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DETERMINACIÓN DE CONCORDANCIA DE EXPRESIVIDAD DE HER -
2 ENTRE INMUNOHISTOQUÍMICA E HIBRIDACIÓN IN SITU
FLUORESCENTE (FISH) Y SU RELACIÓN CON EXPRESIÓN DE
TOPOISOMERASA A2 EN CARCINOMA INVASOR DE MAMA EN EL
HOSPITAL CARLOS ANDRADE MARÍN. 2012-2013.
MD. MARÍA ELISA PUERTAS B.
DR. WAGNER ANDRÉS NARANJO
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSGRADO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA
Quito, Septiembre, 2014
ii
DETERMINACIÓN DE CONCORDANCIA DE EXPRESIVIDAD DE HER -
2 ENTRE INMUNOHISTOQUIMICA E HIBRIDIZACION IN SITU
FLUORESCENTE (FISH) Y SU RELACIÓN CON EXPRESIÓN DE
TOPOISOMERASA A2 EN CARCINOMA INVASOR DE MAMA EN EL
HOSPITAL CARLOS ANDRADE MARÍN. 2012-2013.
MD. MARÍA ELISA PUERTAS B
DR. WAGNER ANDRÉS NARANJO
Trabajo de Tesis presentado como requisito parcial para optar el
Título de Especialistas en Anatomía Patológica
Tutor:
Dra. Sonia Tello
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSGRADO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA
Quito, Septiembre, 2014
iii
FORMULARIO DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO
INSTITUCIONAL
Nombre del autor(es): MD. María Elisa Puertas Bravo. Dr. Wagner AndrésNaranjo Salas. Correo electrónico personal: [email protected] [email protected] Título de la obra: Determinación de concordancia de expresividad de Her-2 entre Inmunohistoquímica e Hibridizacion In Situ Fluorescente (FISH) y su relación con expresión de Topoisomerasa A2 en carcinoma invasor de mama en el Hospital Carlos Andrade Marin. 2012-2013. Tema del trabajo de investigación: Cáncer de mama, Her2 neu, Inmunohistoquímica, FISH, Topoisomerasa 2A, Concordancia.
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL Nosotros MD. María Elisa Puertas Bravo. Dr. Wagner Andrés Naranjo Salas. En calidad de autor del trabajo de investigación o tesis realizada sobre: : Determinación de concordancia de expresividad de Her-2 entre Inmunohistoquímica e Hibridizacion In Situ Fluorescente (FISH) y su relación con expresión de Topoisomerasa A2 en carcinoma invasor de mama en el Hospital Carlos Andrade Marin. 2012-2013.por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de lo que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5,6,8,19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su reglamento.
Con la portada correspondiente, El trabajo de tesis deberá ser grabado en un solo archivo en formato de texto “.doc” (Microsoft Word).
1.- Identificación del Documento y Autor
2.- Autorización
3.- Formato digital (CD):
iv
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por los
Doctores MD. María Elisa Puertas Bravo. Dr. Wagner Andrés Naranjo
Salas, para optar el Título de Especialistas en Anatomía Patológica cuyo
título es “DETERMINACIÓN DE CONCORDANCIA DE EXPRESIVIDAD
DE HER - 2 ENTRE INMUNOHISTOQUIMICA E HIBRIDACIÓN IN SITU
FLUORESCENTE (FISH) Y SU RELACIÓN CON EXPRESIÓN DE
TOPOISOMERASA A2 EN CARCINOMA INVASOR DE MAMA EN EL
HOSPITAL CARLOS ANDRADE MARÍN. 2012-2013.”
Considero que dicho Trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes
para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del
jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito a los veinticinco días del mes de junio del 2014.
v
DEDICATORIAS
A Dios por su fortaleza.
A mi esposo José, compañero de vida.
A mi increíble Isabela.
Mis padres queridos y a todos los demás miembros de mi familia a
quienes adoro.
Siempre mi corazón y agradecimiento.
Maria Elisa
A mis Padres: quienes me dieron la vida y me enseñaron como vivirla
dignamente.
A mi Esposa: el apoyo e impulso que alumbró las sendas más oscuras
A los que atacaron con ansias de lastimar, fortalecieron mi voluntad de
avanzar.
Wagner
vi
RECONOCIMIENTOS
A la Universidad Central del Ecuador, que por medio del Instituto Superior
de Posgrado de la Facultad de Ciencias Médicas, así como la
coordinación del Postgrado de Anatomía Patológica, que nos ha brindado
la oportunidad de ampliar y fortalecer nuestra formación académica y de
los médicos del país.
Al Hospital Carlos Andrade Marín, en especial al Servicio de Anatomía
Patológica, por brindarnos la apertura y aporte técnico, sin el cual el
presente trabajo no se hubiera realizado.
Al Dr. Nicolás Vivar, por su desinteresado apoyo y colaboración científica
generosa en todo momento.
A las tecnólogas médicas del Hospital Carlos Andrade Marín, Jenny
Rodríguez y Cecilia Cruz que con su entusiasmada participación hicieron
posible este estudio.
Al Dr. Klever Sáenz y Dra. Sonia Tello, Asesor metodológico y Directora
de tesis, catedráticos y amigos; por su apoyo y conocimientos científicos
desde la planificación hasta la culminación exitosa de este trabajo.
Los Autores
vii
CONTENIDO
Pág.
APROBACIÓN DEL TUTOR ...................................................................... iv
DEDICATORIAS ........................................................................................ v
RECONOCIMIENTOS ............................................................................... vi
CONTENIDO ............................................................................................ vii
CONTENIDO DE GRÁFICOS .................................................................... x
CONTENIDO DE TABLAS ......................................................................... xi
CONTENIDO DE ANEXOS...................................................................... xiii
RESUMEN ............................................................................................... xiv
ABSTRACT ............................................................................................... xv
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................ 3
CAPITULO I
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ................................................................. 6
1.1 Planteamiento del problema ............................................................ 6
1.2 Hipótesis .......................................................................................... 8
1.3 Objetivos ......................................................................................... 9
1.3.1 Objetivo general .............................................................................. 9
1.3.2 Objetivos específicos ...................................................................... 9
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO .................................................................................. 10
2. MARCO REFERENCIAL, TEÓRICO Y CONCEPTUAL ...................... 10
2.1 Cáncer de Mama ........................................................................... 10
2.2 Epidemiología del Cáncer Mamario .............................................. 11
2.3 Clasificación: Tipo Histológico y Grado Tumoral ........................... 12
2.4 Her-2 y Cáncer de Mama .............................................................. 16
2.5 Significado biológico de la activación de HER-2 ........................... 17
viii
2.6 Métodos de estudio de la activación de HER-2 y su
Interpretación ................................................................................ 18
2.7 Relación de la amplificación de Her2 mediante FISH y el
Herceptest ..................................................................................... 19
2.8 Sobreexpresión de la Topoisomerasa 2A en cáncer de mama ..... 21
2.9 Co-expresión de c-erbB2 y Topoisomerasa 2A en cáncer de
mama ............................................................................................ 23
2.10 HER-2 positivo en cáncer de mama y su relación con grado
histológico tumoral, tamaño tumoral, TNM, estado de
receptores de estrógenos y progesterona ..................................... 25
2.11 Clasificación Molecular del Cáncer de Mama, usando
Inmunohistoquimica como marcador indirecto .............................. 26
CAPITULO III
MARCO METODOLÓGICO ..................................................................... 30
3.1 Diseño de la Investigación ............................................................. 30
3.2 Universo, Población, Muestra ........................................................ 30
3.3 Plan de Análisis ............................................................................. 31
3.4 Definición de variables .................................................................. 32
3.5 Operacionalización y Definición de Variables que participan en
el estudio ....................................................................................... 33
3.6 Metodología ................................................................................... 35
3.7 Consideraciones Éticas ................................................................. 35
CAPITULO IV
MARCO ADMINISTRATIVO .................................................................... 36
4. RECURSOS ......................................................................................... 36
4.1 Talentos Humanos ........................................................................ 36
4.1.1 Investigadores ............................................................................... 36
4.1.2 Tutor .............................................................................................. 36
4.1.3 Asesor Metodológico ..................................................................... 36
4.1.4 Asesor Científico ........................................................................... 36
4.2 Cronograma de Actividades .......................................................... 37
4.3 Recursos Técnicos ........................................................................ 38
ix
4.4 Recursos Financieros .................................................................... 38
CAPITULO V
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS .............................. 39
5. RESULTADOS ..................................................................................... 39
CAPITULO VI
DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ..................... 47
6.1 Discusión .......................................................................................... 47
6.1 Conclusiones ................................................................................. 54
6.2 Recomendaciones ......................................................................... 56
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................ 57
ANEXOS .................................................................................................. 61
CURRICULUM VITAE ............................................................................. 86
INVESTIGADOR 1 ................................................................................... 86
CURRICULUM VITAE ............................................................................. 87
INVESTIGADOR 2 ................................................................................... 87
x
CONTENIDO DE GRÁFICOS
Pág.
Gráfico 1. Distribución de Edad, Muestra General ................................... 39
Gráfico 2 Expresividad (%) de Marcadores Moleculares Usados.
Muestra General ...................................................................................... 40
Gráfico 3. Estadiaje Tumoral. Muestra general ........................................ 41
Gráfico 4. Subtipo Molecular por Inmunohistoquimica. Muestra
General .................................................................................................... 46
xi
CONTENIDO DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Agrupamiento según estadio ..................................................... 15
Tabla 2. Subtipos de Cáncer de Mama determinados por perfiles de
expresión génica ...................................................................................... 29
Tabla 3. Operacionalización y Definición de Variables ............................ 33
Tabla 4. Expresividad de HER2Neu (FISH) y Topoisomerasa 2A
(FISH) por grupo de edad ........................................................................ 40
Tabla 5. Grado histológico por tipo de tumor. Muestra general .............. 41
Tabla 6. Expresión de Estrógenos (Test de Allred) por Grado
Histológico ............................................................................................... 42
Tabla 7. Expresividad de HER2Neu (FISH) por grado histológico y
Estadiaje Tumoral .................................................................................... 43
Tabla 8. Expresividad de HER2NEU (IHQ) por grado histológico y
Estadiaje Tumoral .................................................................................... 43
Tabla 9. Expresividad de Topoisomerasa 2a (Fish) por Grado
Histológico y Estadiaje Tumoral ............................................................... 44
Tabla 10. Expresividad de HER2NEU (FISH), HER2 NEU (IHQ)
Topoisomerasa 2A (FISH) por expresividad de Test de Allred
(Estrógenos) ............................................................................................ 44
Tabla 11. Concordancia de expresividad entre HER2Neu (IHQ)
frente a HER2Neu (FISH) y Topoisomerasa 2A (FISH) ........................... 45
Tabla 12. Concordancia de expresividad entre HER2Neu (FISH) y
Topoisomerasa 2A (FISH). ...................................................................... 45
Tabla 13. Guía para lectura del FISH (Tomado del IncertoTOP2A
FISH pharmDx™ Nº de catálogo K5333 1era edición) ............................ 69
Tabla 14. Guía para recuento de señales de HER 2 FISH (Tomado
del IncertoHER2 FISH pharmDx™, Kit, Nº de catálogo K53334ta
edición) .................................................................................................... 76
xii
Tabla 15. Guía para interpretación de HER por Inmunohistoquimica
(Tomado del Incerto HERCEP TEST ™, Nº de catálogo K520415va.
Edición) .................................................................................................... 80
xiii
CONTENIDO DE ANEXOS
Anexo A ................................................................................................... 62
Anexo B ................................................................................................... 64
Anexo C ................................................................................................... 68
Anexo D ................................................................................................... 71
Anexo E ................................................................................................... 75
Anexo F ................................................................................................... 77
Anexo G ................................................................................................... 81
Anexo H ................................................................................................... 82
Anexo I ..................................................................................................... 83
xiv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE POSGRADO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA
Determinación de concordancia de expresividad de Her - 2 entre Inmunohistoquimica e Hibridizacion In Situ Fluorescente (FISH) y su relación con expresión de Topoisomerasa A2 en Carcinoma Invasor de Mama en el Hospital Carlos Andrade Marín. 2012-2013.
Autores: María Elisa Puertas, Wagner Andrés Naranjo Tutor: Sonia Tello
Junio 2014 RESUMEN
Antecedentes: El beneficio clínico de la determinación de amplificación del HER-2neu en cáncer de mama es bien aceptado; este protooncogen esta amplificado en 20-30%, y su determinación es importante para evaluar pacientes susceptibles a terapias individualizadas. Aunque la Inmunohistoquímica (IHC) es el método frecuentemente utilizado para evaluar la sobre-expresión, la Fluorescencia de Hibridación In Situ (FISH) es el "estándar de oro" y recientemente la Topoisomerasa2A ha sido implicada en la predicción de evolución clínica y respuesta a quimioterapia (antraciclinas). Objetivo: Establecer el grado de concordancia en la expresividad de Her2 entre Inmunohistoquímica e Hibridación In Situ Fluorescente y su relación con la Topoisomerasa2A. Diseño: Ensayo clínico no controlado de evaluación de prueba diagnóstica. Métodos: Servicio de Patología, Hospital Carlos Andrade Marín, Quito-2013. Se elaboraron 2 bloques de microarreglos tisulares con 60 muestras de pacientes con cáncer invasor de mama. De cada bloque se generaron 3láminas histológicas para H-E, FISH Her2neu y TOP2A.Las concordancias se evaluaron por repetitividad compleja e índice Kappa de Cohen; el desempeño diagnóstico de la Inmunohistoquímica para Her2 frente a la prueba de FISH se estableció mediante cálculo de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razones de verosimilud. Resultados: La concordancia de Her2neu por IHQ frente a FISH fue buena (KappaCohen=0.57), con alto porcentaje de falsos negativos 25,8%; bajo porcentaje de falsos positivos 7,1%. La Concordancia entre Topoisomerasa2A y el Her2neu FISH no fue relevante (Kappa Cohen=0.013). Conclusiones: Existe variabilidad entre la IHQ y FISH, con importante porcentaje de falsos negativos, a pesar de la buena concordancia de estas técnicas, necesitando la confirmación con FISH y un control estandarizado de la técnica de IHQ. Descriptores: Cáncer de mama, Her2neu, Inmunohistoquímica, FISH, Topoisomerasa2A
xv
ABSTRACT Background: The clinical benefit of the determination of Her 2/neu
amplification, in breast cancer patients, its well accepted; this
protooncogen is amplificated in 20-30% of the breast tumors and this
determination is important to asses those patients who are sensitive of an
individualized therapy. Although the Inmunohistochemestry (IHC) is
frequently used to evaluate the overexpression, the Fluorescence In situ
Hybridization (FISH), is the gold standard and newly the expression of
Topoisomerasa 2A has been involved in the prediction of the clinical
evolution and the success of chemotherapy specific antraciclinas in the
breast cancer patients.
Objetive: Evaluate the correspondence of Her2neu in FISH and in
inmunohistochemical (IHC) and compare with the presence of
Topoisomerase 2A.
Design: Clinical non-controlled to assess diagnostic test.
Methods: Pathology Service, Hospital Carlos Andrade Marín, Quito-2013.
2 blocks of tissue micro arrangements were prepared with 60 breast
tumors. From each block, 3 histological plates were prepared, stained with
Hematoxylin- Eosin, Her2 neu FISH and TOP 2A FISH. The
correspondence between these different methodologies were evaluated by
complex repeatability and Cohen’s Kappa index, the diagnosis of
inmunohistochemical study to Her2 compared with the results of FISH
were established by sensibility, specificity, predictive values and
authenticity reasons.
Results: The concordance between Her2neu IHC and FISH was good
(Kappa Cohen=0.57), with high false negative 25,8%, and low false
positive 7,1%. The TOP2A correlates with Her2neu in a no relevant
maner.
Conclusion: It is a variability between IHC and FISH, with and an
important false negative percent, despite the good concordance between
the two technicals. Further quality control an standardization of IHC
technique.
KEY WORDS: Breast cancer, Inmunohistochismestry Her 2neu, FISH,
Topoisomerasa2A.
1
INTRODUCCIÓN
El cáncer de mama ha tenido un notable aumento de incidencia en los
últimos años, ocupando el primer lugar de incidencia de cáncer en la
mujer ecuatoriana, que claramente orienta a destinar mayores recursos
para su diagnóstico precoz y más aún para mejorar e individualizar el
tratamiento, consiguiendo terapias personalizadas, que permitan alcanzar
una mayor efectividad en el tratamiento e indirectamente mejorar la
expectativa de vida. (Dowsett M, y cools; 2003) (RegistroNacional de
Tumores, Globocan)
De esto parte el uso de terapias personalizadas enfocadas a su acción
molecular, como es la temática del presente proyecto de estudio en
cuanto a evaluar la amplificación y sobreexpresión de genes y proteínas
como el HER-2 neu y Topoisomerasa 2A ya que la administración del
ciertos medicamentos específicos, se ha convertido en opción terapéutica
importante, en neoadyuvancia de estos tumores. (LebeauA,DeimlingD,
Kaltz C; 2001)
La sobreexpresión del gen o su proteína se puede determinar por medio
de pruebas de Inmunohistoquímica o Hibridación In situ Fluorescente
(FISH) que representa la prueba de oro. (Tanner, M; Isola, J; 2006)
Con el fin de establecer la mejor estrategia para evaluar la amplificación
del protooncogen HER2 neu de pacientes con diagnóstico de cáncer de
mama en el presente estudiose valora el grado de concordancia en la
expresividad de Her2 neu entre Inmunohistoquimica e Hibridación In Situ
Fluorescente (FISH) y su relación con la expresión de Topoisomerasa 2A
y se compara con factores clínicos asociados; como el grado histológico,
el estadio patológico tumoral y la relación con la expresividad de
receptores de estrógenos y progesterona.
2
Con esto se pudo valorar la concordancia de estas dos pruebas en la
determinación de la expresividad del Her2neu y su relación con la
expresión de Topoisomerasa 2A aportando para evaluar a las pacientes
en cuanto a una terapia personalizada, mejor sobrevida y neoadyuvancia.
El presente estudio está estructurado por capítulos en los que constan la
justificación del tema así como el planteamiento del problema sus
objetivos e hipótesis, elementos del marco teórico que aclaran la temática
de estudio, sus variables, metodología, método de análisis, resultados,
conclusiones y finalmente recomendaciones. Además de la parte
administrativa con los recursos a utilizar y el cronograma a seguir.
Finalmente la Bibliografía y Anexos que detallan técnicas y pruebas de
laboratorio empleadas.
Si bien es cierto son pruebas de alto nivel, hoy en día se han convertido
en punto clave del manejo de muchas neoplasias y que se están cada vez
más implementando en los laboratorios de patología, que al tener la
infraestructura y personal capacitado tienen alta sensibilidad y
especificidad.
3
JUSTIFICACIÓN
La importancia de la determinación de la amplificación de Her2, radica en
que aquellas pacientes con cáncer de mama en estadios avanzados de la
enfermedad y que además presentan amplificación de Her2 tienen una
mayor resistencia a los tratamientos convencionales de quimioterapia y
tratamiento hormonal, además de una menor tasa de supervivencia. Sin
embargo, responden mejor al tratamiento combinado de quimioterapia con
fármacos inhibidores del Her2 (trastozumab), aumentando la tasa de
supervivencia. (Salido, M; Sole, F; y cols; 2002)
La amplificación y sobreexpresión del HER-2neu en el carcinoma de
mama están asociadas a un curso clínico adverso, a un menor tiempo de
sobrevida libre de enfermedad y de sobrevida total, incluso un aumento
del riesgo de recurrencia y reducción de las expectativas de vida. (Salido,
M; Sole, F; y cols; 2002)
Existe sobreexpresión de HER2/neu esperada en el 20 a 30% de los
carcinomas de mama. En más del 90% de los casos, la sobreexpresión de
la proteína se debe a la amplificación del gen, y puede determinarse por
la evaluación de la proteína mediante Inmunohistoquímica (IHQ) o
determinando el número de copias del gen por Hibridación In Situ con
Fluorescencia (FISH) que es la prueba de oro.(Petit, T; Wilt, M; y cols;
2004)
Dado que la efectividad del tratamiento con el agente especifico contra el
HER-2neu, viene dada por la amplificación del gen más que por la
sobreexpresión Inmunohistoquímica es importante asegurar esta
expresión. En nuestro medio teniendo en cuenta que solo se envía a FISH
(prueba de oro) los resultados por Inmunohistoquimica que son,
2+(equívocos), se han reportado casos de Her2 por Inmunohistoquimica 0
y 1+ (Negativos), que resultan ser finalmente FISH positivos, así como
4
Herceptest 3+(positivos) con FISH negativos.(Durbecq, V; Desmed, C; y
cols; 2204)
Existen estudios que demuestran que puede ocurrir una discordancia
entre la expresión por IHQ y amplificación por FISH en 3 a 15%. La
Hibridización In Situ detectada por fluorescencia es la prueba estándar de
referencia para determinar la amplificación del gen HER-2; con una
sensibilidad de 96,5% y una especificidad de 100%. (Salido, M; Sole, F; y
cols; 2002)
Es importante anotar que existen en el mercado muchos anticuerpos para
determinar la sobreexpresión del HER-2 por IHQ que difieren en su
sensibilidad y están sujetos a variación por el procesamiento y se pueden
tener falsos positivos o negativos, su precisión está sujeta a la
sensibilidad de la prueba y el método de evaluación utilizado para
interpretar los resultados.(Durbecq, V; Desmed, C; y cols; 2204)
Recientemente la expresión de la Topoisomerasa2A (TOP2A) ha sido
implicada en la predicción de la evolución clínica y la respuesta a la
quimioterapia en cáncer de mama. (Thomson, TA; Hayes, MM; y cols,
2001).Se indica como método auxiliar para predecir una supervivencia sin
recidivas en pacientes con cáncer de mama de alto riesgo que reciben
quimioterapia complementaria con antraciclinas.(Petit, T; Wilt, M; y cols;
2004)
Esta detección de la amplificación de la TOP2A, sirve como indicador de
pronóstico poco favorable en pacientes con alto riesgo. Los datos de
estudios demuestran las implicaciones pronosticas de la amplificaciones y
delecciones de la TOP2A; las pacientes con amplificaciones tienen
significativamente pobres resultados en comparación con las pacientes
sin esta amplificación. ( Knoop, A; Knudsen, H; y cols; 2006). Los factores
pronósticos están en relación a la sobrevida y al tratamiento con
quimioterapia ya que la TOP2A es objetivo de diversos agentes
quimioterápicos, como antraciclinas tipo doxorubicina y epirubicina, estos
5
constituyen básicamente inhibidores de la Topoisomerasa. (Järvinen, TA;
Tanner, M; y cols; 2000)
Un papel importante, de los resultados de los pacientes con cáncer de
mama tanto para Her2 y Topoisomerasa 2A es que curiosamente un alto
porcentaje de tumores primarios de mama con amplificación de
Her2también muestran alteración de otros genes como la Topoisomerasa
2A. Estos datos sugieren que la expresión de la Topoisomerasa 2A y de
la proteína HER2 independientemente podría predecir el resultado clínico
en cáncer de mama. (Durbecq, V; Desmed, C; y cols; 2004)
Aunque los genes HER2 y TOP2A se localizan en el mismo amplicón y si
bien algunos estudios se han centrado en la multiplicación simultánea de
los genes (Tanner, M; Isola, J; y cols; 2006), otros estudios han
demostrado que los genes se deberían analizar en forma independiente y
someter a prueba por separado; como lo hemos hecho en este estudio.
(Järvinen, TA; Tanner, M; y cols; 2000)
6
CAPITULO I
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
El cáncer de mama ocupa el primer lugar de incidencia en mujeres, según
el Globocan 2008, manteniéndose igualmente en el 2012 en primer lugar
con una incidencia de 32.3 y mortalidad de 9.8 por 100.000 habitantes.
Según los últimos datos del Registro Nacional de Tumores Solca Quito, el
Cáncer de mama en Quito (2006-2009) ocupa el primer lugar en
incidencia en la mujer con un 33.3, seguido de Cuenca, Guayaquil y Loja.
A nivel Nacional en el 2013 se diagnosticaron 1890 casos con una tasa de
23,8, ocupando igualmente el primer lugar en mujeres (Tasa cruda
x100.000). (Registro Nacional de Tumores)
La incidencia de cáncer de mama se ha duplicado en veinte años. El
INEC en el 2012 obtuvo 513 defunciones de mujeres por cáncer de
mama, ubicándose en tercer lugar de defunciones por cáncer en general
de un total de 28.197 defunciones.
Este aumento de la incidencia claramente orienta a destinar mayores
recursos para el diagnóstico precoz de cáncer de seno y más aún para
mejorar e individualizar el tratamiento, consiguiendo terapias
personalizadas que permiten alcanzar una mayor efectividad en el
tratamiento e indirectamente mejorar la expectativa de vida en la
población afectada. (Dowsett M, y cools; 2003) (Registro Nacional de
Tumores 2005)
La administración del ciertos medicamentos específicos e individualizados
se ha convertido en opción terapéutica importante en neo adyuvancia de
tumores HER2+, puesto que se ha demostrado que puede lograr la
reducción del tumor hasta en un 40%, respecto a aquellas pacientes a las
7
que no se les suministra estos fármacos; (Buzdar, AU; y cools; 2005) y al
utilizarlo junto con quimioterapia se pueden obtener mejorías en un 12%,
en términos de supervivencia libre de enfermedad y hasta un 52% menos
de recaídas y una disminución del 33% en la mortalidad (Romond, EH; y
cools; 2207)
Con el fin de establecer la mejor estrategia para evaluar el HER-2 / neu
numerosos estudios han comparado los resultados de los dos métodos de
ensayo aprobados por la FDA (Inmunohistoquimica y FISH). (Dowsett M,
y cools; 2003). La discordancia entre la exactitud de la proteína HER-2
determinada por IHQ y la amplificación de genes determinados por FISH;
ha suscitado un amplio debate en los últimos años. Múltiples estudios han
determinado una muy buena correlación (88 al 100%) entre la HER-2/neu
evaluados por FISH e IHQ cuando el score es: 0, 1 + y 3 + pero es menos
predictivo para el escore 2+, en que por FISH detecta únicamente un 10 a
30%. (Salido, M; Sole, F; y cols; 2002). Siendo la mayoría de resultados
por IHQ, 2+falsos positivos en términos de pronóstico y relevancia
terapéutica. (Barrett C; Magee H; y cools; 2007)
Además la cuantificación de la expresión de la Topoisomerasa 2A en las
pacientes con cáncer de mama tiene también un papel en la terapéutica
personalizada; ya que su grado de expresión determina la resistencia o
sensibilidad al tratamiento quimioterapéutico con ciertos fármacos
específicos (antraciclinas). (Salido, M; Sole, F; y cols; 2002). La Top2A es
diana de antraciclinas como doxorubicina y epirubicina, que se usan en la
quimioterapia, y se denominan inhibidores de la Topoisomerasa. Las
Antraciclinas es uno de agentes citotóxicosmas utilizados para el
tratamiento de cáncer de mama.(Järvinen, TA; Tanner, M; y cols; 2000)
Con este antecedente el presente estudio valora la concordancia de
Inmunohistoquimica y FISH en la determinación de la amplificación del
protooncogen HER2 neu de pacientes con cáncer de mama y la compara
con factores clínicos asociados; como el grado histológico, el estadio
8
patológico tumoral, y su relación con la Topoisomerasa2A recientemente
usada también como factor pronóstico en estas pacientes
Por lo que nos hacemos la siguiente interrogante específica:
¿Existe Concordancia entre la expresión de Her 2 por
Inmunohistoquímica e Hibridización in situ Fluorescente (FISH), y su
relación con la expresión de la Topoisomerasa A2, en pacientes con
diagnóstico de carcinoma invasor de mama en el Hospital Carlos
Andrade Marín?
1.2 Hipótesis
La concordancia para determinar la expresividad de Her2 en biopsias de
pacientes con diagnóstico de carcinoma invasor de mama entre
Inmunohistoquimica e Hibridación In Situ Fluorescente es alta y se
relaciona con la expresión de Topoisomerasa 2A.
9
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo general
Establecer el grado de concordancia mediante la valoración de
la expresividad de Her2neu por Inmunohistoquimica frente a
hibridación in situ fluorescente y su relación con la expresión de
Topoisomerasa2A en pacientes con carcinoma invasor de
mama.
1.3.2 Objetivos específicos
Determinar el grado de expresión del gen Her2neu y
Topoisomerasa2A en relación con la edad de los pacientes.
Determinar el grado de expresión del gen Her2neu y su relación
con el grado histológico tumoral.
Determinar el grado de expresión del gen Her2neu y su relación
con el estadiaje histopatológico.
Determinar el grado de expresión de Topoisomerasa2A y su
relación con el grado histológico tumoral.
Determinar el grado de expresión de Topoisomerasa2A y su
relación con el estadiaje histopatológico.
Determinar el grado de expresión del gen Her2neu y
Topoisomerasa2A en relación con la expresividad de receptores de
estrógenos.
Determinar el grado de expresión del gen Her2neu y
Topoisomerasa2A en relación con la expresividad de receptores de
progesterona.
Determinar el Subtipo Molecular por Inmunohistoquimica usado
como marcador indirecto, en los tumores estudiados y su relación
con la amplificación de la TOPO2A.
10
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2. MARCO REFERENCIAL, TEÓRICO Y CONCEPTUAL
2.1 Cáncer de Mama
El cáncer de mama es el crecimiento desenfrenado de células malignas
en el tejido mamario. (Rosen, PP; 2001).
Los principales factores de riesgo incluyen edad avanzada, menarquía
temprana, menopausia tardía, ser nulípara o edad avanzada en el
momento del primer parto, antecedentes familiares de cáncer de mama,
consumo de hormonas como estrógenos y progesterona, ser de raza
blanca. Entre 5 a 10 % de los casos, el cáncer de mama es causado por
mutaciones genéticas heredadas del BRCA1 y BRCA2, existen también el
carcinoma mamario esporádico, es decir sin antecedentes familiares entre
el 70 y el 80% de los casos, y el familiar, con antecedentes familiares,
pero no atribuibles a genética. 15-20%. (Robins; 2010)
Los síntomas del cáncer de mama pueden incluir la presencia de masa
en la mama, cambio de tamaño o forma de la mama, secreciones por el
pezón. El autoexamen y la mamografía pueden ayudar a diagnosticar el
cáncer de mama precozmente. (Robins; 2010)
Para detectar el cáncer de mama, se utilizan diferentes pruebas como
mamografía, ultrasonido mamario (ecografía), o imágenes por resonancia
magnética. (Robins; 2010)
El diagnóstico de cáncer de mama sólo puede adoptar el carácter
definitivo por medio de una biopsia mamaria guiada por eco. Si no es
posible, se pueden hacer biopsias incisionales o excisionales. (Robins;
2010)
11
2.2 Epidemiología del Cáncer Mamario
La prevalencia del cáncer de mama en Ecuador entre 1998 y el 2002
ocupó el segundo lugar con un 27% del total respecto a otros tipos de
cáncer. En el 2002 la incidencia de cáncer de mama ocupó el tercer lugar
después del cáncer cervico-uterino y de estómago. Actualmente el cáncer
de mama ocupa el primer lugar de incidencia en mujeres, según el
Globocan 2008, manteniéndose igualmente en el 2012 en primer lugar
con una incidencia de 32.3 y mortalidad de 9.8 por 100.000 habitantes.
Según los últimos datos del Registro Nacional de Tumores Solca Quito, el
Cáncer de mama en Quito (2006-2009) ocupa el primer lugar en
incidencia con un 33.3, seguido de Cuenca con 24, Guayaquil 22,9 y Loja
21.9. A nivel Nacional en el 2013 se diagnosticaron 1890 casos con una
tasa de 23,8, ocupando igualmente el primer lugar en mujeres (Tasa
cruda x100.000). (Registro Nacional de Tumores)
La incidencia de cáncer de mama se ha duplicado en veinte años. El
INEC en el 2012 obtuvo 513 defunciones de mujeres por cáncer de mama
ubicándolo en tercer lugar de defunciones por cáncer en general de un
total de 28.197 defunciones. (INEC 2012)
La tasa de incidencia por edades muestra un aumento del riesgo a
desarrollar cáncer de seno a partir de los 35-40 años con un incremento
de la incidencia por encima de 80 por 100.000 a partir de los 45 años
llegando a tasas de 140 por 100.000 en las edades comprendidas entre
60 y 64 años. (Registro Nacional de Tumores 2005)
En décadas anteriores el Ecuador ocupó el puesto 49 en cáncer de mama
en cuanto a frecuencia al compararlo con otros países de Latinoamérica,
actualmente ocupa el puesto 56 y sigue incrementándose en
aproximadamente un 0.6% anual (Registro Nacional de Tumores 2005)
El cáncer de mama junto con el cáncer uterino es la principal causa de
muerte en mujeres entre los 35 y 64 años en América Latina.
(Organización Panamericana de la Salud)
12
En América Latina se registraron cerca de 90.000 casos de cáncer de
mama en el año 2000. En los últimos años las tasas de incidencia han
aumentado anualmente en un 5% en los países de bajos
recursos. (Organización Panamericana de la Salud)
En cuanto a la mujer Norteamérica, el cáncer de seno es la patología que
causa más muertes que cualquier otra enfermedad maligna. Cada año en
los Estados Unidos cerca de 200,000 nuevos casos se diagnostican y
40,000 muertes se atribuyen a esta enfermedad. Cerca de 1 de cada 14
mujeres americanas desarrollarán cáncer de mama durante su vida y este
porcentaje tiene una gran expectativa de aumento. (Varshney, D; Zhou,
YY; y cols; 2004)
2.3 Clasificación: Tipo Histológico y Grado Tumoral
Dentro de la patología mamaria en general y del Cáncer de Mama en
particular existen dos tipos de clasificaciones que son imprescindibles
conocer: una es la Clasificación Patológica de los Tumores y la otra es la
Clasificación Clínica TNM.
La clasificación de los tumores en general ha evolucionado
considerablemente a través de los tiempos, sin embargo la clasificación
que se usa hoy en día no difiere mucho en sus características principales
de la que se usaba hace mucho tiempo. (Rosen, PP; 2001).
Cáncer no invasivo In Situ(Intraepitelial) confinado en la luz de los
ductos o de los lobulillos glandulares
- Cáncer lobulillar
- Cáncer ductal
Cáncer invasivo o infiltrante
- Carcinoma Ductal : originado en conductos mamarios
13
- Carcinoma Tubular: altamente diferenciado, células regulares y
ordenadas en túbulos definidos.
- Carcinoma lobulillar: originado en los lobulillos.
- Carcinoma Papilar: 1 a 2%, conformado microscópicamente por
frondas.
- Carcinoma Medular: microscópicamente consta de reacción
linfoplasmocitica, circunscripción microscópica, crecimiento en
láminas, grado nuclear mal diferenciado, mitosis alta.
- Carcinoma con Metaplasia: crecimiento no glandular, escamoso y
heterólogo o metaplasiapseudosarcomatosa.
- Carcinoma escamoso: queratinizante primario de la mama
- Carcinoma Mucinoso: Acumulacion de mucina extracelular mas del
40%
- Carcinoma Apocrino: características manifestadas en el núcleo y
citoplasma.
- Carcinoma de Células Pequeñas en Avena: positivos para Enolasa
Neuronal Especifica
- Carcinoma Secretor: espacios micro quísticos con secreción
abundante.
- (Rosen, PP; 2001).
Clasificación TNM
El sistema de estadificaciónTNM para el cáncer de mama se basa en el
tamaño del tumor (T), si el tumor se ha diseminado a los ganglios
linfáticos (N), y si el tumor se ha metastatizado (M). Los tumores de
mayor tamaño, de propagación nodal y metástasicos tienen un mayor
número de estadiaje y un peor pronóstico. (Derek C Allen; 2006)
14
TX Tumor Primario no valorable
T0 No evidencia de tumor primario
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor hasta 2 cm en su diámetro mayor
T1a Tumor hasta 0.5 cm en su diámetro mayor
T1b Tumor >0.5 cm pero no > 1 cm
T1c Tumor >1 cm pero no >2 cm
T2 Tumor >2 cm pero <5 cm en su diámetro mayor
T3 Tumor >5 cm en su diámetro mayor
T4 Tumor de cualquier tamaño con extensión directa a la pared torácica o
piel
T4a Extensión a la pared torácica (costillas, intercostales o serrato
anterior)
T4b Piel de naranja, ulceración, o nódulos cutáneos satélites
T4c =T4a + T4b
T4d Cáncer inflamatorio de la mama
Nódulos linfáticos regionales
NX Nódulos linfáticos regionales no valorables
N0 No Nódulos linfáticos regionales involucrados
N1 Metástasis a ganglios axilares ipsilaterales móviles
N2 Metástasis a ganglios axilares ipsilaterales fijos unos a otros o a otras
estructuras
N3 Metástasis a ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales
15
Metástasis Distantes
MX No presencia accesible de metástasis distantes
M0 No metástasis distantes
M1 Existencia de metástasis distantes (incluyendo ganglios
supraclaviculares ipsilaterales) (Derek C Allen; 2006).
Tabla 1. Agrupamiento según estadio
Estadio I
T1* N0 M0
Estadio II A
T0 N1 M0
T1* N1 M0
T2 N0 M0
Estadio II B
T2 N1 M0
T3 N0 M0
Estadio III A
T0 N2 M0
T1* N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1, N2 M0
Estadio III B
T4 N0, N1, N2 M0
Estadio III C
Cualquier T N3 M0
Estadio IV
Cualquier T Cualquier N M1
T* incluye T1mic
Rosen, PP. (2001). Patología Mamaria de Rosen. Estados Unidos:
AMDLCA.
Grado Histológico tumoral
Para determinar el grado histológico tumoral es decir la variación de las
células cancerosas comparadas con las células normales, se toma como
referencia el Sistema Scarff-Bloom-Richard (SBR) que considera 3
parámetros en cuanto a la formación de túbulos, grado nuclear y número
de mitosis y a cada uno asigna un puntaje de 1 a 3, como sigue:
16
- Formación de túbulos
75% o más = 1 punto
10 a 75% =2 puntos
Menos del l0%= 3 puntos.
- Grado nuclear
Núcleo pequeño, uniforme escasa variación = 1 punto
Núcleo mayor que uno normal, cromatina en grumos, nucléolo aparente,
variaciones importantes en tamaño= 2 puntos.
- Número de mitosis.
0 a 9 mitosis por 10 campos = 1punto
10 a 19 mitosis = 2 puntos
20 o más = 3 puntos
Con esto finalmente se asigna un grado de diferenciación al tumor:
3 a 5 = Grado 1 Bien diferenciado
6 y 7= Grado 2 Moderadamente diferenciado
8 y 9= Grado 3 Pobremente diferenciado (Derek C Allen; 2006)
2.4 Her-2 y Cáncer de Mama
El protooncogen Her2 conocido también como neu o ErbB2, pertenece a
la familia de receptores celulares de membrana ErbB con actividad
tirosinquinasa en su dominio intracitoplasmático codifica una glicoproteína
de 185kDa y se localiza en la región cromosómica 17q12-212. (Buzdar,
AU; y cools; 2005).
Su parte extracelular es un receptor que interacciona con un factor de
crecimiento todavía no identificado. Su zona intracelular tiene actividad
tirosin-quinasa. La estimulación del receptor activa la región tirosin-
17
quinasa que fosforila a una serie de proteínas citoplasmáticas
transmitiendo una señal estimuladora al interior de la célula. . (Buzdar,
AU; y cools; 2005).
La amplificación del gen Her2 se ha encontrado en el 25 al 30% de los
tumores de mama estudiados. Este aumento de la expresión se asocia
con un pronóstico adverso un aumento del riesgo de recurrencia y
reducción de las expectativas de vida. Varios estudios demuestran que el
estado en cuanto a HER2 está correlacionado con la sensibilidad o
resistencia a determinados regímenes quimioterapéuticos (Barrett C,
Magee H; y cools, 2007)
Slamon y colaboradores fueron los primeros en observar una relación
significativa entre la amplificación del oncogén Her2 y el desarrollo de un
mal pronóstico en las pacientes con cáncer de mama. (Bhargava, R;
Beriwal, S; y cols; 2007)
En estudios retrospectivos se ha puesto de manifiesto que en aquellas
pacientes con cáncer de mama que presentan amplificación de Her2
existe una gran probabilidad de susceptibilidad al tratamiento con
trastozumab. (Nistor A, Watson P; y cols; 2006)
2.5 Significado biológico de la activación de HER-2
Existen muchas evidencias in vitro que apoyan que la activación de HER-
2 confiere una mayor agresividad biológica a las células del cáncer de
mama. (Barrett C, Magee H; y cools, 2007)
La gran mayoría de estudios apoya la idea que la activación de HER-2 se
asocia a un pronóstico peor en las pacientes con cánceres de mama y
metástasis ganglionares. Sin embargo existe una controversia en relación
al significado pronóstico de esta alteración en las pacientes con ganglios
negativos. En los últimos años se ha postulado que la activación de HER-
2 podría ser de gran utilidad en la valoración de sensibilidad de los
tumores a la administración de ciertos fármacos como adriamicina,
18
resistencia a tamoxifeno o indicación de tratamiento con Trastozumab
(Herceptin).. (Nistor A, Watson P; y cols; 2006)
2.6 Métodos de estudio de la activación de HER-2 y su
Interpretación
Existen varios métodos para valorar la activación de HER-2.
EL HER-2 se activa por amplificación génica esto quiere decir que las
células tumorales tienen un número mayor de copias del gen en relación a
las células normales. (Barrett C, Magee H; y cools, 2007)
En las células el exceso de copias del gen se corresponde con un
aumento en los niveles de RNA mensajero de HER-2 y se traduce en un
aumento en los niveles de la proteína codificada por HER-2 permitiendo
entonces emplear distintos métodos para valorar su evaluación; métodos
de estudio de DNA, RNA mensajero o de proteínas. (Thomson TA, Hayes
MM; y cools, 2001)
El método de Inmunohistoquimica, que básicamente consiste en una
reacción antígeno anticuerpo usando un Kit especifico con un reactivo
que consta tanto de moléculas secundarias de inmunoglobulina
marcadas, que producen una reacción cruzada del reactivo provocando la
formación de un producto de reacción visible en el lugar del antígeno.
Entonces, el espécimen puede someterse valoración. (ANEXO F). Los
resultados se interpretan utilizando un microscopio óptico, con
puntuaciones de intensidad de tinción de 0, 1+ y 3+ se suministran para
validar las secuencias de tinción. La intensidad de tinción de estas líneas
celulares se ha relacionado con el número de receptores por célula.
(ANEXO F). Utilizando la siguiente escala según el patrón de tinción:
0: negativo. No se observa tinción o la tinción en la membrana en menos
del 30% de las células del tumor.
1+: Negativo. Tinción leve apenas perceptible en más del 30% de células.
Solo se tiñe parte de la membrana celular.
19
2 +: Positivo. Tinción leve a moderada de la membrana completa en más
del 30% de las células del tumor.
3+: Positivo. Tinción intensa en la membrana completa en más del 30%
de las células del tumor. (ANEXO F)
Dentro de los análisis basados en DNA se cuentan: el Southernblot, la
Hibridación in situ fluorescente (FISH) y la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). La técnica de mayor sensibilidad y considerada como
el estándar de oro es FISH. Para esto se usa un especial para llevar a
cabo un procedimiento FISH con cortes de tejido fijados con formol e
incluidos en parafina, en este kit se utiliza una Mezcla de sondas FISH
basadas en una combinación de tecnología de ANP (ácido nucleico
peptídico) y de ADN. La Mezcla de sondas se compone de una mezcla de
sondas de ADN marcadas con rojo Texas que cubren una región de 218
kb en el gen HER2 del cromosoma 17, así como una mezcla de sondas
de ANP marcadas con fluoresceína específicas para la región
centromérica del cromosoma 17 (CEN-17). (ANEXO D)
Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia. Se
localizan las células cancerígenas y luego se las evalúa teniendo en
cuenta la proporción de señal HER2/CEN-17.
Se usa un patrón o escala y se calcula de la relación HER2/CEN-17
dividiendo total de señales rojas de HER2 entre total de señales verdes
de CEN-17.
Relación HER2/CEN-17 igual o superior a 2 son positivas para
amplificación del gen HER2 (ANEXO E)
2.7 Relación de la amplificación de Her2 mediante FISH y el
Herceptest
La correlación es buena (100%) para los casos negativos (Herceptest 0 o
1+) y para los casos claramente positivos (Herceptest 3+) sin embargo
existen discrepancias en el grupo intermedio (Herceptest 2+) en las que
20
las técnicas de FISH sólo detectan amplificación en un 10% de los casos.
Estas discrepancias pueden ser debidas a problemas de sensibilidad del
Herceptest (que detecte expresión no atribuible a amplificación) del FISH
(que sea poco sensible en la detección de amplificaciones de bajo nivel) a
ambas o que simplemente refleje el hecho que ambas técnicas estudian
elmismo fenómeno desde perspectivas distintas (DNA y proteínas)
(Thomson, TA; Hayes, MM; y cols, 2001).
El 90% de la sobreexpresión es causada por una amplificación genómica;
sin embargo puede ocurrir una discordancia entre la expresión y
amplificación en 3 a 15%. (Bhargava, R; Beriwal, S; y cols; 2007). La
hibridizaciónin situ detectada por fluorescencia (FISH) es la prueba
estándar de referencia para determinar la amplificación del gen HER-2
con una sensibilidad de 96,5% y una especificidad de 100%. La
sobreexpresión de la proteína HER-2 es determinada por
inmunohistoquímica. No obstante existen en el mercado muchos
anticuerpos para determinar la sobreexpresión del HER-2, que difieren en
su sensibilidad y están sujetos a variación por el procesamiento. La
principal ventaja de la inmunohistoquímica sobre el FISH es que es más
rápida, más económica y puede ser hecha de rutina en los laboratorios de
patología. .(Thomson, TA; Hayes, MM; y cols, 2001)
Sin embargo su precisión está sujeta a la sensibilidad de la prueba y el
método de evaluación utilizado para interpretar los resultados. En el año
2000, mil casos en los Estados Unidos fueron erróneamente calificados
como positivos por la variabilidad de interpretación de los resultados de
amplificación/sobreexpresión de HER-2. Al evaluar 94 laboratorios se
encontró una concordancia inter observador de 86% para la
sobreexpresión del HER-2 cuando se utilizó la prueba de
inmunohistoquímica HercepTest. (Barrett C, Magee H; y cools, 2007)
La cantidad de receptores expresados en las células tumorales se refleja
en el patrón y la intensidad de marcación en la membrana celular. Los
criterios de HercepTest, DakoCytomation considera 0 cuando no se
21
observa marcación de membrana o está presente en menos de un 10%
de las células tumorales, 1+ cuando se observa una marcación parcial de
membrana débil en más de 10% de las células tumorales, 2+ si se
observa una marcación completa de membrana débil o moderada en más
de 10% de las células tumorales y 3+ cuando se observa una marcación
completa de membrana fuerte en más de 30% de las células
tumorales.(Thomson, TA; Hayes, MM; y cols, 2001)
2.8 Sobreexpresión de la Topoisomerasa 2A en cáncer de mama
La TOP 2A ha sido utilizada recientemente para detectar amplificaciones y
eliminaciones (modificaciones en la cantidad de copias) del gen TOP2A
mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en muestras
de tejido mamario humano cancerígeno fijadas con formol e incluidas en
parafina(Wang, JC;2002)
Esta situación de la expresión, de la topoisomerasa2A (TOP2A) ha sido
implicada en la predicción de la evolución clínica y la respuesta a la
quimioterapia en cáncer de mama. (Petit, T; Wilt, M; y cols; 2004)
Se indica como método auxiliar para predecir una supervivencia sin
recidivas en pacientes con cáncer de mama de alto riesgo que reciben
quimioterapia complementaria con epirubicina. (Nakopoulou, L; Lazaris,
AC; y cols; 2000)
La detección de la amplificación de la TOP2A sirve como indicador de
pronóstico poco favorable en pacientes con cáncer de mama de alto
riesgo. La utilidad clínica se ha visto en estudios realizados en por el
grupo Danés de cáncer de mama (DBCG) y en población Europea.
(Knoop, A; Knudsen, H; y cols; 2006)
Los datos de estos estudios demuestran las implicaciones pronosticas de
la amplificaciones y delecciones de la TOP2A; las pacientes con
amplificaciones tienen significativamente pobres resultados en
comparación con las pacientes sin esta amplificación. Los factores
22
pronósticos están en relación a la sobrevida y al tratamiento con
quimioterapia usando agentes a base de antraciclinas. (Knoop, A;
Knudsen, H; y cols; 2006)
El gen TOP2A codifica para la enzima topoisomerasa IIα (topo IIα) que
cataliza la ruptura y la nueva unión del ADN bicatenario lo que produce la
relajación de las superhélices del ADN. Las topoisomerasas de tipo II
sonenzimas esenciales que realizan una interconversión de las formas
topológicas del ADN provocando rupturas bicatenarias transitorias en la
cadena principal del ADN (Wang, JC; 2002). Estas enzimas tienen una
importante intervención en diversos procesos nucleares fundamentales
(Austin, CA; Marsh, KL; 1998) entre los que se incluyen: la duplicación,
trascripción, estructura cromosómica, condensación y la disociación del
ADN. En todas las células diploides normales se hallan 2 copias del gen II
de la topoisomerasa IIα, TOP2A, que se localiza en el cromosoma 17q21.
Este gen abarca un área de aproximadamente 27,5 kb y contiene 35
exones que codifican una proteína de 170 kDa (Sng, JH; Heaton,
VJ;1999)
La proteína topo II α ha sido reconocida como marcador de proliferación y
su expresión varia durante el ciclo celular; esta expresión se relaciona
también con el Ki67. Sólo el 20% de los casos de sobreexpresión de la
proteína topo IIα presenta amplificación del gen TOP2A; sin embargo
entre los casos de amplificación de este gen el 93% presentó
sobreexpresión de dicha proteína (Callagy, G; Pharoah, P; y cols; 2005).
Aparentemente diversos factores contribuyen a la sobreexpresión de la
proteína topo IIα tanto la amplificación específica del cáncer como la tasa
de proliferación celular elevada. Las proteínas Ki-67 y topo IIα se
expresan en paralelo lo cual se puede interpretar como una confirmación
de que la tasa de proliferación celular influye sobre la expresión de la
proteína topo Iiα (Callagy, G; Pharoah, P; y cols; 2005).
La Top II α es diana de antraciclinas como doxorubicina y epirubicina que
se usan en la quimioterapia y también se denominan inhibidores de la
23
topoisomerasa. Las Antraciclinas, uno de agentes citotóxicosmas
utilizados, para el tratamiento de cáncer de mama. (Järvinen, TA; Tanner,
M; y cols; 2000).
Se ha demostrado que la cantidad de copias del gen TOP2A influye sobre
la sensibilidad del tumor a los inhibidores de la topoisomerasa (Villman, K;
Sjostrom, J; y cols; 2006).
Para el procedimiento se usa un kit con los reactivos para llevar a cabo un
procedimiento FISH en cortes de tejido sometidos a procesos de rutina,
fijados con formol e incluidos en parafina, este kit emplea un FISH
ProbeMix en base a una combinación de tecnología con PNA (ácido
nucleico peptídico) y ADN. Este ProbeMix se compone de una mezcla de
clones de cósmidos de ADN marcados con Texas Red que abarcan un
total de 228 kb del amplicón del gen TOP2A y una mezcla de sondas de
PNA marcadas con fluoresceína dirigidas a la región centromérica del
cromosoma 17. La hibridación específica en estas dos dianas ocasiona la
formación de una señal roja fluorescente y nítida en cada amplicón del
gen TOP2A y una señal verde fluorescente y nítida en cada región
centromérica del cromosoma 17. (ANEXO B)
Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia. Se
localizan las células cancerígenas y luego se las evalúa teniendo en
cuenta la proporción de señal TOP2A/CEN-17; se considerará la
proporción TOP2A/CEN-17 igual o superior a 2 tienen amplificación del
gen TOP2A y aquéllas con una proporción TOP2A/CEN-17 inferior a 0,8
presentan eliminación del gen TOP2A (ANEXO C).
2.9 Co-expresión de c-erbB2 y Topoisomerasa 2A en cáncer de
mama
La situación de la expresión de la proteína c-erbB2 y más recientemente
de la topoisomerasa2A ha sido implicado en la predicción de la evolución
clínica y la respuesta a la quimioterapia en cáncer de mama ambas
proteínas se encuentran en el cromosoma 17q 21. (Thomson, TA; Hayes,
24
MM; y cols, 2001)Un papel importante de los resultados de los pacientes
con cáncer de mama tanto para el c-erbB2 y topoisomerasa 2A es que
curiosamente un alto porcentaje de tumores primarios de mama con
amplificación de c-erbB2
También muestran alteración de otros genes como la topoisomerasa 2A.
Estos datos sugieren que la expresión de la topoisomerasa 2A y de la
proteína c-erbB2 independiente podrían predecir el resultado clínico en
cáncer de mama. (Romond, EH; Pérez, EA; y cols 2005)
En uno de los estudios más recientes por el Grupo Cooperativo Danés de
Cáncer de Mama (DBCG, DanishBreastCancerCooperativeGroup) en
Copenhague, se registran amplificaciones del gen TOP2A en
aproximadamente el 10% de casos de cáncer de mama y eliminaciones
con igual frecuencia en los estudios se incluyen tanto los tumores HER2
positivos como negativos. (Knoop, A; Knudsen, H; y cols; 2006).
En un principio se suponía que la cantidad anormal de copias del
genTOP2A a consecuencia de la amplificación o eliminación, se limitaba a
los tumores con HER2 amplificado. Más recientemente se han detectado
modificaciones en la cantidad de copias del gen TOP2A en muestras de
tumores con el gen HER2 en estado normal (Järvinen, TA; Tanner, M; y
cols; 2000).
En el estudio DBCG se han hallado modificaciones del gen TOP2A en
casi el 60% de tumores primarios con HER2 amplificado, mientras que el
20% de los tumores con TOP2A anormal presentaban el HER2 en estado
normal. (Knoop, A; Knudsen, H; y cols; 2006).
Los hallazgos del estudio han sido confirmados por una investigación
canadiense que demuestra que el estado del gen TOP2A (amplificación o
eliminación) es un factor predictivo importante de los beneficios obtenidos
mediante el tratamiento con quimioterapia basada en la administración de
epirubicina(O'Malley, F; Chia, S; y cols; 2006).
25
Aproximadamente el 35% de los pacientes que participaron de este
estudio presentaban tumores con HER2 amplificado y se halló una
asociación estadísticamente considerable entre el estado del HER2 y las
anomalías del TOP2A (Pritchard, KI; Shepherd, LE; y cols; 2006).
Aunque los genes HER2 y TOP2A se localizan en el mismo amplicón y si
bien algunos estudios se han centrado en la multiplicación simultánea de
los genes el grupo Danés y otros estudios han demostrado que los genes
se deberían analizar en forma independiente y someter a prueba por
separado (Knoop, AS; Knudsen, H; y cols; 2005).
2.10 HER-2 positivo en cáncer de mama y su relación con grado
histológico tumoral, tamaño tumoral, TNM, estado de receptores
de estrógenos y progesterona
La sobreexpresión del HER-2 varía entre 20 y 30% de los carcinomas de
mama con un rango de 9 y 39%.(Hardisson,D; 2007). La mayor
concordancia entre la Inmunohistoquímica con el HercepTest y el FISH se
da en los casos negativos 0 1+ y positivo 3+. Un 15% de los casos
positivos 2+ no muestra amplificación genómica. (Salido, M; Sole, F; y
cols; 2002).
La sobreexpresión del HER-2 está asociada a otros factores como: la
menopausia, el grado histológico tumoral, infiltración linfoide, tamaño
tumoral, e inversamente asociada a la expresión de receptores de
progesterona y estrógenos. Así como el uso de agentes quimioterapicos
previos a la valoración de expresión del Her 2neu, pueden dar resultados
falsos positivos o negativos en las pruebas de Inmunohistoquimica y FISH
(Lebeau, A; Deimling, D; y cols 2001).
Los receptores de estrógenos y progestágenos se evalúan de acuerdoal
Score de Allred que considera dos parámetros: La Proporción de células
marcadas y la Iintensidad de las mismas.
26
-Proporción del Score:
0–1 1/100
2 1/10
3 1/3
4 2/3
5 1
-Intensidad del Score:
0= negativo
1= débil
2= intermedio
3= intenso
Total del Score:
PS+ IS = 0 a 8 Se considera positivo mayor o igual a 3
2.11 Clasificación Molecular del Cáncer de Mama, usando
Inmunohistoquimica como marcador indirecto
Teniendo como base el manejo de las pacientes con cáncer de mama, se
tiene que en los estadios tempranos, la cirugía es el tratamiento
fundamental, y asociado a la radioterapia, pueden controlar la enfermedad
en la gran mayoría de los casos. A pesar de esto, alrededor de un 30% de
las pacientes finalmente fallecerá debido a su diseminación. A fin de
erradicarlas micrometástasis y por consiguiente prologar el tiempo de
sobrevida, se desarrollaron las terapias coadyuvantes, tales como la
hormonoterapia y la quimioterapia. La decisión sobre qué pacientes
deben recibir estos tratamientos se establece considerando criterios
clínico-patológicos básicos, como la edad, tamaño del tumor, tipo y grado
histológico, compromiso ganglionar axilar, expresión de receptores de
estrógeno y progesterona, y del receptor HER2, que se han venido
desarrollando dentro de este marco teórico, sin embargo, estos criterios
en algunos grupos de pacientes, y muy particularmente en las pacientes
sin compromiso ganglionar axilar, no son buenos indicadores pronósticos
o de recidiva.(Cleator, S; Ashworth, A; 2004)
27
Considerando estos antecedentes, los esfuerzos pioneros de Perou y sus
colegas en 2000 para separar los distintos subgrupos basándose en
similitudes de los perfiles de expresión génica utilizando la plataforma de
microarreglos han sido acogidos con entusiasmo por la comunidad
médica y científica, con la esperanza que el nuevo enfoque proporcionará
nuevos conocimientos en la biología del cáncer de mama y puede afectar
las estrategias terapéuticas. La agrupación de alguna manera ha
evolucionado hasta convertirse en una clasificación molecular del cáncer
de mama. (Rosai, J; Ackerman, L; 2013)
El carcinoma de mama representa un grupo de tumores que muestra un
comportamiento biológico muy diverso y una gran variabilidad clínica. La
clasificación histológica actual de los carcinomas de mama no refleja la
heterogeneidad de los tumores en su comportamiento biológico ni permite
identificar los pacientes que presentarán mejores respuestas y beneficios
con las diferentes modalidades terapéuticas. (Perou, CM; Sørlie, T y Cols;
2000).
La contribución fundamental de los microarreglos de cDNA al estudio del
cáncer de mama ha sido develar la complejidad de los tipos histológicos
tradicionales, y que el cáncer mamario no es una simple enfermedad
derivada de un único progenitor. (Van´t, Veer LJ; Dai, H y cols; 2002).
Permitiendo identificar subgrupos de tumores más homogéneos que
presentan similar comportamiento clínico y sensibilidad a agentes
terapéuticos. Sin embargo, hay variabilidad de respuesta terapéutica entre
los tumores de un mismo grupo. (Goldhirsch, A; Glick, JH; cols 2005)
De acuerdo a los patrones de expresión génica, que se relacionan con el
pronóstico o con el riesgo de metástasis, se divide el cáncer de mama
molecularmente en 2 grandes grupos, basados en la positividad para el
receptor de estrógeno: i)neoplasias de bajo grado, para aquellas que
expresan receptores de estrógeno (RE) y progesterona (RP) y ii)
neoplasias de alto grado que no presentan RE y RP, pero en las cuales
28
hay sobrexpresión y/o amplificación de HER2.(Cleator, S; Ashworth, A;
2004)
Hay esfuerzos para utilizar la inmunohistoqumica, un panel que incluye los
anticuerpos de receptor de estrógeno, progesterona, HER2/neu,
citoqueratina 5/6, EGFR, Ki67, para asignar los tumores de los distintos
subtipos moleculares, Luminal A y B, HER2-positivo, Triple Negativo.
(Rosai, J; Ackerman, L; 2013)
Los carcinomas de mama de tipo luminal son los subtipos con mejor
pronóstico y se caracterizan por expresar el gen del receptor estrogénico,
genes asociados (LIV1 y ciclina D1) y queratinas de bajo peso molecular
(CK7, CK8, CK18, etc.), de forma semejante al epitelio luminal de los
conductos mamarios. Al expresar receptores de estrógenos (RE), estos
tumores pueden tratarse con tamoxifeno o inhibidores de la aromatasa
pero muestran una baja respuesta a la quimioterapia neoadyuvante. El
carcinoma de mama HER2-positivo muestra expresión aumentada de
genes asociados a c-erbB-2 y suele asociarse a otros marcadores de mal
pronóstico, incluyendo alteraciones de otros genes como Toposiomerasa
II alfa, GATA4, genes de angiogénesis y proteolisis. Aunque muestran
una mejor respuesta a la quimioterapia y cerca de 50% responde al
tratamiento con trastuzumab, el pronóstico es malo. El subtipo basal
caracterizado por la sobreexpresión de citoqueratinas características de la
capa basal (CK5/6, CK17) y la expresión de genes relacionados con la
proliferación celular. Estos tumores suelen presentar mutaciones en el
gen oncosupresor p53, sobre expresan el receptor del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR) y se caracterizan por la ausencia de
expresión de RE y de genes relacionados así como de HER2. Este
subtipo se asocia a la mutación BRCA1 y presenta el comportamiento
más agresivo a pesar de su alta sensibilidad a la quimioterapia. (Blows,
FM; Driver, KE; y cols; 2010).
29
Tabla 2. Subtipos de Cáncer de Mama determinados por perfiles de expresión génica
Schnitt S. Classification and prognosis of invasive breast cancer: From
morphology to molecular taxonomy, Breast Long Course. USCAP 2009, 261.
30
CAPITULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1 Diseño de la Investigación
Se realizó un ensayo clínico no controlado de evaluación de prueba
diagnóstica con la finalidad de establecer el grado de concordancia en la
expresividad de Her2 entre las técnicas de Inmunohistoquimica e
Hibridación In Situ Fluorescente y su relación con la expresión de
Topoisomerasa2A.
3.2 Universo, Población, Muestra
El Universo se conformó por muestras en bloque de parafina de pacientes
con tumores mamarios malignos, del Servicio de Patología del Hospital
Carlos Andrade Marín de la ciudad de Quito año 2012.
La muestra se ha calculado con la siguiente fórmula:
𝑛 =z2pq
B2
n= tamaño de la muestra
z= 1.96
p= Frecuencia esperada
q= 1-p
B= precisión menor admitida 10%
n = 60 casos
Como criterios de inclusión se tomaron muestras producto de
mastectomías, o cuadrantectomias de tumores mamarios, que fueron
preservadas en formol buferado (pH 7.0) y que contaron con muestra
suficiente para la ejecución de cortes representativos de la lesión, los
casos excluidos fueron aquellos que no cumplieron con esas
condiciones. Del total de casos, el 40% (n=24) fueron muestras
31
negativas para Her2 (0, 1+) por Inmunohistoquímica y las restantes
positivas con hallazgos 2+,o superior.
3.3 Plan de Análisis
La información requerida, se recopilo en un cuestionario específico
desarrollado para el efecto (Anexo G), a partir del cual se procedió al
análisis en SPSS v16.0.
Las variables cuantitativas fueron expresadas en promedios y
desviaciones estándar, en tanto que las cualitativas en frecuencias
simples y porcentajes. Las concordancias entre las diferentes
metodologías analizadas se evaluaron por repetitividad compleja e índice
Kappa de Cohen; además se establece el desempeño diagnóstico de la
Inmunohistoquímica para Her2 frente a la prueba de FISH para lo que se
calcula su sensibilidad, especificidad, valores predictivos y razones de
verosimilud. Las prevalencias de expresividad se expresaron en
porcentajes, acompañadas de su correspondiente intervalo de confianza
al 95%. Para el análisis inferencial entre variables cualitativas, se usó
prueba t de diferencia de proporciones para grupos no independientes,
aceptando como válido un nivel de significación del 95% (α=0.05).
32
3.4 Definición de variables
Matriz de Variables
Variable Dependiente:
Grado de expresión del gen Her 2 neu y de
Topoisomerasa 2A.
Variables moderadoras:
Edad
Grado Histologico
Receptores de Estrogenos y Progesterona
Estadio Patologico tumoral TNM
Condición de quimioterapia neoadyuvante
Subtipo Molecular por Inmunohistoquimica
Variable Independiente causal:
Tipo de tumor
33
3.5 Operacionalización y Definición de Variables que participan en
el estudio
Tabla 3. Operacionalización y Definición de Variables
Variable Definición Dimensión Indicador Escala
Tipo de tumor Patrones histológicos de tumores mamarios
Patrones histológicos
Patrones histológicos
Intraductal
Ductal
Lobulillar
Papilar
Medular
Secretor
Grado Histológico
Grado de variación de las células cancerosas comparadas con las células normales.
Grado de variación
Sistema Scarff-Bloom-Richardson (ductal). -Formación de túbulos. 3 puntos. -Grado nuclear. 3 puntos -Número de mitosis. 3 puntos
3 a 5 = Grado 1 Bien diferenciado 6 y 7= Grado 2 Moderadamente diferenciado 8 y 9= Grado 3 Pobremente diferenciado.
Grado de expresión del gen Her-2/ neu.
Presencia de sobre expresión del Protooncogen Her2
Sobre expresión del Protooncogen Her2
Inmunohistoquimica FISH .
Patrón de tinción -0: negativo. -1+: Negativo. -2+: .Equivoco, Dudoso -3+: Positivo. Calculo de la relación HER2/CEN-17, igual o superior a 2 son positivas para amplificación del gen HER2
Expresión de Topoisomerasa 2A
Nivel de expresión de la enzima topoisomerasa II , en las células con cáncer
Expresión de la enzima topoisomerasa II
Inmunohistoquimica. Índice de Tinción
Índice de Tinción (tinción nuclear) TOP2A/CEN-17 igual o superior a 2 tienen
34
Variable Definición Dimensión Indicador Escala
Edad Tiempo promedio transcurrido entre el nacimiento y el momento actual
Tiempo Años
Numérica
Grado Expresión de Receptores de Estrógenos y Progesterona
Expresividad de estrógenos y progesterona en células tumorales
Expresividad de estrógenos y progesterona
Score de Allred (Uso de reactivo Dako)
- Proporción del Score: - Intensidad del Score: Total del Score: PS+ IS = 0 a 8 Positivo mayor o igual a 3
Tamaño tumoral Medida del diámetro mayor de la lesión tumoral ex cisionada.
Diámetro mayor de la lesión
Centímetros Numérica
Estadio Patológico Tumoral.
Estimación del grado de extensión tumoral
Grado de extensión tumoral
TNM -Tumor -Nódulos linfáticos regionales -Metástasis Distantes
Condición de quimioterapia neoadyuvante
Antecedente de haber recibido quimioterapia previa
Antecedente tratamiento quimioterápico
Antecedente Presente Ausente
Subtipo Molecular por Inmunohistoquimica
Comportamiento de marcadores de Inmunohistoquimica en tumores mamarios
Comportamiento de marcadores para: Estrògenos, progesterona, Her2/neu
Inmunohistoquimica de R. Estrògenos, progesterona, Her2/neu
Luminal A, Luminal B, Her2 neu, Triple Negativo
35
3.6 Metodología
Los bloques de parafina de los casos seleccionados se obtuvieron del
Archivo del Servicio de Patología del Hospital Carlos Andrade Marín para
elaborar nuevos bloques mediante Microarreglos usando el equipo Quick
Ray® Master UATM-272 (Anexo A), los cuales contienen 30 casos por
bloque (corte de inclusión de 3mm), para posterior obtención de 2
laminillas y la realización de las pruebas con FISH; Topoisomerasa 2 A y
HER 2.
En las laminillas en las cuales se valoró TOP 2A y Her 2, se aplicó la
técnica de FISH usando los protocolos establecidos. (Anexos B, C y E)
Paralelamente a la ejecución de los análisis por FISH, se recuperaron del
Archivo, los reportes de Hercep Test por inmunohistoquímica ejecutadas
dentro de la rutina diagnóstica en los casos seleccionados usando
HercepTest TM (DAKO) (Anexo F).
Adicionalmente, se recopiló información de las historias clínicas de las
mujeres de los casos seleccionados, acerca de: Edad al diagnóstico,
expresividad de receptores Estrógenicos y Progestágenos en el tumor,
tipo y tamaño tumoral, así como el estadio Patológico tumoral
considerando el TNM (tamaño tumoral, compromiso ganglionar y
metástasis a distancia).
3.7 Consideraciones Éticas
El presente estudio respeta los principios fundamentales establecidos en
la Declaración de Helsinky II, sin embargo al no requerir la participación
directa de pacientes, no se solicitó consentimiento informado; pero se
solicitó la autorización correspondiente a los niveles Directivos del
Hospital Carlos Andrade Marín para que se permita el uso de la
información y muestras de archivo, con el compromiso tácito de mantener
la confidencialidad de la identidad de las mujeres cuyas muestras se
incluyeron en el estudio.
36
CAPITULO IV
MARCO ADMINISTRATIVO
4. RECURSOS
4.1 Talentos Humanos
El presente estudio contó con el soporte del Jefe de Servicio, Director de
Tesis y personal profesional médico y paramédico del Servicio de
Patología de Hospital Carlos Andrade Marín, así como con el soporte
técnico-metodológico del Instituto Superior de Postgrado de la Facultad
de Ciencias Médicas de la Universidad Central del Ecuador, Asesor
Metodológico e investigadores.
4.1.1 Investigadores
1) MD. María Elisa Puertas Bravo
2) Dr. Wagner Andrés Naranjo Salas
4.1.2 Tutor
Dra. Sonia Tello
4.1.3 Asesor Metodológico
Dr. Kleber Sáenz
4.1.4 Asesor Científico
Dr. Nicolàs Vivar
37
4.2 Cronograma de Actividades
Actividades Dic.
2012
Ene- Jun.
2013
Jul.- Agos
2013
Sept.
2013
Oct.
2013
Nov., Dic.
2013
Ene, Feb., Mar, Abr.
2014
Mayo, Junio,
2014
Agosto
2014
Diseño, presentación y corrección del proyecto de investigación
Selección de Casos para el estudio y recolección de información de Historias Clínicas y datos adicionales
Realización y Lectura de pruebas, FISH, Topoisomerasa2A y HER2
Creación y análisis de base de datos
Presentación y corrección del informe final
Defensa de Tesis
38
4.3 Recursos Técnicos
Equipos, materiales e instalaciones Cantidad Valor USD
Materiales de oficina
Ordenadores. 2
Hojas de Papel Bond 1000 $60
Lápices, Esferográficos, Borradores 10 $10
Toner Blanco y Negro, Color 4 $60
Artículos Científicos 4 $100
Empastados 4 $400
Insumos de laboratorio
Kit FISH topoisomerasa 2A DAKO 2
Kit Her- 2 FISH DAKO 2
Bloque de Microarreglos (equipo Quick Ray® Master UATM-272)
2
Tiras para hibridizador 4
Placas cargadas labor-glass 4
Laminillas cubreobjetos 24x50mm 4
Alcohol etílico, agua destilada 100ml
Microscopio de luz marca Nikon modelo Eclipse 80i
TOTAL $630
4.4 Recursos Financieros
Contó con el Financiamiento del Servicio de Patología del Hospital Carlos
Andrade Marín para los Kits de FISH HER 2, TOP 2A, insumos de
laboratorio, instalaciones y equipamiento médico.
El soporte Financiero de Gastos administrativos, costos de material de
oficina, imprevistos, movilización, a cargo de los investigadores.
39
CAPITULO V
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
5. RESULTADOS
Se estudiaron un total de 60 casos de pacientes con diagnóstico de
carcinoma invasor de mama. La edad promedio de las mujeres estudiadas
fue de 57.5 ± 11.8 años (Rango: 35 – 85 años). La distribución de edad se
muestra en el siguiente gráfico.
Gráfico 1. Distribución de Edad, Muestra General
La expresividad de los marcadores oncológicos usados, Her2neu,
TOPO2A, para la muestra general se muestra en el siguiente gráfico.
40
Gráfico 2 Expresividad (%) de Marcadores Moleculares Usados. Muestra General
El análisis de la expresividad de Her2Neu (FISH) y TOPO2A, por grupo de
edad, se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 4. Expresividad de HER2Neu (FISH) y Topoisomerasa 2A (FISH) por grupo de edad
Grupo de edad*
Her 2 FISHn(%)
Positivo Negativo No evaluable
< 50 años (n=16) 11 (68.8) 4 (25) 1 (6.2)
> 50 años (n=44) 19 (43.2) 23 (52.3) 2 (4.5)
Grupo de edad*
Topoisomerasa 2A FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
< 50 años (n=16) 3 (18.8) 12 (75) 1 (6.2)
> 50 años (n=44) 13 (29.5) 29 (65.9) 2 (4.5)
* p>0.05 – Chi cuadrado
50
23,326,7
45
51,7
68,3
5 5
25
Her2 Neu (Fish) Her2 Neu (IHQ) Topo Isomerasa 2A (Fish)
Positivo Negativo No evaluable Equívoco
41
En cuanto al tipo histológico de tumor estudiado el 95% fueron Ductal
Infiltrante (n=57), seguido de un 3.3% de casos de Lobulillar Infiltrante
(n=2) y un solo caso (1.7%) de Papilar Infiltrante. El grado histológico por
tipo de tumor estudiado se muestra en la siguiente tabla:
Tabla 5. Grado histológico por tipo de tumor. Muestra general
Tipo de tumor
Grado Histológico n(%)
Bien diferenciado Grado 1
Moderadamente diferenciado
Grado 2
Pobremente diferenciado
Grado 3
Ductal infiltrante (n=57) 5 (8.8) 34 (59.6) 18 (31.6)
Lobulillar infiltrante (n=2) ---- 2 (100) ----
Papilar infiltrante (n=1) ---- ---- 1 (100)
En cuanto al estadiaje tumoral los estadios IA y IIA fueron los más
frecuentes (Gráfico 3).
Gráfico 3. Estadiaje Tumoral. Muestra general
26,7 26,7
20
10
1,7
15
0
5
10
15
20
25
30
IA IIA IIB IIIA IIIC IV
%
Estadiaje tumoral (TNM)
42
En relación con el antecedente de quimioterapia, el 31.7% (n=19) lo
recibieron.
Al analizar la expresividad de estrógenos y progesterona empleando el
test de Allred, el 63.3% (n=38) lo mostraron positivo. El comportamiento
del test de Allred en relación con el grado histológico, se muestra en la
siguiente tabla.
Tabla 6. Expresión de Estrógenos (Test de Allred) por Grado Histológico
Grado Histológico*
Test de Allred (Estrógenos)
Positivo Negativo
Bien diferenciado (n=5) 5 (100) ---
Moderadamente Diferenciado (n= 36) 28 (77.8) 8 (22.2)
Pobremente Diferenciado (n=19) 5 (26.3) 14 (73.7)
Total (n=60) 38 (63.3) 22 (36.7)
* p<0.05 – Chi cuadrado.
El análisis de la expresividad de Her2neu (FISH) e Inmunohistoquimica y
TOPO2A por grado histológico y estadiaje tumoral se presenta en las
siguientes tablas.
43
Tabla 7. Expresividad de HER2Neu (FISH) por grado histológico y Estadiaje Tumoral
Grado Histológico* Her 2 Neu FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
Bien diferenciado (n=5) 1 (20) 3 (60) 1 (20)
Moderadamente Diferenciado (n= 36) 17 (47.2) 17 (47.2) 2 (5.6)
Pobremente Diferenciado (n=19) 12 (63.2) 7 (36.8) ---
Estadiaje Tumoral Her 2 Neu FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
I A (n=16) 4 (25) 11 (68.8) 1 (6.2)
II A (n=16) 10 (62.5) 5 (31.2) 1 (6.2)
II B (n=12) 7 (58.3) 5 (41.7) ----
III A (n=6) 2 (33.3) 3 (50) 1 (16.7)
III C (n=1) 1 (100) ---- ----
IV (n=9) 6 (66.7) 3 (33.3) ----
Tabla 8. Expresividad de HER2NEU (IHQ) por grado histológico y Estadiaje Tumoral
Grado Histológico* Her 2 NeuIHQn(%)
Positivo Negativo Equívoco
Bien diferenciado (n=5) ---- 5 (100) ----
Moderadamente Diferenciado (n= 36) 5 (13.9) 18 (50) 13 (36.1)
Pobremente Diferenciado (n=19) 9 (47.4) 8 (42.1) 2 (10.5)
Estadiaje Tumoral Her 2 NeuIHQn(%)
Positivo Negativo Equívoco
I A (n=16) 2 (12.5) 10 (62.5) 4 (25.0)
II A (n=16) 4 (25.0) 6 (37.5) 6 (37.5)
II B (n=12) 4 (33.3) 5 (41.7) 3 (25)
III A (n=6) --- 5 (83.3) 1 (16.7)
III C (n=1) 1 (100) ---- ---
IV (n=9) 3 (33.3) 5 (56.6) 1 (11.1)
44
Tabla 9. Expresividad de Topoisomerasa 2a (Fish) por Grado Histológico y Estadiaje Tumoral
Grado Histológico* Topoisomerasa 2A FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
Bien diferenciado (n=5) 1 (20) 3 (60) 1 (20)
Moderadamente Diferenciado (n= 36) 9 (25) 25(69.4) 2(5.6)
Pobremente Diferenciado (n=19) 6(31.6) 13(68.4) --------
Estadiaje Tumoral Topoisomerasa 2A FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
I A (n=16) 5(31.2) 10(62.5) 1(6.2)
II A (n=16) 3(18.8) 12(75) 1(6.2)
II B (n=12) 3(25) 9(75) -------
III A (n=6) 1(16.7) 4(66.7) 1(16.7)
III C (n=1) ---------- 1(100) ---------
IV (n=9) 4(44.4) 5(55.6) -----------
En cuanto a la expresividad de Her2Neu y Topoisomerasa 2A en relación
con el comportamiento de los receptores de Estrógenos y Progesterona
mediante test de Allred, los hallazgos son muy similares para los dos y se
muestran en las siguientes tabla en cuanto a los estrógenos.
Tabla 10. Expresividad de HER2NEU (FISH), HER2 NEU (IHQ) Topoisomerasa 2A
(FISH) por expresividad de Test de Allred (Estrógenos)
Expresividad de Test de Allred* Her 2 NeuIHQ n(%)
Positivo 3+ Negativo0/1+ Equívoco2+
Positivo (n=38) 3(7.9) 23(60.5) 12(31.6)
Negativo (n=22) 11(50) 8(36.4) 3 (13,6)
Expresividad de Test de Allred** Her 2 NeuFISHn(%)
Positivo Negativo No evaluable
Positivo (n=38) 16(42.1) 19(50) 3(7.9)
Negativo (n=22) 14(63.6) 8(36.4) --------
Expresividad de Test de Allred** Topoisomerasa 2A FISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
Positivo (n=38) 13(34.2) 22(57.9) 3(7.9)
Negativo (n=22) 3(13.6) 19(86.4) -------
* p<0.05 – Chi Cuadrado No corregido / ** p>0.05 – Chi cuadrado No Corregido
45
Los resultados de la concordancia de la expresividad de Her2Neu (IHQ)
de frente a Her2Neu (FISH) y frente a Topoisomerasa 2A, se muestran en
las siguientes tablas.
Tabla 11. Concordancia de expresividad entre HER2Neu (IHQ) frente a HER2Neu
(FISH) y Topoisomerasa 2A (FISH)
Her 2 NeuIHQ n(%)* Her 2 Neu FISH n(%)
Positivo Negativo No Evaluable
Positivo (3+) (n=14) 13 (92.8) 1 (7.2) -
Negativo (0,1+) (n=31) 8 (25.8) 21 (67.7) 2 (6.5)
Equívoco (2+) (n=15) 9 (60) 5 (33.3) 1 (6.7)
Her 2 Neu IHQ n(%)** Topoisomerasa 2A FISH n(%)
Positivo Negativo No Evaluable
Positivo (3+) (n=14) 1 (7.1) 13 (92.9) ---
Negativo (0,1+) (n=31) 11 (35.5) 18 (58.1) 2 (6.4)
Equívoco (2+) (n=15) 4 (26.6) 10 (66.7) 1 (6.7)
* Kappa Cohen =0.57 / Kappa Cohen = -0.3
Tabla 12. Concordancia de expresividad entre HER2Neu (FISH) y Topoisomerasa
2A (FISH).
Topoisomerasa 2A FISH n(%)*
Her 2 NeuFISH n(%)
Positivo Negativo No evaluable
Positivo(16) 10(62.5) 6(37.5) ----------
Negativo(41) 20(48.8) 21(51.2) --------
No evaluable(3) -------- --------- 3(100)
*Kappa Cohen = 0.013
46
Al analizar el subtipo molecular por Inmunohistoquímica de los tumores,
se obtuvo el 30%(n=18) fueron Luminal A y en igual porcentaje se
clasificaron como Luminal B. Gráfico 4.
Gráfico 4. Subtipo Molecular por Inmunohistoquimica. Muestra General
Si relacionamos esta Clasificación, con la TOP 2A, obtuvimos de los 16
casos positivos para TOP 2A, 5 fueron Luminales A (31,25%), 8
Luminales B (50%), 2 fueron Her2 neu (12,5%) y solamente 1 fue
TripleNegativo (6,25%).
30 30
21,7
13,3
5
0
5
10
15
20
25
30
35
Luminal A Luminal B Her2 Neu Triple Negativo No evaluable
%
Clasificación Molecular por Inmunohistoquimica
Gráfico 4.
47
CAPITULO VI
DISCUSIÓN, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
6.1 Discusión
El cáncer de mama ha tenido un notable aumento de incidencia en los
últimos años, ocupa el primer lugar de incidencia en la mujer ecuatoriana
en el 2013 con una tasa de 23,8, y en Quito de 33,3(2006-2009);
ubicándolo como el tumor más frecuente de las mujeres de Quito, que
además sigue ocupando el primer lugar cuando se compara con otras
regiones del Ecuador (Registro Nacional de Tumores).
La media de edad fue de 57.5 años, dato dentro de lo esperado, así
tenemos que en diversos estudios de este tipo sitúan la edad promedio de
presentación entre los 50 a 60 años, según Gonzales (2005), cita una
media de 56.8 años.
La evaluación del HER2 se ha convertido parte del reporte patológico en
el cáncer mamario invasivo, los tumores que sobre expresan Her2 son
menos diferenciados, con capacidad proliferativa mayor, y asociados a
pronostico más agresivo y peor (Slamon V, y cools; 1987).
La amplificación del Her2neu se espera en un 20 a 30% de los
carcinomas de mama (Petit, T; Wilt, M; y cols; 2004), de los 60 casos
estudiados el 23,3% fueron positivos (3+), encontrándonos dentro de los
rangos mencionados, un 51,7 % fueron negativos (0/1+) y un 25%
equívocos (2+). González (2005) obtuvo una positividad de 31,3% y
68,7% de casos negativos, así mismo Barrett (2007) obtuvo una
positividad de Her2neu en un 19% de casos.
48
En cuanto a la expresión por FISH del Her2neu, se obtuvo un mayor
número de casos positivos 50% y negativos 45%, se encontraron estudios
que incluso se hablan de una positividad de expresión por FISH del 83%,
según Kothari (2002)
La topoisomerasa2A (TOP2A) ha sido implicada en la predicción de la
evolución clínica y la respuesta a la quimioterapia en cáncer de mama.
(Thomson, TA; Hayes, MM; y cols, 2001), puesto que se considera
objetivo de diversos agentes quimioterápicos, específicamente
antraciclinas (Petit, T; Wilt, M; y cols; 2004), esta se expresó en el 26,7 %
de casos siendo negativa en el 68,3%, Romero (2011) obtuvo una
expresión similar a la nuestra con 21.3% de casos positivos.
La sobreexpresión o amplificación del Her2neu, determina regímenes
terapéuticos usados en pacientes con cáncer de mama (Ménard, 2001); y
lo relevante de esta amplificación es el beneficio de estas pacientes al
recibir la terapia personalizada con el medicamento especifico, de ahí la
correcta evaluación de la expresión del Her2 mediante los dos métodos
Inmunohistoquímica y FISH, para disminuir así los falsos negativos y
falsos positivos. AL evaluar el grado de concordancia entre las dos
técnicas esta fue buena (Kappa Cohen=0.57), los casos 3+ se
confirmaron positivos por FISH en un 92,8%, no asi en los casos 0 y 1+
que fueron realmente negativos un 67,7%.
Los porcentajes encontrados superan a los esperados en cuanto a los 0 y
1+ obteniendo un alto valor de falsos negativos 25,8% comparado con un
0% y un 0,7% de un estudio Irani citado por Ghaffari (2011) y segùn
Dowsett (2003) respectivamente, en cuanto a los 3+ son los esperados
con un 7,1% de falsos positivos, finalmente los 2+ fueron positivos en un
superior 60% , en relación a un 27,91% y 48% en los estudios de Ghaffari
(2011) y Dowsett (2003), dato que es muy variable dependiendo de los
laboratorios. La mayoría de reportes sugieren que la Inmunohistoquímica
es predictiva del estado de amplificación genética del Her2, en los casos
extremos (0/1+/3+), pero menor predictiva para los casos (2+),
49
requiriendo indudablemente su verificación por FISH, e incluso se puede
considerar repetir la prueba por Inmunohistoquímica en casos dudosos.
Estos resultados sugieren que la Inmunohistoquímica es una técnica muy
susceptible a variaciones como calidad de fijación, tiempo de la misma y
condiciones de procesamiento, e incluso temperatura del agua, presión
ambiental y el tipo de Kit usado, esto puede conllevar a variaciones en la
intensidad de la tinción para HER2 en las células tumorales, el FISH sin
duda predice significativamente el estado del HER2. (Ellis, I O; Bartlett, J;
y cols 2004)
Se ha evaluado la amplificación de TOP2Ay su concordancia con el
Her2neu FISH, considerada como no relevante (Kappa Cohen=0.013).
Los genes en la región 17q12-q21, como la TOP2A, son frecuentemente
coamplificados o no en cáncer de mama con amplificación de HER2,
debido a esta coincidencia se piensa que la amplificación de la TOP2A
debe ser el estándar de oro para predecir la respuesta a la terapia con
antraciclinas más que el HER2. (Harris, L; y cols; 2009)
Se han relacionado otras variables con la sobreexpresión del Her2neu y la
TOPO2A, una de ellas es la edad (Tabla 3), mostramos que las pacientes
Her2neu (FISH), fueron más prevalentes en el grupo > 50 años
(posmenopáusicas), estudios en relación a este estado hormonal de las
mujeres con cáncer de mama encuentran variedad de resultados, Birner
(2003) en su estudio menciona que el 49,5% de pacientes fueron
posmenopáusicas y 45,2% premenopáusicas, Menard (2002) por su parte
obtuvo 39% premenopausicas y 45% posmenopausicas, mostrando una
mínima relación con el estado menopáusico, si bien nuestros datos
muestras mayor porcentaje de diferencia a favor de las posmenopáusicas,
sigue siendo el grupo que prevalece en las pacientes que tienen
sobreexpresión del Her2 neu.
En cuanto a la expresión de Topoisomerasa 2A, y el grupo de edad, en
ambos grupos prevalecen las pacientes con negatividad para esta
50
sobreexpresión (Tabla 3); los casos positivos para TOPO 2A, son a favor
del grupo posmenopáusico (> 50 años)en un porcentaje más notable que
el Her 2 neu, Romero (2011) no obtuvieron mayor diferencia en esta
variable.
El tipo histológico más prevalente en general fue el ductal infiltrante,
seguido del lobulillar infiltrante y papilar infiltrante (Tabla 4); Gonzales
(2005) obtuvo como tipo histológico más prevalente el ductal infiltrante
(77%), seguido del lobulillar infiltrante (9,9%). Observación similar fue
informada por Bilous (2003), siendo el 81,5% de tipo ductal infiltrante no
especificado y 10% de tipo lobulillar infiltrante. El tipo histológico,
independientemente de la expresión de otros factores, es considerado
como un factor pronóstico.
En nuestro estudio considerando la positividad de los casos Her2neu
evaluados tanto por FISH e inmunohistoquimica se evidencia una
importante relación con el grado histológico tumoral, asi mostramos que
los casos con sobreexpresión del Her2neu FISH, se asocian con los grado
2 (moderadamente diferenciados) y 3 (pobremente diferenciados) Tabla 6.
Los casos pobremente diferenciados, la mayoría 63,2% son positivos para
Her2neu, esto se correlaciona con lo esperado de acuerdo a diversos
estudios ya que es considerado que la expresión de Her2neu al igual que
el grado histológico son de peor pronòstico en cáncer de mama. Birner
(2001) describió resultados similares a los nuestros y también encontró
asociación significativa entre la sobreexpresión del HER-2 y el grado
histológico 3, como en el nuestro particular.
Las características tumorales que tuvieron las pacientes que expresaron
TOP2A muestran significativa asociación con el grado histológico tumoral
estas pacientes estuvieron dentro de los grados 3 y 2 (Tabla 8), Romero
(2011), obtuvieron muy similar relación con el grado 2 y 3. Considerando
la sobreexpresión genética de la TOP2A en relación con tumores con
mayor proliferación y menor diferenciación histológica.
51
El presente estudio determino en cuanto al estadiaje tumoral, que los
estadios IA y IIA fueron los más frecuentes, seguido de IIB.
Se menciona que existe una relación sobre todo entre el número de
ganglios linfáticos comprometidos y el riesgo de recurrencia a distancia.
La sobrevida a cinco años en casos sin compromiso ganglionar es de
82,8%, mientras si tienen de 1 a 3, de 4 a 12 ó de 13 a más ganglios
linfáticos, es de 73%, 45,7% y 28,4%, respectivamente (Lebeau, A;
Deimling, D; y cols 2001), siendo el compromiso ganglionar parte del
estadiaje tumoral, hemos encontrado que en nuestro estudio existe
relación con la positividad del Her2neu evaluado por FISH e
Inmunohistoquimica y el estadiaje tumoral, encontrándose mayormente su
expresión en estadio IIA, seguidos de estadio IIB y estadio IV ( Tabla 6),
estos estadios tienen compromiso ganglionar, dato que está acorde a
ciertos estudios pero no todos, Gonzales (2003) menciona haber obtenido
49,5% de casos con compromiso ganglionar linfático sin asociación con la
sobreexpresión del HER-2 neu, hay que considerar que la positividad de
ganglios linfáticos tiene peor pronóstico incluso si el Her2 neu es negativo.
Tomando en cuenta datos que sugieren la sobreexpresión de TOP2A en
los tumores mamarios como un marcador de proliferaciòn, y peor
pronóstico, nuestros resultados interesantemente no mostraron esto en
cuanto al estadiaje en las pacientes con sobreexpresión de TOP2A, se
encontraron mayormente en estadio IA y estadio IV (Tabla 8). Romero
(2011) igualmente en su estudio no asocia al estadiaje con la
sobreexpresión de TOP2A. Nuestros resultados sugieren entonces que la
sobreexpresión de proteína TOP2A puede ser biológicamente diferente y
variable entre los distintos tumores.
En el presente estudio, al evaluar la expresión de los receptores
estrogénicos y progesterona en la población total de estudio, hubo una
asociación inversa con la sobreexpresión del Her2neu tanto por
Inmunohistoquimica y FISH, resultando ser un factor asociado de forma
independiente (Tabla 9), los casos positivos para receptores de
52
estrógenos y progesterona, la mayoría resultaron negativos para Her 2
neu y de los casos negativos para receptores de Estrògenos y
progesterona la mayoría fueron Positivos para Her2 neu. Por su parte,
Córdova (2001) no encontró asociación con la expresión de receptores de
estrógenos ni de progesterona. Se sabe que los tumores con expresión
de receptores de estrógenos están asociados a una mejor sobrevida libre
de enfermedad (74% vs. 66%) y mejor sobrevida total (92% vs. 82%). En
tal sentido, Birner (2001) encontró una disminución significativa en la
densidad de receptores estrogénicos al comparar los casos con
sobreexpresión del Her2neu, similar nuestros resultados.
El estado de expresión de estrógenos en las pacientes con TOP2A, se
relacionó significativamente (Tabla 9). La mayoría de pacientes que
expresaron la TOPO2A también fueron positivas para estrógenos, el
estudio de Romero (2011) mostro similares datos con un 80% de las
pacientes con sobreexpresión de la TOP2A fueron positivas para
estrógenos.
Teniendo en cuenta el biotipo Molecular por Inmunohistoquimica, se
obtuvieron de los 60 tumores los tipos más frecuentes son Luminales A y
B seguidos del tipo Her2neu y Triple Negativo (Grafico 4),se comparó
estos datos con la expresión de la TOP2A la mayoría fueron Luminales B,
seguidos de Luminales A, obteniendo un resultado ambiguo ya que si bien
es cierto esta expresión es más prevalente en un subtipo molecular
considerado como altamente proliferativo (Luminal B) también obtuvimos
un considerable valor en un tipo molecular de mejor pronóstico (Luminal
A), comparando con los resultados de Romero (2011), que obtuvieron
mayor prevalencia de expresión de TOP2A en el subtipo Luminal B, igual
que nuestros datos, pero también en el Triple Negativo, y Her 2 mayor
que el Luminal A. Evidenciamos que los tumores mamarios tienen
comportamiento biológico muy variable.
Finalmente nuestros resultados además consideraron a 19 pacientes que
recibieron quimioterapia neoadyuvante, este dato a pesar que no ha sido
53
tomado en cuenta en estudios similares, lo relacionamos con que 3 de las
muestras tuvieron defectos para el análisis del FISH, consideradas como
No evaluables y 2 de ellas coinciden con haber recibido quimioterapia
previa por lo que la quimioterapia previa pudo influir en la expresión
genética
El presente estudio se enfocó en un análisis histopatológico de buena
calidad, mediante microarreglos tisulares de tumores mamarios invasores
y la elaboración de sus respectivas laminillas con tecnología de punta,
con objeto de comparar la Inmunohistoquimica y FISH en cuanto a la
evaluación del Her2 neu y la TOP2A, para asi obtener mejores resultados
enfocados a la terapéutica y pronóstico de estas pacientes
54
6.1 Conclusiones
El grado de concordancia de Her2 neu por Inmunohistoquimica frente a
FISH fue buena (Kappa Cohen=0.57), pese a esta concordancia la
probabilidad de falsos negativos en la Inmunohistoquimica fue alta del
25,8%. Limitando el uso de esta prueba para evaluar la amplificación del
gen Her2 neu.
La concordancia de la sobreexpresión de Topoisomerasa 2A con la
amplificación del Her2 neu FISH no fue relevante (Kappa
Cohen=0.013).Siendo la amplificación de la TOP2A el estándar para
predecir la respuesta a la terapia con antraciclinas.
La sobreexpresión del Her2 neu (FISH) fue mayor en las mujeres > 50
años (posmenopáusicas) con un 63,3%. La TOP2A mostro ser más
frecuente en el mismo grupo de edad > 50 años (posmenopáusicas) pero
con un porcentaje mayor que en el Her2 neu, 81,3%.
La sobreexpresión del Her2 neu tanto por FISH e Inmunohistoquimica es
mayor en los tumores con grado histológico 2 (moderadamente
diferenciados) 56,6% y grado 3 (pobremente diferenciados) con un 40%,
con particular relación que en el grado 3 la mayoría de estos fueron
positivos para Her2 neu.
La amplificación de la TOP2A fue mayor en los grados histológicos 3 con
31,6% y grado 2 con 25%.
Se encontró relación con la sobreexpresión del Her2neu por FISH e
inmunohistoquimica con el estadiaje tumoral, encontrándose mayormente
en estadio IIA, IIB y estadio IV, teniendo estos tres estadios compromiso
ganglionar.
Contrariamente la TOP2A no se relacionó directamente con el estadiaje
tumoral ya que se encontraron mayormente en estadio IA, sin embargo
también en estadio IV.
55
Tanto los receptores de estrógenos y progesterona se relaciona en forma
inversa con la sobreexpresión del Her2 neu, de los casos positivos para
estrógenos la mayoría fueron negativos para Her2neu y de los casos
negativos para estrógenos mayormente fueron positivos para Her2neu.
La TOP2A obtuvo alta relación con las pacientes estrógeno positivas.
Se determinaron biotipos moleculares por Inmunohistoquimicade los 60
tumores mamarios estudiados, siendo el tipo Luminal A y B más
prevalente con un 30%, seguido por el Her2neu con un 21,7% y
finalmente Triple Negativo con un 13,3%. Adicionalmente la amplificación
de la TOP2A no necesariamente mostro relacionarse patrones de
expresión considerados como proliferativos, esta se expresó en un 50%
de luminales B y un 31,3% de Luminales A.
56
6.2 Recomendaciones
Dados los hallazgos de falsos negativos se deben considerar errores pre
analíticos, analíticos y pos analíticos, Promoviendo programas o métodos
de evaluación, (control de calidad) de la técnica de Inmunohistoquímica
que permitan identificar problemas en base a factores externos que
pueden afectar su resultado, desde el manejo de las muestras, e incluso
variaciones en la humedad del aire, temperatura del agua usada,
habilidades técnicas o dependientes del tipo de anticuerpo (kit) usado
para la técnica.
Aun cuando se puede evaluar la sobreexpresión genética con técnicas de
inmunohistoquimica, es indispensable el FISH en casos de duda o
dificultad diagnostica, más aun considerando la implicación terapeútica
que esto puede tener en las pacientes con cáncer de mama.
El presente estudio se puede considerar para ampliarse en relación a
otras variables sobre todo de seguimiento clínico de estas pacientes y
observar si en realidad estas sobreexpresiones genéticas a futuro tuvieron
implicaciones en cuanto a pronóstico, recidivas tumorales y beneficio de la
terapia usada e incluso relación con la mortalidad.
57
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61
ANEXOS
62
Anexo A
Proporcionado por el servicio de Biología Molecular del Laboratorio de Histopatología del HCAM, elaborado por Lic. Cecilia Cruz
Procedimiento general para construcción de Tejidos con Microarreglos (Tissue Microarrey TMA) con equipo Quick Ray®
Master 1. Colocar la placa en el microscopio y observar el tejido de interés,
comparar con el bloque de donde se hizo la placa y en el bloque señalar el área de interés con un marcador de aceite de color blanco.
2. Perforar la muestra de tejido desde el bloque donador y colóquelo
en los hoyos del bloque receptor del equipo Quick Ray® Master.
a. Cargar la bandeja principal de los bloques donadores y los bloques
receptores del equipo Quick Ray® Master. b. Perforar la muestra de tejido del bloque donador y entregar el tejido
extraído a los orificios del bloque receptor del equipo Quick Ray Master.
c. Desmonte los bloques receptores de la bandeja.
Figura No. 1Colocación de placa para microscopia optica (Tomado
del Manual de Tejidos de Microarreglos del HCAM)
Figura 2 Equipo Quick Ray Master(Tomado del Manual de Tejidos de Microarreglos del
HCAM)
Figura 3 Colocación de bloques donadores y bloque receptor
(Tomado del Manual de Tejidos de Microarreglos del HCAM)
Figura No. 4 Colocación del bloque receptor en el molde(Tomado del
Manual de Tejidos de Microarreglos del HCAM)
63
3. Colocar el bloque receptor dentro de un molde con la sección cortada hacia abajo y colocar el bloque en una estufa a 60°C por 45 minutos. Figura No. 5 Elaboración del bloque de parafina (Tomado del Manual de Tejidos de Microarreglos del HCAM)
4. Una vez que el bloque receptor está completamente transparente, coloque una caseta plástica sobre el bloque receptor y coloque parafina caliente en la caseta plástica
5. Colocar el bloque en una placa fría y esperar que se solidifique. 6. Cortar el bloque con el microtomo.
Figura No. 6 Corte del Bloque en el microtomo(Tomado del Manual de Tejidos de Microarreglos del HCAM)
7. Finalmente se obtiene el bloque y la placa de TMA
64
Anexo B Tomado del IncertoTOP2A FISH pharmDx™ kit, Nº de catálogo K53331era edición PROCEDIMIENTO TOP2A FISH Principios del procedimiento El kit TOP2A FISH pharmDx™ contiene todos los reactivos clave necesarios para llevar a cabo un procedimiento FISH en cortes de tejido sometidos a procesos de rutina, fijados con formol e incluidos en parafina. Después de la desparafinación y la rehidratación, las muestras se calientan durante 10 minutos en Pre-Treatment Solution. El siguiente paso implica una digestión proteolítica con Pepsin lista para usar a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. Luego del calentamiento y el pretratamiento proteolítico, este kit emplea un FISH ProbeMix en base a una combinación de tecnología con PNA (ácido nucleico peptídico) y ADN. Este ProbeMix se compone de una mezcla de clones de cósmidos de ADN marcados con Texas Red que abarcan un total de 228 kb del amplicón del gen TOP2A y una mezcla de sondas de PNA marcadas con fluoresceína dirigidas a la región centromérica del cromosoma 17. La hibridación específica en estas dos dianas ocasiona la formación de una señal roja fluorescente y nítida en cada amplicón del gen TOP2A y una señal verde fluorescente y nítida en cada región centromérica del cromosoma 17. El ProbeMix también contiene sondas de bloqueo de PNA sin marcar para reducir la tinción de fondo. Luego de realizar un lavado riguroso, las muestras se montan en un medio de montaje fluorescente que contiene DAPI y se las cubre. Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros apropiados. Se localizan las células cancerígenas y luego se las evalúa teniendo en cuenta la proporción de señal TOP2A/CEN-17. Las células normales en el corte del tejido analizado servirán como control positivo interno de la efectividad del pretratamiento y la hibridación. El kit TOP2A FISH pharmDx™, Nº de catálogo K5333, se aplica para realizar tinciones manuales. Tratamiento de tejidos antes de la tinción Desparafinación y rehidratación: Antes de realizar el procedimiento, se debe eliminar la parafina de los portaobjetos con tejido para eliminar el medio de inclusión y así volver a hidratarlos. Este paso se debe realizar a temperatura ambiente (20–25 °C). 1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incúbelos durante 5 (± 1) minutos. Cambie los baños y repita este proceso. 2. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 96% durante 2 (± 1) minutos. Cambie los baños y repita este proceso.
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3. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 70% durante 2 (± 1) minutos. Cambie los baños y repita este proceso. 4. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en Wash Buffer diluido durante un mínimo de 2 minutos. Comience el procedimiento de tinción Protocolo de tinción DÍA 1 Paso 1: Pretratamiento Llene un recipiente de tinción con la Pre-TreatmentSolution diluida Coloque el recipiente de tinción que contiene la Pre-TreatmentSolution en un baño María. Caliente el agua del baño y la Pre-TreatmentSolution a 95–99 °C. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado para asegurarse de que haya alcanzado la temperatura correcta. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Pre-TreatmentSolution precalentada en los recipientes de tinción. Vuelva a medir la temperatura e incube los cortes durante 10 (± 1) minutos a 95–99 °C. Retire el recipiente con los portaobjetos del baño maría. Destape el recipiente y deje que los portaobjetos se enfríen en la Pre-TreatmentSolution durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a un recipiente con Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Sustituya el Wash Buffer y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Paso 2: Pepsin, lista para su uso Elimine el exceso de tampón. Con un papel de seda sin pelusas (por ej., una toallita absorbente o una gasa), limpie con cuidado alrededor de la muestra para eliminar cualquier resto de líquido y mantener los reactivos dentro de la zona prevista. Aplique 5–8 gotas (250 μL) de Pepsin fría (2–8 °C) para cubrir la muestra. La Pepsin siempre se debe conservar a 2–8 °C. Deje incubar las muestras durante 5–15 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Si bien se considera que un período de incubación de 10 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, el tiempo de incubación puede variar en función de la fijación del tejido y/o el grosor del corte; en consecuencia, debería ser establecido por el usuario. Elimine la Pepsin y sumerja los cortes en el Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Sustituya el Wash Buffer y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Deshidrate los cortes de tejido colocándolos en distintas diluciones de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y otros 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire por completo.
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Paso 3: TOP2A/CEN-17 ProbeMix El siguiente paso se debe realizar en una campana extractora de gases. Aplique 10 μL de TOP2A/CEN-17 ProbeMix en el centro del corte de tejido. Inmediatamente después, coloque un cubreobjetos de vidrio de 22 mm x 22 mm sobre el ProbeMix y deje que se distribuya en forma uniforme debajo del cubreobjetos. Evite la formación de burbujas de aire. Si se observan burbujas, elimínelas suavemente del tejido con unas pinzas. Selle el cubreobjetos aplicando CoverslipSealant. Asegúrese de recubrir toda la periferia del cubreobjetos con el sellador. Deje que el CoverslipSealant se superponga al cubreobjetos y al portaobjetos, formando así un sello alrededor del primero. Asegúrese de que el CoverslipSealant selle todo el borde del cubreobjetos. Prepare el DakoHybridizer* (Nº de catálogo S2450/S2451) para iniciar un ciclo de hibridación. Asegúrese de que las tiras de control de humedad (Humidity Control Strips, Nº de catálogo S2452) estén húmedas y en condiciones óptimas de uso. Encienda el horno de hibridación y elija un programa para realizar una desnaturalización a 82 °C durante 5 minutos y una hibridación durante una noche (14–20 horas) a 45 °C Coloque los portaobjetos en el horno de hibridación, asegúrese de que la tapa esté bien cerrada e inicie el programa. DÍA 2 Paso 4: Lavado riguroso Llene dos recipientes de tinción con el StringentWash Buffer diluido. Se recomienda un volumen mínimo de 100 mLó 15 mL por cada portaobjeto en ambos recipientes. Coloque uno de los recipientes de tinción que contiene StringentWash Buffer diluido a temperatura ambiente en una campana extractora de gases y el otro en un baño María. Caliente el baño María y el StringentWash Buffer diluido a 65 (±2) °C. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida la temperatura dentro del recipiente de baño María con un termómetro calibrado para garantizar que sea correcta. El StringentWash Buffer contiene detergente y puede enturbiarse cuando alcanza los 65 °C; de todos modos, esto no afectará su eficacia. Utilizando pinzas o guantes, extraiga los portaobjetos de la cámara de hibridación y, con suavidad, retire el CoverslipSealant y el cubreobjetos y coloque uno a uno los portaobjetos en el recipiente de prelavado a temperatura ambiente. No coloque los portaobjetos en el StringentWash Buffer sin antes haber retirado los cubreobjetos. Tan pronto como todos los cubreobjetos se hayan retirado, transfiera los portaobjetos del recipiente de prelavado a temperatura ambiente al recipiente del baño María a 65 (±2) °C. Realice un lavado riguroso durante exactamente 10 minutos a 65 (±2) °C. Extraiga los portaobjetos del StringentWash Buffer diluido y sumerja los cortes en el Wash Buffer diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C).
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Sustituya el Wash Buffer diluido y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Deshidrate los cortes de tejido colocándolos en distintas diluciones de etanol: 2 minutos en etanol al 70%, 2 minutos en etanol al 85% y otros 2 minutos en etanol al 96%. Deje que los cortes de tejido se sequen al aire por completo. Paso 5: Montaje Aplique 15 μL de Fluorescence Mounting MediuM, al área diana del portaobjetos y aplique un cubreobjetos de vidrio. NOTA: Los portaobjetos se pueden analizar después de 15 minutos o en el plazo de 7 días después de montarlos. No obstante, se puede perder intensidad si se exponen a la luz o a altas temperaturas. Para minimizar la pérdida de intensidad, almacénelos en un lugar oscuro a una temperatura de 2–8 °C.
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Anexo C Tomado del IncertoTOP2A FISH pharmDx™ Nº de catálogo K5333 1era edición
Interpretación de la tinción TOP2A FISH Tejido evaluable, criterios
Sólo se deben evaluar las muestras obtenidas de pacientes con carcinoma invasivo. En los casos en que se detecta un carcinoma in situ y uno carcinoma invasivo en la misma muestra, sólo se debe realizar el recuento en el componente invasivo.
Evite las áreas de necrosis y aquéllas donde los bordes nucleares sean ambiguos.
No incluya los núcleos que requieran una opinión subjetiva.
Pase por alto los núcleos con una intensidad de señal débil y un ruido de fondo no específico o muy elevado.
Utilice el filtro para DAPI para garantizar una tinción uniforme de los núcleos.
Enumeración de señales:
Coloque la muestra del tumor dentro de los límites de un portaobjetos coloreado con tinción H&E y evalúe la misma área en el portaobjetos coloreado con tinción FISH.
Examine varias áreas de células tumorales para tener en cuenta una posible heterogenicidad.
Seleccione un área que tenga una distribución óptima de núcleos. Comience a realizar el análisis desde el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada y, haciendo un barrido de izquierda a derecha.
Cuente la cantidad de señales detectadas dentro de los límites nucleares de cada uno de los núcleos analizados, siguiendo las pautas que se indican a continuación:
Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales.
Se contarán como una sola señal aquellas dos señales que tengan el mismo tamaño y que estén separadas por una distancia igual o inferior al diámetro de una de ellas.
En los núcleos con altos niveles de amplificación del gen TOP2A, es posible que las señales TOP2A se encuentren a poca distancia entre sí, por lo cual se forma un racimo de señales. En estos casos no se puede realizar el recuento de señales TOP2A, sólo se calcula su cantidad.
Se debe prestar especial atención a las señales verdes, debido a que los racimos de señales TOP2A pueden cubrirlas y ocultarlas, lo cual hace que sea imposible detectarlas. En caso de duda, examine las señales verdes con un filtro FITC específico.
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No cuente los núcleos sin señales verdes. Sólo cuente los núcleos con una o más señales verdes de referencia.
Registre el recuento.
Tabla 13. Guía para lectura del FISH (Tomado del IncertoTOP2A FISH pharmDx™ Nº de catálogo K5333 1era edición)
Las señales se pueden contar por medio del método convencional o bien mediante un método alternativo más práctico y breve. En lugar del método convencional de recuento de señales en 60 núcleos, se cuentan un total de 60 eventos, donde uno de ellos representa a una señal genética roja. Mediante este método alternativo, se cuenta una cantidad variable de núcleos hasta alcanzar las 60 señales TOP2A rojas. A su vez, se registran las señales CEN-17 verdes correspondientes en el mismo núcleo. Se debe realizar un recuento de al menos 6 núcleos. En las muestras normales, un promedio de 35 núcleos será suficiente para alcanzar las 60 señales rojas. En los casos de amplificación genética, se incluirán de 6 a 35 núcleos. Aún en los casos en que haya eliminaciones, generalmente una cantidad inferior a 60 núcleos será suficiente.
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De ser posible, se deben contar los núcleos de 3 áreas tumorales diferentes. La proporción TOP2A/CEN-17 se calcula dividiendo el total de señales TOP2A rojas por el total de señales CEN-17 verdes. Se considerará que las muestras con una proporción TOP2A/CEN-17 igual o superior a 2 tienen amplificación del gen TOP2A y aquéllas con una proporción TOP2A/CEN-17 inferior a 0,8 presentan eliminación del gen TOP2A. Los resultados que se aproximen al valor límite o que lo alcancen (1,8–2,2 para las amplificaciones y 0,7–0,9 para las eliminaciones) se deberán interpretar con cautela. Se recomienda verificar que el recuento no incluya un porcentaje elevado de núcleos normales. Si el resultado de la proporción se encuentra dentro de estas dos zonas ambiguas, o si es incierto, es recomendable que el recuento de la muestra sea realizado por una segunda persona, contando los núcleos de más de 3 áreas tumorales y/o contando un total de 60 núcleos. Se sugiere un criterio de aceptación de ±10% CV (coeficiente de variación). La proporción final se debe volver a calcular en base a todos los recuentos. En los casos dudosos, se aconseja realizar una consulta entre el patólogo y el médico responsable.
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Anexo D Tomado del IncertoHER2 FISH pharmDx™, Kit, Nº de catálogo K53334ta edición
PROCEDIMIENTO HER 2 FISH Principio del procedimiento El Kit HER2 FISH pharmDx™ contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo un procedimiento FISH con cortes de tejido fijados con formol e incluidos en parafina (FFPE). Después de la eliminación de la parafina y de la rehidratación, las muestras se calientan en la Solución de pretratamiento durante 10 minutos. El siguiente paso supone una digestión proteolítica con Pepsina lista para su uso, a temperatura ambiente o a 37 °C. El tiempo óptimo de incubación con Pepsina depende del historial de fijación del tejido y debe ser determinado por el usuario, si bien 8 minutos a temperatura ambiente o 2 minutos a 37 °C será adecuado para la mayoría de las muestras. Tras los pasos de calentamiento y pretratamiento proteolítico, en este kit se utiliza una Mezcla de sondas FISH lista para su uso basada en una combinación de tecnología de ANP (ácido nucleico peptídico) y de ADN. La Mezcla de sondas se compone de una mezcla de sondas de ADN marcadas con rojo Texas que cubren una región de 218 kb en el gen HER2 del cromosoma 17, así como una mezcla de sondas de ANP marcadas con fluoresceína específicas para la región centromérica del cromosoma 17 (CEN-17). La hibridación específica de ambas dianas conduce a la formación de una señal fluorescente roja bien definida en cada locus del gen HER2, así como de una señal fluorescente verde bien definida en el centrómero de cada cromosoma 17. A fin de reducir la tinción de fondo. Luego de realizar un lavado riguroso, las muestras se montan en un medio de montaje fluorescente que contiene DAPI y se las cubre. Los resultados se interpretan usando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros apropiados. Se localizan las células cancerígenas y luego se las evalúa teniendo en cuenta la proporción de señal HER2/CEN-17. Las células normales en el corte del tejido analizado servirán como control positivo interno de la efectividad del pretratamiento y la hibridación Tratamiento de los tejidos antes de la tinción Eliminación de la parafina y rehidratación: Antes de llevar a cabo el análisis, debe eliminar la parafina de los portaobjetos de tejido para eliminar el medio de inclusión y rehidratarlos. Trate de no dejar restos de parafina. Cualquier residuo del medio de inclusión provocaría un aumento de a tinción no específica. Este paso debe realizarse a temperatura ambiente (20–25 °C). 1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez.
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2. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 96% durante 2 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. 3. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en etanol al 70% durante 2 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. 4. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en el Tampón de lavado 1 diluido durante un mínimo de 2 minutos. Inicie el procedimiento de tinción. Protocolo de tinción DÍA 1 Paso 1: Pretratamiento Pretratamiento mediante baño de agua: Llene los recipientes,con la Solución de pretratamiento diluida. Sección A.1). Coloque los recipientes de tinción con la Solución de pretratamiento en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Solución de pretratamiento a 97–99 °C. Mida la temperatura del interior del recipiente con un termómetro calibrado para garantizar una temperatura correcta. Tape los recipientes a fin de estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Solución de pretratamiento precalentada en los recipientes de tinción. Vuelva a comprobar la temperatura e incube durante 10 (±1) minutos a 95–99 °C. Retire del baño de agua el recipiente completo con los portaobjetos. Retire la tapa y deje quelos portaobjetos se enfríen en la Solución de pretratamiento durante 15 minutos a temperatura ambiente. Introduzca los portaobjetos a un recipiente que contenga Tampón de lavado 1 diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Sustituya el Tampón de lavado 1 y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Paso 2: Pepsina, lista para su uso Golpee suavemente para eliminar el exceso de Tampón de lavado 1. Utilizando un paño sin pelusa (por ejemplo un paño absorbente o una gasa), frote con cuidado alrededor de la muestra a fin de eliminar cualquier resto de líquido y de mantener los reactivos dentro del área prescrita. Aplique 5-8 gotas (250 μL) de Pepsina fría (2–8 °C) (Vial 2) que garantice que la muestra está tapada. Almacene siempre la Pepsina a 2–8 °C. Incube durante 8 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Un tiempo de incubación de 8 minutos es adecuado para la mayoría de las muestras, aunque el tiempo óptimo de incubación puede depender del historial de fijación del tejido y/o del espesor de la muestra y debe ser determinado por el usuario.
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Golpee suavemente para eliminar la Pepsina y sumerja los cortes en el Tampón de lavado 1 diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Reemplace el Tampón de lavado 1 y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Continúe hasta la deshidratación. Paso 3: Mezcla de sondas HER2/CEN-17, lista para su uso El siguiente paso debe realizarse en una campana extractora de gases. Aplique 10 μL de la Mezcla de sondas HER2/CEN-17 en el centro del corte de tejido. Coloque inmediatamente un cubreobjeto de vidrio de 22 x 22 mm sobre la ProbeMix y deje que ésta se distribuya uniformemente debajo del cubreobjeto. Evite la formación de burbujas de aire. Si observa burbujas de aire, golpee suavemente con unas pinzas para retirarlas del tejido. Selle el cubreobjetos con el Sellador de cubreobjetos, extendiendo el sellador alrededor de la periferia del cubreobjeto. Deje que el Sellador de cubreobjetos se superponga al cubreobjeto y al portaobjeto; así se formará un sello alrededor del cubreobjeto. Asegúrese de que el Sellador de cubreobjetos cubra todo el borde del cubreobjeto. Prepare DakoHybridizer para un ciclo de hibridación. Encienda el Hybridizer y elija un programa que realice la desnaturalización a 82 °C durante 5 minutos y realice la hibridación durante la noche (14–20 horas) a 45 °C Coloque los portaobjetos en el Hybridizer. Asegúrese de que las Humidity Control Strips estén saturadas y en estado óptimo para su utilización. DÍA 2 Paso 4: Lavado astringente Llene dos recipientes de tinción, por ejemplo recipientes de Coplin, con Tampón de lavado astringente diluido Se recomienda utilizar un volumen mínimo de 100 mL o 15 mL por portaobjetos en cada recipiente Introduzca uno de los recipientes de tinción con Tampón de lavado astringente diluido a temperatura ambiente en una campana extractora de gases, y el otro recipiente en un baño de agua. Caliente el baño de agua y el Tampón de lavado astringente diluido a 65 (±2) °C. Asegúrese de que la temperatura se haya estabilizado. Tape el recipiente para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Mida con un termómetro calibrado la temperatura del interior del recipiente que está en el baño de agua a fin de mantener la temperatura correcta. El Tampón de lavado astringente contiene detergente y puede volverse turbio a 65 °C; pero esto no afecta a su eficacia. Utilizando pinzas o guantes, saque los portaobjetos de la cámara de hibridación y, con cuidado, elimine el Sellador de cubreobjetos, así como los cubreobjetos, e introduzca los portaobjetos en el recipiente de prelavado a temperatura ambiente, uno por uno. Tan pronto como todos los cubreobjetos se hayan eliminado, transfiera los portaobjetos del recipiente de prelavado a temperatura ambiente al recipiente del baño María a 65 (±2) °C.
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Lleve a cabo un lavado astringente durante 10 minutos exactos a 65 (±2) °C. Saque los portaobjetos del Tampón de lavado astringente diluido y empape los cortes en Tampón de lavado 1 diluido durante 3 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Sustituya el Tampón de lavado 1 y sumerja los cortes durante otros 3 minutos. Paso 5: Montaje Aplique 15 μL de Fluorescence Mounting MediuM, al área diana del portaobjetos y aplique un cubreobjetos de vidrio. NOTA: Los portaobjetos se pueden analizar después de 15 minutos o en el plazo de 7 días después de montarlos. No obstante, se puede perder intensidad si se exponen a la luz o a altas temperaturas. Para minimizar la pérdida de intensidad, almacénelos en un lugar oscuro a una temperatura de 2–8 °C.
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Anexo E Tomado del IncertoHER2 FISH pharmDx™, Kit, Nº de catálogo K53334ta edición
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS HER 2 FISH Interpretación de la tinción Tejidos evaluables Sólo debe evaluar muestras de pacientes con carcinoma invasivo. En los casos de carcinoma in situ y carcinoma invasivo en la misma muestra, sólo debe evaluarse el componente invasivo. Evite las áreas de necrosis y las áreas donde los bordes nucleares sean ambiguos. No incluya los núcleos que requieran una valoración subjetiva. Ignore los núcleos que presenten una intensidad de señal débil y tinción no específica o tinción de fondo alta Enumeración de la señal: Examine varias áreas de células tumorales a fin de tener en cuenta una posible heterogeneidad. Seleccione un área que tenga una distribución óptima de núcleos. Empezando el análisis en el cuadrante superior izquierdo del área seleccionada, vaya examinando de izquierda a derecha y cuente el número de señales dentro de los límites del núcleo de cada núcleo evaluado según directrices que se indican a continuación.
- Acerque y aleje el enfoque para encontrar todas las señales de los núcleos individuales.
- Si una señal parece tener más de un centro de origen y, por ende, tiene una forma que difiere significativamente de un punto circular, debe contarse como dos señales.
- En los núcleos con altos niveles de amplificación del gen HER2, las señales de HER2 pueden estar muy cerca unas de las otras, formando un grupo de señales. En esos casosno es posible contar el número de señales de HER2; en vez de contarlo, debe realizarseuna estimación. Se le debe prestar especial atención a las señales verdes, ya que gruposde señales HER2 pueden cubrir las señales verdes, dificultando su visualización.
- En caso de duda, no incluya los núcleos en la evaluación. No puntúe los núcleos que no presenten señales o que presenten señales de un solo color. Puntúe sólo los núcleos que presenten una o más señales de cada color.
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Tabla 14. Guía para recuento de señales de HER 2 FISH (Tomado del IncertoHER2 FISH pharmDx™, Kit, Nº de catálogo K53334ta edición)
Conteos de registro Cuente 20 núcleos por muestra de tejido y, si es posible, de áreas tumorales bien definidas. Calcule la relación HER2/CEN-17 dividiendo el número total de señales rojas de HER2 entre el número total de señales verdes de CEN-17. Las muestras que presenten una relación HER2/CEN-17 igual o superior a 2 deben considerarse como amplificadas en cuanto al gen HER2. Los resultados que estén en el punto de corte o cerca de él deben interpretarse con precaución. Si la relación es dudosa, cuente 20 núcleos adicionales y calcule la proporción para los 40 núcleos. En caso de duda, vuelva a puntuar el portaobjetos con la muestra. En los casos de proporción dudosa, el patólogo debe consultar con el médico a cargo de los tratamientos.
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Anexo F Tomado del Incerto HERCEP TEST ™, Nº de catálogo K520415va. Edición
Técnica de Inmunohistoquímica HercepTest, Automatizado
Tecnica General: El Kit de HercepTest™ Marca DAKO, código K 5204 contiene los reactivos necesarios para completar un procedimiento de tinción inmunocitoquímica en dos pasos con especímenes procesados de forma rutinaria e incluidos en parafina. Después de la incubación con el anticuerpo primario de conejo de la proteína HER2 humana, este kit utiliza un reactivo de visualización listo para su uso basado en tecnología de dextrano. Este reactivo consta tanto de moléculas secundarias de inmunoglobulina de cabra anti-inmunoglobulinas de conejo como de moléculas de peroxidasa de rábano rusticano ligadas a un esqueleto de polímero de dextrano común, lo que elimina la necesidad de una aplicación secuencial de anticuerpos de enlace y anticuerpos conjugados con peroxidasa. La reacción cruzada del reactivo de visualización con las inmunoglobulinas humanas y el suero fetal bovino se ha eliminado por absorción en fase sólida. La conversión enzimática del cromógeno añadido posteriormente provoca la formación de un producto de reacción visible en el lugar del antígeno. Entonces, el espécimen puede someterse a contratinción y se puede colocar el cubreobjetos. Los resultados se interpretan utilizando un microscopio óptico. Los portaobjetos de control que contienen tres líneas celulares humanas con cáncer de mama incluidas en parafina y fijadas en formol con puntuaciones de intensidad de tinción de 0, 1+ y 3+ se suministran para validar las secuencias de tinción. La intensidad de tinción de estas líneas celulares se ha relacionado con el número de receptores por célula Procedimiento de Tinción Automatizado Desparafinado y rehidratación: antes de la tinción, los portaobjetos con los tejidos deben desparafinarse, para eliminar el medio de inclusión, y rehidratarse. Evite una retirada incompleta de la parafina. Cualquier residuo del medio de inclusión provocaría un aumento de la tinción no específica. Este paso debe realizarse a temperatura ambiente (20–25 °C). 1. Coloque los portaobjetos en un baño de xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez. 2. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos e introdúzcalos en etanol absoluto durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez. 3. Golpee suavemente para eliminar el exceso de líquido e introduzca los portaobjetos en etanol al 95% durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez
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4. Elimine el exceso de líquido golpeando suavemente los portaobjetos e introdúzcalos en agua destilada o desionizada un mínimo de 30 segundos. Inicie el proceso de tinción. Protocolo de tinción Realizado a temperatura ambiente, 20–25 °C. Paso 1: Recuperación de epítopo Llene los recipientes de tinción, por ejemplo, cubetas de Coplin, con la Epitope Retrieval Solution diluida. Coloque los recipientes de tinción con Epitope Retrieval Solution en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Epitope Retrieval Solution a una temperatura de 95–99 °C. La Epitope Retrieval Solution adquiere un aspecto turbio al calentarla. Cubra los recipientes con tapas para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Epitope Retrieval Solution precalentada de los recipientes de tinción. Vuelva a situar la Temperatura del baño de agua y la epitope retrieval solution de nuevo a 95–99 °c. Incúbela durante 40 (±1) minutos a 95–99 °C Saque la jarra entera con los portaobjetos del baño de agua. Deje que los portaobjetos se enfríen en la EpitopeRetrievalSolution durante 20 (±1) minutos a temperatura ambiente. Procedimiento del Autostainer 1. Utilice el mapa generado con el Autostainer sobre el autoprograma de Hercep Test TM para establecer los tiempos de programa y los volúmenes de reactivo necesarios 2. Coloque los viales de reactivo del Autostainer en la rejilla de reactivos del Autostainer según indica el mapa de reactivos generado por ordenador. 3. Cargue los portaobjetos en el Autostainer según indica el mapa de portaobjetos generado por ordenador. 4. Seleccione Program e inicie el programa de Hercep Test TM: Lo que sigue a continuación es un esquema de la secuencia del programa:
Aclarado 200 µL Peroxidase-Blocking Reagent - 5 minutos ▪ Aclarado 200 µL Primary Anti-HER2 Protein (o Negative Control Reagent) - 30 minutos ▪ Aclarado 200 µL VisualizationReagent - 30 minutos ▪ Aclarado ▪ Aclarado ▪ Cambio 200 µL Substrate-ChromogenSolution (DAB) - 10 minutos Después del paso con sustrato cromógeno, aclare los portaobjetos con agua desionizada
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Paso 3: Contratinción (instrucciones válidas para la hematoxilina) Retire los portaobjetos del Autostainer y realice la contratinción con hematoxilina como se describe a continuación. Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina. Incúbelos entre 2 y 5 minutos, en función de la potencia de la hematoxilina utilizada. Aclárelos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada. Asegúrese de que se han eliminado todos los residuos de hematoxilina. Opcional: introduzca los portaobjetos 10 veces en un baño de agua de amoníaco a 37 mmol/L. Aclare los portaobjetos suavemente en un baño de agua destilada o desionizada entre 2 y 5 minutos. Paso 4: Montaje Se recomienda un medio de montaje no acuoso y permanente. De todas formas, un medio de montaje acuoso también resulta aceptable. Los especímenes pueden montarse y taparse con cubreobjetos con un medio de montaje acuoso NOTA: los portaobjetos pueden leerse cuando resulte apropiado. No obstante, puede que se pierda el color si los portaobjetos se cubren con un medio de montaje acuoso y se exponen a una luz intensa durante una semana. Para minimizar la pérdida de tinte, almacene los portaobjetos en un lugar oscuro a temperatura ambiente (20–25 °C)
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INTERPRETACIÓN DE LA TINCIÓN Interpretación de la tinción - Mama En la determinación de la sobreexpresión de la proteína HER2, sólo deben evaluarse la intensidad y el patrón de tinción de la membrana, utilizando la escala presentada en la Tabla siguiente. La evaluación del portaobjetos debe realizarla un patólogo con la ayuda de un microscopio óptico. Para la evaluación de la tinción y la puntuación inmunocitoquímicas, resulta apropiado un objetivo de aumento 10x. La utilización de un objetivo de aumento 20–40x puede resultar de utilidad para confirmar la puntuación. La tinción citoplasmática debe considerarse como tinción no específica y no se incluirá en la evaluación de la intensidad de tinción de la membrana. Sólo deben contabilizarse los especímenes de pacientes con carcinoma de mama invasivo. En los casos con carcinoma in situ y carcinoma invasivo en la misma muestra, sólo debe puntuar el componente invasivo.
Tabla 15. Guía para interpretación de HER por Inmunohistoquimica (Tomado del Incerto HERCEP TEST ™, Nº de catálogo K520415va.
Edición) PATRÓN DE TINCIÓN PUNTAJE SOBRE EXPRESIÓN DE
HER2
Ninguna tinción de membrana en menos del 10% de células Levemente perceptible tinción de membrana en más del 10% de las células tumorales.
0 1+
Negativo Negativo
Débil a moderada tinción completa de membrana en más del 10% de las células tumorales Tinción completa y fuerte en más del 10% de las células
2+ 3+
Equivoco, Dudoso Positivo
HercepTest™ se interpreta como negativo para la sobreexpresión de la proteína HER2 (con intensidad de tinción 0 y 1+), débilmente positivo (con intensidad de tinción 2+) y altamente positivo (con intensidad de tinción 3+).
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Anexo G
HOJA DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN Y RESULTADOS Resultados
Nombre: HCL No: _____________________ CASO No _____________________
Tratamiento quimioterápico previo: SI NO
Estado del Her 2 FISH HER2 Radio ≥2 Amplificación Positiva HER2 Radio <2 Amplificación Negativa
Estado de Her2 IHQ
HER2 0 Negativo HER2 1+Negativo HER2 2+Equivoco HER2 3+Positivo
Estado de TOP2A FISH
TOP2A Radio ≥2 Amplificación Positiva TOP2A Radio <2 Amplificación Negativa
Expresión de Receptores de Estrógenos y Progestágenos
Test de Allred Estrógenos Positivo Negativo
Test de Allred Progesterona Positivo Negativo
Tipo de Tumor Intraductal Ductal Lobulillar Papilar Medular Secretor
Grado Histologico 3 a 5 = Grado 1 Bien diferenciado 6 y 7= Grado 2 Moderadamente diferenciado 8 y 9= Grado 3 Pobremente diferenciado
Edad al Diagnóstico (AÑOS)
Estadio Patologico Tumoral TNM
Tamaño Tumoral T
Ganglios Linfaticos Regionales
N
Metastasis a Distancia M
NOMBRE DEL INVESTIGADOR:
82
Anexo H
HOJA DE RECOLECCIÓN DE LECTURA DE FISH PARA Her2neu y TOP2A
REPORTES HER 2/TOPO 2A FISH Kit: Fecha: ______________ Identificación de muestra:__________ Nombre del Paciente FOTO:
RECUENTO DE SEÑALES EN 20 NUCLEOS
Núcleo No. Her 2 /TOP 2A (señal roja)
CEN -17- (señal azul)
Nùcleo No. Her 2 /TOP 2A (señal roja)
CEN -17- (señal azul)
1 11
2 12
3 13
4 14
5 15
6 16
7 17
8 18
9 19
10 20
Total (1-10) Total (11-20)
Her 2 /TOP 2A
CEN -17-
Relación HER2/TOPO 2A vs CEN-17
Puntuación Total (1-20)
-------Radio + 2: Se observa amplificación del gen
--------Radio - 2: No se observa amplificación del gen --------Tejido No apto para el estudio
Nombre del patólogo:
83
Anexo I
FOTOGRAFÍAS 1. BLOQUE RECEPTOR DE MICROARREGLOS TISULARES PARA 30 MUESTRAS DE 3mm
2. ORDENAMIENTO DE BLOQUES DONANTES HACIA BLOQUE RECEPTOR
3. BLOQUE DE 30 MUESTRAS DE TUMORES MAMARIOS OBTENIDOS POR MICROARREGLOS
84
4. LÁMINAS DE MICROARREGLOS DE TUMORES MAMARIOS PARA FISH HER2neu Y TOPO2A.
5. FISH MOSTRANDO SOBREEXPRESIÒN PARA HER2neu.
85
6. FISH MOSTRANDO SOBREEXPRESIÓN PARA TOPO2A.
86
CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR 1
DATOS PERSONALES: APELLIDOS: Puertas Bravo
NOMBRES: María Elisa CÉDULA: 1103828032 EDAD: 31 años FECHA DE NACIMIENTO: 16-Jun-1982 ESTADO CIVIL: Casada DIRECCIÓN: 24 de Mayo y Lourdes (Loja) TELÉFONOS: 072573631- 0989347494 CORREO ELECTRÓNICO: [email protected] ESTUDIOS REALIZADOS: Superior:
Universidad Técnica Particular de Loja. Facultad de Ciencias Médicas. Escuela de Medicina.
Título obtenido: Médico
Año de consecución: 2007 Postgrado:
Universidad Nacional de Loja. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Posgrado.
Diplomado Superior en Gerencia de Servicios de Salud.
Año de consecución: 2009.
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Postgrado.
Condición actual: Egresada del Postgrado de Anatomía Patológica
Año de consecución: 2012. EXPERIENCIA:
Médico Devengante de Beca con funciones en Patología del Hospital Provincial Isidro Ayora. (MSP-Loja)
Fecha: 01-Abril-2013 a 01-May-2016
Docente Adscrita, Facultad de Medicina, Universidad Técnica Particular de Loja (UTPL)
87
CURRICULUM VITAE INVESTIGADOR 2
DATOS PERSONALES: APELLIDOS: Naranjo Salas NOMBRES: Wagner Andrés CÉDULA: 1715513170 EDAD: 33 años FECHA DE NACIMIENTO: 07-Sep-1980 ESTADO CIVIL: Casado DIRECCIÓN: Carlos Cabezas N50 109 y Teniente Homero Salas TELÉFONOS: 022536009 - 0939101009 CORREO ELECTRÓNICO: [email protected] ESTUDIOS REALIZADOS: Superior:
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Escuela de Medicina. Título obtenido: Doctor en Medicina y Cirugía Año de consecución: 2005
Postgrado:
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Posgrado. Diplomado Superior en Salud Familiar y Comunitaria. Año de consecución: 2007.
Universidad Central del Ecuador. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto Superior de Postgrado. Condición actual: Especialista (egresado) Postgrado de Anatomía Patológica Año de consecución: 2011.
EXPERIENCIA:
Docente Titular, Escuela de Bioanálisis, Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Docente Titular, Instituto Superior Tecnológico Cruz Roja Ecuatoriana, Cruz Roja Ecuatoriana
Docente Titular, Facultad de Ciencias Médicas, Escuela de Medicina, Universidad Central del Ecuador
Docente Titular, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica del Ecuador
Docente Titular, Facultad de Ciencias de la Salud Eugenio Espejo, Medicina, Universidad Tecnologica Equinoccial
Docente Titular, Facultad de Ciencias de la Salud Eugenio Espejo, Odontología, Universidad Tecnológica Equinoccial
Docente Titular, Colegio de Ciencias de la Salud, Medicina, Universidad San Francisco de Quito
Doctor Residente de Patología , Novaclínica Santa Cecilia
Doctor Residente de Patología , Centro de Patología Integral
Doctor Residente de Patología , Centro de la Piel.
