FACULTAD DE CRIMINOLOGA, CRIMINALSTICA Y TCNICAS PERICIALES.

MAESTRA EN CRIMINALSTICA.

MATERIA: MICROSCOPIAREPORTE DE EXPOSICIN: MICROSCOPIO FLUORESCENTE.ASESOR DE MATERIA: MTRO. M.C. JAIME RODRGUEZ ROJAS.

ALUMNOS: LIC. ISAAS AUGUSTO LPEZ URBINA. LIC. MARIO ALBERTO CASTILLEJOS FUENTES.

Plantel Puebla, otoo 2011

Microscopio Fluorescente. Inventores: 1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.

Qu es? Es un proceso de interaccin entre la radiacin y la materia en el cual un material absorbe radiacin de una fuente especfica y muy rpidamente emite luz cuya energa es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiacin que ha absorbido.1 Cmo se produce? Los electrones son excitados a estados vibracionales y rotacionales ms altos y cuando vuelven a su estado fundamental emiten la energa de excitacin en forma de radiacin. 1) La absorcin de la luz de excitacin eleva la molcula del fluorocromo a un estado de excitacin con un mayor contenido de energa, S1. 2) En este estado de excitacin se mantienen un tiempo determinado, de 10-9 a 10-8 segundos,2 en el cual la molcula sufre cambios conformacionales e interacciones con las molculas de su entorno. Como consecuencia, parte de la energa del estado S1 se disipa, crendose un estado S1 de menor energa. 3) Pasado este tiempo de excitacin la molcula emite luz de menor energa volviendo a su estado fundamental, S0. Debido a la disipacin interna de energa la luz emitida tiene siempre una longitud de onda mayor (menor energa) que la luz de excitacin. La cantidad de luz emitida es muy pequea en comparacin con la utilizada para la excitacin. Lo que diferencia a la fluorescencia de la fosforescencia (ambos son procesos de luminiscencia) es el tiempo de vida ms largo de ste ltimo proceso que puede ir desde milisegundos a minutos y ocurre despus de que el proceso de absorcin haya terminado. Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con configuraciones moleculares particulares conocidas como fluorforos o fluorocromos. Un fluorocromo es una molcula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energa (mayor longitud de onda). Un fluorforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisin de la fluorescencia.

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Manual of Basic Techniques for a Health Laboratory, World Health Organization, Geneve, 2nd. Edition, 2003. 2 Microscopio Lavobal 2, Instrucciones para el uso, Boletn N 30-G060-4, Carl Zeiss Jena, DDR.

Tipos de fluorescencia: La fluorescencia primaria es la que se da porque existe una configuracin inherente a la estructura molecular. Algunas de las fluorescencias ms intensas que se observan se asocian con molculas aromticas, la fluorescencia de materiales inorgnicos se observa en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos especficos: Clorofila, aceite de inmersin, GFP. y La fluorescencia secundaria ocurre cuando una molcula especfica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra. ste es el procedimiento para la mayora de las aplicaciones biolgicas de la microscopa de fluorescencia. y Espectros de excitacin y emisin: Debido a la diferente configuracin electrnica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitacin y de emisin caracterstico y nico. Los fabricantes dan el pico de mxima excitacin y el pico de mxima emisin o bien los espectros de excitacin y emisin.3 Espectro de excitacin: Muestra la diferente intensidad de la luz de emisin mxima a diferentes longitudes de onda de excitacin.

5. Microscopa de fluorescencia

Espectro de emisin: Muestra la intensidad relativa de emisin a diferentes longitudes de onda al excitar con la longitud de onda mxima.4

Light and video microscopy. Randy Wayne. Captulos 4, 6 y 11 Art, J.J., Goodman, M.B., (1993). Rapid Scanning Confocal MIcroscopy. Cell Applications of Confocal Microscopy. Edited by M. Matsumoto. Academic Press, Inc.4

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Biological

Disminucin de la fluorescencia: Una molcula del fluorocromo puede tener varios ciclos de excitacin-emisin. Pero bajo condiciones de iluminacin de alta intensidad hay una destruccin irreversible del fluorocromo excitado que se denomina fotoblanqueado (photobleaching) limitando la deteccin de fluorescencia. Puede ser por dos procesos: 1) Photobleaching: Descomposicin irreversible de las molculas de los fluorocromos. Est directamente relacionado con la intensidad de la excitacin y con el tiempo durante el cual estamos excitando la muestra. Para evitar este efecto se debe trabajar en condiciones de mnima iluminacin posible. 2) Quenching: Disminucin de la intensidad de la emisin debida a condiciones de temperatura o presin elevada, agentes oxidantes y algunas sales. Tambin puede ser debida a interacciones entre molculas de fluorocromo, por lo que aumentar la concentracin de ste no siempre supone un aumento de fluorescencia. Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxgeno.

Uso de la microscopa de fluorescencia: 1) El objetivo principal es la identificacin de una sustancia especfica observando sus propiedades caractersticas de emisin cuando se ilumina con radiacin de longitud de onda apropiada. 2) Un objetivo difcil es la determinacin de parmetros especficos inherentes a la muestra, o que son resultado de la preparacin de la misma, que influyen en la fluorescencia de un fluorocromo especfico en un material dado. 3) Un tercer objetivo incluye la medida de la intensidad de la fluorescencia y una comparacin de esta intensidad con estndares de fluorescencia bien establecidos.

4) El cuarto objetivo es el barrido localizado de una muestra para determinar la distribucin de los fluorocromos que contiene, que es la microscopa de barrido confocal.5 Fuentes de luz La eleccin de la fuente de luz es funcin del fluorocromo especfico que se investiga, sus requisitos de excitacin y su eficiencia cuntica. Para excitar la fluorescencia de un fluorocromo se necesita una fuente de luz intensa que suministre las longitudes de onda de excitacin del fluorocromo en uso. Lmparas de mercurio a alta presin: Son las ms utilizadas. Exhiben mximos discretos sobre un fondo continuo que proporcionan excitacin en el rango del ultravioleta as como en las regiones azul y verde.

Lmparas de mercurio

Estas lmparas son caras, requieren unidades de encendido especiales y el coste de funcionamiento es elevado. La salida de la luz se va reduciendo con el tiempo debido al ennegrecimiento del envoltorio de cuarzo. Nunca deben utilizarse ms tiempo del recomendado por el fabricante ya que existe riesgo de explosin que daara el microscopio y llenara la habitacin de vapores de mercurio. Generalmente llevan un contador de horas incorporado. Se caracterizan por un flujo luminoso estable y regular. Muestran un continuo de elevada intensidad con algunos mximos irregulares entre longitudes de onda de 800 y 1.000 nm. Esta fuerte intensidad en el infrarrojo cercano debe ser eliminada con filtros. Suministran suficiente radiacin azul-verde en la regin de 440 - 540 nm donde las lmparas de mercurio no son muy tiles, sin embargo son deficientes en el ultravioleta. Su vida media es ms larga que las de mercurio.Haugland, R. (1992). Intracellular Ion Indicators. Fluorescent and Luminiscent Biological Activity. Edited by W.T. Mason. Academic Press.5

Probes for

Lmparas de xenon a alta presin:

Tambin como yoduro

se conocen lmparas de de cuarzo.

Son del tipo de fuente de filamento incandescente que tienen un espectro de radiacin continuo. Dan poca emisin en el rango del ultravioleta pero es aceptable en las regiones azul y verde. Permiten un apagado y encendido con frecuencia lo que acortara la vida de las de mercurio. Lmparas halgenas de wolframio: Son ms baratas y ms seguras que las de mercurio pero slo son apropiadas en tcnicas donde se espere tener una elevada fluorescencia ya que tienen una menor energa de excitacin. Si el trabajo requiere fluorescencia de dos colores o se necesitan elevados aumentos o la fluorescencia es tenue se prefieren las lmparas de vapor de mercurio. Filtros:

Con el filtro de excitacin seleccionamos la parte del espectro que utilizaremos para excitar la muestra. La muestra emite fluorescencia en un espectro distinto al de excitacin y al mismo tiempo refleja parte del espectro utilizado para la excitacin. El filtro barrera se encarga de eliminar la parte del espectro reflejado y nos permite visualizar el espectro de emisin correspondiente al fluorocromo. Filtro de excitacin: Selecciona el espectro de excitacin. Espejo dicroico: Refleja la parte del espectro necesaria para la excitacin y transmite el resto. Filtro barrera: Deja pasar la parte de la emisin de la muestra que nos interesa.

Los fabricantes suelen proporcionar bloques de filtros que son combinaciones de filtros de excitacin y de emisin con los apropiados espejos dicroicos.6

Kriete, A. (1992). New Dimensions of Visualization in MIcroscopy.Visualization in Biomedical Microscopies. 3D Imaging and Computer Applications. Edited by Kriete, A. VCH Publishers, Cambridge UK.

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Los filtros se describen utilizando letras y nmeros: BP600/30, LP490, DD488/543. Filtros de excitacin y barrera: BPxxx - Filtro Pasa Banda (Band Pass): Deja pasar una banda determinada del espectro y bloquea el resto. BP460-580: BP significa filtro pasa banda y los nmeros indican la luz que bloquea por debajo, 460 nm, y la que bloquea por encima, 580 nm. BP600/30: Deja pasar una banda cuyo mximo es 600 nm con una anchura de 30 nm. SP600: SP significa filtro pasa bajos (short pass). Deja pasar el espectro por debajo de un valor determinado, en este caso 600 nm, y bloquea lo que est por encima de ese valor. LP490: LP significa filtro pasa altos (long pass). Deja pasar el espectro por encima de un valor determinado, en este caso 490 nm, y bloquea lo que est por debajo de ese valor. Espejos dicroicos: Tambin se describen con nmeros y letras: RSPxxx: Espejo dicroico Reflexin Pasa Bajos, refleja por debajo del valor indicado (xxx) y transmite el resto. DDxxx/yyy: Espejo doble dicroico, tiene dos picos en los que refleja (xxx, yyy) y en el resto transmite. TDxxx/yyy/zzz: Espejo triple dicroico, refleja la luz en tres picos (xxx, yyy, zzz) y transmite en el resto.7

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Minsk M. (1957).Microscopy Apparatus, U.S. Pat. 3,013,467

Filtros 1. La lmpara emite luz en todo el espectro. 2. El filtro de excitacin slo deja pasar la parte del espectro necesaria para excitar la muestra. 3. El espejo dicroico refleja hacia la muestra la excitacin correspondiente. 4. La muestra se excita con la luz que le llega y emite en un espectro superior al de la excitacin. 5. El espejo dicroico transmite la emisin de la muestra. 6. El filtro barrera hace una seleccin exacta del espectro de emisin que nos interesa.

Objetivos Casi las mismas consideraciones se aplican a la evaluacin de los objetivos cuando se requieren para microscopa de fluorescencia o de campo claro. La capacidad del objetivo para captar la luz juega un papel esencial en la microscopa de fluorescencia. Para obtener una intensidad de la seal ptima se debe emplear una apertura numrica elevada y el menor aumento posible. Por otro lado, el tipo de vidrio que se utilice requiere una buena transmisin de la longitud de onda que se use, por eso, los ms utilizados son los de fluorita o los apocromticos. Tambin se deben utilizar objetivos con autofluorescencia extremadamente baja. Puede ocurrir que aunque estn todos los factores anteriores optimizados exista un ruido de fondo. ste se debera a la propia muestra debido a la fijacin, la autofluorescencia o a un proceso de tincin inadecuado. Luz transmitida vs luz incidente Luz transmitida: Los microscopios de fluorescencia antiguos eran poco eficaces en luz transmitida.

Los lugares de fluorescencia dbil eran difciles de observar entre la radiacin que no era especfica de la fluorescencia. El problema se solvent parcialmente utilizando condensadoras de fondo oscuro. La luz incidente sobre la muestra queda restringida a un rea que no entra en el objetivo. Consecuentemente slo la radiacin que surge de la dispersin o de la fluorescencia se recoge en la lente objetivo. Los lugares de fluorescencia dbil se observan sobre un fondo oscuro. Este sistema es ms til en aumentos bajos de aproximadamente 40X y tiene la ventaja de que el contraste es alto. Una desventaja es que se requiere aceite de inmersin no fluorescente o glicerol entre la parte superior de la lente condensadora y la lente objetivo para evitar prdidas de luz de excitacin. Luz incidente: Con el desarrollo del espejo dicroico aument el nmero de aplicaciones de la microscopa de fluorescencia ya que hay muchas muestras que no se pueden observar por transmisin. El espejo dicroico lleva la radiacin a travs del objetivo para la excitacin y se usa de nuevo para permitir la observacin de la radiacin fluorescente. De esta manera el objetivo funciona tambin como condensadora y la intensidad de la fluorescencia es inversamente proporcional a la cuarta potencia de los aumentos. El brillo mximo se obtiene con un ocular de aumento mnimo y el objetivo de apertura numrica mxima. Las ventajas son que la luz de excitacin pasa a travs de menos superficies de vidrio y as se pierde menos luz en el camino debido a absorcin interna. Como la lente objetivo tambin es condensadora el rea observada es la misma que el rea iluminada. Adems no hace falta aceite de inmersin en la condensadora. Aplicaciones: Es til en el estudio de diferentes clases de celulosa, tejidos vegetales, alimentos y medicamentos, fibras animales, minerales en polvo, deteccin de impurezas en mezclas homogneas y heterogneas, polmeros, resinas, cristales lquidos, telas, fibras, madera, papel, carbn mineral, petrleo, cemento, vidrio, cermica, semiconductores, ciencia forense, farmacia, restauracin de arte, biologa y medicina.

ANEXOS

Spirochaeta vista microscopio de florescencia.

Microscopio de fluorescencia.

BIBLIOGRAFIA:y Manual of Basic Techniques for a Health Laboratory, World Health Organization, Geneve, 2nd. Edition, 2003. Microscopio Lavobal 2, Instrucciones para el uso, Boletn N 30-G060-4, Carl Zeiss Jena, DDR. Light and video microscopy. Randy Wayne. Captulos 4, 6 y 11. Art, J.J., Goodman, M.B., (1993). Rapid Scanning Fluorescent MIcroscopy. Cell Biological Applications of Fluorescent Microscopy. Edited by M. Matsumoto. Academic Press, Inc.

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Haugland, R. (1992). Intracellular Ion Indicators. Fluorescent and Luminiscent Probes for Biological Activity. Edited by W.T. Mason. Academic Press.

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Kriete, A. (1992). New Dimensions of Visualization in MIcroscopy.Visualization in Biomedical Microscopies. 3D Imaging and Computer Applications. Edited by Kriete, A. VCH Publishers, Cambridge UK. Minsk M. (1957).Microscopy Apparatus, U.S. Pat. 3,013,467.

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