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Electroforesis de ADN
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ
Reporte 10: Extracción de ADN vegetal
LABORATORIO DE CIENCIAS AMBIENTALES III
Profesor: Cristóbal Aldama Aguilera
Alumno: Saul Ortiz Almendariz
Facultad de Ingeniería
Ingeniería Ambiental
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ Laboratorio de Ciencias Ambientales 3
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INTRODUCCIÓN
El ácido desoxirribonucléico (DNA) es un polímero que tiene la capacidad de almacenar y
transmitir información genética. Este polímero está compuesto por cuatro tipos de
nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) unidos entre ellos por enlaces fosfodiéster;
cada nucleótido estructuralmente contiene un grupo fosfato, una base nitrogenada (purina o
pirimidina) y un azúcar desoxirribosa (Figura 1). En plantas, la biosíntesis de nucleótidos
de purina ocurre en el citoplasma. La forma predominante del DNA es una doble hélice
dextrógira, antiparalela, en la cual las bases nitrogenadas se aparean por dos o tres puentes
de hidrógeno: A=T; G≡T. Ésta hélice tiene direccionalidad 5'-3'. Además del DNA nuclear,
en plantas encontramos DNA en mitocondrias y cloroplastos, estos genomas circulares,
pequeños codifican proteínas importantes para el funcionamiento del organelo y el
mantenimiento de su material genético. La expresión del genoma de organelos como la
mitocondria y el cloroplasto también se encuentra bajo control fino del genoma nuclear. En
plantas, existen mecanismos regulatorios que coordinan la expresión de genes nucleares, de
mitocondria y de cloroplasto que permiten la síntesis de proteínas que funcionan en
organelos citoplásmicos. En esta práctica se aplicará una técnica de rutina para la
extracción de DNA vegetal empleando un detergente iónico SDS (dodecilsulfato sódico).
OBJETIVOS
Conocer la técnica de extracción del DNA de muestras vegetales y electroforesis en gel para
su visualización.
Comprender el uso de las soluciones y reactivos utilizados para lograr la extracción de DNA
vegetal
Obtener DNA de tejido vegetal empleando el método de extracción basado en SDS.
Discutir algunas aplicaciones de la extracción de ácidos nucleicos.
FUNDAMENTO
Los detergentes son moléculas anfipáticas que rompen la membrana al intercalarse dentro de las
bicapas fosfolipídicas y solubilizan lípidos y proteínas en la célula. De esta forma se libera el
contenido celular. La sal (EDTA) permite que el DNA precipite en una solución fría de alcohol y
que las cadenas de DNA no se corten.
MATERIALES Y EQUIPOS
Tubos eppendorf de 2 ml
Micropipetas de 100 y 1000 μl
Puntas para micropipeta de 100 y 1000 μl
Mortero
Nitrógeno líquido
Microcentrífuga
Vortex
Termoblock
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SOLUCIONES Y REACTIVOS
Material vegetal
Buffer de extracción SDS (Tris-HCl 0.2M pH 8.0, NaCl 0.25M, EDTA 0.025M, SDS 0.5%)
Cloroformo
Fenol –Cloroformo-Alcohol isoamílico (25:24:1)
Isopropanol (previamente enfriado a -20°C)
Etanol al 70% (previamente enfriado a -20°C)
Agua destilada estéril
PARA ELECTROFORESIS EN GEL
Gel de agarosa 1%
Bromuro de Etidio
Buffer de carga
Marcador de peso molecular
TAE 1x
Termociclador
Fotodocumentador UV
Cámara de Electroforesis
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Figura 2. Colocar aproximadamente 200 mg de material vegetal molido en un tubo eppendorf.
Figura1. Moler finamente el material vegetal en un mortero con nitrógeno líquido
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Figura 3. Agregar 800 μl del buffer de extracción SDS. Mezclar en vortex.
Figura 4. Mezclar en vortex.
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Figura 5. Colocar la muestra en termoblock a 65°C por 15 minutos. Centrifugar a 12,000 rpm
en microcentrífuga por un lapso de 10 minutos.
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Figura 5.
1. Recuperar fase acuosa y transferir a un
tubo nuevo.
2. Agregar dos volúmenes de fenol,
cloroformo, alcohol isoamílico y un
volumen de isopropanol frío. Colocar en
refrigeración a -20°C por 10 minutos.
3. Centrifugar a 12,000 rpm durante 15
minutos. Una vez centrifugado, descartar el
sobrenadante.
4. Adicionar 1000 μl de etanol al 70%.
5. Centrifugar 12,000 rpm por 5 minutos. Una
vez centrifugado, descartar el sobrenadante
y secar la pastilla a temperatura ambiente.
6. Una vez seca, resuspender la pastilla en 100
μl de agua estéril. Almacenar a -20°C hasta
su utilización.
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Figura 6. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes
muestras biológicas. El medio de separación para esta práctica es un gel de agarosa, derivado de
las algas. Se debe disolver el gel en un buffer tris-borato-EDTA. Se homogeneiniza con agitación
e incremento de temperatura. La utilización de marcadores nos permitirá calcular los pesos
moleculares como el agente intercalante Bromuro de Etilo.
Cuando la temperatura disminuya, se obtiene la gelificacion y el resultado será un polímero,
cuyos poros tendrán un tamaño dependiente de la concentración de agarosa presente y es
importante ya que el gel se comporta como un tamiz que permite separar moléculas en función
de su tamaño y forma. Así moléculas de ADN de diferente tamaño van a migrar de forma
distinta. Esta imagen muestra una cámara de electroforesis, sitio donde deberá gelificarse la
solución de agarosa. Mientras este en estado líquido, ubicamos el peine, para que nos
proporcione los huecos donde colocaremos la muestra. Al gelificar se retira el peine del
polímero. El punto de partida seran los orificios de cada una de las muestras y guiaran los
carriles por donde viajaran gracias al paso de corriente.
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Figura 7. El buffer de carga lo cual da peso a la muestra para que el ADN precipite al fondo de los
pozos de siembra e identificar el efluente de corrido. Habra una relación de muestra con buffer
de carga. Para cada gota con ayuda de micropipeta se suspende la muestra aspirando y
depositando varias veces para después llevar al pozo.
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Figura 8. Se conecta las terminales con voltaje y se logra ver como la banda se mueve a través del
gel. Aquí son sometidas a un campo eléctrico y atraídos hacia el polo opuesto a su carga neta. La
aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquier molécula de ácido nucleico.
La diferencia en velocidad de migración esta dada por la forma y tamaño de la molécula de ADN.
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Figura 9. Observamos como ha migrado las banda y se observa la luminosidad con luz
ultravioleta. La relación de bromuro de etidio con ADN nos permite apreciar la fluorescencia. La
intensidad está relacionada con la cantidad de ácidos nucleicos. El espectrofotómetro tiene la
capacidad de proyectar una haz de luz monocromático de longitud de onda particular a través de
una muestra y medir la cantidad de luz absorbida por la muestra. Esto permite obtener
información, midiendo la absorbancia a distintos largos de onda y graficando esos valores en
función de largo de onda. Formando un espectrograma. Nuestro blanco es el buffer, sustancia en
la que se encuentran disueltas nuestras muestras de ADN, la idea es que sus niveles de
absorbancia no interfieran con la medición de material genético.
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REPORTE
1. ¿Cuál es el papel del SDS (dodecilsulfato sódico) en la extracción de DNA?
Diferentes formas de sodio se utilizan para la extracción de ADN. Dodecil sulfato de sodio, o SDS.
es una sal de sodio que contiene detergente.
Los detergentes se utilizan para romper las paredes y membranas celulares.
2. ¿Por qué recuperamos la fase acuosa en el paso 5?
En este paso se siguen destruyendo las proteínas (debido a la presencia del fenol).
2. ¿Por qué se tiñe el gel de agarosa cargado de DNA, con bromuro de etidio?
En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y
se pueden visualizar mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para
visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio y el nitrato de plata.
El proceso de coloración de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse
entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposición con rayos ultravioleta. Su
sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz
en el que se esté visualizando.
4. Mencione algunas de las aplicaciones de la extracción de DNA de cualquier
organismo en ingeniería ambiental.
La comparación de vegetación sana y vegetación enferma, para la identificación de ácidos nucleicos
de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN, que una vez
localizado en el gel puede ser analizado para investigaciones posteriores.
Algunos microorganismos juegan un papel importante como indicadores de contaminación, y otros
participan en gran medida en el tratamiento biológico de residuos líquidos y sólidos. Identificar
ácidos nucleicos puede ayudar a potenciar resultados de ingeniería biológica.
BIBLIOGRAFÍA
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manual%20Electroforesis%2038.pdf
http://www.geocities.ws/pedrojrocha/pr/rocha23_3.pdf
