DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDAINGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

EVALUACIÓN DE BIOAEROSOLES, BACTERIAS Y HONGOS, EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA –

BIOTECNOLOGÍA DE LA ESPE Y CONSTRUCCIÓN PREVIA DE UN MUESTREADOR DE BURBUJEO EXPERIMENTAL.

Tesista: Andrés López M.Directora: M. Sc. Alma KochCodirector: Ing. Mat. Pedro Romero

I. INTRODUCCIÓN

Problemática

Conjunto de partículas en suspensión de origen biológico variable en un medio gaseoso

Tamaño

Trabajadores

0,001 – 1 µm1 – 5 µm5 – 10 µm

Fuentes

Asociados a• Enfermedades• Rol ecológico

Bioaerosoles

2. Objetivos de la Investigación

Objetivo General

Evaluar los bioaerosoles (bacterias y hongos) en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE y construir previamente un muestreador de burbujeo experimental.

Objetivos Específicos

1. Determinar la existencia de bioaerosoles. 2. Establecer las posibles fuentes de emisión

de bioaerosoles. 3. Evaluar tareas y puestos de trabajo y su

relación con los bioaerosoles. 4. Construir un muestreador de burbujeo

experimental en base al diseño de Agranovski et al. (2002).

5. Tomar muestras de bioaerosoles con el muestreador de burbujeo experimental (Agranovski et al., 2002).

6. Identificar las muestras de bioaerosoles recolectadas usando técnicas de cultivo convencionales.

7. Cuantificar la concentración de bioaerosoles.8. Documentar la presencia de bioaerosoles.

I. INTRODUCCIÓN

3. Hipótesis

Hipótesis nula

• La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE no es significativa.

Hipótesis alternativa

• La presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.

I. INTRODUCCIÓN

II. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Participantes

Tesista: Andrés López M.Directora: M. Sc. Alma KochCodirector: Ing. Mat. Pedro Romero

Personal del LaboratorioEstudiantesCentro de Investigaciones Científicas (CEINCI) de la ESPE

2. Zona de Estudio

Investigación de campo y análisis de laboratorio: Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE (constituido por tres áreas).

Área de Investigaciones

Área de Docencia

Área de Biología Molecular

Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.Área de Investigaciones, Área A. Área aproximada de 30,16 m2


Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.Área de Docencia, Área B. Área aproximada de 53,65 m2


Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.Área de Biología Molecular, Área C. Área aproximada de 46,34 m2


3. Diseño experimental (Gutiérrez & De La Vara, 2008).

Diseño de bloques completos al azar (DBCA)

Arreglo de los datos en el DBCA para la investigación

Modelo estadístico

Hipótesis

Número de tratamientos3 áreas x 3 días x duplicado = 18

Pruebas• LSD de Fisher• Shapiro Wilks• Levene • Independencia


4. Procedimientos

Construcción del muestreador experimental•De acuerdo al diseño de Agranovski et al. (2002), con modificaciones

Inspección detallada del edificio•Inspección exterior•Inspección interior

Descripción de actividades del área de trabajo•Identificar los posibles mecanismos de propagación de bioaerosoles

Identificación de los bioaerosoles muestreados•Mediante técnicas de Microbiología tradicional

•Bacterias (Género y especie)•Hongos (Género)

Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)•De acuerdo a la norma NIOSH 0800 Bioerosols Sampling, con modificaciones

Determinación de las concentraciones de bioaerosoles•Partículas totales•Bioaerosoles viables y no viables•UFC/m3


4.1. Construcción del muestreador experimental

Esquema del muestreador: (a) vista tridimensional y vista lateral, y (b) vista de planta (Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002)

Muestreadores experimentales construidos

Material de construcción Acrílico

Material de construcción PVC

Diseño


(b)

4.1. Construcción del muestreador experimental

Producción de burbujas para fotografías (Agranovski, Braddock, & Myojo, 1999)

Absorción de aerosoles en burbujeo• Circulación de aire en el interior de la burbuja• Deposición inercial • Sedimentación • Difusión

Principio de funcionamiento

Muestreador en funcionamiento


4.2. Inspección detallada del edificio (exterior e interior)

4.3. Descripción de actividades del área de trabajo


Registro de inspección exterior e interior

Registro de actividades durante la evaluación

4.4. Muestreo de bioaerosoles (bacterias y hongos)

Tipos de bioaerosoles a muestrearBacterias y hongos

Puntos de muestreo2 puntos de muestreo por cada área

Número de muestras3 áreas x 3 días x duplicado = 18

Tiempo y flujo de muestreo• 8 h continuas diarias• 4 L/min

Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica

Fluido de recolecciónTripticase Soy Broth (TSB)

Medios de cultivo• Bacterias Tripticase Soy Agar (TSA) con

0,04% de actidiona • Hongos Malt Extract Agar (MEA) con

0,01% de cloranfenicol


Registro muestreo de bioaerosoles


Limpieza y desinfección del equipo muestreador

Limpieza Desinfección

Preparación de los equipos muestreadores

Relleno del dispositivo muestreador de bioaerosoles con 40 mL de medio TSB mediante un dosificador

Equipos muestreadores B1, B2 y B3 con 40 mL de medio TSB listos

Equipos muestreadores sellados y listos



Equipos muestreadores B1, B2 y B3

Bombas de succión de aire

Puntos de muestreo en área A

Uso del equipo muestreador In situ





Bombas de succión de airePuntos de muestreo en área B




Bombas de succión de airePuntos de muestreo en área C



Procesamiento de las muestras de bioaerosoles


Enjuague y recuperación

Volumen final (80 mL)

División en alícuotas (40 mL)

Equipos al finalizar la toma de muestras

Refrigeración


4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles

Recuento total de partículas biológicas y no biológicas

Recuento de bioaerosoles viables y no viables

Conteo en la Cámara de Neubauer

Diluciones seriadas (10-1 y 10-3) y cultivo en medios MEA y TSA


UFC/m3 de aire

4.5. Determinación de las concentraciones de bioaerosoles

Corrección de las mediciones observadas

(Agranovski, Agranovski, Reponen, Willeke, & Grinshpun, 2002)

(TULAS, 2011)


4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados

Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos)

Medios de cultivo• Bacterias Tripticase Soy Agar (TSA) con

0,04% de actidiona • Hongos Malt Extract Agar (MEA) con

0,01% de cloranfenicol• Algunas bacterias y hongos Potato

Dextrose Agar (PDA)

Evaluación morfológica, se escogieron las colonias distintas

Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)


4.6. Identificación de los bioaerosoles muestreados

• Tinción Gram• Prueba de la Catalasa• Prueba de Oxidasa

• Evaluación macroscópica• Evaluación microscópica

• Técnica del celo• Tinción de KOH y azul de

metileno modificada • Tinción Gram

• Determinación del género Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 2001

Bacterias Hongos

• Software Identax Bacterial identification System


III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Construcción previa del muestreador de burbujeo experimental

Equipos muestreadores B1, B2 y B3 (Agranovski et al., 2002) construidos para la Evaluación de Bioaerosoles (bacterias y hongos)

2. Inspecciones exterior e interior del edificio

• Buenas condiciones, • Poco polvo • No había evidencias visibles de fuentes

microbianas, nutrientes o agua.

• No existen sistemas de ventilación o filtración de aire

• La infraestructura física (pisos, mesas de trabajo, ventanas) no cumplen con los requerimientos adecuados para un laboratorio de Microbiología.

Área B


Interior

Exterior

Área A

3. Actividades en el entorno de trabajo

Área B


Área C

3. Actividades en el entorno de trabajo

Acciones comunes

Movimiento del aire generado por • Caminar• Hablar• Toser• Estornudar• Reaerolización de partículas del piso

y de las superficies

Fuentes:• Bacterias aire interior, ocupación

humana, sus actividades• Hongos aire exterior, plantas, suelo


4. Temperatura, humedad relativa y presión atmosférica

Aumento temperatura• Recuentos elevados de microorganismos

y esporas de hongos en el aire

Humedad relativa interior• Desecación puede conducir a la pérdida

de viabilidad


5. Recuento total de partículas biológicas y no biológicas

Observación de dos partículas (posibles bioaerosoles),


6. Recuento de bioaerosoles viables y no viables

Conteo de bioaerosoles (bacterias y hongos) viables en el contador de colonias Quebec


7. Concentración de bioaerosoles, UFC/m3

Bacterias y hongos

ANOVA

(p<0,05)

Límites permisibles sugeridos• Holanda 10000 UFC/m3


Bacterias

ANOVA

(p<0,05)


Límites permisibles sugeridos• Unión Europea 10000 UFC/m3

• OMS 500 UFC/m3


Hongos

ANOVA

(p<0,05)


Límites permisibles sugeridos• Unión Europea 10000 UFC/m3


Selección de dos colonias distintas de bioaerosoles (bacterias),

8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)


Selección de una colonia distinta de bioaerosoles (bacterias resistentes al cloranfenicol),

Selección de la colonia del bioaerosol hongo,

8. Selección de bioaerosoles (bacterias y hongos)


9. Aislamiento de bioaerosoles (bacterias y hongos)

Medio TSA Medio MEA

Medio PDA


10. Identificación de los bioaerosoles bacterias

Catalasa

Oxidasa

Tinción Gram

Pruebas bioquímicas

Antibiograma


Identax

10. Identificación de los bioaerosoles hongos

Tinción de KOH y azul de metileno

Tinción Gram

Tinción de Azul de Lactofenol

Técnica del celo (cinta adhesiva)

Bacterias resistentes al cloranfenicol

Hongo filamentoso


11. Localización de los bioaerosoles encontrados

Área de Investigaciones


8 bacterias

7 especies


Área de Docencia


15 bacterias1 hongo

11 especies 1 género


Área de Biología Molecular


18 bacterias

16 especies

IV. CONCLUSIONES

• Las posibles fuentes de emisión de los bioaerosoles encontrados fueron el movimiento del aire generado por las personas al caminar, al hablar, toser, estornudar, la reaerolización de partículas del piso y de las superficies y también el aire proveniente del ambiente exterior.

• Se analizaron las tareas y puestos de trabajo durante la evaluación de bioaerosoles y se descubrió que la apertura y cierre de puertas constituye la acción predominante que probablemente permite la proliferación de los bioaerosoles, además de la presencia de seres humanos, otras actividades y el aire exterior.

• La viabilidad de los bioaerosoles en las tres áreas analizadas se mantuvo entre 0,654% y 2,386% y los factores principales que posiblemente los afectaron son la humedad y la temperatura ambiental durante la evaluación.

• El área de Biología Molecular registró la mayor concentración de bioaerosoles, la de Docencia mostró una concentración intermedia y la de Investigaciones reveló la menor concentración.

• Se evidenció que casi todas las concentraciones de bioaerosoles detectadas excedieron los límites sugeridos por la Organización Mundial de la Salud, la Unión Europea, y Holanda.

• De las tres áreas del Laboratorio de Microbiología - Biotecnología se aislaron 42 bioaerosoles (41 bacterias y 1 hongo), 38 bioaerosoles bacterias fueron bacilos Gram negativos, mientras que 3 fueron bacilos Gram positivos, de igual manera se halló un sólo bioaerosol hongo filamentoso. Los bioaerosoles bacterias fueron predominantes sobre los hongos.

• Sobre los géneros de bioaerosoles descubiertos se obtuvo que 2 son de Enterobacter, 3 de Yersinia, 1 de Serratia, 5 de Ewingella, 4 de Burkholderia, 1 de Klebsiella, 2 de Proteus, 19 de Pseudomonas, 1 de Hafnia, 3 de Bacillus y 1 de Alternaria spp.

• Se comprobó que la presencia de bioaerosoles, bacterias y hongos, en el Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE es significativa.

IV. CONCLUSIONES

V. RECOMENDACIONES

Se debería:• Ampliar la información sobre bioaerosoles en el Ecuador realizando nuevas investigaciones en

otros ambientes laborales.

• Investigar los bioaerosoles recolectados ya que algunos tienen diversas aplicaciones.

• Incrementar la concentración del agente antibacteriano cloranfenicol en el medio de cultivo MEA o utilizar otras alternativas.

• Extender el número de muestras y la inversión económica para mejorar la inferencia estadística. • Implementar algún sistema de control de bioaerosoles para disminuir sus concentraciones en el

Laboratorio de Microbiología - Biotecnología de la ESPE.

• Rediseñar y adecuar las instalaciones del Laboratorio de Microbiología – Biotecnología de la ESPE para lograr un eficiente desarrollo de sus actividades.

AGRADECIMIENTOS

• A la Escuela Superior Politécnica del Ejército por el apoyo y recursos brindados.

• A mi querida madre Sarita, que me enseñó, apoyó y respaldó mis anhelos y sueños para convertirme en el ser humano que soy.

• A todos esos dilectos amigos y amigas de mi madre, que se preocuparon y me apoyaron para que culmine con éxito mi estudio.

• A M. Sc. Almita Koch Kaiser y al Ing.-Mat. Pedro Romero, Directora y Codirector de mi Tesis, por su acogida, respaldo y conocimientos brindados.

• A Ing. Jessie Maisincho y la Dra. Ligia Ayala por su apoyo y colaboración.

• A mis apreciados amigos y amigas.

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