Evaluaci6n de procedimientos de lab oratorio y muestreo para estndios de persistencia de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin en

frutos de cafe

Carlos Enrique Carpio Ochoa

ZAMORANO Depanamemo de Prore;:ci6n Vegeu;J

Abril, 1999

Evaluacion de procedimientos de Iaboratorio y muestreo para estudios de persistencia de Beauveria hassiana (Balsamo) Vuillemin en

. _, __

frutos de cafe

Proyecto especial prescntado como requisito parcial para optar a] tfrulo de lngeniero Agr6nomo en cl Grado

Acad~mico de Licenciatura.

('N·.~l t ..

presentado por

-··.-....... ~a·rlos EnriQue Carpio Ochoa

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M:•:R0!::01S:_ -rECHA: ·-l

Zamorano-Honduras Abril, 1999

ADios

Ami familia

AJoysee

Ami tierra Luja

'"

DEDICATORlA

AGRADECli\IIEi\'TOS

A mis ascsores Dr. Allan Hruska y Dra. Sally Gladstone.

AI Profesor lvfigucl Avedillo por el tiempo invcrtido y pnr sus conscjos.

Ami familia en Homlur.iS: Giuseppe, Diia.l\ lartha, Rubeny Olenku.

1\ todo el personal del Departamento de Prot~cci6n Vegetal.

A Lourdes, D1la. Nolvia, Elsa Carolina, Di!u. Maria y Geovani.

A Oscar Garcia por toda Ia colaborru:i6n prestado..

A mis amigos de Ia AGP: Marco, Be!y, Frances, Joq~e, Joffre y Emilio.

A Jorge por las mil horns de machete, pl:itica y mala~ noches compartidas.

A mis colcgas-amigos de Ia c!ase PIA: Juan Pablo, Dante, Paola, Claudia, Angel, Ingrid, Gisela, Fabiola, Stefan, lrunir, Rodrigo, Mildrdcna, Erika, Cris!hian y Fredy.

\'i

AGRADECii\UENTO A PATROCINADORES

A Ia Deutsche Stillull!; rur intemm:ionale Entwicklung (D.S.E.) por financia:r mis estudios end Program ad~ Agr6nomo.

AI D~panamemo de Prol~cci6n Vegcta.l por nyudllrme fuw.nciar mis csmdios de curuto aiio.

t\ Ia empresa Mycmcch por cl finauciarnienlo de la tesis.

vii

RESUi\JE,'>:

Carpio, Carlos. 1999. Ewluaciiin de procedimicntos de laboratorio y muestreo par-.1 c~tudios de pel'Sistencia de Beaweria bu~~'ianu (Balsamo) Vuillcmin "n frotos de c:.1.1"C. Proyecto especial del Programa de Ingeniero Agroniimo, Zamorano, Honduras. 60 p.

Unn alrernariva aJ control quimiCQ de Ia broca dd cafC (Hypollumemus hampel) es d hongo ~ntomopatOgcno Reauveria bassirma. La persistencia, c~ t!cdr, Ia capaddad que mucstran las conidias para perrnanecer '~abies en e\ campo, es un factor que afecta Ja cfcctividad del hongo, EJ objctivo g~neral de ~ste trabajo fue evclunr los procedimieutos de lahorntorio y mucstreo para el estudio d\.' Ia persistencia del \JOngo en frutos de cafe, u~ando )a metndologfn de rccolecciOn de frutos, lavado e inoculacicin en mcdlo artificial pnra conko de unidadcs fonnadoras de colonias (UFC). En Ia primeru parte del estudio se probaron para d lavado, diluciOn e inoeulad6n dos vo\umenes de agua, ues diluciones y tres canUdades de in6culo. Se derenninO que para fruros rccogidos inmediatamentc dcspues de Ia aplicaci6n del hon&o deben usarse 2.5 ml de agua!fTuto para cllavado, una diluci<'m 1:10 en agua desti!ada esteril del nguu obtenida dellm'ado y 100 pJ de inOeulo por plato petri. !.a segunda parte del trabajo se desan-oi!O <'!l dos fa~es y tuvo como objetivo determinnr un medio selectivo para aislar B. bassiana de [ru!()~ de cafe. Primero, sc probaron 19 recetas y ~e seleccion<i !a reccta qt.Je menos contaminaci6u presentO para trabajar en Ia segunda etapa. Con los Ires antihil'Hicos que coutenia esa receta (clodine, eidohexamida y clornnfenico\) se reaiizO Ull cxperim~ro para pmbar tres dosis de cada uno y sus combinacioncs. Sc usO \Ill arreglo factorial 3' en \Ill Disct)O Completamcme al t\7.ar (DCA). A los 6, 9 y 12 dias se cvaltio UFC, porcentaje del :irea del plam con contaminaci6n bacterial (PCB) y porcenlllje del area del plato con contaminad6n fungosa (PCH). El amllisis de los datos se realiz6 usaudo vmias mctodologias progresivas y complementarins {ANDEVA ,regresiones, correlaciones y optimizaci6n de las respt.le~tm;). SOlo en el 5% de las obser..'lldones se presentarun porcemajes de comaminaciOn mayo res a 10%. Para obtener un mli.>;imo de UFC oe recomiendahaccr Ia~ evuluaciones e1 diu 9 despuc!s de Ia inoculacicin y usar las dosis minimas probadas de los tres ingredlcmcs (dodinc 300 mgfl, cidohcxamit!a 0 mg/1 y clornnfcnicol 300 mg/1). Para dar rccomendaciones sobrc el 1amailo de !a mucstra en ~studios de per.~i.~tencia sc trabaj6 en un eusa\'o de campo. Se us6 un DCA con 4 repeticiones de 3 tratamientos; dosis alta de B. bassi"ana (ixl0 1 espurnslha), dosis hajn (5xl 012 esporns!ha) y un tcstigo sin aplicnr. Jnmcdiatamente despu6s de Ia aplicaci6n, tle cuda pa:rcela de cuatro :lrboles se tomO una mucstra de 40 frutos (1 0 frutos de una ram a sekccionada de cadn Jirbol). De cad a mu<:stra en ellabomtnrio sc inocularon 3 p!atos petri y se e\•alu6 Ia canddad de UFC dcsarrolladas. Se analiz6 !a fluctuaciOn del codicieme de variaci6n al incrementar el ntimcro de muestras y sc calculO e1 tamano 6ptlmo en trcs posibles esccnarios de c,>;igencia de la precisi6n. Poblaciones menorcs del bongo exigen tumm~os de mueslra mayores a un mismo grado de precisiOn cxigido; sin embargo, con un mil.>;imo de ocho muestras obscrvadas nose pueden dar recomendaciones concluyentes sobre e1 tamaiio de mucstra adccuado. Palabras claves: autibi6ticos, bongos entomopatOgenos, medius selectivos, muesrreo estadfstico.

I' ill

NOTA DE PRE..~SA

;.COMO i\IEDlR LASUl'ERVIVF:NCIA DE LOS HOi\'GOS USADOS PARA COJ\TROLAR LA BROCA DEL CAFE?

En Ia btisqueda de ultcrn3livas menos daiiinM a! amblente y a! hombre, en Zamorano, Honduras, se estiln evaluando ulgunos me!mlos de con1rol bio16gico para las plagas. Parae! control de Ia broca se cstln hadendo estudius con un hongo (Bemn·eria hassiarm) que se ha encomrado ntacando en forma natural al insttto.

De estc hongo ya existen en el mcrcado algunos produc!os comcrci~lcs de companfas que lo ban u!slado del campo y Io ban formulado parn venderlo como un insecticida natural. Sin embargo, aunqut: parece scr una alternati1·a muy prometedom sus resultados end campo no siempre son tan bu~nos como se esperaria.

Uno de los problemas que se ha presentado cs que cl hongo, como mdo organismo vivo, cs afecrado par las condiciones del runbi~nte. Por Ia tanto, si no se consigue que es!e hongo Beauvcria put:da supervi\•ir en d campo, no podr.i ejercer un control efectivo sabre lu plaga.

Como In rcspuesta a In pregumu de crninto puede ~upervivir Bcauvcria despu6 de su aplicadOn es de mocha importnneia pam mcjorar su efccti11dad en d control, en Zamorano se desmTollaron una serie de experimentos para establccer los pmcedimicntos de campo)' laboratorio para medir esta supen1veucia.

Para poder haccr estas medicioncs, como las esporas del hongo (sliS scmillas) sou microsc6pieas ~5 nccesario rccoger los fruro~ del campo y llevarlos allaboratorio. En el Jnboratorio se laYan los frutos para remover las esporas y se culiivan en un media especial. Apmximadamente a los 5 dfas cmpieza a verse a simple ,;s!a el desarrollo del hongo en el media.

E1 estudio determin6 los pmceilimientos nece!lario para recoger los frutos del cnmpo y rcalizar el culdvo en el laborn!orio. Para el cultiYo del hongo artificialmentc se de!enninci que unu recc!a eon!t:niendo cereal, agar y los antibi6ticos clornnfenico! y dodine, Jlicilitahn el crceimk-nto del hongo y no perimitla Ia presencin de otros organismos contuminantcs (otros hongos y bacterias).

Con estos resuttndos se espera que en cl futuro otros investigadorcs pu~>dan trabajar par<~ responder n In pregunta de ~eufulto puede supervivir Beauveria <::n el campo?

I. 1.1.

2.

2.1. 2.2. 2.3. 2..-1-. ' ---~-

3. 3.1. 3.2. 3.2.!. J.2.l.l. 3.2.1.2.

3.2.1.3. 3.2.2. 3.2.2.1.

3.2.2.2. 3.2.2.3. 3.2.2.4. 3.2.2.5. 3.2.2.5.1. 3.2.2.5.2. 3.2.2.5.3.

ix

CONTENIDO

Portadilla .•.•.•.••••.•.•.•..•.•........•.•.•..•••.•.••••.•.•......•.•.•..•• Autor!n .•.•.•.•.•.•..•.•. , ...............•.•.•.•....•.•..•.•.•......•.•.••.. Pagilla de firmns ...........................................•.............. Dedi cat uria ......•...•...••...•..•.•.•.•.•.•....•...••...•.. , .•.•.•.•.•.••• A grade cimi en ( os •••.•.•.•.....••.•..... , •.•......•.•.••.•••.••••••••.•••... Agradceimiemu a patmcinadores .........•.......................•..... Resumen ......................................... , . , ...................... . Notn de prensa .•..••.•.•.•..........................•....•.•.•......•.•..•.

Contenido ................................................................ .. lndice de cuadros ........................................................ .. Imlice de anexus ......................................................... .

G\"TRODUCCTON GEi'i"ERAL ..................................... . Alcancc y limitnciones .................................................. .

OETERMINAClON DE LOS PROCEDii\IIENTOS DE LABORATORIO ...................................................... . Il\'1RODUCCTON ..................................................... . JV[A TER!ALES Y :tviETODOS .................................•.•.•. RESULTADOS Y D!SCUSION .................................... .. CONCLUSIONES ...................................................... . RECDll'lRNOACIONES .............................................. ..

ELABORAClON DE UN i\I"GDIO SELECTIVO Il\'TROOUCCION I"! A TER.L-\LES Y lvl.ETODOS ........................................ . Primern etapa ........................................................... .. Elaboraci6n de los medios ............................................. . Procerlimiento t.k colocad6n del mcdio en el plato, inoculacilin de diluciones, incubaci6n y evaluaci6n ............................... . Jdcntifieaci6n y determinaciOn de la fuenre de eomaminad6n ... .. Segundn etapa ....•.•.•........•.•.•.•......•.••...•.•....•.•..•.•.•....•.. Elabur-Jci6n del medio y proced.imiento de inoculaci6n e incubaci6n ................................................................ . Tratamicntos ............................. , ............................... . Oiseiio experimental. .•• , ••. , .............. , .... , ................... , ... . Variables met.!k!as ......• , • , • , ................... , ••.•.•..•.•..• , ....... .. Amilisis de los datos .................................................... .. Amilisis generales y depumci6n de datus ............................ .. Sele<::d6n de mndelos cxplicativos .................................... . Pron6sticos pnra recum.:ndaci6n de medios 6p1imos .............. ..

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viii ix X

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I 4

5 0

6 7 7 8

9 9

10 II 12

14 15 15

15 16 16 16 16 18 18 19

3.2.2.5.3. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.2.1. 3.3.2.2. 3.3.2.3. 3.4. 3 .5.

4.1 4.2. 4.3. 4.4. 4.5.

5.

G.

Pron6stieos para re~omendoei{).n de mcdios 6pthnos .............. .. RESULTADOS Y DISCUSlON ...................................... . Primern etapa ............................................................. . Scgunda etapa ............................................................ . Amili~i~ generales y depumci6n de datos ............................ .. Moddo~ e:-.]Jlicatiyos ................................................... .. Uso de pron6sticos par.tla r.:comcndnci6n de mcdios 6ptimos .. .. CONCLUSIONES ..................................................... .. RECOME1\'DAC !ON"ES .•.•.•.•....•.•.•....•.•....•..•.•...•.•.•......

REC01>1£NDAC[QNES SOBRE MUESTREO EN EL CAJ\11'0 ................................................................. .. lNTRODUCC!ON ..................................................... .. N1ATERIALES Y l\·IETODOS ....................................... .. RESULTADOS Y D!SCUSION ...................................... . CONCLUSION ES ...................................................... .. RECOMEl\'DACIONES ............................................... ..

BIBLJOGRAFTA ...................................................... ..

Ai\'EXOS ................................................................ ..

19 20 10 22 22 23 39 40 42

43 43 44 45 46 47

48

., ,_

xi

1/'.'DICE DE CUADROS Cundm

L Unidadcs funnadoras de colonia.~ (UFC)I plmo petri obtenida$ de Ia inocu!aci6n de agua proveniente del l:wado de 40 frutoo de cafe.................. 7

2. Rccetas bfu;icas y modificadas evuluadas como m~dios seleclivos pam aislamicnw de Beauwria bu.1·siana de frutos de cafe............................... 12

3. IdentifieaciOn de los orgnnismos coo.tarninuntes d~ cinco platos pdri inoculados con Ia Uiluci6n obtenida del lavado de frutos de cafC aspetjados con Beauverio bassiww ... .................................. , . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 21

4. Espectru antimicroblal de Ia ciclohexarnida y el clonmfenicol............ ......... 21

5. Cuantiles pam Ius variabks UFC, PCB y PCH obtenidus de Ia evuluad6n de cloranfcnicol, clodine y cieluhexamido en tres dosis P= Ia elahoraci6n de medias selecrivos para el aislamiento de BeaUl-cria bassi ana..................... 22

6. Ajuste ':/ signilictmcia de trcs modelos estadislicos paro; las variables UFC, PCB y PCH................................ ............................................. 24

7. Valore~ de los cocficientcs signilicativos (P<O.!O) de las variables indcpendiente~ dd modelo polinominl aditivo ajustado a las variables UFC, PCByPCH................................................................................ 25

8. Cocficientes de correlaciUn mUltiple (R"'.VRZJ entre las vwiables UFC, PCB y PCH y 1rcs grupos de variabks......................................................... 36

9. Teudencia cstimada de rru\.xima respncsta para UFC en el dia 6......... ......... 39

10. 'fendencio estimadu de maxima respn~~ta para UFC en el diu 9............. ..... 39

11. Tcndencia es1inmda de maxima respucsta para UFC en ei dia 12... .... ..... ..... 40

12. Dosis de anribi6ticos y \'lllores mi.ximus e5limados de UFC en los d!as 6, 9 y 12........................................................................................... 40

13. Posib!es tamafios 6ptimos de muestra para poblncioncs namrn1es y aspeijadus de Beauveria ba:;siana en trcs posibles csceuatios de exigl'ncia en I~ predsi6n deseada para la cslimaci6n tl<! Ia pobluci6n .................. ,.. ..... ..... ........ .... 46

:m

Ii'IDICE DE FIGURAS

Figura

1. Dingrama de llujlJ de las fuses del estudio pam Ia determinaciOn de un meilio selectiva para d aislamienta d~ Beam:eria has.~iana de frutos de cafe.......... 11

2. Flujagrama decisional sabre cvaluaci6n cstadisrica de mmldos de anlllisis multivariada para pron6sticos ........... ........ ....... .. ....... ......... ....... .... .. 17

3. Cnrrclaciancs simples y pardales (efectos Llin:ctos c indirectos) entre las w.riables respuesta y corrc\nciones parcialcs (efectos directos) entre los ingredieutes y Ius variables re.~puesta........................... .................. ...... \9

4. Efccto de Ia cidohexamida y d dodine sobrc tmidades fnrnmdoras de colonia (UFC)eneldla6............................... ........................................... 26

5. Ef~cto de Ia dclohcxamida J' el clodine sobrc wtidades formadaras de colonia (UFC) en el dia 9 u tres do~ is de cloranfenicnl: a) 300 mgll, b) 400 mg/1, y c) 500 mg/1................................................................................ 27

6. Efccto de! clornnfenica\ y el dodinc sobrc unidade:s formadoras de colonia (UFC) en e! dla 9 n tres dosis de ciclahe:-:nmidn: a) 0 mg/1, b) 125 mg/1, y c) 250 mg!l.................................................................................... 2S

7. Eli:cto de Ia ciclnhexmnida )' cl cloranfcnicol sobre unidado:~ formadoms de colonia (UFC) ~n d dia 9 a tres dosis de do dine: a) 300 mg/1. b) 450 mg/1, y c) 600 mgfl.............................................. ................................. 29

S. Efecto de Ia ciclohexamida y el cloranfenicol sabre unidades formadorns de ClJiunia (UFC) en el dfa l2 a trcs dosis de dodin<:: a) 301J mg/1, b) 450 mg/1, y c) (jiJO mgfl.................. .............. .... .......................................... 30

9, Efecto del cloranfenicol y ci dodine sobr~ unidades formadoras de colonia (UFC) en el d!a 12 a trcs dosis de cidohe;o.:amida: a) 0 rng/1, b) 125 rng/1, y c) 251J mg/1 ........................... , .............................................. ,.... 31

10. Efecto de Ia cic\ohexamida y el dodine ~llbre unidudes fornJadorns de colonia (UFC) en cl dJa 12 a trcs dosis de cloranfenicol: a) 300 mg/1, b) 400 mg/1, y c) 500 mg/1......................... ........... ........... ....... 32

I I. Efecw de Ia cic\nhc.xamida y cl dodine sobre el porcentaje de contaminaci6n por hongas (PCH) a tres dosis de cloranfcnicol: a) 300 mg/1, b) 400 mg/1, y c) 500 mg.................................................................................. 34

xiii

12. Efecto de la ciclohexamida y el dodioe sabre el porcentaje de contamina~iUn por bru:terim; (PCB) a treS dosis de c!onmfenicol: a) 300 mg/1, b) 400 mg!l, y ~500mg...................... 35

13. Correlaciones simples y parciales (efectos directos e indircctos) entre lm; variables rcspucsta y correlacianes pnrciales {efectos directos) entre eada ingrediente y cnda variable respue.sto a nive\es constantcs de los ouus dos ingredientes........................... ..... . . .• . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... .. .. .. .. . . . ..... 3 7

14. Co:rrelaciones simples y parciales (efcctos directos c indirectos) entre las variables respuesta ;• correlaciones pBrcialcs (cfecms directos) entre cada ingn:Uiente y call:t variable respucsta a oiveles constantes de todas las otras variables..................................................................................... 33

15. F\uctuaci6n dd cocfkicmc de variaci6n de acuerdo al nUmero de muestras en poblaeiones naturales y aspeljadas de 8eau1·eria bassiana en eafcudes al sol y a Ia ~ombnt...... .. . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. ... 46

lNDlCE DE ANEXOS

Anc:"O

1 Amilisis de labora!orlo para la ideuti licadUIJ lie organismos conmmirnurtcs 52 de la primcra fu.~e del experimento para Ia elaboraciUn de un mcdio selectivo para el uislarniento de Beauveria bassiana ....•. ...•••.•..•.•.•....•.. ,

2 Datos de Jab<Jnuorlo de Ia segunda lit.-;e del experimentn pam clabomci6n 54 de un nJcdio sekctivo para el aislamieuto de Buam·eria bassiana ...•......••.

l.li\'TRODUCCION

La hroca del cafC, Hypolherwmus !urmpei Fcrr. (Cnleoptera:: Scolytidae), llegO n Honduras en 1977 y a.l igual que en olru~ palses centroamericunos se convirtiO en el principal pmhlemn entomul6gico del cultivo (Quezada y Urbina, 1987). La presencia d~ Ia brol:a ocasiona perclidas econ6micas al disminuir el rendimiento y Ia caUdad del producto y al increm~:nlar los costos por las nul'\'tlS pricticas agricolas que es necesario introducir para cnfrentar ~1 problema.

Para cl combate qu.\mico de H. hampei e) irtsecticida mas uriliza.do ha sido el endomlfiin. Aunquc e\ uso de e:;tc producw representa un cficiente e i!Uilediato control, ocasiona problemas de contarninaci6n ambiental, dail.os n Ia salud de los trabajudores, residuos t6xicos, desbalance ecol6gico e inclusive desde Nueva Caledonia se ha reportado el primer caso de rcsistcnda de broca al insccticida (Brun et ul., 1989). Todo csto ha Ilevado a los inve~tigadores a bU!icar otrns ronnas de contrnl c!icaces y que no ocnsioncn problemas ecoiOgicos y/o econ6micos.

Una altemati,~J. a Ia que ~e hH pu<'5tu mucht> en!hsi~ es el estudio del hongo cntomopat6gcno Beuuveria bassiuna (O~ut~rumycotina: Hyphurnycek~). que ha sido encun\rndo atacando en forma uatural a Ia broca y que ademits ha sido usado desde muchos u11o~ ulr<is en Rusia, China y Brasil para controlar plagas del suelo y fo!lajc en varios cultivos (FerrOn, 1981).

La infeeci6n causada por B. bassiana ocurrc primariamemc a travi!s de Ia cuticula. Las conidias germinan en un ambiente de alta humedad y log tubos genninarivos penetmn Ia cuticula del insecto e invadcn el homocelo. El hospedero muere debido a Ia deleci6n de los nutricmcs del hemolinfa )'fo a Ia toxemia causada por rneta.bolitos t6xicos del bongo. Postcrionncnte, bajo condiciones de alta hmnedad, cl hongo emerge )' csporula en Ia supcrficie del cadaver del insecto. Otros investigodores tambic!n han encontrndo en algunos insccws efectos suhletalcs o secundarins del hongo como reducci6n en su fertilidad y fccundidn.d y dismiouci6n en e1 desarrollo de sus huevos (Faizi, 1978; Zhang &. Huang, 19S8; Ft'rrun ~~a!., 1991; cil.Ul!u~ pur Feng, eta!., I 994)

E."pcrimentos de campo realizados en varios p.nises para evaluar Ia cfcdividad de B. bassimw en cl control de Ia broca del eafC mucstran resultados muy variables. Esto se debe a que Ia acci6n de los entomopat6genos escl condicionada por: 1) actividnd biol6gica de Ia furmulaci6n, 2) persistencia de las conidias end campo, 3) tccnologia de aspersiOn y, 4)la oportunidad de los tratamientos con respecto a! atW.JUe de Ia plaga (Bustillo y Posada, 1996; Lacayo el al,, 199..!).

La persistencia, es decir Ia capaddad qu~ mue.stran Ia~ conidias para pcrmancccr \':iables end campo, ha sido sefiaillda como Ia mas importantc r~stricci6n para el U>IJ .:fectivo del hongo (Daoust J' Pereira, 1986); por lo tanto, su e~tutlitJ e~ una pieza clave pum Ia selecri6n de cepns rnejor adaptadas, tle formulaciones mejoraclas J' de posibles estrategias de aplicaci6n que incrementen Ia superviYcncill del pat6geno.

La estnbilidad del hongo cs afcct.ada porfacton:s abi61icos como Ia temperatura, Ia radiacitin solar, Ia humcdad y las sustnncias quimica.~.

El rango 6ptimo de temperatura para Ia in!"ecd6n, crecimiento y Uesarrollo de Ia mayorfa cl<! entomopat6genos oscila entn:: los 1 D y 30"C. Las tcmperaturas sobre los 35 "C generalmente inhiben d crecimiento y desarrollo de los entomopat6genos y ademlls, Ia ,.Jabilidad de lu actiYidad iosecticida del in6culo decrece marcadamente con tempcraturas sobrc los 50 nc. El declo de Ia temperatura tambien cst:i asociado con el tiempo de exposici6n a ella. La longevidad de las conidias de Beauwria brusiana n diferenteS «:!,<imencs de temperat.um es Ia siguieme:l) 900 dias de longevidad a una tcmperttrura de entre 5 y 10 °C: 2) &5 dias a tempemturas entre 20 y 30 "C; y })mcnos de un dia a temperahlf!IS de entre 45 y 50 °C (lgnoffo, 1992).

!..a luz naturul (entre 290 y 400 nm.) es ei factor ;unbiental que mas afectn Ia persistencia de los cntomopatOgenos. La vida media de los dill:r~nte~ tipos de in<lculo (conidia:;, e~por .. ~, virioncs, toxinas) e.'\pllt!lila~ a Ia ltiZ natural sc cstima de una hom en las 1mls sensibles a 96 hor .. s en Ius mas resistcmcs. La forma en que Ia Iuz solar inactiva los pm6~enos puede ser d.irecUI o indirecta. El efecto di:recto incluye delec-ione~, uniones crw..adas, ruptura de bandas y formaci On de sitios Ja.bilcs en lu molCcula de ADN. Los cfcctos indirl'Ctos pucden debcrsc a In gcneraci6n de radicales altamente rcacti\"oS que al activarsc destruyen los en!omopat6genos (lgnoffo, 1992).

La vida media de las conidias de Ja mayorfa de hongos entomopat6gcnos expu.estos a luz anificiot csni en un rnngo de entre 1 a .J. horos, micntras que a lm~ natural en las plantas cl rango se amplia en incremcnm de .J. a 200 horn.~. J..n diferencia en vida media se debe a Ia prmccciOn dada porIa plama. Para B. bassiana lu yjda media de las esporas e.xpucstas a luz artificial vade 1.9 a 2 hom~ y a Iuz naiur<~l \'U t.k: 43 a 72 horas en hoju~ de soya (Ignoffo. 1992).

Para proteger las esporns del clecto de Ia mdiaci6n solar se han probado con algUn Cxito formulaciones en aceite y protectores solares como Tinopal LPW (Ca!cofluor blanco) y emulsi6nes de arcilla (Inglis, eta/., 1995; Velez & ll•!omoya, 1993).

Con reluci6n al efecto de Ia hwnedad., e.~te es dificil de separnr de ~u comhinuci6n con OtTO~ factures ambientales; sin ~mbargo, puede d~cirs"' que es l!Il requerimkntll primordial paw. lu germinuei6n de las conidias, la esporulaci6n y Ia dispersiOn de las csporas. Para la gcrminaci6n se requk'Tc de una bumedad de alrcdedor del 70% , para Ia esporulaci6n en d cadaver se requieren humedades relativas altas y para Ia diseminaci6n son mas favora.bles las humcdndcs n:lativas bajas (lgnoffo, 1992; Castillo, ct a!., 1995).

l

A nivel de campo todos los factores ante:; mencionados e.w\n actuando en conjunto, sin embargo son pocos los trabnjos que se han hccho para cvaluar Ia pcrsistencia de B. bru:siona. Gardner e/ a!. (1977), cit~dos por Velez y lv!onto)'ll (1998) dmerminnron una perdida del 50% de Ia actividnd del pnt6geno en el follaje de soya entre 5 y 10 tlfa~ despu6s d~ lu nplicnci6n. En otro exp~rimento en l"pOllD bujo invernadero, para control de P/wella xylrwella, Sheil<Jn el a/. [I \I \IS} cncontraron un control mayor a1 50% ml.n 7 dias despues de Ia aplicaci6u y detedaron prcSL"IlCia dd hongo por un tiempo mayor a dos semanas. En cullivos de cafe al sol y a Ia sombra se han encontrado disminucioncs de Ius poblaciones de esporns viables del bongo de entre 37.9% y 95,4% hasta los 28 dins post-aplicaci6n fl/ekz y Montoya, 1998).

Paro )a medici6n de In persistencia del bongo en cl campo se han usa do tres metodologias: 1) en ei cnmpo, exponicndo insccms dentro de mangus entomolOgk:u; a plumas aplicada:;; 2) en e1 laboratorio, e:-;ponieni.lu insel:lus a makrial aplicado y re~'Qgido del carupo; y, 3) en cl laboratorio, realizando com~o de unidades formadotaS de colonias{UfC) del lavado de material reoogido del campo {Sponagcl,l99..f.; Shelton, eta/., 1998; Velez y 1-lontoya, 1998)

En In tCcnica de las mangas cntomol6gicas, inscctos dentro de una manga son cxpuestos en diferentes tiempos poot-aplicaeiOn a material aplicado con el hongo. Aunque estc procedimicnto tiene Iugar directamente en el ca.mpo, al usar )a mangn sc puede crea:r un ambiente artificial que fnvorct:ca )a pcrsistcncia y cfectividad del bongo.

En lnbomrorio, el mo!todo de exposiciOn de insecws a maierial recogidn del campt"! en difercntes tiempns pnst-nplicuci6n, es posiblcrnente el m:is cfcrtivo y preciso de los tres memdns. Desde el morncnto que se recoge el material del campo se evitu que lisle siga siendo ufcctudo por las muy variubl~~ condicione~ ambk:nta\es naturales. Sin embrn-go, se requiere rna.n\ener una. cria del in~ectu ya qo<: en el ~.~p~rimt:nto se necesitan ~i~mpn:: individuo~ de apro.ximadarnente \a mismn cdad.

El merodo del contt"O de las UFC es e1 mis scncillo de los trcs mCtodos. Despues de hnccr npticnciones end campo, se R-coge material vegetal )' se llcva allaboratorio. I!stc material cs lavado y el agua obtenida o una diluci6n de ella es inoeulada en un media selectivo que Unicumente permite el crccin1iento de B. bussiana.

El objctivo de este trabujo fue elaborar un protocolo para un estudio de persistencia de Reauveria ba~siana en el cultivo de cafe ll!illildt"! Ia metodolngla del cnmeo de UFC. El protocolo induye : 1) procedirniemo~ <k laburntorio; 2)composieiOn dd media selectivo 6ptimo dependiendo de las posibles condiciones que se tengan en c! campo; y, 3) rccomL"Ildaciones sabre ei mc!todo de muestrco de frutns.

.,

l.l.ALCANCE Y LE\flTACIOi\"ES DEL ESTUDIO

El estudio realizado s~ vio limitado por los siguicntcs factores:

1. Algunas de las recomendnciones sobre las pmccdinlicntos de lnbnmtnrio ~e limimn a los prim<.-ros muestreos de un. esiUdio de pen;islencin.

2. Fnlla de conocirnientos de microbiologia y !1mnacologia que no permitieron identificar especificameme los cunlamirnmtes presentes ni discutir con mayor amplitud los efectos de los antibiUticos sobre los organismos.

3. El ensayo de optimizaci6n de los medios s61(uncnte se realiz6tma vcz y con mucstras de frutos de cafe tomadas de un sOlo Iugar.

4. Los rangos de do;;is usadas en el experlmenw pnra la deterrninaci6n del media 6ptimo fueron seleecionadas de ohservaciones aisladas de Ia primera fuse del e;;tudio, siendo quo: Ia mctodologia de superficie de respuesta cxigc una serie de eru;a)'U~ ~uc~sil•os para 1:.. se!ccci6n d~ las do,is de ingr~dientes a usur t:n los ensayos.

:J. Lus condusiones sobre muc:s\reo no vicnen de un cnsayo planifkado para tal efecto sino que ~~ sirvi~ron Lie dntos de un ellSayo de ev~luaci6n de Ia pcrsistcncia que no pudo ser cunduido.

2, OETERt\ili'\ACION DE LOS PROCEDh\llENTOS DE LABORATORJO

2.J.INTRODUCCION

El mCtodo de comeo de UFC para la evaluaci6n de !a persistencia tie B. bassiana consta de trcs elapas: I) recolecci6n dd material vegetal; 2) procesamiento del ntal~riul en labor<ilorio: que iocluye su lavado, Ia rcalizaci6n de dilucioncs, colocaci6n del in6culo en los platos CUlt

medio selectivo y Ia incubad6n de los mismos; y, 3)conteo de las UFC.

DespuCs de rccogcr los fnnos del campo, Ia etapa dos deber.i resultar en un plam petri con una comidad de UFC f!\cil de contar (con un cxponente entre 102 o 101 ) >'que permita al mismo tiempo evalunr adecundamente su vnriabilidad .

Para tcncr a! final dicha ctmtidad de UFC por plato petri debenl tcncrsc en !a Ultima tliluci6n una concentraci6n adecuada de esporns. Esra coocentraciOn dependenl. de Ia cantidad de agua usada pam el Javado del material vegetal, del nUmero y valores de las diluciones y de Ia cantidad de in6culo a colocar en cada plaiD,

La dcumninaci6n de !a can!idad de agua para el lavado puede hacerse en base al peso d~l material (relaci6n peso del material en gramos/ volumcn de agua en ml) o en otros casos pucdc usarsc una cantidad consmnte de liquido y Io que se mide es el iirea de !a superfici~ del material vegeml. El nUmcro de dilucioncs a usnr dcpender"- de la conccntraci6n de esporas en el agua de lavado, pcro debeni. balancearse entre hscer por lo mcnos una para disminuir Ia cnrga contaminante, pero no hacer muchas porque enda diluci6n ai'lode error cx:perimcntal. Y !inalm~nt<:, Ia cantidad d~ [n6culo a colocar en cada plato dependen\ tambiCn de Ia conccmraci6n de espoms ~n ht diluciUn final.

Rivera el a/. (1 994) recomicndan usar una proporci6n de l :9 (p~so de Ji"utu~ eng! volumcn de agua en mlJ para hacer el luvado de los frutos de cafe. Tambi6o recomiendan hac~r una diluci6o de I en I 00 }'colo car 0.1 ml de dicha diluci6n en cada plato petri.

De uo trubajo hecho en soyn, Daoust y Pereira (1986) recomiendnn medir Ia superfieic de cada hoja, lavarla en 7 ml de agua desrilada esteril con Tween SO a! 0.5% y lucgo inocular 0.3 ml de e3m dilud6n en cada plato petri. Chase cr a/. (1995) para evolunr lo persistencia de B. bassi ana en hojas de trigo usaron 20 ml de agua destilada esteril con Tween 80 al 0.05 % por cada hoja, lu~go hicierun unn diluciOn de 1 co 10 y colocaron fino.lmente 100 ~tl de diluci6n en cada plato petri.

La dificultad en Ia determin~ci6n exacta de las cantidadcs de agua y diluciones a usar estriba

' en In imposibilidad de hnccr un conteo directo de csporas en el hemacit6me!rtJ con el agua obtenida del luvado. Estn ngua a m:is de Ia.~ esporas del hongo contiene esporas de otros microorganismos y materiales commninnmes que son fllcilmente confundidas con las esporas del hongo. Por eso es nec~sario hacer todo el procesn )' esperar hastn que las UFC aparezcan en cl plato con media selectivo (medio que pemrita s61o e! crecimiento de B. bassimw).

El objctivo de cste e.\:perimcnto :fue dctcrm.inar. 1) In cantidad de agua p<m~ el Invade de los frutos, 2) el mlmero y vnlorcs de Ia.~ diluciones, y 3) Ia cantidad de in6culo u colocar por plato petri, para tener al final en el plato petri una cantidad de UFC con un expon.entc de 102

o 1 o1.

2.2. i\lATERfALES Y l\IJ::TODOS

Los cnsayos fue:ron hechos durante ci mes de junio 1998 en Ia Escucla Agricoln Panamcricana "EJ Zamorano", Honduras. Los trab3jos de labor..~turio se rentizaron en el Cenrro de Tnvcntario Agroceol6gico y Oiagn6stico de! Oepanamenw de Proi~cciUn Vegetal de frutos recogidos de un cnfctal al sol del Departamento de Horticu!tura.

De una plantn de cafe reciCn aspcijada con B. bass/ana {tvfycotrol® ) en una i.lusi~ de 1 X 101) esporas/ha, se recogiernn en bolsas pldsticas dos muestras de -10 frutos. Los frutos fuerun m::ogido~ uno por uno usando pinzns pnra evita:r cl con\aeto de las manos con las esporas. I..as muestras se llel'arun ullaburatorio cl mismo diu pnru su proccsamiento.

En e]Jaboratorio, enla misma bolsa phistica, \llla mucstra se lav6 con 1000 ml y Ia otra con 100 ml de agua desti!nda egteril ~· Tween 20 en una concentraci6n dd 0.1 %. Apro:dmadarnente UilDS 100 ml del agua ob1enida llc! la1'!1do de cada mue.<rtrn sc pasaron a bikers y sc hicieron tres diluciones; l l'll I 0, I en J 00 y 1 en 1 000.

Para Ia determinaci6n de lo eantidad de in6culo a colocar en cada plato se hiw una prucba inocnlando 1 ml, 0.1 ml, 0.001 ml (100 J.!l) del agua pr{)l'enientt: dellavado de fiutos. Se ohserv6 si en d plato habiM acumuladones del in6culo en ciertas Ur= o si t!ste goteaha clUUldo sc ponia ei plato al reves. AI final se detcrminU que 100 f.!] era el volumen mris odecuado.

/llamcnicndo elliquido en constantc ogitsci6n, s-e tomaron 100 pl tanto del agua del Javado como de las trc.~ diludones de las dos mu~stras y en condicione~ a~ct!pticas sc inocularon en un plato petri con medio sclcctivo (20 gil de Gerber baby oatmeal, 20 gil de bactu-agar, 0.6 g/1 de dodint: , l mill de gentomicino ~ Usando un rastrillo, cl in6culo fue distribu.id() unifonnemcnt~ en el plato. De cada concentraciOn sc inoeularon 5 platos petri. Los platos fueron guartlados en Ia cO.mara de inculmci6n [1.7 - 29 °C) y a los 6 dlas se hizo conteo de UFC.

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2.3. RSSlJLTADOS Y DlSCUSlON

En relaci6n a Ia cantidad de inU~ulo a colocar tn cuda plato petri, se dctcmtin6 100 fl] como eJ yolmm:n m<is apropiado. Con esta cantidad de in6culo Ja tensiOn superficial permite at llquido mantenerse en su posiciOn, mient:ras qu~ con los otros volumcncs (0.1 y 1 ml) hay acumulaci6n de in6culo en ciertas areas o caida d-el mismo cuando sc pone ci plato a! revc!s en Ia incubadora.

La camidad de UFC considerada como Ia mili; ai.lccuada P'4r'"-la e1•aluaci6n de Ia persistencia (exponente de 101

) IUe obtenida usando 100 ml de agua destilada )'una diluci6n 1 en 10, o tambic!n con 1000 ml de agua destilada cstCril sin Ia nccesidad de hacer diluci6n (Cuadra 1 ). Sin embargo, p<:~r facilidad de manejo y por Iu alta cantidad de mucstras cou las que sc nccesit.1 trabajar en las evaluaci6nes de persistcncia se recomicnda usar los 100 ml para d lavado y Ia diluci6n I en 10. Gcncralizando In rccomcndaci6n podria sugcrirse \ISilT 2.5 ml de agua dcsrilada esrCril por CDda fruto recogido.

Cundm 1. Unidadcs furmador<~S dt: culuni~ (UFC)Iplato petri obtenidas de Ia inoculacibn de agua provenientc del lavado de 40 frutos de ca£6 (pmmcdio' ± error est:indm).

Cantidl!d de agua para Diluciones dd agua de lavado dt: I Tutus en agua eli:!Vado de frutos ticstilada esttril

ml 1 ; 1 1 : 1 0 I : 1 00 1:1000 100 966.00 + 99.20 95.76± 11.6-l 11.00±3.19 1.50 ±0.64

1000 80.25 + 8.77 7.5±1.19 1.25 ± 0.48 0.50.;. 0.50 , pr<lm<Uin do oiooo phtos p<n!

El;ta rccomendaci6n estii basadl! en el nUrnero de frutos usados, difiriendo del criteria de Rivera el a/, (199~) que basan Ia canridl!d de a!;ua a usar en cllavado en ei peso de los frutos usndos. Adennls. Ia ~omendad6n sc rcstring.e pam los primeros muestrcos post-aplicaci6n de B. bassimw, pucsto que confonne pasan los d!as, se di=inuye Ia cantidud de esporas en los frutos. Para muestr~os posteriores debe ajustarse las dilucioncs pam tmtar de mamcncr una cantidad adccuada de UFC o si no se quicrc hncer fljusles, de.~de el inicio puede trabnjnrsc con una camidad tllll)'Or de UFC (10'1 o I 03) [Velez y lvlontoyu, 1998).

2.~. CONCLUSIOi\'ES

Para frutos rccogidos inmediatarnente desput:s de Ia aplicaci6n de B. hussiana, Ia inoculaci6n de 100 J.ll de una diluci6n 1 l'll 10 obtenida de S\1 lavado con un volumen de 2.5 ml agua dcstiladalfruio, nos pcrmi!c obtener en el pluto petri una cantidad de csporas con un exponcnte !01. Esta cantidl!d resulta f:icil de contar y permitc nl mismo tiempo poder observur difcrcncias entre trntnmiento$.

2.5. RECOMENDACIONES

l. Comparar los resultados obtenidos detenniuando la cantidad de agua para ellavado en ba~e al peso yen base al nUmero de frutos.

2. Haccr un experimento para dcfinir las diluciones en cada fecha de mucstreo del estudio de persistencla.

3. ELABORACTON DE UN i\IEDIO SELECTIVO

3.1.11'\J'RODUCCION

Un mcdio sclectivo es aqud que pennite lm.icamc:ntc d crecimiento de un organismo o tipo de organismos. Estos mcdios pcrsigucn proveer al organismo deseado de las caracteristicas 6ptima~ parn su desarrollo y al mismo liempo prcsentar caracterisdcas advcrsas para el crecimiento de otms tipn~ de organismos. En Fitopatologia, por eJemplo, es muy eomUn el u5o de medios acidificados que permiten el crccim.icnto de bongos e inhiben Ia contaminaci6n por bact~rim;.

Los medios selectivos son usados frecuentcm~nk para el aislamiento de hongos emomopat6gcnos Hyphomeycetes. Estos medios tienen bll5icamente dos tipos de ingredientes: J)los que componen el medio basal, cuya funci6n es prov~er ~osto!n )' nutrientcs a las esporas del bongo; y 2)los agentes anticontaminantes.

Pam aislar el bongo B. bossina segUn Chase, eta:!. (19S6) ei mejor medio basal se componc de 20 gil d~ cereal y 20 g/1 de agar. Rivcrn, eta!. (1994) sugieren en eambio Agar Sabourad D~xtrosa (SDA) como media basal.

En los medics selectivos Ia mayoria de bacterias y Actinomycete.~ son inhibidos por un bajo pH, yen general, el crecimiento fungoso pllede ser f!worecido en medios con un pH menor a :>. Sin embargo, en Ia mayo ria de los casas la inhibiciC.n de las bacterias ha sido mejor usando agentes antibacteriales. Los agentes anlibacu:riales m:is frecuentemente us«<los induyen el clofllllknicol, la genuunieina, Ia tetnlciclina y Ia estreptomicina. Estos agentes pueden ser usados solos o en combinaci6n . El crystal Yiolet.a es comunmente usado como un colorank que provee contraste visuul pam Ia observaci!ln de las colonias, p~"TT tambi€n inhibe el crccirniento de bacteria'> Gram-positivns. Los antibi6tkos deben ser usados con cuidado puesto que pueden inhibir cl crecimiento de algunas ccpas de bongos (Goettel e Inglis, 1997). Rhoera "I a!. (1994) recomiendan usar junto con SDA acidificado cl o:dcloruro de cobre como bactcricida.

La inhibici6n de hongos contaminantes cs mucho mas problemliticu que Ia bact~rial. Hongos de los generos Trichoderma. ,\[ucor y Rhi::opus tiene crecimiento ripido y pueden en el lapso de 2 o 3 dias tapar las colonias de Hyphomycctes, hacienda d aislamiento dificil o imposiblc. Especies d~: los generos Penicill!um "l Aspergillus pueden ser tambien problemiticas ya que son ~sponrlatluras tnuy pmlific~s (Goettel e lngli~, 1997). J3eilharz et ri/. (1982) detenninaron que el fungicida dodine (n-dod~cylguanidina acetate) en un medio basal de cereal y agar (325 a 650 ppm de ing:redieme activo) actUn select.ivamcnte par" B.

-~

bassiana evi.tando Ia prolifcmd6n de otro ripo de hongos. Di.sminuycndo Ia concemraci6n de dutlinc a 0.46 gfl y w1adicmlu 0.38 rngn de bcnumyl, Chase ef af. (19S6) tambi<!n obtuvierun buenos resultados aislundt) B. bassiana. RJyeru u/ a!. (1994) re<.:omkndan c1 uso de Alto® (cyproconazol) y del oxicloruro de cobre como fungicidas.

Las rccomendadones sabre composici6n de medias sdectivos para B. bussiana varian de un autor a otro y ademfts enda uno de est:aS recetas pucde ser variadn dcpcndicndo de las cara.ctcr!sricas del sistema en cl que sc cst6 evaluando Ia persiSleneia del hongo (presencia mayor o menor de bactcrias u hongos).

El objetivo de este trnbajo fue detenninar un media selectivo para aislilr B. bassiann de frutos de cafe y adcrnlis rccomendar posiblcs Ymiaciones en su composici6n para que se ~daptc n otras condiciones de presencia de mayor cantidad y/o diYcrsidad de hongos, hncterias y leYaduras.

3.2. i\tA TERIALES Y i\IETODOS

Los cnsayos fueron h~chos durante el mes de junio !998 en In Escuela Agricola PanamL'rieana "El Zamorano", Honduras. Los trabajos se realizaron en el Centro de lnventario Agroecol6gico ;• Diagn6srico del D~partarnento de Protecci6n Vegetal de fruto~ rceogidos de un cafctal a! sol del Departamento de Horticultum.

El cxperirnen10 se realiz6 en dos emp= En Ia primern, se ]l1"obaron un eonjumo de medias, reeopi!ados de Ia Iiteraturu y par recomcndaci6n de )a empresa ll'l)•coteeh (fahricante de lvl)•cotrol®, producto cnmercial de B. hlLI',\"im1a).Rn la segunda fuse se tmbaj6 con los trcs ing(cdientes del mejar mcdio de )a primera fuse, pam Ia determinaciOn de un media selective 6ptimo para las condiciones presentes (Figura.!).

Figura L

, ____ ,_ ·-----­·--·- I

;

"

Diagrama de l1ujo de las fases del estudio para Ia determinaciOn de un rn~dio selective pnrn el aislamiento de Bcauveria bassiana de frulos de cafe.

3.2.1. Primera etapa

En c~ta etapa, en total siete mcdios bfulicos y 12 vuriantes a los mism0s fueron probBdns (Cuadrol). De cada recetu sc hicieron 10 pintos pdri.

Cuadro 2. Recetas b:isicas y modificadas evaluadas como medios selectivos para cl aislamiento de Beauveria bassiana de frutos de cafe.

32.1.1 Elaboraci6n de los medios

A wntinuaci6n se presenta los ingreclientes y los proceUimientos para Ia elaboraci6n de los medina seleetivos evaluados:

i\IeUio ODA + geutawici:ua

20 g/1 cereal para beb6 20 gil bacto-agar 0.6 gil clodine (Cyprcx 65-\V) 1 rnl!l gcn10ncin (sulfuto de gentamieina 50 mgiml)

Se autoclav6 el cereal con el ~"Ua desti!ada durante 20 minutos a 15 psi. Sc co]6 !a suspensiOn, se afuldiU el bacto agar, el clodine y la gentamidna, y se ajust6 el volumen a 1 litro . La mezcla se autoclav6 nuevamente durante 20 rninutos a 15 psi.

Se probaron tambi6n las siguientes variantes:

a) Aplicaci6n del antibi6tico despu~s del amodavado. b) Incremento de dosis del antihi6tico en 5, 10, 25, 50 y 100%. c) Antibi6tico mas 10 mg/1 de crista] viol eta.

Mcdio ODA + sulfato de estreptoroicina

20 g/[ cereal para belle 20 gil bacto agar 0.6 gil clodine (Cyprex 65-W)

10 mg/1 de sulfato de esl.rt!ptomicina

Se autoclav6 el cereal con el <~gua destilada durante 20 minutos a 15 psi. Se w!U Ia suspensi6:n, se aiiadi6 el bacto agar, el dodine y se ajust6 el volumen a 1 litro . La mezcla se autoclav6 nuevamcntc durante 20 minutos 15 psi. La estreptomicina fue aftadida en condiciones l!SCepticas cuando el medio estatra eofdando entre los 50 y 55 oc.

Se probaron tambien las siguicntes variantes:

aJ Incremento de la dosis de esrreptomicina a 30 mgil b) Adici6n de 10 mgll de crista! viol eta a las dos d.osis •

. Medio ODA + cloranfenicol y cidohe:;~:amida

20 gil cereal para be be 20 gil bacto4gar 0.6 gil dodine (Cyprc.x 65"\\') 500 mg/1 cloranfenicol 250 mg/1 cidohexamida

Se autoclavO el cere-<ll con el agua destilada durante 20 minutos a 15 psi. Se colO !a suspensiOn, se afiadi6 el bacto agm-, el dodine y se ajust6 el volumen a 1 Utro . La mezc!a se autoclav6 nuevarnerrte durante 20 minutos a 15 psi. El doranfenicol y 1a ciclohexamida fueron aiiadidos en condiciones ascipticas cuando ei media esmha enftiando entre los 50 y 55 °C.

1\'ledio ODA + clorunfcnicol, benlate y crista! violcta

20 gfl cereal p<mt beb6 20 gil bacto"agar 0.3 g/1 dodine 0.25 gil cloranfenicol 0.8 mg/1 benlate (benomy\50%) \0 mg/1 crista! vio!eta

Se autOlllavU el germen con el agllll u~stilada durante :w minutos a 15 psi. Se col6 Ia suspcns.i6n, se ai'iadiU e\ l:r"acto agar, el dodine y el benlatc y se ajust6 el vo\umen a 1 lltro. La mezcla se autoclav6 nuevarnentc durante 20 minutos a 15 psi. El cloranfenicol, Ja cidohexamida y el crista! violeta fueron afiadidos en condiciones ascepticas cuando ei medio estaba enfiiando, entre los 50 y 55"C.

SDA + Cobre +Alto® (cyproconazol).

SDA (Sabouraud dextrosa agar) icido hictico 0.37% 0,4 gil oxiclororo de eobrc 27 microlitros/1 Alto 100 SL (cyproconazol)

Los ingredientes en mezcla en un Jitro de agua destilada se autoclav:rron durante 20 minutos a 15 psi.

1\Tedio ODA + penicilina y e.~treptomicina.

35 gil cereal agar 5 gil agar 0.9 gil dodine 5 mgll crista! violeta 0.4 gil pen:icilina 1 gil estrcptomicina

Se autoelavaron en mezcla el cereal agar, el agar y el dodine en un litro de agua, durante 20 minutos a 15 psi. La penicilina, la esptreptomicina y el crista! violeta fueron afiadidos en condiciones asc8pticas cuando el medio esraba enfriando, entre los 50 y 55cc.

Papa de...:trosa agar (PDA) + .:icido t:\ctico al25%.

39 gil PDA 100 gotas/1 >icido 1<\ctieo

Se runoc!avar6 el PDA en un Iitro de agua, durante 20 minutos a 15 psi. El iicido hictico se aiiadi6 en condiciones asc6pticas cl.lalldO e) media estaba enfriando, entre los 50 y 55°C.

3.2.1.2 Proc~>dimienlo de eolocaciiin del medio en el plato, inoculaciiin de diluciones., incubaciiin y eyaJuaci6u.

Bajo la c<imara de flujo laminar yen condiciones ascepticas se coloc6 aproximadamente 15" 20 ml de mcdio en cada plmo petri. Se esper6 que solidificara y"" tap6 el contorno con papel parafina.

Los pJa[OS petri con medio se colu=on 24 horns enla incubadora (27-29 oq para observar una posible contamina<Oi<Jn en el medio .

Dcspues de las 24 hoFa.s, en cada plato se inocularon 100 ).ll de Ia diluei6n 1 en 10 obrenida

dellavado de 40 frutos wn 100 ml de agua destilada esttril y Tween 20 al 0.1%. Los frutos se recogieron de una planta asperjada con MyCQtrol®, en una dosis de lxlOll esporas.tha.

Los plalos petri inoculados se colocaron en Ia incubadora {27-29 oq. La evaluaci6n se hizo a los 4 y 5 dias, obscrvando en el plato Ia presencia de UFC de B. bassiana o de hongos y bacterias contaminantes. Se eliminaron los medias en los que Ia eontaminaci6n era en promcdio mayor al20%.

3.2.1.3. Jdentifieacitin y determinaciOn de }a fnente de C<Jnfaminaci6n.

Para Ia identificaci6n de los contaminantes, de los difcrentcs medias probados, se 10m6 una muestra al azar de cinco platos petri inoculados y contaminados. La identificaci(>n de los contaminantes y el aru\lisis de coloraci6n de Gram fue realizada en ellaboratorio de CESCO (Centro de Estudios )"Control de Contaminantes) de Tegucigalpa (Anexo 1).

Para determinar la fuente de conl.aminacilin, se w4liz6 un ensayo para averiguar si tsta venia del campo en los fruto~. de alguno de los ingredientes, o del ambiente dellaboratorio.

Cada una de las siguientes sustancias fue inoculada sabre cinco platos petri eon medio ODA+ sulfato de estreptomicina y crista! violeta:

• Agua destilada esteril • Agua mas Ja lbrmulaei6n de B. bassi ana Gvlycotrol®) • AguamasTween20alO.l% • Agua de ]a diluci6n obtenida dellaYado de los frutos.

3.2.2. Segunda etapa

En esta fuse se diseii6 un experimento con los ingredientes del media ODA + cloranfenicol y ciclohexamida. Se e.scogi6 este medio porque fue el Unieo que present6 en la priruera etapa contaminaciones de bongos y bacterias menores a! 20% , y sc dccidi6 probar con diferentes niveles de los ingredientes para snpcrar los problemas de bajo crecimiento de UFC que present6 inicialmente.

3.2.2.1. Elabor.<d6n de medio y procedi:miento de inocula ciOn e incubaci6n.

La elaboraci6n del media y el procedimieuto fueron idCnticos a los usados en Ia primera etapa para el media ODA + cloranfenicol y ciclohexamida.

3.2.2.2. Tratamientos

Los 27 tratamientos fueron todas las combinaciones posibles de las tre~ dosis de los ingredien!es dodine, cloranfenicol y ciclohexamida.

Las dosis de dodine usadas fueron: 0.6 gil, 0.45 g/1 y 0.3 g/1. El primer nivel fue !a rnisma concentraci6n recornendada para ei rnedio en ]a ctapa anterior. Los otros dos niveles se escogieron en base a Ia recornendadUn hecha por Chase, eta!. (1986), quienes recomiendan usar siempre niveles de dodine mayores a 0,32 g/1.

Las dosis de cloranfenicol utilizadas fueron: 500 mgll, 400 mg/1 y 300 mg/1. El primer nivcl fue Ia misma concentraciOn usada en este medio en Ia etapa anterior. La menor concentraciOn fue Ia usada en e! medio ODA + cloranfenicol, benlate y eristal viol eta en e1 que se observO cierto grado de control de las bacterias. El nivel de 400 gil es el interrnedio del primer y ler~er nivel.

Las tres dosis de cie!ohexamida empleadas fueron: 250 mg!l, 125 mgll y 0 mg!l. El primer nivel fue Ia misma concentraci6n usada en este medio en Ia etapa anterior. Se probaron tambi61 una concentraciOn de 0 mg/1 pma ver que pasaba en ausencia de cstc ingrediente y una dosis intermcdia.

3.2.2.3. Disefio experimental

Se u.s6 un arreglo factorial de 3:1 en un diseiio ~ompletamentc a! azar con 4 repeticiones. La metodologia empleada en este experimento tarnbiCn se conoce como aju.ste de superficies de respuestas.

3.2.2.4. Variables medidas

A los 6, 9 y 12 dias despu6s de la inoculaci6n de los plato petri se evaluaron Ia.~ siguientes variables:

1. Cantidad de UFC por plato petri. 2. Porcentaje del area del plato petri wntaminadapor bongos (PCH). 3. Porcentaje del area del plato petri contaminada por bocterias (PCB).

3.2.2.5. Anilisb; de los datos.

El anR!isis estadistico fue realizado usando varias metodologfas progresivas y complementarias (Figura l). Para los c:\Jculos se utiliz6 el progmma estadistioo SAS (SAS Institute, 1985).

··-·-·-·· ... ·-·-········· ....................... ··-·--···-·-··--------------i--~~;~,_,--,c.J-;: ..... ~-,., .. ,:~·-;-···'·'···'·'·e--·-·--···----·---·--·--·-·-·-·-·-·

Figura 2.

...... _, ~··"··= ... _ ,....,.. ... ,.._

""""'"' .. "' ""'' ~ ~-"" ........ " ---

~-~~··­AND~ A\

.......... _,~ - ''"""""""""'

""'w'~"""'-" ,.....,...,"""""""

~ .. _ ........ -.. "' O><O<IodM-o;o

"="'"~"'"",_

.,.,., .... ~~ ... -=, .. ,.......,.,.,

00

2. ""'"'"""" 00 modeloo oxp,.c>!lvos

Flujugrama decisional sobre evaluaci6a cstadistica de modelos de aruilisis multivariado para proa6sticos de medius 6ptimos para aislamiento de Beauveria bassiana de frutos de cafe.

3.2.2.5.1. Amilisis generales y dcpumci6n de los datos

Primero se analiz6lanormalidad de los datos y se aplic6 el metoda de Boxy Cox1 para la clcccl6n de Ia mcjortransformaci6n de las variables de respuesta. En las tres variables dependientes: UFC, PCH y PCB se aplic6la siguicme transformaci6n:

f(y}-~ [log(y+l)] [1]

El efecto del tiempo (dfas de muestre<.>) y de los tratamientos fue analizado usando un amilisis de varianza factorial (ANDEVA), con tratamicntos y tiempo como factores fijos.

3.2.2.5.2. Selecci6n de moddos c:<:plicativos

Se determinti un sistema de ecuaciones simultimeas usando funcioncs polin6micas aditivas con los tCnninos lineales, cuadnl.ticos y las interacciones simples de las variables independientes. Las funciones usadas fueron de Ia siguiente fonna:

Endonde:

)= UFC, PCB o PCH x 1 "" cloranfenicol x2 = ciclohexamida x, = dodine.

En blisqueda de un mayor ajuste de las funclones de PCB y PCH, se arnpli6 las variables e: .. :plicativas con las variables respucsta, bajo !a hip6tesis de que E\stas eran interinfluyentes. Es dt"cir, <::n hi Ecuaci6n 2 se induy6, con los tenninos lineales, cuadnl.ticos y Ia~

interacciones simples las variables:

X4=UFC xs =PCB o PCII (dependiendo de cual era en ese momenta Ia variable dependicnte)

Se ajust6 tambiE\n las funciones al modclo multiplicativo de Cobb" Douglas, bajo la hip61esis de una potenciaci6n del efecw de los ingredientes con dosis incrcmcntalcs (Freund y Littell, 1992). El modelo mencionado es el siguiente:

' CANAS, L. !998. Met<Xlo de Box y Cm: pam transformaei6n de variables respuesta. El Zamorano, lion d. Departamento de Proleeci6n Vegetal, Escnela Agricola Panamericana "El Zamorano'' (Comunicaci6n personal).

,. ?o'!los

'""ue;~ '". "; ,...,"-'!/~ ~ '<o'~""'"'

Una vcz ajustadas las funciones se realiz6 una se\ecni6n de los mejores modelos de regresi6n usando el procedimiento "BACKWARD" para eliminar los coeficientes con nna P>O.lO {Frennd y Littell, 1992).

Dados los bajos ajustes obteuidos, para mejorar las inteJpremciones, a] final se realizO nn anilisis de scndcros determinando correlaciones parciales y simples (Avedillo, s.f.). Entre las variables respuesta se d.eterminaron los coeficieutes de conelaci6n simple y parcial para vcr los cfcctos dircctos c indircctos. Entre cada uno de los ingredientes y las variables respuesta sOlo se analiz6 los efectos directos a rraves de las correlaciones parciales (Figura 3).

Figura 3.

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_:·~~"---------?,r'iJFC\ j;,.,b=l ' -~~

--~ ~~~ ... -- "'' ~ ... ---- "" ' '""'

""""""" .. "'"""""'~«="~ ,..,_ ,..,., ..... ,_ ... """"'""""" """'""~-~~--~"'"'""..,~ --~ ---'"'"'"' .... ~ .. '"' . -~ , ~....-. --"'""""""""·"'"'~""=->'",..... '"""'"""_,,_ '"''"'""'"' .... "'"'"""-'""

[dhub:>:<

Correlaci6nes simples y parciales (efectos indirectos y directos) entre las variables respuesta y curreladont'S parciales (efedu~ direclos) entre los ingredientes y las variables respuesta

3.2.2A.3. Pron6sticos pant recomendacion de medios Optimos

Despues de los an<ilisis estad.isticos !lil trabajb en )a optimi:;-..aci6n de las funciones. Primero se us6 las metodologla de optimizaciOn uniobjetivo trabajando independientement" para maximizar UFC o minimizar PCB y PCH. Posteriormente se uso !a metodologla de optimizaci6n multiobjetivo tratando de maximizar UFC mientras se minimi.zaba, aJ mismo tiempo, PCB y PCH. En los dos casos, los an8.lisis fueron hechos con y sin restricciones {definiendo los rangos de dosis usadas o sin definirlas).

La oplimizaci<Jn uniobjetivo ':/ restringida fue realizada en el programa estadfstico SAS con el procedimieuto "PROC RSREG", que calcula la superficie de respuesta. y el comando "RIDGE" que hace cl an:\lisis de ]as tendencias bacia los maximos o mfnimos (Frennd y Littell, 1992). Los dem<ls procedimientos de optimizaci6n se realizaron con el programa maternitico EUREKA, usando las mejorcs regresiones calculadas.

3.2. RESULTADOS Y DJSCUSION

3.3.1. Primera etapa.

Los medios SDA+ cyproconazol y oxiclomoro de cobre y PDA+ &cido liktico resultaron totalmente contaminados tanto por hongos como por bactcrias.

Las recetas conteniendo ODA no presentaron en ninguno de los easos problemas de contaminaci6n con bongos. El fungicida dodine actu6 muy bien inhibiendo su crecimiento en las tres dosis usadas: 0.3, 0.6 y 0.9 g/1. Chase eta!. (1986). obluvieron tambi6n resultados de inhibici6n de hongos contaminames con dosis de dodinc mayorcs a 0.32 g/1 en medios con avena agar.

Con relaci6n a la contaminaci6n por bacterias, s6lo en los dos mcdios conteniendo cloran:fenicol se obtuvo controles aceptables. El medio ODA+ cloranfenicol (500 mg/1) y ciclohexamida present6 porcentajes de contarninaei6n menores a! 5%; mientras que el medio ODA + cloranfenicol (250 mg!l), benlatc y crista! violcta prcscnt6 contaminaciones entre 20 y30%.

Aunque Ia literatura los cita como selectivos, los medios conteniendo otros antibi6ticos (penicilina, estreptomicina y genl.amicina) resullimm cun altus grados de contaminaci6n bacterial. Esto puede deberse a las difereutes condiciones ecol6gicas presentes en cada Jugar­y cultivo y que dan Iugar a Ia presencia de diversos tipos de organismos con variables nive!es de susccptibilidad a los antibi6ticos.

No sc dcscarta tampoco la posibilidad del uso de antibi6ticos en mal estado, aunque tanto para estreptomicina como pru:a gentamicina las dosis incrcmcntalcs fucron hechas usando fraseos diferentes.

Del am\li~is de laburulorio para Ia identificaci6n de los contaminantes hecho por CESCO se determin6 que las contaminarrtes predominantcs eran las bacteria;; gramnegativas y las bacterias grampositivas. En uno de los platos se encontraron tam bien levaduras (Cuadra 3),

Cuadra 3. Identific:Jd6n de los organisn1os comaminames de cinco plaros petri inoculados con Ia diluci6n obtcnid!t de frutos de cafe llSperjados con Beau>'eria baso·iww.

On::mismo contaminantc Bacteria~;

Cocos Gram : Cocos Gram­Cocobacilos Gram­

Lcvaduras;

Nlimcro de colonia~

6

Estos resultados e;<plican Ia inefecliv:idad de Ia cstreplomicina ya que este antibi6tico cs pn\cticamente inactivo frcnlc a cocos gramposilh"tJos y negati,•os (Lab. NORMON, 1990).

Los rangos conocidos de nctividad antimicrobial de Ia ciclohe.xamida y d cloranfcnicol (Cumlro 4), que cubren muy bien a los contaminantes presentes, explica los bu~nos resultados obtcnidus con el mcdio cnnteniendo estos antibi6ticos.

Cuadro 4. Esp~etru antimicrobial de Ia ciclohcxnmida y el doranfenicol.

Or.!anismo Bacteria~;

Gram+ Gram-

Hongo~:

Pat6genos de plantm; Pat6genos de animaleg Sapr6fitos Levaduras -. -­, -~ ... -' ,._,,._...

, -~···"""

CiclGhe:<amida I Cloranfcnicol

0 2 0 l

' 0 I 0 2 0 3 0

Fuente: Goldherg y Luckey (1959), ndaptado por el autor.

De los dos medias conteniendo dor-.mfenicol, ODt\ + cloranfenicol y ciclohcxamida, aunquc presen16 bajos porcentajcs de contaminaci6n, uo pemliti6 un buen crccimicmo de UFC de B. has.<iann; en cambiG, ODA + cloranfenicol, benlate y <-Tistal >~olcta perimiti6 un mcjor d~sWTOllo de UFC, pero n) mismo tiempo nivelcs mayorcs de contamimu:i6n. Las dosis incremcn1.ales de dodinc (dtl 0.3 a 0.6 gil) l' de cloranfcnicol (de 250 n 500 rng/l.) m<is d efccto de Ia ciclohexamidn purcccn actuar inhibicndo Ia contaminad6n, y al mismo tiempo cl crecimiento de UFC de H. fW.\"Iiiana. Esto contradice lo exprcsado por Chase et af.(l9lHi) quicncs concluyeron que dosis de clodine entre 0.32 y 0.62 g/1 no influycn en !a recuperaci6n de R. bassiana; tambio!n son contraries a lo expueslO en Goldberg y Luckey (1959), quicnc.s

clornnfenicol no tiene pr.lcticmneme ninglin cfccto sobrc hongos. De por medio queda Ia posibilidad de alglin tipo de sincrgia entre los ingredientes ode actividnd antibi6tica mds amplia a1 incrementar !uti ~onc~ntrw;iones de los mismos.

Los rcsulmdos antes mcncionudos sin':iemn de bast'! para Ia segumla etap:~ Lid e~mdio. Lo que sc buscaba en esta segunda fuse era un medio que permitiera al mismo tiempo bajos porccnrojcs de contaminaci6n y una alta recuperaci-6n de B. bassiana.

End ensayo para Ia idcntificnci6n de la fuente de contamimntes s6l(liTlcnte los platos petri iuoculados con dilud6n del agua obtcnida del lavadn de los frutos rcsultaron contaminados. Es decir, que Ia fuente d~ conl.uminaci6n bacteriunn venia del campo en los frutos de cafe.

3.3.2. Segunda etap<l.

3.3.2.1. Gene:ralidades

AUJt(.JU~ los valore:; observados de las tres variables estudiadas fluctuaron entre rangos rdativamente amplios, ~n !oLio~ los caws, los datos tendieron a cnncentrnrsc en valores bajos (Cuadro 5).

Cuadro 5. Cuantiles para las variables UFC1, PCB< y PCH3 obt~nidos de Ia evaluaci6n de cloranfenicol, dodin~ y clclohexamida en lrcs dosis para la dabomci6n de medias sel~tivos para cl aislamicnto de Beauwria bassiana

Lo anterior nos l!eva a concluir que en general, en ci experimento, los vnlores de PCB y PCH sc mrunuvieron dentro de los limites aceptables (menos del 10%); sin embargo, Ia mayoria de volorcs UFC no alcanzoron d valor m!nimo aceptable (IOO UFC/plut.o petri). 1\.fM especifie(liTlente., el ron go mli:dmo de contaminaei6n del lll% sOlo fue sup~-rado en e\ 1% de lo~ cru;u~ en PCB y en 3.7% en PCH. Para UFC tinicamcntc c1 27.2% de los valores supcraron las 100 UFC,

Del AND EVA para dererminar e1 efecto dd tk'lllpo (dfas de muestreo) s~ Lldennimi que para las vnriahles PCB y PCH, Ia imcracci6n entre tmtruniento y tiempo era significativa, por lo

,. _,

que los dermis anilisis fueron hechus Wlo pam el dia 9 que es el de mayor corrtaminaci6n; mientras que pm:a Ia variable UfC en Ia que dicha irrteracci6n si result6 signiftcativa, los dem:is ana!isis se hiciewn para cada dfa.

3.3.3.2. Modelos expliCi!tivos de Ia variaci6n de UFC, PCB y PCH.

Para las tres fechas (6, 9 y 12 dias) en que se analiz6, Ia variable UFC present6 un muy buen aju~>te (R2>U.S2) al modelo polinomial aditiw propuesto (Ecuaci6n 2}. Para las variables PCB y PCH el ajuste para el mismo modelo result6 bajo (Cuadro 6).

Al incluir UFC y PCB o PCH como variables ec.:plicativas en Ia Ecuaci6n 2, los :Yustes a los modelos nose incrementaron significativamcntc (Cuadro 6). Aunquc parccc razonab!c pcns.ar que cl crccimiento de un organismo afecta al crecimiento de otro, parece ser que a los illveles b~os de crecimiento observados esto no sucede. teniendo mayor influencia en el desarrollo de B. bassiana Ia composici6n del medio. Si por ejemplo, se tuv:ienm PCB de un 80%, esto ali!<.llaria el desarrollo de los bongos contaminantes y de las colonias de B. bassi ana.

Los ajustes de las variables PCB y PCH al modelo multiplicative de Cobb- Douglas {Ecuaci6n 3) resultaron menores que los ajustes a los modelos aditivos (Cuadro 6). Esta falta de ajuste sugierc que no hay una potenciaci6n simult:inea de los tres ingredientes en el control de los contamirum.tes.

En general, !a falta de ajustc de las funcioncs cstudiadas a las variables PCB y PCH pudo dcbcrsc a que las cspecies de contamirumtes presentes en el eJo.-perimento escapaban e1 espectro de control de los antibi6tico~ empleados. en el rango de dosis usada.~, o tarnhi<ln a una mala identificaci6n de las variables respuesta. Las funciones ajustadas para estas dos variables sOlo expli<'arian Ja variabilidad de los contaminantes sobre los cua.les los antibi6ticos si tienen cfecto.

Cuadro 6. Ajuste y significancia de tres modelos estadisticos para las variables UFC', PCB0y PCH0

•

Efecto de Jos antihi6tieos sobre UFC

La selecci6n de los modelos de regresiOn con las variables cuyo aporte a] poder predictiVD es significative (P<O.l 0), nos perrnite evaluar el efecto de cada uno de los ingredierrtes en las variables respuesta (Cuadro 7) (Figur<tS 1-13).

Cuadro 7.

" . ·'

Valores de los codicieutes signi!icativos (P<O.IO) de las variables indep~nllientcs del modelo polinomial aditivon ajustallu a las variables UFC0, PCB'y PCH~.

Pam In variable UFC el ingn~dieme que tienc mayor cfecto es Ia ciclohcxumida. En los tres tlfas en que se evnlu6 !a funci6n, a dosis increm~nlUk~ de ciclohexamidn hay una =ada disminuci6n de UFC (Figuras 4, 5, 7, S y 9 ). En e! d!a 6, en Ia dosis mds baja de clodine (300 mg/1), con apenas 125 mg/1 de ciclohexamida sc inhibe: por comp!cto cl desarrollo de UFC (Figura 4). Ademil.s, a do.~is incrcmcntales de eielohexamida el efecto de los otros dos ing:rcdientes tien" menor influencia (Figura 6).

Siguicndo en importancia, con re!aci6n al efecto detrimental sabre UFC, tcncmos al clodine . Su cfccto en e1 dla 6 comienza con aproximadamcntc 3.20 mg/1 yen d dfa 9 y 12 <:on 400 mg/1, sin embargo cste efecw di~nrinuy~ conformc se incremcntan las do~is dl' ciclohexnmida {Figuras 4, 5, 6, 9 y \0). El duranli:nicol es el ingrcdicnte que meuos afecta csta variable; en e\ dia 6 no aparece en Ia fund6n '! en los subsiguientcs dim; tienc ap~nas un !eve efecu1 en !a \~Miabilidad de las colonia:; de B. bassi ana (Figuras 4,6,7,S y 9).

Estos Ultimos resultados contnu.li~en nuevamen!c lo cxpresado por Chase et al.{l9S6) quiencs concluyeron que dosis de clodine ~ntre 0.32 y O.li2 g/1 no iniluyen en Ia recuperaci6n u~ B. bass/ana y son contraries t=bi6n a Io c.xpuesto en Goldberg y Luckey {1959),

quienes afrrman que cidohexamida tiene poco efecto sabre hongos pat6genos de animales,

Uot<Moo forrna<lon<> colont"'

')

Figura 4. Efecto de la eielohcxamida )' el do dine sabre unidades formadoras de colonia (UFC) en el dia 6.

-

U"id>.d<s !;mnl.dor"' <I< coloni»

Uoid>.des foanado!lli de

""""'"

Figura 5.

o)

b)

c)

Efecto de )a ciclohexamida y el dodine sabre unidades formadoras de colonia (UFC) en el dia 9 a tres dosis cloranfeoicol: a) 300 mgfl, b) 400 mg/l, y c) 500 mg/1.

Lin idod " fo!Tlll'dom do wlom.,

LIH iJ•d" fomtadO<>> "' col om"'

Ll"l~<> forma<lo= do

ooro"'"'

b)

')

Figura 6. Efecto del clornnfenicol y el dodine sobre unidadcs formadoras de colonia (UFC) en e] dia 9 a tres dosis de ciclohe:-:amida: a) 0 mg/1, b)I25 mgll y c) 250 mg/1.

Und>Oos fom>>dor>; d' colom:~s

Umdad« form>dola< d;, <olonLOS

o)

Figura 7. Efecto de Ia cicluh~xamida y el cloranfenicol sobrc unidades formadoras de colonia (UFC) en el dia 9 a tres dusis de clodine: a) 300 mg/l, b) 450 mg/1, y c) 600 mg/l.

IJnida<l" fomla<for.>, do rolon;.,

IJ 0 «<>.de3 formodor.•do <Oioolas

o)

Figura S. Efecto de Ia ciclohexamida y el c:loranfenicol sobre unidades formadoras de colonia (UFC) en el dfa 12 a tres dosis de dodine: a) 300 mg/l, b) 450 rng/1 yc) 600 mg/1.

1Jni<±i1es fo:rmdoru oolonm

1J n lililde< IO<m>do= ~< eolon""

IJniU.d<:< fcmn>doru Oo oolonbs

e)

I b)

o)

Figura 9. Efccto del cloranfenicol y el dodine sobre unidades formadoras de colonia (UFC) en e] dfa 12 a trcs dosis de ciclohc.'i:amida: a) 0 mg/1, b) 125 mg!l y c) 250 mg/1.

b)

Un>da<l., to.m•O= d< «ll<"li><

Figura 10.

o)

Ete~to t]~ Ia ciclohexamida y cl clodine sabre unidudes formadoras de colonia (UFC) en c! dia 12 a tr~s dosis i.lt~ cloranfenicol: a) 300 rng/1, b) 400 mg/1, y c) 500 mg/1.

Efeeto de los antibi6ticos sobre PCB y PCH

Como mencionamos antes, los ajustes de las funcioncs para las variables PCH y PCB no fueron altos debido prubablemente ala presencia de cnnmmimmtes que salen del espectro de control de estos ingredientes dentro de lo~ nmgos estudiados y/o a una mala idemificaci6n de las variables respuesta.

Dentro de los rnngos de dosis usadas los valores estimados de las variables respuesta "~timadas son negativos (Figura~ 11 y 12). Adcmis, tanto para PCB como para PCH las superficies de respuesta estimadas son pianos casi paralelos a) plano fonnado por los ejes x y y. Es dedr, el efecto de los antibiUticos dentro de los rangos usados fuc minimo. Pnicticamente no existe diferencia entre el uso de una dosis alta o baja de los mismos.

?<>""""!'de con:ami"aci6n ""' hon~o>

fu<Wl"-J" de rootami .. d<)n po< ~on~o>

Figura 11.

o)

b)

c)

El\:c\u d~: Ia ciclohexamida y el dodine sobre el porcentaje de contaminaci6n por hongos (PCH) a tres dosis de cloranfenicol: a) 300 mgll, b) 400 mgil y c) 500 mgll.

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P"' """J< 0 ' cont>m;na<J011 ""' PlO!<ll:~>

1\lroent:oj' "' ooot><ltinociOO • por """';" • •

')

b)

c)

Figum 12. Efccto de la ciclohexamida (:.:) y el dodine (d) sabre el porcentaj~ d~

contarninuci6n por bactcrias (PCB) a tres dosis de cloranfenicol; a) con 300 mg/1, b) con 400 mg/1, y c) con 500 mg/1.

.AmHisis de las correlacione~ simples, parcialcs y mUltiples

Los coeficientes de correlaci6n simple entre las variables fet.Jll.lesta resultaron mayores a los respectivos coeficientes parciales, Jo que da a entender el efecto de otr".<S variables en las rclacioncs. Adcmas, ptlesto que estos coeficientes de correlaci6n parcial resultaron con valores muy bajos, pucdc dccirsc qm: el desauollo de contaminantes no afect6 el crecimierrto de colonias de B. bassianll (Figura 17).

Para relacionar los antibiUtir:os y l<tS variables respuesta se calcularon los coeficicntcs de correlaci6n parcial entre cada variable respllesta )' cada ingrediente manteniendo constarrte: prirnero, los otros dos antibi6ticos usados; y segundo, los otrus dus antibi6ticos y !a.~ otras dos variables respuesta. Los cocficientes de correlaci6n parcial manteniendo constantes s6lo los otros antibi6ticos resultaron mayores a los coeficientes de correlaci6n parcial mamcnicndo constantes todas las otras variables (Figura 17). El diferencial enlre los coeficicntcs antes mencionados e"-Jllica el hecho de que al mantener a un mismo nivel los ingredientes (dentro de los rangos usados), hay un cierto efecto detrimental de las otras dos variables respuesta (Figurru; 17 y 18). Lo ideal scda no tener ninguna interrclaci6n entre las variables.

Los valores de los coeficientes de currelaci6n parcial entre cada variable respuesta y carla antlbiOtico manteniendo constantes todas las otras variables resultaron bajos en mdos los casos, cxccpto para cidohexamida y UFC que pres<::ni.U una relaci6n media (Figura 18). Esm indica que defmitivamente el efecto de los ingredicntes en el control de los contamimmces fue muy baja; sin embargo, ciclohexamida atect6 negativamente el desarrollo de UFC.

Los cocficicntcs de correlaci6n mUltiple entre cada variable respuesta y: 1) todas las otras variables, 2) los amibi6ticos y 3) solamente clodine y ciclohexamida ; al no presentar gnm difercncia confinnan nuevamente el efccto predominante de esos dos ingredientes en Ja variabilidad de los organismos. Asl mismo, tanto en PCB y PCH se observa de nuevo un buen porcenlaje de variabilidad que no explica la relaci6n (Cuadro 8).

Cuadro 8. Coeficientes de eorrelaci6n mUltiple (R=..Jlz")cntre las variables UFC", PCBb y PCH0 y tres grupos de variables

Variable Grupo de variable con que se relaciona respuesta

Todas las otras Antibi6ticos ciclohexamida, Antibi6!icos clodine y >'llriables dodine y cloanfenicol ciclohexamida

UFC 0.56 0.52 0.51 PCB 0.53 0.50 0.43 PCH 0.31 0.80 0.80 a !lni.fudO> fcmmdora• do"""'"'"' t> Potceni>.i< d;, cootami">eh\n b•mrL>l ' Poromtaje de conl><rn-iOo por ~on~w

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3.3.3.3. Uso de pron{i~ticQ~ P'W4 !a recomendaci6n de medios 6ptimos.

La opci6n RIDGE del SAS (Fre\llld y Littell,l992) nos permite analizar Ia tendencia de los valores de las variables independientes hacia los 6ptimos de las variables respuesta, teniendo sicmpre como pilllto de partida del amilisis las dosis medias de los ingredientes.

La maximi=i6n de Ia variable UFC, en los tres dias de estudio, se consigue manteniendo pr:icticamentc constante e! c\oranfenicol, disminuyendo un poco el clodine y disminuyendo significativamente Ia ciclohexamida (Cuadros 9, 10 y II).

Cuadro 9. Tendencia eslimnda de milxima rcspuesta para UFC1 en el dia 6

C~o !0. Tendencia estimada de mfu:ima respuesta para UFC 1 en el dia 9

Cuadro 11. Tendencia estimada de rru\xima respuesta para UFC1 en el ilia 12

AI pasar del dia 6 al9 y dc19 all2, se incrementan las respuestas estimadas iniciales con las dosis medias de los antibi6ticos. Es decir, los antibi6ticos no inhiben totalmente el desarrollo de UFC sino que lo retardan. La obtenci6n de val ores al!os de UFC con dosis mayores de los anlibi6licos puede conseguirse hacienda las evaluaciones mas tarde.

Por otra parte, los valort$ 6ptimos ~alculados mediante el programa matemB.tico EUREKA muestran resultados similares a los vistos an\eriorrnente (Cuadro 12). Los valores m:i.>:imos se consiguen con dosis minimas de ciclohexamida y dosb f:'lltre 300 y 400 mg/1 de doranfenicol y cidohexamida. El valor estimado rru\ximo se consigue eo el dia 9.

Cnadro 12. Dosis de los antibi6ticos cic!ohexamida, cloranfenicol y dodine para los val ores mliximos estimados de UFC1 co los dias 6, 9 y 12.

Dia

3.4. CONCLUSJONES

Prirnera etttpa

mgll Valorcs m:iximos estimados de UFC

1. Antes de que un medio selective sea usado en estudios de persisteocia, debe ser cvaluado para ver si se adapta a las condiciones presentes en el ecosistema en el que se esta trabajando.

2. El dodine usado en dosis entre 0.3 y 0.6 mg/1 nHmtit:ne los niveh:s de conraminaci()n por bongos a nivdes aceptabl<:s.

3. Snlumente el antiohi6tieo cloranfcnicol rcsullil efectivo en el control de bacterias conllllninantes.

4. I!! medio ODA (cent! clodine agarJ mlis cloranli:nicol y ciclohc:mmidu fue e! media que rcsult6 con menores porccntajes de conta.Jninnci6n bacterial; sin embargo, present6 problemas de poco desarrollo de colonias de B. bassiana.

5. En arden de importanciu los organismos contnminantes prcscntes, provenientes de los Ii"utos de cafe fucron bocterias grllm negmivas, bacterias grmn positivns y levaduras.

S~'J!Uild2 ctapa

1. En general, las dosis de nntibi6ticos usadas (d[)(.lin~ 300-600 mgfl, ciclnhexamida 0-250 mg/1 y doranfenicol 300-500 mgfl) mantuvieron los nivdes de contaminad6n por debajo del I 0% que se fij6 como maximo permitido, pcm tambi6n 1011 Ia mayo ria de los casas no pcmtiticron valores altos de UFC.

2. Los \'alores de UFC se incrcmcntaron graduulrneme de un dia de e;'aluaci6u al olm ya que lo~ amibi6ticos retordun el desarrollo de las colonias de B. b11s~·iana.

J. El d!a en c! que se akam·.a e! mlix..imo valor de UFC cs cl dia 9.

4. A los niveles de eontaminacilin presentes, Ia interrelaci6n entre las variables respuesta fuc muy baja UFC, PCB y PCH,

5. Los bajos niveles de eomaminaci6n pre~entes riO fueron controlados en forma efectiva al in creme= las dosis de los runibi6ticos.

6. A lo.s dosis usada.s no sc cncontr6 un efecto de po!endaci6n signi!kativo entre los tres ingredientes.

7. EI ingn::Lliente ciclohexamida es el que nills afccta la formaci6n de UFC.

S. Dodine empieza atcnl'r 10fecto detrimental apro.ximadameme a p:mir de los 450 mgfl.

9. El desarrollo 6p1imo de UFC se puede conseguir usando las m~nores dosis posibles de dc!ohexamida, dosis de dodinc de medins a bajas (300-450 mg/1) y dosis tle dornnl"enicol entre 300 '/ 500 mgn.

3.5. RECQ;.ffi'\'DACIONES

Pdmer.i etapa

1. Cudu media selectivo debe ser evaluado antes de realizar llll tn1bajo de estudio de pcrsistencia.

2. Para Ia evaluaci6n de Ia per~isrencia de las aplicaciones de B. bassfmw eu frutos de cafe eJ mediu mas n:comendudo es llllO conteniendn ODA como media basal y doranfenicol, ciclohexamida y do dine cumo antibiOticos.

Segunda ctapa

I. Pam posLeriores trnbajos de cvaluaci6n de mo;odios seleccivos. las variables PCB y PCH debcrian ser identifiC<ldns con mayor prccisi6n (gl!nero, especic, IL-spucsta a coloraci6n de Grum, etc.) para anali7.llr con mayor rigor cl cfec\0 de cada llllO de los ingredientes sobn: ~~to~ organismos especfticos. Ademlis, se rccomicnda haeer nuevas ensayos inc\uyendo antibi6tkos en cuyo espcctro de control se incluynn los organismos idcntificados.

2. Evaluar los mismos antibi6tkos USi!lldo nmgos de dosis mayores.

3. Llevar a cabo d proccso completo de Ia mdodulugia de superficies de respuesta para dcfinir los rangos de dosis 6primas para controlru- commninantes y pmnitir el des<~rrollo UFC.

4. Evo.hw.r Ia formvcion de UFC en el dfa 9.

5. El medio 6ptimo para eJ deMJTOI!o de UFC sc co!ISigue con lllla dosis de 0.13 mg/1 de ciclohcxamida, 300 mg/1 de doranfenicol )' 33H mgll de dodine.

6. Adquirir un paquete matemii.tico qu~ pem1ita evaluar con focilidud coojuntos de superficies de respucs\a,

-l. RECOi\.IENDAClOI"iES PARA i\IUESTR£.0 EN £STUDIOS OJ! PERSISTENClA

4.J,INTRODUCCTON

En todo plan de wues\r~o uno de los prindpa!cs aspectos a considcrar es e! tamaiio 6ptimo de Ia muestra. Si rum muestra es muy pequeiln, las estimadones que saquemos de ~ua pueden ser poco confiables; mienl.ras que si unn muestra cs demasindo grande, aunque las cstimaciones sean muy prccisas su costo de rt:aliznci6n puede ser clcvado.

Seglin Avcdillo (1992), eltamaiio 6ptimo de muestra es un valor re!ativo que depcnde de Ia detcmJinoci6n previa de trcs condiciones:

1. PrecisiOn deseada. QtiC sc cstablece prefijando d limite miLx.imo de error pennisible entre c] cstimador (x) y el verdadero valor poblacional (fl). Este error cs mAs fAcil de cxpresar en fonna relativa (E%).

2. Grado de con:fiaru:a eJ.:igido para que sc mantenga Ia precb;i6n deseada. Se estab\ece en forma de probabilidad:

P (E% de laestim~ci6n <= E% limite prcfijado)'" 1- a;

a e~ el nivel de signiflcnci6n en Ia distribuci6n "t" de Student, segl111 Ia Cl.lai se distribuye el estimador muestral Jo: nlredcdor del panlmctro poblacional J.l.

3. Variabilidad de Ia variahle nleamria mucstml Jo: estimada por su eoclieiem~ de variaci6n (CV%).

Con cstus tres condiciones cltamaiio 6ptimo de mucstra sc calcula con In siguicme fOnnula:

EI objetivo de este lmbajo fue detenniuar el lllrnail.o ndecua.do de mueSU"ns para estim~r Ia c!llltidad de csporas del hongo en10mopat6geno B. hussiana que se encuentran en los frutos de cafe en forma natural )' tambiCn despu6s de una aspersiOn de un pmducto comercial del bongo.

4.2. iYIATERL.!,.LES Y 1\lETODOS.

4.2.1. Ubicaci6u

EI ensayo de campo se realiz6 ~'1! Ia finca Santa Lastenia localizada a IS Km a] este de ]a ciudad de DanH, en ]a cou>unidad de Linaca, Departamento de El Paraiso, al sur oriente de Honduras.

Los trabajos de laboratorio fueron hechus durante el mes de diciembre de 1998 en Ia Escue]a Agricola Panamericana "EI Zanwrano", Honduras, en cl Centro de Tnvemario Agroeco16gico y Diagn6stico del Departamerrto de ProtecciUn Vegetal.

4.2.2. Mauejo del experimeuto

Las aspersione.~ se realizaron en dos lutes: uno al sol y otro ala sombra Como tratamientos se usaron dos dosis de f._,lycotro!® (B. basli;ana) y una parcela sin aplicar . Las dosis usadas fucron:

Dosis 0: Sin aplicar Dosis baja: 5 xHP esporas/ha Th:Jsis alta: Jxi0' 3 esporas/ha.

Las aspersi6nes se hieierun eon una bomba manual de espalda l\·1atabi® por los dos !ados de las filas de Ia plantaci6n.

Cada lote se dividi6 en 12 parcelas en las que los tres tratamit:nlus fucron distribuidos al a?;n-.

Las parcelas contenian 6 plantas de cafe en fila y estaban separadas a lo <UJcho por una fila sin a pUcar. Como parcel a Uti! sOlo se consider6las 4 plantas centrales.

De cada una de las cuatro plantas que conformaba Ia parcela se escogi6 una rama y se tomaron 10 frutos, resultando a! final en una muestra de 40 frutos que fuerou colocados en una bolsa plii~\ica. Lm frutos fucron recogidos uno pur uno usando pinzas para evitar el contacto de las manos con las esporas. Las muestras sc llevaron a]labonrtorio el mismo ilia para su procesamiento.

En cl laboratorio, en Ia misma bolsa pl:istica, )a muestra se lav6 con 100 ml de agua destilada estCril y Tween 20 eu una concentraci6n del 0.1 %. Con el agua dellavado se hizo una di]uci6n 1 :10 en agua destilada cSLCril. Para cada muestra se prepararon 3 platos petri con medio selectivo (20 g/1 de Gerber baby ommeal, 20 gil de bacto-agar, 0.6 gil de dodine, I mlll de gentomidna) yen cada plato se inocu\aron en condiciones asc6pticas 100 J.d de Ia diluciUn antes mencionada.

Los platos petri inoculados se colocaron en Ia incubadora (27"29 °C). La evaluaci6n se hizo a los 4 y 5 dias, contabilizando en cl plato Ia presencia de UFC de B. bm;siana.

4.2.3. Ami!isis de los datos

Se establecieron 4 grupos de muestras:

Muestras de parcelas con dosis baja Muestras de parcelas con dosis aim lvluestr""4S de par~elas sin aplicar en sombm Muestras de pareelas sin apliC<U" a! sol

En el grupo de mucstras de parcelas con dosis baja y alta se unicron las muestr:.s de los cafctalcs a! sol }' a Ia sombra. Se consider6 que no habia diferencia entre las poblaciones puesto que alm no habian sido afectadas por las condiciones ambientales diferentes que presenta cada sistema.

Para detenninar el nfunero de rnuestras en el que se estabili:m el coeficente de variaci6n, en cada gn1po se calcul6los coeficientes de variaci6n de subgrupos conteniendo desde una hasta el total de rnuestras.

Con el coeficiente de vanacron y deliniendo tres posibles escenarios de cxigcncia de precisiOn de los estimadores ( rnuy exigcnte, medianamente exigente y poco exigentc) sc calcul6 segUn Ia &uaci6n 3 los tamai'ios 6ptimos de muestm.

4.3. RESULT ADOS Y DISCUS! ON

Los coeficienies de variaci6n calculados camhiarou dependicndo de las dosis usadas en el ""-perimento. A dosis mayores !us coeficientc.s de variaci6n disminuycn. Solan1ente Ia curva de datos de dosis alta tiene la forma teOrica del mimero de muestras en funci6n del coeficiente de variaci6n (Figura 19).

La diferencia entre los coeficientes de variaci6n se refleja despuo!s en los tamafios de muestras idealcs recomendados para Ia evaluaci6n de Ia persistencia. Los tamafios de mue~tras 6ptimos tambiCn sc incrementan sustancialmente al pasar de un nivel de mt:nos exigencia a otro de mas exigencia, resultando en tarnafios demasiado grandcs en el caw de las poblaeion"s mtturales con altos o medianos niveles de cxigencia [Cuadro 13). Los cilculos de los tamaiios 6ptlmos wn en todos los casos tentativos puesto que defmitivamente en ninguno de los grupos de datos Ia curva de relaci6n coeficiente de variaci6n y nUmero de muestras lleg6 a estabilizarse complctamente.

••,------------------------------------------------------------------,

""" ---------

' ' .• ' ' ' i ... j

Figura 19.

Cuodro 13.

---'~ - ....... .:>1

. -- ...• -----

Fluctua~iUn llel wdlciente da \'ariacmn (CV) de ocuerdo al nfuncro de muestras en poblaclones n<~lurulc~ ll~ Beauvieria bassitma en cafelnles al sol y a Ia sombra y poblaciones de plantas asperjadas condos do sis del bongo.

Posibles trunailos 6ptimos de muestra pam poblaciones naturales y aspeijudas de Beam·erfa bassiana en tres posibles escenarios de exigencia en Ia precisi6n desenda para Ia estimuci6n de Ia poblaci6n.

+A. CONCLUSTOi\'ES

1. La variabilidad de I!!,'; publuciones de B. ba.ts!ana se incrementan al dismimlir su tarnail.o.

2. La evaluaci6n de pcrsistencia de B. bass!umt usando dosis altas (csporasfha) pucde scr rcalizada con una fill)' buena pJ:ecisi6n ::uin con tm t:unail.o u~ muesl.ra. pequei\a.

3. Las evaluaciones de poblaeiones naturales de B. bassiana para ser precis:as requiercn lmnail.o de muestra grnndes.

"-5. RECOi\IENDACJONES

I. En trnbajos de evalunci6n ck Ia persistencin. de las aplicaciones de B. ha1·siana dosis menores requeriran Ulmail.os de muestrn mayorcs.

2. Durante cl desarrollo de los trabajos de persistencia el mimero de muesl.ro.s debcni ~er incrementado si sc dcsea mantener cl mi~mo b'l"ado de precisiOn. AI pasar el tiempo las poblaciones de espora~ l"iables disminuyen.

3. Realizar un esrudio esp.:dfico para Ia determinnci6n de un mues\n.'<l Oprimo usando Wl mayor niimero de mucstrns {del tipo usado en es1e esrudio) ~·con W1 diferem;e tipo de muestreo (m:is frutos por mma, mas n•mas por drhol, mas arboles por pnrcela. etc.).

5. BIBLIOGRAFJA

A YEDILLO,lvl. s.f. Apunt~s para el cursu de "lvletodos estadisticos para agricultura". Zamorano, Hond., Escue Ia Agri~ula Panamericana "El Zamorano". pp. 52-75

AVEDILLO, lvl. 1992. Muestreo estadistico (Apuntes mimeognrl'iados). Zamorano, Hond., Escuela Agricola Panamericana "EI Zamorano". 7 p.

BETLHARZ, C.; PARBERY, D.O. 1982. Dodinc: a selective agent for certain soil fungi. Transactions of the British ]ldycological Society (G.B.) 79(3): 507-511.

BRUN, L.O.; MARCJLLAUD,C.; GAUDICHON, V.; SUCKLfNG,D.M. 1989. Endosulfan resistence in Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidac) in New Caledonia. Journal of Economic Entomology (EE.UU.) 82(5): 1311-1316.

BUSTILLO P., A. E.; POSADA F. 1996. Eluso de entomopat6genos en el control de la broca del cafe.lvlanejo Integrado de Plagas {C.R.) 42: 1-13.

CASTILLO, P.; ACOSTA, N.; CILIEZA.R, A. 1995. Control Microbiol6gico de Plagas .Artr6podas. In: manual para Ia ensefianza de control bio\6gico en America Latina. Ed por: R. D. Cave. Zamorano, Hond., Zamorano Academic Press. pp. 5!-72.

CHASE, A.R.; OSBORNE, L.S.; FERGUSON, V.M. 19S6. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauverfa bassiaoo and Merarhi;;hrm anisop!iae from an artificial potting medium. Florida Entomologist (EE.UU.) 69{2): pp.2S5"292.

DAOUST, R.; PEREIRA, R.M. !986. Stability ofEntornopathogenic Fungi Beam·eria bassiana and Metarhiz:ium anisup!iae on Beetle -attracting Tubers and Cowpea Foliage in Brazil. Environmental Entomology (EE.UU.) 15{6): 1237-1243.

F AlZ.l, R. 197S. Effet d' une infection chronique a Beauveria bassi ana {Fungi Imperfe<;ti, lvloniJiales) sur lc potcnticl biotique de Chilo suppresalis (Walker)(Lepidoptera, Pyra!idae, Crambinae). These de 3eme Cycle, Universite Paris XI Orsay, Francia.

Citado por: Feng, M.G.; Puprawski, T.J.; Khachatourians, G.G. I 994. Production, Formulation, and Aplicatiun of\he Entomopathogenic Fungus Beau1·eria bassiww for Insect Control: Current Status. Biocontrol Science and Technology (EE.UU.) 4: J-34.

FENG, lvLG.; POPRAWSKY,T.J.; KHACHATOURIANS, G.G. 1994. Production, Formulation and Application of the Entomopatbogenic FlUlgus Beam-·eria bassiana for Insect Control: Current Status. Diocontrol Science and Technology (EE.UU.) 4: 3-34.

FERRON, P. 1981. Pest control by the :fungi Beauveria and Metarhiziwn. In: Microbial control of pests and plant di~ea~es. Ed. by H.D. Burges. London, Academic Press Inc. pp. 465-482.

FERRON, P.; FARGUES, J.; RIDA, G. 1991. Fungi as microbial insecticides against pests. In: Handbook of Applied }.·fycology. Ed by D.K. Arora, L. Ajcllo, K.G. Mukcrgi. New York, (·krrcd Dcckker Inc. pp. 665"706.

Citado por: Feng, ll.f.G.; Poprawski, T.J.; Khachatourians, G. G. 1994. Production, Formulation, and Ap!ic:rtiun of the Entomopathogenic Fnngus Beauveria bassiann for Insect Control: Current Status. Biocorrtrol Science and Technology {EE.UU.) 4: 3-34.

FREUND, IU.; LITTELL, R.C. 1991. SAS System for Regression. 2 ed. Cary, NC, EE.UU., SAS Institute Inc. 210 p.

GARDNER., W.A.; SUTION, R.M.; NOBLET, R. 19n. Persistence of Beauveria hassiana, Nomuroea rileyi, nnd Nosema necmrix on Soybean Foliage. Environmental Entomology (EE.UU.) 6(3): 616-618.

Citadu por: P.E. Velez- Arango, E. C. Montoya Restrepo. 1993. Supervivencia del hongo Beauveria bassiarza bajo ra-d.iaci6n solar en condiciones de laboratorio y campo. Ceuicaf6 (Col.) 44(3):11!-122.

GOETTEL, M.S.; INGLIS, G.D. 1997. Fungi: IIyphomycetes. In: lvfanual ofTechniques in Insect Patology. Ed by: L. Lacey. San Diego, EE.UU., Academic Press. pp. 213* 248.

GOLDBERG, H.S.; LUCKEY, T.D. 1959. Effect~ of Antibiotics. In: Antibiotics: Their Chemistry and Non-Medical Uses. Ed by H.S. Goldberg. Toronto, Can., D. Van Nostrand Company, Inc. pp. 10-23.

IGNOFFO, C.M. 1992. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist (EE.UU.) 75(4): 516-525.

INGLIS, G. D.; GOETTEL,M.S.; JOHNSON, D.L. !995. Influence ofU1travio1et Light Protectrmts on Persistence of the Entornopathogeuic Fungus, Beauveria hassiarza.Biological Control (EE.UU.) 5:581-590.

JARONSKY, S.T. 1998. Preparation ofDodine Oat Meal Selective Agar. lv1ycotech

Corporation, Montana, USA. {Comt>nicaci6n Personal).

JARONSKY, S:r. 1999. Recommendations for Preparation ofDodine Oat Meal Selective Agar. Mycotech Corporation, lvlont;ma, USA. (Comunicaci6n Personal).

LACAYO, L.; BARRIOS, A.,lvL; .JTMENEZ, C.; SANDJNO,V. 1994. Elt!SO de hongos entomopat6genos para cl manejo de Ia broca del caf6 (Hypolhenemus hampei) en Nicaraglll!. In: Uso de bongos entomopat6genos para manejo de plagas en Nicaragua. Nic., Proyecto de hongos entomopat6genos CATIEIINTA-lvllP. s.p.

QUEZADA R.,J.; URBD'lA, N.R. 1937. La broea del cafeto y su control. In: Plagas y enfermedades de caracter epidCmico en cultivos frutales de Ia regiOn centroamericana. Ed. por J. Pinochet. Panarrui, CA TIE. pp. 48-59.

RIVERA, M.; LOPEZ, J.C. 1992. Medio selectivo para aislamiento de Beauveriu bussiana {Balsamo) Vuillemin a partir de muestras de suelo. In; Congreso Sociedad Columbiana de Entomologia. Manizales, Col., SOCOLEN. p.46.

RIVER.<\, M.; LOPEZ, N.; BUSTILLO P., A. E. 1994. Medio selectivo para aislamiento de Beauveria bassiana {Bals.) Yuill. de material vegetal, sudo e insectos infectados. In: Congreso Sociedad Colombiana de Entomologia Medellin, Col., SOCOLEN.

p.46.

SAS IN"STITUTE .me. 1985. Sas/Stat Guide; User's Guide for personal computers, 6 ed. Cary, NC, EE.mJ. 243 p.

SHELTON, A.M.; VEND ENBERG, J.D.; RAi'viOS, M.; WILSEY, W."!". 1998. Efficacy and Persistence of Beauveriu bassiana and Other Fungi for Control of Diamondback Moth (Lepidoptera; Plutellidae) on Cabbage Seedlings. Journal of Entomology Science {EE.UU.) 33(2): 142-151.

SPONAGEL.,K.W. 1994. La Broca del Caf6 Hypothenemus hampei en las plantae! ones de Cafe Robusta en Ia Amazonia Ecuatoriana. Trad. por Wilma Miranda-Sponagel. Giessen, Alemania, Wissenschaftlichcr Fachverlag. 279 p.

VELEZ A., P.E; MONTOYA R.,E.C.; 1993. Supen~vencia del bongo Bemllieria bassiana ba.jo ra.diaci6n solar en condiciones de laboratorio y campo. Cenicaf6 (Col.) 44(3):111~122.

VELEZ A., P.E; MO:t--'TOYA R.,E.C.; 1998. Supervivcncia de Beauveria bassiona y }¥felarhi::ium anisopliae en doslocalidades ca.feteras colombianas. CenicafC (Col.) 49(1 ):51-71.

ZHANG, Z.G.; HUANG, X.Y. 1988. Study of the inf!t>ence of Beauwria bassiana on oviposition of Nephotellix dm:ticeps and Nilaparata lugens.In Study and

Application OfEntomogenous Fungi in China Ed by Li, Y.W. Li, Z.Z. Li, Z.Q. Liang, J.W. Wu, Z.K. \Vu, Q.F. Xu. Beijing, Academic Periodical Press, pp. 85· S9

Citado por: Feng, M.G.; Popnwcski, T.J.; Khachatourians, G.G. 1994. Production, Formulation, and Aplication of the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassi ana for Insect Control: Cunent Status. Biocontrol Science and Technology {EE.UU.) 4: J-34.

Anexo 1.

6. A.i'iEXOS

Amilisis de laboratorio para Ia identificnci6n d'! organismos contaminanles de Ia primera fase del cxp~rimento para la elaboraci6n de un medio selective para el aislamiemo de Benuwria bas:riwm

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Ancxo 2.. Datos de la.boratono de Ia segunda lase delii!xperimeniD para elaboracl6n da un medlo

selectlvo para el aislamiento de Beauveria bassiana

tratamiento dia clclohexamlda cloranfenicol dodine mpeticio<l UFC PCH PCO

' ' '"' 400 "'" ' " " " ' ' 250 "" FOO ' " " " ' ' 250 "" 600 ' " " " ' 6 250 "" 600 ' 0 0 " ' 6 " 400 600 ' "" 0 " ' 6 " '"" "'" 2 " 0 0 2 0 0 '"" 600 3 95 0 '" ' ' 0 400 "'" ' " 0 ' ' 6 "' "'" 600 ' " 0 " ' ' "' "'" "'" 2 " " " 3 ' "' 500 "'" 3 " " " 3 ' "' "'" "'" ' " 0 " ' ' m "" FOO ' " 0 " ' 6 125 300 600 2 0 0 0 4 6 '" 300 600 0 0 0 0 4 6 "' "" FOO ' " 0 " ' ' 250 "" "" ' " 0.5 " ' ' 260 "" "" ' " 0 0

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" 5 0 000 050 2 540 ' ' " 5 0 000 <50 5 555 0 0

" 5 0 000 <50 4 522 5 ' 56 5 m 500 <50 ' 0 0 0 56 5 m 500 "' 2 0 0 0 56 5 125 500 450 5 0 0 0 56 5 125 500 450 4 0 0 0 57 5 0 400 '50 ' 530 0.5 ' 57 5 0 <00 450 ' ""' 2 0 57 5 0 <00 450 5 539 0.5 0 57 6 0 .00 450 ' ''" 0 0 56 5 125 400 450 ' 0 0 0

'" 5 125 400 450 2 0 0 0

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'" 5 "' ""' "' 4 0 0 2

" ' 0 300 500 ' 66 0 0

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