INTRODUCCION

La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.

a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.

b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

Tipos de cromatografía

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía:

a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre.

a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.

c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase móvil.

Cromatografía en capa fina.

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.

La mezcla a analizar se deposita a una pequeña distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase móvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separación. Cuando el frente del disolvente se encuentra próximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza.

La relación entre la distancia recorrida por un compuesto y por el disolvente desde el origen se conoce como Rf (rate factor).

Rf= Distancia recorrida por el compuesto/ Distancia recorrida por el disolvente

La búsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo.

La mayoría de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualización requiere utilizar un agente revelador. El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografía en columna.

Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico a escala preparativa. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de

vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase móvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los más polares quedan más retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retención.

El adsorbente más utilizado para cromatografía de columna es gel de sílice, aunque también se puede emplear alúmina y florisil. La elución de la cromatografía puede realizarse por gravedad o mediante presión (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos está en el tamaño de las partículas de gel de sílice (0,063-0,200 nm, sílice de columna, 0,040-0,063 nm, sílice flash). Debido a que la disminución del tamaño de las partículas de adsorbente conduce a una separación más eficaz, la cromatografía a media presión (flash) proporciona mejores resultados, además de ser más rápida.

Las variables que más influyen en la eficacia de la separación en cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente son las siguientes:

a) Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura del adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a separar.

b) Elección del disolvente. El disolvente tiene que conducir a una buena separación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en gradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo.

OBJETIVOS

Extraer los pigmentos de un producto natural asignado por el profesor haciendo uso de la técnica más adecuada

Elegir mediante cromatografía en capa delgada el eluyente o mezcla de eluyente para separar los diferentes pigmentos de un producto natural por cromatografía en columna

Verificar en cromatografía en capa delgada que se logró la separación de los pigmentos en cromatografía en columna

HIPÓTESIS

Si se selecciona un buen sistema de elución a partir de la cromatografía en capa fina, por lo tanto se obtendrán los componentes vegetales (clorofila a y clorofila b) del pasto por medio de la cromatografía en columna.

VARIABLES

Dependientes IndependientesAdsorbente (selección del mejor adsorbente para el pasto)

Disolvente (sistema de elución para el pasto)

Sustancia a cromatografíar

MATERIAL

Anillo metálico Mortero con pistilo Pipeta graduada 1/100 Gradilla Tubos de ensayo Embudo de separación Probeta Soporte universal Pinzas de tres dedos

Reactivos

ArenaGel de sílice HexanoBencenoMetanolCloroformoAcetonaEtanolÉter etílicoÉter de petróleoDiclorometano

TÉCNICA

Primeramente se determinó el disolvente para el pasto, esto se realizó sometiendo pequeñas cantidades de la muestra en los diferentes disolventes empleados, al obtener resultados conforme a lo anterior se pudo obtener el pigmento del pasto para que este fuera utilizado en cada placa de gelice.

Se realizaron las cámaras con los diferentes aluyentes que se manejaron y así se sometió placa por cámara, donde finalmente se observó la polaridad de cada eluyente , con base a esto se pudo realizar los posibles sistemas de elución que se emplearía en la cromatografía de columna.

Obtenido el sistema de elución adecuado se montó el sistema de cromatografía en columna donde obtuvo los compuestos vegetales del pasto.

Diagrama del procedimiento

Macerado recoleccion de la muestra (pasto)

Evaluacion de los diferentes disolventes

cromatografia en capa fina

Preparacion de la camara de elucion

preparacion de las placas

obtencion del siistema de elucion

cromatografia en columna

montar el sistema de la C.C

Obtencion de los diferentes

productos del pasto

ESQUEMAS DE LOS APARATOS UTILIZADOS EN LA CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

En el cuadro de arriba se observa cómo se llevó acabo la cromatografía en capa fina, como primera parte de la práctica.

La imagen muestra el procedimiento y montado del sistema de una cromatografía en columna

RESULTADOS

DISOLVENTESHEXANO SIBENCENO LEVEMENTEMETANOL SI MAYORMENTECLOROFORMO NO EXTRAJOACETONA SI EXTRAJOETANOL SI EXTRAJOETER ETILICO LEVEMENTEETER DE PETROLEO NO EXTRAJODICLOROMETANO NO EXTRAJO

RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Elección de los disolventesMaceración del pasto

SISTEMAS DE ELUCION OBTENIDOS

ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS

En la tabla de los disolventes podemos darnos cuenta que muy pocos extrajeron el pigmento, donde se utilizó una proporción de tres diferentes disolventes, para extraer el producto vegetal, donde posteriormente se sometió a un lavado que posiblemente pudo haber alterado la polaridad, ya que fue en el único momento en que se tuvo contacto con otras sustancias externas a las utilizadas para la elucion, pero más adelante se explicara detalladamente.

En la cromatografía de capa fina se determinó el sistema de eluyentes en base a la polaridad del arrastre que tiene con el pigmento del pasto.

Se utilizó como se muestra en las placascromatograficas el éter de petróleo siendo el menos polar, el éter etílico que podemos definirlo con un término medio de polaridad y finalmente el de mayor polaridad que fue cloroformo o acetato de etilo, donde claramente se observa que al cambiar este último eluyente modifica gran parte del arrastre del compuesto vegetal, por lo tanto podemos decir que nuestro compuesto vegetal era muy polar.

CONCLUSIONES

Se puede concluir que se llevó a cabo parte de los objetivos ya que al observar lo sistemas de elución obtenidos en la cromatografía de capa fina, nos podemos dar cuenta de que el sistema de elución empleado es apolar, esto se debe a que los componentes de los pigmentos son polares

Como se puede ver en los resultados de cromatografía en capa fina se puede aprecia el hecho de que los pigmentos se separan casi adecuadamente sin embargo no lo suficiente para que este sistema sea empleado en una cromatografía en columna, por ello al emplear los sistemas de elución en la cromatografía en columna ningún pigmento se separa óptimamente.

BIBLIOGRFIA

Abb David INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFIA, España, Ahambra 1937

Hernandez V. INTRODUCCION A LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS, Mexico, UNAM

Bequer F. CROMATOGRAFIA, princeles y técnicas Mexico bb1975

CUESTIONARIO

1-¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

Carotenoides, Xantofilas, Clorofila a y b

2-¿A qué se deben que estos compuestos sean coloridos?-Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en los alimentos vegetalesEntre mayor sea la intensidad del color mayor será el contenido de carotenoides-Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz.-En los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y  amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenides.

3--Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.Cromatografía de particiónLa mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en diferentes solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se mezclan entre sí, se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad en cada uno. Se llama efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o más solventes que no se mezclan. El solvente o el líquido que es atrapado por el medio del sostén sea este papel, gel, sílice o alúmina, se llama fase estacionaria. Al solvente revelador se le llama fase móvil. Se puede obtener una fragmentación completa si se permite al soluto entre las fases estacionaria y móvil.

AdsorciónLa cromatografía de adsorción o liquido-sólido, es la forma clásica de cromatografía de líquidos. La adsorción se lleva a cabo cuando hay una concentración más alta en la superficie de un sólido que en la solución circundante. La adsorción se refiere al enlace de una sustancia a la superficie de otra. Generalmente los adsorbentes usados en cromatografía son el carbón mineral, el gel de sílice, y la alúmina

4--¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en comparación con la cromatografía en columna?

Cromatografía en columna:Las separaciones en la cromatografía en columna pueden realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. El estado físico del adsorbente ha de ser de tal manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de disolvente a través de ella.

Cromatografía en capa finaCromatografía en papel y electro cromatografía. En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el soporte o bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad la cromatografía en plano se centra en la técnica de la capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución y es más sensible que su alternativa en papel.

5-Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad

Columna:Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la celulosa, gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para separaciones por adsorción y de intercambio iónico). Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente

Capa delgada:Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)Celulosa (Nativa o micro-cristalina)PoliamidasEstos adsorbentes deber tener las siguientes características:• Tamaño de Partículao Volumen de Poroo Diámetro de Poroo Área Superficial• Homogeneidad• Pureza

6-Hacer una lista de los eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna y capa delgada en orden creciente de polaridad.En capa fina:Éter de petróleoToluenoDietil-éter, t-butil-éterDiclorometanoAcetato de etilon-pentano, n-hexanoCiclohexano

Tetracloruro de carbonoÉter dietílicoCloroformoAcetonaIso-propanolEtanolMetanolÁcido acético

8-¿Como se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca?

Se le aplica calor para así poder romperlo pero esto hace que n nos quede un orificio muy grande

9-¿Por que es necesario que la cámara de elusión este saturada con los vapores del eluyente?

Porque así será más fácil el arrastre de los pigmentos

10-Explique cada uno de los siguientes términos:

Eluyente: Un eluyente es un solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un compuesto que se quiere separar de otra fase.Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna después de cada extracción.Eluccion fraccionada: Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una columna con una rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución búfer es dirigido a través de la luz de la columna electroforética en una dirección perpendicular a la de migración electroforética. El contenido de la columna se gira en relación con el jet estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solución libre o en columnas empaquetadas.Adsorcion: La adsorción es un proceso donde un sólido se utiliza para eliminar una sustancia soluble del agua. Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidosPartición:Elusión: se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerteAdsorbente: es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Se caracterizan por una alta superficie específica y por su inercia química frente al medio en el que se van a utilizar.Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la concentración de la sustancia en el agua, la temperatura y la polaridad de la sustancia.

14-¿Cuándo es conveniente activar una placa y como se activa?

Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor depende del tipo de separación que se requiere para compuestos hidrofilicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados, para los compuestos hidrofobicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso.

15-¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.?No tiene que ser espeso y No debe ser muy aguado, debe deslizarse solo por la placa.

18-¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna?La polaridad del eluyente debe ser mayor

19-¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografía en columna?En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A.Éter de petróleo.Éter dietílico.Ciclohexano.Acetato de etilo.Tetracloruro de carbono.*Piridina.Benceno.*Etanol.Cloroformo.*Metanol.Diclorometano.Agua.Ácido acético.

20-¿A qué se le llama frente del eluyente en cromatografía en capa delgada?

(a) = Distancia del punto de aplicación a la mancha.(b) = Distancia del punto de aplicación al frente del eluyente

21-¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en columna?Se controla con la llave de la bureta se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensaye.