por debajo del 7% del valor calórico total (VCT), las grasas trans
<1% VCT y el colesterol <300mg/día optando siempre por carne magra, productos
lácteos semidesnatados o desnatados, minimizando el consumo de bebidas o
alimentos con azúcares añadidos, limitando el consumo de sal, consumo moderado
de alcohol, y aconsejando una dieta rica en frutas y vegetales, alimentos ricos en
fibra y granos enteros, y consumo de pescado graso al menos dos veces por
semana [86]. Básicamente, estas recomendaciones son características de una dieta
baja en grasa y alta en hidratos de carbono complejos; recomendaciones que
difieren ligeramente del estilo de dieta Mediterránea con respecto la cantidad de
grasa recomendada, pero concuerda con la calidad de las demás características.
El principal aporte de grasa en la dieta Mediterránea proviene del aceite de
oliva, que es una fuente de ácidos grasos monoinsaturados y compuestos fenólicos
por excelencia [87, 88]. El consumo de aceite de oliva mejora los parámetros
característicos del SMet, como la reducción en las concentraciones de triglicéridos
y aumento en las concentraciones de colesterol-HDL, atribuyendo al aceite de
oliva, efectos cardioprotectores [87-90].
Los efectos provocados tras el consumo de ácidos grasos monoinsaturados
y saturados sobre la lipemia postprandial difieren bastante [90, 91]. El consumo de
Introducción
28
ácidos grasos saturados supone un factor de riesgo para el desarrollo de SMet [92,
93]. Además, la adherencia a la dieta Mediterránea parece estar disminuyendo en
personas con sobrepeso y obesidad, fenómeno que se asocia con un aumento en la
prevalencia del SMet [89]. Por otra parte, las evidencias demuestran que el
consumo de dietas ricas en grasa monoinsaturada y ricas en hidratos de carbono,
mejoran la sensibilidad a la insulina, mientras que el consumo de ácidos grasos
saturados induce un deterioro de la misma [94, 95].
La disminución de la sensibilidad a la insulina, es también un factor clave
en el desarrollo del SMet [85]. La resistencia a la insulina y la disminución en la
secreción de insulina son trastornos metabólicos que generan hiperglucemia y
aumento de las concentraciones plasmáticas de ácidos grasos no esterificados que
pueden causar lesión en las células β y los tejidos periféricos deteriorando su
función. A su vez, la resistencia a la insulina se relaciona con el estado
inflamatorio de bajo grado y un aumento del estrés oxidativo, ambos
característicos del SMet [67].
La reducción en la ingesta de ácidos grasos saturados debe evaluarse en el
contexto de la sustitución por otro macronutriente. Por lo tanto, la sustitución de
las grasas saturadas por grasas monoinsaturadas en la dieta puede ser una
estrategia eficaz para reducir el estrés oxidativo en pacientes con obesidad y
síndrome metabólico, así como prevenir la aparición de los factores de riesgo tales
como niveles alterados de triglicéridos, LDL-colesterol, glucosa, HDL-colesterol,
además obesidad abdominal, procesos inflamatorios y pro-trombóticos.
Se ha considerado reemplazar la grasa saturada por una dieta rica en
hidratos de carbono, pero esto depende del tipo de carbohidratos y su índice
glucémico. En particular, los carbohidratos refinados aumentan de manera
exagerada la dislipidemia aterogénica en asociación con resistencia a la insulina y
obesidad, así como también incrementan los triglicéridos y partículas LDL
pequeñas, además reducen el colesterol-HDL, por lo tanto se enfatiza limitar el
consumo de hidratos de carbono refinados [93]. Por otra parte, una dieta rica en
Introducción
29
hidratos de carbono complejos administrados en forma de arroz con contenido de
almidón resistente, se asocia con una mejoría en la función endotelial, reducción
de glucosa y estrés oxidativo postprandial en pacientes con alteración de la
glucosa en ayunas, intolerancia a la glucosa o diabetes tipo 2 recién diagnosticada
[96].
Por lo tanto, modificar los patrones dietéticos en pro de nuestros genes
sería una estrategia eficaz en la prevención y tratamiento del síndrome metabólico,
siguiendo lineamentos tales como, limitar la ingesta de grasas saturadas, aumentar
la ingesta de alimentos con alto contenido en fibra y bajo índice glucémico.
Además, de permitir cantidades moderadas de grasas monoinsaturadas a expensas
de aceite de oliva, ya que sus efectos cardioprotectores son más que conocidos,
esto siempre y cuando no se exceda su consumo pues puede promoverse el
sobrepeso.
2.5. Síndrome Metabólico y disfunción del tejido adiposo, inflamación de
bajo grado y estrés oxidativo
El tejido adiposo está compuesto por células adiposas incrustadas en una
malla de tejido conectivo laxo que está constituido principalmente por adipocitos,
y fracción del estroma vascular que incluye fibroblastos, macrófagos, monocitos,
células sanguíneas, células endoteliales y pre-adipocitos [63]. Anteriormente se
pensaba que el tejido adiposo sólo tenía la función de almacenar energía en forma
de triglicéridos, diacilglicelores, fosfolípidos, ácidos grasos no esterificados y
colesterol, los cuales son movilizados y liberados cuando el gasto energético
sobrepasaba la ingesta. Actualmente, se sabe que el tejido adiposo es además, un
órgano endócrino inervado y vascularizado, que regula el metabolismo energético
y que libera moléculas señal llamadas adipoquinas.
Los adipocitos se originan por diferenciación a partir de células madre
pluripotenciales de origen mesenquimal. Estos adipoblastos originan los pre-
adipocitos, los cuales acumulan una importante cantidad de lípidos y además
expresan prematuramente marcadores de células adiposas [97, 98]. En la última
Introducción
30
etapa embrionaria, los pre-adipocitos se convierten a adipocitos [98], cuyo
desarrollo está mediado por una serie de señalizaciones y factores de transcripción,
que convergen en la sobreexpresión de C/EBP (proteínas potenciadoras de unión
CCAAT) y PPARγ (receptor activado proliferador del peroxisoma) implicados en
la lipogénesis, así como también la hipertrofia del adipocito [65, 98].
La propiedad para almacenar lípidos está determinada por la capacidad de
expansión del tejido adiposo, hiperplasia e hipertrofia. En periodos de crecimiento,
el tejido adiposo se hiperplasia (aumenta el número de adipocitos), en cambio, en
la edad adulta la capacidad de los pre-adipocitos para diferenciarse en adipocitos
maduros declina y predomina la hipertrofia (adipocito aumenta de tamaño) [65,
98]. La lipogénesis es la síntesis de ácidos grasos esterificados que forman
triglicéridos [83] a partir de carbohidratos u otras fuentes de energía aportadas por
la dieta y tiene lugar predominantemente en el hígado y en menor proporción en el
tejido adiposo. La síntesis lipídica está aumentada en estado postprandial y tras el
consumo de carbohidratos debido a la secreción de insulina, y es inhibida en
condiciones de ayuno. Varias son las enzimas involucradas en la lipogénesis que
están inducidas por la insulina [65]. La insulina y los glucocorticoides inducen la
sobreexpresión tanto de C/EBP como de PPARγ, mientras que éstos por el
contrario son reprimidos por TNFα [65, 97]. SREBP1 es un factor de transcripción
involucrado en el metabolismo de ácidos grasos y colesterol, además modula la
lipogénesis estimulando la expresión de PPARγ [65, 98].
Por otra parte, en la lipólisis se hidrolizan los TG almacenados en la gota
lipídica mediante la lipasa triglicérido adiposa (ATGL) que libera diacilglicerol y
ácidos grasos en caso de demanda de energía. Durante el ayuno, el glucagón y las
catecolaminas estimulan la lipólisis mediante la activación de la PKA (proteína
quinasa A) lo que resulta en la movilización de ácidos grasos libres desde el
adipocito a la circulación, unidos a la albúmina y transportados al músculo,
hígado, corazón, y otros tejidos para su oxidación o reesterificación [98]. En la
obesidad, la liberación excesiva de ácidos grasos del tejido adiposo incrementa su
Introducción
31
acumulación en musculo e hígado contribuyendo al desarrollo de la resistencia a la
insulina [62].
Existen dos tipos de tejido adiposo, en función de su estructura celular,
localización, color, vascularización y función. Estos son, el tejido adiposo blanco
[99] y el tejido adiposo marrón (WAT y BAT, respectivamente por su siglas en
inglés) [62]. El WAT almacena energía en forma de TGs en una gota lipídica del
adipocito, mientras que el tejido adiposo marrón los almacena en adipocitos
multiloculares (adipocitos con varias gotas lipídicas). El BAT posee una gran
cantidad de mitocondrias que expresan grandes cantidades de UCO-1 (proteína de
desacoplamiento 1) que es responsable de regular el proceso termogénico
mediante la oxidación de ácidos grasos dentro del adipocito [65, 98].
La localización del tejido adiposo explica sus diferentes funciones. El
tejido adiposo subcutáneo como su nombre lo indica, se localiza debajo de la piel
y tiene la función de aislamiento térmico. Además, cuando existe demanda
energética, los ácidos grasos son movilizados principalmente del tejido adiposo
subcutáneo, luego mesentérico y peritoneal [65, 98]. Por su parte, el tejido adiposo
visceral llena los espacios entre los órganos y los mantiene en la posición
apropiada. El exceso de masa grasa visceral, se asocia con la insulinorresistencia
periférica y hepática, la dislipidemia, la intolerancia a la glucosa, la hipertensión,
el estado hipercoagulable y el riesgo cardiovascular [65, 98].
Los adipocitos hipertrofiados-hiperplásicos muestran menor densidad de
receptores de insulina y mayor expresión del receptor β-adrenérgico-3, lo que
facilita el paso de los monocitos al estroma adiposo visceral, iniciando un ciclo
pro-inflamatorio [64]. En el estado de inflamación crónica de bajo grado
característico del SMet, el tejido adiposo se halla infiltrado de macrófagos, los
cuales aumentan la producción de adipoquinas pro-inflamatorias [100],
contribuyendo a la disfunción de dicho tejido [63, 97]. Por lo tanto, el SMet y sus
consecuencias clínicas se relacionan con la secreción anormal de adipoquinas,
hipertrofia del adipocito, liberación excesiva de ácidos grasos, la inflamación de
Introducción
32
bajo grado y estrés oxidativo a consecuencia de la disfunción del tejido adiposo
[64, 101].
Entre las adipoquinas secretadas por el tejido adiposo, TNF-α e IL-6
tienen propiedades pro-inflamatorias y sus niveles se encuentran elevados en
personas obesas. Por su parte, la pérdida de peso reduce la infiltración de
macrófagos y por tanto la expresión de marcadores inflamatorios [100-102]. Los
factores estimulantes de estas adipoquinas son los lipopolisacáridos (LPS), la
insulina, el tamaño de los adipocitos per se y las catecolaminas [102]. Se ha
demostrado que el TNF-α induce la resistencia a la insulina, reduciendo la
expresión del transportador Glut-4 y la sensibilidad a la insulina, a la vez que
estimula la expresión de la lipasa sensible a hormona (HSL) lo que incrementa la
lipólisis [100, 102].
El TNF-α modula la enzima NADPH-oxidasa contribuyendo al
incremento en la producción de ROS [103], y a su vez el TNF-α es modulado por
la grasa de la dieta [104]. La producción de adipoquinas está alterada en la
obesidad, la diabetes tipo 2 y el SMet [64]. Individuos con SMet, presentan una
repuesta inflamatoria postprandial exacerbada, que parece ser independiente de la
cantidad y tipo de grasa proveniente de la dieta [105].
El consumo de dietas con alto contenido en grasas puede alterar el
metabolismo del oxígeno, debido a que los depósitos grasos tienden sufrir
oxidación [5]. La oxidación de ácidos grasos en el peroxisoma y la mitocondria,
genera ROS [101], por lo tanto, si la producción de ROS excede la capacidad
antioxidante, la peroxidación lipídica incrementa el estrés oxidativo, lo que podría
contribuir al desarrollo de la aterosclerosis [5, 101].
Como ya se ha dicho en el apartado sobre “estrés oxidativo”, la
producción de ROS en condiciones normales es fisiológica, pero también está
involucrado en procesos fisiopatológicos como la obesidad, diabetes, enfermedad
cardiovascular y procesos aterogénicos, en los que los niveles de ROS se
incrementan [26, 105]. En modelos de ratones obesos-diabéticos y obesos-no
Introducción
33
diabéticos, la actividad antioxidante se vio reducida, posiblemente debido a la
obesidad per se [26].
Varios marcadores de daño oxidativo tales como malonaldheido (MDA),
F-2 isoprostanos y la proteína C reactiva (PCR), se incrementan en personas
obesas y se correlacionan directamente con el índice de masa corporal (IMC), el
porcentaje de grasa corporal, la oxidación de las LDL y los niveles de TG [101].
Actualmente, la atención está centrada en el exceso de adiposidad
abdominal, siendo éste uno de los componentes más importantes en el SMet [59].
De hecho, Furukawa y cols., señalan a la grasa acumulada como un importante
mecanismo patogénico de la obesidad asociada al SMet, cuyo esquema se explica
en la Figura 3 [26]. En esta hipótesis, Furukawa propone que el incremento del
estrés oxidativo generado en la grasa acumulada es consecuencia de la obesidad
per se; debido al incremento de la NADPH-oxidasa y la disminución de los
antioxidantes, y que como consecuencia, provocan la producción alterada de
adipoquinas, lo que conduce a un estrés oxidativo sistémico que ocasiona daños a
otros órganos tales como, el hígado, el músculo esquelético y la aorta, lo que
desencadena el desarrollo del SMet [26].
Figura 3. Esquema de la hipótesis de Furukawa sobre la función de las ROS en el SMet
[26].
Introducción
34
La dieta, en particular la cantidad y el tipo de grasa proveniente de ella,
tiene la capacidad de modular la inflamación y el estrés oxidativo en pacientes con
SMet [11, 104-106]. Ciertas modificaciones en la composición de la dieta, sumado
a ejercicio regular mejoran notablemente la hipertensión, estrés oxidativo, la
biodisponibilidad de NO y el perfil metabólico, mitigando de esta manera la
progresión de la aterosclerosis [107].
Por lo tanto, las evidencias sugieren que una dieta saludable, reduce el
estrés oxidativo en el SMet y sus manifestaciones clínicas (hipertensión,
enfermedad cardiovascular y diabetes).
2.6. Síndrome Metabólico y co-morbilidades asociadas
Las complicaciones del SMet, van más allá de los componentes
relacionados con el desarrollo del mismo. Las co-morbilidades que acompañan
este síndrome conducen a desórdenes metabólicos en algunos casos irreversibles,
así como también al deterioro de la calidad de vida del paciente que los padece.
2.6.1. Disfunción endotelial y aterosclerosis
El endotelio vascular, está compuesto por una capa unicelular que cubre la
superficie interna de los vasos sanguíneos y conforma la pared de los capilares.
Tiene funciones autócrinas/parácrinas que regulan la adhesión plaquetaria, la
coagulación, el sistema fibrinolítico, el tono vascular y la interacción de la pared
vascular con las células sanguíneas y macromoléculas circulantes. Estas funciones
le confieren al endotelio la propiedad de mantener la homeostasis vascular [67,
108]. Cuando el endotelio pierde sus propiedades fisiológicas (vasodilatación,
fibrinólisis y antiagregación), se vuelve vulnerable a la inflamación,
vasoconstricción, e incrementos de la permeabilidad vascular, resultando en
disfunción endotelial, condición en la que se promueve el crecimiento vascular
anormal como desencadenante de la aterosclerosis, agregación plaquetaria y
trombosis [67, 108, 109] (Figura 4).
Introducción
35
Figura 4. Representación esquemática del desarrollo de la aterosclerosis desde etapas
iniciales de la disfunción endotelial a la formación de la placa de ateroma. MCP-1:
proteína quimiotáctica de monocitos; PDGF: factor de crecimiento plaquetario; M-CSF:
factor estimulador de colonias de macrófagos; FT: factor tisular; PAI-1: inhibidor del
plasminógeno tipo-1 activado; UPA: activador del plasminógeno tipo uroquinasa; MMP:
metaloproteinasas. Adaptado de Badimón L. et al. [110].
El óxido nítrico (NO) se sintetiza en el endotelio, y se le atribuye una
propiedad ateroprotectora con funciones como vasodilatador, antiagregante
plaquetario y antioxidante, entre otros. La alteración de la biodisponibilidad de NO
en este proceso, podría deberse a su inadecuada producción, a su degradación y/o
respuesta relacionada con la hipercolesterolemia, concentraciones elevadas de
LDL y LDL-oxidada, condición que perturba la homeostasis vascular y potencia el
desarrollo de la aterosclerosis [5, 108]. Existen evidencias sobre la inactivación del
NO, por el anión superóxido (O2•−
) y otras ROS; en el caso de que NO reaccione
con O2•−
se forma el compuesto peroxinitrito (ONOO-) disminuyendo de esta
forma la biodisponibilidad del NO, contribuyendo a la disfunción endotelial [111].
Pero, no sólo la falta de biodisponibilidad del NO altera la función endotelial, sino
que todos los factores de riesgo cardiovascular como la hipercolesterolemia, la
diabetes, la hipertensión arterial, el tabaquismo, además de otros factores de riesgo
Introducción
36
tales como ROS, homocisteína, infecciones, déficit de estrógeno, alteran la
función endotelial [108].
En pacientes diabéticos, la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la
hipercolesterolemia y los ácidos grasos no esterificados (NEFAs) elevados,
activan la NADPH-oxidasa [25] y se acelera el desarrollo de la aterosclerosis
incrementando la producción de ROS y la permeabilidad endotelial a lipoproteínas
aterogénicas [109].
Las ROS generadas por la NADPH-oxidasa son las encargadas de regular
el tono vascular y la función endotelial de manera fisiológica, pero también de
manera patológica, ya que esta enzima puede generar estrés oxidativo debido al
aumento excesivo de ROS y consecuentemente provoca disfunción endotelial [25,
67]. La NADPH-oxidasa puede ser activada y regulada por agonistas de los
receptores acoplados a proteínas G, tales como angiotensina II y endotelina I,
además de factores de crecimiento como la trombina y el factor de crecimiento
endotelio-vascular (VEGF), TNFα, hiperglucemia, hiperinsulinemia, NEFAs
elevados, lípidos oxidados, entre otros [25]. Por lo tanto, los niveles del anión
superóxido (O2•−
) generados por la NADPH-oxidasa que contribuyen a la
disfunción vascular, están elevados en los vasos sanguíneos en condiciones
fisiopatológicas tales como, hipertensión, aterosclerosis, diabetes,
hiperhomocisteinemia, insuficiencia cardiaca, sepsis, hemorragia subaracnoidea,
envejecimiento y Alzheimer [111].
La disfunción endotelial es suficiente para iniciar el proceso de
aterosclerosis a través del incremento de la permeabilidad endotelial a las
lipoproteínas aterogénicas (LDL modificada, LDL-oxidada, etc.) [5]. Los niveles
elevados de colesterol-LDL, conocido factor de riesgo de la enfermedad
cardiovascular, estimulan la generación del anión superóxido por la NADPH-
oxidasa, lo que contribuye a su vez a la oxidación de dichas lipoproteínas [25],
acrecentando el poder aterogénico de éstas y promoviendo la adhesión celular de
los monocitos a la pared vascular [112]. En el proceso de iniciación de la
Introducción
37
aterosclerosis, las LDL pueden entrar y salir de la íntima, quedando atrapadas en la
matriz mediante la unión a proteoglucanos (Figura 5). Una cantidad insuficiente
de antioxidantes, hace que los lípidos y las LDL sean propensos a la oxidación
mediante productos oxidantes derivados de células que residen en la pared del
vaso. Así mismo, las LDL están sujetas también a los procesos de glicación, para
formar las LDL-mínimamente modificadas (MM-LDL), que tras la posterior
oxidación, con el tiempo se convierten en LDL oxidadas [113] (Figura 5).
Figura 5. Esquema representativo de la formación de células espumosas en la íntima.
Adaptado de Osterud y Bjorklid [113]. LDL: lipoproteínas de baja densidad; MM-LDL:
LDL mínimamente modificadas; VCAM-1: molécula de adhesión celular vascular; ICAM-
1: molécula de adhesión intercelular; MCP-1: proteína monocito quimioatrayente-1; M-
CSF: factor estimulante de colonias; TLR4: receptor Toll-like 4; HSP-60: proteína de
choque térmico; LPS: lipopolisacáridos; PSGL-1: ligando de glicoproteína-1 P-selectina;
LFA-1: función de los linfocitos antígeno-1; EC: células endoteliales; SMC: células
musculares lisas.
Las modificaciones que sufren las LDL pueden ser químicas y/o
estructurales cuando interaccionan con oxidantes (ROS, lipo-oxigenasas, etc.),
enzimas proteolíticas (trombina, metaloproteinasas, etc.) y enzimas lipolíticas
Introducción
38
(fosfolipasa A y C), además interaccionan con componentes de la matriz
extracelular (proteoglucanos, colágeno y elastina) (Figura 5) [110].
El reclutamiento de las células mononucleares (monocitos y linfocitos T)
como respuesta inflamatoria especializada para la exposición de LDL-
mínimamente modificadas (MM-LDL), caracteriza la fase de iniciación de la
formación de la lesión aterosclerótica [113]. Las LDL-modificadas inducen la
expresión de MCP-1 e IL-8, además de un aumento en la expresión de moléculas
de las adhesión como integrinas y selectinas a través de la activación de NF-Kb,
que favorecen el reclutamiento, la adhesión y la transmigración leucocitaria
(monocitos, linfocitos T) (Figuras 5 y 6) [110]. Una vez adheridas, las células
mononucleares entran a la pared arterial dirigidas por la proteína monocito
quimioatrayente-1 (MCP-1). Las partículas de LDL atrapadas en la íntima son
propensas a la oxidación progresiva, haciéndolos reconocibles por los receptores
scavenger de macrófagos. Tras una amplia captación de LDL-modificadas por los
receptores scavenger (CD36 y SR-A), los macrófagos son finalmente convertidos
en células espumosas [113], ver Figuras 5 y 6.
La oxidación e inflamación continúan, y la lesión se amplía invadiendo el
lumen arterial con la adherencia y agregación plaquetaria. La migración de las
células musculares lisas a la íntima y finalmente la formación de una cápsula
fibrosa (comprende componentes de la matriz extracelular, células musculares
lisas y colágeno) y necrótica en el núcleo de la lesión, deterioran el flujo de sangre
(Figura 6) [5].
La acumulación de LDL oxidada en la íntima y los productos de
activación celulares resultantes tales como, factores quimiotácticos, factores de
crecimiento y citoquinas, también promueven la proliferación de células del
músculo liso, la captación de LDL oxidada y finalmente, la conversión a células
espumosas cargadas de lípidos [113].
Introducción
39
Figura 6. Esquema representativo de la formación de la placa de ateroma. Adaptado de
Stocker [5].
Una complicación de la aterosclerosis avanzada es la trombosis, resultado
de la ruptura de la placa de ateroma y la exposición de sus componentes
trombogénicos a la circulación sanguínea, ocluyendo completamente el lumen [5]
y consecuentemente, se desatan los eventos cardiovasculares como el infarto al
miocardio o accidentes cerebrovasculares.
En resumen, las LDL-oxidadas desempeñan un papel clave en la patogenia
del proceso aterotrombótico. Por lo tanto, las estrategias para disminuir la
oxidación de los ácidos grasos y en particular de las LDL, así como los niveles
plasmáticos de esta lipoproteína, son puntos claves para evitar o reducir el
desarrollo de la aterosclerosis.
2.6.2. Resistencia a la insulina y DMT2 en el Síndrome Metabólico
La insulinorresistencia puede ser definida como la capacidad disminuida
de la célula para responder a la acción de la insulina, siendo la característica más
importante en el estado “pre-diabético” [114] y el primer deterioro detectable en
DMT2. A menudo la resistencia a la insulina es compensada por una
hiperinsulinemia [114]. La insulinorresistencia es consecuencia de los efectos de
Formación de la cápsula fibrosa
Formación del núcleo necrótico
Macrófagos
Formación de células espumosas
Migración de las células musculares lisas
Adherencia e infiltración de leucocitos
Introducción
40
factores inflamatorios, hormonales, así como de estrés de retículo endoplásmico
sobre tejidos insulino-sensibles tales como adipocitos, hepatocitos, musculo
esquelético y células β pancreáticases, además constituye uno de los factores de
riesgo para el desarrollo de diabetes tipo 2 (DMT2) y SMet [114].
Los factores genéticos y ambientales, como la falta de ejercicio físico y el
tipo de dieta subyacen a las anomalías metabólicas del SMet y pueden ser la causa
de la insulinorresistencia [67]. El consumo de dietas hipercalóricas y con alto
contenido en grasas saturadas se relacionan con aumento de la grasa corporal, y
por consiguiente deterioro de la sensibilidad a la insulina, mientras que los ácidos
grasos monoinsaturados y poliinsaturados mejoran la sensibilidad a la insulina
[115]. La obesidad y el exceso de adiposidad abdominal son factores
determinantes en la resistencia a la insulina y representa el factor de riesgo más
importante para la DMT2 y SMet [63, 115]. La adiponectina es una proteína
secretada por el tejido adiposo cuyas funciones metabólicas son la supresión de la
gluconeogénesis hepática, estimulación de la oxidación de ácidos grasos en hígado
y músculo esquelético, secreción de insulina, captación de glucosa por el músculo
esquelético, así como modulación de la ingesta y el gasto energético. Los niveles
de esta adipoquina se ven reducidos en presencia de obesidad, exceso de
adiposidad y resistencia a la insulina [63] y por consiguiente, sus funciones
metabólicas se ven deterioradas. Sin embargo, la pérdida de peso mejora
notablemente la sensibilidad a la insulina en tejidos periféricos, disminuye la
incidencia de diabetes y mejora las anormalidades metabólicas [115].
La secreción de insulina a niveles fisiológicos activa un sistema generador
de H2O2 por la NADPH-oxidasa en las membranas plasmáticas de adipocitos
humanos [116]. Cuando el receptor de insulina es estimulado, éste se fosforila a sí
mismo y también a varios sustratos como el sustrato del receptor de insulina (IRS-
1, del inglés insulin receptor sustrate) [117], requisito para iniciar la cascada de
señalización cuya inhibición es uno de los primeros pasos a través del cual la señal
inflamatoria conduce a la resistencia a la insulina [118, 119]. El aumento del
Introducción
41
metabolismo de la glucosa genera una producción incrementada de ROS, más
elevada aún en la obesidad, provocando una mayor activación de las vías
inflamatorias [26]. La fosforilación de IRS-1 se inhibe cuando la célula está
expuesta a marcadores inflamatorios como el TNF-α o elevados niveles de ácidos
grasos libres, característicos en la obesidad [118, 119].
El desarrollo de la DMT2 se caracteriza por la hiperglucemia e
hiperinsulinemia como consecuencia de la resistencia a la insulina de diferentes
tejidos tales como el tejido adiposo, musculo esquelético e hígado. La secreción
fisiológica de insulina genera H2O2 [116], por lo que la constante secreción de
insulina en el caso de la hiperinsulinemia por consiguiente, produce un aumento de
ROS, desencadenando estrés oxidativo en varios tipos celulares incluyendo las
células β pancreáticas. Los efectos de la hiperinsulinemia sumado a la producción
elevada de H2O2, deteriora las funciones de las células β pancreáticas
conduciéndolas hacia la muerte [120]. En modelos animales, se observó que la
hiperglucemia induce la disfunción de las células β pancreáticas, debido al
aumento de ROS, en particular del anión superóxido y que el tratamiento de éstas
células con TPO (tempol), un mimético del antioxidante superóxido dismutasa
(SOD) impide el aumento del anión superóxido total y mitocondrial, así como la
disfunción de las células β pancreáticas inducida por hiperglucemia [121].
La acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno ha sido
vinculada con la obesidad [97], la aterosclerosis [110], así como en la insuficiencia
de células beta en la diabetes tipo 2 [121]. El vínculo de unión entre la el SMet y la
DMT2, es el estrés oxidativo, implicado tanto en la obesidad abdominal como en
la resistencia a la insulina, respectivamente [122].
Introducción
42
3. DIETA Y ESTADO POSTPRANDIAL
3.1. Importancia del estado postprandial
En la actualidad, los patrones de alimentación establecen la ingesta de tres
o más comidas al día, de las cuales cada una contiene aproximadamente entre 20-
70 g de grasa [123, 124], de manera que cada comida es ingerida antes de que los
niveles plasmáticos de triglicéridos (TG) resultantes de la ingesta anterior,
retornen a sus niveles basales (a excepción del desayuno) [124]. Por lo tanto, el
estado postprandial es una situación en la que los humanos pasamos la mayor
parte del tiempo, a raíz de las sucesivas ingestas durante el día siguiendo los
hábitos alimentarios actuales [124].
La lipemia postprandial representa una respuesta metabólica aguda a una
comida o nutrientes, y es una condición dinámica que comprende una rápida
remodelación de las lipoproteínas en comparación con el estado de ayuno en el
que estas lipoproteínas se mantienen estables. En la lipemia postprandial, los
niveles de triglicéridos aumentan dentro de la primera hora tras la ingesta de
alimentos con alto contenido graso y pueden mantenerse elevados de 5 a 8 horas.
La capacidad de los individuos para regular el aclaramiento de los TGs es el
reflejo de la eficiencia metabólica [123, 125], y el retraso en este aclaramiento
representa una respuesta alterada a la ingesta de alimentos que podría reflejar la
existencia de insulinorresistencia [126].
Los triglicéridos son rutinariamente medidos en ayunas, y exceptuando las
primeras horas de la mañana, la mayoría de los individuos permanecen en estado
postprandial gran parte del día [124, 126]. Frecuentemente, los factores de riesgo
cardiovascular han sido determinados y medidos en estado de ayuno, aunque la
importancia del estudio de la lipemia postprandial radica en evidencias que la
asocian con la aterosclerosis [125-127].
La hipertrigliceridemia postprandial se ha asociado con el riesgo
incrementado de infarto de miocardio y cardiopatía isquémica y muerte [125]. Las
lipoproteínas ricas en TGs (remanentes de quilomicrones) pueden penetrar la capa
Introducción
43
de células endoteliales y residir en el espacio sub-endotelial, donde contribuyen a
la formación de células espumosas, caracterizando a la aterosclerosis temprana,
como parte de un fenómeno postprandial [110, 126, 128]. El valor del ratio
TGs/apoB proporciona una estimación del tamaño medio de las partículas, lo cual
es importante, ya que refleja la tasa de aclaramiento de los TGs [123]. En cuanto a
las LDL, su tamaño se ha relacionado con riesgo cardiovascular [123], de hecho
las LDL desempeñan un papel importante en el desarrollo de aterosclerosis,
principalmente las LDL-oxidadas ya que son mucho más aterogénicas [113], y los
antioxidantes en la dieta por su parte, ejercen cierto efecto beneficioso evitando la
oxidación de las mismas [129, 130].
El tejido adiposo capta lípidos ingeridos en la dieta, durante al menos las 5
horas siguientes a la ingesta de los alimentos y, por tanto ocurre durante todo el
día dentro de un patrón de alimentación de 3 comidas al día. El aumento de
adiposidad en los individuos obesos, plantea la disminución de la capacidad del
tejido adiposo para almacenar más TG en los adipocitos, por lo tanto, los lípidos
tienden a acumularse en otros tejidos u órganos [131]. El estrés oxidativo que se
genera en el tejido adiposo, consecuencia de la obesidad per se; debido al
incremento de la NADPH-oxidasa y la disminución de genes antioxidantes,
provoca una producción alterada de adipoquinas pro-inflamatorias [26].
3.2. Dieta y estrés oxidativo postprandial
El estado postprandial se asocia con el estrés oxidativo y la inflamación,
característicos de enfermedades cardiovasculares, SMet y diabetes [132]. La dieta
parece modular estos procesos, de manera que se han realizado estudios aplicando
diferentes modelos dietéticos que puedan utilizarse como prevención y/o
tratamiento de enfermedades crónicas [7, 11, 104, 133-137]. De hecho, varios
estudios han demostrado que los alimentos que componen una dieta mediterránea,
en particular aquellos ricos en MUFA (ácidos grasos monoinsaturados),
disminuyen la expresión de genes relacionados con la inflamación y el estrés
Introducción
44
oxidativo en células mononucleares de sangre periférica, tanto en personas con
SMet como en personas de edad avanzada [7, 11, 104, 136, 137].
Por el contrario, el consumo de una dieta rica en grasas saturadas aumenta
la expresión de genes implicados en procesos de inflamación en el tejido adiposo,
y sin embargo, una dieta MUFA induce un perfil de expresión génica
antiinflamatorio en estado de ayunas [92], mientras que en estado postprandial, el
incremento de citoquinas pro-inflamatorias en tejido adiposo de personas con
SMet, parece ser independiente de la calidad y la cantidad de grasa en la dieta
[105]. La disfunción del tejido adiposo y las patologías metabólicas y vasculares
presentes en la obesidad, tienen como un punto de unión la inflamación sistémica
de bajo grado, siendo ésta un factor de riesgo en las enfermedades
cardiovasculares [138].
Por otra parte, el consumo de aceite de oliva, cuya fuente de ácidos grasos
monoinsaturados y compuestos fenólicos caracterizan a la dieta Mediterránea,
modulan los genes involucrados en la señalización del receptor de las células β-
pancreáticas y endocitosis [139], así como también reduce la expresión de los
genes que inducen el estrés oxidativo [137] y la respuesta inflamatoria [140] en
estado postprandial en CMSP de personas de edad avanzada. Así pues, el
postprandio generalmente asociado tanto a niveles elevados de TGs y glucosa,
como también al aumento en la expresión de genes relacionados con la
inflamación y el estrés oxidativo, resultan en daño celular, daño al ADN, ácidos
nucleicos, proteínas, carbohidratos y lípidos. Se ha demostrado que el incremento
del estrés oxidativo postprandial es un factor importante en la disfunción
endotelial y la aterosclerosis [5, 108, 110].
Las comidas con alto contenido en grasas y en carbohidratos inducen un
mayor y más prolongado estrés oxidativo e inflamatorio postprandial en obesos, en
comparación con sujetos normopeso, lo que puede contribuir al aumento del riesgo
aterogénico en la obesidad [141]. En contrapartida, añadir nueces a una comida
con alto contenido en grasas saturadas mejora la dilatación mediada por flujo
Introducción
45
independientemente de los cambios en la oxidación, inflamación o dimetilarginina
asimétrica plasmática. Además, las nueces y el aceite de oliva conservan el
fenotipo protector de las células endoteliales [142]. Por lo tanto, el tipo de grasa en
las comidas puede afectar diferencialmente a la inflamación, a la activación
endotelial y al estrés oxidativo en estado postprandial [117, 137].
Las personas con SMet presentan marcadores de estrés oxidativo
incrementados en ayunas, escenario que se agrava en estado postprandial tras la
ingesta de una sobrecarga grasa en comparación con personas sanas [143]. Las
evidencias respaldan el hecho de que el estrés oxidativo postprandial puede ser
modulado por la cantidad y el tipo de grasa de la dieta, en particular el tipo de
grasa de la dieta, por tanto se han estudiado sus efectos en estado postprandial [11,
94, 104-106, 136, 137, 142], y los resultados sugieren que los ácidos grasos
monoinsaturados (MUFA) del aceite de oliva tienen posibles efectos
cardioprotectores [11], juntos con sus componentes minoritarios tales como los
compuestos fenólicos, los cuales se ha demostrado que reprimen la expresión de
genes pro-inflamatorios [106] en personas con síndrome metabólico, y mejora la
función endotelial en hombres hipercolesterolémicos [129].
El efecto antioxidante de una dieta Mediterránea rica en MUFA
suplementada con CoQ exógeno, reduce la expresión de las subunidades de la
NADPH-oxidasa, y por consiguiente se reduce la expresión postprandial de los
genes antioxidantes en las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), en
personas mayores, mientras que una dieta rica en ácidos grasos saturados (SFA)
aumenta la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo [137].
Igualmente en pacientes con SMet, el consumo de una dieta rica en grasa
monoinsaturada mejora los niveles plasmáticos postprandiales de GSH (glutatión
reducido) y la relación GSH/GSSG, así como también disminuye los niveles de
lipoperóxidos, proteínas carboniladas, H2O2 y la actividad SOD, en comparación
con una dieta rica en grasa saturada, mientras que las dietas bajas en grasa y altas
Introducción
46
en hidratos de carbono complejos, ejercen un efecto intermedio en relación con las
dietas HMUFA y HSFA [11].
El aceite de oliva como fuente de compuestos fenólicos y ácidos grasos
monoinsaturados, así como los aceites de semilla con agregado de antioxidantes
artificiales (dimetilpolisiloxano) o provenientes de la aceituna como el alperujo,
podrían reducir el estrés oxidativo postprandial en comparación con aceite de
girasol refinado [136].
Por lo tanto, la sustitución de las grasas saturadas por grasas
monoinsaturadas en la dieta puede ser una estrategia eficaz para reducir el estrés
oxidativo en pacientes con obesidad y síndrome metabólico, así como sus
consecuencias fisiopatológicas.
III. HIPÓTESIS
Hipótesis
49
HIPÓTESIS
El tejido adiposo disfuncional, se caracteriza por el aumento en la
infiltración de monocitos y macrófagos; incrementando la producción de
adipoquinas pro-inflamatorias.
Furukawa y cols., propusieron que la obesidad per se, podría inducir estrés
oxidativo sistémico, debido al incremento en la expresión de la NADPH-oxidasa y
la disminución de la expresión de los genes antioxidantes en tejido adiposo, lo que,
al menos en parte, causa la alteración en la liberación de adipoquinas y está
asociado con el desarrollo del SMet.
Estudios previos de intervención dietética, han demostrado que la
modificación de la calidad de la grasa de la dieta puede reducir significativamente
el estrés oxidativo. De hecho, se ha demostrado que el consumo de una dieta rica
en grasas monoinsaturadas (MUFA) induce una reducción del daño oxidativo
mejorando los niveles de sustratos antioxidantes plasmáticos de GSH (glutatión
reducido) y la relación GSH/GSSG, así como también las biomoléculas
plasmáticas (lipoperóxidos, proteínas carboniladas, H2O2 y la actividad SOD) en la
misma población de pacientes con SMet del presente estudio.
Así, teniendo en cuenta que la etiología del síndrome metabólico es
consecuencia de una compleja interacción entre factores genéticos y ambientales,
de entre los que destaca la dieta, y en particular el tipo de grasa; el desarrollo del
síndrome metabólico podría estar relacionado con la cantidad y tipo de grasa de la
dieta, a través de la modulación que ejerce ésta sobre el estrés oxidativo sistémico
asociado a una producción alterada de adipoquinas.
Sobre la base de estos hallazgos anteriores, nos planteamos el hecho de
que la cantidad y tipo de grasa de la dieta podrían modular el perfil de expresión
de genes implicados en la formación de especies reactivas de oxígeno y en la
defensa antioxidante en tejido adiposo y en células mononucleares de sangre
periférica de pacientes con Síndrome Metabólico, y así influir en el grado de estrés
oxidativo a nivel sistémico.
IV. OBJETIVOS
Objetivos
53
OBJETIVO PRINCIPAL
Determinar el efecto del consumo a largo plazo de cuatro modelos de dieta
con diferente cantidad y tipo de grasa [A. Dieta rica en ácidos grasos saturados
(HSFA), 38 % de energía proveniente de la grasa; B. Dieta alta en ácidos grasos
monoinsaturados (HMUFA), 38 % de energía proveniente de la grasa; C. Dieta
baja en grasa (28 % de energía), rica en hidratos de carbono complejos (LFHCC);
D. Dieta baja en grasa, rica en hidratos de carbono complejos, suplementada con
PUFA n-3 de cadena larga y de origen marino (LFHCC n-3)], tanto en ayunas
como en estado postprandial en la expresión génica (niveles de ARNm) de las
subunidades que conforman el complejo generador del anión superóxido,
NADPH-oxidasa en tejido adiposo subcutáneo de pacientes con SMet.
OBJETIVOS SECUNDARIOS
1. Estudiar el efecto del consumo a largo plazo de cuatro modelos de
dieta con diferente cantidad y tipo de grasa en la expresión génica en ayunas y en
estado postprandial de enzimas relacionadas con el sistema de defensa
antioxidante: SOD1 y SOD2, CAT, GSR, GPx1, GPx3 y GPx4, TXN, TXNRD1,
el factor de transcripción NFE2L2 y KEAP1, en tejido adiposo de pacientes con
SMet.
2. Estudiar el efecto del consumo a largo plazo de cuatro modelos de
dieta en la expresión génica de las subunidades del complejo generador del anión
superóxido, NADPH-oxidasa y el factor de transcripción PU.1, así como la
expresión de genes relacionados con el sistema de defensa antioxidante: SOD1 y
SOD2, CAT, GSR, GPx1, GPx4, TXN, TXNRD1 y el factor de transcripción
NFE2L2, tanto en ayunas como en estado postprandial en células mononucleares
de sangre periférica con el objetivo de establecer efectos diferenciales en cada tipo
celular.
3. Analizar la relación entre la expresión génica tanto en tejido adiposo
como en células mononucleares de sangre periférica de los genes relacionados con
Objetivos
54
el estrés oxidativo y los parámetros lipídicos y biomarcadores plasmáticos de
estrés oxidativo.
4. Identificar las proteínas de respuesta rápida al tipo de grasa ingerida
en la dieta, mediante cambios en el proteoma de CMSP aisladas de pacientes con
SMet, en respuesta a la ingesta aguda de cuatro comidas con diferente tipo de
grasa.
V. DISEÑO Y
METODOLOGÍA
Diseño y Metodología
57
1. POBLACIÓN DE ESTUDIO
El presente trabajo se llevó a cabo en el marco del estudio LIPGENE
“Diet, genomics and the metabolic syndrome: an integrated nutrition, agro-food,
social and economic analysis”, (NCT00429195). Un subgrupo de 75 pacientes (28
hombres y 47 mujeres) con Síndrome Metabólico (SMet) completó el estudio de
lipemia postprandial de las fases pre- y post-intervención. Todos los participantes
dieron su consentimiento informado por escrito y se les realizó una historia clínica
detallada completa junto con un examen físico y una analítica previos a la
inclusión en el estudio. El SMet se definió según los criterios del ATP III [61,
144], cuando los pacientes presentaron tres o más de las siguientes características:
Concentración de glucosa en ayunas: 5,5 mmol/L (100 mg/dL).
Niveles de triglicéridos en plasma: 1,7 mmol/L (150 mg/dL).
Concentración de c-HDL en plasma: <1,0 mmol/L (<40 mg/dL) en
hombres y <1,3 mmol/L (<50 mg/dL) en mujeres.
Presión sanguínea: 130/85 mmHg.
Perímetro de cintura: >102 cm en hombres y >88 cm en mujeres.
Este ensayo clínico se realizó en la Unidad de Lípidos y Arteriosclerosis
del Hospital Universitario Reina Sofía, de febrero de 2005 a abril de 2006.
Durante estos 2 años aproximadamente, se dividió a los pacientes en 2 subgrupos.
Los pacientes de la subcohorte I (N = 36) pertenecen al primer año del estudio, y
los pacientes de la subcohorte II (N = 39) pertenecen al segundo año del estudio de
intervención.
El protocolo experimental fue aprobado por el comité ético del centro de
intervención, de acuerdo con la declaración de Helsinki.
1.1. Cálculo del tamaño muestral
El cálculo del tamaño de la muestra se llevó a cabo utilizando la
calculadora de tamaño muestral GRANMO (Versión 7.12 abril 2012).
El cálculo se ha realizado en base a las siguientes premisas:
Diseño y Metodología
58
Variable principal del estudio: Expresión de NADPH-oxidasa gp91phox
(niveles de
ARNm)
Diferencia mínima esperada: H0= 2 H1=1,4 (Diferencia mínima esperada 30% en
la variación en la expresión de NADPH oxidasa gp91phox
= 0,6).
Error alfa = 0,05 (Nivel de confianza= 95%)
Error beta = 0,10 (Potencia= 90%)
Pérdidas estimadas: 10%
Contraste de Hipótesis: Bilateral
En base a estas premisas se precisaron un total de 9 pacientes por grupo.
1.2. Criterios de inclusión
Se establecieron los siguientes criterios de inclusión de acuerdo a los
establecidos en la realización del estudio LIPGENE:
Síndrome metabólico según los criterios de ATP-III
Hombres y mujeres entre 35-70 años
IMC entre 20-40 kg/m2
Colesterol total <8,0 mmol/l (144 mg/dl)
Medicación/suplementos nutricionales permitidos: antihipertensivos
(incluyendo beta-bloqueantes), terapias hormonales, polivitamínicos y
antioxidantes.
Fumadores y no fumadores.
Consumo de alcohol de forma no excesiva sin elevación de las enzimas
hepáticas (AST y ALT).
Europeos de raza blanca.
1.3. Criterios de exclusión
Del mismo modo, se establecieron los siguientes criterios de exclusión, de
acuerdo a los establecidos en el estudio LIPGENE:
Edad inferior a 35 o superior a 70 años.
Diabetes u otros desórdenes endocrinos.
Diseño y Metodología
59
Enfermedades inflamatorias crónicas.
Disfunción renal o hepática.
Anemia (hemoglobina <12 g/dl en hombres o <11 g/dl en mujeres).
Medicación hipolipemiante y antiinflamatoria concomitante.
Consumo de suplementos de ácidos grasos incluyendo aceites de pescado,
etc.
Alto consumo de pescado (>2 piezas de pescado a la semana de arenques,
caballa, sardinas, salmón, trucha, atún).
Consumo de altas dosis de vitaminas antioxidantes (A, C, E, β-caroteno).
Realización de un ejercicio físico intenso más de 3 veces a la semana.
Inicio de una dieta especial durante los 3 meses de duración del estudio.
Modificaciones del peso corporal en 3 o más kg durante los 3 meses de
duración del estudio.
Abuso de alcohol o de drogas.
Mujeres embarazadas o lactantes o mujeres que deseen quedarse
embarazadas en los próximos 12 meses al estudio. Las mujeres que se queden
embarazadas durante el estudio deberán abandonar el mismo.
2. DISEÑO EXPERIMENTAL DEL ESTUDIO
2.1. Estudio de intervención dietética
Los voluntarios fueron aleatorizados para recibir una de las cuatro dietas
durante 12 semanas (Figura 7). Esta aleatorización se realizó según edad, género
y concentración de glucosa plasmática en ayunas utilizando el programa de
aleatorización MINIM (Minimisation Programme for Allocating patients to 8
Clinical Trials, Dept of Clinical Epidemiology, the London Hospital Medical
College, UK). El diseño del estudio de intervención dietética se describió
previamente en el artículo publicado por Shaw y cols. [145] que aporta
información detallada acerca del control del consumo de los alimentos durante el
periodo de intervención dietética, la adherencia de los voluntarios a la dieta y
Diseño y Metodología
60
detalles de la composición de los alimentos durante las fases de pre- y post-
intervención del estudio.
La composición de las cuatro dietas del estudio fue la siguiente:
A. Dieta Occidental, rica en ácidos grasos saturados (HSFA)
Compuesta por un 15% de proteína en relación al contenido calórico total (CCT),
47% de HC del CCT y 38 % de grasa del CCT [de los cuales, 16% grasa saturada
(SFA), 12 % grasa monoinsaturada (MUFA) y 6% grasa poliinsaturada (PUFA)].
B. Dieta alta en ácidos grasos monoinsaturados (HMUFA)
Con un 15% de proteína del CCT, 47% de HC del CCT y 38 % de grasa del CCT
(de los cuales, 8% SFA, 20% MUFA y 6% PUFA).
C. Dieta baja en grasa y rica en HC complejos (LFHCC)
Compuesta por un 15% de proteína del CCT, 57% de HC del CCT y 28 % de
grasa del CCT (de los cuales, 8% SFA, 11% MUFA y 6% PUFA). Además, esta
dieta se suplementó con un 1 g/d de aceite de girasol alto en ácido oleico (HOSO)
en forma de cápsula.
D. Dieta baja en grasa, alta en HC complejos y suplementada con PUFA
n-3 de cadena larga y de origen marino (LFHCC n-3)
Con un 15% de proteína del CCT, 57% de HC del CCT y 28% de grasa del CCT
(de los cuales, 8% SFA, 11% MUFA y 6% PUFA). Esta dieta fue suplementada
con 1,24 g/d de PUFA n-3 de cadena larga y de origen marino, en forma de
cápsula (Marinol ™ C-38, un concentrado natural de aceite de pescado con alto
contenido en EPA y DHA).
Las cápsulas que contenían ácidos grasos de cadena larga PUFA fueron
utilizadas en vez del consumo de pescado por varias razones. Las cápsulas
proveían de una cantidad ajustada y composición estable de ácidos grasos, las
cuales eran más convenientes que el incremento en el consumo de pescado, porque
éstas pueden ser administradas fácilmente como suplemento dietético. Además los
suplementos que contienen aceite de pescado proveen cantidades equivalentes de
EPA y DHA tanto como el pescado graso, el cual es igualmente efectivo al
Diseño y Metodología
61
enriquecer los lípidos sanguíneos como los ácidos grasos de cadena larga PUFA
[146]. La composición de cada cápsula de placebo (HOSO) y de Marinol TM
C-38
de las dos dietas bajas en grasa del estudio se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Composición de las cápsulas de las dos dietas bajas en grasa del estudio.
Descripción Marinol TM
C-38 Placebo HOSO
Ácidos grasos g/100 g g/100 g
C14:0 5,0 -
C16:0 10,5 3,5
C16:1 4,5 -
C17:0 0,2 -
C18:0 2,5 3,4
C18:1 8,0 79,2
C18:2 1,0 11,8
C18:3 0,5 0,2
C20:0 0,2 0,3
C20:1 1,1 0,3
C22:0 0,2 0,9
C24:0 0,2 0,3
C20:5 24,0 -
C22:6 17,5 -
Tocoferol natural 3,0 mg 3,0 mg
Antes de iniciar el periodo de intervención dietética (Pre-intervención), en
el punto medio del estudio (semana 6) y al finalizar el mismo (semana 12), todos
los voluntarios completaron un diario de consumo de alimentos durante 3 días
consecutivos en los que había que incluir pesos específicos de cada alimento
ingerido y un cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos, que permitía la
identificación de posibles errores en la ingesta, lo que permitía su corrección. Al
inicio del periodo de intervención dietética, se les facilitó a los pacientes un
manual con los diferentes alimentos que podrían consumir según la dieta a la que
habían sido asignados. Además, la especialista en nutrición les asesoró sobre los
alimentos que podían consumir fuera del hogar, los cuales debían ser registrados
en el manual proporcionado con el fin de detectar incidencias en la alimentación.
Se les proporcionó alimentos a los voluntarios cada dos semanas a lo largo de todo
Diseño y Metodología
62
el estudio. Durante la visita para la recogida de alimentos, se les pidió que hicieran
un recordatorio de 24 horas (de los alimentos que habían consumido el día
anterior), que fue evaluado con un sistema de puntos según los alimentos
consumidos. Además, dicha visita también sirvió para motivar a los voluntarios y
así detectar posibles errores en el cumplimiento de las pautas de alimentación. Con
el fin de analizar los alimentos consumidos durante las 12 semanas de duración del
estudio de intervención dietética se utilizó el programa informático “Dietsource”,
version 2.0.
Figura 7. Diseño del estudio Lipgene
Dieta LFHCC n-3
38 % grasa, 15% proteína, 47% HC
16% SFA, 12 % MUFA, 6% PUFA
EPA y DHA total :1.24 g/d
CMSP=20 T.A.=10
Comida LFHCC n-3
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
(1.24 g/d de PUFA)
Intervención dietética
Comida HSFA
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Dieta HSFA
38 % grasa, 15% proteína, 47% HC
16% SFA, 12 % MUFA, 6% PUFA
CMSP=17 T.A.=8
Comida LFHCC
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Dieta LFHCC
38 % grasa, 15% proteína, 47% HC
8% SFA, 11 % MUFA, 6% PUFA
CMSP=20 T.A.=12
Comida HMUFA
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Dieta HMUFA
38 % grasa, 15% proteína, 47% HC
8% SFA, 20 % MUFA, 6% PUFA
CMSP=18 T.A.=9
Post-intervención
Sobrecarga grasa
Estudio
postprandial12 semanas
MuestrasCMSP: ayunas (0h) y postprandio (2h y 4h)T.A.: ayunas (0h) y postprandio (4h)
Muestras CMSP: ayunas (0h) y postprandio (2h y 4h)T.A.: ayunas (0h)
Comida LFHCC n-3
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
(1.24 g/d de PUFA)
Comida HSFA
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Comida LFHCC
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Comida HMUFA
65% grasa, 10%
proteína y 25% HC
Pre- intervención
Sobrecarga grasa
Estudio
postprandial
Diseño y Metodología
63
2.2. Estudio del postprandio
El estudio postprandial se llevó a cabo al inicio del estudio (Pre-
intervención) y una vez finalizadas 12 semanas de intervención dietética (Post-
intervención) (Figura 7). Los pacientes consumieron una sobrecarga grasa en
forma de comida que reflejaba la misma composición que la dieta a la que cada
individuo fue asignado en el periodo de intervención dietética, y que estaba
compuesto por 0,7 g de grasa/kg de peso, 5 mg de colesterol/kg de peso y 60.000
IU/m2 por área de superficie corporal de Vitamina A, con la siguiente distribución
calórica: 65% de grasa, 10% de proteína y 25% de hidratos de carbono. Los
pacientes acudieron a nuestra Unidad a las 8:00 horas de la mañana, en ayunas, en
el caso de fumadores, sin haber fumado desde el día anterior y con una abstinencia
alcohólica de al menos 7 días antes de la toma de muestras. Las extracciones
sanguíneas y obtención de las muestras de tejido adiposo subcutáneo en el tiempo
basal, se realizaron tras 12 horas de ayuno y antes de tomar el desayuno. Después
de la sobrecarga grasa se realizaron extracciones de sangre a las 2 y 4 horas y
obtención de muestra de tejido adiposo de la región abdominal a las 4 horas del
postprandio. Las muestras de tejido adiposo subcutáneo en estado postprandial
fueron obtenidas de un subgrupo de 39 voluntarios. Durante el periodo
postprandial los participantes no consumieron más alimentos, aunque sí pudieron
tomar agua. En la Figura 7 se muestra un esquema que resume el diseño del
estudio LIPGENE.
La composición en grasa para el estudio de lipemia postprandial fue la
siguiente:
A. Comida rica en SFA (HSFA): 38% SFA, 21% MUFA y 6% PUFA, a
expensas de mantequilla, leche entera, pan blanco y huevos.
B. Comida rica en MUFA (HMUFA): 12% SFA, 43% MUFA y 10%
PUFA, a expensas de aceite de oliva, leche desnatada, pan blanco, huevos, yema
de huevos y tomates.
Diseño y Metodología
64
C. Comida baja en grasa y alta en HC complejos con placebo (LFHCC):
21% SFA, 28% MUFA y 16% PUFA (con 1 g de aceite de girasol alto en ácido
oleico), a expensas de mantequilla, aceite de oliva, leche desnatada, pan blanco,
huevos, yema de huevos y nueces.
D. Comida baja en grasa y alta en HC complejos, suplementado con
Marinol ™ C-38 (LFHCC n-3): 21% SFA, 28% MUFA y 16% PUFA (con 1,24
g de PUFA n-3 de cadena larga y de origen marino), a expensas de mantequilla,
aceite de oliva, leche desnatada, pan blanco, huevos, yema de huevos y nueces.
Diseño y Metodología
65
3. DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS
3.1. Extracciones sanguíneas
Fueron extraídas muestras de sangre de los 75 voluntarios antes del inicio
del periodo de intervención dietética (Pre-intervención), en ayunas, a las 2 y a las
4 horas después de la administración de la sobrecarga grasa. Para el estudio de
lipemia postprandial, se recogieron muestras después de las 12 semanas de
intervención dietética en ayunas, a las 2 y a las 4 horas después de la
administración de la sobrecarga grasa. Las muestras fueron recogidas en tubos que
contenían 1 mg/dL de ácido etilendiamino-tetracético (EDTA) para evitar la
oxidación de las lipoproteínas y como anticoagulante, fueron depositadas en
contenedores con hielo y mantenidas en oscuridad.
3.2. Aislamiento del plasma
Inmediatamente después de la extracción sanguínea se procedió a la
separación del plasma mediante centrifugación (1500 g por 15 min a 4 ºC). Las
muestras de plasma se alicuotaron y fueron guardadas a -80 ºC hasta la realización
de las determinaciones, para evitar las variaciones inter-ensayo.
3.3. Análisis lipídico
La concentración de las diferentes variables lipídicas fue determinada
utilizando un autoanalizador modular (DDPPII Hitachi; Roche, Basel,
Switzerland), con reactivos específicos suministrados por Boehringer-
Mannheim. El colesterol total, los TG y las fracciones lipoproteicas fueron
determinados mediante procedimientos enzimáticos [147, 148]. El c-HDL se
determinó analizando el sobrenadante obtenido tras la precipitación de una
alícuota con dextrano sulfato-Mg2+ [149]. Los niveles de c-LDL se determinaron
mediante la fórmula de Friedewald [150] basada en las concentraciones de
colesterol total, TG y c-HDL.
Diseño y Metodología
66
Los métodos de determinación de biomarcadores de estrés oxidativo tales
como H2O2, hidroperóxidos totales, LPOs (lipoperóxidos) y proteínas carboniladas
en plasma fueron descritas previamente por Pérez-Martínez et al [11].
3.4. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)
Muestras sanguíneas de 15 mL fueron diluidas 1:2 (v/v) en tampón fosfato
salino (PBS) y fueron separadas en un gradiente de Ficoll (solución de aislamiento
de CMNs, Rafer) por centrifugación a 2000 g por 30 min. La capa de células
mononucleares fue recogida y lavada dos veces en PBS a 1800 rpm, 10 min a 4
ºC. Seguidamente, las células se resuspendieron en “Buffer A” (10 mM ácido N-2
hidroxietil-piperazin-N’-2-etanosulfónico (HEPES) [pH=7.8], 15 mM KCl, 2 mM
MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol (DTT) y 1 mM phenylmethanesulfonyl
fluoride (PMSF)) para la posterior extracción de las proteínas y en TRIZOL
(Tri®Regeant, Sigma, St Louis, MO) para el aislamiento del ARN. Una vez
finalizados estos pasos, todas las muestras se guardaron congeladas a -80 ºC.
3.4.1. Extracción de ARN de células mononucleares de sangre periférica
(CMSP)
Se extrajo ARN total de células mononucleares obtenidas de las muestras
de sangre en ayunas, a las 2 y 4 horas pre- y post-intervención utilizando el kit TRI
Reagent (Sigma, St Louis, Mo, USA) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN extraído se cuantificó usando Nanodrop ND-1000 v3.5.2
spectrophotometer (Nanodrop Technology®, Cambridge, UK). La integridad del
ARN se midió en geles de agarosa.
3.4.2. Eliminación del ADN de interferencia y digestión de ADN
Para eliminar la posible contaminación de las muestras de ARN con ADN
genómico, se utilizó el kit AMP-D1 (Sigma, St Louis, Mo, USA), el cual consiste
en el uso de una endonucleasa que digiere ADN de cadena sencilla y doble. A 1
g de ARN diluido en H2O libre de ARNsas se le añadió 1 L del Reaction Buffer
al 10X (0,2 M Tris-HCl a pH=8,3; 0.020 M MgCl2) y 1 L de la enzima DNAsa I
Diseño y Metodología
67
(1 unidad/L en 50 % glicerol, 0,010 M Tris-HCl a pH 7,5; 0,010 M CaCl2 y 0,010
M MgCl2). Se incubó durante 45 min a 30 ºC y luego se añadió 1 L de Stop
solution (0,050 M EDTA) para inactivar la enzima DNAsa I. Las muestras se
calentaron 10 min a 70 ºC para inactivar la DNAsa I y se pusieron en hielo para, a
continuación, realizar la transcripción inversa.
3.4.3. Transcripción inversa
Para obtener ADNc a partir de la muestra de ARN de CMSP se utilizó el
kit de retrotranscripción (RT) High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
with RNAse inhibitor (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del
fabricante para la preparación de las mezclas de reacción a un volumen final de 20
µL y partiendo de 2 µg de ARN total por muestra. Cada una de las mezclas se
preparó en tubos estériles libres de RNAsas, DNAasa y DNA exógeno. La
reacción de RT se llevó a cabo utilizando el termociclador iQ5 iCycler (Bio-Rad)
con el siguiente protocolo:
25 ºC por 10 min.
37 ºC por 120 min.
85 ºC por 5 min.
Se guardaron las muestras con el ADN copia (cDNA) a -80 ºC, hasta
llevar a cabo la PCR a tiempo real.
3.5. Obtención de muestras de tejido adiposo
Las muestras de tejido adiposo subcutáneo de un subgrupo de 39
voluntarios (14 hombre y 25 mujeres) se obtuvieron desde la región abdominal
lateral superficial hasta el ombligo con el instrumento Bard ® Magnum
(MG1522), agujas Bard Magnum ® Core (MN1410) (Sales M & I Medical, Inc.,
Miami, Florida, EE.UU.). Las muestras de tejido adiposo se obtuvieron en ayunas
antes del inicio del periodo de intervención dietética (Pre-intervención). Para el
estudio de la función postprandial adipositaria, se recogieron muestras en ayunas
al inicio del estudio y después de 12 semanas de la intervención dietética, así como
Diseño y Metodología
68
a las 4 horas después de la administración de la sobrecarga grasa administrada
después de las 12 semanas de intervención dietética y se almacenaron a -80 ºC.
3.5.1. Extracción del ARN de tejido adiposo
El tejido adiposo se homogeneizó mediante Ultra-Turrax T25 (IKA
Labortechnik). Tras la retirada de los lípidos de la parte superior del tubo, se aisló
el ARN con el kit comercial RiboPure kit (Ambion) que está diseñado para una
purificación de ARN rápida y de alta calidad. El ARN se recogió de la fase acuosa
mediante unión a un filtro de fibra de vidrio. La cuantificación del ARN se realizó
usando el espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 v3.5.2 spectrophotometer
(Nanodrop Technology®, Cambridge, UK).
3.5.2. Transcripción inversa
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) tras la amplificación y
retrotranscripción se llevó a cabo utilizando el kit comercial Message BOOSTER
cDNA Synthesis Kit para qPCR (Epicentre, EE.UU.), siguiendo las instrucciones
del fabricante. Se amplificó 500 pg de ARN total que luego se convirtió en ADNc.
Se ajustó la cantidad de reacción a 20 μl. Las condiciones de incubación utilizados
en el termociclador MJ Thermal Cycler Personal mini ™ closure (BioRad Inc.,
Hercules, CA, EE.UU.) fueron:
25 ºC por 5 min.
42 ºC por 30 min.
85 ºC por 5 min.
Se guardaron las muestras con el ADN copia (cDNA) a -80 ºC, hasta
llevar a cabo la PCR a tiempo real.
Diseño y Metodología
69
3.6. Análisis de la expresión génica mediante qRT-PCR semicuantitativa
en tiempo real mediante la plataforma OpenArray Real-Time PCR (Applied
Biosystems).
La reacción de PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando la plataforma
OpenArray™ NT Cycler System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Este
sistema de análisis de expresión génica utiliza como método para cuantificación
las sondas TaqMan. Por otra parte se basa en la característica de multireacción
(2088 reacciones por array) y multiarray (2 arrays por carrera). Esto permite
estudiar una mayor cantidad de genes en una mayor cantidad de muestras, en un
menor tiempo y menor consumo de reactivos.
Se utilizó el formato de array TaqMan® OpenArray® RT PCR Inventoried
Format 56, el cual permite el análisis de 53 genes de interés, más 3 genes
constitutivos en grupos de 24 muestras por duplicado. Considerando que cada
array se configura en un formato 12 X 4, para un total de 48 subarrays. En cada
subarray se encuentran 64 pocillos para un total de 3.072 pocillos de reacción y en
los que se encontrarían los cebadores específicos para cada uno de los genes de
interés. Los cebadores que amplificarían los genes de interés fueron seleccionados
de la base de datos TaqMan Gene expression assays (Applied Biosystems,
Carlsbad, CA, USA):
https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&
catID=601267, en la ficha assays search teniendo como criterios de búsqueda:
selección en homo sapiens y gene expression assays para cada uno de los genes de
interés que se detallan a continuación:
CMSP
La expresión relativa para cada gen, fue calculada utilizando el gen
constitutivo GADPH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Los genes
analizados fueron: NFE2L2 (nuclear factor erythroid-derived 2-like 2), SOD1
(superoxide dismutase 1), SOD2 (superoxide dismutase 2), CAT (catalase), GPx1
(glutathione peroxidase 1), GPx4 (glutathione peroxidase 4), GSR (glutathione
Diseño y Metodología
70
reductase), TXN (thioredoxin) and TXNRD1 (thioredoxin reductase 1), las
subunidades de la NADPH oxidasa (gp91phox
, p22phox
, p47phox
, p67phox
and p40phox
)
y el factor de transcripción PU.1.
Tejido adiposo
La expresión relativa para cada gen, fue calculada utilizando el gen
constitutive RPLP0 (ribosomal protein, large, P0). Los genes analizados fueron:
NFE2L2 (nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2), KEAP1 (kelch-like ECH-
associated protein 1), SOD1 (superoxide dismutase 1), SOD2 (superoxide
dismutase 2), CAT (catalase), GPx1 (glutathione peroxidase 1), GPx3 (glutathione
peroxidase 3), GPx4 (glutathione peroxidase 4), GSR (glutathione reductase), TXN
(thioredoxin), TXNRD1 (thioredoxin reductase 1) y las subunidades de la NADPH
oxidasa (gp91phox
, p47phox
, p67phox
and p40phox
) y el factor de transcripción PU.1.
Cada reacción constaba de 1,2 µL de cDNA 1:2 (v/v) mezclado con 3,8 µL de
GeneAmp Fast PCR Master mix (2,5 µL ABI Gene Amp Master Mix, 1 µL Remix,
0,30 µL de Agua MQ). Las muestras fueron cargadas en el array utilizando el
OpenArray™ NT Autoloader siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada
subarray se cargó con aproximadamente 5 µL de mezcla de reacción, es decir cada
uno de los pocillos del subarray contendría 33 nL de volumen total.
3.6.1. Análisis de la expresión génica
Los valores de CT obtenidos para cada uno de los genes y en cada una de
las muestras se obtuvieron mediante el software OpenArray® Real-Time qPCR
Analysis Software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) para obtener los
datos de expresión relativa. Este mismo programa permitió la selección del gen
constitutivo con menor variabilidad entre las muestras procesadas para
posteriormente utilizarlo en la normalización de la expresión de los genes
estudiados.
Diseño y Metodología
71
3.7. Análisis Proteómico Bidimensional (2D-PAGE)
3.7.1. Extracción de proteínas de CMSP
Los extractos proteicos de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de
CMSP, fueron obtenidas siguiendo el procedimiento descrito previamente por
Hernández-Presa et al [151]. Las muestras se descongelaron en hielo durante 15
minutos, se agitaron en vórtex durante 20 minutos y se centrifugaron a 15.000 x g
durante 5 min a 4 ºC, la fracción citoplasmática se recogió del sobrenadante y se
almacenaron a -80 ºC. El pellet se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis C (20
mM HEPES, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM
DTT, 10 mg/ml CLAP) y se incubó en hielo durante 20 minutos. Las muestras se
agitaron en vórtex cada 5 minutos durante 30 segundos a lo largo del período de
incubación. Posteriormente se centrifugó a 10.000 x g, durante 5 min a 4 ºC. Se
recogieron las proteínas nucleares del sobrenadante obtenido y se almacenaron a -
80 ºC. Las proteínas extraídas se cuantificaron por el método de Bradford
utilizando Dye Reagent Protein (Bio-Rad Laboratories, Inc., Herucles, CA, USA)
según las instrucciones del fabricante.
3.7.2. Electroforesis Bidimensional
Se seleccionaron 6 sujetos por dieta en cada fracción (citoplasma y núcleo)
para realizar la electroforesis bidimensional (2D-PAGE) en geles de
poliacrilamida, se llevó a cabo según el procedimiento descrito por Görg, et al
[152]. Para eliminar sales y restos celulares contaminantes que pudieran existir
tras el aislamiento, las muestras de proteínas se purificaron con el kit Ready Prep
2-D Cleanup Kit siguiendo las instrucciones del fabricante. El Isoelectroenfoque
(IEF) se realizó en tiras de 11cm pH 3-10 con gradiente de pH lineal inmovilizado
(IPG). Cada tira se rehidrató durante la noche con 200 µg de proteína en 200 µL
de tampón de rehidratación (urea 8 M, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% Bio-Lyte
3/10 anfólito y 0,002% azul de bromofenol). El IEF se realizó en un Protean IEF
Cell (Bio-Rad Laboratories) bajo las siguientes condiciones: Rampa Lenta, 250 V
(15 min), 8000 V (5 h, de gradiente lineal), 8000 V hasta 26.000 Vh, para un total
Diseño y Metodología
72
de 40.000 Vh. Después de IEF, las tiras se incubaron 10 min en tampón de
equilibrio I [6 M de urea, 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8, 2% SDS, 20% de glicerol,
2% (w / v) TDT] y luego por otros 20 minutos en tampón de equilibrio II [6 M de
urea, 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 2% de glicerol, 2,5% (w / v) yodoacetamida].
Antes de la SDS-PAGE los Geles Criterion XT Precast Bis-Tris al 12% de 1 mm
de espesor se montaron en una Criterion Dodeca Cell y se ejecutó la separación de
proteínas en tampón MOPS al 1X a 180V.
Los geles fueron teñidos durante la noche en la oscuridad con SYPRO Ruby
y la fijación de las proteínas se llevó a cabo en metanol al 40% y ácido acético al
10% durante 2 h. Antes de la adquisición de imágenes, los geles se lavaron en
metanol al 40% y ácido acético al 10%, 2 veces durante 1 h y una vez en agua
destilada durante 30 minutos.
3.7.3. Adquisición de imágenes y detección de spots
Los geles teñidos con SYPRO Ruby se visualizaron con luz UV a través del
sistema ChemiDocs XRS (Bio-Rad Laboratories). Las imágenes fueron adquiridas
mediante el software Quantity One 16.0 (Bio-Rad Laboratories). Los spots se
detectaron con el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories). Los parámetros
de detección de spots fueron los siguientes: Sensibilidad de detección = 6,0,
Tamaño de la escala = 5, Promedio máximo = 2000, Sensibilidad de filtro para
speakles = 70,0, Suavidad: tipo de filtro = medio, tamaño = 3x3, método Floating
ball y radio de fondo = 67, radio de líneas verticales y horizontales = 111. El
método de normalización elegido fue la cantidad total de spots válidos. Las
imágenes de los geles de 6 sujetos por cada dieta del tiempo Pre 0 (en ayunas antes
del inicio de periodo de intervención dietética) se compararon con las imágenes
correspondientes al tiempo Pre 4 (en estado postprandial antes del inicio de
periodo de intervención dietética).
Diseño y Metodología
73
3.7.4. Recorte de proteínas del gel, digestión enzimática e identificación por
Espectrometría de Masas MALDI-TOF-TOF
Los spots se picaron automáticamente en una estación Pro-Pic (Genomic
Solutions, Huntingdon, UK) y sometidos a análisis de espectrometría de masas
(MS). Para el análisis MALDI-TOF-MS, los geles fueron desteñidos 2 veces (30
min a 37 ºC) con 200 mM de bicarbonato de amonio/acetonitrilo al 40%. Los
fragmentos de gel deshidratados durante 5 min con acetonitrilo puro y secados
durante 4 h, fueron automáticamente digeridos con tripsina de acuerdo con los
protocolos estándar en una estación ProGest (Gnomic Solutions). El análisis MS y
MS/MS de los péptidos obtenidos se llevaron a cabo en una Proteomics Station
4700 (Applied Biosystems, CA, USA). La espectrometría de masas MALDI TOF /
TOF de las proteínas seleccionadas se realizó en el Servicio Centralizado de
Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Córdoba, el cual pertenece
al Nodo 6 del Consorcio ProteoRed financiado por Genoma España y forma parte
de la Plataforma Andaluza de Genómica, Proteómica y Bioinformática.
3.7.5. Análisis de las rutas metabólicas afectadas por el tipo de grasa en la
comida ingerida
Con el fin de investigar las relaciones funcionales en el conjunto de
proteínas expresadas diferencialmente, se utilizó el software Ingenuity Pathway
Analysis (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA.) [153], que emplea una
base de conocimiento predefinido, la cual contiene más de 10.000 genes humanos.
El análisis de redes dio como resultado 15 subredes diferentes. De las 10 proteínas
expresadas diferencialmente que se observaron tras la ingesta de la comida HSFA,
2 proteínas (PSME1, ZFP2) fueron descartadas para el análisis de redes, el cual
proporcionó 6 subredes. Respecto a la comida HMUFA, de las seis proteínas, dos
de ellas (CCDC150, Serpin B1) fueron descartadas para el análisis de redes que
proporcionó 4 subredes. Para la comida LFHCC, de las cinco proteínas, dos de
ellas (HSPA6, MYL12A) fueron descartadas y se obtuvieron 3 subredes. Para la
comida LFHCC n-3, de las cinco proteínas, tres proteínas (ALDH2, CAPZB y
Diseño y Metodología
74
ECH1) fueron descartadas y el análisis proporcionó 2 subredes. Posteriormente,
construimos dos redes fusionando aquellas subredes que compartían una o más
proteínas.
3.8. Validación de experimentos por Western Blot
3.8.1. Validación de los resultados de la proteómica
Los anticuerpos comerciales utilizados para la validación de los
experimentos de Western blot fueron suministrados por Santa Cruz Biotechnology,
Inc (Santa Cruz, CA, USA.). Se cargaron 40 μg de proteína tanto de la fracción
citoplasmática como de la nuclear de cada sujeto (8 pacientes que consumieron la
comida HSFA, 9 pacientes que consumieron la HMUFA, 12 pacientes que
consumieron la comida LFHCC y 10 pacientes que consumieron la comida
LFHCC n-3) en geles de SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas
de nitrocelulosa, las cuales fueron bloqueadas con solución trisbuffered salino al
1X y Tween 20 (TBS-T) que contiene 2% de albúmina de suero bovino, seguido
de incubación con los anticuerpos primarios diluido en TBS-T en las
concentraciones indicadas por el fabricante: Trombospondin 1/2 (H-300: rabbit
polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, inc.), NAP1L1 ((2609C3a): mouse
monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, inc.), HSP706 (C-17: goat polyclonal,
Santa Cruz Biotechnology, inc.), Ezrin (H-276: rabbit polyclonal, Santa Cruz
Biotechnology, inc.), Plectin 1 (H-80: rabbit polyclonal, Santa Cruz
Biotechnology, inc.), Septin 2 (N-12: goat polyclonal, Santa Cruz Biotechnology,
inc.), Myosin (MRCL3/MRLC2/MYL9) (E-4: mouse monoclonal, Santa Cruz
Biotechnology, inc.). Después del lavado, las membranas se incubaron con el
anticuerpo secundario IgG-HRP conjugado apropiado. Las membranas se
incubaron durante 2 min con SuperSignal West Pico sustrato ECL (Thermo
Scientific) para la detección de la proteína. Las imágenes fueron adquiridas en un
Molecular Imager ChemyDoc XRS (Bio-Rad Laboratories), y el análisis de la
densidad de banda se llevó a cabo con QuantityOne software V (Bio-Rad
Diseño y Metodología
75
Laboratories). La intensidad de la señal de las bandas se normalizó por la proteína
total en las membranas, que se midió por el método de tinción de Ponceau S.
3.8.2. Determinación de niveles de proteínas NFE2L2 Y KEAP1 en CMSP
mediante Western Blot
Se seleccionaron 10 sujetos por dieta, a excepción de los sujetos de la
dieta HSFA, de los cuales utilizamos muestras de 6 sujetos pertenecientes al grupo
de la dieta HSFA, debido a la mala calidad de las muestras. Para el Western Blot
se utilizaron tanto extractos citosólicos como nucleares. Se cargaron 40 μg de
proteína tanto de la fracción citoplasmática como de la nuclear. Se realizo una
electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida (14% poliacrilamida) para
conseguir una mejor separación de las proteínas citoplasmáticas y geles
prediseñados Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gels (10% poliacrilamida) de
BioRad para proteínas nucleares. Las proteínas se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa (BioTrace NT Membrane; PALL Gelman Laboratory) mediante
transferencia semi-seca. Las membranas se tiñeron con Ponceau-S para verificar la
correcta transferencia de las proteínas y fueron escaneadas con el fin de cuantificar
la proteína total cargada. Posteriormente, las membranas fueron lavadas tres veces
con TTBS durante 15 min cada uno y bloqueadas con BSA al 3%. Se incubaron en
agitación a 4 ºC durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: diluido
en TTBS solamente (para eliminar mejor restos de BSA) en concentraciones
indicadas por el fabricante: NFE2L2 (C-20: rabbit polyclonal, Santa Cruz
Biotechnology, inc.), Keap1 (H-190: rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotechnology,
inc.), TFIIB (C-18: rabbit polyclonal, Santa Cruz Biotechnology, inc.) y -actina
(C-2: mouse monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, inc.). Posteriormente se
procedió a la incubación con los anticuerpos secundarios IgG-HRP conjugado
apropiado, en TTBS solamente. Las muestras se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente y en agitación. Tras esta incubación se procedió al lavado de
la membrana: tres veces con TTBS durante 15 min cada uno. Para el revelado se
usó un kit de quimioluminiscencia (Immun-StarTM
WesternCTM
) con el cual se
Diseño y Metodología
76
incubaron las membranas durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación,
las membranas se revelaron con el CHEMI DOC XRS (BIORAD, Barcelona,
España), que realiza fotografías a las membranas a distintos tiempos de
incubación. Los niveles de proteínas fueron cuantificados mediante el programa
Image Lab TM
versión 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Los resultados se
expresaron en unidades arbitrarias (UA).
3.9. Análisis estadístico
El programa estadístico utilizado fue el PASW Statistics, Versión 18
(Chicago, IL, USA). La distribución normal de las variables se evaluó mediante la
prueba de Kolmogorov-Smirnov, siendo transformadas logarítmicamente todas
aquellas variables que no cumplían los criterios de normalidad. Con el fin de
detectar variaciones significativas entre grupos se realizó un test de t de Student y
un análisis de la varianza para medidas repetidas (ANOVA) seguido de la
corrección de Bonferroni para las comparaciones múltiples. En este último
análisis, estudiamos el efecto de la dieta o la sobrecarga grasa en el estudio
postprandial administrada independientemente del tiempo (representado como P1
dieta); el efecto del tiempo y también los cambios de esta variable después del
periodo de intervención dietética y la sobrecarga grasa del estudio sobre el periodo
postprandial (representado como P2 tiempo). Además, se estudió el efecto de la
interacción entre las distintas dietas consumidas y el tiempo, lo cual es indicativo
de la magnitud de la respuesta postprandial de cada sobrecarga grasa (representado
como P3 interacción dieta-tiempo). El contraste estadístico usado cuando el
criterio de esfericidad no se cumplía fue el de Greenhouse Geisser. Además, para
determinar la correlación existente de los biomarcadores de estrés oxidativo,
lípidos plasmáticos y datos de expresión génica se usó el coeficiente de
correlación lineal de Pearson. Las variables tales como las características
antropométricas y los parámetros lipídicos basales y niveles postprandiales de las
proteínas NFE2L2 y KEAP1 (citoplasma y núcleo) fueron analizadas mediante
ANOVA de un factor para determinar el efecto de la dieta. Se consideraron
Diseño y Metodología
77
significativos los valores de P<0,05. Los datos en el texto, las tablas y las figuras
están expresados como mediaerror estándar de la media. El análisis en geles 2-D
se llevó a cabo por el software de PDQuest (Bio-Rad Laboratories), versión 8.0.
Se llevaron a cabo correcciones manuales para validar los emparejamientos
generados automáticamente por el software. Los valores del volumen de los spots
se normalizaron en cada gel, dividiendo la cantidad en bruto de cada spot por el
volumen total de todos los spots incluidos en el mismo gel. Otras normalizaciones
proporcionadas por el software PDQuest también se llevaron a cabo con resultados
similares. Las variaciones de todos los spots identificados fueron finalmente
confirmadas y cuantificadas mediante medidas de densidad utilizando el software
ImageJ 1,40 g.
VI. RESULTADOS
Resultados
81
1. CARACTERÍSTICAS DE LOS PACIENTES
Las características antropométricas y los parámetros lipídicos basales de
los pacientes que participaron en el estudio se muestran en la Tabla 5. No se
observaron diferencias estadísticamente significativas entre los 4 grupos asignados
a las distintas dietas.
Tabla 5. Características basales de los pacientes con SMet que completaron el estudio. Los valores están expresados como mediaerror estándar de la media. Los valores de P
corresponden al análisis ANOVA de un factor.
HSFA (n=17) HMUFA
(n=18) LFHCC (n=20)
LFHCC n-3
(n=20) P
Edad 58,6±1,9 54,6±1,9 56,4±1,9 55,3±1,5 0,435
IMC (kg/m2) 35,3±0,9 34,5±0,9 35,4±0,7 35,0±0,8 0,856
PC (cm) 110,9±2,1 106,4±1,9 107,9±2,3 108,9±1,9 0,507
CT (mg/dL) 200,0±9,9 189,1±7,0 207,2±10,4 189,5±8,0 0,405
TG total (mg/dL) 171,1±33,3 143,7±13,4 144,5±13,0 138,4±14,3 0,654
LDL-c (mg/dL) 136,1±7,7 131,6±5,7 147,6±8,6 131,5±7,7 0,374
HDL-c (mg/dL) 43,2±2,5 44,6±2,4 44,6±2,3 42,1±1,9 0,834
Glucosa (mg/dL) 109,9±3,9 112,3±4,5 102,8±2,3 117,8±7,2 0,173
IMC: índice de masa corporal PC: perímetro de cintura
CT: colesterol total TG: triglicéridos
LDL-c: colesterol vehiculizado por lipoproteínas de baja densidad
HDL-c: colesterol vehiculizado por lipoproteínas de alta densidad.
2. EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDO ADIPOSO. EFECTO DEL
CONSUMO A LARGO PLAZO DE CUATRO MODELOS DE DIETAS
CON DIFERENTE CANTIDAD Y TIPO DE GRASA
En este estudio hemos analizado el efecto del consumo a largo plazo de
cuatro dietas con diferente cantidad y tipo de grasa (HSFA, HMUFA, LFHCC y
LFHCC n3) administradas durante 12 semanas en la expresión, tanto en ayunas
como en estado postprandial, de genes involucrados en el estrés oxidativo en el
tejido adiposo de un subgrupo de 39 pacientes con SMet. Para llevar a cabo el
estudio postprandial, tras el periodo de intervención dietética, se administró una
Resultados
82
sobrecarga grasa en forma de una comida con la misma composición grasa que la
dieta a la que cada individuo fue asignado.
2.1. Efecto de la dieta en la expresión génica de las subunidades de la
NADPH-oxidasa en tejido adiposo.
En primer lugar, se analizo la expresión génica del factor de transcripción
PU.1 y las subunidades de la NADPH-oxidasa (gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47pho
x y
p40phox
), un complejo enzimático que cataliza la producción de anión superóxido
(O2•−
) y está localizado en la membrana plasmática de células fagocíticas
(neutrófilos, eosinófilos, monocitos y macrófagos), aunque también se encuentra
en las células no fagocíticas del tejido adiposo [18, 19].
El consumo a largo plazo de la dieta HSFA aumentó los niveles en ayunas
del ARNm de las subunidades gp91phox
, p67phox
y p47phox
(P=0,042, P=0,011 y
P=0,019, respectivamente). El consumo a largo plazo de la dieta HMUFA
aumentó los niveles en ayunas del ARNm de p22phox
, p67phox
, y p47phox
(P<0,001,
P<0,001 y P=0,009, respectivamente), mientras que la ingesta de la dieta LFHCC
incrementó los niveles en ayunas del ARNm de p22phox
(P=0,021), y la dieta
LFHCC n-3 aumentó los niveles en ayunas del ARNm de p67phox
(P<0,001).
El análisis post hoc mostró que tras el periodo de intervención dietética, los
niveles en ayunas del ARNm de p22phox
tras el consumo de las dietas HUMFA
(P=0,027) y LFHCC (P=0,008) eran mayores que tras el consumo de la dieta
HSFA. Además, los niveles en ayunas del ARNm de p67phox
fueron mayores tras
la dieta LFHCC n-3 que tras la dieta LFHCC (P=0,020). Los resultados se detallan
en la Tabla 6.
Los niveles en ayunas del ARNm del factor de transcripción PU.1, no
fueron detectables.
Tabla 6. Niveles en ayunas de ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
y p40phox
en tejido
adiposo de pacientes con Síndrome Metabólico. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los niveles de ARNm en
estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
HSFA: dieta rica en grasa saturada; HMUFA: dieta rica en ácidos grasos monoinsaturados; LFHCC: dieta baja en grasa, alta en hidratos de
carbono complejos; LFHCCn-3: dieta baja en grasa y alta en hidratos de carbono complejos con 1,24 g / día PUFAn-3.
Datos analizados mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 39). Símbolos de las pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni:
los superíndices con distintas letras difieren significativamente, P<0,05. * significa efecto significativo del tiempo (P<0,05) dentro de la
dieta en comparación con el estado de ayuno previo a la intervención. & significa P<0,05 entre la dieta HSFA y la dieta indicada, las dos
determinaciones en ayunas en conjunto.
Dietas gp91 phox
p22 phox
p67 phox
p47 phox
p40 phox
Pre-
intervención
Ayunas (0h)
HSFA 0,032±0,007 0,034±0,006 0,018±0,004 0,008±0,002 0,063±0,010
HMUFA 0,067±0,014 0,051±0,008 0,007±0,001 0,008±0,002 0,064±0,012
LFHCC 0,108±0,010 0,073±0,007 0,030±0,008 0,016±0,004 0,071±0,007
LFHCC-n-3 0,136±0,025 0,057±0,009 0,016±0,003 0,022±0,005 0,094±0,017
Post-
intervención
Ayunas (0h)
HSFA 0,120±0,020 * 0,047±0,009 0,059±0,008
ab * 0,022±0,004
* 0,075±0,019
HMUFA 0,132±0,024 0,123±0,025 & *
0,064±0,017 ab
* 0,020±0,003
* 0,073±0,016
LFHCC 0,169±0,046 0,108±0,014 & *
0,032±0,005 a 0,026±0,004 0,066±0,007
LFHCC-n-3 0,131±0,034 0,066±0,016 0,088±0,020 b *
0,027±0,006 0,077±0,010
Valores P
Efecto Dieta 0,131 0,005 0,112 0,072 0,486
Efecto Tiempo 0,011 0,001 <0,001 <0,001 0,980
Interacción dieta-tiempo 0,398 0,055 0,006 0,476 0,622
Resultados
84
2.2. Efecto de la dieta en la expresión de genes relacionados con el sistema
de defensa antioxidante en tejido adiposo.
En este estudio hemos analizado la expresión de los genes implicados en
la defensa antioxidante SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx3, GPx4, GSR, TXN,
TXNRD1, así como de los genes reguladores NFE2L2 y KEAP1. En ausencia de
estrés, NFE2L2 se encuentra retenido por KEAP1 en el citoplasma [46-48], no
obstante en condiciones de estrés oxidativo, inicia el proceso por el que NFE2L2
se libera de KEAP1 y se transloca al núcleo [46], donde NFE2L2 se une a ARE y
activa la transcripción de genes antioxidantes encargados de la detoxificación y
eliminación de ROS [47, 48].
El consumo a largo plazo de las dietas HSFA (P=0,014), HMUFA
(P=0,006) y LFHCC (P=0,013) aumentaron los niveles en ayunas del ARNm de la
SOD1, mientras que los niveles en ayunas del ARNm de la enzima SOD2 tras el
consumo de la dieta HSFA eran mayores que tras el consumo de las demás dietas
administradas (HMUFA P<0,001, LFHCC P=0,013, y LFHCC P<0,001) (Tabla
7).
El consumo a largo plazo de la dieta LFHCC n-3 disminuyó los niveles en
ayunas del ARNm de CAT (P=0,007), mientras que el consumo de la dieta HSFA
provocó su aumento (P<0,001), de manera que el incremento tras el consumo de la
dieta HSFA, fue mayor que tras el consumo de las dietas HMUFA (P<0,001),
LFHCC (P=0,004) y LFHCC n-3 (P<0,001). Además, el análisis post hoc mostró
que tras la administración de la dieta HSFA, el aumento de los niveles en ayunas
del ARNm de CAT fueron mayores que tras las dietas HMUFA, LFHCC y
LFHCC n-3 (todas P<0,001) (Tabla 7).
El consumo a largo plazo de las cuatro dietas aumentó los niveles del
ARNm en ayunas de la glutatión peroxidasa 1 (GPx1) (todas P<0,001). Sin
embargo, el aumento de los niveles en ayunas del ARNm de GPx1 fue mayor tras
el consumo de la dieta HSFA que tras el consumo de la dietas HMUFA (P=0,006),
LFHCC (P=0,006) y LFHCC n-3 (P=0,039). Los niveles en ayunas del ARNm de
Resultados
85
GPx3, una isoforma extracelular de la glutatión peroxidasa, aumentaron tras el
consumo a largo plazo de la dieta HSFA (P<0,001), de manera que este
incremento fue mayor que tras el consumo de las dietas HMUFA, LFHCC y
LFHCC n-3 (todas P<0,001). El análisis post hoc mostró que tras el periodo de
intervención dietética, los niveles en ayunas del ARNm de GPx3 eran mayores tras
el consumo de la dieta HSFA que tras el consumo de las dietas HMUFA
(P=0,002), LFHCC y LFHCC n-3 (ambas, P<0,001). El consumo a largo plazo de
la dieta HSFA disminuyó los niveles en ayunas del ARNm de GPx4, una
peroxidasa lipídica (P<0,001), mientras que se mantuvo sin cambios tras el
consumo de las demás dietas (Tabla 7).
El consumo a largo plazo de la dieta HSFA aumentó los niveles en ayunas
del ARNm de TXNRD1 (P<0,001), de manera que éstos fueron mayores que los
observados tras el consumo de las dietas HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3 (todas,
P<0,001) (Tabla 7). No se encontraron diferencias significativas en los niveles en
ayunas del ARNm de los genes TXN, NFE2L2 y KEAP1 tras el consumo de
ninguna de las cuatro dietas (Tabla 7).
Los niveles en ayunas del ARNm de GSR, no fueron detectables.
Tabla 7. Niveles en ayunas de ARNm de NFE2L2, Keap1, SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx3, GPx4, TXN, and TXNRD1 en tejido
adiposo de pacientes con Síndrome Metabólico. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los niveles de ARNm en
estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
DIETA valores P
Genes HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n-3 Efecto dieta Efecto tiempo Efecto dieta-tiempo
Keap1 Pre 0,12±0,02 0,06±0,01 0,11±0,02 0,15±0,04
0,539 0,209 0,108 Post 0,16±0,04* 0,16±0,05* 0,10±0,01* 0,13±0,03
NFE2L2 Pre 3,04±0,38 2,68±0,38 2,92±0,53 3,82±0,46
0,188 0,721 0,727 Post 2,34±0,49* 3,18±0,63* 2,86±0,32* 3,55±0,59
SOD1 Pre 0,60±0,18 0,70±0,13 0,85±0,16 1,09±0,21
0,959 <0,001 0,657 Post 1,74±0,54* 1,93±0,43* 1,79±0,34* 1,63±0,41
SOD2 Pre 1,75±0,36 0,89±0,17 1,21±0,21 1,16±0,30
<0,001 0,120 0,072 Post 3,17±0,74 a 0,95±0,12 b 1,80±0,29 b 0,66±0,08 b
CAT Pre 3,54±0,71 2,48±0,34 3,88±0,55 3,75±0,45
<0,001 0,032 <0,001 Post 7,82±0,58 a* 3,20±0,38 b& 3,23±0,35 b& 2,03±0,58 b&*
GPx1 Pre 7,43±1,04 0,19±0,08 0,94±0,36 0,06±0,02
0,003 <0,001 0,087 Post 83,66±8,41 a* 49,20±8,08 b* 51,20±5,11b* 45,10±5,63b*
GPx3 Pre 0,032±0,006 0,019±0,004 0,021±0,002 0,017±0,001
<0,001 <0,001 0,001 Post 0,118±0,026 a* 0,043±0,011b& 0,036±0,004b& 0,022±0,003b&
GPx4 Pre 7,18±0,75 4,03±0,68 4,64±0,63 3,05±0,70
0,075 0,582 0,001 Post 3,41±0,73* 5,33±0,45 5,26±0,55 3,95±0,58
TXN Pre 0,30±0,08 0,28±0,04 0,34±0,04 0,39±0,05
0,331 0,401 0,597 Post 0,28±0,07 0,41±0,09 0,31±0,07 0,49±0,14
TXNRD1 Pre 0,052±0,007 0,034±0,007 0,036±0,009 0,037±0,009
<0,001 <0,001 <0,001 Post 0,504±0,071 a* 0,094±0,035b& 0,047±0,016 b& 0,089±0,023b&
Datos analizados mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 39). Pre: Pre-intervención; Post: Post-intervención. Símbolos de las
pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni: los superíndices con distintas letras difieren significativamente, P <0,05; * significa
efecto significativo del tiempo (P <0,05) dentro de la dieta en comparación con el estado de ayuno previo a la intervención; & significa
P<0,05 entre la dieta HSFA y la dieta indicada, las dos determinaciones en ayunas en conjunto.
Resultados
87
2.3. Expresión génica postprandial de las subunidades de la NADPH-
oxidasa en tejido adiposo.
Nuestro estudio mostró que la ingesta de la comida HSFA aumentó los
niveles postprandiales del ARNm de gp91phox
, p67phox
, p47phox
y p40phox
(P<0,001,
P<0,001, P=0,001 y P<0,001, respectivamente) (Tabla 8). Así mismo, se observó
un incremento postprandial en los niveles del ARNm de p47phox
tras la ingesta de
las comidas HMUFA y LFHCC (P<0,001 y P=0,010), mientras que los niveles del
ARNm de p40phox
aumentaron tras la ingesta de las comidas HMUFA, LFHCC y
LFHCC n-3 (P<0,001, P=0,002 y P=0,034, respectivamente).
La ingesta de la comida HSFA aumentó los niveles del ARNm de
gp91phox
, en comparación con la ingesta de la comida LFHCC n-3 (P=0,048). Así
mismo, el aumento en los niveles del ARNm de p67phox
tras la ingesta de la comida
HSFA fue mayor que tras el consumo de en MUFA (P=0,045), LFHCC (P=0,005)
y LFHCC n-3 (P=0,012) (Tabla 8). Por el contrario, se observó un descenso
postprandial en los niveles del ARNm de p22phox
tras la ingesta de la comida
HSFA, en comparación con la ingesta de las comidas LFHCC (P<0,001) y
LFHCC n-3 (P=0,010). Además, observamos que los niveles del ARNm de p22phox
tras la ingesta de la comida HSFA eran mayores que tras la ingesta de la comida
HMUFA (P=0,006) (Tabla 8).
El análisis post hoc mostró que la ingesta de la comida HSFA produjo un
aumento postprandial de los niveles del ARNm de gp91phox
y p67phox
en
comparación con la ingesta de las comidas HMUFA (P=0,003 y P=0,039),
LFHCC (P=0,007 y P=0,009) y LFHCC n-3 (P=0,001 y P=0,006).
Los niveles postprandiales del ARNm del factor de transcripción PU.1, no
fueron detectables.
Tabla 8. Expresión génica postprandial de la expresión génica de las subunidades de la NADPH-oxidasa (gp91phox
, p22phox
, p67phox
,
p47phox
y p40phox
) en tejido adiposo de pacientes con Síndrome Metabólico. Los valores representan la media ± error estándar (SE).
Diferencia postprandial post-intervención entre los niveles de ARNm de los tiempos 0 y 4. Datos analizados mediante ANOVA para
medidas repetidas (n = 39).
DIETA valores P
Genes HSFA
HMUFA
LFHCC
LFHCC-n-3 Efecto
dieta
Efecto
tiempo
Efecto dieta-
tiempo
gp91phox
0,231±0,044 a* 0,034±0,035
ab‡ 0,020±0,062
ab‡ 0,013±0,044
b‡ 0,038 0,007 0,021
p22phox
-0,004±0,010 -0,026±0,037 ‡ 0,035±0,040
‡ 0,082±0,033
‡ <0,001 0,229 0,183
p67phox
0,527±0,153 a* 0,137±0,093
b‡ 0,125±0,052
b‡ 0,022±0,066
b‡ 0,004 <0,001 0,004
p47phox
0,558±0,200 * 0,600±0,104 * 0,342±0,148 * 0,250±0,079 0,867 <0,001 0,266
p40phox
0,320±0,055 * 0,218±0,041 * 0,162±0,063 * 0,121±0,039 * 0,071 <0,001 0,090
P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto interacción dieta-tiempo. Símbolos de las pruebas de comparaciones múltiples de
Bonferroni: los superíndices con distintas letras difieren significativamente, P<0,05; * Significa que el efecto del tiempo significativo
(P<0,05) dentro de la dieta en comparación con el estado de ayuno posterior a la intervención. ‡ significa P<0,05 entre la dieta HSFA y la
dieta indicada, las dos mediciones post-intervención en conjunto.
Resultados
89
2.4. Expresión postprandial de genes relacionados con el sistema de
defensa antioxidante en tejido adiposo.
Nuestro estudio mostró un aumento postprandial en los niveles del ARNm
de la isoforma mitocondrial de la SOD2, independientemente de la comida
administrada a los pacientes (todas, P<0,05) (Figura 8B). El aumento postprandial
de la SOD2 fue mayor tras la ingesta de la comida HSFA que tras la ingesta de las
comidas HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3 (todas, P<0,001). No obstante, no se
encontraron cambios significativos en la expresión de la isoforma citoplasmática
(SOD1) (Figura 8A). La ingesta de las comidas HSFA y LFHCC redujeron los
niveles postprandiales del ARNm de CAT (P<0,001 y P=0,030, respectivamente)
(Figura 8C). No obstante, el incremento postprandial que observamos en los
niveles del ARNm de CAT después de la ingesta de la comida HMUFA fue
estadísticamente significativo comparado con el descenso postprandial de los
niveles del ARNm de CAT tras la ingesta de las comidas HSFA (P=0,002) y
LFHCC (P=0,013). Además, el descenso postprandial en los niveles del ARNm de
CAT tras el consumo de la comida HSFA fue mayor comparado con el que se
observó tras el consumo de las comidas LFHCC y LFHCC n-3 (P=0,037 y
P=0,014, respectivamente). Los niveles postprandiales del ARNm de GPx1
disminuyeron tras la ingesta de la comida HSFA (P=0,001) y aumentaron tras la
ingesta de la comida HMUFA (P=0,018), de manera que este aumento en los
niveles del ARNm de GPx1 fue mayor tras la ingesta de la comida HMUFA que
tras el consumo de las comidas HSFA (P=0,004), LFHCC (P=0,005) y LFHCC n-
3 (P=0,002) (Figura 8D). La ingesta de la comida HSFA redujo los niveles
postprandiales del ARNm de GPx3 en comparación con el consumo de las
comidas HMUFA (P=0,037), LFHCC (P=0,001) y LFHCC n-3 (P=0,003) (Figura
8E). Por el contrario, el aumento postprandial en los niveles del ARNm de GPx4
tras la ingesta de la comida HSFA fue mayor que tras la ingesta de las comidas
HMUFA (P=0,049), LFHCC (P=0,025) y LFHCC n-3 (P<0,001) (Figura 8F).
Resultados
90
Figura 8. Cambios en la expresión génica postprandial de las enzimas antioxidantes
en tejido adiposo de pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error
estándar (SE). Cambios de expresión génica en (A) superóxido dismutasa 1, (B)
superóxido dismutasa 2, (C) catalasa, (D) glutatión peroxidasa 1, (E) glutatión peroxidasa
3 y (F) glutatión peroxidasa 4, tras la sobrecarga de un desayuno que con la misma
composición de ácidos grasos de las dietas administradas durante la intervención dietética.
Datos analizados mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 39). P1: efecto de la
dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto interacción dieta-tiempo. Análisis estadístico Post
hoc mediante la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni, * P<0,05 diferencia
significativa entre dietas, † P<0,05 efecto del tiempo significativo.
También hemos estudiado la expresión génica de la tioredoxina (TXN),
una proteína con función redox involucrada en la eliminación de ROS, y TXNRD1,
la enzima que reduce la tioredoxina oxidada a la forma reducida y activa.
*
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Niv
ele
sd
e A
RN
m S
OD
1
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
A
P1=0.517P2=0.722P3=0.329
0
2
4
6
8
10
12
Niv
ele
sd
e A
RN
m S
OD
2
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
†
† †
B*
**
P1<0.001P2<0.001P3<0.001
-5-4-3-2-10123
Niv
ele
sd
e A
RN
m C
AT
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
††
**
* *
C
P1<0.001P2=0.010P3<0.001
-60-50-40-30-20-10
01020
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
Px1
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
†
D**
P1=0.036P2=0.033P3=0.001
-0.10
-0.05
0.00
0.05
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
Px3
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
E **
*
†
P1=0.001P2=0.183P3=0.026
-4
-2
0
2
4
6
8
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
Px4
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
† †
**
*
F
P1=0.001P2=0.117P3<0.001
Resultados
91
Los niveles del ARNm de TXN aumentaron tras la ingesta de las comidas
HSFA (P<0,001), MUFA (P=0,006) y LFHCC (P<0,001), siendo este incremento
postprandial mayor tras la ingesta de la comida HSFA que tras la ingesta de las
comidas HMUFA y LFHCC n-3 (ambas, P=0,001) (Figura 9A). Por otra parte,
observamos que los niveles del ARNm de TXNRD1 disminuyeron tras la ingesta
de la comida HSFA (P<0,001), siendo este descenso significativamente mayor que
el observado tras la ingesta de las comidas HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3
(todas, P<0,001) (Figura 9B).
Cuando analizamos el efecto postprandial de las diferentes dietas
administradas a los pacientes, observamos que los niveles del ARNm del factor de
transcripción NFE2L2, regulador positivo de la respuesta antioxidante, aumenta
tras la ingesta de la comida HSFA (P=0,028), LFHCC (P<0,001) y LFHCC n-3
(P=0,008), y tiende a aumentar tras la ingesta de la comida HMUFA (P=0,052)
(Figura 9C). No obstante, cuando analizamos los niveles del ARNm de KEAP1,
una proteína que regula negativamente la actividad de NFE2L2, la cual es
degradada por el proteosoma, observamos un incremento postprandial en los
niveles del ARNm de KEAP1 tras la ingesta de la comida HSFA (P=0,001)
(Figura 9D), siendo este aumento significativamente mayor que el observado tras
la ingesta de la comida HMUFA (P=0,013) y LFHCC n-3 (P=0,035).
Los niveles postprandiales del ARNm de GSR, no fueron detectables.
Resultados
92
Figura 9. Expresión génica postprandial de proteínas antioxidantes y del complejo
regulador de la respuesta antioxidante en tejido adiposo de pacientes con SMet. Los
valores representan la media ± error estándar (SE). Cambios de expresión génica en (A)
tiorredoxina, (B) tiorredoxina reductasa1, (C) NFE2L2 y (D) KEAP1 tras la sobrecarga de
un desayuno que con la misma composición de ácidos grasos de las dietas administradas
durante la intervención dietética. Los datos se analizaron mediante ANOVA para medidas
repetidas (n = 39). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto interacción
dieta-tiempo. Análisis estadístico Post hoc mediante la prueba de comparaciones múltiples
de Bonferroni, * P<0,05 diferencia significativa entre dietas, † P<0,05 efecto del tiempo
significativo.
0
1
2
3
4
Niv
ele
sA
RN
m N
FE2
L2
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
†
†
CP1=0.112P2<0.001P3=0.180
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
Niv
ele
s A
RN
m K
EAP
1
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
**
D
P1: 0.012P2: 0.048P3: 0.013
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Niv
ele
sd
e A
RN
m T
XN
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
†
†
**
A
P1=0.319P2<0.001P3=0.025
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
Niv
ele
sd
e A
RN
m T
XN
RD
1
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
†
**
*B
P1<0.001P2=0.040P3<0.001
Resultados
93
3. EFECTO DEL CONSUMO A LARGO PLAZO DE CUATRO
MODELOS DE DIETAS CON DIFERENTE CANTIDAD Y TIPO DE
GRASA EVALUADO MEDIANTE EL ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA
COMO MODELO CELULAR IN VIVO.
En estudios previos realizados en el grupo se ha demostrado que la dieta
HMUFA mejora los parámetros plasmáticos de estrés oxidativo en estado
postprandial, y que las dietas LFHCC y LFHCC n-3 tienen un efecto intermedio
en relación con las dietas HMUFA y HSFA en una población con SMet de la
cohorte española incluida en el estudio LIPGENE [11]. Además, en la primera
parte de mi trabajo de tesis doctoral, demostramos que el consumo de la dieta
HSFA aumentó el estrés oxidativo postprandial debido a un desequilibrio entre la
generación de ROS y su posterior eliminación, como consecuencia del aumento en
los niveles de ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa y la disminución
en la expresión de enzimas antioxidantes en el tejido adiposo [154].
Tomando como base estos hallazgos, nos planteamos si la dieta,
específicamente la cantidad y la calidad de la grasa de la dieta, también podrían
modificar la expresión de genes pro-oxidantes y anti-oxidantes en las CMSP de
pacientes con SMet. Las CMSP (monocitos y linfocitos) [133], desempeñan un
papel crítico en el sistema inmune, en la iniciación y progresión de la
aterosclerosis [113, 155], sustrato responsable de la enfermedad cardiovascular en
pacientes con SMet [61]. Además, estas células se están utilizando cada vez más
para estudios de expresión génica, [156, 157] y se ha demostrado que modifican su
perfil de expresión génica en respuesta a estímulos tales como la grasa de la dieta,
factores metabólicos tales como la dislipidemia, y moléculas inflamatorias
producidas por otros órganos y tejidos [133, 158, 159].
En este bloque experimental, abordamos el uso de las CMSP como un
modelo celular in vivo para evaluar la respuesta oxidativa sistémica a la
intervención dietética. Para ello, se estudió el efecto de cuatro dietas que difieren
Resultados
94
en la cantidad y calidad de la grasa en la expresión postprandial de genes pro-
oxidantes como gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
y p40phox
y el factor de
transcripción PU.1, y genes implicados en la defensa antioxidante tales como
SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx4, GSR, TXN, TXNRD1 y NFE2L2 en PBMC de
los pacientes con síndrome metabólico.
3.1. Efecto de la dieta en la expresión génica de las subunidades de la
NADPH-oxidasa en CMSP
El consumo a largo plazo de la dieta LFHCC n-3 aumentó los niveles en
ayunas del ARNm de p22phox
(P=0,025), comparado con los niveles del ARNm en
ayunas medidos antes de iniciar la intervención dietética (Tabla 9). Sin embargo,
no observamos cambios significativos en la expresión de los genes gp91phox
,
p67phox
, p47phox
, p40phox
, ni del factor de transcripción PU.1, tras el consumo a
largo plazo de las cuatro dietas administradas en este estudio.
Tabla 9. Niveles en ayunas de ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
, p40phox
y el factor
de transcripción PU.1 en CMSP de pacientes con Síndrome Metabólico. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los
niveles de ARNm en estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
Dietas gp91 phox
p22 phox
p67 phox
p47 phox
p40 phox
PU.1
Pre-
intervención
Ayunas (0h)
HSFA 0,963±0,046 0,567±0,065 0,400±0,029 0,381±0,037 0,197±0,021 0,659±0,051
HMUFA 1,056±0,148 0,590±0,084 0,413±0,046 0,443±0,075 0,206±0,025 0,691±0,089
LFHCC 1,012±0,100 0,624±0,095 0,370±0,029 0,410±0,055 0,166±0,023 0,591±0,056
LFHCC-n-3 1,215±0,129 0,551±0,063 0,442±0,048 0,368±0,036 0,219±0,027 0,677±0,067
Post-
intervención
Ayunas (0h)
HSFA 1,275±0,179 0,680±0,085 0,492±0,065 0,470±0,072 0,240±0,026 0,984±0,180
HMUFA 1,087±0,039 0,582±0,080 0,402±0,026 0,394±0,030 0,236±0,020 0,705±0,047
LFHCC 1,225±0,092 0,693±0,041 0,378±0,026 0,375±0,033 0,217±0,018 0,802±0,068
LFHCC-n-3 1,119±0,118 0,727±0,076* 0,454±0,031 0,341±0,024 0,171±0,016 0,814±0,110
Valores P
Efecto Dieta 0,914 0,902 0,380 0,656 0,182 0,904
Efecto Tiempo 0,100 0,035 0,283 0,914 0,177 0,134
Interacción dieta-tiempo 0,337 0,360 0,950 0,924 0,094 0,789
HSFA: dieta occidental rica en grasa saturada; HMUFA: dieta rica en ácidos grasos monoinsaturados; LFHCC: dieta baja en grasa, alta en
hidratos de carbono complejos; LFHCCn-3: dieta baja en grasa y alta en hidratos de carbono complejos con 1,24 g / día PUFAn-3. Datos
analizados mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 75). *significa efecto significativo del tiempo (P<0,05) dentro de la dieta en
comparación con el estado de ayuno previo a la intervención.
Resultados
96
3.2. Efecto de la dieta en la expresión de genes del sistema de defensa
antioxidante en CMSP
Nuestro estudio mostró un incremento de los niveles en ayunas del ARNm
de SOD1 tras el consumo a largo plazo de la dieta HMUFA (P=0,034), LFHCC
(P=0,012) y LFHCC n-3 (P=0,021), además de una tendencia tras el consumo de
la dieta HSFA (P=0,058) (Figura 10A). Además, observamos un aumento de los
niveles en ayunas del ARNm de SOD2 y CAT, independientemente de la cantidad
y tipo de grasa de la dieta, comparado con los niveles en ayunas antes de iniciar la
intervención dietética (Figura 10B y 10C).
Figura 10. Niveles de ARNm en ayunas de las enzimas antioxidantes en CMSP de
pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los niveles
de ARNm en estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
(A) superóxido dismutasa 1, (B) superóxido dismutasa 2, (C) catalasa. Pre-intervención
(barras blancas) y Post-intervención (barras negras). Datos analizados mediante ANOVA
para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto
interacción dieta-tiempo. *significa efecto significativo del tiempo (P<0,05) dentro de la
dieta en comparación con el estado de ayuno previo a la intervención.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sd
e A
RN
m S
OD
1
PRE 0 POST 0
P1: 0.586P2< 0.001P3: 0.966
* * *
A
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sd
e A
RN
m S
OD
2
PRE 0 POST 0
P1: 0.799P2: 0.004P3: 0.952
B
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sd
e A
RN
m C
AT
PRE 0 POST 0
P1: 0.683P2: 0.001P3: 0.968
C
Resultados
97
Los niveles en ayunas del ARNm de GPx1 aumentaron tras el consumo a
largo plazo de las dietas HMUFA (P=0,024) y LFHCC n-3 (P=0,012) (Figura
11A). En el periodo post-intervención, observamos un aumento en los niveles del
ARNm de GPx4 (P=0,044), independientemente de la cantidad y tipo de grasa de
la dieta (Figura 11B). Así mismo, el consumo a largo plazo de las dietas HSFA y
HMUFA (P=0,014 y P<0,001, respectivamente) aumentaron los niveles en ayunas
del ARNm de GPx4. Los niveles en ayunas del ARNm de GSR aumentaron tras el
consumo a largo plazo de las dietas HSFA y HMUFA (P=0,005 y P=0,002,
respectivamente) (Figura 11C).
Figura 11. Niveles de ARNm en ayunas de las enzimas antioxidantes en CMSP de
pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los niveles
de ARNm en estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
(A) Glutation peroxidasa1, (B) Glutation peroxidasa 4, (C) GSR. Pre-intervención (barras
blancas) y Post-intervención (barras negras). Los datos se analizaron mediante ANOVA
para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto
interacción dieta-tiempo. *significa efecto significativo del tiempo (P<0,05) dentro de la
dieta en comparación con el estado de ayuno previo a la intervención.
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sde
AR
Nm
GSR
PRE 0 POST 0
P1: 0.223P2< 0.001P3: 0.708
**
C
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
Px
1
PRE 0 POST 0
P1: 0.879P2: 0.002P3: 0.312
**A
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
eles
de A
RN
m G
Px4
PRE 0 POST 0
P1: 0.420P2< 0.001P3: 0.044*
*
B
Resultados
98
Nuestro estudio mostró un aumento en los niveles en ayunas del ARNm de
TXN tras el consumo a largo plazo de las dietas HMUFA (P=0,029) y LFHCC
(P=0,050), además de una tendencia tras el consumo de la dieta HSFA (P=0,052)
(Figura 12A). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en los
niveles del ARNm de TXNRD1 en estado de ayunas post-intervención (Figura
12B).
Figura 12. Niveles de ARNm en ayunas de las enzimas antioxidantes en CMSP de
pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error estándar (SE), de los niveles
de ARNm en estado de ayunas al inicio y tras finalizar el periodo de intervención dietética.
(A) Tiorredoxina, (B) Tiorredoxina reductasa 1, (C) NFE2L2. Pre-intervención (barras
blancas) y Post-intervención (barras negras). Los datos se analizaron mediante ANOVA
para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto
interacción dieta-tiempo. * significa efecto significativo del tiempo (P<0,05) dentro de la
dieta en comparación con el estado de ayuno previo a la intervención, † significa diferencia
significativa post-intervención entre dietas, P <0,05.
El consumo a largo plazo de las dietas HSFA (P=0,021) y HMUFA
(P=0,005) aumentó los niveles en ayunas del ARNm del factor de transcripción
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
eles
de A
RN
m N
FE2L
2
PRE 0 POST 0
P1: 0.638P2: 0.011P3: 0.008
**
†C
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
ele
sd
e A
RN
m T
XN
PRE 0 POST 0
P1: 0.653P2: 0.003P3: 0.294
**
A
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
Niv
eles
de A
RN
m T
XN
RD
1
PRE 0 POST 0
P1: 0.638P2: 0.057P3: 0.302
B
Resultados
99
NFE2L2. No obstante, el consumo a largo plazo de la dieta LFHCC n-3 tiende a
disminuir los niveles en ayunas del ARNm de NFE2L2 (P=0,098) (Figura 12C).
El análisis post hoc mostró que el aumento de los niveles en ayunas del ARNm de
NFE2L2 tras la dieta HMUFA fue mayor que el observado tras la dieta LFHCC n-
3 (P=0,007).
3.3. Expresión génica postprandial de las subunidades de la NADPH-
oxidasa en CMSP.
Cuando estudiamos el efecto postprandial del consumo a largo plazo de
cada una de las dietas, se observó un aumento en los niveles del ARNm de
gp91phox
(P<0,001), p22phox
(P=0,005), p47phox
(P=0,001), p40phox
(P<0,001) a las 2
horas de la ingesta de la comida HSFA (Figura 13), mientras que la expresión de
estos genes permaneció sin cambios tras el consumo de las demás comidas. El
análisis post hoc demostró que el aumento en los niveles postprandiales del
ARNm de gp91phox
, p47phox
, p40phox
y PU.1 a las 2 horas de la ingesta de la comida
HSFA fueron mayores que tras la ingesta de las comidas HMUFA (P=0,020,
P=0,001, P=0,002 y P=0,027, respectivamente), LFHCC (P=0,034, P<0,001,
P=0,010 y P=0,042, respectivamente) y LFHCC n-3 (P=0,001, P<0,001, P<0,001
y P=0,007, respectivamente) (Figura 13). Además, se observó que el aumento en
los niveles postprandiales del ARNm de p47phox
se mantuvieron tras 4 horas de la
ingesta de la comida HSFA, y éstos fueron mayores que tras la ingesta de las
comidas HMUFA (P=0,050) y LFHCC n-3 (P=0,024) (Figura 13D). También
observamos que después de 4 horas de la ingesta de la comida HMUFA, los
niveles postprandiales del ARNm de p40phox
fueron menores que los observados
tras la ingesta de las comidas HSFA (P=0,022) y LFHCC (P=0,038) (Figura 13E).
Resultados
100
Figura 13. Niveles de ARNm postprandiales del factor de transcripción PU.1 y las
subunidades de la NADPH-oxidasa en CMSP de pacientes con SMet. Los valores
representan la media ± error estándar (SE).Cambios de expresión génica en (A) gp91phox
,
(B) p22phox
, (C) p67phox
(D) p47phox
, (E) p40phox
, (F) PU.1. Los datos se analizaron mediante
ANOVA para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y
P3: efecto interacción dieta-tiempo. ‡ significa P<0,05 para el desayuno HSFA comparado
con HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3, § significa P<0,05 para el desayuno HSFA
comparado con LFHCC; significa † P<0,05 2 h después del desayuno HSFA comparado
con HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3; ¥ significa P<0,05 4 h después del desayuno HSFA
comparado con HMUFA y LFHCC n-3; Ω significa P<0,05 4 h después del desayuno
HMUFA comparado con HSFA y LFHCC, y * significa P<0,05 2 h después del desayuno
HSFA frente al estado de ayuno; α significa P<0,05 4 h después del desayuno HSFA frente
a las 2 h del postprandio.
0.8
1.2
1.6
2.0
2.4
2.8
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m g
p91
ph
ox
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.078
P2: 0.032P3: 0.027
A †*
α
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m p
22p
ho
x
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.534
P2: 0.020P3: 0.224
B*
α
0.5
0.8
1.0
1.3
1.5
1.8
2.0
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m P
U.1
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.096P2: 0.060P3: 0.026F †
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m p
67
ph
ox
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.022P2: 0.289P3: 0.183
C§
§ §
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m p
47
ph
ox
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1 <0.001P2: 0.003P3: 0.025
D†*
α¥
‡
‡
‡
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m p
40ph
ox
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1 <0.001P2: 0.035P3: 0.001E †
Ω
*
‡
‡
‡
Resultados
101
La ingesta de la comida HSFA aumentó los niveles postprandiales del
ARNm p47phox
de manera que éstos fueron mayores a los observados tras la
ingesta de las comidas HMUFA (P=0,007), LFHCC (P=0,007) y LFHCC n-3
(P<0,001) (Figura 13D). También observamos que el aumento en los niveles
postprandiales del ARNm de p40phox
tras la ingesta de la comida HSFA fueron
mayores que tras la ingesta de las comidas HMUFA (P=0,008) y rico en LFHCC
n-3 (P<0,001) (Figura 13E). Así mismo, el aumento postprandial en los niveles
del ARNm de p40phox
fueron mayores tras la ingesta de la comida LFHCC que tras
la ingesta de la comida LFHCC n-3 (P=0,014). El aumento en los niveles del
ARNm de p67phox
tras la ingesta de la comida HSFA fueron mayores que los
observados tras la ingesta de la comida LFHCC (P=0,016) (Figura 13C).
3.4. Expresión postprandial de genes del sistema de defensa antioxidante
en CMSP.
Hemos observado que los niveles del ARNm de GSR y GPx1 aumentaron
a las 2 horas de la ingesta de la comida HSFA (ambos, P<0,001), mientras que no
encontramos cambios significativos en los niveles del ARNm de estos genes tras
la ingesta de las demás comidas. (Figura 16B y 16C).
Los niveles postprandiales del ARNm de GSR, GPx1, TXNRD1 y NFE2L2
a las 2 horas de la ingesta de la comida HSFA fueron más elevados que a las 2
horas de la ingesta de las comidas HMUFA (P=0,001, P=0,019, P=0,021 y
P=0,001, respectivamente), LFHCC (P=0,001, P=0,038, P=0,002 y P=0,001,
respectivamente) y LFHCC n-3 (P<0,001, P=0,001, P=0,001 y P<0,001,
respectivamente) (Figura 16B, 16C, 16F y Figura 14).
El aumento en los niveles postprandiales del ARNm de SOD1 y GPx4
observado a las 2 horas de la ingesta de una comida HSFA fue mayor que tras la
ingesta de la comida LFHCC n-3 (P=0,029 y P=0,005, respectivamente) (Figura
15A y 16D) y el aumento en los niveles postprandiales del ARNm de GSR, tras la
ingesta de la comida HSFA fue mayor que tras la ingesta de las comidas HMUFA
(P=0,013) y el LFHCC (P=0,006) (Figura 16B). Así mismo, los niveles
Resultados
102
postprandiales del ARNm de CAT y la TXNRD1 tras la ingesta de la comida
HSFA fueron mayores que tras la ingesta de las comidas LFHCC (P=0,039 y
P=0,013) y LFHCC n-3 (P=0,011 y P=0,033) (Figura 16A y 16F). Cuando
estudiamos el efecto postprandial de la comida HSFA, observamos unos niveles
postprandiales del ARNm de GPx1 (P=0,044) y NFE2L2 (P<0,001) más elevados
que los observados tras la ingesta de la comida LFHCC n-3 (Figura 16C y Figura
14).
Figura 14. Niveles de ARNm postprandiales de NFE2L2 en CMSP de pacientes con
SMet. Los valores representan la media ± error estándar (SE). Los datos se analizaron
mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del
tiempo y P3: efecto interacción dieta-tiempo. Δ significa P<0,05 para el desayuno HSFA
comparado con LFHCC n-3, † significa P<0,05 2 h después del desayuno HSFA
comparado con HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3.
Figura 15. Niveles de ARNm postprandiales de genes implicados en la respuesta
antioxidante de pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error estándar
(SE). (A) SOD1, (B) SOD2. Datos analizados mediante ANOVA para medidas repetidas
(n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del tiempo y P3: efecto interacción dieta-tiempo.
¤ significa P<0,05 2 h después del desayuno HSFA comparado con LFHCC n-3, #
significa P<0,05 2 h después del desayuno HSFA comparado con LFHCC y LFHCC n-3.
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4
Niv
eles
AR
Nm
NFE
2L2
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1 <0.001
P2: 0.115P3 <0.001
†
Δ
Δ
Δ
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m S
OD
2
tiempo (h)HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.051
P2: 0.654P3: 0.026
B #
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m S
OD
1
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.469
P2: 0.211P3: 0.036
A ¤
Resultados
103
Figura 16. Niveles de ARNm postprandiales de genes implicados en la respuesta
antioxidante de pacientes con SMet. Los valores representan la media ± error estándar
(SE). (A) CAT, (B) GSR, (C) GPx1, (D) GPx4, (E) TXN, (F) TXNRD1. Datos analizados
mediante ANOVA para medidas repetidas (n = 75). P1: efecto de la dieta, P2: efecto del
tiempo y P3: efecto interacción dieta-tiempo. £ significa P<0,05 para el desayuno HSFA
comparado con LFHCC y LFHCC n-3, ¶ significa P<0,05 para el desayuno HSFA
comparado con HMUFA y LFHCC, Δ significa P<0,05 para el desayuno HSFA
comparado con LFHCC n-3, † significa P<0,05 2 h después del desayuno HSFA
comparado con HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3, # significa P<0,05 2 h después del
desayuno HSFA comparado con LFHCC y LFHCC n-3, ¤ significa P<0,05 2 h después del
desayuno HSFA comparado con LFHCC n-3, * significa P<0,05 2 h después del desayuno
HSFA frente al estado de ayuno; α significa P<0,05 4 h después del desayuno HSFA frente
a las 2 h del postprandio.
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m T
XN
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.060
P2: 0.193P3: 0.012
E #
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m G
Px4
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.301
P2: 0.229P3: 0.003
D¤
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
SR
tiempo (h)HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.004P2: 0.011P3: 0.001*
α
†
B
¶
¶
¶
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m G
Px1
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.031P2: 0.016P3: 0.005
*
α
†
C
Δ
Δ
Δ
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0 2 4
Niv
ele
sd
e A
RN
m C
AT
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.007
P2: 0.374P3: 0.131
A £
££
0.02
0.04
0.06
0.08
0 2 4
Niv
eles
de A
RN
m T
XN
RD
1
tiempo (h)
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
P1: 0.010P2: 0.286P3: 0.004
F †
£
£
£
Resultados
104
3.5. Niveles de la proteína de NFE2L2 en células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) mediante Western Blot.
Con el objeto de evaluar el efecto postprandial de la cantidad y tipo de
grasa de la dieta, tanto en ayunas como en estado postprandial, tras una sobrecarga
grasa que reflejaba la composición de la dieta a la que fue asignado, se determinó
la activación del factor de transcripción NFE2L2 en CMSP de los pacientes con
Síndrome Metabólico. Puesto que este factor transcripcional migra al núcleo de la
célula cuando es activado, se ha determinado la cantidad de proteína NFE2L2
tanto en la fracción nuclear como en la fracción citoplasmática de CMSP mediante
la técnica de Western Blotting, como medida de la activación de este factor de
transcripción.
No se observaron cambios significativos en cuanto a los niveles en ayunas
de la proteína NFE2L2 en la fracción nuclear ni en la citoplasmática tras el
consumo de ninguna de las dietas.
No obstante, los niveles postprandiales de la proteína NFE2L2 en la
fracción nuclear fueron mayores tras la ingesta de la comida HSFA en
comparación con los niveles observados tras la ingesta de las comidas LFHCC, y
LFHCCn-3 (P=0,018 y P=0,011) (Figura 17). A su vez, los niveles
citoplasmáticos de la proteína NFE2L2 fueron menores tras la ingesta de las
comidas HSFA y LFHCC n-3 comparado con los niveles elevados de ésta proteína
observados tras la ingesta de la comida HMUFA (P=0,047 y P=0,003).
Resultados
105
Figura 17. Incremento de la proteína nuclear y cytoplasmática en CMSP tras el
consumo de desayunos con diferente cantidad y tipo de grasa. Valores representados
por la media ± S.E.M. Diferencias entre el tiempo de 4 h y el basal tras la intervención
dietética, n = 36. Datos analizados mediante ANOVA de un factor, P: efecto de la dieta.
Las barras con diferentes letras representan diferencias estadísticamente significativas
entre las dietas (P<0,05). Niveles postprandiales de NFE2L2 nuclear (A) y citoplásmica
(B), en CMSP de acuerdo con la comida consumida. Inmunoblot representativo de
NFE2L2 nuclear y citoplásmico (C).
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
NFE
2L2
Nu
cle
ar
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
AP=0.004a
abc cbc
HSFA HUMFA LFHCC LFHCC-n3
57kDa NFE2L2 Nuclear
NFE2L2 Citoplasmático57kDa
0h 4h 0h 4h 0h 4h 0h 4hC
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
NFE
2L2
Cit
op
lasm
átic
o
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n3
BP=0.007
a
b
abc ac
Resultados
106
4. CORRELACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN CMSP,
TEJIDO ADIPOSO Y LOS PARÁMETROS Y BIOMARCADORES DE
ESTRÉS OXIDATIVO PLASMÁTICOS EN ESTADO POSTPRANDIAL.
4.1. Análisis de correlación entre la expresión génica en CMSP con los
biomarcadores de estrés oxidativo y los parámetros plasmáticos lipídicos en
estado postprandial.
En este trabajo, se hemos analizado la relación entre los niveles del ARNm
de CMSP (genes: gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
, p40phox
, PU.1, NFE2L2, SOD1,
SOD2, CAT, GPx1, GPx4, GSR, TXN and TXNRD1) y marcadores de estrés
oxidativo, tales como lipoperóxidos (LPOs), H2O2 y proteínas carboniladas
previamente descritos por Pérez-Martínez et al. [11], así como los niveles
plasmáticos de lípidos como el colesterol total, triglicéridos, c-HDL y c-LDL en
estado postprandial. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.
Nuestro estudio mostró una correlación positiva entre las concentraciones
plasmáticas de proteínas carboniladas y los niveles del ARNm en CMSP de
gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
, p40phox
, PU.1, NFE2L2, SOD1, SOD2, CAT,
GPx1, GPx4, GSR, TXN y TXNRD1) a las 2 horas de la ingesta de la sobrecarga
grasa, ver Tabla 10. Además, observamos una correlación negativa entre las
concentraciones plasmáticas de proteínas carboniladas con los niveles del ARNm
de p22phox
y NFE2L2, a las 4 horas de la ingesta de las comidas (P=0,003 r= -0,342
y P=0,020 r= -0,275, respectivamente).
Además, observamos una correlación positiva entre la concentración
plasmática postprandial de H2O2 con los niveles del ARNm de las subunidades de
la NADPH -oxidasa (gp91phox
, p67phox
, p40phox
y PU.1) y los antioxidantes (SOD1,
SOD2, CAT, GPx1, GPx4, TXN, TXNRD1 y NFE2L2) a las 2 horas tras la ingesta
de la sobrecarga grasa (Tabla 10).
Nuestro estudio mostró una correlación positiva entre los niveles
plasmáticos de LPOs, con los niveles del ARNm del factor de transcripción PU.1 a
las 2 horas tras la ingesta de las comidas grasas (P=0,041 r=0,241). Por otra parte,
Resultados
107
se observó una correlación positiva entre los niveles plasmáticos de LPOs y los
niveles del ARNm de gp91phox
, p67phox
, p40phox
, SOD2, GSR y TXN a las 4 horas
tras la ingesta de las comidas grasas (Tabla 10).
Resultados
108
Tabla 10. Correlaciones entre la expresión génica en CMSP y los biomarcadores
plasmáticos de estrés oxidativo en estado postprandial.
2 h 4 h
P H2O2
Proteínas LPOs H2O2
Proteínas LPOs
r carboniladas carboniladas
ARNm gp91phox 0,002 0,003
n.s. n.s. n.s. 0,008
0,358 0,341 0,312
ARNm p22phox n.s. 0,037
n.s. n.s. 0,003
n.s. 0,247 -0,342
ARNm p67phox 0,001 0,001
n.s. n.s. n.s. 0,014
0,400 0,389 0,287
ARNm p47phox n.s. <0,001
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,493
ARNm p40phox 0,002 <0,001
n.s. n.s. n.s. 0,019
0,364 0,428 0,275
ARNm PU.1 0,001 0,001 0,041
n.s. n.s. n.s. 0,382 0,389 0,241
ARNm NFE2L2 0,023 <0,001
n.s. n.s. 0,02
n.s. 0,268 0,458 -0,0275
ARNm SOD1 0,025 0,014
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,265 0,29
ARNm SOD2 0.001 <0,001
n.s. n.s. n.s. 0,007
0,372 0,42 0,317
ARNm CAT <0,001 0,010
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,443 0,303
ARNm GPx1 0,002 0,003
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,358 0,345
ARNm GPx4 0,018 0,001
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,279 0,394
ARNm GSR n.s. <0,001
n.s. n.s. n.s. 0,010
0,484 0,303
ARNm TXN 0,009 0,027
n.s. n.s. n.s. 0,029
0,307 0,26 0,257
ARNm TrxR 0,003 0,002
n.s. n.s. n.s. n.s. 0,350 0,365
Resultados
109
4.2. Análisis de correlación entre la expresión génica postprandial en
CMSP y en tejido adiposo.
En este trabajo, hemos analizado la relación entre los niveles del ARNm
en CMSP y en tejido adiposo (genes: gp91phox
, p22phox
, p67phox
, p47phox
, p40phox
,
PU.1, NFE2L2, SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx4, GSR, TXN and TXNRD1).
Nuestro estudio mostró una correlación positiva entre los niveles del
ARNm de gp91phox
en CMSP y GPx1 en T.A. (P=0,022 r=0,370) (Figura 18A), a
las 4 horas tras la ingesta de las comidas. Además, hemos encontrado
correlaciones negativas entre los niveles del ARNm de TXN en T.A. con los
niveles del ARNm de p47phox
en CMSP (P=0,008 r= -0,442) (Figura 18B) a las 4
horas tras la ingesta de las comidas. Igualmente, observamos correlaciones
negativas entre los niveles del ARNm de TXNRD1 en T.A. con los niveles del
ARNm de p47phox
y GPx1 en CMSP (P=0,045 r= -0,328 y P=0,038 r= -0,338,
respectivamente) (Figuras 18C y D).
Figura 18. Correlaciones entre A) niveles postprandiales del ARNm de GPx1 en T.A. y
gp91phox
en CMSP, B) niveles postprandiales del ARNm de TXN en T.A. y gp47phox
en
CMSP, C) niveles postprandiales del ARNm de TXNRD1 en T.A. y gp47phox
en CMSP,
D) niveles postprandiales del ARNm de TXNRD1 en T.A. y GPx1 en CMSP, tras 4 horas
de haber ingerido los desayunos con la misma composición grasa de la dieta. Coeficiente
de correlación lineal de Pearson.
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
Niv
ele
sA
RN
m
GP
x1 T
.A.
Niveles ARNm gp91phox CMSP
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80
Niv
ele
sA
RN
m T
XN
T.A
.
Niveles ARNm p47phox CMSP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80
Niv
ele
sA
RN
m T
XN
RD
1 T
.A.
Niveles ARNm p47phox CMSP
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.00 0.50 1.00 1.50
Niv
ele
sA
RN
m T
XN
RD
1 T
.A.
Niveles ARNm GPx1 CMSP
A B
C D
P=0,022 r=0,370
P=0,008 r= -0,442
P=0,045 r= -0,328
P=0,038 r= -0,338
Resultados
110
5. EFECTO DEL TIPO DE GRASA EN EL PROTEOMA
POSTPRANDIAL DE CMSP MEDIANTE PROTEÓMICA 2-D
La proteómica es una plataforma central en nutrigenómica y describe
cómo nuestro genoma se expresa en respuesta a determinados estímulos, como
pueden ser diferencias en la dieta [160]. No obstante, mientras que la proteómica
representa una novedosa y prometedora herramienta para descubrir mecanismos de
acción de los nutrientes, así como también para identificar posibles biomarcadores
de salud o enfermedad, el uso de esta técnica en ensayos de intervención dietética
es todavía bastante limitado [161].
En este bloque experimental hemos analizado la regulación que sufre el
proteoma de CMSP de pacientes con SMet en estado postprandial, en función del
tipo de grasa ingerida, lo que nos permitió identificar proteínas de respuesta rápida
ante la ingesta aguda de comidas con diferente composición grasa. Este estudio se
realizó antes de iniciar el periodo de intervención dietética. Los alimentos
utilizados en las comidas han sido detallados en el apartado de Diseño y
Metodología.
5.1. Análisis del efecto de la grasa en la dieta en el proteoma
Nuestro estudio consistió en comparar el proteoma antes (estado de
ayunas) y después (estado postprandial) de la ingesta aguda de cada una de las
comidas mediante electroforesis en 2-D, fracciones nucleares y citoplasmáticas de
CMSP por separado de pacientes con SMet. Se detectaron en promedio más de
400 spots en cada gel, tanto en los correspondientes a las fracciones nucleares
como citoplasmáticas.
En el análisis comparativo del proteoma de CMSP en ayunas y en estado
postprandial, observamos que la ingesta aguda de la comida HSFA aumentó la
expresión postprandial de cinco proteínas (ZFP2, SMC6, HLA-C, THBS1 y
PSME1) y redujo la de cinco proteínas (REV3-like, PDIA3, HSPA1A, FGB y
PLEC). Por su parte, la ingesta de la comida HMUFA aumentó la expresión
postprandial de tres proteínas (HSPA1A, HLA-A y PDIA3) y la reducción
Resultados
111
postprandial de otras tres proteínas (CCDC150, CEP290 y SERPIN B1). La
ingesta de la comida LFHCC aumentó la expresión postprandial de cuatro
proteínas (FLNA, GRIN1, HLA-C y HSPA6) y redujo la de una (MRLC3). Por
último, la ingesta de la comida LFHCC n-3 aumentó la expresión postprandial de
tres proteínas (VIM, PPIA, ALDH2) y redujo la de dos (CAPZB, ECH1).
Las proteínas identificadas cuya expresión postprandial es susceptible de
ser modulada por el tipo de grasa ingerida, se pueden agrupar en las siguientes
categorías, tomando como criterio la función que realizan:
(a) chaperonas moleculares y respuesta al stress (HSPA1A, HSPA6, PDIA3);
(b) interacción célula-célula (FGB, THBS1);
(c) mantenimiento del DNAe (SMC6, REV3-like, CEP290);
(d) filamentos estructurales o componentes del citoesqueleto (PLEC, FLNA,
VIM, MRLC3, CAPZB);
(e) enzimas y receptor (HLA-A, HLA-C, SERPIN B1, GRIN1, PPIA, ALDH2,
ECH1);
(f) otros (ZFP2, CCDC150, PSME1) (Figura 19).
Resultados
112
Figura 19. Proteómica 2-D PAGE del proteoma completo de las CMSP, fracción
nuclear (1) y la fracción citoplasmática (2). La separación de proteínas se llevó a cabo en
geles 2-D, utilizando tiras de 18 cm con pH 3-10 en la primera dimensión y geles SDS-
PAGE al 12% en la segunda dimensión, tal y como se describe en el apartado de Diseño y
Metodología. Las proteínas expresadas diferencialmente están indicadas con flechas. Los
números correspondientes a los spots se detallan en la Tabla 11.
pH 3 pH 10
1
23
11
19
20
12
5
6
4
9
10
17
13
15
18
7
8
21
22
23
14
16
pH 3 pH 10
Tabla 11. Efecto de la grasa de la dieta sobre los cambios postprandiales en el proteoma.
PC valor P M pI Nº acceso %ICM Cont. Pep. %IC Iones
Cambios postprandiales de las proteínas tras la ingesta aguda de una comida HSFA
Fracción nuclear
1. ZFP2: Zinc finger protein 2 homolog 3,27 0,036 54359,7 8,91 gi|47271457 8
2. SMC6: structural maintenance of chromosomes 6 2,35 0,006 35828 7,59 gi:122070455 99,919 11
3. REV3-like: catalytic subunit of DNA polymerase zeta (yeast), isoform CRA 0,44 0,031 37,5 9,6 gi:119568677 99,093
Fracción Citoplasmática
4. HLA-C: HLA class I histocompatibility antigen. Cw-1 alpha chain 3,90 0,030 24053,8 6,75 gi|599786 30,637 6
5. THBS1:Thrombospondin 2,53 0,043 42215,2 6,6 gi|553801 99,99 5 99,997
6. PSME1: Proteasome activator subunit 1 isoform 1 1,90 0,031 28754,9 6,28 gi|30581141 99,982 28 81,644
7. PDIA3: Protein disulfide-isomerase 0,58 0,043 52884,4 4,76 gi:2507460 100 8 100
8. HSPA1A: Heat shock 70kDa protein 1A 0,43 0,047 70280,1 5,48 gi|5123454 100 16 100
9. FGB: Fibrinogen beta chain. isoform CRA_f 0,33 0,026 44723,6 8,84 gi|119625340 100 9 99,834
10. PLEC: Plectin-1 0,32 0,049 518510,8 5,60 gi:209572726 99,322 33
Cambios postprandiales de las proteínas tras la ingesta aguda de una comida HMUFA
Fracción nuclear
11. CCDC150 protein 0,25 0,032 44114,5 9,47 gi|38541637 83,74 9
12. CEP290: Centrosomal protein of 290 kDa IE 0,018 268104,8 5,75 gi:116241294 99,941 26
Fracción Citoplasmática
8. HSPA1A: Heat shock 70kDa protein 1A 2,20 0,045 70110,0 5,42 gi|386785 100 16 100
13. HLA-A: MHC class I antigen 1,81 0,042 21139,1 5,77 gi|89152359 44,903 6
7. PDIA3: Protein disulfide isomerase 1,40 0,043 54453,6 6,78 gi|119597640 100 15 99,95
14. SERPIN B1: serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 1 0.36 0.036 42889.8 6.22 gi:266344 99.999 9 99.512
Tabla 11. Efecto de la grasa de la dieta sobre los cambios postprandiales en el proteoma (Continuación).
PC valor P M pI Nº acceso %ICM Cont. Pep. %IC Iones
Cambios postprandiales de las proteínas tras la ingesta aguda de una comida LFHCC
Fracción Citoplasmática
15. FLNA: filamin alpha (actin binding protein 280), isoform CRA_e 7,94 0,0434 266548,5 5,79 gi|119593154 100 15 100
16. GRIN1: glutamate receptor subunit zeta-1 2,73 0,0469 105373 8,5 gi:548377 99,274 14
4. HLA-C: HLA class I histocompatibility antigen. Cw-17 alpha chain 1,38 0,029 19045,2 6,95 gi:34395506 39,587 6
17. HSPA6: Heat shock 70kDa protein 6, variant 1,35 0,046 71416,3 5,81 gi|62898285 99,874 5 99,992
18. MRLC3: Myosin regulatory light chain 12A. 0,49 0,0397 19456,2 4,74 gi|127169 99,992 5 99,916
Cambios postprandiales de las proteínas tras la ingesta aguda de una comida LFHCC n-3A
Fracción nuclear
19. VIM: vimentin 1,94 0,031 53604,1 5,09 gi|47115317 53,109 6 73,579
20. PPIA: cyclophilin A 1,84 0,047 18039,9 8,37 gi|75766275 100 5 100
Fracción Citoplasmática
21. ALDH2: Aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial) 1,78 0,042 56932,9 6,63 gi|48146099 92,902 2 99,944
22. CAPZB: Capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta 0,69 0,045 29561,9 6,45 gi|55665440 100 7 100
23. ECH1: Enoyl Coenzyme A hydratase 1, peroxisomal IE 0,014 36077,5 8,47 gi|16924265 100 6 100
PC, porcentaje de cambio (niveles de proteínas en estado postprandial / niveles de proteínas en ayunas); valor P, valor P del t test, M, peso
molecular teórico; pI, punto isoeléctrico teórico; %ICM, índice de confianza del marcador; Cont. Pep., conteo de péptidos; IE,
infraexpresados, no se detecta en postprandial.
Resultados
115
5.2. Validación de los resultados obtenidos por proteómica 2-D, mediante
Western blot
Para confirmar los resultados obtenidos por proteómica 2-D, se decidió
utilizar una técnica independiente, como es el western blot, para analizar la
expresión de ocho proteínas identificadas mediante proteómica 2-D, los cuales
correspondieron a las siguientes categorías: tres chaperonas, dos enzimas, dos
componentes estructurales de la célula y una de interacción célula-célula y cuya
expresión iba desde represión 0,43 hasta sobreexpresión 2,45. La cuantificación de
estas proteínas mediante western blot, mostraron los mismos cambios inducidos
por la dieta que aquellos observados en la proteómica 2-D (Figura 20).
Resultados
116
Figura 20. Validación de la proteómica 2-D PAGE mediante Western Blot
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
THBS1 ALDH2 HSPA6
Un
idad
es
Arb
itra
rias
Fasting Postprandial
p=0.044 p=0.003 p=0.044
Ayunas Postprandio
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
ECH1 MRLC3 VIM
Un
idad
es
Arb
itra
rias
Fasting Postprandial
p=0.019 p=0.013 p=0.037
Ayunas Postprandio
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
HSPA1A PDIA3 HSPA1A PDIA3
Un
idad
es
Arb
itra
rias
Fasting Postprandial
p=0.049 p=0.066 p=0.014 p=0.099
Comida HSFA Comida HMUFA
Ayunas Postprandio
Resultados
117
5.3. Análisis de las rutas afectadas por el tipo de grasa en la comida
ingerida
Mediante el programa Ingenuity Pathway Analysis [153], se llevó a cabo
la identificación de las rutas moduladas por el tipo de grasa en la dieta. Nuestro
estudio mostró que la respuesta inflamatoria fue principal ruta afectada tras la
ingesta de la comida HSFA: HLA-C, THBS1 y PSME1, proteínas
sobreexpresadas; PLEC, FGB y HSPA1A, proteínas reprimidas. Así mismo, los
diferentes desórdenes genéticos fueron las principales funciones asociadas a las
proteínas expresadas diferencialmente tras la ingesta aguda de las comidas
HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3.
En términos de función molecular, la señalización e interacción célula-
célula (HSFA cinco proteínas, HMUFA dos proteínas y LFHCC cero proteínas),
junto con la replicación, recombinación y reparación de ADN (HSFA dos
proteínas, HMUFA dos proteínas y LFHCC cero proteínas), fueron las funciones
más representadas tras la ingesta de las comidas HSFA y HMUFA en comparación
con la comida LFHCC, pero no tras la ingesta de la comida LFHCC n-3
(señalización e interacción célula-célula, dos proteínas; replicación, recombinación
y reparación de ADN, dos proteínas). En cambio, las proteínas involucradas en la
organización y ensamblaje celular (HSFA una proteína, HMUFA una proteína,
LFHCC dos proteínas y LFHCC n-3 tres proteínas), así como aquellas
involucradas en la morfología celular (HSFA cero proteínas, HMUFA cero
proteínas, LFHCC dos proteínas y LFHCC n-3 dos proteínas) fueron funciones
más representadas tras la ingesta de ambas comidas LFHCC que tras la ingesta de
las comidas HSFA y HMUFA.
Con el fin de investigar si las proteínas expresadas diferencialmente
después de la ingesta de diferentes tipos de grasa interaccionan entre sí,
analizamos la relación entre las proteínas expresadas diferencialmente en el estado
postprandial después de la ingesta aguda de las cuatro comidas. El análisis de las
redes de interacción creó 15 diferentes subredes, que se agruparon en dos redes
Resultados
118
mediante la fusión de las subredes que compartían una o más proteínas. Las
principales funciones asociadas a la red 1 fueron el crecimiento, proliferación,
movimiento y desarrollo celular. En el caso de la red 2, fueron la respuesta
inflamatoria, la muerte celular, el crecimiento y proliferación celular. Por último,
fueron eliminadas aquellas proteínas que no se conectaban directamente a las
proteínas identificadas (Figura 21).
Resultados
119
Figura 21. Interacción entre las proteínas inducidas en estado postprandial.
Redes de proteínas expresadas diferencialmente en estado postprandial tras la ingesta
aguda de cuatro comidas con diferente tipo de grasa proveniente de la dieta que se
encontraban interconectadas e interactuando unas con otras. Los símbolos grises indican
que las proteínas estaban sobreexpresadas o reprimidas por la grasa de la dieta en estado
postprandial.
Nucleus
Cytoplasm
Extracellular Space
Network 1 Network 2
↑HMUFA
↑HSFA
↑HPUFA
↑HMUFA
↓HSFA
↑HPUFA
↑HSFA
↓HSFA
↑HMUFA
↓HSFA
↑HPUFA
n-3
↑HPUFA
n-3
VII. DISCUSIÓN
Discusión
123
Cantidad y tipo de grasa en la dieta y el estrés oxidativo en tejido adiposo
El consumo de una dieta rica en ácidos grasos saturados, afecta
negativamente los niveles de colesterol, marcadores inflamatorios y de estrés
oxidativo dando lugar al desarrollo de obesidad, resistencia a la insulina y
enfermedad cardiovascular [93, 162, 163]. Los estudios de intervención dietética a
largo plazo, tienen como objetivo la búsqueda de un modelo dietético idóneo para
la prevención y el tratamiento de numerosas patologías, y generalmente
administran dietas hipo- y normo-calóricas con una duración de entre 4 a 24
semanas [164-166]. El hecho de que se utilicen dietas normocalóricas e
isoenergéticas (dietas con aporte energético similar) en los estudios de
intervención, permite estudiar los cambios metabólicos en respuesta a
determinados alimentos y/o nutrientes sin influir en el peso corporal [11, 104, 154,
167-169]. Por otra parte, las dietas hipocalóricas, además de la pérdida de peso
provocan cambios más acentuados en el perfil metabólico debido a la pérdida de
tejido adiposo y muscular provocando desajustes hormonales, lo que puede
enmascarar el efecto real del o los alimentos y/o nutrientes estudiados [170-172].
Así pues, en la intervención dietética llevada a cabo en este estudio, se
administraron cuatro dietas normocalóricas e isoenergéticas para determinar los
efectos sobre el perfil metabólico y bioquímico del organismo y sobre los factores
de riesgo del SMet, en respuesta a la ingesta de los alimentos y/o nutrientes que se
investigan [164-168].
El desequilibrio entre la producción de radicales libres y su eliminación
por los sistemas antioxidantes produce una situación de estrés oxidativo, lo que da
lugar a daño celular [1] y a alteraciones en biomoléculas tales como lípidos,
proteínas y ácidos nucleicos [173]. Estudios en animales han demostrado que el
elevado estrés oxidativo sistémico que tiene lugar en condiciones de obesidad, es
causado por la producción de ROS en el tejido adiposo pero no en otros tejidos,
como consecuencia de un incremento en la expresión de la NADPH-oxidasa,
complejo enzimático generador de ROS [99] y la disminución en la expresión de
Discusión
124
enzimas antioxidantes [26]. En este contexto nuestros resultados sugieren que la
generación de estrés oxidativo en el tejido adiposo de humanos puede ser
modulado por la grasa de la dieta.
En estado postprandial, situación en la que la mayoría de las personas pasa
la mayor parte del día, se ha observado que la expresión de las subunidades de la
NADPH-oxidasa se incrementa y el proceso de detoxificación de ROS se ve
reducido por la disminución en la expresión de algunas de las enzimas
antioxidantes y por lo tanto, se produce un desequilibrio que da como resultado el
incremento del estrés oxidativo postprandial tras la ingesta de la comida HSFA,
situación que no ocurre tras la ingesta de las comidas HMUFA y ambas comidas
LFHCC. Nuestros resultados concuerdan con un estudio previo de la misma
población a la que hace referencia ésta tesis, donde se demostró que la dieta
HMUFA reduce los niveles plasmáticos de los parámetros relacionados con estrés
oxidativo en comparación con los efectos de la dieta HSFA y de ambas dietas
LFHCC, las cuales tuvieron un efecto intermedio entre las dietas HMUFA y
HSFA [11].
Debido a los hábitos alimentarios de hoy en día, la duración del
postprandio se extiende durante varias horas e incluso actualmente, las personas
pasan la mayor parte del día en estado postprandial [174], el cual es básicamente
una condición de estrés, como el incremento de estrés oxidativo que ocurre tras la
ingesta de alimentos [143, 175, 176]. Aunque las ROS se generan en condiciones
fisiológicas como subproductos del metabolismo, varias enzimas incluyendo la
NADPH-oxidasa generan ROS [99]. La NADPH-oxidasa, además de expresarse
en las células fagocíticas, también lo hace en las células no fagocíticas del tejido
adiposo [119]. La obesidad, componente central del SMet [80-82], está asociada
con la acumulación de macrófagos en tejido adiposo [66, 119], donde se producen
y liberan especies reactivas de oxígeno por la NADPH-oxidasa durante la
explosión oxidativa (del inglés respiratory burst) [177, 178].
Discusión
125
Nuestro estudio demostró que los niveles del ARNm de las subunidades de la
NADPH-oxidasa se incrementaron en estado postprandial, siguiendo un patrón
definido de sobreexpresión, tras la ingesta de la comida HSFA. Por lo tanto, la
sobreexpresión de las subunidades de la NADPH-oxidasa en tejido adiposo podría
ser la causa del incremento de estrés oxidativo tras la ingesta de la comida HSFA
observado en nuestro estudio previo [11].
Los niveles del ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa se ven
aumentados en el tejido adiposo de ratones obesos [26, 179, 180] y en personas
con SMet [154].
Las enzimas antioxidantes tales como SOD, CAT y GPxs pertenecen a la
primera línea de defensa antioxidante ante la agresión de las ROS durante el estrés
oxidativo. Nuestro estudio mostró que la ingesta de la comida HSFA reduce la
expresión postprandial disminuida de varios de los genes del sistema de defensa
antioxidante, CAT, GPx1, GPx3 y TXNRD1. La función de la enzima SOD es
catalizar la dismutación del O2•−
a H2O2 y O2, donde el H2O2 su vez es convertido a
agua y oxígeno molecular por las enzimas CAT o GPx. En la familia de isoenzimas
GPxs, la isoforma GPx4 se encarga de la detoxificación de hidroperóxidos
lipídicos generados mediante la interacción de lípidos con el anión superóxido
[111, 181, 182]. Nuestros resultados sugieren que es la isoforma mitocondrial,
SOD2 en lugar de la isoforma SOD1, la principal responsable de la dismutación de
O2•−
en el tejido adiposo durante el periodo postprandial, en base a que los niveles
del ARNm de SOD2 aumentan en estado postprandial, y por el contrario no
encontramos cambios significativos en la expresión de la enzima SOD1.
Nuestro estudio sugiere que la detoxificación del H2O2 por las enzimas
CAT, GPx1 y GPx3 disminuye tras la ingesta de la comida HSFA, en tejido
adiposo. Por el contrario, la detoxificación del H2O2 parece aumentar tras la
ingesta de la comida HMUFA en base al aumento de los niveles del ARNm de las
enzimas CAT y GPx1 observado. Estos resultados sugieren que la comida HSFA
reduce los niveles del ARNm de los genes antioxidantes CAT, GPx1 y GPx3,
Discusión
126
involucrados en la dismutación de O2•−
y la posterior eliminación de H2O2,
resultados respaldados por un estudio previo realizado por nuestro grupo, en el
cual se observó un incremento postprandial de H2O2 en plasma la ingesta de la
comida HSFA comparado con las demás comidas administradas a los pacientes
[11]. Por otra parte, los niveles de ARNm de GPx4, aumentaron tras la ingesta de
una comida HSFA, siendo estos niveles de ARNm postprandiales mayores que
tras la ingesta de las comidas HMUFA y ambas LFHCC. Esto, sugiere que la
expresión de GPx4, enzima responsable de la detoxificación de hidroperóxidos
lipídicos, aumenta en consecuencia del aumento de la peroxidación lipídica
provocado por un elevado estrés oxidativo postprandial tras la ingesta de la
comida HSFA [183, 184].
El sistema tiorredoxina es un sistema oxidorreductasa ubicuo con función
antioxidante y de regulación redox. Este sistema se compone de las proteínas
Tiorredoxina (TXN) y Tiorredoxina reductasa (TXNRD1), además de la enzima
NADPH [43]. Aunque no hemos encontrado diferencias entre dietas en los niveles
de ARNm de TXN, sí que observamos una disminución postprandial en los niveles
de ARNm de TXNRD1, enzima que reduce a TXN [185], sugiriendo que la
capacidad para reciclar la proteína TXN de la forma oxidada a la reducida, se ve
disminuida tras la ingesta de la comida HSFA. Por el contrario, la ingesta de una
comida HMUFA y ambas comidas LFHCC aumentaron los niveles de ARNm de
TXNRD1 en estado postprandial.
Los resultados de expresión génica observados en ayunas reflejan la
activación del sistema de defensa antioxidante contra el estrés oxidativo generado
tras el consumo de la dieta HSFA, sistema de defensa antioxidante cuya inducción
se ve reducida en estado postprandial con esta dieta lo que se refleja en unos
menores niveles postprandiales de ARNm de enzimas antioxidantes [154]. Estos
resultados, coinciden con estudios realizados en tejido adiposo de modelos
animales obesos y diabéticos, respecto a la disminución de los antioxidantes SOD,
CAT y GPx [26, 186, 187].
Discusión
127
Posiblemente el ataque que sufren las células en estado de ayunas es
menos agresivo, por lo que todavía el sistema de defensa antioxidante puede
responder, en cambio difiere de lo que ocurre en estado postprandial donde el
sistema de defensa antioxidante se ve claramente deteriorado [154].
La grasa acumulada per se incrementa el estrés oxidativo en la obesidad,
incrementando la NADPH-oxidasa y disminuyendo los antioxidantes
probablemente como resultado de la disfunción del tejido adiposo [26].
Por otra parte, también se analizó NFE2L2, factor de transcripción que
regula la expresión de numerosos genes que codifican para proteínas antioxidantes
y enzimas de fase II. El balance entre la producción de ROS y su detoxificación
por las enzimas antioxidantes está regulado por el factor de transcripción NFE2L2
[188], el cual migra al núcleo como respuesta al estrés oxidativo y promueve la
expresión de genes antioxidantes [189, 190]. En ausencia de estrés en las células,
el NFE2L2 se encuentra regulado por Keap1 en el citoplasma, y se encuentra en
constante ubiquitinación por el complejo Cul3-Keap1 ubiquitin ligasa, por lo tanto
NFE2L2 es degradado rápidamente por el proteosoma [46-48]. De acuerdo con
esto, la disminución de los niveles de ARNm de NFE2L2 observados en aquellos
pacientes que consumieron una comida HSFA podría explicarse por el hecho de
que, esos mismos pacientes presentaron niveles más altos del ARNm de Keap1 en
comparación con los pacientes que consumieron las demás comidas. Una posible
explicación es que los ácidos grasos saturados están bloqueando la expresión de
genes antioxidantes y por lo tanto causan un incremento del estrés oxidativo
mediante el aumento en los niveles de ARNm de Keap1.
Discusión
128
Células mononucleares de sangre periférica efectos a largo plazo
Las CMSP (linfocitos y monocitos) desempeñan un papel importante en el
sistema inmunológico [113, 155]. La inflamación de bajo grado se asocia con la
activación de las CMSP y con cambios en la expresión de citoquinas relacionadas
con la inflamación y la respuesta inmune, tales como la interleuquina-6 y el factor
de necrosis tumoral- [156, 157]. Además, se ha demostrado que las CMSP son
útiles para distinguir entre un estado de salud y de enfermedad, alterando su perfil
normal de liberación de proteínas a otro mucho más pro-inflamatorio en presencia
de enfermedad [191, 192], y tras la ingesta dietética, reflejando lo que ocurre a
nivel sistémico modificando la expresión de genes relacionados con la inflamación
y el estrés oxidativo [104, 133, 137, 156]. En este bloque experimental analizamos
el uso de las CMSP como modelo celular in vivo, mediante estudios de expresión
de genes relacionados con el estrés oxidativo, ante el estímulo provocado por la
grasa de la dieta y como biomarcadores del estrés oxidativo generado en el tejido
adiposo.
Nuestros resultados muestran que la ingesta de una comida HSFA
aumenta en las CMSP los niveles postprandiales de ARNm de SOD1, SOD2, CAT,
GPx1, GPx4, GSR, TXN y TXNRD1, genes involucrados en la defensa
antioxidante, en respuesta al estrés oxidativo, mientras que en estado de ayunas los
niveles de ARNm de los genes antioxidantes, SOD1, SOD2, CAT, GPx1, GPx4,
GSR, TXN y NFE2L2, aumentaron con todas las dietas tras las 12 semanas de
intervención dietética, lo que sugiere una respuesta adaptativa a la dieta que en
estado de ayunas no parece discriminar entre la cantidad y tipo de grasa. No
obstante, la ingesta de la comida HSFA aumentó la expresión postprandial de los
genes que codifican para las diferentes subunidades del complejo enzimático
generador de ROS [99] NADPH-oxidasa (gp91phox
, p22phox
, p47phox
y p40phox
).
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en estudios previos en esta
misma población, basados en los parámetros de estrés oxidativo en plasma, donde
la ingesta de una comida HSFA aumentó el estrés oxidativo postprandial en
Discusión
129
comparación con la ingesta de las demás comidas [11]. No obstante, en tejido
adiposo subcutáneo, se observó un incremento en los niveles de ARNm de las
subunidades de la NADPH-oxidasa y una disminución en la expresión del ARNm
de las enzimas antioxidantes tras la ingesta de una comida HSFA, lo que sugiere
un aumento de estrés oxidativo en este tejido [154]. Estas observaciones apoyan la
idea de que los cambios en los parámetros oxidativos observados en las CMSP
reflejan, lo que ocurre en el tejido adiposo de pacientes con SMet, es decir,
responden al estrés oxidativo generado en el tejido adiposo.
De acuerdo al estilo de vida actual, la mayoría de las personas pasan gran
parte del día en estado postprandial [123], condición que se caracteriza por un
incremento del estrés oxidativo [143, 175, 176], causado por un desequilibrio entre
la producción de ROS como subproductos del metabolismo o generados por el
complejo enzimático NADPH-oxidasa [26, 137] y la detoxificación de las ROS
por los antioxidantes [1, 193].
No obstante, el estrés oxidativo postprandial puede ser modulado por la
dieta según resultados observados en varios estudios [11, 107, 136, 137, 194]. De
hecho, estos estudios demostraron que el consumo de ácidos grasos saturados
causa efectos nocivos relacionados con el incremento de marcadores inflamatorios
y de estrés oxidativo; este último causado por la generación de ROS como
subproductos del metabolismo, así como también por el complejo enzimático
NADPH-oxidasa [26, 99, 137, 194]. De acuerdo con esto, se observó un aumento
postprandial de los niveles de ARNm de SOD1, SOD2, GPx1, GPx4, GSR, TXN y
TXNRD1 en CMSP, a las 2 horas de la ingesta de la comida HSFA, mientras que
estos mismos genes antioxidantes se mantuvieron sin cambios tras la ingesta de las
demás comidas.
Ha sido demostrado que en respuesta al estrés oxidativo, las células
incrementan su sistema de defensa antioxidante [11, 137, 143], por lo que el
incremento postprandial que hemos observado en los niveles de ARNm de SOD1,
SOD2, CAT, GPx1 y GPx4 a las 2 horas, podría ser consecuencia del estrés
Discusión
130
oxidativo postprandial generado tras la ingesta de la comida HSFA a diferencia de
las demás comidas administradas a los pacientes [11]. Por el contrario, en el tejido
adiposo se observó la disminución postprandial en los niveles de ARNm de varios
antioxidantes tales como CAT, GPx1, GPx3 y TXNRD1 tras la ingesta de la
comida HSFA [154] de un subgrupo de la población analizada en este estudio, lo
que causa, al menos en parte, un desequilibrio entre la generación de ROS y la
detoxificación tras la ingesta de la comida HSFA, dando lugar al incremento del
estado oxidativo [11, 154].
Las CMSP han sido ampliamente utilizadas para estudiar los cambios en el
estado inflamatorio y de estrés oxidativo inducidos por la intervención dietética
[136, 137]. Sin embargo, en términos de estrés oxidativo, los resultados
encontrados en CMSP eran contradictorios con la hipótesis de Furukawa, respecto
al incremento del estrés oxidativo sistémico generado por el tejido adiposo como
consecuencia de la disminución de la expresión de genes antioxidantes [26, 154],
ya que los estudios en CMSP demostraron el incremento de su sistema de defensa
antioxidante cuando aumenta el estrés oxidativo [136, 137, 195].
Nuestros resultados sugieren que la maquinaria de defensa antioxidante en
las CMSP se activa en estado postprandial mediante el aumento en los niveles de
ARNm de los genes antioxidantes tras la ingesta de la comida HSFA, mientras que
en ayunas, la expresión de estos genes parece aumentar de manera constitutiva tras
el consumo de todas las dietas [136, 137, 154].
Basados en estudios previos de esta población, y en lo referente a los
incrementados niveles postprandiales de ARNm de los antioxidantes SOD1,
SOD2, CAT, GPx1 yGPx4 a las 2 h de la ingesta de una comida HSFA, sugiere
que el incremento del estrés oxidativo postprandial es generado en el tejido
adiposo tras la ingesta de la comida HSFA [11, 154], y en respuesta a este
aumento del estrés oxidativo, las células mononucleares de sangre periférica
parecen reforzar sus defensas antioxidantes mediante el aumento de la expresión
de los genes antioxidantes.
Discusión
131
Junto con los cambios en la expresión génica descritos en párrafos
anteriores, también observamos que la ingesta de la comida HSFA aumentó los
niveles de ARNm de GSR y TXNRD1 en comparación con la ingesta de las
comidas HMUFA, LFHCC y LFHCC n-3. La función de la GSR es catalizar la
reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH), el cual es
utilizado como sustrato por la GPx en presencia de H2O2 [37, 38], por su parte, la
TXNRD1 en una oxidorreductasa que depende de NADPH y transfiere los
electrones al sitio activo de la TXN oxidada (disulfuro -S2) y ésta se reduce (ditiol
[-(SH)2]), luego se transfieren los equivalentes reductores a los grupos disulfuro
de las proteínas diana y la TXN se oxida de nuevo [44, 45] [185]. Por lo tanto, es
probable que el aumento en los niveles de ARNm de GSR y TXNRD1 a las 2 horas
del consumo de una comida HSFA, incremente la presencia de GSH y TXN en su
forma reducida para reforzar los sistemas antioxidantes de la célula, con el fin de
disminuir el estrés oxidativo inducido por la ingesta de grasa saturada, así como
también reducir la oxidación de macromoléculas o proteínas [196], probablemente
más abundantes tras la ingesta de la comida HSFA, basándonos en nuestros
estudios previos [11, 154].
En condiciones de estrés oxidativo, el complejo KEAP1-NFE2L2
localizado en el citoplasma se rompe, y NFE2L2 migra al núcleo para unirse
específicamente a ARE (elemento de respuesta antioxidante) y promover la
expresión de genes que codifican la respuesta antioxidantes tales como CAT, SOD
y GPx [49, 137]. De acuerdo con los cambios de expresión génica observados tras
la ingesta de la comida HSFA, también observamos un incremento en los niveles
de la proteína NFE2L2 en la fracción nuclear, así como su descenso en la fracción
citoplasmática tras la ingesta de la comida HSFA, lo cual pudo haber ocurrido
como una respuesta al aumento de ROS tras la comida HSFA. Estos resultados
coinciden con un estudio previo llevado a cabo en una población de personas
mayores [137].
Discusión
132
Como ya hemos señalado antes, las especies reactivas de oxígeno son
generadas como subproductos del metabolismo, pero varias enzimas, incluso la
NADPH-oxidasa está relacionada con la producción de ROS [186, 197]. Estudios
en modelos animales demostraron que el consumo de dietas altas en grasas,
incrementan la expresión de NADPH-oxidasa [136, 137]. Así mismo, nuestro
grupo ha demostrado que la calidad de la grasa de la dieta es también un factor que
puede modular la expresión de este complejo enzimático [137]. De hecho, se
observó que el consumo de grasa saturada induce un incremento en la expresión
postprandial de subunidades de la NADPH-oxidasa, p22phox
y p47phox
en
comparación con el consumo de grasa monoinsaturada. De acuerdo con esto,
hemos demostrado que en CMSP de pacientes con SMet, la ingesta de una comida
HSFA incrementa los niveles de ARNm de las subunidades de la NADPH-oxidasa
tales como p91phox
, p47phox
y p40phox
y del factor de transcripción PU.1 relacionado
con la regulación positiva de la transcripción de p91phox
[198]. A diferencia de los
genes antioxidantes, los cuales son inducidos en las CMSP y disminuyen en tejido
adiposo tras la ingesta de una comida HSFA, la expresión de las subunidades de la
NADPH-oxidasa parece incrementar tanto en CMSP como en tejido adiposo tras
la ingesta de la comida HSFA y se mantiene sin cambios tras la ingesta de las otras
tres comidas en CMSP y en tejido adiposo.
Cabe destacar que hemos observado un estrecho paralelismo entre los
cambios en la expresión génica tras la ingesta de la comida HSFA, donde se
incrementa la expresión de genes antioxidantes a las 2 horas de la ingesta y
descienden a las 4 h hasta niveles basales, y los parámetros plasmáticos de estrés
oxidativo, los cuales se incrementan a las 2 h de la ingesta y descienden hasta
niveles basales a las 4 horas [11]. De acuerdo con esto, nuestros resultados
también demostraron una correlación positiva entre varios parámetros de estrés
oxidativo tales como H2O2, proteínas carboniladas y lipoperóxidos con la
expresión génica de las subunidades de la NADPH-oxidasa y genes antioxidantes
en estado postprandial.
Discusión
133
Con estas observaciones demostramos que el incremento en la expresión
de genes antioxidantes tienen lugar en las CMSP en respuesta al incremento en la
expresión de las subunidades de la NADPH-oxidasa y el aumento de ROS tras la
ingesta de una comida HSFA, situación en la cual se generan productos
secundarios tales como H2O2, proteínas carboniladas y lipoperóxidos produciendo
daño oxidativo.
Proteómica. Efecto postprandial agudo
La importancia de nuestro estudio radica en que muestra la respuesta
postprandial del proteoma a diferentes modelos dietéticos en pacientes con SMet,
cuya etiología está relacionada precisamente con los hábitos alimenticios, y entre
los que se destaca el tipo de grasa de la dieta [79]. Nuestro abordaje proteómico
nos proporcionó 23 proteínas expresadas diferencialmente en estado postprandial
tras la ingesta aguda de cuatro comidas con diferentes calidades de grasa. Las
comidas HSFA y HMUFA causaron cambios proteómicos postprandiales en
procesos tales como señalización e interacción celular y la reparación del ADN.
En contraste, la ingesta de la comida LFHCC provocó cambios postprandiales en
las proteínas implicadas en procesos tales como ensamblaje y organización celular
o morfología celular. Además, la suplementación de una comida LFHCC con
PUFA n-3 de cadena larga provocó cambios en el proteoma relacionado con la
señalización e interacción celular, reparación del ADN, ensamblaje y organización
celular, y la morfología celular.
En el presente estudio demostramos que a pesar de la heterogeneidad de
las sobrecargas grasas administradas en forma de comida, en términos de calidad
de la grasa, la mayor parte de las proteínas de la respuesta postprandial aguda,
podrían agruparse en una red interconectada y asociada a funciones celulares tales
como crecimiento y proliferación celular (red 1), la cual podría ser clave para el
desarrollo de la aterosclerosis ya que se ha demostrado que la progresión de esta
enfermedad está asociada con la expansión clonal de las células T [199].
Discusión
134
No obstante, ninguno de los modelos dietéticos administrados mostró un
perfil proteómico que indique de forma clara que alguna de las comidas provoque
la inducción o represión del crecimiento y la proliferación de CMSP. El hecho de
que la ingesta de las comidas provocó el aumento o disminución en la expresión
postprandial de sólo una o dos proteínas en la red 1, sugiere que la grasa de la
dieta podría afectar a los procesos de crecimiento y proliferación celular en estado
postprandial, pero no en las proporciones de ácidos grasos o las dosis
administradas en nuestro estudio.
Cabe destacar que, varias de las proteínas expresadas diferencialmente o
las isoformas de proteínas observadas en nuestro estudio [proteína de choque
térmico (HSPA1A, HSPA6), cadena reguladora de miosina, subunidad activadora
del proteasoma, filamina alfa, cadena beta de fibrinógeno y trombospondina] han
demostrado ser moduladas por las isoflavonas de la soja en ayunas tras una
intervención dietética a largo plazo [134]. Este estudio mostró el efecto crónico de
una dieta con extracto de soja enriquecida con isoflavonas en mujeres
posmenopáusicas. Estos hallazgos, junto con los nuestros apoyan la idea de que
estas proteínas son sensibles a la modulación por la intervención dietética.
El estado postprandial se relaciona con un aumento en la producción de
ROS, lo que puede causar daño a las macromoléculas biológicas tales como las
proteínas y el ADN [200, 201]. La proteína HSPA1A, es un miembro de la familia
de las proteínas de choque térmico [202], cuya expresión génica es reprimida por
p53, cuando está activada por daño al ADN [203]. Estudios previos realizados en
nuestro laboratorio han demostrado que la ingesta de una comida HMUFA,
después del consumo a largo plazo de una dieta rica en MUFA disminuye varios
biomarcadores de estrés oxidativo postprandial en comparación con la ingesta de
la comida HSFA después del consumo a largo plazo de una dieta rica en SFA [11].
Teniendo en cuenta que p53 tiene funciones antioxidantes que protegen al genoma
de la oxidación producida por el estrés oxidativo [204, 205], nuestros resultados
sugieren que la activación de p53 por el estrés oxidativo postprandial tras la
Discusión
135
ingesta de una comida HSFA - probablemente por daño al ADN, tal como se
demostró previamente en un población de edad avanzada [206] - podría ser
responsable de la reducción postprandial de la proteína HSPA1A y, el efecto
contrario, el aumento postprandial tras la ingesta de una comida HMUFA, lo que
puede explicarse por la falta de activación postprandial de p53.
Cabe destacar que, la proteína THBS-1, una glicoproteína de adhesión
celular cuya expresión génica es incrementada por p53 [207], aumentó su
expresión postprandial tras la ingesta de la comida HSFA y se mantuvo sin
cambios tras la ingesta de las otras tres comidas. Esta glicoproteína está
involucrada en la agregación plaquetaria [208], un proceso fisiológico de defensa
contra la hemorragia no controlada, pero que en ciertas condiciones puede llegar a
ocluir los vasos sanguíneos con trombos, lo que puede llegar a provocar la
aparición de eventos cardiovasculares, incluyendo angina inestable e infarto de
miocardio [209]. De hecho, también observamos una disminución postprandial en
la cadena beta de fibrinógeno (FGB), cuya síntesis es la etapa limitante en la
producción de fibrinógeno maduro [210]. El fibrinógeno es cortado por la
trombina para formar fibrina insoluble, que es el componente más abundante de
los coágulos de sangre [211]. Por lo tanto, la disminución postprandial de FGB
tras la ingesta de la comida HSFA sugiere un aumento en la producción de fibrina
por corte y liberación, lo que reduce la cantidad de sustrato, FGB.
Tanto el aumento postprandial de la proteína THSB1, como la
disminución de FGB sugieren un estado pro-coagulante, tras la ingesta de la
comida HSFA en comparación con la ingesta de las otras comidas estudiadas. En
este sentido, se ha relacionado el desequilibrio entre la actividad pro-coagulante y
pro-fibrinolíticas con cardiopatía coronaria [212]. Esto es básicamente importante
en pacientes con SMet, ya que presentan un estado protrombótico en estado de
ayunas [69] que parece incrementarse en estado postprandial tras la ingesta de la
comida HSFA.
Discusión
136
La idea de que varios de los cambios postprandiales observados en el
proteoma sean debido al aumento del estrés oxidativo postprandial tras la ingesta
de la comida HSFA, se apoya en el hecho de que SMC6, una proteína implicada
en el mantenimiento de la estructura de los cromosomas [213] y PSME1, un
activador del proteosoma [214] que recientemente ha sido relacionado con la
protección frente al estrés oxidativo [215], aumentaron su expresión postprandial
en aquellos pacientes que consumieron esta dieta. Por otra parte, REV3, una
proteína implicada en la síntesis del ADN de translesión [216], disminuyó su
expresión tras la ingesta de la comida HSFA. Cabe destacar, que los niveles de las
proteínas SMC6, PSME1 y REV3 se mantuvieron sin cambios tras la ingesta de
las otras tres comidas.
Por otro lado, PDIA3 (también llamado ERp57) pertenece a una familia de
oxidorreductasas, que incluyen a PDI, ERp72, P5 y PDIR que están implicados en
la formación de enlaces disulfuro nativos, y en condiciones de estrés oxidativo, las
oxidorreductasas se reducen rápidamente y permanecen activas. Cabe destacar
que, PDIA3 ha demostrado ser reducido directamente por el glutatión [217], una
molécula que aumenta en el estado postprandial tras una comida HMUFA luego
del consumo a largo plazo de una dieta rica en MUFA, y disminuye tras la ingesta
de la comida HSFA luego del consumo a largo plazo de una dieta rica en SFA en
nuestra población [11]. En conjunto, estos resultados indican que la dieta HSFA
podría disminuir los niveles de PDIA3 a corto plazo y reprimir la actividad de la
enzima, cuando el componente responsable de su reducción (glutatión) es escaso
(es decir, tras la ingesta a largo plazo de una dieta HSFA). Por el contrario, la
expresión postprandial aumentó tras la ingesta de la comida HMUFA, así como los
niveles de glutatión pueden ser mayores que los observados tras la ingesta de la
comida HSFA, como ha sido demostrado por Pérez-Martínez et al. [11].
En su conjunto, estos hallazgos sugieren que el proteoma o al menos en
parte, parece estar respondiendo al estado oxidativo en estado postprandial tras la
ingesta de las diferentes comidas administradas en este estudio, directamente y
Discusión
137
mediante el daño al ADN. Además de la relación con el estrés oxidativo, la ruta
principal asociada con las proteínas expresadas diferencialmente tras la ingesta de
la comida HSFA, fue la respuesta inflamatoria, lo cual apoya la relación entre el
estrés oxidativo y la inflamación [101, 218]. Cabe destacar que, aunque HSPA1A
y PDIA3 pertenecen a la familia de las proteínas asociadas al estrés de retículo
endoplásmico (HSP70 y PDI), estas isoformas parecen responder al estrés
oxidativo en lugar de responder al estrés de retículo endoplásmico, que a su vez
está relacionado con el estrés oxidativo [219], y esto apoya el concepto de que la
respuesta al mal plegamiento de las proteínas cumple un amplio espectro de
funciones fisiológicas [220]. Por lo tanto, en condiciones de estrés oxidativo
postprandial elevado (es decir, tras la ingesta de una comida HSFA), que parece
tener una deficiencia en la respuesta al mal plegamiento de las proteínas en
pacientes con SMet, lo que también podría contribuir al deterioro del estado
postprandial de estos pacientes.
Cuando las comidas contenían porcentajes similares de SFA y MUFA
(comidas LFHCC), no se observaron cambios en el proteoma relacionados con el
estrés oxidativo, probablemente debido a una situación intermedia entre las
comidas HSFA y HMUFA. Sin embargo, la ingesta de las comidas LFHCC (con o
sin suplementos de n-3) parecen causar cambios postprandiales en la morfología
celular, según lo sugiere la reducción postprandial observada en FLNA (filamina
alfa) y MRLC3 (cadena ligera reguladora de la miosina) tras la ingesta de LFHCC,
y VIM (vimentina) y CAPZB (Capping protein, filamentos de actina) tras la
ingesta de LFHCC suplementada con ácidos grasos n-3de cadena larga.
Además, la suplementación de una comida LFHCC con PUFA n-3 de
cadena larga dio lugar a un cambio en el proteoma relacionado con el metabolismo
de ácidos grasos. La beta-oxidación de ácidos grasos se lleva a cabo tanto en las
mitocondrias como en los peroxisomas. Las mitocondrias catalizan la beta-
oxidación de la mayor parte de los ácidos grasos derivados de la dieta, y los
peroxisomas están involucrados preferentemente, en la beta-oxidación del
Discusión
138
acortamiento de la cadena de ácidos grasos de cadena larga [221]. Se ha sugerido
que la ingesta incrementada o suplementación con ácidos grasos n-3 pueden
mejorar los defectos en la señalización de insulina [222]. Pues, se ha demostrado
que la beta-oxidación peroxisomal es inhibida por la insulina [223] y el hecho de
que en nuestro estudio observamos que los niveles de la proteína ECH1, una
enzima implicada en la vía de la beta-oxidación peroxisomal [224], disminuyó tras
la ingesta de una comida LFHCC n-3, sugiere que la reducción postprandial en la
expresión de ECH1 y la consiguiente reducción de la beta-oxidación peroxisomal
podrían ser la base de efectos beneficiosos en la señalización de insulina
observada tras la ingesta de ácidos grasos n-3, y por consiguiente sugiere que la
inhibición de la beta-oxidación peroxisomal por la insulina podría ser causado por
la reducción postprandial en la expresión de la proteína ECH1.
Así mismo, la suplementación de una comida LFHCC con PUFA n-3 dio
lugar al aumento en la expresión postprandial de PPIA (ciclofilina A), una proteína
que se une a la ciclosporina, un inmunosupresor que por lo general se utiliza para
evitar el rechazo en órganos trasplantados, mediante la interrupción en la
producción de moléculas pro-inflamatorias TNF-α e interleucina-2 [225], y que
está involucrada también en los efectos anti-inflamatorios asociados al consumo
de ácidos grasos n-3 [226]. Por lo tanto, el consumo de PUFA n-3 podría potenciar
el efecto de la ciclosporina, lo cual apoyaría la idea de la administración
terapéutica de PUFA n-3 en combinación con ciclosporina después de un
trasplante de órganos.
Discusión
139
Discusión general
Desde una perspectiva general, este trabajo aporta información relevante
sobre el efecto de la cantidad y calidad de la grasa en la dieta sobre el estrés
oxidativo postprandial. La importancia de realizar estudios postprandiales frente a
realizarlos analizando el efecto de la dieta en ayunas, radica en el hecho de que en
la actualidad, el estado postprandial es el estado en el que las personas pasamos la
mayor parte del tiempo.
Este trabajo de tesis doctoral muestra por un lado el efecto de la ingesta
aguda de comidas con diferente tipo de grasa, llevado a cabo antes del periodo de
intervención dietética, lo que nos ha permitido identificar proteínas de respuesta
rápida a la grasa en la dieta sin el enmascaramiento que pudiera derivarse de
efectos adaptativos tras un periodo de consumo a largo plazo, y por otro, el efecto
postprandial tras el periodo de intervención dietética, tras las 12 semanas de
intervención dietética, una situación más extrapolable a la vida real de las personas
que siguen diferentes modelos de dietas en función del lugar que habitan (dieta
occidental, dieta mediterránea y la dieta oriental) o por elección de un modelo de
dieta en concreto.
Nuestros resultados han demostrado que en el estado postprandial,
situación en la que las personas pasan la mayor parte del día, la expresión de las
subunidades de la NADPH-oxidasa aumentan y el proceso de detoxificación de
ROS disminuye, mediante la disminución de la expresión de genes antioxidantes,
tras la ingesta de la comida HSFA, lo que sugiere que el consumo de grasa
saturada genera un aumento del estrés oxidativo en el tejido adiposo de personas
con SMet, lo cual parece incrementar el estrés oxidativo sistémico reflejado en
nuestros resultados en CMSP, en contrapartida con el estudio previo basado en
medidas plasmáticas de marcadores de estrés oxidativo.
En términos de estrés oxidativo, este mecanismo concuerda con el
propuesto por Furukawa [26], quien describió el mecanismo por el cual el estrés
oxidativo sistémico observado en la obesidad, es causado por la producción de
Discusión
140
ROS en el tejido adiposo y no en otros tejidos, como consecuencia de un aumento
en la expresión de la NADPH-oxidasa y una disminución en la expresión de los
antioxidantes [26]. Esto sugiere que, el estrés oxidativo postprandial observado en
nuestro estudio, podría ser generado en el tejido adiposo tras la ingesta de la
comida HSFA [11, 154], debido al incremento en la expresión de la NADPH-
oxidasa y la disminución de genes antioxidantes [154] y además, verse reflejado
en el incremento del sistema de defensa antioxidante en las CMSP, cuando
aumenta el estrés oxidativo generado en tejido adiposo [136, 137, 195].
De hecho, nuestros resultados sugieren que las CMSP activan su
maquinaria de defensa antioxidante en estado postprandial, mediante el aumento
en los niveles de ARNm de los genes antioxidantes tras la ingesta de la comida
HSFA, en respuesta al estrés oxidativo postprandial generado en el tejido adiposo
[26, 154]. Estos resultados muestran la utilidad del estudio de las CMSP como
biomarcadores de estrés oxidativo, y apoyan la idea de que son una herramienta
útil para evaluar entre estado de salud o enfermedad [156, 157, 191], así como
para evaluar los cambios que ocurren en el estado oxidativo e inflamatorio
estimulado en respuesta a distintos tratamientos [104, 106, 136, 137, 169].
Por otra parte, hemos evaluado el efecto global del tipo de grasa ingerida
en la dieta mediante una aproximación proteómica que nos ha permitido identificar
proteínas de respuesta rápida a la calidad de la grasa de la dieta en el proteoma de
CMSP de pacientes con SMet. Nuestros resultados mostraron una estrecha
relación entre la ingesta de grasa saturada y la expresión de proteínas involucradas
en la ruta del estrés oxidativo, así como en procesos de daño al ADN y estado pro-
coagulante [169] en comparación con la ingesta de grasas monoinsaturadas y poli-
insaturadas. Desde el punto de vista clínico vemos que la expresión postprandial
de las proteínas THBS-1 y cadena beta de fibrinógeno (FGB) tras la ingesta de la
comida HSFA están relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad
cardiovascular [212], cuyo desarrollo está estrechamente relacionado con los
componentes del SMet [59, 69].
Discusión
141
En resumen, nuestro trabajo muestra que la ingesta de una comida rica en
grasas saturadas aumenta el estrés oxidativo, lo cual a su vez ha sido asociado a la
obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes y el SMet [18, 26, 154]. Además,
elevados niveles de ROS, favorecen a la disfunción vascular, lo cual ocurre en
condiciones fisiopatológicas tales como, hipertensión, aterosclerosis, diabetes,
hiperhomocisteinemia, insuficiencia cardiaca, sepsis, hemorragia subaracnoidea,
envejecimiento y Alzheimer [111, 136, 137], de las cuales algunas son
componentes del SMet.
VIII. CONCLUSIONES
Conclusiones
145
CONCLUSIÓN PRINCIPAL
El consumo de grasa saturada aumenta el estrés oxidativo postprandial,
como consecuencia del desequilibrio entre la producción y detoxificación de ROS
en tejido adiposo, lo cual no ocurre cuando se ingieren dietas ricas en grasas
monoinsaturadas o bajas en grasas y ricas en hidratos de carbono complejos.
CONCLUSIONES SECUNDARIAS
1. El consumo de grasa monoinsaturada aumenta la expresión
postprandial de enzimas antioxidantes en el tejido adiposo y consecuentemente
reduce el estrés oxidativo.
2. En términos de estrés oxidativo, las células mononucleares de sangre
periférica y el tejido adiposo responden de forma diferente frente a la grasa
ingerida en la dieta. Si bien, la NADPH-oxidasa, tras la ingesta de grasa saturada
aumenta tanto en células mononucleares de sangre periférica como en tejido
adiposo, la expresión de los genes antioxidantes disminuye en tejido adiposo y
aumenta en células mononucleares de sangre periférica.
3. En el estado postprandial, unos niveles elevados de biomarcadores
plasmáticos de estrés oxidativo están asociados a una mayor expresión de genes de
las subunidades de la NADPH-oxidasa y genes antioxidantes en células
mononucleares de sangre periférica.
4. Los cambios observados en el proteoma de las células mononucleares
de sangre periférica tras la ingesta de una comida rica en grasas saturadas, frente a
comidas ricas en grasas monoinsaturadas y poli-insaturadas, en términos de daño
al ADN y estado pro-coagulante, reflejan un mayor estrés oxidativo postprandial.
Además, los cambios en el proteoma sugieren que los ácidos grasos PUFA n-3 de
Conclusiones
146
cadena larga mejoran la señalización de insulina y ejercen un efecto anti-
inflamatorio.
IX. REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Referencias bibliográficas
149
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] Ďuračková Z. Current Insights into Oxidative Stress. Physiol. Res.
2010;59:459-69.
[2] Halliwell B,Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative
damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what
do the results mean? Br J Pharmacol. 2004;142:231-55.
[3] Halliwell B, Murcia MA, Chirico S,Aruoma OI. Free radicals and
antioxidants in food and in vivo: what they do and how they work.
Crit Rev Food Sci Nutr. 1995;35:7-20.
[4] Gutiérrez CJRV. Daño Oxidativo, Radicales libres y Antioxidantes. Rev
Cubana Med Milit. 2002;31:126-33.
[5] Stocker R,Keaney JF, Jr. Role of oxidative modifications in
atherosclerosis. Physiol Rev. 2004;84:1381-478.
[6] Murphy MP, Holmgren A, Larsson NG, Halliwell B, Chang CJ,
Kalyanaraman B, et al. Unraveling the biological roles of reactive
oxygen species. Cell Metab. 2011;13:361-6.
[7] Meza-Miranda ER, Camargo A, Rangel-Zuñiga OA, Delgado-Lista J,
Garcia-Rios A, Perez-Martinez P, et al. Postprandial oxidative stress
is modulated by dietary fat in adipose tissue from elderly people.
Age (Dordr). 2013;doi:10.1007/s11357-013-9579-y.
[8] Ballesteros M, Fredriksson A, Henriksson J,Nystrom T. Bacterial
senescence: protein oxidation in non-proliferating cells is dictated
by the accuracy of the ribosomes. Embo J. 2001;20:5280-9.
[9] Dukan S, Farewell A, Ballesteros M, Taddei F, Radman M,Nystrom T.
Protein oxidation in response to increased transcriptional or
translational errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:5746-9.
[10] Alondra E. Díaz-Acosta,Membrillo-Hernández J. Consecuencias
fisiológicas de la oxidación de proteínas por carbonilación en
diversos sistemas biológicos. Tip Revista Especializada en Ciencias
Aquímico-Biológicas. 2006;9:34-44.
[11] Perez-Martinez P, Garcia-Quintana JM, Yubero-Serrano EM, Tasset-
Cuevas I, Tunez I, Garcia-Rios A, et al. Postprandial oxidative
stress is modified by dietary fat: evidence from a human
intervention study. Clin Sci. 2010:251–61.
[12] Cabiscol E, Tamarit J,Ros J. Oxidative stress in bacteria and protein
damage by reactive oxygen species. Int Microbiol. 2000;3:3-8.
[13] Sautin YY, Nakagawa T, Zharikov S,Johnson RJ. Adverse effects of
the classic antioxidant uric acid in adipocytes: NADPH oxidase-
Referencias bibliográficas
150
mediated oxidative/nitrosative stress. Am J Physiol Cell Physiol.
2007;293:C584-96.
[14] Foster DB, Van Eyk JE, Marban E,O'Rourke B. Redox signaling and
protein phosphorylation in mitochondria: progress and prospects. J
Bioenerg Biomembr. 2009;41:159-68.
[15] Liu Y, Fiskum G,Schubert D. Generation of reactive oxygen species
by the mitochondrial electron transport chain. J Neurochem.
2002;80:780-7.
[16] Varabyova A, Topf U, Kwiatkowska P, Wrobel L, Kaus-Drobek
M,Chacinska A. Mia40 and MINOS act in parallel with Ccs1 in the
biogenesis of mitochondrial Sod1. Febs J. 2013.
[17] Joo YC,Oh DK. Lipoxygenases: potential starting biocatalysts for the
synthesis of signaling compounds. Biotechnol Adv. 2012;30:1524-
32.
[18] Krieger-Brauer HI, Medda PK,Kather H. Insulin-induced activation of
NADPH-dependent H2O2 generation in human adipocyte plasma
membranes is mediated by Galphai2. J Biol Chem.
1997;272:10135-43.
[19] Mahadev K, Wu X, Zilbering A, Zhu L, Lawrence JT,Goldstein BJ.
Hydrogen peroxide generated during cellular insulin stimulation is
integral to activation of the distal insulin signaling cascade in 3T3-
L1 adipocytes. J Biol Chem. 2001;276:48662-9.
[20] Babior BM. NADPH oxidase: an update. Blood. 1999;93:1464-76.
[21] Babior BM. NADPH oxidase. Curr Opin Immunol. 2004;16:42-7.
[22] Li SL, Valente AJ, Zhao SJ,Clark RA. PU.1 is essential for p47(phox)
promoter activity in myeloid cells. J Biol Chem. 1997;272:17802-9.
[23] Marden CM, Stefanidis D, Cunninghame-Graham DS,Casimir CM.
Differentiation-dependent up-regulation of p47(phox) gene
transcription is associated with changes in PU.1 phosphorylation
and increased binding affinity. Biochem Biophys Res Commun.
2003;305:193-202.
[24] Assari T. Chronic Granulomatous Disease; fundamental stages in our
understanding of CGD. Med Immunol. 2006;5:4.
[25] Kleniewska P, Piechota A, Skibska B,Goraca A. The NADPH oxidase
family and its inhibitors. Arch Immunol Ther Exp (Warsz).
2012;60:277-94.
[26] Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, Iwaki M, Yamada Y,
Nakajima Y, et al. Increased oxidative stress in obesity and its
impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 2004;114:1752-61.
Referencias bibliográficas
151
[27] Martino F, Loffredo L, Carnevale R, Sanguigni V, Martino E, Catasca
E, et al. Oxidative stress is associated with arterial dysfunction and
enhanced intima-media thickness in children with
hypercholesterolemia: the potential role of nicotinamide-adenine
dinucleotide phosphate oxidase. Pediatrics. 2008;122:e648-55.
[28] Mendoza Coussette U, García Piñeiro JC, Gastell PL,Armenteros AA.
Xantina oxidorreductasa, propiedades, funciones y regulación de su
expresión genética. Rev Cubana Invest Biomed. 2005;24.
[29] Armitage ME, Wingler K, Schmidt HH,La M. Translating the
oxidative stress hypothesis into the clinic: NOX versus NOS. J Mol
Med (Berl). 2009;87:1071-6.
[30] Roe ND,Ren J. Nitric oxide synthase uncoupling: a therapeutic target
in cardiovascular diseases. Vascul Pharmacol. 2012;57:168-72.
[31] Skrzypczak-Jankun E, Jankun J,Al-Senaidy A. Human lipoxygenase:
developments in its structure, function, relevance to diseases and
challenges in drug development. Curr Med Chem. 2012;19:5122-7.
[32] Dobashi Y, Miyakawa Y, Yamamoto I,Amao H. Effects of intestinal
microflora on superoxide dismutase activity in the mouse cecum.
Exp Anim. 2011;60:133-9.
[33] Zelko IN, Mariani TJ,Folz RJ. Superoxide dismutase multigene
family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2),
and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression.
Free Radic Biol Med. 2002;33:337-49.
[34] FAO/WHO. Human Vitamin and Mineral Requirements. Report of a
joint FAO/WHO expert consultation. Bangkok, Thailand. Food and
Agriculture Organization of the United Nations, Rome and World
Health Organization, Geneva. 2001.
[35] Naziroglu M. Molecular role of catalase on oxidative stress-induced
Ca(2+) signaling and TRP cation channel activation in nervous
system. J Recept Signal Transduct Res. 2012;32:134-41.
[36] Putnam CD, Arvai AS, Bourne Y,Tainer JA. Active and inhibited
human catalase structures: ligand and NADPH binding and catalytic
mechanism. J Mol Biol. 2000;296:295-309.
[37] Kobayashi H, Matsuda M, Fukuhara A, Komuro R,Shimomura I.
Dysregulated glutathione metabolism links to impaired insulin
action in adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab.
2009;296:E1326-34.
[38] Margis R, Dunand C, Teixeira FK,Margis-Pinheiro M. Glutathione
peroxidase family - an evolutionary overview. Febs J.
2008;275:3959-70.
Referencias bibliográficas
152
[39] Drevet JR. The antioxidant glutathione peroxidase family and
spermatozoa: a complex story. Mol Cell Endocrinol. 2006;250:70-9.
[40] Utomo A, Jiang X, Furuta S, Yun J, Levin DS, Wang YC, et al.
Identification of a novel putative non-selenocysteine containing
phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (NPGPx)
essential for alleviating oxidative stress generated from
polyunsaturated fatty acids in breast cancer cells. J Biol Chem.
2004;279:43522-9.
[41] Ballatori N, Krance SM, Notenboom S, Shi S, Tieu K,Hammond CL.
Glutathione dysregulation and the etiology and progression of
human diseases. Biol Chem. 2009;390:191-214.
[42] Satoh N, Watanabe N, Kanda A, Sugaya-Fukasawa M,Hisatomi H.
Expression of glutathione reductase splice variants in human tissues.
Biochem Genet. 2010;48:816-21.
[43] Holmgren A,Lu J. Thioredoxin and thioredoxin reductase: current
research with special reference to human disease. Biochem Biophys
Res Commun. 2010;396:120-4.
[44] Nordberg J,Arner ES. Reactive oxygen species, antioxidants, and the
mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med.
2001;31:1287-312.
[45] Burke-Gaffney A, Callister ME,Nakamura H. Thioredoxin: friend or
foe in human disease? Trends Pharmacol Sci. 2005;26:398-404.
[46] Itoh K, Wakabayashi N, Katoh Y, Ishii T, Igarashi K, Engel JD, et al.
Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsive
elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2
domain. Genes Dev. 1999;13:76-86.
[47] Nguyen T, Sherratt PJ, Nioi P, Yang CS,Pickett CB. Nrf2 controls
constitutive and inducible expression of ARE-driven genes through
a dynamic pathway involving nucleocytoplasmic shuttling by
Keap1. J Biol Chem. 2005;280:32485-92.
[48] Nguyen T, Nioi P,Pickett CB. The Nrf2-antioxidant response element
signaling pathway and its activation by oxidative stress. J Biol
Chem. 2009;284:13291-5.
[49] Aleksunes LM,Manautou JE. Emerging role of Nrf2 in protecting
against hepatic and gastrointestinal disease. Toxicol Pathol.
2007;35:459-73.
[50] Hayes JD,McMahon M. Molecular basis for the contribution of the
antioxidant responsive element to cancer chemoprevention. Cancer
Lett. 2001;174:103-13.
Referencias bibliográficas
153
[51] Nguyen T, Sherratt PJ,Pickett CB. Regulatory mechanisms controlling
gene expression mediated by the antioxidant response element.
Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003;43:233-60.
[52] Bachmann K. Chapter 8. Drug Metabolism. In: WMaKB Miles
Hacker, editor. Pharmacology Principles and Practice: Elsevier;
2009.
[53] Staicu ML, Muresan A, Tache S,Moldovan R. Effects of exogenous
antioxidants on oxidative stress in pregnancy. J Med Life.
2011;4:163-7.
[54] Da Costa LA, Badawi A,El-Sohemy A. Nutrigenetics and modulation
of oxidative stress. Ann Nutr Metab. 2012;60 Suppl 3:27-36.
[55] Barbosa KB, Bressan J, Zulet MA,Martinez Hernandez JA. [Influence
of dietary intake on plasma biomarkers of oxidative stress in
humans]. An Sist Sanit Navar. 2008;31:259-80.
[56] Covas MI, Gambert P, Fito M,de la Torre R. Wine and oxidative
stress: up-to-date evidence of the effects of moderate wine
consumption on oxidative damage in humans. Atherosclerosis.
2010;208:297-304.
[57] Fito M, de la Torre R, Farre-Albaladejo M, Khymenetz O, Marrugat
J,Covas MI. Bioavailability and antioxidant effects of olive oil
phenolic compounds in humans: a review. Ann Ist Super Sanita.
2007;43:375-81.
[58] Martin-Pelaez S, Covas MI, Fito M, Kusar A,Pravst I. Health effects of
olive oil polyphenols: Recent advances and possibilities for the use
of health claims. Mol Nutr Food Res. 2013.
[59] Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP)
Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High
Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final
report. Circulation. 2002;106:3143-421.
[60] Alberti KG, Eckel RH, Grundy SM, Zimmet PZ, Cleeman JI, Donato
KA, et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim
statement of the International Diabetes Federation Task Force on
Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood
Institute; American Heart Association; World Heart Federation;
International Atherosclerosis Society; and International Association
for the Study of Obesity. Circulation. 2009;120:1640-5.
[61] Grundy S.M., Brewer H.B. Jr., Cleeman J.I., Smith S.C. Jr., C.; L,
National Heart L, and Blood Institute;, et al. Definition of metabolic
syndrome: report of the National Heart, Lung, and Blood
Institute/American Heart Association conference on scientific issues
Referencias bibliográficas
154
related to definition. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24:e13-
e8.
[62] Abate N, Garg A, Peshock RM, Stray-Gundersen J, Adams-Huet
B,Grundy SM. Relationship of generalized and regional adiposity to
insulin sensitivity in men with NIDDM. Diabetes. 1996;45:1684-93.
[63] Rabe K, Lehrke M, Parhofer KG,Broedl UC. Adipokines and insulin
resistance. Mol Med. 2008;14:741-51.
[64] Deng Y,Scherer PE. Adipokines as novel biomarkers and regulators of
the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 2010;1212:E1-E19.
[65] Hertzel A. V., Thompson B. R., Wiczer B. M.,A. BD. Lipid
metabolism in adipose tissue (Chapter 10). In: Vance D.E.,V J.E.,
editors.: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes.
Elsevier.; 2008.
[66] Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL,Ferrante
AW, Jr. Obesity is associated with macrophage accumulation in
adipose tissue. J Clin Invest. 2003;112:1796-808.
[67] Serrano Ríos M., Caro J. F., Carraro R.,A. GFJ, eds. The Metabolic
Syndrome at the Beginning of the XXI Century. A Gentetic and
Molecular Approach. 2005, Elsevier.
[68] Grundy SM. Metabolic syndrome pandemic. Arterioscler Thromb
Vasc Biol. 2008;28:629-36.
[69] Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, Donato KA, Eckel RH, Franklin
BA, et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome:
an American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood
Institute Scientific Statement. Circulation. 2005;112:2735-52.
[70] Alberti KG,Zimmet PZ. Definition, diagnosis and classification of
diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and
classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO
consultation. Diabet Med. 1998;15:539-53.
[71] Global health risks: mortality and burden of disease attributable to
selected major risks.: Geneva, World Health Organization,
(http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/GlobalHealt
hRisks_report_full.pdf). 2009.
[72] World Health Statistics. A Snapshot of Global Health.: World Health
Organization.
(http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/70889/1/WHO_IER_HSI_
12.1_eng.pdf). 2012.
[73] Balkau B, Charles MA, Drivsholm T, Borch-Johnsen K, Wareham N,
Yudkin JS, et al. Frequency of the WHO metabolic syndrome in
Referencias bibliográficas
155
European cohorts, and an alternative definition of an insulin
resistance syndrome. Diabetes & metabolism. 2002;28:364-76.
[74] Hernández A, Riera C, Solá E OM,Martínez ML MC, et al.
Prevalencia del síndrome metabólico entre pacientes con cardiopatía
isquémica. Med Clin (Barc). 2003;212:204-8.
[75] Alvarez EE, Ribas L,L S. Prevalencia del síndrome metabólico en la
población de la Comunidad Canaria. 2003. 2003;120:172-4.
[76] Alegria E, Cordero A, Laclaustra M, Grima A, Leon M, Casasnovas
JA, et al. [Prevalence of metabolic syndrome in the Spanish
working population: MESYAS registry]. Rev Esp Cardiol.
2005;58:797-806.
[77] Mohan V,Deepa M. The metabolic syndrome in developing countries.
Diabetes Voice. 2006;51:15-7.
[78] Marquez-Sandoval F, Macedo-Ojeda G, Viramontes-Horner D,
Fernandez Ballart JD, Salas Salvado J,Vizmanos B. The prevalence
of metabolic syndrome in Latin America: a systematic review.
Public Health Nutr. 2011;14:1702-13.
[79] Phillips C, Lopez-Miranda J, Perez-Jimenez F, McManus R,Roche
HM. Genetic and nutrient determinants of the metabolic syndrome.
Curr Opin Cardiol. 2006;21:185-93.
[80] Kahn BB,Flier JS. Obesity and insulin resistance. J Clin Invest.
2000;106:473-81.
[81] Lowell BB,Spiegelman BM. Towards a molecular understanding of
adaptive thermogenesis. Nature. 2000;404:652-60.
[82] Montague CT,O'Rahilly S. The perils of portliness: causes and
consequences of visceral adiposity. Diabetes. 2000;49:883-8.
[83] Southam L, Soranzo N, Montgomery SB, Frayling TM, McCarthy MI,
Barroso I, et al. Is the thrifty genotype hypothesis supported by
evidence based on confirmed type 2 diabetes- and obesity-
susceptibility variants? Diabetologia. 2009;52:1846-51.
[84] Hales CN,Barker DJ. The thrifty phenotype hypothesis. Br Med Bull.
2001;60:5-20.
[85] Vessby B. Dietary fat, fatty acid composition in plasma and the
metabolic syndrome. Curr Opin Lipidol. 2003;14:15-9.
[86] Lichtenstein AH, Appel LJ, Brands M, Carnethon M, Daniels S,
Franch HA, et al. Diet and lifestyle recommendations revision 2006:
a scientific statement from the American Heart Association
Nutrition Committee. Circulation. 2006;114:82-96.
Referencias bibliográficas
156
[87] Cicerale S, Lucas L,Keast R. Biological activities of phenolic
compounds present in virgin olive oil. Int J Mol Sci. 2010;11:458-
79.
[88] Trichopoulou A,Lagiou P. Worldwide patterns of dietary lipids intake
and health implications. The American journal of clinical nutrition.
1997;66:961S-4S.
[89] Paletas K, Athanasiadou E, Sarigianni M, Paschos P, Kalogirou A,
Hassapidou M, et al. The protective role of the Mediterranean diet
on the prevalence of metabolic syndrome in a population of Greek
obese subjects. J Am Coll Nutr. 2010;29:41-5.
[90] Thomsen C, Rasmussen O, Lousen T, Holst JJ, Fenselau S,
Schrezenmeir J, et al. Differential effects of saturated and
monounsaturated fatty acids on postprandial lipemia and incretin
responses in healthy subjects. The American journal of clinical
nutrition. 1999;69:1135-43.
[91] Ortega A, Varela LM, Bermudez B, Lopez S, Abia R,Muriana FJ.
Dietary fatty acids linking postprandial metabolic response and
chronic diseases. Food Funct. 2012;3:22-7.
[92] van Dijk SJ, Feskens EJ, Bos MB, Hoelen DW, Heijligenberg R,
Bromhaar MG, et al. A saturated fatty acid-rich diet induces an
obesity-linked proinflammatory gene expression profile in adipose
tissue of subjects at risk of metabolic syndrome. The American
journal of clinical nutrition. 2009;90:1656-64.
[93] Siri-Tarino PW, Sun Q, Hu FB,Krauss RM. Saturated fat,
carbohydrate, and cardiovascular disease. The American journal of
clinical nutrition. 2010;91:502-9.
[94] Perez-Jimenez F, Lopez-Miranda J, Pinillos MD, Gomez P, Paz-Rojas
E, Montilla P, et al. A Mediterranean and a high-carbohydrate diet
improve glucose metabolism in healthy young persons.
Diabetologia. 2001;44:2038-43.
[95] Vessby B, Uusitupa M, Hermansen K, Riccardi G, Rivellese AA,
Tapsell LC, et al. Substituting dietary saturated for monounsaturated
fat impairs insulin sensitivity in healthy men and women: The
KANWU Study. Diabetologia. 2001;44:312-9.
[96] Kwak JH, Paik JK, Kim HI, Kim OY, Shin DY, Kim HJ, et al. Dietary
treatment with rice containing resistant starch improves markers of
endothelial function with reduction of postprandial blood glucose
and oxidative stress in patients with prediabetes or newly diagnosed
type 2 diabetes. Atherosclerosis. 2012;224:457-64.
[97] Serrano Ríos M., Ordovás J. M.,A. GFJ, eds. Obesity. 2011, Elsevier.
Referencias bibliográficas
157
[98] Vazquez-Vela ME, Torres N,Tovar AR. White adipose tissue as
endocrine organ and its role in obesity. Arch Med Res.
2008;39:715-28.
[99] Inoguchi T,Nawata H. NAD(P)H oxidase activation: a potential target
mechanism for diabetic vascular complications, progressive beta-
cell dysfunction and metabolic syndrome. Curr Drug Targets.
2005;6:495-501.
[100] Bastard JP, Maachi M, Lagathu C, Kim MJ, Caron M, Vidal H, et al.
Recent advances in the relationship between obesity, inflammation,
and insulin resistance. Eur Cytokine Netw. 2006;17:4-12.
[101] Fernandez-Sanchez A, Madrigal-Santillan E, Bautista M, Esquivel-
Soto J, Morales-Gonzalez A, Esquivel-Chirino C, et al.
Inflammation, oxidative stress, and obesity. Int J Mol Sci.
2011;12:3117-32.
[102] Coppack SW. Pro-inflammatory cytokines and adipose tissue. Proc
Nutr Soc. 2001;60:349-56.
[103] Dusi S, Donini M, Lissandrini D, Mazzi P, Bianca VD,Rossi F.
Mechanisms of expression of NADPH oxidase components in
human cultured monocytes: role of cytokines and transcriptional
regulators involved. Eur J Immunol. 2001;31:929-38.
[104] Cruz-Teno C, Perez-Martinez P, Delgado-Lista J, Yubero-Serrano
EM, Garcia-Rios A, Marin C, et al. Dietary fat modifies the
postprandial inflammatory state in subjects with metabolic
syndrome: the LIPGENE study. Mol Nutr Food Res. 2012;56:854-
65.
[105] Meneses ME, Camargo A, Perez-Martinez P, Delgado-Lista J, Cruz-
Teno C, Jimenez-Gomez Y, et al. Postprandial inflammatory
response in adipose tissue of patients with metabolic syndrome after
the intake of different dietary models. Mol Nutr Food Res.
2011;55:1759-70.
[106] Camargo A, Ruano J, Fernandez JM, Parnell LD, Jimenez A, Santos-
Gonzalez M, et al. Gene expression changes in mononuclear cells in
patients with metabolic syndrome after acute intake of phenol-rich
virgin olive oil. BMC Genomics. 2010;11:253.
[107] Roberts CK, Vaziri ND,Barnard RJ. Effect of diet and exercise
intervention on blood pressure, insulin, oxidative stress, and nitric
oxide availability. Circulation. 2002;106:2530-2.
[108] Badimón L,Martínez-González J. Endothelial Dysfunction. Rev Esp
Cardiol. 2006;6 Suppl A:21-30.
Referencias bibliográficas
158
[109] Nakagami H, Kaneda Y, Ogihara T,Morishita R. Endothelial
dysfunction in hyperglycemia as a trigger of atherosclerosis. Curr
Diabetes Rev. 2005;1:59-63.
[110] Badimón L, Vilahur G,Padró T. Lipoproteins, Platelets and
Atherothrombosis. Rev Esp Cardiol. 2009;62:1161-78.
[111] Faraci FM,Didion SP. Vascular protection: superoxide dismutase
isoforms in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol.
2004;24:1367-73.
[112] Colome C, Martinez-Gonzalez J, Vidal F, de Castellarnau C,Badimon
L. Small oxidative changes in atherogenic LDL concentrations
irreversibly regulate adhesiveness of human endothelial cells: effect
of the lazaroid U74500A. Atherosclerosis. 2000;149:295-302.
[113] Osterud B,Bjorklid E. Role of monocytes in atherogenesis. Physiol
Rev. 2003;83:1069-112.
[114] Serrano Ríos M.,A. GFJ, eds. Type 2 Diabetes Mellitus. 2010,
Elsevier.
[115] Riccardi G, Giacco R,Rivellese AA. Dietary fat, insulin sensitivity
and the metabolic syndrome. Clin Nutr. 2004;23:447-56.
[116] Krieger-Brauer HI,Kather H. Human fat cells possess a plasma
membrane-bound H2O2-generating system that is activated by
insulin via a mechanism bypassing the receptor kinase. J Clin
Invest. 1992;89:1006-13.
[117] Peairs AD, Rankin JW,Lee YW. Effects of acute ingestion of
different fats on oxidative stress and inflammation in overweight
and obese adults. Nutr J. 2011;10:122.
[118] Wellen KE,Hotamisligil GS. Inflammation, stress, and diabetes. J
Clin Invest. 2005;115:1111-9.
[119] Xu H, Barnes GT, Yang Q, Tan G, Yang D, Chou CJ, et al. Chronic
inflammation in fat plays a crucial role in the development of
obesity-related insulin resistance. J Clin Invest. 2003;112:1821-30.
[120] Sampson SR, Bucris E, Horovitz-Fried M, Parnas A, Kahana S,
Abitbol G, et al. Insulin increases H2O2-induced pancreatic beta
cell death. Apoptosis. 2010;15:1165-76.
[121] Tang C, Han P, Oprescu AI, Lee SC, Gyulkhandanyan AV, Chan
GN, et al. Evidence for a role of superoxide generation in glucose-
induced beta-cell dysfunction in vivo. Diabetes. 2007;56:2722-31.
[122] Eriksson JW. Metabolic stress in insulin's target cells leads to ROS
accumulation - a hypothetical common pathway causing insulin
resistance. FEBS Lett. 2007;581:3734-42.
Referencias bibliográficas
159
[123] Lairon D, Lopez-Miranda J,Williams C. Methodology for studying
postprandial lipid metabolism. European journal of clinical
nutrition. 2007;61:1145-61.
[124] Lopez-Miranda J, Williams C,Lairon D. Dietary, physiological,
genetic and pathological influences on postprandial lipid
metabolism. The British journal of nutrition. 2007;98:458-73.
[125] Nordestgaard BG, Benn M, Schnohr P,Tybjaerg-Hansen A.
Nonfasting triglycerides and risk of myocardial infarction, ischemic
heart disease, and death in men and women. Jama. 2007;298:299-
308.
[126] Bansal S, Buring JE, Rifai N, Mora S, Sacks FM,Ridker PM. Fasting
compared with nonfasting triglycerides and risk of cardiovascular
events in women. Jama. 2007;298:309-16.
[127] Nordestgaard BG,Freiberg JJ. Clinical relevance of non-fasting and
postprandial hypertriglyceridemia and remnant cholesterol. Curr
Vasc Pharmacol. 2011;9:281-6.
[128] Proctor SD,Mamo JC. Retention of fluorescent-labelled chylomicron
remnants within the intima of the arterial wall--evidence that plaque
cholesterol may be derived from post-prandial lipoproteins.
European journal of clinical investigation. 1998;28:497-503.
[129] Fuentes F, Lopez-Miranda J, Sanchez E, Sanchez F, Paez J, Paz-
Rojas E, et al. Mediterranean and low-fat diets improve endothelial
function in hypercholesterolemic men. Annals of internal medicine.
2001;134:1115-9.
[130] Barona J, Jones JJ, Kopec RE, Comperatore M, Andersen C,
Schwartz SJ, et al. A Mediterranean-style low-glycemic-load diet
increases plasma carotenoids and decreases LDL oxidation in
women with metabolic syndrome. The Journal of nutritional
biochemistry. 2012;23:609-15.
[131] Fielding B. Tracing the fate of dietary fatty acids: metabolic studies
of postprandial lipaemia in human subjects. Proc Nutr Soc.
2011;70:342-50.
[132] Paglialunga S,Cianflone K. Regulation of postprandial lipemia: an
update on current trends. Appl Physiol Nutr Metab. 2007;32:61-75.
[133] de Mello VD, Kolehmanien M, Schwab U, Pulkkinen L,Uusitupa M.
Gene expression of peripheral blood mononuclear cells as a tool in
dietary intervention studies: What do we know so far? Mol Nutr
Food Res. 2012;56:1160-72.
[134] Fuchs D, Vafeiadou K, Hall WL, Daniel H, Williams CM, Schroot
JH, et al. Proteomic biomarkers of peripheral blood mononuclear
Referencias bibliográficas
160
cells obtained from postmenopausal women undergoing an
intervention with soy isoflavones. The American journal of clinical
nutrition. 2007;86:1369-75.
[135] Kallio P, Kolehmainen M, Laaksonen DE, Kekalainen J, Salopuro T,
Sivenius K, et al. Dietary carbohydrate modification induces
alterations in gene expression in abdominal subcutaneous adipose
tissue in persons with the metabolic syndrome: the FUNGENUT
Study. The American journal of clinical nutrition. 2007;85:1417-27.
[136] Perez-Herrera A, Rangel-Zuniga OA, Delgado-Lista J, Marin C,
Perez-Martinez P, Tasset I, et al. The antioxidants in oils heated at
frying temperature, whether natural or added, could protect against
postprandial oxidative stress in obese people. Food Chem.
2013;138:2250-9.
[137] Yubero-Serrano EM, Gonzalez-Guardia L, Rangel-Zuniga O,
Delgado-Casado N, Delgado-Lista J, Perez-Martinez P, et al.
Postprandial antioxidant gene expression is modified by
Mediterranean diet supplemented with coenzyme Q(10) in elderly
men and women. Age (Dordr). 2011.
[138] Murdolo G,Smith U. The dysregulated adipose tissue: a connecting
link between insulin resistance, type 2 diabetes mellitus and
atherosclerosis. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 2006;16 Suppl 1:S35-
8.
[139] van Dijk SJ, Feskens EJ, Bos MB, de Groot LC, de Vries JH, Muller
M, et al. Consumption of a high monounsaturated fat diet reduces
oxidative phosphorylation gene expression in peripheral blood
mononuclear cells of abdominally overweight men and women. J
Nutr. 2012;142:1219-25.
[140] Camargo A, Delgado-Lista J, Garcia-Rios A, Cruz-Teno C, Yubero-
Serrano EM, Perez-Martinez P, et al. Expression of
proinflammatory, proatherogenic genes is reduced by the
Mediterranean diet in elderly people. The British journal of
nutrition. 2012;108:500-8.
[141] Patel C, Ghanim H, Ravishankar S, Sia CL, Viswanathan P, Mohanty
P, et al. Prolonged reactive oxygen species generation and nuclear
factor-kappaB activation after a high-fat, high-carbohydrate meal in
the obese. The Journal of clinical endocrinology and metabolism.
2007;92:4476-9.
[142] Cortes B, Nunez I, Cofan M, Gilabert R, Perez-Heras A, Casals E, et
al. Acute effects of high-fat meals enriched with walnuts or olive oil
Referencias bibliográficas
161
on postprandial endothelial function. J Am Coll Cardiol.
2006;48:1666-71.
[143] Cardona F, Tunez I, Tasset I, Montilla P, Collantes E,Tinahones FJ.
Fat overload aggravates oxidative stress in patients with the
metabolic syndrome. European journal of clinical investigation.
2008;38:510-5.
[144] Grundy SM. Obesity, metabolic syndrome, and coronary
atherosclerosis. Circulation. 2002;105:2696-8.
[145] Shaw DI, Tierney AC, McCarthy S, Upritchard J, Vermunt S,
Gulseth HL, et al. LIPGENE food-exchange model for alteration of
dietary fat quantity and quality in free-living participants from eight
European countries. The British journal of nutrition. 2009;101:750-
9.
[146] Harris WS, Pottala JV, Sands SA,Jones PG. Comparison of the
effects of fish and fish-oil capsules on the n 3 fatty acid content of
blood cells and plasma phospholipids. The American journal of
clinical nutrition. 2007;86:1621-5.
[147] Allain CC, Poon LS, Chan CS, Richmond W,Fu PC. Enzymatic
determination of total serum cholesterol. Clin Chem. 1974;20:470-
5.
[148] Bucolo G,David H. Quantitative determination of serum triglycerides
by the use of enzymes. Clin Chem. 1973;19:476-82.
[149] Warnick GR, Benderson J,Albers JJ. Dextran sulfate-Mg2+
precipitation procedure for quantitation of high-density-lipoprotein
cholesterol. Clin Chem. 1982;28:1379-88.
[150] Friedewald WT, Levy RI,Fredrickson DS. Estimation of the
concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma,
without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem.
1972;18:499-502.
[151] Hernandez-Presa MA, Ortego M, Tunon J, Martin-Ventura JL, Mas
S, Blanco-Colio LM, et al. Simvastatin reduces NF-kappaB activity
in peripheral mononuclear and in plaque cells of rabbit atheroma
more markedly than lipid lowering diet. Cardiovasc Res.
2003;57:168-77.
[152] Gorg A, Drews O, Luck C, Weiland F,Weiss W. 2-DE with IPGs.
Electrophoresis. 2009;30 Suppl 1:S122-32.
[153] Calvano SE, Xiao W, Richards DR, Felciano RM, Baker HV, Cho
RJ, et al. A network-based analysis of systemic inflammation in
humans. Nature. 2005;437:1032-7.
Referencias bibliográficas
162
[154] Peña-Orihuela P., Camargo A., Rangel-Zuñiga O. A., Perez-Martinez
P., Cruz-Teno C., Delgado-Lista J., et al. Antioxidant system
response is modified by dietary fat in adipose tissue of metabolic
syndrome patients. The Journal of nutritional biochemistry. 2013.
[155] Bouloumie A, Curat CA, Sengenes C, Lolmede K, Miranville
A,Busse R. Role of macrophage tissue infiltration in metabolic
diseases. Current opinion in clinical nutrition and metabolic care.
2005;8:347-54.
[156] de Mello VD, Kolehmainen M, Schwab U, Mager U, Laaksonen DE,
Pulkkinen L, et al. Effect of weight loss on cytokine messenger
RNA expression in peripheral blood mononuclear cells of obese
subjects with the metabolic syndrome. Metabolism. 2008;57:192-9.
[157] Ghanim H, Aljada A, Hofmeyer D, Syed T, Mohanty P,Dandona P.
Circulating mononuclear cells in the obese are in a proinflammatory
state. Circulation. 2004;110:1564-71.
[158] Ziegler-Heitbrock HW. Definition of human blood monocytes.
Journal of leukocyte biology. 2000;67:603-6.
[159] Bories G, Caiazzo R, Derudas B, Copin C, Raverdy V, Pigeyre M, et
al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral
blood mononuclear cells from obese subjects. Diab Vasc Dis Res.
2012;9:189-95.
[160] Ordovas JM,Corella D. Nutritional genomics. Annual review of
genomics and human genetics. 2004;5:71-118.
[161] de Roos B,McArdle HJ. Proteomics as a tool for the modelling of
biological processes and biomarker development in nutrition
research. The British journal of nutrition. 2008;99 Suppl 3:S66-71.
[162] Flock MR,Kris-Etherton PM. Diverse physiological effects of long-
chain saturated fatty acids: implications for cardiovascular disease.
Current opinion in clinical nutrition and metabolic care.
2013;16:133-40.
[163] Wycherley TP, Brinkworth GD, Keogh JB, Noakes M, Buckley
JD,Clifton PM. Long-term effects of weight loss with a very low
carbohydrate and low fat diet on vascular function in overweight
and obese patients. Journal of internal medicine. 2010;267:452-61.
[164] Arguin H, Dionne IJ, Senechal M, Bouchard DR, Carpentier AC,
Ardilouze JL, et al. Short- and long-term effects of continuous
versus intermittent restrictive diet approaches on body composition
and the metabolic profile in overweight and obese postmenopausal
women: a pilot study. Menopause. 2012;19:870-6.
Referencias bibliográficas
163
[165] Noakes M, Keogh JB, Foster PR,Clifton PM. Effect of an energy-
restricted, high-protein, low-fat diet relative to a conventional high-
carbohydrate, low-fat diet on weight loss, body composition,
nutritional status, and markers of cardiovascular health in obese
women. The American journal of clinical nutrition. 2005;81:1298-
306.
[166] Snel M, van Diepen JA, Stijnen T, Pijl H, Romijn JA, Meinders AE,
et al. Immediate and long-term effects of addition of exercise to a
16-week very low calorie diet on low-grade inflammation in obese,
insulin-dependent type 2 diabetic patients. Food Chem Toxicol.
2011;49:3104-11.
[167] Uusitupa M, Hermansen K, Savolainen MJ, Schwab U, Kolehmainen
M, Brader L, et al. Effects of an isocaloric healthy Nordic diet on
insulin sensitivity, lipid profile and inflammation markers in
metabolic syndrome -- a randomized study (SYSDIET). Journal of
internal medicine. 2013;274:52-66.
[168] Brader L, Uusitupa M, Dragsted LO,Hermansen K. Effects of an
isocaloric healthy Nordic diet on ambulatory blood pressure in
metabolic syndrome: a randomized SYSDIET sub-study. European
journal of clinical nutrition. 2013.
[169] Camargo A, Rangel-Zuniga OA, Pena-Orihuela P, Marin C, Perez-
Martinez P, Delgado-Lista J, et al. Postprandial changes in the
proteome are modulated by dietary fat in patients with metabolic
syndrome. The Journal of nutritional biochemistry. 2012;24:318-24.
[170] Rossmeislova L, Malisova L, Kracmerova J,Stich V. Adaptation of
human adipose tissue to hypocaloric diet. International journal of
obesity (2005). 2013;37:640-50.
[171] Siklova-Vitkova M, Klimcakova E, Polak J, Kovacova Z, Tencerova
M, Rossmeislova L, et al. Adipose tissue secretion and expression
of adipocyte-produced and stromavascular fraction-produced
adipokines vary during multiple phases of weight-reducing dietary
intervention in obese women. The Journal of clinical endocrinology
and metabolism. 2012;97:E1176-81.
[172] Rizkalla SW, Prifti E, Cotillard A, Pelloux V, Rouault C, Allouche R,
et al. Differential effects of macronutrient content in 2 energy-
restricted diets on cardiovascular risk factors and adipose tissue cell
size in moderately obese individuals: a randomized controlled trial.
The American journal of clinical nutrition. 2012;95:49-63.
Referencias bibliográficas
164
[173] Hopps E, Noto D, Caimi G,Averna MR. A novel component of the
metabolic syndrome: the oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc
Dis. 2010;20:72-7.
[174] de Koning EJ,Rabelink TJ. Endothelial function in the post-prandial
state. Atheroscler Suppl. 2002;3:11-6.
[175] Devaraj S, Wang-Polagruto J, Polagruto J, Keen CL,Jialal I. High-fat,
energy-dense, fast-food-style breakfast results in an increase in
oxidative stress in metabolic syndrome. Metabolism. 2008;57:867-
70.
[176] Ursini F,Sevanian A. Postprandial oxidative stress. Biol Chem.
2002;383:599-605.
[177] Jones RD, Hancock JT,Morice AH. NADPH oxidase: a universal
oxygen sensor? Free Radic Biol Med. 2000;29:416-24.
[178] Wientjes FB,Segal AW. NADPH oxidase and the respiratory burst.
Semin Cell Biol. 1995;6:357-65.
[179] Matsuzawa-Nagata N, Takamura T, Ando H, Nakamura S, Kurita S,
Misu H, et al. Increased oxidative stress precedes the onset of high-
fat diet-induced insulin resistance and obesity. Metabolism.
2008;57:1071-7.
[180] Jiang F, Lim HK, Morris MJ, Prior L, Velkoska E, Wu X, et al.
Systemic upregulation of NADPH oxidase in diet-induced obesity
in rats. Redox Rep. 2011;16:223-9.
[181] Mates JM, Perez-Gomez C,Nunez de Castro I. Antioxidant enzymes
and human diseases. Clin Biochem. 1999;32:595-603.
[182] Rahman I, Biswas SK, Jimenez LA, Torres M,Forman HJ.
Glutathione, stress responses, and redox signaling in lung
inflammation. Antioxid Redox Signal. 2005;7:42-59.
[183] Blokhina O,Fagerstedt KV. Oxidative metabolism, ROS and NO
under oxygen deprivation. Plant Physiol Biochem. 2010;48:359-73.
[184] Gago-Dominguez M, Jiang X,Castelao JE. Lipid peroxidation,
oxidative stress genes and dietary factors in breast cancer
protection: a hypothesis. Breast Cancer Res. 2007;9:201.
[185] Mustacich D,Powis G. Thioredoxin reductase. Biochem J.
2000;346:1-8.
[186] Coate KC,Huggins KW. Consumption of a high glycemic index diet
increases abdominal adiposity but does not influence adipose tissue
pro-oxidant and antioxidant gene expression in C57BL/6 mice. Nutr
Res. 2010;30:141-50.
[187] Long EK, Olson DM,Bernlohr DA. High-fat diet induces changes in
adipose tissue trans-4-oxo-2-nonenal and trans-4-hydroxy-2-
Referencias bibliográficas
165
nonenal levels in a depot-specific manner. Free Radic Biol Med.
2013;63C:390-8.
[188] Jaiswal AK. Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant
gene expression. Free Radic Biol Med. 2004;36:1199-207.
[189] Kobayashi M,Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the
Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant gene regulation. Antioxid
Redox Signal. 2005;7:385-94.
[190] Xu W, Hellerbrand C, Kohler UA, Bugnon P, Kan YW, Werner S, et
al. The Nrf2 transcription factor protects from toxin-induced liver
injury and fibrosis. Lab Invest. 2008;88:1068-78.
[191] Burczynski ME,Dorner AJ. Transcriptional profiling of peripheral
blood cells in clinical pharmacogenomic studies.
Pharmacogenomics. 2006;7:187-202.
[192] Maas K, Chan S, Parker J, Slater A, Moore J, Olsen N, et al. Cutting
edge: molecular portrait of human autoimmune disease. J Immunol.
2002;169:5-9.
[193] Scandalios JG. Oxidative stress responses--what have genome-scale
studies taught us? Genome Biol. 2002;3:REVIEWS1019.
[194] Roberts CK, Ng C, Hama S, Eliseo AJ,Barnard RJ. Effect of a short-
term diet and exercise intervention on inflammatory/anti-
inflammatory properties of HDL in overweight/obese men with
cardiovascular risk factors. J Appl Physiol. 2006;101:1727-32.
[195] Kodydkova J, Vavrova L, Zeman M, Jirak R, Macasek J, Stankova B,
et al. Antioxidative enzymes and increased oxidative stress in
depressive women. Clin Biochem. 2009;42:1368-74.
[196] Taguchi K, Motohashi H,Yamamoto M. Molecular mechanisms of
the Keap1-Nrf2 pathway in stress response and cancer evolution.
Genes Cells. 2011;16:123-40.
[197] Du Z, Yang Y, Hu Y, Sun Y, Zhang S, Peng W, et al. A long-term
high-fat diet increases oxidative stress, mitochondrial damage and
apoptosis in the inner ear of D-galactose-induced aging rats. Hear
Res. 2012;287:15-24.
[198] Suzuki S, Kumatori A, Haagen IA, Fujii Y, Sadat MA, Jun HL, et al.
PU.1 as an essential activator for the expression of gp91(phox) gene
in human peripheral neutrophils, monocytes, and B lymphocytes.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:6085-90.
[199] Hansson GK, Libby P, Schonbeck U,Yan ZQ. Innate and adaptive
immunity in the pathogenesis of atherosclerosis. Circ Res.
2002;91:281-91.
Referencias bibliográficas
166
[200] Bonnefont-Rousselot D. Glucose and reactive oxygen species.
Current opinion in clinical nutrition and metabolic care. 2002;5:561-
8.
[201] Jain A, Agrawal BK, Varma M,Jadhav AA. Antioxidant status and
smoking habits: relationship with diet. Singapore Med J.
2009;50:624-7.
[202] Schmitt E, Gehrmann M, Brunet M, Multhoff G,Garrido C.
Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins:
repercussions in cancer therapy. Journal of leukocyte biology.
2007;81:15-27.
[203] Daoud SS, Munson PJ, Reinhold W, Young L, Prabhu VV, Yu Q, et
al. Impact of p53 knockout and topotecan treatment on gene
expression profiles in human colon carcinoma cells: a
pharmacogenomic study. Cancer Res. 2003;63:2782-93.
[204] Appella E,Anderson CW. Post-translational modifications and
activation of p53 by genotoxic stresses. Eur J Biochem.
2001;268:2764-72.
[205] Sablina AA, Budanov AV, Ilyinskaya GV, Agapova LS, Kravchenko
JE,Chumakov PM. The antioxidant function of the p53 tumor
suppressor. Nat Med. 2005;11:1306-13.
[206] Gutierrez-Mariscal FM, Perez-Martinez P, Delgado-Lista J, Yubero-
Serrano EM, Camargo A, Delgado-Casado N, et al. Mediterranean
diet supplemented with coenzyme Q10 induces postprandial
changes in p53 in response to oxidative DNA damage in elderly
subjects. Age (Dordr). 2012;34:389-403.
[207] McKeown NM, Meigs JB, Liu S, Saltzman E, Wilson PW,Jacques
PF. Carbohydrate nutrition, insulin resistance, and the prevalence of
the metabolic syndrome in the Framingham Offspring Cohort.
Diabetes Care. 2004;27:538-46.
[208] Roberts W, Magwenzi S, Aburima A,Naseem KM. Thrombospondin-
1 induces platelet activation through CD36-dependent inhibition of
the cAMP/protein kinase A signaling cascade. Blood.
2010;116:4297-306.
[209] Jennings LK. Role of platelets in atherothrombosis. Am J Cardiol.
2009;103:4A-10A.
[210] Iacoviello L, Vischetti M, Zito F,Benedetta Donati M. Genes
encoding fibrinogen and cardiovascular risk. Hypertension.
2001;38:1199-203.
Referencias bibliográficas
167
[211] Redman CM,Xia H. Fibrinogen biosynthesis. Assembly, intracellular
degradation, and association with lipid synthesis and secretion. Ann
N Y Acad Sci. 2001;936:480-95.
[212] Smith A, Patterson C, Yarnell J, Rumley A, Ben-Shlomo Y,Lowe G.
Which hemostatic markers add to the predictive value of
conventional risk factors for coronary heart disease and ischemic
stroke? The Caerphilly Study. Circulation. 2005;112:3080-7.
[213] Pebernard S, Perry JJ, Tainer JA,Boddy MN. Nse1 RING-like
domain supports functions of the Smc5-Smc6 holocomplex in
genome stability. Mol Biol Cell. 2008;19:4099-109.
[214] Ahn K, Erlander M, Leturcq D, Peterson PA, Fruh K,Yang Y. In vivo
characterization of the proteasome regulator PA28. J Biol Chem.
1996;271:18237-42.
[215] Li J, Powell SR,Wang X. Enhancement of proteasome function by
PA28α overexpression protects against oxidative stress.
Faseb J. 2011;25:883-93.
[216] Murakumo Y, Ogura Y, Ishii H, Numata S, Ichihara M, Croce CM, et
al. Interactions in the error-prone postreplication repair proteins
hREV1, hREV3, and hREV7. J Biol Chem. 2001;276:35644-51.
[217] Jessop CE,Bulleid NJ. Glutathione directly reduces an oxidoreductase
in the endoplasmic reticulum of mammalian cells. J Biol Chem.
2004;279:55341-7.
[218] Codoner-Franch P., Valls-Belles V., Arilla-Codoner A.,E. A-I.
Oxidant mechanisms in childhood obesity: the link between
inflammation and oxidative stress. Transl Res. 2011;158:369-84.
[219] Gregor MF,Hotamisligil GS. Thematic review series: Adipocyte
Biology. Adipocyte stress: the endoplasmic reticulum and metabolic
disease. J Lipid Res. 2007;48:1905-14.
[220] Minamino T, Komuro I,Kitakaze M. Endoplasmic reticulum stress as
a therapeutic target in cardiovascular disease. Circ Res.
2010;107:1071-82.
[221] Reddy JK,Hashimoto T. Peroxisomal beta-oxidation and peroxisome
proliferator-activated receptor alpha: an adaptive metabolic system.
Annu Rev Nutr. 2001;21:193-230.
[222] Carpentier YA, Portois L,Malaisse WJ. n-3 fatty acids and the
metabolic syndrome. The American journal of clinical nutrition.
2006;83:1499S-504S.
[223] Hamel FG, Bennett RG, Upward JL,Duckworth WC. Insulin inhibits
peroxisomal fatty acid oxidation in isolated rat hepatocytes.
Endocrinology. 2001;142:2702-6.
Referencias bibliográficas
168
[224] FitzPatrick DR, Germain-Lee E,Valle D. Isolation and
characterization of rat and human cDNAs encoding a novel putative
peroxisomal enoyl-CoA hydratase. Genomics. 1995;27:457-66.
[225] Wang P,Heitman J. The cyclophilins. Genome Biol. 2005;6:226.
[226] Wall R, Ross RP, Fitzgerald GF,Stanton C. Fatty acids from fish: the
anti-inflammatory potential of long-chain omega-3 fatty acids. Nutr
Rev. 2010;68:280-9.
X. ANEXOS
Anexos
Publicaciones derivadas de la Tesis
Postprandial changes in the proteome are modulated by dietary fat in patients
with metabolic syndrome
Camargo A, Rangel-Zúñiga OA, Peña-Orihuela P, Marín C, Pérez-Martínez P,
Delgado-Lista J, Gutiérrez-Mariscal FM, Malagón MM, Roche HM, Tinahones
FJ, Pérez-Jiménez F, López-Miranda J.
J Nutr Biochem. 2013 Jan;24(1):318-24. doi: 10.1016/j.jnutbio.2012.06.014.
Epub 2012 Sep 5
Antioxidant system response is modified by dietary fat in adipose tissue of
metabolic syndrome patients
Peña-Orihuela P, Camargo A, Rangel-Zúñiga OA, Pérez-Martínez P, Cruz-Teno
C, Delgado-Lista J, Yubero-Serrano ME, Paniagua JA, Tinahones FJ, Malagón
MM, Roche HM, Pérez-Jiménez F, López-Miranda J.
J Nutr Biochem. 2013 Oct;24(10):1717-23. doi: 10.1016/j.jnutbio.2013.02.012.
Epub 2013 May 3
Postprandial changes in the proteome are modulated by dietary fat in patients withmetabolic syndrome,,
Antonio Camargoa,1, Oriol Alberto Rangel-Zúñigaa,1, Patricia Peña-Orihuelaa, Carmen Marína,Pablo Pérez-Martíneza, Javier Delgado-Listaa, Francisco Miguel Gutierrez-Mariscala, María M. Malagónb,
Helen M. Rochec, Francisco José Tinahonesd, José Lopez-Mirandaa,⁎, 2
aLipids and Atherosclerosis Unit, IMIBIC/Reina Sofia University Hospital/University of Córdoba and CIBER Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CIBEROBN), Instituto de Salud Carlos III. 14004,Córdoba, Spain
bDepartment of Cell Biology, Physiology and Immunology, IMIBIC, University of Córdoba and CIBER Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CIBEROBN), Instituto de Salud Carlos III. 14014, Córdoba, SpaincNutrigenomics Research Group, UCD School of Public Health and Population Science, UCD Conway Institute, University College Dublin, Befield, Dublin 4, Ireland
dHospital Virgen de la Victoria, Malaga, Spain, and CIBER Fisiopatologia de la Obesidad y Nutricion, Instituto de Salud Carlos III, Málaga, Spain
Received 18 December 2011; received in revised form 10 May 2012; accepted 15 June 2012
Abstract
Metabolic syndrome is a multicomponent disorder whose etiology is the result of a complex interaction between genetic, metabolic and environmental factorsincluding dietary habits. Our aimwas to identify proteome–diet interactions during the postprandial state after the acute intake of fourmeals with different qualities offat in the proteomeof peripheral bloodmononuclear cells. A randomized controlled trial conductedwithin the LIPGENE study assigned 39metabolic syndromepatientsto one of four meals: a high-saturated-fatty-acid (HSFA) meal, a high-monounsaturated-fatty-acid (HMUFA) meal and two high-polyunsaturated-fatty-acid (fromwalnut) (HPUFA) meals supplemented with n-3 PUFA or placebo. We analyzed the postprandial changes in the whole proteome of both nuclear and cytoplasmicfractions of peripheral blood mononuclear cells by two-dimensional proteomics. Twenty-three proteins were differentially expressed. HSFA intake caused thepostprandial increase of proteins responding tooxidative stress (HSPA1A, PDIA3 andPSME1) andDNAdamage (SMC6),whereasHMUFA intake led to theup-regulationof HSPA1A and PDIA3. HPUFAmeal supplementation with n-3 PUFA produced peroxisomal beta-oxidation inhibition by down-regulation of ECH1, a process related toinsulin signaling improvement. In conclusion, HSFA meal intake causes deleterious postprandial changes in the proteome in terms of DNA damage and procoagulantstate, which reflect a higher postprandial oxidative stress after HSFA meal intake as compared to intake of HMUFA and HPUFA meals. Moreover, the addition of long-chain n-3 PUFA to an HPUFA meal may improve insulin signaling and exerts an anti-inflammatory effect when compared to an HPUFA meal.© 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Proteomic; Diet; Oxidative stress; Atherothrombosis; Metabolic syndrome
1. Introduction
The metabolic syndrome (MetS) is a multicomponent disorderassociated with an increased risk of type 2 diabetes andcardiovascular diseases [1]. The etiology of MetS is the result of acomplex interaction between genetic, metabolic and environmentalfactors, including dietary habits and, probably, the quality of dietaryfat [2].
The postprandial state causes an important stress on thehomeostasis due to the increase in lipid-derived proinflammatorymolecules, oxidative stress and a transient increase in proinflamma-tory molecules released by human white blood cells and endothelialcells [3]. Likewise, the changes in postprandial metabolism occurringevery time we eat a meal and alterations in this state play animportant role in the development of cardiovascular disease andassociated pathologies [4].
An inflammatory response is a feature of the complex proathero-genic phenotype occurring during the postprandial state [5], whichis especially important in patients with MetS since they are
Available online at www.sciencedirect.com
Journal of Nutritional Biochemistry xx (2012) xxx–xxx
Source of funding: This research has been funded partly by research grantsfrom the SpanishMinistry of Science and Innovation (AGL 2004–07907, AGL2006-01979 and AGL2009-12270 to J.L.-M.; SAF07-62005 to F.P.-J.; FIS PI10/01041 toP.P.-M.; PI10/02412 to F.P.-J.); Consejería de Economía, Innovación y Ciencia,Proyectos de Investigación de Excelencia, Junta de Andalucía (P06-CTS-01425 toJ.L.-M., CTS5015 and AGR922 to F.P.-J., CTS-03039 toM.M.M.); Consejería de Salud,Junta de Andalucía (06/128, 07/43 and PI0193/09 to J.L.-M.; 06/129 to F.P.-J.; 06/127 to C.M.-H., 0118/08 to F.P.-J., PI-0252/09 to J.D.-L., PI-0058/10 to P.P.-M.);Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); Science Foundation Ireland PIProgramme (06/IM.1/B105) to H.M.R.; EU Sixth Framework Food Safety & QualityProgramme (Contract Number FOOD-2003-CT-505944).
Conflict of interests: None of the authors has any conflict of intereststhat could affect the performance of the work or the interpretation of the data.
Clinical Trial Registration number: Study identifier at ClinicalTrials.govwas NCT00429195.
⁎ Corresponding author. Reina Sofia University Hospital, Lipids andAtherosclerosis Research Unit, 14004 Córdoba, Spain. Tel.: +34 957 012882;fax: +34 957 204763.
E-mail address: [email protected] (J. Lopez-Miranda).1 The first two authors (A.C. and O.A.R.-Z.) contributed equally to this study.2 The last two authors (F.P.-.J and J.L.-M.) contributed equally to this study.
0955-2863/$ - see front matter © 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2012.06.014
characterized as exhibiting a state of low-grade inflammation. MetSpatients are particularly vulnerable since they exhibit an exacerba-ted hypertriglyceridemia response [6] and abnormalities in thepostprandial metabolism of lipoproteins [7]. In addition, postpran-dial hypertriglyceridemia has been related to the proinflammatorystate [3].
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a subset ofwhite blood cells consisting of lymphocytes and monocytes/macrophages. They are relatively easily accessible in humans byisolation from a blood sample, and they can be used to assessbiological responses and are a potential source to discover newbiomarkers of response to environmental cues, including nutrition[8–10]. Despite the increasing number of studies that utilize PBMCsfor diagnosis or disease-associated purposes [8], most of themanalyze gene expression, and, while relevant, they have the intrinsiclimitation of not focusing on the final products that perform thebiological function. However, in the area of nutritional research,these studies have shown, for example, that diet modulates the geneexpression of inflammatory genes [11,12], metabolism-related genes[13] and oxidative stress [14].
Proteomics is a central platform in nutrigenomics that describeshow our genome expresses itself as a response to diet [15]. However,while proteomics represents a novel, promising tool to uncover themechanisms of action of nutrients as well as to identify potentialbiomarkers of health or disease, the actual use of this technique indietary intervention trials is still rather limited [16]. Fuchs et al. [17]have shown the PBMC proteome response to a dietary interventionwith isoflavone-enriched soy extract in postmenopausal women inthe fasting state. However, no studies to date have addressed thepostprandial modulation of PBMC proteome by diet. Additionally, anobservational study has shown that the plasma proteomic profilediffers between young people of diverse ethnocultural groups withdifferent dietary habits [18].
In this study, we present data on changes in the proteome ofPBMCs isolated from MetS patients in response to the acute intake offour diets with different quantities and qualities of fat. The nutritionalregulation of the postprandial proteomewas analyzed to identify fast-response proteins to the quality of dietary fat and to pave the way forfuture research into the molecular mechanism underlying gene–nutrient interaction. To the best of our knowledge, our study is thefirst one focusing on postprandial proteome modulation by diet.
2. Methods and materials
2.1. Participants and recruitment
This study was conducted within the framework of the LIPGENE study (Diet,genomics and metabolic syndrome: an integrated nutrition, agro-food, social andeconomic analysis), a Framework 6 Integrated Projected funded by the EuropeanUnion. All participants gave written informed consent and underwent a comprehen-sive medical history, physical examination and clinical chemistry analysis beforeenrolment. This study was carried out at the Lipid and Atherosclerosis Unit of the ReinaSofia University Hospital from February 2005 to April 2006. The experimental protocolwas approved by the local ethic committee according to the Helsinki Declaration.
From this LIPGENE cohort, we analyzed the PBMC proteome from 24 patients, 6patients per meal (3 women and 3 men), by two-dimensional (2-D) proteomicanalysis. After that, we used the PBMC proteins from the whole subgroup, whichcomprised 39 patients (Supplemental Table 1) [8 patients ingested a high-saturated-fatty-acid (HSFA) meal, 9 patients ingested a high-monounsaturated-fatty-acid(HMUFA) meal, 12 patients ingested a high-polyunsaturated-fatty-acid (HPUFA)meal, and 10 patients ingested an HPUFA n-3 meal] to validate proteomic data byWestern blot.
2.2. Design, randomization and intervention
MetS patients were randomly stratified to one of four test meal intakes. MetS wasdefined by published criteria [19], which conformed to the LIPGENE inclusion andexclusion criteria [20]. Randomization was completed centrally according to age,gender and fasting plasma glucose concentration using the Minimization Program forAllocating Patients to Clinical Trials (Department of Clinical Epidemiology, London
Hospital Medical College, UK) randomization program. Themeals differed in fat qualitywhile remaining isoenergetic (Supplemental Table 2).
Briefly, HSFA meal provided 38% E from SFA, 21% from MUFA and 6% from PUFA;HMUFA meal provided 12% E from SFA, 43% from MUFA and 10% from PUFA; andHPUFA meals provided 21% E from SFA, 28% from MUFA and 16% from PUFA. HPUFAwith placebo, meal included 1.2 g supplement of control high-oleic sunflower seed oilcapsules; HPUFA with long chain (LC) n-3 PUFA, meal included 1.24 g/d of LC n-3 PUFA(ratio 1.4 EPA:1 DHA).
Patients arrived at the clinical center at 08:00 h following a 12-h fast, refrainedfrom smoking during the fasting period and abstained from alcohol intake during thepreceding 7 days. In the laboratory and after cannulation, a fasting blood sample wastaken before the test meal, which then was ingested within 20 min under supervision.
Test meals provided an equal amount of fat (0.7 g/kg body weight), E content (40.2kJ/kg body weight), cholesterol (5 mg/kg of body weight), fiber and vitamin A [62.9mmol vitamin A (retinol)/m2 body surface area]. The test meal provided 65% of E as fat,10% as protein and 25% as carbohydrates. During the postprandial assessment,participants rested and did not consume any other food for 9 h but were allowed todrink water.
The natural foods used in the meals were as follows: HSFA, 38% E from SFA, basedon butter, whole milk, white bread and eggs intake; HMUFA, 43% E from MUFA, basedon olive oil, skimmed milk, white bread, eggs, yolk eggs and tomatoes intake; HPUFA(21% SFA, 28% MUFA), based on butter, olive oil, skimmed milk, white bread, eggs, yolkeggs and walnuts.
2.3. Blood sample collection
Venous blood samples were obtained in the fasting state, after a 12-h fast, beforeand at 4 h after the ingestion of the breakfast. Samples from the fasting andpostprandial states were collected in tubes containing 1 g EDTA/L and were stored incontainers with iced water in the dark. Special care was taken to avoid exposure to air,light and ambient temperature. Plasma was separated from whole blood by low-speedcentrifugation at 1500g for 15 min at 4°C within 1 h of extraction.
2.4. Isolation of peripheral blood mononuclear cells
PBMCs were isolated within 2 h after blood draw from 30-ml EDTA anticoagulatedblood samples. Buffy coats were diluted 1:2 in phosphate-buffered saline (PBS), andcells were separated in 5 ml Ficoll gradient (lymphocyte isolation solution, Rafer) bycentrifugation at 2000g for 30 min. PBMCs were collected and washed twice with coldPBS. PBMCs were stored in lysis buffer A (10 mMHEPES; 10mMKCl; 0.1 mM EDTA; 0.1mM EGTA; 0.5 mM PMSF; 1 mM DTT; 10 μg/ml CLAP; 1% NP-40) at −80°C prior toprotein extraction.
2.5. Protein extraction from peripheral blood mononuclear cells
Protein extracts from nuclear and cytoplasmic fractions from PBMCs were obtainedfollowing the procedure previously described by Hernandez-Presa et al. [21]. Briefly,samples were thawed for 15 min in ice, and then they were vortexed for 20 min andcentrifuged at 15,000g for 5 min at 4°C, and the cytoplasmic fraction was collected onthe supernatant. Pellet was dissolved in 100-μl lysis buffer C (20 mM HEPES; 400 mMNaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM PMSF; 1 mMDTT; 10 μg/ml CLAP) and incubatedfor 20 min in ice. Samples were vortexed every 5 min for 30 s during the incubationperiod. After centrifugation at 10,000g for 5 min at 4°C, the nuclear fraction wascollected on the supernatant. Protein samples were quantified by Bradford methodusing Dye Reagent Protein (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) according tothe manufacturer's instructions.
2.6. 2-D gel electrophoresis
Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) was performedas described by Görg et al. [22]. Protein fractions were cleaned using the Ready Prep 2-D Cleanup Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) according to themanufacturer's instructions. A total of 200 μg of protein were diluted in 200 μl ofrehydration buffer (8M urea, 2% CHAPS, 50mMDTT, 0.2% Bio-Lyte 3/10 ampholyte and0.002% bromophenol blue). Immobilized pH gradient strips (11 cm, pH 3–10) wererehydrated overnight in a Protean IEF Cell (Bio-Rad Laboratories) following a stepwisevoltage: slow ramp, 250 V (15 min), 8000 V (5 h, linear gradient), 8000 V (26,000 Vh),total Vh 40,000. Strips were equilibrated in equilibration buffer I [6 M urea, 0.375 MTris–HCl, pH 8.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 2% (w/v) DTT] for 10min and then for another 20 min in equilibration buffer II [6 M urea, 0.375 M Tris–HCl,pH 8,8, 2% glycerol, 2.5% (w/v) iodoacetamide]. Thereafter, proteins were separated in12% Bis-Tris Criterion XT Precast Gels (Bio-Rad Laboratories) using a Criterion DodecaCell system (Bio-Rad Laboratories) in MOPS buffer 1× at 180 V.
Gel staining was performed overnight in darkness with SYPRO Ruby after proteinfixing by using 40% methanol and 10% acetic acid for 2 h. Gels were washed in 40%methanol and 10% acetic acid twice for 1 h and once in distilled water for 30min beforeimaging acquisition.
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2.7. Imaging acquisition and spots detection
After staining, gels were visualized with UV light by using ChemiDoc XRS System(Bio-Rad Laboratories). Images were acquired using the software Quantity One 16.0(Bio-Rad Laboratories). The spots were detected by the PDQuest software 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories). Detection parameters set: spot detection sensitivity=6.0; sizescale=5; mini peak=2000. Speckle filter enable and sensitivity=70.0. Imagesmoothing enabled, filter median and smooth kernel size 3×3. Background subtractionenabled, method floating ball and background radius=67. Streak removal enabledvertical and horizontal streak radius=111. The normalization method chosen was thetotal quantity in valid spots.
2.8. MALDI-TOF MS analysis
Spots were excised automatically in a ProPic station (Genomic Solutions,Huntingdon, UK) and subjected to MS analysis. For matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) analysis, gel specimenswere unstained twice (30 min, 37°C) with 200 mM ammonium bicarbonate/40%acetonitrile. Gel pieces dehydrated for 5minwith pure acetonitrile and dried out over 4h were automatically digested with trypsin according to the standard protocols in aProGest station (Genomic Solutions). MS and MS/MS analyses of peptides of eachsample were performed in a 4700 Proteomics Station (Applied Biosystems, CA, USA).Mass spectrometry was performed at the Proteomics Facility (SCAI) of the University ofCordoba, which is Node 6 of the ProteoRed Consortium financed by Genoma Españaand belongs to the Andalusian Platform for Genomics, Proteomics and Bioinformatics.
2.9. Pathway analysis
In order to investigate functional relationships in the set of differentially expressedproteins, we used the Ingenuity Pathway Analysis Software (Ingenuity Systems,Redwood City, CA USA) [23] which employs a predefined knowledge base containingover 10,000 curated human genes.
Network analysis yielded 15 different subnetworks. From the 10 proteins founddifferentially expressed after the intake of HSFA, 2 proteins (PSME1, ZFP2) were noteligible for network analysis, which yielded 6 subnetworks. For HMUFAmeal, of the sixproteins, two proteins (CCDC150, Serpin B1) were not eligible for network analysiswhich yielded four subnetworks. For HPUFA meal, of the five proteins, two proteins(HSPA6, MYL12A) were not eligible and yielded three subnetworks. For HPUFA n-3meal, of the five proteins, three proteins (ALDH2, CAPZB, and ECH1) were not eligibleand yielded two subnetworks. After that, we built two networks merging thosesubnetworks sharing one or more proteins.
2.10. Western blot validation experiments
Commercial antibodies used for Western blot validation experiments wereprovided by Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Forty microgramsof protein from each individual subject (8 patients who ingested an HSFA meal, 9patients who ingested an HMUFA, 12 patients who ingested an HPUFA meal and 10patients who ingested an HPUFA n-3 meal) was loaded in gels for SDS-PAGE. Proteinswere transferred to nitrocellulose membranes, which were blocked with 1× tris-buffered saline and tween 20 (TBS-T) containing 2% of bovine serum albumin, followedby incubation with the corresponding primary antibody diluted in TBS-T at theconcentrations indicated by the manufacturer. After washing, membranes wereincubated with the appropriate IgG–HRP-conjugated secondary antibody. Membraneswere incubated for 2minwith SuperSignalWest Pico ECL Substrate (Thermo Scientific)for protein detection. Images were acquired on a Molecular Imager ChemyDoc XRS(Bio-Rad Laboratories), and band density analysis was performed with QuantityOneSoftware V (Bio-Rad Laboratories). Band intensity signal was normalized by totalprotein in membranes, which was measured by Ponceau S stain method.
2.11. Statistical analysis
2-D gel analysis was performed by PDQuest software (Bio-Rad Laboratories),version 8.0. Manual corrections were also performed to validate the matchesautomatically generated by the software. Spot volume values were normalized ineach gel by dividing the raw quantity of each spot by the total volume of all the spotsincluded in the same gel. Other normalizations provided by the PDQuest software werealso performed with similar results. Variations of all the identified spots were finallyconfirmed and quantified by density measurements using ImageJ 1.40g software.Statistical analysis used SSPS statistical software, version 15.0 for WINDOWS (SSPS,Chicago, IL, USA). Normal distribution of variables to characterize differences in theexpression of proteins under study was assessed using the Kolmogorov–Smirnov testfollowed by a Student's t test for independent samples. Differences were consideredsignificant at Pb.05. All data are expressed as mean±S.E.M.
3. Results
3.1. Baseline characteristics
No significant differences were observed in the baseline charac-teristics of the 39 subjects with MetS participating in the dietaryintervention (Supplemental Table 1).
3.2. Proteomic analysis
We performed 2-D gel electrophoresis of nuclear and cytoplasmicfractions from PBMCs separately. On average, N400 different proteinspots from nuclear and cytoplasmic fractions were resolved by 2-DPAGE.
Comparative proteomic analysis of the PBMC proteome frompatients before (fasting state) and after the intake of the test meal(postprandial state) (Table 1) revealed that the acute intake of HSFAmeal caused the postprandial up-regulation of five proteins (ZFP2,SMC6, HLA-C, THBS1 and PSME1) and the postprandial down-regulation of five proteins (REV3-like, PDIA3, HSPA1A, FGB andPLEC). HMUFA meal intake caused the postprandial up-regulation ofthree proteins (HSPA1A, HLA-A and PDIA3) and the postprandialdown-regulation of three proteins (CCDC150, CEP290 and SERPINB1). HPUFAmeal intake caused the postprandial up-regulation of fourproteins (FLNA, GRIN1, HLA-C and HSPA6) and the postprandialdown-regulation of one protein (MRLC3). HPUFA n-3 meal intakecaused the postprandial up-regulation of three proteins (VIM, PPIA,ALDH2) and the postprandial down-regulation of two proteins(CAPZB, ECH1).
The identified proteins could be grouped into the followingcategories: (a) molecular chaperones and stress response (HSPA1A,HSPA6, PDIA3); (b) cell-to-cell interaction (FGB, THBS1); (c) DNAmaintenance (SMC6, REV3-like, CEP290); (d) structural filaments orcomponents of the cytoskeleton (PLEC, FLNA, VIM, MRLC3, CAPZB);(e) enzymes and receptor (HLA-A, HLA-C, SERPIN B1, GRIN1, PPIA,ALDH2, ECH1); (f) others (ZFP2, CCDC150, PSME1) (Fig. 1).
3.3. 2-D proteomic result validation by Western blot
To confirm proteomic analysis results using an independenttechnique, we analyzed eight differentially expressed proteins (foldchange ranging from 2.53 to 0.43) by Western blot, whichcorresponded to the following categories: three chaperones, twoenzymes, two cell structural components and one cell-to-cellinteraction. Quantification of the immunoreactive bands revealedthe same diet-induced changes as those observed by 2-D proteomics(Supplemental Figure 1).
3.4. Pathway analysis
Ingenuity Pathway Analysis showed that the top functionassociated with proteins differentially expressed after HSFA mealintake was inflammatory response (HLA-C, THBS1 and PSME1, up-regulated; PLEC, FGB and HSPA1A, down-regulated). Likewise,different genetic disorders were the top functions associated toproteins differentially expressed after acute intake of HMUFA, HPUFAand HPUFA n-3 meals.
In terms of molecular function, cell-to-cell signaling and interac-tion (HSFA five proteins, HMUFA two proteins and HPUFA zeroprotein), together with DNA replication, recombination and repair(HSFA two proteins, HMUFA two proteins, and HPUFA zero protein),showed higher representation after the intake of HSFA and HMUFAthan after the intake of HPUFAmeal, but not after the intake of HPUFAn-3 (cell-to-cell signaling and interaction, two proteins; DNAreplication, recombination and repair, two proteins). On the other
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hand, cellular assembly and organization (HSFA one protein, HMUFAone protein, HPUFA two proteins and HPUFA n-3 three proteins) aswell as cell morphology (HSFA zero protein, HMUFA zero protein,HPUFA two proteins and HPUFA n-3 two proteins) showed higherrepresentation after the intake of HPUFA meals than after the intakeof HSFA and HMUFA meals.
In order to investigate whether the differentially expressedproteins after the intake of different quality of fat interact with eachother, we studied the relationships between the differentiallyexpressed proteins at the postprandial state after the acute intakeof four test meals by using the Ingenuity Pathway Analysis Software.Thus, the network analysis yielded 15 different subnetworks, whichcould be grouped into two networks by merging those subnetworkssharing one ormore proteins. The top functions associated to network1 were cellular growth, proliferation, movement and development.For network 2, they were inflammatory response, cell death, cellulargrowth and proliferation. Finally, we removed those proteins notconnecting the identified proteins directly (Fig. 2).
4. Discussion
Herein, we report for the first time the postprandial proteomes ofPBMC in response to the quality of fat in diet. Moreover, this is the firststudy dealing with postprandial response to different dietary modelsin MetS patients, whose etiology is related to dietary habits [2].
Our proteomic approach yielded 23differentially expressed proteinsat the postprandial state after the acute intake of four test meals withdifferent qualities of fat. HSFA and HMUFA meals caused postprandialproteome changes in processes such as cell signaling and interactionand DNA repair. In contrast, an HPUFA postprandial challenge led topostprandial changes in proteins involved in processes such as cellularassembly and organization, or cell morphology. Additionally, thesupplementation of an HPUFAmeal with LC n-3 PUFA caused proteomechanges related to cell signaling and interaction, DNA repair, cellularassembly and organization, and cell morphology.
The current study showed that despite the heterogeneity of thefatty meals administered, in terms of fat quality, most of thepostprandial short-term response proteins could be grouped in aninterconnected network, associated to cellular functions such ascellular growth and proliferation (network 1), which may beimportant for the development of atherosclerosis since it has beendemonstrated that the progression of this disease is associated withthe clonal expansion of T cells [24].
However, none of the dietary models tested showed a proteomeprofile favoring or repressing the growth and proliferation of PBMC.The fact that each meal intake caused the up-regulation or down-regulation of only one or two proteins in the network suggests thatdietary fat may affect cellular growth and proliferation processes atthe postprandial state but not in the fatty acid proportions or dosesadministered in our study.
Table 1Quantity and quality of dietary fat effect in the postprandial changes on proteome
FC P value MW pI Accession no. Score CI % Pep count Ion CI %
Postprandial changes of proteins induced after acute HSFA meal consumptionNuclear fraction1. ZFP2: zinc finger protein 2 homolog 3.27 .036 54359.7 8.91 gi|47271457 82. SMC6: structural maintenance of chromosomes 6 2.35 .006 35828 7.59 gi:122070455 99.919 113. REV3-like: catalytic subunit of DNA polymerase zeta (yeast), isoform CRA 0.44 .031 37.5 9.6 gi:119568677 99.093Cytoplasm fraction4. HLA-C: HLA class I histocompatibility antigen. Cw-1 alpha chain 3.90 .030 24053.8 6.75 gi|599786 30.637 65. THBS1: thrombospondin 2.53 .043 42215.2 6.6 gi|553801 99.99 5 99.9976. PSME1: proteasome activator subunit 1 isoform 1 1.90 .031 28754.9 6.28 gi|30581141 99.982 28 81.6447. PDIA3: protein disulfide-isomerase 0.58 .043 52884.4 4.76 gi:2507460 100 8 1008. HSPA1A: heat shock 70-kDa protein 1A 0.43 .047 70280.1 5.48 gi|5123454 100 16 1009. FGB: fibrinogen beta chain. isoform CRA_f 0.33 .026 44723.6 8.84 gi|119625340 100 9 99.83410. PLEC: plectin-1 0.32 .049 518510.8 5.60 gi:209572726 99.322 33
Postprandial changes of proteins induced after acute HMUFA meal consumptionNuclear fraction11. CCDC150 protein 0.25 .032 44114.5 9.47 gi|38541637 83.74 912. CEP290: centrosomal protein of 290 kDa UE .018 268104.8 5.75 gi:116241294 99.941 26Cytoplasm fraction8. HSPA1A: heat shock 70-kDa protein 1A 2.20 .045 70110.0 5.42 gi|386785 100 16 10013. HLA-A: MHC class I antigen 1.81 .042 21139.1 5.77 gi|89152359 44.903 67. PDIA3: protein disulfide isomerase 1.40 .043 54453.6 6.78 gi|119597640 100 15 99.9514. SERPIN B1: serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 1 0.36 .036 42889.8 6.22 gi:266344 99.999 9 99.512
Postprandial changes of proteins induced after acute HPUFA meal consumptionCytoplasm fraction15. FLNA: filamin alpha (actin binding protein 280), isoform CRA_e 7.94 .0434 266548.5 5.79 gi|119593154 100 15 10016. GRIN1: glutamate receptor subunit zeta-1 2.73 .0469 105373 8.5 gi:548377 99.274 144. HLA-C: HLA class I histocompatibility antigen. Cw-17 alpha chain 1.38 .029 19045.2 6.95 gi:34395506 39.587 617. HSPA6: heat shock 70-kDa protein 6, variant 1.35 .046 71416.3 5.81 gi|62898285 99.874 5 99.99218. MRLC3: myosin regulatory light chain 12A. 0.49 .0397 19456.2 4.74 gi|127169 99.992 5 99.916
Postprandial changes of proteins induced after acute HPUFA n-3 meal consumptionNuclear fraction19. VIM: vimentin 1.94 .031 53604.1 5.09 gi|47115317 53.109 6 73.57920. PPIA: cyclophilin A 1.84 .047 18039.9 8.37 gi|75766275 100 5 100Cytoplasm fraction21. ALDH2: aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial) 1.78 .042 56932.9 6.63 gi|48146099 92.902 2 99.94422. CAPZB: capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta 0.69 .045 29561.9 6.45 gi|55665440 100 7 10023. ECH1: enoyl Coenzyme A hydratase 1, peroxisomal UE .014 36077.5 8.47 gi|16924265 100 6 100
FC, fold change (proteins level at postprandial/proteins level at fasting). P value, t test P value; MW, theoretical molecular weight; pI, theoretical isoelectric point. Pep count, peptidecount; CI, confidence index; UE, underexpressed, not detected at postprandial.
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Notably, several of the differentially expressed proteins or proteinisoforms found in our study [heat shock protein (HSPA1A, HSPA6),myosin regulatory chain, proteasome activator subunit, filamin alpha,fibrinogen beta chain and thrombospondin] have been shown to bemodulated by soy isoflavones in the fasting state after a long-termintervention [17]. This study showed the chronic effect of a dietaryintervention with isoflavone-enriched soy extract in postmenopausalwomen. Together, these and our findings support the idea that theseproteins are sensitive to modulation by nutritional intervention.
The postprandial state involves an increase in the production ofreactive oxygen species, which can cause damage to biologicalmacromolecules such as proteins and DNA [25,26]. HSPA1A is amember of the heat shock protein family [27], whose gene expressionis repressed by p53 when activated by DNA damage [28]. Previousstudies from our laboratory have shown that an HMUFA mealfollowing a long-term consumption of a MUFA-rich diet loweredseveral postprandial oxidative stress biomarkers as compared to thatevoked by an HSFA meal after long-term consumption of an SFA-richdiet [29]. Taking into account that p53 has antioxidant functionsprotecting the genome from oxidation produced by oxidative stress[30,31], our results suggest that p53 activation by postprandialoxidative stress after an HSFA meal intake — probably by DNAdamage, as shown previously in an elderly population [32]— could beresponsible for HSPA1A down-regulation and, for the opposite effect,up-regulation after an HMUFAmeal, whichmay be accounted for by alack of p53 postprandial activation.
Interestingly, THBS-1, an adhesive glycoprotein whose geneexpression is increased by p53 [33], was up-regulated after theHSFA meal intake and remained unchanged after the intake of theother three meals. This glycoprotein has been shown to promoteplatelet aggregation [34], a physiologic process of defense againstuncontrolled hemorrhage, although it also occludes blood vesselswith thrombi, thus leading to cardiovascular events, includingunstable angina and myocardial infarction [35]. In line with this, wealso observed a postprandial decrease in fibrinogen beta chain (FGB),whose synthesis is the limiting step in the production of maturefibrinogen [36]. Fibrinogen is cleaved by thrombin to form insolublefibrin which is the most abundant component of blood clots [37].Thus, FGB postprandial decrease after an HSFA meal intake suggestsan increased fibrin production by cleavage and release, which wouldreduce the substrate amount, FGB.
Both THSB1 increase and FGB decrease suggest a procoagulantstate after an HSFA meal when compared to the other mealsinvestigated herein. In this regard, an imbalance between procoagu-lant and profibrinolytic activity has been linked to coronary heartdisease [38]. This is especially important in MetS patients as theyexhibit a prothrombotic state in the fasting state [1], which seems tobe increased in the postprandial state after an SFA-rich meal intake.
The notion that several of the postprandial proteome changesobserved are due to increased postprandial oxidative stress after anSFA meal intake is also supported by the observation that SMC6, aprotein involved in the structural maintenance of chromosomes [39],and PSME1, a proteasome activator [40] that has been recently relatedto oxidative stress protection [41], were up-regulated in patientsfollowing this diet. Moreover, REV3, a protein involved in translesionDNA synthesis [42], was down-regulated after an HSFA meal intake.Remarkably, protein levels of SMC6, PSME1 and REV3 remainedunchanged after the intake of the other three meals.
On the other hand, PDIA3 (also called ERp57) belongs to a familyof oxidoreductases, including PDI, ERp72, P5 and PDIR, which areinvolved in the formation of native disulfide bonds, and underconditions of oxidative stress, the oxidoreductases are quicklyreduced and remain active. Interestingly, PDIA3 has been shown tobe reduced directly by glutathione [43], a molecule that increases atthe postprandial state after an HMUFA meal following long-termconsumption of an HMUFA-rich diet, and decreases after an HSFAmeal intake following the consumption of a long-term SFA-rich diet inour population [29]. In all, these findings indicate that HSFA dietwould decrease PDIA3 levels in the short term and repress the activityof the enzyme when the component responsible for its reduction(glutathione) is scarce (i.e., after long-term consumption of an HSFAdiet). In contrast, it was up-regulated after HMUFA intake, asglutathione levels may be higher than after an HSFA meal intake, ashas been shown by Perez-Martinez et al. [29].
Taken together, these findings suggest that the proteome, atleast partially, seems to be responding to the oxidative status at thepostprandial state after the intake of the different meals, directlyand through DNA damage. In addition to the relationship withoxidative stress, the top function associated with the proteinsdifferentially expressed after an HSFA meal intake was inflamma-tory response, which supports the link between oxidative stress andinflammation [44,45]. Notably, although both HSPA1A and PDIA3belong to protein families associated with endoplasmic reticulumstress (HSP70 and PDI), these isoforms seem to respond to oxidativestress rather than to ER stress, which is also related to oxidativestress [46], and this supports the notion that unfolded proteinresponse fulfils a wide spectrum of physiological roles [47]. Thus, inconditions of high postprandial oxidative stress (i.e., after intake ofan HSFA meal), it seem to have a lack of unfolding protein responsein MetS patients, which could also contribute to impair thepostprandial state of these patients.
pH 3 pH 10
1
23
11
19
20
12
5
6
4
9
10
17
13
15
18
7
8
21
22
23
14
16
pH 3 pH 10
Fig. 1. 2-D PAGE of PBMCwhole proteome, nuclear fraction [1] and cytoplasmic fraction[2]. Proteins were separated on a 2-DE gel using 18-cm pH 3–10 strips in the firstdimension and 12% SDS-PAGE gels in the second dimension, as described in Materialand Methods. Differentially expressed proteins are indicated with arrows. Thenumbers corresponding to the spot numbers are listed in Table 1.
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When meals contained close percentages of SFA and MUFA(HPUFA meals), no proteome changes related to oxidative stresswere observed, probably due to an intermediate situation betweenHSFA and HMUFA meals. However, the intake of HPUFA meals (withor without n-3 supplementation) seems to cause postprandialchanges in cell morphology, as suggested by the dysregulationobserved in FLNA (filamin alpha) and MRLC3 (myosin regulatorylight chain) after HPUFA intake, and VIM (vimentin) and CAPZB(capping protein, actin filament) after HPUFA intake supplementedwith LC n-3 fatty acids.
In addition, the supplementation of an HPUFA meal with LC n-3PUFA led to a proteome change related to fatty acid metabolism.Fatty acid beta-oxidation occurs in both mitochondria and peroxi-somes. Mitochondria catalyze the beta-oxidation of the bulk of fattyacids derived from diet, and peroxisomes are involved, preferen-tially, in the beta-oxidation chain shortening of very long chain fattyacids [48]. It has been suggested that increased intakes orsupplements of n-3 fatty acids may improve defects in insulinsignaling [49]. Since peroxisomal beta-oxidation has been shown tobe inhibited by insulin [50], the fact that our study has shown thatECH1, an enzyme involved in the peroxisomal beta-oxidationpathway [51], was down-regulated after an HPUFA n-3 meal intakesuggests that ECH1 down-regulation and the subsequent reductionof peroxisomal beta-oxidation may underlie the beneficial effects in
insulin signaling observed after intake of n-3 fatty acids, andsuggests that peroxisomal beta-oxidation inhibition by insulin couldbe caused by ECH1 down-regulation.
In addition, n-3 PUFA supplementation of an HPUFA meal led tothe postprandial up-regulation of PPIA (cyclophilin A), a protein thatbinds to cyclosporine, an immunosuppressant which is usually usedto suppress rejection after internal organ transplants, by halting theproduction of the proinflammatorymolecules TNF-α and interleukin-2 [52] and was also involved in the anti-inflammatory effectsassociated to n-3 fatty acid consumption [53]. Thus, n-3 PUFAconsumption could increase the effect of cyclosporine which wouldsupport the therapeutic administration of n-3 PUFA in combinationwith cyclosporine after organ transplantation.
In conclusion, HSFA meal intake causes deleterious postprandialchanges in the proteome, in terms of DNA damage and theprocoagulant state, which reflects higher postprandial oxidativestress after an HSFA meal intake when compared to the intake ofHMUFA and HPUFA meals. Moreover, the addition of LC n-3 PUFA toan HPUFA meal may improve insulin signaling and exerts an anti-inflammatory effect when compared to an HPUFA meal.
Further research is needed to extend our knowledge about thenutritional regulation of the postprandial events related to cardio-vascular diseases. In addition, it would be interesting to compare theeffect of dietary fat in pathological and nonpathological conditions.
Nucleus
Cytoplasm
Extracellular Space
Network 1 Network 2
HMUFAHSFA
HPUFA
HMUFAHSFA
HPUFA
HSFA
HSFA
HMUFA
HSFA
HPUFAn-3
HPUFAn-3
Fig. 2. Interaction between induced proteins at the postprandial state. Networks of differentially expressed proteins at the postprandial state after the acute intake of four diets withdifferent quantities and qualities of fat that were found to be interconnected and interacting with each other. Gray symbols denote that the proteins were found overexpressed orunderexpressed by dietary fat at the postprandial state.
6 A. Camargo et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2012) xxx–xxx
Supplementary data to this article can be found online at http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2012.06.014.
Acknowledgments
The CIBEROBN is an initiative of the Instituto de Salud Carlos III,Madrid, Spain. We thank Ma Jose Gomez-Luna for her technicalsupport.
References
[1] Grundy SM, Cleeman JI, Daniels SR, et al. Diagnosis and management of themetabolic syndrome: an American Heart Association/National Heart, Lung, andBlood Institute scientific statement. Circulation 2005;112:2735-52.
[2] Phillips C, Lopez-Miranda J, Perez-Jimenez F,McManusR, RocheHM.Genetic andnutrientdeterminants of the metabolic syndrome. Curr Opin Cardiol 2006;21:185-93.
[3] van Oostrom AJ, Rabelink TJ, Verseyden C, et al. Activation of leukocytes bypostprandial lipemia in healthy volunteers. Atherosclerosis 2004;177:175-82.
[4] Parks EJ. Recent findings in the study of postprandial lipemia. Curr AtherosclerRep 2001;3:462-70.
[5] Magne J, Mariotti F, Fischer R, Mathe V, Tome D, Huneau JF. Early postprandiallow-grade inflammation after high-fat meal in healthy rats: possible involvementof visceral adipose tissue. J Nutr Biochem 2010;21:550–5.
[6] Khoury DE, Hwalla N, Frochot V, Lacorte JM, Chabert M, Kalopissis AD.Postprandial metabolic and hormonal responses of obese dyslipidemic subjectswith metabolic syndrome to test meals, rich in carbohydrate, fat or protein.Atherosclerosis 2010;210:307-13.
[7] Ruotolo G, Howard BV. Dyslipidemia of the metabolic syndrome. Curr Cardiol Rep2002;4:494-500.
[8] Caimari A, Oliver P, Keijer J, Palou A. Peripheral blood mononuclear cells as amodel to study the response of energy homeostasis-related genes to acutechanges in feeding conditions. Omics 2010;14:129–41.
[9] Burczynski ME, Dorner AJ. Transcriptional profiling of peripheral blood cells inclinical pharmacogenomic studies. Pharmacogenomics 2006;7:187-202.
[10] Bouwens M, Afman LA, Muller M. Fasting induces changes in peripheral bloodmononuclear cell gene expression profiles related to increases in fatty acid beta-oxidation: functional role of peroxisome proliferator activated receptor alpha inhuman peripheral blood mononuclear cells. Am J Clin Nutr 2007;86:1515-23.
[11] Baer DJ, Judd JT, Clevidence BA, Tracy RP. Dietary fatty acids affect plasmamarkersof inflammation in healthy men fed controlled diets: a randomized crossoverstudy. Am J Clin Nutr 2004;79:969-73.
[12] Paschos GK, Rallidis LS, Liakos GK, et al. Background diet influences the anti-inflammatory effect of alpha-linolenic acid in dyslipidaemic subjects. Br J Nutr2004;92:649-55.
[13] Konstantinidou V, Khymenets O, Fito M, et al. Characterization of human geneexpression changes after olive oil ingestion: an exploratory approach. Folia Biol(Praha) 2009;55:85-91.
[14] Crujeiras AB, Parra D, Milagro FI, et al. Differential expression of oxidative stressand inflammation related genes in peripheral blood mononuclear cells inresponse to a low-calorie diet: a nutrigenomics study. Omics 2008;12:251-61.
[15] Ordovas JM, Corella D. Nutritional genomics. Annu Rev Genomics Hum Genet2004;5:71–118.
[16] de Roos B, McArdle HJ. Proteomics as a tool for the modelling of biologicalprocesses and biomarker development in nutrition research. Br J Nutr2008;99(Suppl. 3):S66-71.
[17] Fuchs D, Vafeiadou K, Hall WL, et al. Proteomic biomarkers of peripheral bloodmononuclear cells obtained from postmenopausal women undergoing anintervention with soy isoflavones. Am J Clin Nutr 2007;86:1369-75.
[18] Garcia-Bailo B, Brenner DR, Nielsen D, et al. Dietary patterns and ethnicity are associatedwith distinct plasma proteomic groups. Am J Clin Nutr 2012;95:352–61.
[19] Grundy SM, Brewer Jr HB, Cleeman JI, Smith Jr SC, Lenfant C. Definition ofmetabolic syndrome: report of the National Heart, Lung, and Blood Institute/A-merican Heart Association conference on scientific issues related to definition.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:e13-8.
[20] Shaw DI, Tierney AC, McCarthy S, et al. LIPGENE food-exchange model foralteration of dietary fat quantity and quality in free-living participants from eightEuropean countries. Br J Nutr 2009;101:750-9.
[21] Hernandez-Presa MA, Ortego M, Tunon J, et al. Simvastatin reduces NF-kappaBactivity in peripheral mononuclear and in plaque cells of rabbit atheroma moremarkedly than lipid lowering diet. Cardiovasc Res 2003;57:168-77.
[22] Gorg A, Drews O, Luck C, Weiland F, Weiss W. 2-DE with IPGs. Electrophoresis2009;30(Suppl. 1):S122-32.
[23] Calvano SE, Xiao W, Richards DR, et al. A network-based analysis of systemicinflammation in humans. Nature 2005;437:1032-7.
[24] Hansson GK, Libby P, Schonbeck U, Yan ZQ. Innate and adaptive immunity in thepathogenesis of atherosclerosis. Circ Res 2002;91:281-91.
[25] Bonnefont-Rousselot D. Glucose and reactive oxygen species. Curr Opin Clin NutrMetab Care 2002;5:561-8.
[26] Jain A, Agrawal BK, Varma M, Jadhav AA. Antioxidant status and smoking habits:relationship with diet. Singapore Med J 2009;50:624-7.
[27] Schmitt E, Gehrmann M, Brunet M, Multhoff G, Garrido C. Intracellular andextracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy.J Leukoc Biol 2007;81:15-27.
[28] Daoud SS, Munson PJ, Reinhold W, et al. Impact of p53 knockout and topotecantreatment on gene expression profiles in human colon carcinoma cells: apharmacogenomic study. Cancer Res 2003;63:2782-93.
[29] Perez-Martinez P, Garcia-Quintana JM, Yubero-Serrano EM, et al. Postprandialoxidative stress is modified by dietary fat: evidence from a human interventionstudy. Clin Sci (Lond) 2010;119:251-61.
[30] Appella E, Anderson CW. Post-translational modifications and activation of p53 bygenotoxic stresses. Eur J Biochem 2001;268:2764-72.
[31] Sablina AA, Budanov AV, Ilyinskaya GV, Agapova LS, Kravchenko JE, ChumakovPM. The antioxidant function of the p53 tumor suppressor. Nat Med 2005;11:1306-13.
[32] Gutierrez-Mariscal FM, Perez-Martinez P, Delgado-Lista J, et al. Mediterraneandiet supplemented with coenzyme Q10 induces postprandial changes in p53in response to oxidative DNA damage in elderly subjects. Age (Dordr)2012;34:389-403.
[33] McKeown NM, Meigs JB, Liu S, Saltzman E, Wilson PW, Jacques PF. Carbohydratenutrition, insulin resistance, and the prevalence of the metabolic syndrome in theFramingham Offspring Cohort. Diabetes Care 2004;27:538-46.
[34] Roberts W, Magwenzi S, Aburima A, Naseem KM. Thrombospondin-1 inducesplatelet activation through CD36-dependent inhibition of the cAMP/proteinkinase A signaling cascade. Blood 2010;116:4297–306.
[35] Jennings LK. Role of platelets in atherothrombosis. Am J Cardiol 2009;103:4A–10A.
[36] Iacoviello L, Vischetti M, Zito F, Benedetta Donati M. Genes encoding fibrinogenand cardiovascular risk. Hypertension 2001;38:1199-203.
[37] Redman CM, Xia H. Fibrinogen biosynthesis. Assembly, intracellular degradation,and association with lipid synthesis and secretion. Ann N Y Acad Sci 2001;936:480-95.
[38] Smith A, Patterson C, Yarnell J, Rumley A, Ben-Shlomo Y, Lowe G. Whichhemostatic markers add to the predictive value of conventional risk factors forcoronary heart disease and ischemic stroke? The Caerphilly Study. Circulation2005;112:3080-7.
[39] Pebernard S, Perry JJ, Tainer JA, Boddy MN. Nse1 RING-like domain supportsfunctions of the Smc5-Smc6 holocomplex in genome stability. Mol Biol Cell2008;19:4099-109.
[40] Ahn K, Erlander M, Leturcq D, Peterson PA, Fruh K, Yang Y. In vivo characterizationof the proteasome regulator PA28. J Biol Chem 1996;271:18237-42.
[41] Li J, Powell SR, Wang X. Enhancement of proteasome function by PA28αoverexpression protects against oxidative stress. Faseb J 2011;25:883-93.
[42] Murakumo Y, Ogura Y, Ishii H, et al. Interactions in the error-pronepostreplication repair proteins hREV1, hREV3, and hREV7. J Biol Chem 2001;276:35644-51.
[43] Jessop CE, Bulleid NJ. Glutathione directly reduces an oxidoreductase in theendoplasmic reticulum of mammalian cells. J Biol Chem 2004;279:55341-7.
[44] Fernandez-Sanchez A, Madrigal-Santillan E, Bautista M, et al. Inflammation,oxidative stress, and obesity. Int J Mol Sci 2011;12:3117–32.
[45] Codoner-Franch P, Valls-Belles V, Arilla-Codoner A, Alonso-Iglesias E. Oxidantmechanisms in childhood obesity: the link between inflammation and oxidativestress. Transl Res 2010;158:369–84.
[46] Gregor MF, Hotamisligil GS. Thematic review series: adipocyte biology. Adipocytestress: the endoplasmic reticulum and metabolic disease. J Lipid Res 2007;48:1905-14.
[47] Minamino T, Komuro I, Kitakaze M. Endoplasmic reticulum stress as a therapeutictarget in cardiovascular disease. Circ Res 2010;107:1071-82.
[48] Reddy JK, Hashimoto T. Peroxisomal beta-oxidation and peroxisome proliferator-activated receptor alpha: an adaptive metabolic system. Annu Rev Nutr 2001;21:193-230.
[49] Carpentier YA, Portois L, MalaisseWJ. n-3 fatty acids and the metabolic syndrome.Am J Clin Nutr 2006;83:1499S-504S.
[50] Hamel FG, Bennett RG, Upward JL, Duckworth WC. Insulin inhibits peroxisomalfatty acid oxidation in isolated rat hepatocytes. Endocrinology 2001;142:2702-6.
[51] FitzPatrick DR, Germain-Lee E, Valle D. Isolation and characterization of rat andhuman cDNAs encoding a novel putative peroxisomal enoyl-CoA hydratase.Genomics 1995;27:457-66.
[52] Wang P, Heitman J. The cyclophilins. Genome Biol 2005;6:226.[53] Wall R, Ross RP, Fitzgerald GF, Stanton C. Fatty acids from fish: the anti-
inflammatory potential of long-chain omega-3 fatty acids. Nutr Rev 2010;68:280–9.
7A. Camargo et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2012) xxx–xxx
Antioxidant system response is modified by dietary fat in adipose tissue of metabolicsyndrome patients,,
Patricia Peña-Orihuelaa,b,1, Antonio Camargoa,b,1, Oriol Alberto Rangel-Zuñigaa,b, Pablo Perez-Martineza,b,Cristina Cruz-Tenoa,b, Javier Delgado-Listaa,b, Elena M. Yubero-Serranoa,b,
Juan A. Paniaguaa,b, Francisco J. Tinahonesc, Maria M. Malagond, Helen M. Rochee,Francisco Perez-Jimeneza,b, Jose Lopez-Mirandaa,b,⁎
aLipids and Atherosclerosis Research Unit, IMIBIC/Reina Sofia University Hospital/University of Cordoba. Cordoba 14004, SpainbCIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutricion (CIBERobn), Instituto de Salud Carlos III, Spain
cHospital Virgen de la Victoria. Malaga 29010, Spain, and CIBER Fisiopatologia de la Obesidad y Nutricion, Instituto de Salud Carlos III, SpaindDepartment of Cell Biology, Physiology and Immunology, University of Cordoba, Cordoba 14071, Spain
eNutrigenomics Research Group, UCD School of Public Health and Population Science, UCD Conway Institute, University College Dublin, Ireland
Received 4 November 2012; received in revised form 12 February 2013; accepted 26 February 2013
Abstract
Metabolic syndrome (MetS) is associated with high oxidative stress, which is caused by an increased expression of NADPH-oxidase and a decreased expression ofantioxidant enzymes in the adipose tissue. Our aimwas to evaluatewhether the quality and quantity of dietary fat canmodify that process. A randomized, controlled trialconductedwithin the LIPGENE study assignedMetS patients to one of four diets for 12wk each: (i) high-saturated fatty acid (HSFA), (ii) high-monounsaturated fatty acid(HMUFA), (iii) and (iv) two low-fat, high-complex carbohydrate diet supplementedwith n-3 polyunsaturated fatty acids (LFHCC n3), or placebo (LFHCC). A fat challengereflecting the same fatty acid composition as the original diets was conducted post-intervention. The intake of an HSFA meal induced a higher postprandial increase ingp91phox and p67phox mRNA levels than after the intake of HMUFA, LFHCC and LFHCC n-3 meals (all p-values b 0.05). The postprandial decrease in CAT, GPXs andTXNRD1mRNA levels after theHSFAmeal intakewashigher than after the intake ofHMUFA, LFHCCand LFHCCn-3meals (all p-values b 0.05). The intakeof anHSFAmealinduced a higher postprandial increase in KEAP1 mRNA levels than after the consumption of the HMUFA (P = .007) and LFHCC n-3 (P = .001) meals. Our studydemonstrated that monounsaturated fat consumption reduces oxidative stress as compared to saturated fat by inducing higher postprandial antioxidant response inadiposetissue,andthus, replacingSFAforMUFAmaybeaneffectivedietarystrategytoreducetheoxidativestress inMetSpatientsanditspathophysiological consequences.© 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Metabolic syndrome; Oxidative stress; Antioxidant enzymes; Diet; Adipose tissue; LIPGENE study
1. Introduction
The metabolic syndrome (MetS) is a multi-component disordercharacterized by hypertriglyceridemia, low HDL cholesterol, hyper-glycaemia, abdominal obesity and hypertension, and is closely linkedto cardiovascular disease (CVD) and type 2 diabetes mellitus [1,2].
The etiology of MetS is the result of a complex interaction betweengenetic, metabolic and environmental factors including dietary habitsand, probably, the quality and quantity of dietary fat [3].
Obesity is the central component of the MetS [4–6]. Furthermore,the expansion of adipose tissue and the enlargement of adipocytes inobesity have been shown to be associated with hypoxia, oxidative
Available online at www.sciencedirect.com
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Clinical Trial Registration Number: Study identifier at ClinicalTrials.gov was NCT00429195. Conflict of interests: None of the authors has any conflict of interests that could affect the performance of the work or the interpretation of the data. Sourceof funding: This studywas supportedpartly by researchgrants from the European community (LIPGENEEuropeanproyect-505944), the SpanishMinistry
ofHealth (CB06/03/0047 (CIBER Fisiopatología de laObesidad yNutrición) and the following Spanish entities:Ministerio deCiencia e Innovación (AGL2006-01979/ALI,AGL2009-12270 to JL-M and SAF2007-62005 to FP-J), Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Proyectos de Investigación de Excelencia Junta de Andalucía (AGR05/00922 and CT5015 to FP-J and P06-CTS-01425 to JL-M); Consejería de Salud, Junta de Andalucía (06/128, 07/43, PI 0193/09 to JL-M, 06/129 to FP-J), Centro deExcelencia Investigadora Aceite deOliva y Salud (CEAS), FEDER, Fondo Social Europeo. PP-Ohas a fellowship fromPrograma de Formación de ProfesoradoUniversitario(FPU), Ministerio de Educación. Gobierno de España.
⁎ Corresponding author. Servicio de Medicina Interna, Unidad de Lípidos y Arteriosclerosis, Hospital Universitario Reina Sofía, Avda. Menendez Pidal, s/n,14004, Cordoba, Spain. Tel.: +34 957 012882; fax: +34 957 204763.
E-mail address: [email protected] (J. Lopez-Miranda).1 The first two authors (P.P-O. and A.C.) contributed equally to this study.
0955-2863/$ - see front matter © 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.02.012
stress and even mechanical damage due to hypertrophy of theadipocyte [7]. This adipocyte hypertrophy and the subsequentdysfunctional adipose tissue lead to a pro-oxidative and pro-inflammatory state characteristic of MetS patients [8]. In addition tolow grade inflammation [9], MetS patients have high oxidativedamage, as evidenced by increased oxidative stress plasma bio-markers [10].
Oxidative stress induces damage to DNA, lipids and proteins, andis also involved in the pathogenesis and etiology of several diseases,such as insulin resistance, impaired glucose tolerance, diabetes andCVD [11]. In addition, oxidative stress induces inflammation throughthe generation of inflammatory mediators, such as interleukins andadhesion molecules [12].
Systemic oxidative stress in obesity seems to be caused by animbalance between reactive oxygen species (ROS) production anddetoxification in the adipose tissue but not in other tissues [13].Additionally, it has been proposed that adipose tissue oxidative stressis responsible for the development of MetS through dysregulation ofthe release of adipocytokines and by generating systemic oxidativestress [13]. Diet, and specifically the quality of dietary fat, canmodulate this process. Previous dietary intervention studies havedemonstrated that altering fat composition can significantly reduceoxidative stress in the MetS [14,15]. However, these studies haveassessed oxidative stress in the fasting state, and humans spend mostof the day in a continuous postprandial state. Postprandial oxidativestress is characterized by an imbalance between the production ofROS and their elimination by the antioxidant system [16,17], with anincrease in oxidative stress biomarkers after meals [18–20], which isvery important, as humans spendmost of the time in the postprandialstate [21].
Previous findings from the LIPGENE study have shown that dietmay influence several features of the MetS. In fact, this studydemonstrated that consumption of n-3 decreases the risk of MetS[22]. Moreover, consumption of n-3 and MUFA reduces the post-prandial abnormalities of MetS [23], and the atherogenicity of thecholesterol-LDL particles [24].
In a previous work performed in the Cordoba subcohort of theLIPGENE study, we demonstrated that the HMUFA diet improvesplasma postprandial oxidative stress parameters, and that the LFHCCand LFHCC n-3 diets have an intermediate effect relative to theHMUFA and HSFA diets in MetS patients [25]. On the basis of theseprevious findings, the aim of the current work was to explore themolecular mechanism that may trigger the diet-induced changes inpostprandial oxidative stress by analyzing the gene expression ofNADPH-oxidase (involved in ROS production), the antioxidantenzymes, and the regulatory genes NFE2L2 and KEAP1, in the adiposetissue of the MetS patients.
2. Methods and materials
2.1. Participants and recruitment
The current study was conducted within the framework of the LIPGENE study(“Diet, genomics and the metabolic syndrome: an integrated nutrition, agro-food,social and economic analysis”), a Framework 6 Integrated Project funded by theEuropean Union. This study was carried out at the Lipid and Atherosclerosis Unit at theReina Sofia University Hospital, from February 2005 to April 2006. The 75 patients ofthe Cordoba cohort of the LIPGENE study were accepted to participate in thepostprandial study and successfully concluded the dietary intervention and the post-intervention postprandial lipaemia studies. The Cordoba cohort was divided into twosubgroups, patients in subcohort I (N = 36) followed the dietary intervention in thefirst year (2005), and patients in subcohort II (N = 39) followed the dietaryintervention in the second year (2006). Due to the difficulty of collecting adiposetissue samples, we only collected postprandial adipose tissue samples from subcohortII (N = 39), in the second year of study (8 in HSFA diet group, 9 in HMUFA diet group,12 in LFHCC diet group, and 10 in LFHCC n-3 diet group). All participants gave writteninformed consent and underwent a comprehensive medical history, physicalexamination, and clinical chemistry analysis before enrolment. Clinical Trial Registra-
tion Number: NCT00429195. The experimental protocol was approved by the localethic committee according to the Helsinki Declaration.
2.2. Design
Patients were randomly stratified to 1 of 4 dietary interventions for 12 wk. MetSwas defined by published criteria [26], which conformed to the LIPGENE inclusion andexclusion criteria [27]. A post-intervention high-fat meal was administered providingthe same amount of fat (0.7 g/kg body weight) contained in the intervention period.The intervention study design and intervention protocol, which also providesinformation about pre, mid, and post-intervention food consumption and dietarycompliance have been described in detail by Shaw et al. [27].
2.3. Randomization and intervention
Randomization was completed centrally, according to age, gender and fastingplasma glucose concentration using the Minimisation Program for Allocating patientsto Clinical Trials (Department of Clinical Epidemiology, London Hospital MedicalCollege, UK) randomisation program. Four differed diets in fat quantity and qualitywhile remaining isoenergetic (Supplemental Table 1). Two diets were designed toprovide 38% energy (E) from fat: a high-fat, saturated fatty acid-rich diet (HSFA), whichwas designed to provide 16% E as SFA, and a high monounsaturated fatty acid rich diet(HMUFA) designed to provide 20% E fromMUFA. The other two diets were low fat, highcomplex carbohydrates-rich diet (LFHCC and LFHCC (n-3); 28%E from fat); the LFHCC(n-3) diet included a 1.24-g/d supplement of long chain (n-3) PUFA [ratio of 1.4eicosapentaenoic acid (EPA):1 docosahexaenoic acid (DHA)] and the LFHCC dietincluded a 1.2- g/d supplement of control high-oleic sunflower seed oil capsules(placebo). The test meal, which represents a fat overload providing the same amount offat (65%), allowed us to study the postprandial responses after a fat challenge that maybe influenced by the previous dietary intervention because of adaptive effect after along-term dietary intervention [27]. Patients received a fat meal reflecting the fattyacid composition of the original diet. Patients arrived at the clinical center at 8:00 a.m.following a 12 h. Fast, having refrained from smoking during the fasting period andabstained from alcohol intake during the preceding 7 days. After cannulation, a fastingblood sample was taken before the test meal, which then was ingested within 20 min.under supervision. Then, the blood samples were drawn at 4 h. The test meals wereprepared in the center, reflecting the fatty acid composition of each subject’s chronicdietary intervention (the composition of the meals has been previously described[28]). These test meals provided an equal amount of fat (0.7 g/kg body weight), Econtent (40.2 kJ/kg body weight), cholesterol (5 mg/ kg of body weight), fiber, andvitamin A [62.9 μmol vitamin A (retinol)/m2 body surface area]. The test meal provided65% of E as fat, 10% as protein, and 25% as carbohydrates. During the postprandialassessment, participants rested and did not consume any other food, but were allowedto drink water. The composition of the breakfasts was as follows: HSFA, 38% E from SFA,based on butter, whole milk, white bread and eggs intake; HMUFA, 43% E from MUFA,based on olive oil, skimmed milk, white bread, eggs, yolk eggs and tomatoes intake;LFHCC with placebo capsules, 16% E as PUFA; LFHCC with LC (n-3) PUFA, 16% E as PUFA[1.24 g/d of LC (n-3) PUFA (ratio 1.4 EPA:1 DHA)]. Meals after LFHCC diets were basedon butter, olive oil, skimmed milk, white bread, eggs, yolk eggs and walnuts.
2.4. Subcutaneous adipose tissue samples collection
Subcutaneous adipose tissue samples were obtained from the superficialabdominal subcutaneous adipose tissue lateral to the navel with instrument Bard®Magnum (ref. MG1522), needles Bard® Magnum Core (ref. MN1410). Samples wereobtained at post-intervention in fasting state and 4 hours after the administration ofthe fatty meal. Immediately after extraction, samples were stored in eppendorf tubeswith RNAlater until RNA extraction.
2.5. RNA isolation from adipose tissue
Adipose tissue was homogenized by Ultra-Turrax T25 (IKA Labortechnik). Afterlipids removal from the top of the tube, RNA was isolated with a commercial kitRiboPure kit (Ambion) designed for rapid purification of RNA and high quality. RNA iscollected from the aqueous phase by binding to a glass fiber filter. The quantification ofRNA is made using the spectrophotometer v3.5.2 Nanodrop ND- 1000 spectropho-tometer (Nanodrop Technology ®, Cambridge, UK).
2.6. Gene expression by Real-time PCR
Retrotranscription reaction was performed with 1 μg of total RNA using thecommercial kit iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA,USA) according to the manufacturer’s instructions. Real-time PCR reactions werecarried out using the OpenArray NT Cycler system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA,USA), according to the manufacturer’s instructions. The gene expression analysis wasperformed in duplicated samples from 39 subjects at fasting and postprandial states.Primer pairs were selected from the database TaqMan Gene Expression assays (AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, USA) https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd = catNavigate2&catID = 601267for the following genes: nuclear
2 P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NFE2L2), kelch-like ECH-associated protein 1(KEAP1), superoxide dismutase 1 (SOD1), superoxide dismutase 2 (SOD2), catalase(CAT), glutathione peroxidase 1 (GPX1), glutathione peroxidase 3 (GPX3), glutathioneperoxidase 4 (GPX4), thioredoxine (TXN) and thioredoxin reductase 1 (TXNRD1),NADPH oxidase subunits (gp91phox, p47phox, p67phox and p40phox). The relativeexpression for each gene was calculated using the ribosomal protein, large, P0(RPLP0) as a housekeeping gene. The data set was analyzed by OpenArray Real-TimeqPCR Analysis Software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
2.7. Statistical analysis
SPSS statistical software, version 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) was used forstatistical analysis. The normal distribution of variables to characterize the postprandialresponse was assessed using the Kolmogorov-Smirnov test. The p47phox geneexpression values were log transformed to get a normal distribution. We performedanalysis of variance (ANOVA) for repeated measurements to determine the postpran-dial effect of the fat meal composition, with dietary intervention as the inter-subjectfactor. The global p-values indicate: P1: the effect of the diet (between-subject effect);P2: the time effect (within-subject effect); and P3: the interaction of both factors (dietby time interaction). Post hoc statistical analysis was completed using Bonferroni’smultiple comparisons test. A P value b0.05 was considered significant.
3. Results
3.1. Baseline characteristics
No significant differences were found in the baseline character-istics between the groups of MetS patients assigned to each diet in thedietary intervention study (Table 1).
3.2. Diet effect on NADPH-oxidase gene expression in thepostprandial state
We analyzed the effect of the dietary fat on the gene expression ofNADPH-oxidase subunits (gp91phox, p67phox, p47phox and p40phox) inthe postprandial state. We found a postprandial increase in p40phox,
p47phox, p67phox and gp91phox mRNA levels (P b 0.001, P b 0.001,P b 0.001, and P = 0.007, respectively) (Table 2). However, theintake of HSFA meal induced a higher postprandial increase in thegp91phox and p67phoxmRNA levels than the intake of HMUFA (p =0.003 and p = 0.039), LFHCC (p = 0.007 and p = 0.009) and LFHCCn-3 (p = 0.001 and p = 0.006) meals.
3.3. Effect of diet on antioxidant enzyme gene expression in thepostprandial state
We also studied the effect of the dietary fat on the postprandial geneexpression of the antioxidant enzymes SOD1, SOD2, CAT, GPX1, GPX3,and GPX4. We did not observe any postprandial changes in SOD1mRNAlevels, but the SOD2mRNA levels, the mitochondrial isoform, increasedin the postprandial state irrespective of themeal ingested (all, P b 0.05)(Fig. 1A). Post hoc statistical analysis showed that the postprandialincrease in SOD2 mRNA levels were higher after the HSFA meal thanafter the intake of the other meals (all, P b 0.001) (Fig. 1B).
The postprandial increase in CAT mRNA levels observed after anHMUFA meal intake was statistically significant compared to thepostprandial decrease in CAT mRNA levels observed after an HSFA(P = 0.002) and LFHCC (P = 0.013) meals intake (Fig. 1C). Inaddition, the postprandial decrease after the HSFA meal intake washigher than after the intake of LFHCC (P = 0.037) and LFHCC n-3(P = 0.014) meals. Moreover, the postprandial increase in GPX1mRNA levels observed after an HMUFA meal intake was statisticallysignificant compared to the postprandial decrease in GPX1 mRNAlevels observed after an HSFA (P = 0.004), LFHCC (P = 0.005) andLFHCC n-3 (P = 0.002) meals intake (Fig. 1D).
Additionally, the postprandial decrease in GPX3 mRNA levels afterthe HSFAmeal intake was higher than after the intake of HMUFA (P =0.037), LFHCC (P = 0.001) and LFHCC n-3 (P = 0.003)meals (Fig. 1E).By contrast, the postprandial increase in GPX4 mRNA levels after theHSFA meal intake was higher than after the intake of HMUFA (P =0.049), LFHCC (P = 0.025) and LFHCC n-3 (P b 0.001) meals (Fig. 1F).
3.4. Effect of diet on gene expression of antioxidant redox-relatedproteins in the postprandial state
We have also studied the gene expression of TXN, a small redoxprotein involved in ROS detoxification and TXNRD1, the enzyme thatreduces thioredoxin from the oxidised form to the reduced, active (interms of ROS detoxification) form. Our study showed that thepostprandial increase in TXN mRNA levels after intake of an HSFAmeal was higher than after HMUFA (P = 0.001) and LFHCC n-3(P = 0.001) meals. Moreover, the postprandial decrease in TXNRD1mRNA levels after the intake of an HSFA meal was greater than afterthe HMUFA (P b 0.001), LFHCC (P b 0.001) and LFHCC n-3(P b 0.001) meals (Fig. 1H).
Table 1Baseline characteristics of subjects with the MetS assigned to each diet
Baselinecharacteristics
HSFA(n = 8)
HMUFA(n = 9)
LFHCC(n = 12)
LFHCC n-3(n = 10)
P-value
Age (years) 57.8 ± 3.1 57.1 ± 2.3 56.5 ± 2.0 54.8 ± 2.1 .839BMI (kg/m2) 36.0 ± 1.2 34.5 ± 1.2 35.7 ± 1.0 35.0 ± 1.2 .817Waist
circumference111.7 ± 3.1 104.0 ± 2.0 109.0 ± 3.1 108.3 ± 3.3 .420
TC (mg/dl) 204.0 ± 19.0 192.2 ± 11.1 206.8 ± 14.9 196.9 ± 10.0 .877TG total (mg/dl) 226.7 ± 65.2 159.1 ± 20.9 161.5 ± 17.5 158.1 ± 20.3 .422c-LDL (mg/dl) 129.7 ± 13 135.9 ± 9.6 148.2 ± 12.1 140.4 ± 8.8 .693c-HDL (mg/dl) 41.0 ± 4.5 44.4 ± 3.3 43.4 ± 3.6 41.4 ± 2.9 .906Glucose (mg/dl) 117.7 ± 6.2 120.3 ± 7.1 106.1 ± 3.2 125.1 ± 13.5 .371Insulin (mU/ml) 15.3 ± 1.3 11.5 ± 1.3 12.6 ± 1.4 13.3 ± 1.7 .400
Values presented are the mean ± S.E.M. of each diet group. Abbreviations: HSFA, SFA-rich diet; HMUFA, MUFA-rich diet; LFHCC, Low-fat, high-complex carbohydrate dietwith placebo; LFHCC n-3, Low fat, high-complex carbohydrate diet with 1.24 g/d LC n-3PUFA diet; BMI, body mass index; TC, total cholesterol; TG, triglycerides; c-HDL, highdensity lipoprotein-cholesterol; c-LDL, low density lipoprotein-cholesterol. P-valuecorresponds to ANOVA statistical analysis.
Table 2Postprandial increment in NADPH oxidase subunits gp91phox, p67phox, p47phox, p40phox mRNA levels in adipose tissue of subjects with MetS after the dietary intervention
Genes DIETS P values
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC-n-3 Diet effect Time effect Diet-by-time effect
gp91phox 0.231 ± 0.044 ⁎ 0.034 ± 0.035 ‡ 0.020 ± 0.062 ‡ 0.013 ± 0.044 ‡ 0.038 0.007 0.021p67phox 0.527 ± 0.153 ⁎ 0.137 ± 0.093 ‡ 0.125 ± 0.052 ‡ 0.022 ± 0.066 ‡ 0.004 b0.001 0.004p47phox 0.558 ± 0.200 ⁎ 0.600 ± 0.104 ⁎ 0.342 ± 0.148 ⁎ 0.250 ± 0.079 0.867 b0.001 0.266p40phox 0.320 ± 0.055 ⁎ 0.218 ± 0.041 ⁎ 0.162 ± 0.063 ⁎ 0.121 ± 0.039 ⁎ 0.071 b0.001 0.090
Postprandial post-intervention differences in the parameter levels between time 0 and time 4 are shown as Δ 4 h. HSFA: SFA-rich diet; HMUFA: MUFA-rich diet; LFHCC: Low-fat, high-complex carbohydrate diet with placebo; LFHCCn-3: Low-fat, high-complex carbohydrate diet with 1.24 g/day long-chain n-3 PUFA diet. Values are represented bymeans ± standarderrors (SE). Data were analyzed using ANOVA for repeated measures (n = 39). P1: diet effect, P2: time effect and P3: diet by time effect.⁎ Means significant time effect (P b 0.05) intra-diet versus fasting state post-intervention.‡ Means P b 0.05 between HSFA diet and the indicated diet, taken together the two post-intervention measurements.
3P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
3.5. Effect of diet in the postprandial state on antioxidant responseregulatory genes
The NFE2L2 transcription factor is sequestered in thecytoplasm by Keap1 and constantly ubiquitinated and degradedby proteasome action; however, under stress conditions, theKeap1-NFE2L2 complex is disrupted and NFE2L2 migrates to thenucleus. We found that NFE2L2 mRNA increased in thepostprandial state after the HSFA, LFHCC and LFHCC n-3 meals(P = 0.028, P b 0.001 and P = 0.008, respectively), and it tendedto increase after the HMUFA meal (Fig. 2A), although it did not
reach statistical significance (P = 0.052), and no statisticallysignificant diet effect was found on NFE2L2 mRNA levels.Moreover, the HSFA meal induced a higher KEAP1 mRNA levelsincrease than the HMUFA (P = 0.007) and LFHCC n-3 (P =0.001) meals (Fig. 2B).
4. Discussion
Oxidative stress breaks the equilibrium, leading to tissue damage[16] and biomolecular alterations such as in lipids, proteins andnucleic acids [29]. Animal studies have shown that systemic oxidative
1.01.52.0 P1=.517
P2=.722P3=.329
81012 †
**
*P1<.001P2<.001P3<.001
-1.5-1.0-0.50.00.5
SO
D1
mR
NA
leve
ls
SO
D2
mR
NA
leve
ls
HSFA HMUFA LFHCC LFHCCLFHCC n-3
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3 HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3
LFHCC n-30246
HSFA HMUFA
LFHCC LFHCC n-3HSFA HMUFA
LFHCC LFHCC n-3HSFA HMUFA
†
† †
*
-10123
††
**
* *
-20-10
01020
†
†**
-5-4-3-2
CAT
mR
NA
leve
ls
P1<.001P2=.010P3<.001
-60-50-40-30
GP
X1
mR
NA
leve
ls
P1=.036P2=.033P3=.001
*
-0.05
0.00
0.05
† †
P1=.001 2468 †
† †
**
P1=.001P2=.117P3<.001
-0.10GP
X3
mR
NA
leve
ls
GP
X4
mR
NA
leve
ls
P2=.183P3=.026
-4-20
**
0.5
1.0
1.5
2.0
TX
N m
RN
A le
vels
†
†
†
P1=.319P2<.001P3=.025
-0.4
-0.2
0.0
0.2†
P1<.001P2=.040P3<.001
0.0 -0.6TX
NR
D1
mR
NA
leve
ls
**
*
**
*
A B
C D
E F
G H
Fig. 1. Antioxidant enzymes postprandial changes in adipose tissue according to the four diets consumed. Mean (±S.E.M.) of postprandial gene expression changes in (A) catalase, (B)superoxide dismutase 1, (C) superoxide dismutase 2, (D) thioredoxin, (E) glutathion peroxidase 1, (F) glutathion peroxidase 2, (G) glutathion peroxidase 3, (H) thioredoxin reductase,after the intake of a meal reflecting the fatty acid composition of the diets consumed during the dietary intervention. HSFA: high-saturated fatty acid; HMUFA: high-monounsaturatedfatty acid; LFHCC n-3: low-fat, high-complex carbohydrate diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids; LFHCC: low-fat, high-complex carbohydrate diet supplementedwith placebo. ANOVA for repeated measured, global p-values: P1: diet effect; P2: time effect; P3: diet by time interaction. Post hoc statistical analysis using Bonferroni’s multiplecomparisons test, *P b 0.05 between diets, †P b 0.05 between time points.
4 P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
stress in obesity is caused by ROS production in the adipose tissue butnot in other tissues, as a consequence of an increase in the expressionof NADPH-oxidase, an enzyme involved in the production of ROS [30],and by a decrease in the expression of antioxidant enzymes [13].
In the present study, we have shown for the first time in humansthat this process can be modulated by dietary fat. We have found thatin the postprandial state, the condition in which humans spend mostof the time, we observed that the expression of NADPH-oxidase isincreased and the ROS detoxification process is reduced by HSFA dietconsumption but not by HMUFA or both LFHCC diets, which thereforeleads to an imbalance between ROS production and inactivation, and,as a consequence, to higher postprandial oxidative stress (Fig. 3).Consistent with this, we demonstrated in a previous study that
HMUFA diet reduces the plasma postprandial oxidative stressparameters in a MetS population as compared to the HSFA diet, andboth LFHCC diets had an intermediate effect between HMUFA andHSFA diets [25].
Due to current dietary habits and the extension of the postprandialstate, which can take up to several hours, people in westernizedcultures nowadays live in a postprandial state most of the day [21],which is an essentially stressful condition, as an increase in oxidativestress takes place after the intake of meals [18–20]. Although ROS aregenerated as by-products of the metabolism, several enzymes,including NADPH-oxidase, are also involved in ROS production [30].Obesity, the central component of the metabolic syndrome [4–6], isassociated with macrophage accumulation in adipose tissue [31,32],
4
AP1=.112 0.30
**
B
1
2
3†
†
†
P2<.001P3=.180
0.00
0.10
0.20†
P1:.012P2:.048P3:.013
0NF
E2L
2 m
RN
A le
vels
HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3 HSFA HMUFA LFHCC LFHCC n-3-0.10
KE
AP
1 m
RN
A le
vels
Fig. 2. Postprandial changes in adipose tissue mRNA levels of NFE2L2 and KEAP1. Mean (±S.E.M.) of postprandial gene expression changes in (A) nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, (B) kelch-like ECH-associated protein 1, after the intake of a meal reflecting the fatty acid composition of the diets consumed during the dietary intervention. HSFA: high-saturated fatty acid; HMUFA: high-monounsaturated fatty acid; LFHCC n-3: low-fat, high-complex carbohydrate diet supplemented with n-3 polyunsaturated fatty acids; LFHCC: low-fat, high-complex carbohydrate diet supplemented with placebo. ANOVA for repeated measured, global p-values: P1: diet effect; P2: time effect; P3: diet by time interaction. Post hocstatistical analysis using Bonferroni’s multiple comparisons test, *P b 0.05 between diets, †P b 0.05 between time points.
Antioxidant enzymes in response to HSFA diet
Cytosol
SOD1 SOD2 CAT GPx TXN TrxR
HSFA DIET
HMUFA DIET
LFHCC DIET
LFHCC-n-3 DIET
Keap1
Keap1 NADP+ NADPH
GPx
2GSH GSSG + 2H 2O
GSR
SOD2 CAT
Antioxidant enzymes in response to HSFA diet
H2O + O2
TXN ox. TXN red.TrxR
ROS
ROS
NFE2L2
Active NADPH oxidase
H2O2
Rac2GTP
p40 p67phox
p47phox
H2O2
p22ph
ox
gp91
NucleusARE
NFE2L2
HSFA diet
phox
phox
Rac 1A
Fig. 3. Postprandial oxidative stress in metabolic syndrome adipose tissue. In the postprandial state, the condition in which humans spend most of the time, the ROS detoxificationprocess is reduced by HSFA diet consumption but not by HMUFA or both LFHCC diets, which therefore leads to an imbalance between ROS production and inactivation, and as aconsequence, higher postprandial oxidative stress after the intake of an HSFA diet.
5P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
which produces ROS by NADPH-oxidase in the respiratory burst[33,34]. However, in addition to the phagocytic cells, NADPH-oxidaseis also expressed in the non-phagocytic cells of the adipose tissue [32].
Our study showed that the postprandial gene expression of NADPH-oxidase subunits increased in the postprandial state with a definedpattern of upregulation after the intake of the HSFAmeal. Therefore, anupregulation of the NADPH-oxidase subunit adipose tissue geneexpression may be a cause of the higher postprandial oxidative stressafter HSFA diet consumption observed in our previous study [25].
Additionally, HSFA diet consumption induced lower postprandialgene expression of the antioxidant defence system. The antioxidantenzymes SOD, GPX, and CAT are regarded as the first line of defenceagainst the ROS generated during oxidative stress [35]. SOD converts•O2
- into H2O2, which is, in turn, is converted into water or molecularoxygen by either CAT or GPX. Additionally, GPX4 isoform is mainlyinvolved in the detoxification of lipid hydroperoxides generated bythe action of •O2
- [36–38]. Our results suggest that the mitochondrialSOD isoform, SOD2, seems to be the main cause of •O2
- detoxificationinto H2O2 at the postprandial state in adipose tissue, rather than thecytoplasmatic isoform SOD1, because SOD2 mRNA levels increased inthe postprandial state, and no postprandial changes were observed inSOD1 gene expression.
Our study showed that the further H2O2 detoxification by GPX1,GPX3 and catalasa is reduced after an HSFA meal as the postprandialexpression of the antioxidant enzymes CAT, GPX1 and GPX3decreased, and H2O2 detoxification is increased after an HMUFAmeal because the postprandial expression of CAT and GPX1 increases.These findings suggest that an HSFA meal reduces the expression ofthe antioxidant enzymes involved in the detoxification step after •O2
-
inactivation, and they are supported by the greater increase inpostprandial H2O2 in plasma found in our previous study after theintake of an HSFA meal as compared to the other meals [25].
In contrast, GPX4 postprandial mRNA levels increased only after anHSFA meal and its postprandial gene expression values were higherthan after the HMUFA, and both LFHCCmeals. This observation can beexplained by the high preference of GPX4 to detoxify lipidhydroperoxides. In a previous study, it has been demonstrated thatan HSFA diet leads to a high oxidative stress condition in thepostprandial state, in which lipid peroxidation increases [39,40] andtherefore, it also increases the gene expression of GPX4, the enzymeresponsible for lipid hydroperoxide detoxification.
Additionally, the intake of an HSFA meal seems to reduce TXN,another antioxidant defence system. TXN is an antioxidant proteininvolved in the reduction of other proteins by cysteine thiol-disulfideexchange [41], and also by acting as an electron donor to peroxidises[42]. Althoughwe did not observe any differences in TXNmRNA levelsbetween meals, the postprandial reduction in TXNRD1 mRNA levels,the only enzymes known to reduce thioredoxin [43], suggest that thecapacity to recycle TXN protein from the oxidized to the reduced andactive form after a HSFA meal is diminished. In contrast, the intake ofHMUFA and LFHCC meals increased the expression of TXNRD1 in thepostprandial state.
Moreover, we also analyzed the expression of the regulatory genesthat control the gene expression of antioxidant enzymes. The balancebetween ROS and antioxidant enzymes is regulated by the NFE2L2transcription factor [44], which migrates to the nucleus as a responseto oxidative stress and promotes the expression of antioxidantenzymes [45,46]. However, under non-stimulating conditions,NFE2L2 interacts with KEAP1 in the cell cytoplasm and is degradedby the proteasome [47]. In line with this, the lower antioxidant geneexpression found after an HSFA meal may be explained by the factthat after that meal intakewe observed a higher postprandial increasein KEAP1mRNA levels than after the othermeals. Presumably, the SFAfatty acids are blocking the antioxidant gene expression and thereforecausing an increase in the oxidative stress by increasing KEAP1 levels.
In conclusion, our study showed that SFA consumption increasesoxidative stress as a consequence of the imbalance between ROSproduction and the detoxification caused by an increased expressionof NADPH-oxidase and decreased expression of antioxidant enzymesin adipose tissue. Additionally, the fact that MUFA consumptioninduces higher postprandial expression of antioxidant enzymes inadipose tissue, and consequently reduces the oxidative stress,suggests that the replacing of SFA for MUFA may be an effectivedietary strategy to reduce the oxidative stress in MetS patients.Moreover, the consumption of a MUFA-rich diet may also prevent thedevelopment of metabolic syndrome by reducing the adipose tissueoxidative stress which has been shown to be one of the main causesresponsible for the development of MetS [3,13]. The current findingsalso agree with other harmful effects noted in previous reports fromthe LIPGENE study regarding HSFA diet consumption as compared tothe other diets in terms of lipid management [24], and abnormalitiesin lipoproteins [23], postprandial TAG levels [48], and insulinsensitivity [49].
Supplementary data to this article can be found online at http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.02.012.
Acknowledgments
The CIBEROBN is an initiative of the Instituto de Salud Carlos III,Madrid, Spain.We thankMª Jose Gomez-Luna for her technical support.
References
[1] Alberti KG, Eckel RH, Grundy SM, et al. Harmonizing the metabolic syndrome: ajoint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force onEpidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute;American Heart Association; World Heart Federation; International Atheroscle-rosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation2009;120:1640–5.
[2] Eckel RH, Alberti KGMM, Grundy SM, Zimmet PZ. The metabolic syndrome. Lancet2010;375:181–3.
[3] Phillips C, Lopez-Miranda J, Perez-Jimenez F, McManus R, Roche HM. Genetic andnutrient determinants of the metabolic syndrome. Curr Opin Cardiol 2006;21:185–93.
[4] Kahn BB, Flier JS. Obesity and insulin resistance. J Clin Invest 2000;106:473–81.[5] Lowell BB, Spiegelman BM. Towards a molecular understanding of adaptive
thermogenesis. Nature 2000;404:652–60.[6] Montague CT, O'Rahilly S. The perils of portliness: causes and consequences of
visceral adiposity. Diabetes 2000;49:883–8.[7] Gregor MF, Hotamisligil GS. Thematic review series: adipocyte biology adipocyte
stress: the endoplasmic reticulum and metabolic disease. J Lipid Res 2007;48:1905–14.
[8] Gustafson B. Adipose tissue, inflammation and atherosclerosis. J AtherosclerThromb 2010;17:332–41.
[9] Subramanian S, Chait A. The effect of dietary cholesterol on macrophageaccumulation in adipose tissue: implications for systemic inflammation andatherosclerosis. Curr Opin Lipidol 2009;20:39–44.
[10] Armutcu F, Ataymen M, Atmaca H, Gurel A. Oxidative stress markers, C-reactiveprotein and heat shock protein 70 levels in subjects with metabolic syndrome.Clin Chem Lab Med 2008;46:785–90.
[11] Ceriello A, Motz E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlyinginsuline resistence, DIabetes, and cardiovascular disease? the common soilhypothesis revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:816–23.
[12] Roebuck KA. Oxidant stress regulation of IL-8 and ICAM-1 gene expression:differential activation and binding of the transcription factors AP-1 and NF-kappaB (Review). Int J Mol Med 1999;4:223–30.
[13] Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, et al. Increased oxidative stress in obesityand its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest 2004;114:1752–61.
[14] Roberts CK, Vaziri ND, Barnard RJ. Effect of diet and exercise intervention on bloodpressure, insulin, oxidative stress, and nitric oxide availability. Circulation2002;106:2530–2.
[15] Roberts CK, Won D, Pruthi S, et al. Effect of a short-term diet and exerciseintervention on oxidative stress, inflammation, MMP-9, and monocyte chemo-tactic activity in men with metabolic syndrome factors. J Appl Physiol 2006;100:1657–65.
[16] Ďuračková Z. Current insights into oxidative stress. Physiol Res 2010;59:459–69.[17] Scandalios JG. Oxidative stress responses—what have genome-scale studies
taught us? Genome Biol 2002;3:1019.1–6.[18] Cardona F, Tunez I, Tasset I, Montilla P, Collantes E, Tinahones FJ. Fat overload
aggravates oxidative stress in patients with the metabolic syndrome. Eur J ClinInvest 2008;38:510–5.
6 P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
[19] Devaraj S, Wang-Polagruto J, Polagruto J, Keen CL, Jialal I. High-fat, energy-dense,fast-food-style breakfast results in an increase in oxidative stress in metabolicsyndrome. Metabolism 2008;57:867–70.
[20] Ursini F, Sevanian A. Postprandial oxidative stress. Biol Chem 2002;383:599–605.[21] de Koning EJ, Rabelink TJ. Endothelial function in the post-prandial state.
Atheroscler Suppl 2002;3:11–6.[22] Paniagua JA, Perez-Martinez P, Gjelstad IM, et al. A low-fat high-carbohydrate diet
supplemented with long-chain n-3 PUFA reduces the risk of the metabolicsyndrome. Atherosclerosis 2011;218:443–50.
[23] Jimenez-Gomez Y, Marin C, Peerez-Martinez P, et al. A low-fat, high-complexcarbohydrate diet supplemented with long-chain (n-3) fatty acids alters thepostprandial lipoprotein profile in patients with metabolic syndrome. J Nutr2010;140:1595–601.
[24] Hartwich J, Malec MM, Partyka L, et al. The effect of the plasma n-3/n-6polyunsaturated fatty acid ratio on the dietary LDL phenotype transformation —
insights from the LIPGENE study. Clin Nutr 2009;28:510–5.[25] Perez-Martinez P, Garcia-Quintana JM, Yubero-Serrano EM, et al. Postprandial
oxidative stress is modified by dietary fat: evidence from a human interventionstudy. Clin Sci 2010:251–61.
[26] Grundy SM, Brewer Jr HB, Cleeman JI, et al. Definition of metabolic syndrome:report of the National Heart, Lung, and Blood Institute/American HeartAssociation conference on scientific issues related to definition. ArteriosclerThromb Vasc Biol 2004;24:e13–8.
[27] Shaw DI, Tierney AC, McCarthy S, et al. LIPGENE food-exchange model foralteration of dietary fat quantity and quality in free-living participants from eightEuropean countries. Br J Nutr 2009;101:750–9.
[28] Camargo A, Rangel-Zuniga OA, Pena-Orihuela P, et al. Postprandial changes in theproteome are modulated by dietary fat in patients with metabolic syndrome.J Nutr Biochem 2012;24:318–24.
[29] Hopps E, Noto D, Caimi G, Averna MR. A novel component of the metabolicsyndrome: the oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2010;20:72–7.
[30] Inoguchi T, Nawata H. NAD(P)H oxidase activation: a potential target mechanismfor diabetic vascular complications, progressive beta-cell dysfunction andmetabolic syndrome. Curr Drug Targets 2005;6:495–501.
[31] Weisberg SP, McCann D, Desai M, Rosenbaum M, Leibel RL, Ferrante Jr AW.Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. J ClinInvest 2003;112:1796–808.
[32] Xu H, Barnes GT, Yang Q, et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role inthe development of obesity-related insulin resistance. J Clin Invest 2003;112:1821–30.
[33] Jones RD, Hancock JT, Morice AH. NADPH oxidase: a universal oxygen sensor? FreeRadic Biol Med 2000;29:416–24.
[34] Wientjes FB, Segal AW. NADPH oxidase and the respiratory burst. Semin Cell Biol1995;6:357–65.
[35] Ray G, Husain SA. Oxidants, antioxidants and carcinogenesis. Indian J Exp Biol2002;40:1213–32.
[36] Faraci FM, Didion SP. Vascular protection: superoxide dismutase isoforms in thevessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:1367–73.
[37] Mates JM, Perez-Gomez C, Nunez de Castro I. Antioxidant enzymes and humandiseases. Clin Biochem 1999;32:595–603.
[38] Rahman I, Biswas SK, Jimenez LA, Torres M, Forman HJ. Glutathione, stressresponses, and redox signaling in lung inflammation. Antioxid Redox Signal2005;7:42–59.
[39] Blokhina O, Fagerstedt KV. Oxidative metabolism, ROS and NO under oxygendeprivation. Plant Physiol Biochem 2010;48:359–73.
[40] Gago-Dominguez M, Jiang X, Castelao JE. Lipid peroxidation, oxidative stressgenes and dietary factors in breast cancer protection: a hypothesis. Breast CancerRes 2007;9:201.
[41] Yoshida T, Nakamura H, Masutani H, Yodoi J. The involvement of thioredoxin andthioredoxin binding protein-2 on cellular proliferation and aging process. Ann N YAcad Sci 2005;1055:1–12.
[42] Arner ES, Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxinreductase. Eur J Biochem 2000;267:6102–9.
[43] Mustacich D, Powis G. Thioredoxin reductase. Biochem J 2000;346:1–8.[44] Jaiswal AK. Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant gene
expression. Free Radic Biol Med 2004;36:1199–207.[45] Kobayashi M, Yamamoto M. Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1
pathway of antioxidant gene regulation. Antioxid Redox Signal 2005;7:385–94.[46] Xu W, Hellerbrand C, Kohler UA, et al. The Nrf2 transcription factor protects from
toxin-induced liver injury and fibrosis. Lab Invest 2008;88:1068–78.[47] Zhang DD. Mechanistic studies of the Nrf2-Keap1 signaling pathway. Drug Metab
Rev 2006;38:769–89.[48] van Hees AMSW, Hul GB, Schaper NC, Timmerman BE, Lovegrove JA, Roche HM,
Blaak EE. Effects of dietary fat modification on skeletal muscle fatty acid handlingin the metabolic syndrome. Int J Obes (Lond) 2010;34:859–70.
[49] Anneke MJ, van Hees JWEJ, Essers Y, Roche HM, Wim HM, Saris EEB. Adiposetriglyceride lipase and hormone-sensitive lipase protein expression in subcu-taneous adipose tissue is decreased after an isoenergetic low-fat high-complexcarbohydrate diet in the metabolic syndrome. Metab Clin Exp 2012;61:1404–12.
7P. Peña-Orihuela et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
