DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS … · Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente

1

DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS ASOCIADOS

AL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA, CON ENFASIS EN EL VIRUS MOP-

TOP (PMTV, POMOVIRUS).

JOSÉ FERNANDO GIL RAMÍREZ

Tesis de Grado presentada para optar al Título de

Magíster en Ciencias - Biotecnología

DIRECTOR

MAURICIO ALEJANDRO MARÍN MONTOYA I.A., M.Sc., PhD.

ASESOR ESTADÍSTICO

JOSÉ MIGUEL COTES TORRES I.A., M.Sc., PhD

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MEDELLÍN

FACULTAD DE CIENCIAS

2010

2

CONTENIDO

RESUMEN 16

2. OBJETIVOS 23

2.1. Objetivo general 23

2.2. Objetivos específicos 23

3. MARCO TEÓRICO 24

3.1. Virus asociados al cultivo de la papa 24

3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia 27

3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa 30

3.3.1. Familia Virgaviridae 30

Género Pomovirus 32

Potato mop-top virus (PMTV) 33

3.3.2. Familia Potyviridae 36

Género Potyvirus 37

Potato virus Y (PVY) 39

3.3.3. Familia Alphaflexiviridae 42

Género Potexvirus 43

Potato virus X (PVX) 44

3.3.4. Familia Betaflexiviridae 46

Género Carlavirus 47

Potato virus S (PVS) 48

3.3.5. Familia Luteoviridae 50

3

Género Polerovirus 50

Potato leafroll virus (PLRV) 52

3.3.6. Familia Closteroviridae 55

Género Crinivirus 56

Potato yellow vein virus (PYVV) 57

3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal 60

3.4.1 Métodos Biológicos 61

Inoculación mecánica 63

Inoculación por vectores 63

Injertos 64

3.4.2. Métodos serológicos 64

ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay) 65

Otros métodos de inmunodiagnóstico 67

Microscopía electrónica 68

3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos 69

Hibridización molecular 69

Técnicas basadas en PCR 71

PCR en tiempo real 72

4.1. Localización 74

4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa 75

4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea 77

4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante

RT-PCR y secuenciación 78

4.5 Secuencias parciales de los genomas virales 82

4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real 84

4

5. RESULTADOS 89

5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa 89

Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa 89

5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas 93

5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 12 zonas productoras de

Colombia 94

5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia 99

5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa mediante

RT-PCR y secuenciación 102

5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY 106

5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV 111

5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS 115

5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV 120

5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX 124

5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV 128

5.6. Secuencias parciales de los genomas virales 136

5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV 136

5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY 148

5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX 159

5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS 166

5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV 169

5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV 171

5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real 176

5.7.1. Pruebas de detección de PVY 176

5.7.2. Pruebas de detección de PMTV 179

5

6. DISCUSIÓN 185

CONCLUSIONES 200

AGRADECIMIENTOS 203

BIBLIOGRAFÍA 204

ANEXOS 227

6

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus. 74

Tabla 2. Cebadores específicos utilizados en la detección por RT-PCR de cada uno de los

virus bajo estudio. 80


virus bajo estudio. 83

Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los

virus PVY y PMTV. 86

Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY. 86

Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV. 87

Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas

de papa afectadas por S. subterranea. 100

Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de Nicotiana

benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea. 101

Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY. 103

Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV. 104

Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX. 105

Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS. 105

Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV. 106

Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus

PMTV. 106

Tabla 15 Matriz de identidad para cepas del virus PVY de cultivos de papa de Colombia y

otros países del mundo. 108

Tesis_JFGil_Agosto_14_2010.doc#_Toc269640952


7

Tabla 16 Matriz de identidad para cepas del virus PYVV de cultivos de papa de Colombia y

Perú. 112

Tabla 17. Matriz de identidad para cepas del virus PVS en cultivos de papa de Colombia y

el Mundo. 118

Tabla 18. Matriz de identidad para cepas del virus PLRV de Colombia y el Mundo 122

Tabla 19. Mariz de identidad para cepas del virus PVX de Colombia y el Mundo 126

Tabla 20. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (TGB) de Colombia y el Mundo.

130

Tabla 21. Matriz de identidad para cepas del virus PMTV (CP) de Colombia y el Mundo.

133

Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas. 136

Tabla 23. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del primer fragmento de la

región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 140

Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la

región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 140

Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado

de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo. 142


región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 144

Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región

CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 144

Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB

secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo. 145

Tabla 29. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región P1 secuenciada

para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 150











8

Tabla 30. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada

para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 151


para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo 151


para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo. 155





Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada

para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 160

Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada

para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo. 161

Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp

secuenciada para la cepa Carmen de PVX y su comparación con otros aislamientos del

mundo. 163

Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp


mundo. 164

Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP-

3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros

aislamientos del mundo. 164


para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del

mundo. 167

9

Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR

secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros


Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP

secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros


Tabla 43. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región parcial del

extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV

del Perú. 172


extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de

PYVV del Perú. 172


para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú. 173

Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N.

benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres

metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR). 180

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia

Virgaviridae. 31

Figura 2. Representación del genoma de PMTV. 36

Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus. 39

Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus. 44

Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus. 48

Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus. 52

Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus. 57

Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV. 60

Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades

virales en cultivos de papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia. 89

Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro

departamentos de Colombia. 90

Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente

asociados a enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia,

Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 91

Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente

asociados a enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 12 zonas de muestreo

dentro de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 93

Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con

respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y

MR) en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. 94

11

Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus

Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia.

96


Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia,

Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 97


Potyvirus, PLRV, PVS y PVX en cultivos de papa de 12 zonas productoras de los

departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. 98

Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S.

subterranea. 102

Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de

tejido foliar de plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 107

Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para

aislamientos de PVY obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo.

110

Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a

partir de tejido foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia. 111


aislamientos de PYVV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú. 114

Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de



aislamientos de PVS obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 119

Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de


12


aislamientos de PLRV obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 123

Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de



aislamientos de PVX obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 127

Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir

de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 129

Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para

aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 131

Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de

tejido de raíz de N. benthamiana de tres departamentos de Colombia. 132


aislamientos de PMTV obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. 135

Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir

de tejido de raíz de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 138

Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) y

PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado

en suelo infestado con S. subterranea. 138

Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) y

PMTV1948F – 123end (448 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en

sustrato infestado con S. subterranea. 139

|Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA

RNA3 (647 pb) a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en suelo infestado

con S. subterranea. 139

13

Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para laa región CP de la cepa R25

de PMTV respecto a la secuencia de referencia NC 003724. 141

Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa

R25de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725. 143

Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa

RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003724. 146

Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa

RValle de PMTV con respecto a la secuencia de referencia NC 003725. 147

Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del

departamento de Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb), PVYCPF –

PVYCPR (827 pb); PVYF – 3ntr (1061 pb); PVYF – 3ntrC (1061 pb) 148

Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb), PVYCPF –

3ntrC (1219 pb), a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de

Antioquia. 149

Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la

cepa Ceja respecto a la secuencia de referencia AJ584851.1. 152

Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la

cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867. 153


cepa Ceja respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867. 154


cepa Carmen respecto a la secuencia de referencia AJ585342. 157

Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY

de la cepa Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y 166867. 158

14

Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb), PVX1F-

PVX1651R (1651 pb), PVX3130-PVX4495 (1365 pb), PVX5476F-PVX6415R (939 pb), a

partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 159

Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y

CP de la cepa Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215. 162

Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp

parcial, 3‟RdRp parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa Carmen de PVX, respecto a

la secuencia de referencia EU021215. 165

Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles

12 a 20, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 166

Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de

cepas Carmen y Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y

AJ863509. 168

Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las

cepas de PLRV Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388. 170

Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de

tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Nariño. 171

Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de

PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y

AJ557129.1. 174

Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de

PYVV Obonuco y Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y

AJ557129.1. 175

Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir

de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia. 177

15

Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF,

PVYUnivR y la sonda PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos

departamentos de Colombia. 178

Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRT-

PCR en muestras de tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño. 178

Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a

partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S.

subterranea de cuatro departamentos de Colombia 182

Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F,

PMTV2017R y la sonda PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana

cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro departamentos de Colombia

183

Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRT-

PCR en muestras de tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de

cuatro departamentos de Colombia. 184

16

RESUMEN

El cultivo de la papa representa uno de los renglones agrícolas de mayor importancia en

Colombia, alcanzando cerca de 162.000 ha y una producción que supera 2.721.396 ton.

Este cultivo es afectado por diversas plagas y enfermedades, entre las que se destacan las

polillas de los tubérculos, el tizón tardío y los problemas virales. Diferentes trabajos indican

que los problemas virales reducen los rendimientos y la calidad del tubérculo semilla en

cultivos de papa de todo el mundo, razón por la cual su manejo debe hacer parte

fundamental de los programas de manejo fitosanitario en este cultivo. Esta investigación se

planteó con el fin de evaluar la presencia y características genotípicas de los virus Potyvirus

(PVY), PVX, PLRV, PVS, PYVV y PMTV en los cultivos de papa de los departamentos de

Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, determinándose además los niveles de

incidencia de cuatro de ellos (Potyvirus, PLRV, PVS y PVX) en diez regiones de dichos

departamentos. Adicionalmente, se evaluó la utilidad de la técnica de qRT-PCR para la

detección de los virus PVY y PMTV, seleccionados por su importancia económica y

carácter cuarentenario, respectivamente. Los resultados confirmaron la presencia de los seis

virus bajo estudio en los cultivos de papa de Colombia, siendo los Potyvirus y PVS los de

mayor incidencia con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se

encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Los análisis moleculares de los seis

virus analizados, permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales,

encontrándose que los virus PLRV y PYVV presentan bajos niveles de variación y

diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo, mientras que

los virus PVY y PVS resultaron con niveles apreciables de variación. De gran interes

resultó el hecho que un alto número de cepas colombianas de PVY estuvieron asociadas

17

con la raza PVY-NTN, responsable de la enfermedad conocida como PTNRD. Los virus

PVX y PMTV presentaron un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad,

aunque algunos aislamientos compartieron bajos niveles de identidad con los genotipos de

referencia mundial. El uso de la técnica de qRT-PCR permitió detectar el virus PVY en el

100% de las muestras analizadas y el PMTV en el 45% de raíces de plantas de Nicotiana

benthamiana utilizadas como plantas señuelo para S. subterranea. Estas proporciones de

detección mediante qRT-PCR fueron superiores en 34% y 20% para PVY y PMTV con

respecto a la técnica de ELISA, y en 9% (PVY) y 17% (PMTV) cuando se comparó con

RT-PCR convencional. Se espera que la información generada en esta investigación sea

incorporada para el diseño de metodologías de diagnóstico viral que apoyen los programas

de certificación de tubérculo semilla y los programas de manejo integrado de enfermedades

virales en los cultivos de papa de Colombia.

18

1. INTRODUCCIÓN

El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.) ocupa un lugar importante en la economía

mundial, debido a su uso como fuente de almidón para consumo fresco y para la industria

de alimentos, de concentrados para animales y de bebidas alcohólicas (Horton, 1992). En el

año 2007, la producción mundial de papa alcanzó 325,30 millones de ton con un

rendimiento promedio de 16,8 ton/ha, siendo la región Andina la de mayor crecimiento en

la producción del tubérculo, pasando de 30 millones de ton/año en el decenio de 1960 a

165,41 millones de ton para el 2007. En el año 2005 los países en desarrollo presentaron un

incremento en la producción del tubérculo, a tal punto que alcanzaron a superar la

producción de los países desarrollados. China, Rusia e India, son en su orden los mayores

productores del tubérculo en el mundo, con 72, 36 y 26 millones de ton de papa en el año

2007, respectivamente (FAO, 2008).

Para el mismo año, América Latina tuvo un área cosechada de papa de 963.766 ha, con un

rendimiento promedio de 16,3 ton/ha, un valor cercano al promedio mundial y similar al

Europeo, cuyo rendimiento fue de 17,4 ton/ha. Sin embargo, América Latina presenta una

reducción en el consumo de papa (20,7 kg/persona), lo que contrasta con los altos

consumos que se presentan en regiones como Europa, que alcanzan promedios de 87,8

kg/persona (FAO, 2008).

En Colombia, el cultivo de la papa genera una producción de 2.721.396 ton en

aproximadamente 162.000 ha cosechadas. El rendimiento promedio del cultivo para el

2006 fue de 16,8 ton/ha, valor similar al promedio de rendimiento mundial. La producción

nacional está distribuida en su orden en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá,

Nariño y Antioquia con 398.926, 297.492, 266.112 y 119.854 ton, respectivamente.

19

Alrededor de 25.000 ton/año, son exportadas como papa fresca o refrigerada y el 7% del

total de dichas exportaciones, son representadas por productos procesados. Con respecto a

importaciones del tubérculo, para el año 2006 éstas ascendieron a 84.791 ton, con cerca del

62% correspondiente a papas procesadas, congeladas y féculas (MADR, 2006).

Los principales problemas en la producción de papa en Latinoamérica se pueden definir en

su orden en: problemas de comercialización y poscosecha (variación en precios, costos de

almacenamiento y demanda), las plagas y enfermedades y la reducida calidad del tubérculo

semilla. Esta última está estrechamente relacionada con el segundo aspecto y con la

capacidad técnico-científica de los países productores (Herrera y Scott, 1993). Los efectos

adversos de diferentes factores climáticos también limitan la producción de papa en gran

medida (MADR, 2006), especialmente bajo las condiciones actuales del cambio climático

global.

Desde tiempo atrás se han venido reportando los efectos que tienen los virus en el cultivo

de la papa y principalmente en su rendimiento. Aunque el promedio del rendimiento

nacional para el año 2006 es semejante al promedio mundial obtenido en el año 2007, no es

el óptimo, debido principalmente a la degeneración del tubérculo semilla ocasionado en

gran medida por los patógenos virales (Howard, 1978; Sánchez de Luque et al., 1991). Lo

anterior se evidencia mejor, si se compara el rendimiento promedio de 45 ton/ha en una

región como Inglaterra, donde se cuenta con un estricto sistema de certificación de semilla

(Defra, 2005). Datos similares se han registrado en Latinoamérica en la provincia de

Buenos Aires (Argentina), donde se han reportado rendimientos promedios de 30-50 ton/ha

(Cantos de Ruiz et al., 1989) y en la localidad de Colpac, Huancayo (Perú), donde se

obtuvieron registros de rendimiento que alcanzaron 74 ton/ha (Benza, 2008), cuando se

20

aplicaron medidas para reducir la presencia de virus en el tubérculo semilla y se realizaron

todas las prácticas agronómicas necesarias para el correcto manejo del cultivo.

En el mundo los principales virus que afectan la papa son: PLRV (Potato leafroll virus,

Polerovirus), PVY (Potato virus Y, Potyvirus), PVA (Potato virus A, Potyvirus) y PVX

(Potato virus X, Potexvirus) (Salazar, 1997a), sumándose a éstos PVS (Potato virus S,

Carlavirus) y PYVV (Potato yellow vein virus, Crinivirus) en Colombia (Salazar, 1997a;

Arciniegas, 2003). El efecto del PLRV en variedades susceptibles puede llegar a ocasionar

pérdidas de hasta el 90%, mientras que PVY y PYVV, pueden reducir los rendimientos

hasta en 80% y 60%, respectivamente. Sin embargo los estudios en virología han

demostrado que el efecto sobre la producción en papa es especialmente crítico cuando los

virus se presentan en conjunto; así por ejemplo, la infección simultánea de PVA y PVX

pueden llegar a destruir completamente el cultivo (Arciniegas, 2003; Zapata 2004). Debido

a estos graves efectos sobre la producción de papa, el Instituto Colombiano Agropecuario

(ICA), dirige un Programa Nacional de Certificación de Semilla de Papa cuyas tolerancias

mínimas para virus en cultivos destinados a semilla son los siguientes: para PLRV, PVY,

PVX y PVS no se permite presencia de virus en semilla Super Élite y Élite, 1% de

presencia de virus en semilla básica, 2% en semilla registrada y 5% en semilla certificada.

Para el caso de PYVV no se permite presencia de virus en semilla Super Élite, Élite y

Básica, 1% en semilla registrada y 1% en semilla certificada (Zapata, 2004). Sin embargo,

la utilización sucesiva de tubérculo semilla por parte de los agricultores conduce al

aumento de los niveles de incidencia y severidad de estos virus y de otros no incluidos en el

programa de certificación, generando reducciones importantes en la producción de este

cultivo en el país. Entre los virus no incluidos se destacan el PMTV (Potato mop-top virus,

21

Pomovirus), que según Salazar (2006), está distribuido en todos los Andes suramericanos,

desde Venezuela hasta Bolivia, pero no induce la sintomatología clásica reportada en la

zona templada y por tanto tiende a ser confundido con otros problemas virales o incluso

con problemas abióticos. Este virus fue recientemente detectado por Vélez (2007) en

cultivos de Zipaquirá y Subachoque, mediante RT-PCR con cebadores específicos y a partir

de un ensayo de inoculación en plantas de tabaco mediada por Spongospora subterranea

(Plasmodiophoridae), el agente causal de la sarna polvosa de la papa y que actúa como su

vector en el suelo.

Ya que el problema de la sarna polvosa de la papa causado por S. subterranea se ha

expandido dramáticamente en los últimos años en las principales regiones cultivadores del

tubérculo del país (Jaramillo y Botero, 2007), es posible que paralelamente la infección por

el virus Mop-top también se encuentre en franco aumento, razón por la cual se planteó la

presente investigación, con el objetivo principal de evaluar la presencia de PMTV en las

principales regiones cultivadoras de papa de los departamentos de Antioquia,

Cundinamarca, Boyacá y Nariño, determinado el nivel de variabilidad de las cepas

detectadas mediante análisis de secuencias de la región que codifica para la cápside viral y

implementando una prueba diagnóstico basada en RT-PCR en tiempo real que permita la

detección del PMTV. Dichas evaluaciones fueron acompañadas por el estudio de los

niveles de incidencia de los virus PVY, PVX, PLRV, PVS y PYVV mediante pruebas de

ELISA y análisis de secuencias diagnósticas para determinar su identidad y afinidades

filogenéticas con cepas de dichos virus cuyas secuencias están reportadas en las bases de

datos moleculares. De esta manera el desarrollo de esta investigación ha generado un

cuerpo actualizado de información sobre el estado de la sanidad viral de los cultivos de

22

papa en Colombia y sobre las características genéticas de sus agentes causales, bases para

el diseño de las estrategias de manejo de estas enfermedades en los cultivos de papa de

nuestro país.

23

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Detectar y caracterizar los principales virus que afectan la sanidad de los cultivos de papa de las

regiones productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, con

énfasis en el estudio del virus PMTV.

2.2. Objetivos específicos

Determinar los niveles de incidencia de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY y PMTV

mediante pruebas de ELISA, en las principales regiones cultivadoras de papa de los

departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño.

Evaluar la presencia del virus PMTV en quistosoros de S. subterranea presentes en agallas de

raíces y/o tubérculos y muestras de suelos de lotes afectados por sarna polvosa mediante

pruebas de ELISA y RT-PCR.

Definir las afinidades filogenéticas entre las variantes de los virus PVS, PVX, PLRV, PVY,

PYVV y PMTV identificadas mediante RT-PCR convencional y secuenciación en cultivos de

papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño, y aquellas cuyas

secuencias se encuentran depositadas en las bases de datos moleculares.

Implementar una metodología basada en RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de los

virus PVY y PMTV, seleccionados para este análisis por su importancia económica y

condición cuarentenaria, respectivamente.

24

3. MARCO TEÓRICO

3.1. Virus asociados al cultivo de la papa

El cultivo de la papa es uno de los más afectados por los problemas virales en la agricultura

mundial, siendo reportados al menos 25 virus y viroides (Salazar, 1995; Salazar, 2006) que

se pueden agrupar con base en la dependencia de la papa para su supervivencia y

diseminación. Dentro del grupo de los dependientes se destacan: PVX, PVY, PVS, PVM

(Potato virus M, Carlavirus), PAMV (Potato aucuba mosaic virus, Potexvirus), PMTV,

PLRV, PVT (Potato virus T, Betaflexiviridae sin género asignado), APMV (Andean potato

mottle virus, Comovirus), PBRV (Potato black ringspot virus, Nepovirus), WPMV (Wild

potato mosaic virus, Potyvirus), PSTVd (Potato spindle tuber viroid, Pospiviroid) y APLV

(Andean potato latent virus, Tymovirus). En el segundo grupo, es decir, los que no

dependen de la papa para su supervivencia se encuentran: AMV (Alfalfa mosaic virus,

Alfamovirus), BCTV (Beet curly top virus, Curtovirus), CMV (Cucumber mosaic virus,

Cucumovirus), PYDV (Potato yellow dwarf virus, Nucleorhabdovirus), TRV (Tobacco

rattle virus, Tobravirus), TMV (Tobacco mosaic virus, Tobamovirus), TRSV (Tobacco

ringspot virus, Nepovirus), ToBRV (Tomato black ring virus, Nepovirus), ToSWV

(Tomato spotted wilt virus, Tospovirus) y TSV (Tobacco streak virus, Ilarvirus). Los virus

del primer grupo generalmente presentan un rango de hospederos más restringido o

moderado que los del segundo (Salazar, 1995), mientras que PLRV, PVY, PVA, PVX y

PVS, son considerados los de mayor importancia económica y con la más amplia

distribución mundial (Solomon-Blackburn y Barker, 2001).

Los problemas virales en el cultivo de la papa afectan la producción de tubérculos al

reducir el área fotosintética, la movilización de nutrientes y por tanto la acumulación de

25

carbohidratos para la formación adecuada de los tubérculos, lo cual está asociado

directamente a reducciones del rendimiento y además imposibilita al agricultor para obtener

tubérculo semilla a partir de su propio cultivo (Salazar, 1995). En sistemas agrícolas

tradicionales como los que predominan en las zonas alto-andinas de Suramérica, esta

situación es frecuente y conduce a la pérdida de vigor de la semilla, y a un efecto

acumulativo de diferentes virus que termina por reducir dramáticamente los rendimientos,

al cabo de varios ciclos de siembra-cosecha. En explotaciones tecnificadas, dicha situación

se remedia mediante el empleo de semilla certificada, la cual es monitoreada por los

organismos de sanidad de los estados. Así por ejemplo, en Colombia se permite hasta un

5% de presencia de virus para semilla certificada y de 0 a 1% para semilla básica

dependiendo de los virus (Zapata, 2004), mientras que en Inglaterra los límites permitidos

no superan el 0.01% de plantas con síntomas virales para semilla pre-básica; 4% para

semilla básica y 10% para semilla certificada (Defra, 2006). La siembra de semilla

certificada es sin duda un factor fundamental para el aumento de los rendimientos en este

cultivo.

La degeneración del tubérculo semilla se ha debido entre otras causas, a los virus que

inciden en el cultivo de la papa (Guerrero y Martínez, 1980; Santos Rojas, 1985) y dicha

incidencia se debe principalmente al desconocimiento de los patógenos virales que posee el

tubérculo semilla empleado para la siembra y a la dificultad para su detección prematura, lo

que hace más difícil controlar la diseminación de los virus y mantener rendimientos

óptimos en los cultivos (Howard, 1978; Salazar, 1982). La relación de los patógenos del

tubérculo semilla es bastante estrecha, encontrándose en ocasiones incidencias debidas a la

sucesiva propagación del mismo material hasta del 100% (Secor y Rivera-Varas, 2004).

26

Una ilustración de la degeneración del tubérculo semilla debida a la afección viral, es la

situación del rendimiento en Perú para la década de los 80, en la cual se reportaba una

producción promedio de 8 ton/ha (Salazar, 1986; FAO, 1987), que luego de un proceso de

implementación de programas de saneamiento de semilla y estudios sobre la influencia de

los virus y el tipo de partículas virales relacionadas con la degeneración de las variedades

locales (Ezeta y Scheidegger, 1985) logró aumentarse a 12,1 ton/ha a nivel nacional y a 17

ton/ha en la región costera del país (Nuñez, 2009). Lo anterior indica que la disminución en

el rendimiento productivo del cultivo de la papa puede llegar a niveles críticos en la región

Andina, llegándose a estimar hasta en un 50% (Guerrero y Martínez, 1980).

Además de los virus tradicionalmente encontrados en los cultivos de papa, frecuentemente

se reporta la aparición de nuevas especies o variantes virales y/o ocurre la re-emergencia de

otros virus que habían perdido importancia económica. Dichas situaciones están muy

asociadas a la globalización de los mercados, que facilitan el movimiento de productos de

origen agrícola entre continentes y países, en donde los virus pueden encontrar nuevas

variedades susceptibles y condiciones agroambientales o antropogénicas que favorezcan su

proceso infectivo y dispersión. Algunos ejemplos que ilustran estas situaciones incluyen la

emergencia de la raza PVY-NTN que causa necrosis de tubérculo y los virus codificados

como SB26/29 y SB41, que causan mosaicos severos y enanismos en cultivos de papa del

Perú, con reducciones en el rendimiento de hasta el 80% para SB26/29 (transmitido por el

Psyllidae, Russelliana solanicola) (Rojas et al., 1993; Tenorio, 2000; Salazar, 2006). De

otra parte el virus PMTV ha sido reportado en diferentes regiones del continente americano,

representa una gran preocupación para los productores en Norte América, donde fue

reportado en 1991-1992 (Xu et al., 2004; Johnson, 2009) y en Costa Rica se ha detectado

27

mediante serología en el 50% de las muestras evaluadas, principalmente en las zonas con

altitudes comprendidas entre 1800 y 2500 msnm (Vásquez et al., 2006). En Colombia

PMTV fue recientemente reportado en cultivos de papa de Cundinamarca y Boyacá (Vélez,

2007). Como anota Salazar (2006), esta variación en re-emergencia de algunos virus y la

aparición de otros nuevos, puede estar influenciada fuertemente por los cambios climáticos

que además de afectar la fisiología del cultivo, influyen sobre las poblaciones de los

vectores de los virus, razones por las que es necesario mantener una vigilacia fitosanitaria

permanente que conduzca a evitar su diseminación y efecto económico en la producción de

los cultivos.

3.2 Virus asociados al cultivo de la papa en Colombia.

En estudios realizados desde años atrás en el país, se ha evidenciado la presencia e

interacción de diversos virus afectando el cultivo de la papa. Tal es el caso de los virus

PVX, PVY y PLRV, para los cuales se reportaron pérdidas del orden del 61% en

rendimiento (Guerrero, 1978). Además de estos virus, en las últimas décadas ha cobrado

importancia el PYVV (Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004), gracias a su eficiente

diseminación por parte de Trialeurodes vaporariorum, un insecto que es además

comúnmente encontrado en otros cultivos de la región Andina como frijol (Phaseolus

vulgaris), zanahoria (Daucus carota) y diversas plantas arvenses (especialmente solanáceas

silvestres y poáceas) (Salazar, 1997b). Más recientemente, se ha reportado en el país el

virus PMTV o Mop-top de la papa (Vélez, 2007); dicho virus puede causar pérdidas

estimadas de hasta 25% en rendimiento en la región templada, lo que sumándose al efecto

del daño ocasionado por su vector S. subterranea, pudiera ascender a valores de 50 - 80%

28

(Jones y Harrison, 1972; Guerrero, 1997; Guerrero, 2000). Según Salazar (2006), el PMTV

es uno de los virus que ha sido prevalente en el cultivo de la papa en los andes

sudamericanos, pero su efecto sobre el rendimiento del cultivo no se ha establecido

claramente en esta zona. La enfermedad inducida por PMTV presenta una amplia gama de

síntomas dependiendo de la variedad del cultivar, que incluyen amarillamiento foliar,

anillos necróticos y cuarteamiento de tubérculos y moteados tipo Äucuba¨ (Salazar, 1995;

Sokmen et al., 1998; Xu et al., 2004). En Colombia, no es posible identificar con exactitud

la sintomatología que induce PMTV en los cultivos de papa, pudiéndose confundir con

desordenes fisiológicos o afecciones de otros patógenos, incluyendo algunas razas de PVY

y PVS.

Con respecto a la importancia económica de estos virus en Colombia, se han realizado

diferentes estudios tendientes a estimar los porcentajes de reducción atribuibles a los

principales virus que afectan el cultivo de papa. Así, para PYVV se estimó que bajo las

condiciones del centro experimental La Selva de CORPOICA (Rionegro, Antioquia), este

virus ocasiona una disminución del 28% en la variedad Diacol Capiro (Zapata, 2004). En

los casos de PVX, PVY y PLRV, estudios realizados en la variedad ICA-Puracé,

encontraron que las inoculaciones individuales de los virus PVX y PVY en plantas sanas no

ocasionaron una disminución significativa en el desarrollo y rendimiento del cultivo; sin

embargo, su inoculación conjunta, condujo a pérdidas del orden del 61%. Las inoculaciones

individuales de PLRV ocasionaron pérdidas de 47% respecto al testigo, mientras que el

asocio de PVY y PLRV redujo la producción en un 55%. Finalmente, cuando se inocularon

conjuntamente PVX-PVY y PVX-PLRV, estos valores fueron del 39% y 24%,

respectivamente (Guerrero y Martínez, 1980).

29

Por otra parte, en un estudio en el que se evaluaron la incidencia y los efectos en los

rendimientos de los virus PVX, PVS, PVY y PLRV en tres regiones altitudinales (páramo-

3200 msnm, media-2600 msnm y baja-2150 msnm) sobre las variedades Parda Pastusa,

ICA Puracé, Diacol Capiro e ICA Tequendama, a lo largo de tres años consecutivos

empleando los tubérculos semilla del mismo experimento, se encontró que la zona baja fue

la que presentó mayor incidencia viral, con valores de 68 y 87% para el primer y segundo

semestre del año y disminuciones en el rendimiento del 50 y 40%, respectivamente. La

zona media tuvo incidencias del 34 y 46% y disminución en el rendimiento del 14 y 30%.

En la zona del páramo, la incidencia fue tan sólo del 18% y no se presentó una disminución

evidente en la producción durante el primer semestre; sin embargo, para el segundo

semestre las incidencias fueron del 30% reduciéndose el rendimiento en un 3%. Los

resultados confirmaron la relación estrecha entre el incremento de las poblaciones de áfidos

y otros insectos vectores con la incidencia de los virus que afectan papa (Sánchez de Luque

et al., 1991).

Para Solanum phureja, en un estudio con 800 muestras de los municipios de Nariño y

Cundinamarca y que estimó la incidencia de virus mediante Inmuno-impresión, se

encontraron valores de 86%, 72%, 39% y 91%, para los virus PVS, PVY, PVX y PLRV,

respectivamente. Esta misma evaluación se realizó al material del banco de germoplasma

de la Colección Central Colombiana de S. phureja y en este caso los valores de incidencia

fueron de 20%, 19%, 5.7% y 6,6%, respectivamente (Guzman et al., 2004a).

30

3.3. Generalidades de algunos virus asociados al cultivo de la papa.

3.3.1. Familia Virgaviridae.

La familia taxonómica Virgaviridae fue recientemente descrita y agrupa virus cuya

partícula viral posee forma de bastón (Latín Virga). Incluye los géneros Furovirus (5

especies), Hordeivirus (4 especies), Pecluvirus (2 especies), Pomovirus (4 especies),

Tobamovirus (25 especies) y Tobravirus (3 especies) y un total de 43 especies descritas.

Las características del grupo son entre otras, proteínas de replicación de tipo alfa, genoma

de ARN de sentido positivo con un motivo de ARN de transferencia asociado a su extremo

3‟ terminal, forma de bastón de sus viriones y un canal central de 20 a 25 nm de diámetro.

Por último, las proteínas de cápside poseen tamaños que oscilan entre 19 a 24 kDa (Adams

et al., 2009; ICTV, 2010).

Los virus de esta familia se caracterizan también por poseer al menos una proteína de

movimiento “30K”, como es el caso de Furovirus, Tobamovirus y Tobravirus. Por su parte,

Hordeivirus, Pecluvirus y Pomovirus, tienen un grupo de tres proteínas relacionado con su

movimiento sistémico en la planta denominado “TGB” (Bloque triple de genes). Existen

algunas diferencias en la organización de sus genomas y el número de ARN que los

componen varía desde 1 a 3 dependiendo del género. Hordeivirus y Pomovirus poseen tres

ARN genómicos (ARNg), pero el primer grupo tiene su motivo de ARN polimerasa

dependiente de ARN (RdRp) en un ARN diferente al de los motivos Helicasa y Metil-

transferasa, los cuales están juntos en los demás géneros de la familia. Tobamovirus es el

único género cuyos integrantes poseen un solo ARN como genoma y no es transmitido por

un patógeno del suelo; el resto de miembros de la familia poseen dos ARNg (Adams et al.,

2009).

31

Mediante el análisis filogenético de la RdRp de los virus de la familia con aquellos

agrupados como Benyvirus (viriones con forma de bastón), miembros de las familias

Closteroviridae y Bromoviridae, el género Idaeovirus y miembros del orden Tymovirales,

se encontró que los géneros que agrupa la familia Virgaviridie están fuertemente soportados

por la alta relación filogenética de sus secuencias y que los virus del género Benyvirus son

realmente distantes de la familia en cuestión (Adams et al., 2009). En la figura 1 se pueden

visualizar las diferencias en los genomas de los virus pertenecientes a la familia

Virgaviridae.

Figura 1. Diagrama representativo de los seis géneros que conforman la familia Virgaviridae. (M) Motivo

Metil-transferasa, (H) Motivo Helicasa, (R) Motivo RdRp, el Bloque triple de genes (TGB) esta representado

por los cuadros en tramas, (MP) Proteínas de movimento de la superfamília “30K”, (C) Proteína rica en

cisteína o “CRP”. Los triángulos representan sitios de supresión del codón de finalización. (t) representa

motivos de ARN de transferencia con los aminoácidos que acepta. Los corchetes representan ORF que no

están presentes en algunas razas. Tomado de Adams et al, (2009).

32

Género Pomovirus

El género Pomovirus deriva su nombre de la especie tipo Potato mop-top virus (PMTV). El

género está compuesto por tres especies además de PMTV: Beet soil-borne virus (BSBV),

Beet virus Q (BVQ) y Broad bean necrosis virus (BBNV). BSBV y BVQ son transmitidos

por Polymyxa betae (Meunier et al., 2003), mientras que BBNV es transmitido por P.

graminis y PMTV por S. subterranea (Deacon, 2010). Los virus de este género poseen

viriones con simetría helicoidal cuyas longitudes varían de 60 a 310 nm, dependiendo del

virus (Büchen-Osmond, 2010) y el ARN. PMTV posee 3 moléculas de ARN con tamaños

de 6,4 kb, 3 kb y 2,5 kb, con caperuzas hacia el extremo 5‟ y una estructura tipo ARNt

hacia el extremo 3‟. El coeficiente de sedimentación de las partículas formadas es de 230,

170 y 125S. El ARN 1 codifica para una proteína que tiene motivos de metiltransferasa y

helicasa (ORF 1) y una proteína generada por supresión del codón de finalización del ORF

1 con motivos de RdRp. Cerca del extremo 3´del ARN 2 se presenta una proteína asociada

a la transmisión por vector y generada a partir de la supresión del codón de terminación del

ORF que codifica para CP. Esta proteína parece ser la responsable de la pérdida de la

estructura helicoidal en los extremos del ARN durante el proceso de desensamblaje. El

ARN 3 codifica para cuatro polipéptidos de 51, 21, 13 y 8 kDa, respectivamente. Los

primeros tres presentan secuencias similares a proteínas de TGB de otros virus,

involucradas en el movimiento célula a célula. La función de la cuarta proteína, una

proteína rica en cisteína (CRP), parece ser la de actuar en el incremento de la virulencia; sin

embargo, no es indispensable para el proceso infectivo (Reavy et al., 1998; Savenkov et al.,

2003).

33

Las secuencias de los virus de este género comparten menos del 80% de identidad cuando

se comparan sus genomas completos y menos del 90% cuando se comparan las secuencias

de aminoácidos de la proteína de cápside. También difieren en su rango de hospederos,

especies vectores, morfología de los cuerpos de inclusión en tejidos, relaciones serológicas

y componentes del genoma, particularmente presencia o ausencia de CRP (Büchen-

Osmond, 2010).

La especie PMTV es transmitida por zoosporas de S. subterranea y BSBV es transmitido

por P. betae, ambos plasmodiofóridos que afectan los sistemas radiculares de sus

hospedantes. Estos virus también pueden ser transmitidos por semilla asexual. Los virus

pueden permanecer en las estructuras de resistencia de sus vectores por varios años en el

suelo (Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006).

Potato mop-top virus (PMTV)

PMTV es transmitido de forma persistente y muy específica por S. subterranea f. sp.

subterranea, agente causal de la sarna polvosa de la papa. S. subterranea posee unas

estructuras de resistencia denominadas quistosoros (conglomerado de esporas de resistencia

características del patógeno) que pueden sobrevivir en el suelo durante largos periodos de

tiempo. El patógeno inicia su infección cuando lo quistosoros liberan las zoosporas

primarias, las cuales se adhieren a los pelos radicales de la planta y comienza la fase de

penetración, empleando para ello un “estilete” que se genera posterior a la formación del

“tubo” por el quiste infectivo. Este tubo, junto con el estilete, son los que permiten que el

protoplasto del patógeno ingrese al interior de la célula del hospedero. Una vez dentro de

34

las raíces de la planta, el patógeno forma un plasmodio primario multinucleado con una

delgada membrana que posteriormente se convierte en un zooesporangio, el cual será

liberado a la fase líquida del suelo como zoosporas secundarias (Dijkstra y Khan, 2002;

Merz y Fallon, 2009).

En los ensayos de transmisión del virus se ha observado que éste es transmitido

eficientemente a plantas indicadoras (ej. N. tabacum y N. benthamiana) a partir de muestras

de suelo infestadas con quistes del patógeno (Campbell, 1996; Vélez, 2007).

El virus posee tamaños de 6043 nt (ARN 1), 3134 nt (ARN 2) y 2964 nt (ARN 3) (PMTV

accesiones de GenBank N° NC_003723.1, NC_003724.1 y NC_003725.1,

respectivamente). Su virión consiste en una partícula elongada con simetría helicoidal en

forma de bastón con longitudes de 100 a 150 nm y 250 a 300 nm, y un diámetro de 18 a 20

nm. El coeficiente de sedimentación corresponde a 236S, TIP de 75 a 80°C, LIV mayor a

200 días y el DEX alrededor de 3 (Büchen-Osmond, 2010).

El ARN 1 tiene dos ORF, el primero codifica para la proteína de 149 kDa y el segundo

produce la proteína RdRp mediante la estrategia de supresión del codón de parada. En las

proteínas de dicho ARN se han detectado además dominios de metiltransferasa y helicasa

(Savenkov et al., 1999). El ARN 2 tienen una estrategia similar, con dos ORFs los cuales

codifican para la CP y para una proteína generada por supresión del codón de parada

denominada CP2 (Figura 2). El ARN 3 codifica para TGB y para CRP, como se enunció en

las generalidades de los Pomovirus (Savenkov et al., 2003).

El PMTV constituye un pequeño grupo de virus que para su movimiento sistémico en la

planta hospedante no requiere de la expresión de CP, ni de la formación del virión

(McGeachy y Barker, 2000), debido a que el TGB le ofrece la posibilidad de mover el ARN

35

infeccioso a través de largas distancias en la planta (Melander et al., 2001). Dicho ARN

desnudo se puede encontrar en tubérculos asintomáticos y causar una infección secundaria

para la siguiente temporada de siembra (McGeachy y Barker, 2000). La manifestación de

los síntomas característicos de la enfermedad depende de la presencia de los tres ARN en el

tejido (Savenkov et al., 2003).

Los principales síntomas que causa PMTV en cultivos de regiones templadas corresponden

a mosaicos tipo “aucuba” en las hojas y anillos necróticos y agrietamientos en los

tubérculos. En las variedades cultivadas en los Andes estos síntomas no son evidentes, y en

su lugar se presentan amarillamientos foliares, enanismos y acortamiento de entrenudos

(Salazar, 1995; Dijkstra y Khan, 2006; Büchen-Osmond, 2010). En condiciones

experimentales el virus puede infectar plantas de las familias Chenopodiaceae, Solanaceae

y Tetragoniaceae. Dentro de estas se encuentran las plantas que se usan para su

diagnóstico, las cuales corresponden a Nicotiana debneyi y Chenopodium amaranticolor,

en las que se produce necrosis sistémica y lesiones locales concéntricas cafés,

respectivamente. Nicotiana benthamiana, N. debneyi y N. clevelandii, son las especies más

apropiadas para el mantenimiento y propagación del virus bajo condiciones experimentales

(Büchen-Osmond, 2010).

36

Figura 2. Representación del genoma de PMTV. a. En las cajas se observan las proteínas para las que

codifica el genoma. Las flechas indican las proteínas originadas y los ARN subgenómicos (ARNsg). b.

Representación de la encapsidación independiente de los tres ARN de PMTV. Fuente:

http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/643.html.

3.3.2. Familia Potyviridae

La familia Potyviridae debe su nombre al género Potyvirus. Dentro de la familia se

encuentran los géneros, Brambyvirus (1 especie), Bymovirus (6 especies), Ipomovirus (4

especies), Macluravirus (6 espcies), Potyvirus (143 especies), Rymovirus (3 especies),

Tritimovirus (4 especies) y 3 especies sin género asignado: Spartina mottle virus (SpMoV),

Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) y Tomato mild mottle virus (TomMMoV). Es la

familia taxonómica con mayor número de especies de virus de plantas, con 170 especies

formalmente reconocidas por el ICTV (ICTV, 2010), los que se caracterizan por su

morfología filamentosa y flexuosas de 11 a 15 nm de diámetro con simetría helicoidal y

longitudes de 650 a 900 nm para los virus monopartita (Brambyvirus, Ipomovirus,

http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/643.html

37

Macluravirus, Potyvirus, Rymovirus, Tritimovirus) y de 200-300, 500-600 nm para los

virus bipartita del género Bymovirus (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007) (Figura 3).

Su ARN es de cadena sencilla con sentido positivo y lleva una proteína VPg (Proteína viral

asociada al genoma) de alrededor de 24 kDa unida covalentemente al extremo 5‟ y una

poly-A de longitudes variables hacia el extremo 3‟. Cada ARN comprende un solo ORF

que traduce una poliproteína de 340-370 kDa que es clivada por las proteasas virales para

generar las proteínas funcionales del virus. Su genoma es de 10 kb rodeado por cerca de

2000 copias de la proteína de cápside (CP) (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La familia

Potyviridae también se caracteriza por inducir inclusiones cilíndricas citoplasmáticas (CI),

como ruedas de carreta (pinwheels) o agregados laminares. Estas CI contienen proteínas

codificadas por el genoma viral que poseen actividad Adenosín trifosfatasa (ATPasa) y

Helicasa. Otra proteína viral, HC-Pro (Helper component protease) provoca inclusiones

amorfas (AI) en las que generalmente se encuentran asociadas organelas degradadas de la

célula con partículas virales. Esta proteína, también posee funciones de proteinasa y se

asocia a la transmisión por el vector (Dijkstra y Khan, 2006; Urcuqui-Inchima et al., 2001).

Género Potyvirus

El nombre del género Potyvirus se deriva de la especie “Potato virus Y” (Dijkstra y Khan,

2006). El género posee 143 especies aprobadas, lo que le convierte en el más numeroso de

los siete géneros de la familia (ICTV, 2010). Las partículas virales tienen una longitud de

680 a 900 nm, cuyos viriones poseen un coeficiente de sedimentación de 150 a 160S, una

densidad de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl y un genoma de ARN con alrededor 9700 nt

(Dijkstra y Khan, 2006).

38

Como ya se había indicado, el genoma contiene solo un marco de lectura abierto (ORF) que

codifica para una poliproteína de 340-370 kDa (Riechmann, et al., 1992; Riechmann et al.,

1995) que es procesada posteriormente, por acción de tres proteasas en siete proteínas

pequeñas: P1, componente asistente (Helper Component); P3, de inclusión cilíndrica (CI);

inclusión nuclear A (NIa); inclusión nuclear B (NIb); proteína de cápside (CP) y dos

proteínas putativas denominadas 6K1 y 6K2 (Riechmann et al., 1992) (Figura 3). Las

proteasas corresponden a la proteinasa P1 y del componente asistente (HC-pro), que

catalizan solo reacciones autoproteolíticas en los extremos C-terminales (Carrington et al.,

1989; Verchot, et al., 1991), mientras que los clivajes restantes son catalizados mediante

mecanismos trans y autoproteolíticos mediados por la proteína de inclusión nuclear (NIa-

Pro), un homólogo de la proteinasa del Picornavirus 3C (Langenberg y Zhang, 1997). El

procesamiento y función de todas estas proteínas es aún controversial pero se cree que

muchas de ellas son multifuncionales (Riechmann et al., 1992; Verchot y Carrington 1995;

Mahajan et al., 1996).

39

Figura 3. Organización del genoma de un potyvirus. a. Se observa el ARN genómico asociado a VPg hacia el

extremo 5‟ y la poly-A en el extemo 3‟. Dentro de lo demarcado como una caja se detalla la poliproteína con

las proteínas maduras luego del clivaje. Se indican con flechas las proteínas que realizan el clivaje y los

lugares donde ocurre el mismo. b. Representación del virión de un Potyvirus. Fuente:

http://ca.expasy.org/viralzone/all_by_species/50.html

Potato virus Y (PVY)

El virus PVY posee un genoma de 9704 nt (PVY raza N, accesión del GenBank No.

X12456.1), una proteína VPg hacia su extremo 5‟ y poliadenilación (poly-A) hacia el

extremo 3‟ (Shukla et al., 1994). La morfología del virus consiste en una cápside no

envuelta, elongada con simetría helicoidal monopartita y flexuosa, una longitud de 684 nm

a 730 nm, diametro de 11 nm y un canal axial de 2-3 nm (Ogawa et al., 2008). La proteína

de la cápside (CP) es el principal componente del virión con aproximadamente 2000

unidades monoméricas (Urcuqui-Inchima et al., 2001). La densidad de los viriones en CsCl

es de 1.323 g/cm3 para cepas tipo PVY-O y de 1.326 g/cm

3 para cepas PVY-N. El punto de

inactivación térmico (TIP) es de 50-62 °C, su longevidad in vitro (LIV) de 7 a 50 días y el

http://ca.expasy.org/viralzone/all_by_species/50.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=X12456

40

exponente decimal (DEX) de la dilución esta usualmente entre 2 a 6. La infectividad de las

partículas no cambia por tratamientos con éter y es inactivado con fenol o diferentes

detergentes (Gibbs y Mackenzie, 1997; Van Regenmortel et al., 2000; Hsu et al., 2005).

La especie PVY esta formada por un complejo de diferentes aislamientos (Smith, 1931),

siendo la primera variante identificada del virus la denominada PVC (Potato virus C), que

luego pasó a ser llamada PVY-C (Bawden, 1943). Históricamente los aislamientos del virus

se han dividido en tres razas principales: PVY-O, PVY-N, y PVY-C, de acuerdo a los

síntomas inducidos en Nicotiana tabacum cv. Samsun y Solanum tuberosum ssp.

tuberosum (Delgado-Sánchez y Grogan, 1970). Hay que tener en cuenta además que no

todas las variantes del virus son transmitidas por áfidos, como ocurre con algunos

aislamientos de la raza PVY-C (Blanco-Urgoiti et al., 1998). Más recientemente se ha

incorporado en la clasificación de sus variantes el criterio del tipo de antigenicidad de su

proteína de cápside y los genes de resistencia que vence en el hospedante; tal es el caso del

aislamiento denominado PVY-Z, el cual esta serológicamente clasificado como PVY-O,

pero que sobrepasa los genes Nytbr y Nc (Jones, 1990) y elicita el gen Nz en las plantas

(Singh et al., 2008). Otro grupo es denominado PVY-N-Wilga (PVY N-Wi), el cual tiene

propiedades biológicas de los aislamientos PVY-N, pero está serológicamente clasificado

como PVY-O, lo que permite deducir que presenta un genoma recombinante entre las

secuencias de los dos tipos de aislamientos (Glais et al., 2002a). En los últimos años se ha

detectado una variante adicional denominada PVY-NTN, serológicamente relacionada con

PVY-N, pero que causa anillos necróticos en tubérculos de papa, enfermedad conocida

como PTNRD (Potato tuber necrotic ringspot disease) y que puede ocasionar pérdidas

hasta del 100% en este cultivo (Kogovsek et al., 2008).

41

Dentro de las regiones que determinan la variabilidad del virus o mejor, del complejo viral,

se ha determinado que las regiones 5ŃTR (Región no traducible del 5‟) y de la proteína

P1, corresponden a las secuencias más variables en el género Potyvirus, siendo responsable

hasta de un 28% de la variabilidad total existente entre los grupos O y N (Marie-Jeanne-

Tordo et al., 1995; Ward et al., 1995). Hacia el interior de la región CP (Glais et al., 2002a;

Ohshima et al., 2000) ó dentro de la región del gen HC-Pro (Schubert et al., 2007), es

posible que se encuentre la secuencia responsable de los síntomas PTNRD. De otra parte,

las regiones NIb y 3‟-NTR, constituyen puntos de variación y recombinación, y pueden

servir para diferenciar las razas o patotipos del virus a partir del estudio de sus secuencias

(Kogovsek et al., 2008).

El PVY es transmitido de forma mecánica, por injerto y por áfidos de manera no

persistente, principalmente por la especie Myzus persicae, aunque también se han reportado

Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Myzus (Nectarosiphon) certus, Myzus (Phorodon)

humuli y Rhopalosiphum insertum. No requiere de un virus auxiliar; sin embargo, si puede

facilitar la transmisión de otros virus como el Potato aucuba mosaic virus.

Experimentalmente, se pueden emplear especies de las familias Solanaceae,

Commelinaceae y Chenopodiaceae para las pruebas biológicas de transmisión y expresión

de síntomas, así como también para obtener fuente de inóculo. Dentro de dichas familias, se

destacan las especies Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Chenopodium

amaranticolor, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicum, Nicotiana glutinosa,

Nicotiana tabacum, Physalis floridana, Solanum chacoense, Solanum demissum, Solanum

demissum x S. tuberosum, Solanum tuberosum, Tinantia erecta. Luego de las

inoculaciones, en N. glutinosa y N. tabacum, se pueden desarrollar síntomas tales como

42

moteado sistémico suave o severo y aclaramiento sistémico de venas. En papa,

dependiendo de la variedad y la raza viral, se pueden desarrollar síntomas que van desde

moteados y clorosis en las venas hasta necrosis de tubérculo (Büchen-Osmond, 2010).

3.3.3. Familia Alphaflexiviridae

La familia Alphaflexiviridae pertenece al orden Tymovirales y está compuesta por seis

géneros: Allexivirus (8 especies), Botrexvirus (1 especie, Micovirus), Lolavirus (1 especie),

Mandarivirus (1 especie), Potexvirus (35 especies) y Sclerodarnavirus (1 especie,

Micovirus) que suman un total de 57 especies. Los virus de este grupo taxonómico se

caracterizan por poseer viriones filamentosos flexuosos entre 470 a 800 nm y 12-13 nm de

diámetro, constituidos por subunidades de una sola CP. Son virus monopartita con ARN de

sentido positivo con tamaños de 5.4 a 9 kb, su primer ORF codifica para una RdRp tipo

potex y poseen TGB que se expresan a partir de ARNsg (ARN subgenómico). El extemo 5‟

posee una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Su genoma

varía entre 6.400 a 9.300 nt (Huang et al., 2004; Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;

ViralZone, 2010; DPVweb, 2010). Hacia el extremo 5‟ se encuentra una proteína replicasa

tipo alfa constituida por motivos metiltransferasa, helicasa y RdRp y hacia el extremo 3‟ se

ubica el gen CP, que codifica para proteínas de 22 a 44 kDa (Dijkstra y Khan, 2006). En

esta familia recientemente se incluyó el género Sclerodarnavirus, que carece de cápside e

infecta al hongo Sclerotinia sclerotiorum; de allí deriva su nombre Sclerotinia sclerotiorum

debilitation-associated RNA virus (SsDRV). El virus solo posee un ORF que codifica para

la replicasa tipo alfa, altamente relacionada filogenéticamente con los géneros Allexivirus,

43

Potexvirus y Mandarivirus, siendo la carencia de cápside razón suficiente para ser

considerado un género diferente (Adams y Kreuze, 2008a).

Género Potexvirus

Este nombre se deriva de la especie tipo Potato virus X (PVX). El género se caracteriza por

poseer viriones filamentosos flexuosos con simetría helicoidal y longitudes de 470 a 580

nm (Huang et al., 2004) y un diámetro de 13 nm. Los viriones poseen un coeficiente de

sedimentación que se encuentra entre los rangos 115 a 130S y un coeficiente de densidad

de flotación de 1,31 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006).

La molécula de ARN contiene cinco ORF (Figura 4) y su tamaño es de 6,4 kb. El ARNg,

lleva a la expresión del ORF 1, el cual contiene los motivos metiltransferasa, helicasa y

polimerasa. Desde el ORF 2 al 5, el virus emplea la estrategia de ARNsg. Los ORF 2, 3 y 4

son traslapados y constituyen el TGB, que codifica para proteínas de 25, 12 y 8 kDa,

respectivamente, involucradas en el movimiento del virus célula a célula. El ORF 2

también contiene un segundo motivo helicasa, mientras que el ORF 5 codifica para la

proteína CP (Dijkstra y Khan, 2006; Verchot-Lubicz et al., 2007). Los NTR de los virus de

este género, juegan un papel importante en la regulación y el movimiento del virus a través

de las células de su hospedero. El 5‟NTR está implicado en la regulación de la síntesis del

ARNg, ARNsg, la encapsidación del virus y el transporte del virus por los plasmodesmos.

Por su parte, el 3‟NTR está involucrado en la síntesis, tanto de la cadena positiva del ARN

como de la negativa (Verchot-Lubicz et al., 2007).

44

Dentro del género Potexvirus se han descrito 35 especies (ICTV, 2010). Estos virus se

transmiten fundamentalmente de forma mecánica, aunque algunas especies se transmiten

por semilla, como es el caso de WClMV (White clover mosaic virus) (Astier et al., 2007).

Figura 4. Representación del genoma de un Potexvirus. a. En las cajas se indican los ORF. En la parte

inferior se ilustra la formación de los ARNsg, que dan origen a las proteínas de movimiento (TGB) y CP. b.

Representación del virión de un Potexvirus. Fuente: http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/272.html

Potato virus X (PVX)

El virus PVX se caracteriza por tener una longitud de 470 a 580 nm y un diámetro de 13

nm con simetría helicoidal (ICTV, 2000), un genoma de 6,435 kb de ARN con sentido

positivo (PVX raza Tula, accesión del GenBank N° EU021215.1) contenidos en una varilla

flexuosa (monopartita) (Huisman et al., 1988); posee una caperuza hacia el extremo 5‟ al

igual que una región 5‟NTR compuesta por 84 nt, cinco ORF y una secuencia 3‟NTR de 72

http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/272.html

45

nucleotidos (nt) (Skryabin et al., 1988). El virión tiene un canal axial central de cerca de 3

nm de diámetro. La densidad en gradiente de CsCl es de 1,31 g/cm3. La cápside del virus

está compuesta por alrededor 1.000 a 1.500 subunidades de la proteína CP, que en algunos

aislamientos de PVX es glicosilada (ICTV, 2000). Su PI corresponde a un pH de 4,4, con

un TIP de 68-76°C, LIV de 40-60 días y un DEX de 5 a 6. Las proteínas constituyen un

94% del peso de la partícula y su virión sólo tienen una proteína estructural (CP) (Büchen-

Osmond, 2010).

En la región 5‟NTR, el virus posee un motivo repetitivo de ACCA muy conservado entre

aislamientos de PVX, pero no siempre presente en todas las especies del género Potexvirus;

por ejemplo Potato aucuba mosaic virus no cuenta con dicho motivo. Esta región 5‟NTR,

interactúa con regiones complementarias a lo largo del genoma que funcionan como

promotores de la transcripción de los ARNsg y presentan estructuras secundarias del tipo

tallo-asa (SL) que participan en la regulación de la síntesis del ARN (Vechot-Lubicz et al.,

2007). Mutaciones dirigidas a esta secuencia repetida (ACCA), han mostrado que las

repeticiones localizadas entre los nt 9 a 13 son indispensables para la acumulación del

ARNg y además afectan la replicación viral (Morozov et al., 1991; Verchot et al., 1998;

Park et al., 2008).

El virus se puede transmitir por inoculación mecánica y de manera natural por contacto

entre plantas, pero no por polen o semilla. Las especies susceptibles al virus se encuentran

en las familias Amaranthaceae, Cruciferaceae y Solanaceae, siendo Brassica campestris

ssp. rapa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Nicotiana tabacum y Solanum

tuberosum, especies comúnmente utilizadas para su estudio. Los síntomas en papa varían

dependiendo de su interacción con otros virus, pudiendo originar mosaicos, moteados,

46

manchas anulares y necrosis, mientras que en Datura stramonium y N. tabacum,

corresponden a anillos cloróticos sistémicos seguidos de moteados y anillos cloróticos o

moteados, respectivamente (Büchen-Osmond, 2010).

3.3.4. Familia Betaflexiviridae

La familia Betaflexivirida al igual que Alphaflexiviridae, pertenecen al orden Tymovirales.

La familia está integrada por los géneros Capillovirus (2 especies), Carlavirus (43

especies), Citrivirus (1 especie), Foveavirus (4 especies), Trichovirus (5 especies), Vitivirus

(6 especies), además de seis especies sin un género asignado: African oil palm ringspot

virus (AOPRV), Banana mild mosaic virus (BanMMV), Cherry green ring mottle virus

(CGRMV), Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV), Potato virus T (PVT) y

Sugarcane striate mosaic-associated virus (SCSMaV), sumando un total de 67 especies en

la familia. Los virus de este grupo se caracterizan por poseer viriones filamentosos

flexuosos de 600 a 1000 nm de longitud y de 12 a 13 nm de ancho. Poseen genomas de

tamaños que oscilan entre 6.5 a 9 kb de ARN de sentido positivo, cuyo extremo 5‟ posee

una caperuza de Metilguanosin y su extremo 3‟ tiene una cola poly-A. Otra característica

determinante de la familia, es que su RdRp es de tipo carlavirus y con tamaños que varían

de 150 a 250 kDa, posee una o varias proteínas de movimiento (TGB en Carlavirus y

Foveavirus y 30K en los demás géneros), la CP posee tamaños variables, de acuerdo al

género, de 22 a 44 kDa. Se denominó Beta, debido a que es la segunda familia creada de la

división de la antigua familia Flexiviridae (Adams y Kreuze, 2008b; ICTV, 2010,

ViralZone, 2010; DPVweb, 2010)

47

Género Carlavirus

El virus tipo del género es el Carnation latent virus (CLV). Los 43 virus del género poseen

partículas flexuosas de 470 a 1000 nm, con diámetros de 12 a 15 nm con simetría

helicoidal. Los viriones tienen coeficientes de sedimentación entre 147 a 176S y densidades

de flotación de 1,31 a 1,33 g/cm3 en CsCl (Dijkstra y Khan, 2006, ViralZone, 2010). Sus

genomas son de ARN de cadena sencilla de sentido positivo con tamaños de 5.8 a 9 kb;

hacia el extremo 5‟ presentan una caperuza y hacia el extremo 3‟ tienen una cola poly-A

(ViralZone, 2010). La TIP se encuentra entre 55 a 85°C, dependiendo de la especie del

virus. Poseen 6 ORF: El ORF 1, representa alrededor del 70% del genoma y su proteína

presenta tres dominios: hacia el N-terminal de metil-transferasa, un dominio con motivos

de helicasa en la parte central y el motivo de polimerasa hacia el extremo C-terminal. Esta

proteína es autocatalítica. Los ORF 2, 3 y 4 forman el TGB involucrado en el movimiento

de la partícula viral, además la proteína 2 posee un motivo helicasa y las proteínas 3 y 4

poseen regiones posiblemente transmembranales muy hidrofóbicas. Estas proteínas se

expresan mediante ARNsg (Figura 5). El ARNsg que se genera de los ORF 5 y 6 da origen

a las proteínas CP y CRP; ésta última permite la unión del ARN a la cápside. Cabe destacar

que la polimerasa de estos virus guarda homología con la polimerasa de los Potexvirus,

Closterovirus y Tymovirus (Foster, 1992; Zavriev et al., 1991).

La transmisión de los virus se da por inoculación mecánica ó por áfidos de forma no

persistente. Algunas especies son transmitidas por Bemisia tabaci (Cowpea mild mottle

virus, CPMMV) o a través de semilla. Los síntomas característicos de los carlavirus se

enmarcan entre infecciones latentes (CLV), mosaicos (Poplar mosaic virus, PopMV),

48

necrosis (Pea streak virus, PeSV) y ocasionalmente causan pérdidas significativas en los

cultivos (Potato virus M, PVM y Potato virus S, PVS) (Astier et al., 2007).

Figura 5. Representación del genoma de los Carlavirus. a. En los cuadros se muestran las proteínas

originadas a partir de cada región del genoma. Se observan los dos ARNsg producidos y las proteínas que

estos codifican. b. Representación del virión de un Carlavirus. Fuente:


Potato virus S (PVS)

El virus PVS se caracteriza por poseer un genoma de 8464 nt (PVS aisalmiento Vltava,

accesión del Genbank N° AJ863510). Sus partículas poseen una longitud de 650 nm y un

diámetro de 12 nm (Mackenzie et al., 1989). El ORF 1 característico del género codifica

para la proteína de replicación, con motivos de metiltransferasa (MTR), helicasa (Hel) y

RdRp hacia el extremo 5‟. Produce dos ARNsg hacia el extremo 3‟ del genoma, con


49

tamaños de 2,5 y 1,5 kb, los cuales están incluidos en los filamentos flexuosos de las

partículas del virus. El más pequeño de estos ARNsg codifica para la CP y el segundo para

la proteína de 11 kDa. Se ha encontrado una variabilidad moderada en el virus, que se basa

principalmente en diferencias en las secuencias de los genes CP y CRP. La transmisión del

virus se da mediante áfidos de forma no persistente, e infecta plantas de las familias

Solanaceae y Chenopodiaceae, principalmente (Matousek et al., 2000; Matousek et al.,

2004).

Con base en la infección sistémica y no sistémica en Chenopodium spp., se pueden

reconocer dos razas del virus: PVSA (PVS Andino) y PVSO (PVS Ordinario),

respectivamente. Las homologías entre ambas razas para las secuencias que codifican CP y

la proteína de 11 kDa son de 93% y 79%, respectivamente. En estas proteínas también se

encuentra el mayor número de aminoácidos que difiere entre ambas razas, diferencias que

sugieren los diferentes tipos de transmisión y sintomatologías que inducen (Foster y Mills,

1992). Así por ejemplo, PVSO no causa sintomatología en la mayoría de cultivares de papa

de Europa, pero ocasionalmente produce leves rugosidades en las hojas; mientras que PVSA

induce fuertes síntomas, que incluyen senescencia prematura y pérdida de hojas

especialmente en plantas con infección secundaria, ocasionando pérdidas superiores al 20%

cuando se encuentra asociado a PVX (Jeffries, 1998). La transmisión de PVSO se da

principalmente por contacto más que por áfidos, mientras que PVSA se concentra más en el

tejido y es eficientemente transmitido por áfidos como M. persicae. El virus también puede

ser transmitido a partir de tubérculos infectados e incluso por plantas in vitro (EPPO,

2009).

50

3.3.5. Familia Luteoviridae.

La familia Luteoviridae se deriva del género Luteovirus y se divide de acuerdo al origen

filogenético del gen de la polimerasa y a las propiedades biológicas, en tres géneros:

Enamovirus (1 especie), Luteovirus (6 especies) y Polerovirus (13 especies), además de

ocho especies sin género asignado: Barley yellow dwarf virus-GPV (BYDV-GPV), Barley

yellow dwarf virus-RMV (BYDV-RMV), Barley yellow dwarf virus-SGV (BYDV-SGV),

Chickpea stunt disease associated virus (CpSDaV), Groundnut rosette assistor virus

(GRAV), Indonesian soybean dwarf virus (ISDV), Sweet potato leaf speckling virus

(SPLSV) y Tobacco necrotic dwarf virus (TNDV), lo que suma 28 especies en la familia.

Los viriones son partículas isométricas de 25 a 30 nm de diámetro, los cuales están

compuestos por dos proteínas de cápside con alrededor de 180 copias. Poseen un genoma

de ARN de cadena sencilla con sentido positivo de un tamaño de 5,6 a 6 kb. Los ORF están

agrupados en bloques separados por regiones no codificantes de 100 a 200 nt. La expresión

de los genes comprende las estrategias supresión de codón de parada (readthrough), cambio

en el marco de lectura (frameshift), ARNsg y transactivación de traducción localizada en el

extremo 3‟ (Taliansky et al., 2003; Astier et al., 2007; Dijkstra y Khan, 2006; ViralZone,

2010).

Género Polerovirus.

Los polerovirus se caracterizan por presentar cápside no envuelta con simetría icosahédrica

con diámetro de alrededor de 23 nm (ViralZone, 2010). Los viriones poseen coeficientes de

flotación en CsCl de 1,38 a 1,42 g/cm3, con densidades de 1.34 g/cm

3 en Cs2SO4. El

51

coeficiente de sedimentación es de 115S, el TIP es de 70 a 80°C y el DEX se encuentra

alrededor de 4, aunque éste depende del hospedero. Los genomas comprenden tamaños de

5880 a 5990 nt de longitud.

Los virus de este género son transmitidos por vectores generalmente del orden Hemiptera y

la familia Aphididae, así como mediante injertos, pero no por semilla, por inoculación

mecánica, ni a través del polen (Büchen-Osmond, 2010).

El género Polerovirus, presenta al menos siete ORF (Figura 6). El ORF 0 codifica para una

proteína de 29 kDa, que es indispensable para la acumulación del virus. El ORF 1 tiene un

motivo de proteinasa y se cree que de éste se deriva la proteína VPg. El ORF 2 codifica

para la polimerasa a partir de un mecanismo de cambio en el marco de lectura -1

(Ribosomal frameshift). El ORF 3 codifica para la proteína de la cápside viral, y se fusiona

con el ORF 5 mediante supresión del codón de finalización (Ribosomal readthrough),

dando origen a una proteína que parece estar involucrada en la transmisión por áfidos, al

conferir estabilidad a la partícula viral en la hemolinfa del insecto. El ORF 4 está

involucrado con el movimiento del virus en la planta, y se deriva del ORF 3 (Astier et al.,

2007; Dijkstra y Khan, 2006). Las únicas proteínas traducidas directamente del ARNg, son

ORF0 que genera a P0, la poliproteína del ORF1 (P1) y la polimerasa (ORF1-2) que se

origina, cómo se indicó anteriormente, como una fusión por cambio en el marco de lectura

cerca del final del ORF1. La proteína Rap1 se produce por la omisión del primer codón de

inicio (Leaky Scanning) por parte del ribosoma e inicia ésta en un inusual IRES (sitio

interno de entrada del ribosoma) (Figura 6). El resto de los ORF de los polerovirus se

traducen a partir de ARNsg (ViralZone, 2010).

52

Figura 6. Representación del genoma de los Polerovirus. a. Las cajas indican los ORF y debajo de ellas se

muestran las diferentes estrategias para la expresión de las proteínas. b. Representación del virion de un

Polerovirus. Fuente: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/610.html.

Potato leafroll virus (PLRV)

El PLRV corresponde a una partícula isométrica que posee un genoma completo de 5865 nt

de ARN de sentido positivo (PLRV raza Zim13, accesión del GenBank N° AF453388), en


53

cuyo extremo 5‟ se encuentra asociado a una VPg (Taliansky et al., 2003). Su cápside tiene

una simetría icosahédrica con diámetro de 24 nm (Peters, 1967; Takanami y Kubo, 1979).

El virión posee una densidad de flotación en CsCl de 1,39 g/cm3, el TIP es de 70.8°C, la

LIV es de 5-10 días y el DEX es de alrededor de 4. Las proteínas representan el 70% del

peso del virión (Büchen-Osmond, 2010).

El virus tiene divido su genoma en ocho ORF densamente empaquetados, con el ORF 1

solapando el ORF 0 y el ORF3 traslapado con el ORF 4 (Mayo y Miller, 1999). El virus

emplea diferentes estrategias para la modulación de su ARN; así los tres primeros ORF

proximales a 5‟ (0 al 2), son expresados a partir del ARNg, y los ORF proximales al

extremo 3‟ (3 al 7), son expresados a partir de ARNsg, lo que hace que el virus sea muy

versátil y económico en el uso de secuencias codificadoras (Taliansky et al., 2003). El ORF

0 esta involucrado en el desarrollo de la sintomatología y se cree que es un supresor del

silenciamiento de genes en sus hospedantes, P1 tiene funciones de proteinasas y contiene la

secuencia que codifica para VPg y posiblemente para una helicasa; el ORF 2 codifica para

RdRP mientras que el ORF 3 lo hace para la CP de 23 kDa. El ORF 4 codifica para una

proteína de movimiento y la fusión de los ORF 3 y 5 genera una proteína estructural menor

de 80 kDa, que se cree participa en la transmisión del virus por áfidos. Los ORF 6 y 7 han

sido descritos recientemente y aunque sus funciones son desconocidas, se especula que P7

tiene propiedades de unión a ácidos nucleicos (Taliansky et al., 2003).

Los aislamientos difieren muy poco unos de otros en sus secuencias. Esto se demostró en

un estudio en el que se usaron 12 secuencias completas de aislamientos del virus y las

identidades fueron del 94 al 98% sobre todos los ORF. Sin embargo, en el mismo estudio

con 19 aislamientos de PLRV que representaban cepas de diferentes continentes, se

54

encontró que comparando las secuencias de los ORF 0 y 5 y parte del 1, era posible dividir

a la especie en tres grupos: aislamientos Australianos, aislamientos Peruanos e Ingleses y

un tercer grupo con aislamientos de Australia, Cuba y algunos europeos. Lo anterior

conduce a plantear dos hipótesis sobre el origen de esta especie: que divergió recientemente

de un ancestro viral como resultado de su adaptación a papa o que es una especie con

fuertes restricciones de selección. En cualquier caso, la estrecha base genética de los

cultivares de papa, puede ser un factor que restrinja la variación de este virus (Guyader y

Ducray, 2002). El virus más relacionado con PLRV en la secuencia de CP es el virus

suramericano SPLSV (Sweet potato leaf speckling virus), el cual guarda una identidad del

70%, mientras que con otros Polerovirus, este valor no supera el 65% de identidad (Fuentes

et al., 1996).

PLRV es transmitido por áfidos de manera persistente no propagativa, multiplicándose en

el floema del huésped (Taliansky et al., 2003). El insecto más eficiente para su transmisión

es M. persicae; sin embargo, Macrosiphum euphorbiae se constituye en un buen vector del

virus, aunque menos eficiente, sobre todo para aislamientos australianos. Las familias

taxonómicas Amaranthaceae, Cruciferaceae, Portulacaceae y Solanaceae, contienen las

especies que bajo condiciones experimentales presentan mayor susceptibilidad al virus,

destacándose Amaranthus caudatus, Capsella bursa-pastoris, Celosia argentea, Datura

stramonium, Gomphrena globosa, Lycopersicon esculentum, Montia perfoliata, Nicotiana

clevelandii, Physalis floridana, Solanum tuberosum, Solanum tuberosum ssp. andigena,

Solanum tuberosum ssp. tuberosum.

Los síntomas principales que ocasiona este virus en papa corresponden a enanismos y

enrollamiento de hojas, acompañados de una grave reducción en el rendimiento. En plantas

55

indicadoras como Datura stramonium, se pueden observar amarillamientos sistémicos entre

venas y en Physalis floridiana se presenta clorosis sistémica entre venas y enrollamiento de

hojas (Büchen-Osmond, 2010).

3.3.6. Familia Closteroviridae

La familia Closteroviridae deriva su nombre del género Closterovirus (9 especies) y se

compone, además del ya mencionado, de los géneros Ampelovirus (8 especies), Crinivirus

(12 especies) y la especie sin género asignado Mint vein banding-associated virus

(MVBV), sumando así 30 especies para la familia. Esta clasificación es basada

principalmente en el modo de transmisión y en las características del ARNg. Los miembros

de la familia poseen viriones flexuosos con una longitud de 650 a 900 nm, ó 1200 a 2200

nm y un diámetro de 10-13 nm. Su genoma posee un rango de tamaños entre 15 y 20 kb

(Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Hacia el extremo 3‟, posee una terminación en

estructura de horquilla (hairpin) y hacia el extremo 5‟ probablemente posee una caperuza

de nucleótidos metilada. Los viriones poseen un coeficiente de sedimentación entre 96 y

140S y densidades de flotación en CsCl de 1,30 a 1,34 g/cm3. Otra característica particular

de la familia es la presencia de genes que codifican para proteínas homólogas a las

proteínas celulares de choque térmico 70 (HSP: heat shock proteins) y para una CP análoga

o adicional, la cual conforma la cola del virión (Dijkstra y Khan, 2006; Astier et al., 2007;

Büchen-Osmond, 2010; ViralZone, 2010).

Los virus de esta familia son generalmente transmitidos por vectores Homópteros de forma

no persistente (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Ampelovirus y Closterovirus poseen

56

genomas monopartitas, mientras que en el caso de los Crinivirus, se pueden presentar

genomas bipartitas ó tripartitas (Livieratos et al., 2004).

Género Crinivirus

Los virus de este género poseen partículas de 650 a 850 nm y 700 a 900 nm de longitud,

con un diámetro de 12 nm. Su genoma esta segmentado en dos ARN generalmente (Figura

7) (caso especial PYVV con 3 ARN), con tamaños de 8,1 y 7,2 kb, respectivamente. Sus

ARNg son encapsidados independientemente. El ARN 1 lleva el módulo de replicación,

con los ORF 1a, 1b y 2. Los dos primeros están involucrados en la codificación para

proteínas de replicación, incluyendo la RdRp y el tercero (ORF 2), codifica para una

proteína de 31 kDa con función desconocida. El ORF 1b se produce por un cambio en el

marco de lectura +1, que contiene el motivo RdRp (Hull, 2002). El ARN 2, tiene siete

ORFs, correspondiendo el ORF 6 a la proteína CPm (Cápside menor) y el ORF 5 a CP. El

ORF 2 codifica para una proteína HSP70h, esencial para el ensamblaje del virión y su

movimiento entre células (Figura 7) (Aguilar et al., 2003; Hartono et al., 2003).

Los virus se pueden encontrar en células del floema y su transmisión ocurre por insectos de

la familia Alleyrodidae de forma no persistente; no pudiendo ser transmitidos de manera

mecánica. Los síntomas ocasionados por los virus del género corresponden a

amarillamientos de nervaduras en hojas viejas generalmente, y algunas veces pueden

inducir necrosis. Estos virus pueden causar epidemias severas en los cultivos susceptibles

relacionadas con el incremento de su vector en el campo (Astier et al., 2007).

57

Figura 7. Representación del genoma de un Crinivirus. a. Las cajas indican lo ORF y en la parte inferior de

éstas, las estrategias de traducción. b. Representación del virión de un Crinivirus. Fuente:

http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/287.html.

Potato yellow vein virus (PYVV)

La enfermedad causada por el virus PYVV se reportó por primera vez en cultivos de papa

en Antioquia (Colombia) en el año de 1943 (Alba, 1950). El virus se caracteriza por poseer

un genoma tripartita y al menos cinco especies de ARNdc (ARN de doble cadena),

denominados ARNdc 1, ARNdc 2, ARNdc 3, x y y. Presenta en su extremo 5‟ una caperuza

y una estructura de pseudo-nudo hacia el extremo 3‟. El ARN 1 (8035 nt, accesión del

GenBank N° AJ557128.1) posee 3 ORF: ORF 1a y 1b los cuales contienen los dominios

conservados L-Pro, MTR, Hel y RdRp (Figura 8) y la pequeña proteína hidrofóbica p7

(Livieratos et al., 2004). RdRp se produce por el cambio en el marco de lectura +1, como

http://www.expasy.org/viralzone/all_by_species/287.html

58

ha sido demostrado para el género Closterovirus (Agranovsky et al., 1994). El ORF 2

produce una pequeña proteína hidrofóbica que contiene putativamente una hélice

transmembranal. Esta proteína varia en su ubicación en los crinivirus (Livieratos et al.,

2004).

El ARN 2 (5339 nt, accesión del GenBank N° AJ557129) tiene cinco ORF potenciales:

Hsp70h, p7, p60, p10 y CP. En su orden, la primera proteína es homóloga a la familia de

chaperonas Hsp70 y está estrechamente relacionada con las Hsp70 de otros closterovirus y

crinivirus. La proteína se asocia a las partículas virales y es indispensable para el correcto

ensamblaje del virión y del movimiento del virus, como se ha visto en Beet yellow virus

(BYV, Closterovirus) (Alzhanova et al., 2001) y Citrus tristeza virus (CTV, Closterovirus)

(Satyanarayana et al., 2000). La proteína del ORF 2 es muy conservada entre los virus de la

familia Closteroviridae, aunque en posiciones diferentes del genoma; sin embargo, aún no

se conoce su función (Livieratos et al., 2004). El ORF 3 codifica para una proteína p60

homóloga para otros Closterovirus y Crinivirus (Karasev, 2000), que en el virus BYV

corresponde a la proteína p64, cuarto componente integral del virión, junto con CP, CPm y

Hsp70h (Napuli et al., 2003). El ORF 4 (proteína p10) codifica para una proteína que no

posee similitud con ninguna otra en las bases de datos, ni siquiera estableciendo

alineamientos de la secuencias con otros Crinivirus en ubicaciones similares del genoma

(Karasev, 2000). Por último el ORF 5 codifica para la proteína putativa CP, que en

homología y tamaño es muy similar a las de otros Crinivirus; además posee una región

consenso de aminoácidos conservados que se encuentra en las CP de muchos virus

flexuosos (Alzhanova et al., 2001).

59

El ARN 3 (3892 nt, accesión del GenBank N° AJ508757) posee tres ORF potenciales: p4,

CPm y p26. La primera proteína no posee su contraparte en los otros genomas descritos de

la familia Closteroviridae, ni homología con ninguna otra secuencia en las bases de datos.

El ORF 2 codifica para una proteína putativa denominada CPm por su homología con la CP

menor de otros closterovirus (Livieratos et al., 2002). El ORF 3 codifica para una proteína

con posición similar y tamaño a la descrita para el ARN 2 de Lettuce infectious yellows

virus (LIYV, Crinivirus) (Klaassen et al., 1995; Büchen-Osmond, 2010), el ARN 2 de

Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV, Crinivirus) (Aguilar et al., 2003), el

ARN 2 de Sweet potato clorotic stunt virus (SPCSV, Crinivirus) (Kreuze et al., 2002) y el

ARN 1 de CuYV (Hartono et al., 2003). Parece ser única para el género Crinivirus; sin

embargo, p26 guarda una limitada identidad con sus contrapartes del género (máximo de

36% con p26 de CuYV) y no presenta homología con otras secuencias en las bases de

datos. Es de destacar que los tres ARN presentes en el virus poseen UTRs (regiones que no

se traducen) con secuencias diferentes cada uno (Livieratos et al., 2004).

El virus presenta una baja variación genética entre los aislamientos de Perú y Colombia,

siendo éstas las regiones de referencia debido a que sus cultivos son los más afectadas por

la enfermedad (Offei et al., 2004). Igualmente, se ha reportado que puede ocasionar

pérdidas de hasta el 50% en los cultivos de papa de dichos países (Salazar et al., 2000). Sus

síntomas característicos corresponden a amarillamientos de las venas secundarias

acompañados de un color amarillo intenso en la lámina foliar. Sin embargo, las nervaduras

pueden recuperar el color verde hasta que la planta muere. Mediante infecciones dirigidas

en diferentes solanáceas, se ha encontrado que además de papa, puede infectar el tomate y

60

algunas plantas arvenses como Polygonum sp., Tagetes sp. y Catharanthus roseus (Salazar

et al., 2000; Arciniegas, 2003; Morales et al., 2004).

Figura 8. Representación esquemática de la organización del genoma del PYVV. Las líneas oscuras

representan el ARNg, las cajas representan las proteínas originadas con su respectivo nombre y los ORFs de

cada proteína se indican en la parte superior o inferior. La flecha indica el sitio de corte de una proteína

autocatalítica. Fuente: Livieratos et al, (2004).

3.4. Métodos de diagnóstico en virología vegetal

En la mayoría de los estudios de virus de plantas, es esencial poder establecer un

diagnóstico acertado, esto implica tener las herramientas para reconocer la enfermedad e

identificar de manera precisa el (los) virus que la causa(n). Por tal razón, es necesario

establecer técnicas de diagnóstico altamente eficientes, rápidas y económicas para el

estudio de la epidemiología de la enfermedad viral, evaluar la eficiencia de los métodos de

manejo ó para garantizar que las plantas y las semillas están libres de virus (Astier et al.,

2007). A continuación se describen brevemente los principales métodos empleados para el

diagnóstico de virus en plantas.

61

3.4.1 Métodos Biológicos

Cuando los virus infectan las plantas, pueden o no inducir síntomas. Si los síntomas son

producidos en las plantas infectadas, éstos pueden tener un valor en el diagnóstico (Salazar,

1995). Los síntomas principales asociados a enfermedades virales incluyen cambios en la

pigmentación normal de las plantas (mosaicos, amarillamientos, grabados), cambios en el

crecimiento (enanismos), necrosis de tejidos (para algunos virus), deformaciones y

reducción en el rendimiento. Las observaciones de la planta en su conjunto y el contexto en

que ocurren dicho cambios y su análisis, constituyen los primeros pasos para el diagnóstico

de virus (Astier et al., 2007).

La sintomatología es la fuente primaria en la descripción de las enfermedades virales. El

nombre de la especie de virus es principalmente tomado sobre la base del síntoma que

causa en la planta en la cual fue identificado por primera vez (Astier et al., 2007). Sin

embargo, la sintomatología se constituye en el método más insensible de diagnóstico, por

cuanto solo la experiencia puede indicar cuándo es conveniente usarla (Salazar, 1995).

Entre los síntomas más comunes se presentan:

Mosaicos: Es una distribución anormal de los pigmentos de clorofila en las hojas,

frecuentemente asociada con la estructura de los cloroplastos. Resulta en la yuxtaposición

de varios tonos de color en la superficie de la hoja.

Variegación: Típico en flores, donde hay una ausencia de antocianinas vacuolares que

generan visos blancos o una acumulación de estos pigmentos que originan tonos rojizos

oscuros.

62

Amarillamientos: Es característico de infecciones virales en las cuales la partícula se

multiplica en los tejidos vasculares. La acumulación de virus en el floema impide el flujo

normal de savia, lo que crea un estado de deficiencia que causa atrofia de raíces y

enanismo.

Necrosis: Los puntos necróticos y la coloración café ocurren por la muerte de las células

infectadas. Algunas necrosis pueden inducir a la muerte de la planta. La necrosis también se

puede observar en frutos o tubérculos como es el caso de PVY-NTN.

Reducción en el crecimiento y deformación: La multiplicación del virus está acompañada

de alteraciones metabólicas que producen generalmente reducción en el vigor de las plantas

infectadas y reducción en su desarrollo. El enanismo es un síntoma característico de

enfermedades virales que se acompaña de hojas pequeñas y acortamiento de entrenudos, así

como también de la reducción en cantidad y tamaño de flores, frutos y semillas (Astier et

al., 2007).

Los síntomas anteriormente descritos, van acompañados a su vez de disminuciones en los

rendimientos de los cultivos.

Algunos virus no llevan a la expresión de síntomas en su planta hospedera, no parecen

causar detrimento de ésta o pasan desapercibidos en el material de propagación. En

ocasiones estos virus tienen un fuerte sinergismo con otros, intensificando su efecto como

es el caso de Lily symptomless virus (LSLV, Carlavirus), el cual, en infecciones conjuntas

con CMV causan la enfermedad de las manchas necróticas en Liliáceas.

A nivel celular también se pueden determinar síntomas, siendo en algunos casos útiles para

identificar un género taxonómico particular (ej: Potyvirus, Carlavirus, Comovirus,

Tobamovirus). Esta técnica, sin embargo, requiere cierto nivel de experiencia pero no

63

equipo muy sofisticado. El tipo de tinción empleado para diferenciar los síntomas también

es determinante en la identificación del grupo viral.

Inoculación mecánica.

Se basa en el uso de plantas herbáceas que reaccionan frente a un alto número de virus

diferentes y se constituyen en plantas indicadoras de la presencia de infecciones virales a

partir de inoculaciones mecánicas. Algunas de éstas plantas son: N. benthamiana, N.

clevelandii, Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, entre otras.

Las pruebas de inoculación mecánica deben realizarse en plantas jóvenes mantenidas en

ambientes controlados para asegurar la sensibilidad y reproducibilidad de los síntomas.

Usualmente se emplea una solución tampón a base de fosfato para acompañar el extracto

macerado de la planta infectada, que se aplicará en la superficie de las hojas de las plantas

sanas. La inoculación mecánica se da cuando se frota con la savia infectada el tejido sano

con ayuda de algún material, usualmente carborundum® ó celita, que permiten causar

micro-heridas en éste. Las hojas deben lavarse luego de la inoculación con agua y asegurar

que las plantas permanezcan en un ambiente controlado que favorezca la multiplicación del

virus y la expresión de los síntomas en la planta.

Inoculación por vectores.

Algunos virus no pueden ser transmitidos de forma mecánica, como por ejemplo algunos de

los que están restringidos al floema de las plantas como los Luteovirus, Polerovirus,

Nanovirus, entre otros. En este caso, las plantas indicadoras son inoculadas con sus

vectores específicos, previa alimentación de éstos en plantas sintomáticas.

64

Injertos.

Otro tipo de indexación ampliamente usada para la detección de virus o agentes infecciosos

de etiología poco/no conocida, es la injertación. Esta se da principalmente en especies

frutales y se eligen especies leñosas que manifiesten rápidamente los síntomas de la

enfermedad, lo que generalmente ocurre varios meses después.

Hay que destacar que los síntomas expresados en la planta son de dos tipos, localizados o

restringidos a la hoja inoculada y sistémicos. Los primeros hacen referencia a la reacción

fisiológica de la planta al ingreso del virus y en ocasiones al daño ocasionado por la

inoculación, los cuales se presentan pocos días después de esta. En el segundo caso, son

síntomas que se presentan luego que la partícula viral comienza a desplazarse en la planta y

se expresan en tejido diferente al de la inoculación.

El diagnóstico basado únicamente en expresión de síntomas es insuficiente, debido a que

los síntomas no sólo dependen del virus y sus variantes, sino también del genotipo del

hospedero y de las condiciones bióticas y abióticas prevalecientes durante la prueba (Astier

et al., 2007).

3.4.2. Métodos serológicos.

Estos métodos se basan en la interacción de dos tipos de proteínas: antígenos (proteínas de

origen viral) y anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulinas que reconocen dichos

antígenos y se produce a partir del sistema inmune de los animales). Por mucho tiempo se

han empleado las partículas virales en sí mismas como antígenos, porque son relativamente

fáciles de obtener y purificar.

65

Los anticuerpos son Inmunoglobulinas (Ig), de las cuales las más usadas son IgG, que

representan a su vez las tres cuartas partes de las inmunoglobulinas producidas en los

mamíferos. Existen dos tipos de anticuerpos para el diagnóstico de virus: los anticuerpos

policlonales (pABs) y los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales son

producidos generalmente en animales como conejos y cabras, mediante la inyección de

proteínas purificadas del virus que inducen la producción por los linfocitos B de un

complejo de anticuerpos que son colectados en el suero sanguíneo del animal. Por su parte,

los anticuerpos monoclonales (mABs), son obtenidos a partir de células cancerosas que se

obtienen por una fusión del mieloma de ratones y células limfocitarias y se multiplican in

vivo en un medio selectivo. A este cultivo se aplica el antígeno, generándose un

sobrenadante con los anticuerpos que reconocen un epítope particular de la proteína viral,

por lo que este tipo de anticuerpos es mucho más específico que los policlonales (Astier et

al., 2007; Shcherbakova, 2007).

ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)

Esta técnica se basa en la unión o marcaje de las inmunoglobulinas con enzimas que

generan una reacción de color al degradar un sustrato. El conjugado con fosfatasa alcalina

es el más comúnmente empleado. La prueba de ELISA puede ser directa o indirecta,

dependiendo de que tipo de anticuerpo esté asociado a la enzima. En la directa, el antígeno

objetivo es detectado por una enzima conjugada de anticuerpos homólogos (antígeno

específica). En la prueba indirecta, un anticuerpo homólogo al antígeno, pero sin marcar

(ABs1), es el que captura el antígeno objetivo y luego un conjugado de enzima es el que

66

detecta el complejo antígeno-anticuerpo, a partir de un segundo anticuerpo contra ABs1

(Shcherbakova, 2007).

Hay diversidad de protocolos en los que se usan platos de poliestireno como soporte para la

aplicación de las pruebas de ELISA, pero el más común es el formato DAS (double

antibody sandwich), que se basa en poner el antígeno en medio de dos anticuerpos

específicos. La IgG se une fuertemente al poliestireno e interactúa con el antígeno. Para

revelar la reacción se hace uso de la misma IgG pero marcada con la enzima (conjugado),

la cual se fija al antígeno y posteriormente se adiciona el sustrato para que ocurra la

reacción de color. La intensidad del color es medida a una longitud de onda de 405 nm. La

absorbancia puede en ciertos rangos de concentración, ser proporcional al logaritmo de la

concentración (Salazar, 1995; Astier et al., 2007; Shcherbakova, 2007).

Otras variantes de ELISA corresponden al sandwich de ELISA indirecto o TAS-ELISA

(Triple antibody sandwich), que involucra anticuerpos provenientes de dos especies

animales, siendo los anticuerpos que detectan el antígeno objetivo, producidos en una de

estas especies y el anticuerpo del conjugado, producido en la otra especie animal. Una

ventaja de este método es la universalidad del conjugado, ya que puede se empleado para el

análisis de varios antígenos. Otro formato de ELISA es DAC (recubrimiento directo de

antígenos) ó PTA (antígenos atrapados en placa). En este procedimiento, los antígenos son

inmovilizados en una placa, contrario a lo que pasa en el DAS-ELISA. Se usa

preferiblemente para evaluar la respuesta inmune a un antígeno y no tanto para realizar

diagnóstico (Shcherbakova, 2007). Una técnica similar pero realizada en membranas de

nitrocelulosa, es la denominada NCM-ELISA (ELISA en membranas de nitrocelulosa). Se

basa principalmente en fijar el antígeno a la membrana y posteriormente unir los

67

anticuerpos específicos y el conjugado, como en la prueba DAC-ELISA, pero requiere un

paso adicional y es el bloqueo de la membrana luego de fijado el antígeno (Salazar, 1995).

Otros autores describen la técnica como DBIA (dot blot immuno assay) ó dot-ELISA,

pudiéndose emplear además de membranas de nitrocelulosa, aquellas de

Polivinilidenofluoruro (PVDF). La técnica de flujo lateral (LFA), es empleada in situ y

consiste en una barra que contiene en su orden superficies con: la región de aplicación de la

muestra, una membrana de nitrocelulosa con pequeñas láminas con los anticuerpos

específicos inmovilizados y la almohadilla absorbente. A medida que el antígeno es

adsorbido por la membrana, éste sube por la barra y se une a los anticuerpos, los cuales se

concentran en las laminillas donde se da la reacción de color. Dos líneas indican una prueba

positiva y una sola línea en la barra indica una prueba negativa o que el antígeno no se

encuentra en la muestra analizada (Shcherbakova, 2007).

Otros métodos de inmunodiagnóstico.

Inmuno-fluorescencia (IFA): actualmente se usan para la prueba anticuerpos monoclonales,

los cuales son marcados con colorantes fluorescentes para producir los conjugados con

moléculas como fluorosceína isotiocianato o rhodamina isotiocianato. En el ensayo directo,

se emplean conjugados con anticuerpos específicos para el antígeno objetivo, en el caso del

ensayo indirecto, como en el TAS-ELISA, el segundo anticuerpo es el que se encuentra

marcado con el colorante fluorescente. El resultado se observa en un microscopio de

fluorescencia, lo que se puede potenciar si se utiliza un software apropiado que cuantifique

las unidades fluorescentes presentes en la placa (Shcherbakova, 2007).

68

Immunobloting: Es denominado también Western bloting. Es un método muy sensible para

la identificación de proteínas y se basa en la combinación de geles de electroforesis y la

interacción antígeno-anticuerpo. El método consta de tres etapas: separación de las

proteínas a analizar en un gel de poliacrilamida desnaturalizante con dodecil sulfato de

sodio (SDS-PAGE), donde pueden ser visualizadas luego de una tinción y comparadas con

las muestras de referencia. La segunda etapa se basa en la transferencia y fijación de las

proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis (blotted). Por último, los

pABs o mABs son aplicados a la membrana para realizar la detección mediante reacción

enzimática similar a la descrita en las pruebas de ELISA (Shcherbakova, 2007).

Microscopía electrónica.

La microscopía electrónica permite obtener resultados de diagnóstico a partir de una

evidencia visual mediante la tinción negativa con metales pesados de los tejidos/savia

vegetales (Salazar, 1995). Es frecuente su combinación con métodos inmunológicos

(inmuno-electromicroscopía-IEM) que se constituye en uno de los medios directos más

precisos de identificación de virus. La técnica es simple y rápida y consiste en examinar un

extracto crudo de planta, de manera que los anticuerpos se fijan a los motivos antigénicos

de la cápside viral formando un tipo recubrimiento alrededor de la partícula, que es

fácilmente observable al microscopio electrónico (Salazar, 1995; Astier et al., 2007).

69

3.4.3. Métodos basados en el uso de ácidos nucleicos.

Las técnicas basadas en el uso de ácidos nucleicos han permitido a los investigadores

sobrepasar las desventajas que presentan las técnicas dependientes de la interacción

antígeno-anticuerpo, en particular los problemas asociados a su posible inespecificidad.

Una ventaja de los métodos basados en el uso de ácidos nucleicos es por tanto, la alta

precisión que ofrecen para la detección viral así como su uso simultáneo para la

caracterización genética de los virus bajo estudio e incluso de su interacción con el

hospedero. Estos métodos se dividen básicamente en dos grupos: hibridización con

secuencias de ADN/ARN y aquellos que emplean la metodología de reacción en cadena de

la polimerasa (PCR) (Shcherbakova, 2007).

Hibridización molecular.

El principio de estas técnicas se basa en la fijación de pequeñas cantidades de extractos de

plantas (Tissue-printing) ó de ácidos nucleicos totales (Dot-blot) en membranas de nylon o

nitrocelulosa, que son reconocidos por sondas marcadas radioactivamente ó por sondas no

isotópicas. El resultado se monitorea por el cambio de coloración que se observa en la

membrana (detección colorimétrica) ó sobre una película de detección (métodos

radioactivos ó quimioluminiscentes) (Astier et al., 2007).

Hibridización Dot-blot: En esta metodología, se parte de una pequeña cantidad de savia de

la muestra a evaluar, a la cual se realiza extracción de ácidos nucleicos procediendo a su

denaturalización a altas temperaturas o por tratamiento con álcali; luego una pequeña

muestra es fijada en la membrana con la ayuda de UV. Los sitios no específicos de

70

reconocimiento en la membrana son bloqueados por incubación en la etapa de

prehibridización, utilizando una solución que contiene una proteína (generalmente

albúmina de suero bovino). Posteriormente, se realiza el proceso de hibridización en la

membrana con una sonda marcada, para luego proceder a lavar y realizar el revelado que

depende del tipo de sonda utilizada (Hull, 2004). Se ha reportado que la técnica puede

detectar hasta 0,5 pg de titulo viral (Khan y Dijkstra, 2006). Considerando que la prueba es

fiable, rápida y fácil de desarrollar, se presenta como una alternativa al uso de la técnica de

ELISA convencional, cuando no se cuentan con anticuerpos específicos para un virus de

interés o cuando los costos de éstos son muy altos (Astier et al., 2007).

Tissue-printing: En este caso, se utiliza una aplicación directa de secciones frescas de tejido

infectado (tallo, hojas o bulbos) en una membrana para visualizar in situ la distribución en

los tejidos de los virus (Makkouk et al., 1993). El procedimiento es rápido, sensible y

simple (no utiliza extracción de virus), es económico por que no requiere de equipo

especializado, además es apropiado para evaluar un alto número de muestras por día

(Webster et al., 2004). Esta técnica permite estudiar aspectos relacionados con la

localización de las partículas virales en los tejidos de las plantas y evaluar su movimiento

entre células y através de los haces vasculares (Más y Pallas, 1995).

Las hibridizaciones son reveladas mediante el marcaje de la prueba con un isotopo

radioactivo (fósforo 32) o un reportero no radioactivo como biotina, acetilaminofluorene

(AAF), fluorovitosina o digoxigenina (Astier et al., 2007).

71

Técnicas basadas en PCR.

Se fundamentan en la amplificación exponencial de una secuencia de ácidos nucleicos que

es flanqueada por un par de cebadores, los cuales son usados por una polimerasa termo

estable de ADN para la formación de las nuevas cadenas. La técnica consta de múltiples

ciclos (usualmente 35 a 40) en los cuales hay desnaturalización de ADN de doble cadena,

anillamiento de los cebadores (oligonucleotidos de 16 a 35 bases), extensión

(polimerización) y nuevamente desnaturalización. Esto permite la detección precisa de una

secuencia viral y posterior secuenciación para caracterizarla con exactitud (Astier et al.,

2007; Shcherbakova, 2007).

En el caso de los virus de ARN es necesario un paso anterior a la PCR, en el cual se pasa el

ARN a su homólogo de ADN, denominado ADN copia (ADNc). Este proceso es realizado

por una enzima transcriptasa reversa de orígen viral.

Los métodos basados en PCR permiten una mayor sensibilidad que las pruebas

mencionadas anteriormente, debido a que una pequeña secuencia es amplificada millones

de veces, posibilitándose su visualización como bandas a través de electroforesis en geles

(Shcherbakova, 2007). Entre las diferentes variaciones que tiene esta técnica se incluyen:

PCR anidada: se fundamenta en el empleo de dos pares de cebadores, los externos que dan

origen a un fragmento que sirve de molde para el segundo par (internos), generando

amplicones altamente específicos. Un ejemplo del uso exitoso de esta técnica en virología,

corresponde a la detección de especies de virus de los géneros Vitivirus y Foveavirus en

plantas de vid (Shcherbakova, 2007; Webster et al., 2004).

PCR-RFLP: En esta técnica se hace uso en conjunto de la metodología RFLP (Restriction

fragment length polymorphism) y PCR, para estudiar las diferencias entre los virus con

72

base en la ausencia/presencia de sitios de restricción en la secuencia de sus genomas. Luego

de la amplificación por PCR, los fragmentos obtenidos son digeridos con una enzima de

restricción y se analiza el patrón de bandas mediante electroforesis. Es un método que

permite diferenciar aislamientos sin los costos que consumen la clonación y la

secuenciación (Webster et al., 2004).

RT-PCR múltiple: Múltiples especies o razas pueden ser detectadas en una sola reacción de

PCR, que combina cebadores específicos para los diferentes virus. La técnica requiere que

los productos de la amplificación posean tamaños diferentes para cada virus y que entre los

cebadores no haya reacciones cruzadas (Webster et al., 2004).

PCR-Inmunocaptura (IC-PCR): Esta metodología combina el reconocimiento del virus con

el uso de anticuerpos específicos y la amplificación por PCR. La reacción antígeno-

anticuerpo, constituye la primera fase, en la cual se reducen el riesgo de contaminación con

inhibidores presentes en el tejido de la planta, al obtenerse el virus fijado a las placas de

poliestireno. Luego, en condiciones alcalinas y en presencia de un detergente se libera el

ARN ó ADN viral para ser amplificado posteriormente mediante RT-PCR o PCR

convencional (Webseter et al., 2004; Shcherbakova, 2007).

PCR en tiempo real.

Esta metodología permite monitorear la acumulación en tiempo real de los productos de

PCR para cada ciclo durante toda la reacción. La técnica no requiere correr las muestras en

gel de electroforesis ya que la información requerida se obtiene en las gráficas del

monitoreo de la reacción. Es más rápida, específica y sensible que una PCR convencional,

73

además de ser un método cuantitativo al suministrar información de la cantidad de producto

amplificado, previa generación de una curva de calibración (Shcherbakova, 2007).

El equipo para este procedimiento posee instrumentación para la medición de la

fluorescencia generada por la liberación de fluorocromos liberados o incorporados en los

diferentes ciclos de la reacción. Se pueden emplear colorantes como SYBRgreen®, que es

un compuesto que se intercala en el ADN de doble cadena y es la forma de detección más

simple de la técnica; aunque tiene como desventaja el hecho que el colorante se puede

intercalar en amplicones inespecíficos generados durante la reacción (Shcherbakova, 2007).

Otra metodología que evita los problemas de detección inespecífica, consiste en el uso de

sondas Taqman® (25-30 nt), las cuales se unen al interior de la secuencia demarcada por

los cebadores. Posee un marcaje en su extremo 5‟ de un derivado de Fluorosceína

(generalmente 6-FAM) y en el extremo 3‟ un compuesto que absorbe la fluorescencia del

primero, denominado atenuador (quencher) (generalmente TAMRA). La detección se da

cuando la sonda hibridiza en la secuencia de interés (al igual que los cebadores específicos)

y al comenzar la extensión, la acción 5‟-3‟ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda,

liberando el flurocromo que se encuentra hacia el extremo 5‟, siendo posible su detección

por parte del equipo. Otros formatos de la técnica incluyen las denominadas sondas

Scorpion™ ó del tipo Molecular Beacons, en los cuales las sondas forman estructuras

plegadas en forma de asa, que una vez se eleva la temperatura en la reacción son separadas,

produciéndose la fluorescencia y por tanto la detección respectiva (Shcherbakova, 2007).

El uso de PCR en tiempo real viene extendiéndose ampliamente en el campo de la

fitopatología, permitiendo identificar virus y otros patógenos que afectan las plantas. Es un

método de diagnóstico e identificación evaluado en patógenos cuarentenarios como el

74

viroide de la papa (PSTVd) y en virus de gran importancia económica como Tomato

spotted wilt virus (TSWV) y PVY-NTN (Webster et al., 2004; Shcherbakova, 2007).

4. METODOLOGÍA

4.1. Localización

Esta investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biología celular y molecular de la

Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Las muestras de plantas de papa fueron

obtenidas en los principales municipios cultivadores de los Departamentos de Antioquia,

Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 1). Las plantas utilizadas para la detección de

PMTV a partir de muestras de suelo infestadas con quistosoros de S. subterranea, fueron

mantenidas en casas malla en el Centro Experimental Paysandú, ubicado en el

corregimiento Santa Elena, municipio de Medellín (bh-MB, 2.550 msnm., temperatura

media 14°C y precipitación promedio anual de 2.000 mm).

Tabla 1. Procedencia de las muestras de papa utilizadas para la detección de virus.

Departamento Zona Municipio Vereda N°Lotes

Antioquia

Oriente

La Unión

Buena Vista 1

El Vergel 1

San Juan 1

El Cardal 1

Sonsón Tasajo 3

La Honda 1

Oriente Cercano

Santuario El Carmelo 3

Marinilla

La Ramada 1

Alto de Mercado 1

Barbacoa 1

Carmen de Viboral 2

75

Norte Sta Rosa de Osos

El Roble 5

Santana 3

Cundinamarca

Villapinzón Villapinzón

Chasques 3

1

Quincha 3

Bosabita 1

Zipaquirá Zipaquirá

San Jorge 3

Alto del Águila 2

Páramo de Guerrero 2

Venta Larga 1

Occidente

Cota Parcelas 1

La Variante 2

Madrid Los Árboles 3

Facatativá 2

Boyacá

TV

Turmequé

Joyagua 1

Siguineque 1

Chiratá 1

Juratá 1

Rosales 1

Ventaquemada Sota 1

Capellanía 2

Tunja Siachoque

Cormechoque 3

Jurubita 3

Soracá Quebrada Vieja 2

Nariño

Pasto Pasto

Santa Bárbara 1

La Victoria 3

Catambuco 1

Cruz Loma 1

Jongovito 1

Obonuco 1

Ipiales Ipiales

Saguarán 1

El Placer Bajo 1

Suras 2

El Chita 1

Giro San Antonio 3

4.2. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa

Para esta evaluación se realizaron muestreos aleatorios en ocho cultivos de papa de

diferentes variedades ubicados en tres zonas productoras del Departamento de Antioquia

(zona 1: Oriente, zona 2: Oriente cercano, zona 3: Norte Antioqueño), tres zonas en

Continuación Tabla 1

76

Cundinamarca (zona 4: Zipaquirá, zona 5: Villa Pinzón, zona 6: Occidente), dos zonas en

Boyacá (zona 7: Turmeque-Ventaquemada, zona 8: Tunja) y dos zonas en Nariño (zona 9:

Pasto, zona 10: Ipiales) (Tabla 1). En cada cultivo se realizó un recorrido aleatorio

evaluándose 100 plantas por sintomatología general presumiblemente asociada a virus (AV:

amarillamiento de venas, En: enanismo, EF: enrollamiento foliar, MR: mosaico rugoso, O:

sin síntomas visibles). Estas 100 plantas se dividieron en cuatro grupos de 25, tomándose

dos hojas de las plantas correspondientes a las lecturas 5, 10, 15, 20 y 25 de cada grupo,

para generar una muestra compuesta (bulk) para el análisis serológico. Adicionalmente y

con fines comparativos, de cada zona se tomó una muestra de plantas con cada uno de los

síntomas indicados anteriormente (AV, En, EF, MR), con el fin evaluar la asociación de

dichos síntomas con la presencia de alguno(s) de los virus bajo análisis.

Una vez en el laboratorio, las muestras obtenidas de cada cultivo se evaluaron mediante

pruebas de ELISA con anticuerpos específicos de la compañía Agdia (Indiana, EEUU) para

los virus PVX, Potyvirus, PLRV y PVS. Para la detección del virus PMTV se utilizaron

anticuerpos de la compañía Bioreba (Reinach, Suiza). Las siguientes son las características de

cada uno de las pruebas de ELISA empleadas para esta detección viral:

PLRV: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con

anticuerpos policlonales conjugados a la enzima Fosfatasa alkalina.

Grupo de Potyvirus: Prueba de ACP-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales

desarrollados por USDA Florist and Nursery Crops Laboratory (Beltsville, Maryland,

USA) y detección con anticuerpo monoclonal conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.

PVX: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con


77

PMTV: prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados por

Scottish Agricultural Science Agency (SASA) y su detección con anticuerpo monoclonal

conjugado a la enzima Fosfatasa alkalina.

PVS: Prueba de DAS-ELISA utilizando anticuerpos policlonales y detección con


Para las pruebas de ELISA, se tomaron fracciones de tejido foliar de cada muestra y se

pesaron 100 mg, procediéndose a macerar con el buffer de extracción recomendado para

cada virus en concentración 1X y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados

colorimétricos fueron cuantificados en un equipo Multiscan (Labsystem, Finlandia),

incluyendo en cada prueba un control positivo (suministrado por el fabricante en forma

liofilizada) y un control negativo (buffer de extracción). Los pozos fueron considerados con

reacción positiva cuando la lectura de absorbancia a 405 nm presentó un valor mínimo del

doble de la lectura obtenida en el control negativo (Matthews, 1993).

Los resultados de niveles de incidencia fueron analizados a través de un modelo lineal

generalizado aleatorio considerando una distribución binomial para la variable incidencia y

utilizando una función de ligamiento logit. Los efectos aleatorios fueron: zona y cultivos de

dentro de zona. Para el análisis estadístico de utilizó el procedimiento GLIMMIX del

programa estadístico SAS versión 9.1.3.

4.3. Detección del PMTV en cultivos afectados por S. subterranea

En cada una de las diez zonas bajo estudio, se ubicó al menos un cultivo afectado por sarna

polvosa, tomándose una muestra de raíces y/o tubérculos sintomáticos, además de una

78

muestra de suelo de 1 kg. Las muestras de tejidos sintomáticos fueron utilizadas para la

detección de PMTV directamente a partir de los quistosoros del patógeno, mediante ELISA

y RT-PCR, como se describe en los otros apartados de la metodología; mientras que la

muestra de suelos fue tamizada para la extracción de quistosoros siguiendo la metodología

de Jaramillo y Botero (2007), en la cual se utiliza un juego de tamices de 250 y 90 μm. Una

vez realizado este procedimiento, se tomaron 5 g del material retenido en el tamiz de 25 μm

(suelo y quistosoros) para realizar su inoculación en macetas con turba de 250 g de

capacidad, en las cuales se transplantaron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con

2-3 pares de hojas verdaderas, siguiendo la metodología de Vélez (2007). La concentración

de quistosoros de cada una de las muestras tamizadas fue cuantificada a partir de una

dilución de 100 mg/10 ml de agua mediante un hematocitometro. Tres meses despues de la

siembra se tomaran muestras de hojas y raíces para el diagnóstico de PMTV mediante

pruebas de ELISA y RT-PCR.

4.4. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa

mediante RT-PCR y secuenciación

Para el análisis filogenético de los virus PVY, PLRV, PVS, PVX y PYVV se utilizaron

secuencias parciales de la región del genoma que codifica para la cápside viral; mientras

que para PMTV además de esta región, también se realizó el análisis con base en una

porción del gen TGB2.

El ARN molde necesario para la técnica de RT-PCR se obtuvo a partir de extracciones de

ARN total de plantas de papa con los diferentes síntomas virales mediante el kit RNeasy

79

plant mini kit (QIAGEN Inc., California, USA). Para el caso de PMTV, además del análisis

de plantas de papa, también se evaluó tejido foliar de plantas de N. benthamiana

mantenidas en suelos infestados con quistosoros de S. subterranea y directamente de

agallas de raíces y tubérculos con sarna polvosa. Para este procedimiento se maceraron 100

mg de tejido foliar, utilizando 450 μL de buffer RLT (para tejido foliar) o RLC (para raíces

y tubérculos) y 4,5 μl de β-mercaptoetanol, siguiendo las instrucciones del fabricante, pero

con dos centrifugaciones simultáneas en la etapa de lavado del ARN. Al finalizar el

procedimiento, el ARN obtenido fue resuspendido en 40 μl de agua destilada ésteril tratada

con DEPC.

Adicionalmente, ante la dificultad de obtener los amplicones esperados en algunas zonas de

muestreo mediante el procedimiento de extracción de ARN total, se realizó la transcripción

reversa a partir de liberación post-ELISA, siguiendo el procedimiento de inmunocaptura

propuesto por Harju et al. (2005). Brevemente, una vez concluída la prueba de ELISA, se

remueve el sustrato mediante tres lavados de 1 min con PBS-T (PBS suplementado con

0.05% Tween 20) y las partículas virales fueron liberadas con buffer-R (10mM Tris–HCl,

pH 8.0 with 1.0% Triton X-100) bajo incubación a 70°C por 10 min. La solución resultante

se almacenaba a -20°C hasta su uso directo en la RT.

Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos (Two-Steps RT-PCR). Para esto se

utilizaron cebadores específicos (Tabla 2) y/o oligo-dT (para los virus que presentan colas

de poly-A en sus regiones 3‟) en las reacciones de retrotranscripción de un volumen de 20

µl, incluyendo 1,9 µl de agua, 4 µl de buffer RT 5X, 4 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de dNTPs

10 mM, 1 µl de cebador reverso 10 µM, 0,1 µl de inhibidor de RNasa (40U/µl), 2 µl de

enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 U/µl )(Fermentas, Lituania) y 5 µl de ARN o

80

alternativamente una dilución 1:5. El programa consistió en 37°C por 60 min, 75°C por 15

min y finalmente las muestras fueron mantenidas a 4°C hasta su uso en el PCR posterior.

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 µl con 16,2 µl de agua, 2,5 de

buffer de enzima 10X, 1,8 µl de MgCl2 (25 mM), 0,5 µl de dNTPs (10 mM), 0,5 µl de cada

cebador (10 µM) (Tabla 2), 0,2 µl de Taq ADN polimerasa (5 U/µl) (Fermentas) y 2,5 µl de

ADNc, aunque en algunas ocasiones fue necesario preparar diluciones de 1:5 y 1:10 de

ADNc. El programa de PCR consistió en 95°C por 30 s, seguido de 40 ciclos de 95°C por

30s, 52-60°C (Tabla 2) por 45 s, 72°C por 1 min (1 min por cada 1000 pb esperados) y una

extensión final a 72°C por 5 min.


virus bajo estudio.

Virus Cebador Secuencia Tamaño

amplicón

T°

annealing Referencia

PVY PVYF 5'-ACG TCC AAA ATG AGA ATG CC-3'

480 pb 53°C Nie y Singh, 2001 PVYR 5'-TGG TGT TCG TGA TGT GAC CT-3'

PVX PVXF 5'-TAG CAC AAC ACA GGC CAC AG-3'

562 pb 57ºC Nie y Singh, 2001 PVXR 5'-GGC AGC ATT CAT TTC AGC TTC-3'

PYVV PYVVCPF

5´-ATG GAA ATC CGA TCG TGG AAC

CT-3´ 758 pb 55°C Livieratos et al.,

2002 PYVVCPR 5´-CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA-3´

PVS

PVSCPF 5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3'

1288 pb 53°C

Chikh Ali et al.,

2008

PVSR 5'-ATG ATC GAG TCC AAG GGC ACT G -

3' Nie y Singh,2001

PLRV

PLRVF 5' -CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC-3'

336 pb 54ºC Singh et al., 1995 PLRVR 5'-GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT-3'

PMTV

C819 5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA

CC-3‟

460 pb 56°C MacKenzie, 1996

H360 5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA

GT-3‟

81

PMTVF4 5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟ 417 pb 56°C Xu et al., 2004

PMTVR4 5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATACTGC-3‟

Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%

suplementado con 4 μL de bromuro de etidio (10 mg/ml), visualizados utilizando un

transiluminador UV (Biometra, Göttingen, Alemania) y su tamaño verificado por

comparación con el marcador de peso molecular Generuler 100 pb DNA ladder

(Fermentas). Los amplicones del tamaño esperado para cada uno de los virus bajo análisis,

fueron purificados directamente del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen),

para proceder a su secuenciación en ambos sentidos utilizando los mismos cebadores del

RT-PCR en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied Biosystems) de la compañía

Macrogen (Corea del Sur).

Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit

6.0.6 y Chromas 1.45, construyéndose secuencias consenso y confirmándose su identidad

con genes virales por comparación con las bases de datos moleculares, mediante el

programa nucleotide BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi). Esta

información sirvió de base para realizar el análisis de las relaciones filogenéticas de las

cepas virales encontradas y aquellas de otras regiones del mundo, cuyas secuencias están

reportadas en las bases de datos moleculares. Para esto se alinearon las secuencias mediante

el software Clustal W y la matriz generada fue utilizada para obtener un árbol filogenético

basado en Máxima Parsimonia utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP

4.0b, asumiendo los espacios (gaps) como nucleótidos eliminados (missing value) y la

orden tree-bisection reconnection (TBR) (Swofford, 1998). El soporte de la topología

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi

82

interna de los dendrogramas fue determinado por análisis de bootstrap con 1000

remuestreos (Felsenstein, 1985).

4.5 Secuencias parciales de los genomas virales

Con el fin de obtener un mayor nivel de información sobre las características de los

genomas de los virus bajo estudio, adicionalmente se evaluaron múltiples cebadores

dirigidos a otras regiones del genoma, diferentes a las utilizadas en el análisis filogenético

(Tabla 3). Para esto se siguieron los procedimientos de extracción de ARN, RT-PCR y

secuenciación descritos anteriormente, pero utilizando un menor número de aislamientos.

Para realizar el ensamblaje de los genomas parciales, las secuencias se editaron mediante

Chromas, generándose los consensos con ambos cebadores usando Bioedit. Posteriormente,

se verificaba el marco de lectura correcto utilizando el servidor de Expasy (Expasy

Proteomic Server, http://www.expasy.ch/tools/dna.html) y se procedía a su alineamiento

con respecto a los genomas completos para cada virus, disponibles en el GenBank. Las

regiones alineadas eran seleccionadas para evaluar sus niveles de identidad en nucleótidos y

aminoácidos con la herramienta de matriz de identidad del programa Bioedit. Con las

secuencias disponibles para cada aislamiento viral, se generaba un ensamble en contigs

mediante la herramienta ContigExpress del software vector NTI (versión 11.0 Invitrogen

Corporation 2008). Finalmente, aquellos genomas que presentaban mayores niveles de

identidad con respecto a las secuencias ensambladas de las cepas nativas, fueron utilizados

como base de referencia para realizar diagramas de su ubicación en el contexto genómico,

mediante el software Vector NTI.

http://www.expasy.ch/tools/dna.html

83


virus bajo estudio.

Virus Cebador Secuencia

Posición en

el genoma

(nt)

T°

annealing Referencia

PVY

PVYc 5'-AAT TAA AAC AAC TCA ATA CA- 3' 2 a 21

53°C

Glais et al.,

2002a

PVYd 5'-TGY GAH CCA CGC ACT ATG AA-3' 955 a 974

PVYHC-

ProF 5'-CGM ARG GGY GAT AGT GGA GT-3' 880 a 899

PVYHC-

ProR 5'-GTT TCT GCY GCT GAC ACT CG-3' 2704 a 2723

PVYCPF 5'-ACC ATC AAG SAA ATG ACA CA-3' 8564 a 8583

PVYCPR 5'-CGG AGA GAC ACT ACA TCA CA-3' 9371 a 9390

HF 5'-AAC CAT TCT TCA AGA AGC CAA CAC

TGC GTA-3' 4034 a 4063

Glais et al.,

1998

HR 5'-TAC GCA GTG TTG GCT TCT TGA AGA ATG

GTT-3' 4034 a 4063

3ntr 5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT ACA GTC ACT

GYT ATG A-3' 9670 a 9703

3ntrC 5'-GTC TCC TGA TTG AAG TTT AC-3' 9684 a 9703

PVX

PVX1F 5'-GAA AAC TAA ACC ATA CAC CAA CAA C-

3' 1 a 25

Rain et al.,

2007

PVX1651R 5'-CGC GTT TRG CTT TCT TTR CRG-3' 1651 a 1672

PVX3130F 5'-GTS GAG AAT GAG GAG TC-3' 3130 a 3146

PVX4495R 5'-CCT AAA CTT TTC AAA CTA NTG ATG AG-

3' 4495 a 4520

PVX5476F 5'-CAA TCA TAG CAG TMA TTA G-3' 5476 a 5494

PVX6415R 5'-ATT TAT ATT CAT ACA ATC-3' 6415 a 6435

PVS

PVSCPF 5'-CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3' 7098 a 7117

53°C Chikh Ali et

al., 2008 PVSCPR 5'-TGG TAT CAC CTC AGT TAC TCC-3' 8366 a 8386

PYVV

CPm1 5'-ATG GAT AAG TCT GTT TTA GAT G-3' 916 a 937

52° Livieratos et

al., 2002 CPm2 5'-TCA AAA GTT TTG ATT CAC ATT C-3' 2919 a 2940

PMTV FURO-Hel 5'-GAT GGT GTA CCC GGA TGT GGA AAG TC-

3' 3151 a 3176 58°C

Savenkov et

al., 1999

84

123 end 5'-GTG AAC CAC GGT TTA RCC CTG KAA GC-

3' 5847 a 5872

PMTV759F 5'-ACC TGA GGT CAG AGT TAT CGA CG-3' 1072 a 1094 Presente

Trabajo PMTV1552R 5'-GCC AAT TGT CTC AAT CAT ACA CTG-3' 1865 a 1888

C819 5‟-CTA TGC ACC AGC CCA GCG TAA CC-3‟ 822 a 844

56°C

MacKenzie,

1996 H360 5‟–CAT GAA GGC TGC CGT GAG GAA GT-3‟ 385 a 407

PMTVF4 5‟ CAG CAA CCA CAA ACA GAC AGG-3‟ 1726 a 1746 Xu et al.,

2004 PMTVR4 5‟ AGC CAC TAA CAA AAC ATA CTG C-3‟

2120 a 2141

PMTV5

USA RNA3 5'-GGT GAA CAC GAG GAC AAG GT-3'

1417 a 1436 Lambert et

al., 2003 PMTV7

USA RNA3 5'-AAC AGT CCG GTC TTG TGA AC-3'

2044 a 2063

4.6. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real

Con el fin de generar una prueba de diagnóstico que permita la detección rápida y sensible

de los virus, se evaluó una metodología de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) utilizando

sondas Taqman® y cebadores específicos para los virus PVY y PMTV. Estos virus fueron

seleccionados en la investigación debido a su importancia económica y amplia distribución

en las regiones cultivadoras de papa (PVY) y a su condición de patógeno cuarentenario

(PMTV) asociado a S. subterranea. Se utilizaron 40 muestras de tejido foliar de papa (para

PVY) obtenidas de cultivos de los departamentos de Antioquia y Nariño (Tabla 5) y 40 de

raíces de plantas de N. benthamiana obtenidas de suelos infestados con quistosoros de S.

subterranea de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño (Tabla 6). Todas las muestras

fueron evaluadas mediante ELISA, RT-PCR convencional y qRT-PCR. Las pruebas de

ELISA se realizaron con anticuerpos comerciales para PVY (Agdia) y para PMTV


85

(Bioreba), mientras que los RT-PCR convencional se desarrollaron con cebadores

específicos para PVY: PVYF y PVYUnivR (Tablas 3 y 4); para PMTV se utilizaron los

cebadores diseñados a partir de las secuencias obtenidas en el proyecto PMTV759F y

PMTV1552R (Tabla 3). Las reacciones de qRT-PCR se realizaron en un sólo paso,

utilizando el kit QuantiTect Probe RT-PCR (Qiagen, Alemania) en 20 μl de reacción

conteniendo 10 μl de 2X QuantiTect Probe Master Mix (HotStarTaq DNA Polymerase,

QuantiTect Probe RT-PCR Buffer, dNTPs incluyendo dUTP, ROX buffer), 0,2 μl

QuantiTect RT Mix (Reverso transcriptasas Omniscript y Sensiscript), 6,9 μl de agua libre

de ARNasas, 0,8 μl de cada cebador (10 μM), 0,3 μl de sonda Taqman® (10 μM) (Tabla 4)

y 1 μl de ARN. Las reacciones fueron realizadas en un equipo Rotor-Gene Q 5plex

Platform (Qiagen) y consistieron de 50°C por 30 min, seguido por la activación de la Taq

polimerasa Hotstart a 95°C por 15 min; y el PCR en 40 ciclos de 15 s 94°C y 1 min a 60°C.

Para cada muestra se calcularon los valores Ct utilizando el software del equipo. Los

resultados obtenidos para cada prueba fueron comparados mediante análisis de los niveles

de significancia corregidos por el método de Bonferroni y utilizando el programa SAS

System 9.1.3.

86

Tabla 4. Cebadores específicos y sondas a utilizar en la detección por qRT-PCR de los

virus PVY y PMTV.

Virus Cebadores

sondas Secuencia

Tamaño

amplicón

T°

Annealing Referencia

PVY

UnivF 5'- CAT AGG AGA AAC TGA

GAT GCC AAC T -3´

73 pb 60ºC Kogovsek et

al., 2008

UnivR 5'- TGG CGA GGT TCC ATT TTC

A -3'

Sonda

UnivPVY

FAM-TGA TGA ATG GGC TTA

TGG TTT GGT GCA-BHQ-1

PMTV

1948F 5'-GTG ATC AGA TCC GCG TCC

TT-3'

70 pb 60°C Mumford et

al., 2000

2017R 5'-CCA CTG CAA AAG AAC

CGA TTT-C 3'

Sonda FAM ACC AGA ACT ACG GTG

CCG CGT CG BHQ-1

PMTV-

1970

Tabla 5. Muestras empleadas para la detección del virus PVY.

Muestra Localidad Vereda Variedad

P3 6-10 Pasto La Victoria Parda pastusa

P3 EN Pasto La Victoria Parda pastusa

P4 1-5 Pasto La Victoria Nevada

P4 AV Pasto La Victoria Nevada

P4 11-15 Pasto La Victoria Nevada

P5 11-15 Pasto Catambuco Capiro

P6 11-15 Pasto Cruz Loma Capiro

P7 MR Pasto Jongovito Criolla

P8 AV Pasto Obonuco Criolla

P8 16-20 Pasto Obonuco Criolla

87

IP EF Ipiales Saguarán Capiro

IP ESP Ipiales Saguarán Capio

IP EN Ipiales Saguarán Capiro

IP MR Ipiales Saguarán Capiro

IP1 AV Ipiales Saguarán Capiro

IP2 MR Ipiales El placer Bajo Capiro

IP3 EF Ipiales Suras Capiro

IP3 1-5 Ipiales Suras Capiro

IP4 AV Ipiales Suras Criolla

IP4 11-15 Ipiales Suras Criolla

U1 La Unión Las Llamas Capiro

U2 La Unión Sta Inés Capiro

U3 La Unión Sn juan Capiro

U4 La Unión Sn Juan Capiro

U5 La Unión Madera Puracé

U6 La Unión Las Acacias Puracé

U7 La Unión Sn Miguel abajo Capiro

U8 La Unión El Guarango Capirol

SR1 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro



SR4 Sta Rosa de Osos Betania Capiro

SR5 Sta Rosa de Osos Betania Capiro


SR7 Sta Rosa de Osos El Roble Capiro

SR8 Sta Rosa de Osos Quitasol Capiro

SR9 Sta Rosa de Osos Quitasol Capiro

B1 Belmira la Salazar Capiro



Tabla 6. Muestras empleadas para la detección del virus PMTV.

Muestra Localidad Vereda Variedad

C+ KIT ELISA

C+ 1/5 KIT ELISA

C+ 1/10 KIT ELISA

C+ 1/50 KIT ELISA

7 Ipiales Rosario Unica

10 Pasto El Campanero Parda Pastusa


88

10(1) Pasto El Campanero Parda Pastusa

23 Zipaquirá

Páramo

Guerrero Pastos

23(1) Zipaquirá

Páramo

Guerrero Pastos

25 La unión La Cabaña Criolla

25(1) La unión La Cabaña Criolla

35 La unión Madera Criolla

36 La unión Vallejuelito Criolla

Vallejuelito La unión Vallejuelito Capiro

Villapinzón Villapinzón Chasques Capiro

Villapinzón(1) Villapinzón Chasques Capiro

Villapinzón(2) Villapinzón Chasques Capiro

Madrid Madrid Los Árboles Capiro

Madrid(1) Madrid Los Árboles Capiro

Madrid(2) Madrid Los Árboles Capiro


Páramo

Guerrero Parda Pastusa

Zipaquirá(1) Zipaquirá

Páramo



Páramo



Páramo



Páramo


Tunja Tunja Siachoque Capiro

Tunja(1) Tunja Siachoque Capiro



Ventaquemada Ventaquemada Capellanía Capiro

ventaquemada (1) Ventaquemada Capellanía Capiro

Ventaqumada(2) Ventaquemada Capellanía Capiro

Ventaquemada(3) Ventaquemada Capellanía Capiro

SRO L2 Sta Rosa de Osos Aragón Capiro



SRO L5(2) Sta Rosa de Osos Aragón Capiro


SRO L7 Sta Rosa de Osos El Tres Capiro

TZ1Z1 Turmeqé Siguineque Criolla


89

5. RESULTADOS

5.1. Evaluación de niveles de incidencia viral en cultivos de papa

Evaluación de incidencia de síntomas en cultivos de papa

El análisis de la sintomatología visual presumiblemente asociada a posibles infecciones

virales indicó que el mosaico rugoso se presenta como el síntoma con mayores niveles de

incidencia en los cultivos de papa de los cuatro departamentos bajo estudio, con un

promedio del 16%, seguido por el enrollamiento foliar (10%) y el amarillamiento de venas

(7%). El síntoma enanismo fue el menos evidente, alcanzando un promedio del 2% (Figura

9).

Figura 9. Promedio de cuatro síntomas visuales posiblemente asociados a enfermedades virales en cultivos de

papa ubicados en cuatro departamentos de Colombia. AV: amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar,

EN: enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno

de los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

90

Figura 10. Síntomas observados en campo sobre tejido foliar de plantas de papa en cuatro departamentos de

Colombia. A: Amarillamiento de Venas (AV); B, D: Mosaico Rugoso (MR); C: Otros síntomas

(verdeamiento de nervaduras). E: Enrollamiento Foliar (EF); F: Enanismo (EN).

Las observaciones de síntomas visuales entre cultivos de papa de diferentes departamentos,

demostraron mayor niveles de incidencia en los cultivos de Antioquia para los cuatro

síntomas evaluados, alcanzando promedios del 34% para el MR, 20% para AV, 18% para

EF y 7% para EN, mientras que los niveles de incidencia de los cuatro síntomas observados

91

en los Departamentos de Boyacá y Cundinamarca fueron muy similares, no superando

valores de 15% para ninguno de ellos, e incluso presentando niveles marginales para el

síntoma EN (< 2%). La situación encontrada en el Departamento de Nariño, indicó bajos

niveles de incidencia para los cuatro síntomas evaluados, con ninguno de ellos superando el

10% (Figura 11).

Figura 11. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a

enfermedades virales en cultivos de papa para los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y

Nariño. AV: Amarillamiento de venas, EF: Enrollamiento foliar, EN: Enanismo y MR: Mosaico rugoso. Sint:

representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de los síntomas evaluados. Las líneas dentro

de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

92

Al evaluar los niveles de incidencia de los cuatro síntomas bajo estudio en las zonas

muestreadas dentro de cada departamento, se evidenció que la región Oriente cercano (Ant)

presentó los promedios más altos respecto al síntoma AV, siendo éste de 37% y

significativamente superior al del resto de las zonas, con excepción de Ipiales (Nar), cuyo

promedio fue de 20%. Las dos zonas con mayores promedios para EF, fueron Santa Rosa

de Osos (Ant) y Occidente (Cund), cuyos valores fueron 22% y 17%, respectivamente. EN

fue el síntoma con los menores promedios de incidencia en todas las zonas, encontrándose

en rangos de 1% a 5%. Por último, MR fue más frecuente en la zona de Santa Rosa de Osos

(Ant), con promedios del 30%, seguido por Zipaquirá (Cund) con el 27% (Figura 12).

93

Figura 12. Promedio de observaciones de plantas con síntomas visuales presumiblemente asociados a

enfermedades virales en cultivos de papa ubicados en 10 zonas de muestreo dentro de los departamentos de

Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. AV: amarillamiento de venas, EF: enrollamiento foliar, EN:

enanismo y MR: mosaico rugoso. Sint: representa las observaciones en las que se presentó al menos uno de

los síntomas evaluados. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

5.2 Detección serológica de virus en muestras de papa sintomáticas

Con el fin de evaluar la asociación de la presencia de los virus Potyvirus, PVS, PLRV y

PVX con alguno (s) de los cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación, se

realizó un análisis serológico sobre grupos de plantas que compartían los mismos síntomas,

no encontrándose ninguna correlación significativa para las combinaciones virus/síntomas

evaluados. Por el contrario, esta evaluación detectó la ocurrencia de potyvirus en promedios

superiores al 68% para los cuatro síntomas, alcanzándose valores tan altos como 90% en

plantas con EF y EN. Así mismo, las pruebas de ELISA detectaron en una alta proporción

de plantas sintomáticas la presencia de PVS (>30% para los cuatro síntomas), mientras que

PLRV se detectó en un rango del 13 al 25% de las muestras con diferentes síntomas. Por

último, PVX fue el virus con menores niveles de detección en este ensayo en plantas con

síntomas de MR y EF (< 6%), aunque su presencia en plantas con AV y EN superó el 20%

(Figura 13). En síntesis este ensayo conduce a reevaluar la creencia generalizada en

técnicos y agricultores de papa de que plantas presentando síntomas particulares estarían

afectadas por una especie viral determinada, como es el caso evidente con los resultados de

AV, donde se detectaron los cuatro virus en promedios superiores al 15%, no siendo

94

entonces el PYVV el único virus presente en dichas muestras. Para éste último no hay

disponibles anticuerpos comerciales para su detección.

Figura 13. Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los

cuatro síntomas evaluados visualmente en la investigación (AV, EN, EF y MR) en cultivos de papa de cuatro

departamentos de Colombia. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

5.3 Niveles de incidencia de virus en cultivos de papa de 10 zonas productoras de

Colombia

Los resultados de la detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX

indican su presencia generalizada en las zonas productoras de papa del país, siendo los

95

Potyvirus y el PVS los que arrojaron mayores niveles de incidencia con promedios

nacionales de 72% y 40%, respectivamente; mientras que el virus PLRV se detectó con un

promedio del 20%. Por otra parte, PVX fue el virus evaluado con menor nivel de

incidencia, alcanzando un valor del 8%. En promedio, el 90% de las muestras colectadas en

la investigación fueron positivas a alguno de los virus estudiados (Figura 14). Al analizar

dichos resultados en cada uno de los cuatro departamentos evaluados, no se encontraron

diferencias significativas para la incidencia de los cuatro virus entre departamentos, aunque

resalta el hecho que algunos virus se presentaron en proporciones muy altas, como el caso

de los Potyvirus en el 76% de las muestras de Boyacá y PVS en el 58% de las muestras

analizadas de Cundinamarca. Contrariamente, PVX presentó valores relativamente bajos

con respecto a los otros virus, siendo las muestras de Nariño donde su proporción promedia

fue mayor (14%), mientras que para Cundinamarca y Boyacá alcanzó el 5%. En promedio,

el 91% de las muestras fueron positivas a alguno de los virus evaluados en Antioquia, 90%

en Boyacá y Cundinamarca y 85% en Nariño (Figura 15).

96

Figura 14. Niveles de incidencia evaluados a partir de pruebas de ELISA para los virus Potyvirus, PLRV,

PVS y PVX en cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia. Sint: representa las muestras que

resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones serológicas. Las líneas dentro de las

barras indican los intervalos de confianza al 95%.

97


PVS y PVX en cultivos de papa de los departamentos de Antioquia, Boyacá, Cundinamarca y Nariño. Sint:

representa las muestras que resultaron positivas para al menos uno de los virus en las evaluaciones

serológicas. Las líneas dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

El análisis de la incidencia viral al interior de cada una de las diez zonas cultivadoras de

papa evaluadas indicó que Potyvirus es el grupo predominante, presentando promedios de

hasta el 80% para Santa Rosa de Osos (Ant), seguido por Tunja (Boy) y Oriente Cercano

(Ant) con 77% y 75%, respectivamente, mientras que las demás zonas presentaron valores

superiores al 56%. El segundo virus más incidente dentro de las zonas fue PVS, siendo

Oriente Cercano (Ant) y Pasto (Nar) las zonas donde se obtuvieron mayores promedios

98

(49% y 47% respectivamente). PLRV se ubicó entre valores del 30% (Villapinzón) y 14%

(Zipaquirá), siendo Turmequé-Ventaquemda (Boy) la segunda zona con mayor incidencia

del virus (27%). Pasto (Nar) y Oriente cercano (Ant), reportaron los promedios más altos

para PVX, ubicándose en el orden de 28% y 25%, respectivamente. Las demás zonas

tuvieron promedios por debajo del 9%. En general, la zona Oriente Cercano (Ant) fue la

que presentó mayores niveles de incidencia viral, con un promedio de 94% de las muestras

positivas para al menos uno de los virus (Figura 16).


PVS y PVX en cultivos de papa de 10 zonas productoras de los departamentos de Antioquia, Boyacá,

Cundinamarca y Nariño. Sint: Al menos una de las muestras fue positiva en la prueba serológica Las líneas

dentro de las barras indican los intervalos de confianza al 95%.

99

5.4 Detección serológica de PMTV en cultivos de papa de Colombia

La detección del virus PMTV a partir de muestras foliares de papa no arrojó resultados

positivos para ninguna de las muestras evaluadas procedentes de las 10 zonas bajo estudio,

razón por lo cual se realizó una evaluación piloto en 12 muestras de raíces de plantas con

síntomas de sarna polvosa y tubérculos con pústulas de la enfermedad, de diferentes

departamentos (Tabla 7). Nuevamente, en los resultados de las pruebas de ELISA no se

detectó ninguna muestra con PMTV, aunque si en los controles positivos del kit de

Bioreba, lo cual validaba el funcionamiento de la prueba. Por esta razón se decidió evaluar

la presencia del virus PMTV a partir de plantas de N. benthamiana cultivadas en macetas

con turba e inoculadas con quistosoros de S. subterranea, tal como se describió en la

metodología. En total se evaluaron las raíces de plantas procedentes de sustratos infestados

con 18 muestras diferentes de S. subterranea (Figura 17), encontrándose que cinco

muestras de Antioquia, y una de Boyacá, Cundinamarca y Nariño arrojaron resultados

positivos en las pruebas de ELISA (Tabla 8).

100

Tabla 7. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces y tubérculos de plantas

de papa afectadas por S. subterranea.

Muestra Tejido evaluado Departamento Municipio Absorbancia Resultado

Control + 2,421 Positivo

Control - 0,112 Negativo

PC tubérculo cáscara Boyacá Siguineque 0,119 Negativo

PP tubérculo pulpa Boyacá Siguineque 0,121 Negativo

Tunja C tubérculo cáscara Boyacá Siachoque 0,116 Negativo

Tunja P tubérculo pulpa Boyacá Siachoque 0,12 Negativo

Ventaquemada C tubérculo cáscara Boyacá Ventaquemada 0,124 Negativo

Ventaquemada P tubérculo pulpa Boyacá Ventaquemada 0,141 Negativo

Solanas C tubérculo cáscara Cundinamarca Villapinzón 0,127 Negativo

Solanas P tubérculo pulpa Cundinamarca Villapinzón 0,12 Negativo

Villapinzón C tubérculo cáscara Cundinamarca Villapinzón 0,124 Negativo

Villapinzón P tubérculo pulpa Cundinamarca Villapinzón 0,122 Negativo

RZ1 Raíz Cundinamarca Zipaquirá 0,205 Negativo



RV2 Raíz Cundinamarca Villapinzón 0,221 Negativo

RO6 Raíz Cundinamarca Madrid 0,214 Negativo

RTunja1 Raíz Boyacá Siachoque 0,209 Negativo

RTV2 Raíz Boyacá Siguineque 0,205 Negativo

101

Tabla 8. Detección mediante pruebas de ELISA de PMTV en raíces de plantas de

Nicotiana benthamiana cultivadas en sustratos infestados con S. subterranea.

Muestra

Procedencia del Suelo tamizado

Absorbancia Resultado Departamento Municipio Variedad

Control + 2,47 Positivo

Control - 0,12 Negativo

7 Nariño Ipiales Única 0,137 Negativo

10 Nariño Pasto Parda Pastusa 0,131 Negativo

25 Antioquia La Unión Criolla 1,215 Positivo

35 Antioquia La Unión Criolla 0,14 Negativo

36 Antioquia La Unión Criolla 0,148 Negativo

SRO L2 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 0,139 Negativo



SRO L6 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 1,015 Positivo

SRO L7 Antioquia Sta Rosas Osos Capiro 1,442 Positivo

Vallejuelito Antioquia La Unión Capiro 0,13 Negativo

23 Cundinamarca Zipaquirá Pastos 0,154 Negativo

Villapinzón Cundinamarca Villapinzón Capiro 0,146 Negativo

Madrid Cundinamarca Madrid Capiro 0,791 Positivo

Zipaquirá6 Cundinamarca Zipaquirá Parda Pastusa 0,124 Negativo

Tunja1 Boyacá Siachoque Capiro 0,121 Negativo

TZ1Z1 Boyacá Siguineque Criolla 0,172 Negativo

TV2 Boyacá Siguineque Criolla 0,487 Positivo

102

Figura 17. Plantas señuelo y fotos de microscopía de sus raíces infectadas con S. subterranea. a. Plantas de

N. benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea. b. Microscopía de raíces de N.

benthamiana sembradas en sustratos infestados con S. subterranea, donde se observan estructuras del

patógeno (40X y 100X).

5.5. Definición de afinidades filogenéticas de virus asociados a cultivos de papa

mediante RT-PCR y secuenciación

Debido al alto número de muestras que resultaron positivas en las pruebas de ELISA para

los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX, se optó por realizar las evaluaciones de RT-PCR y

103

las secuenciaciones correspondientes en al menos una muestra representativa de cada

departamento, obteniéndose un total de 33 secuencias consenso para PVY (seleccionado

por ser el potyvirus de mayor importancia económica en este cultivo en el mundo) (Tabla

9), 18 para PLRV (Tabla 10), 14 para PVX (Tabla 11), 15 para PVS (Tabla 12) y 10 para

PYVV (Tabla 13). Para este último virus, ante la no disponibilidad de anticuerpos

específicos, se tomaron como base de selección las muestras con sintomatología

característica de AV. Para el caso de PMTV, el bajo número de muestras detectadas como

positivas, condujo a la obtención de tres secuencias consenso para la región TGB2 y cuatro

secuencias para una gran porción del gen CP (Tabla 14).

Tabla 9. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVY.

Código Departamento Municipio Vereda Variedad

5MED Antioquia Sta Rosa Osos El Roble Capiro

6MED Antioquia Sta Rosa Osos El Roble Capiro

7MED Antioquia Sta Rosa Osos Santana Capiro

8MED Antioquia Sta Rosa Osos Santana Capiro

11BM Cundinamarca Villapinzón Capiro

12BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Criolla

12COL Antioquia Unión Buena Vista Capiro

13BM Cundinamarca Zipaquirá

Alto del

Águila Suprema

13COL Antioquia Sonsón Tasajo Capiro

13FB Cundinamarca Madrid Los Árboles Capiro

14BM Cundinamarca Zipaquirá

Alto del

Águila Única


14FB Antioquia Carmen de Viboral Capiro

15BM Cundinamarca Cota Parcela Capiro

15COL Nariño Pasto Cubijan Parda Pastusa

16BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Capiro

17BM Boyacá Siachoque Cormechoque Capiro

104


18BM Boyacá Soracá

Quebrada

Vieja Única


19BM Boyacá Turmequé Rosales Única


20BM Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro


21BM Antioquia Unión Capiro


34MY Nariño Pasto Cruz Loma Capiro

35MY Nariño Ipiales Saguarán Capiro

36MY Nariño Ipiales El Placer Bajo Capiro

37MR Antioquia Santuario Valle de María Nevada


38MR Antioquia La Ceja Capiro

39MR Antioquia Carmen de Viboral Aldana abajo Nevada

Tabla 10. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PLRV.


1BM Cundinamarca Villapinzón Capiro

1C Boyacá Turmequé Siguineque Suprema

2BM Cundinamarca Villapinzón Chasques Suprema

2C Cundinamarca Facatativá Criolla

3BM Cundinamarca Villapinzón Bosabita Esmeralda

4BM Cundinamarca Zipaquirá San Jorge Suprema

4C Antioquia La unión El Vergel Capiro

5BM Cundinamarca Madrid Los árboles Capiro

5C Antioquia Sonsón Tasajo Capiro

6BM Cundinamarca Madrid Los árboles Capiro

6C Antioquia La unión Buena vista Capiro

7BM Boyacá Turmequé Siguineque Crolla

7C Nariño Pasto El Campanero ICA Nariño

8C Nariño Pasto El Campanero Criolla

9BM Boyacá Siachoque Jurubita Parda Pastusa

14MED Antioquia Sta Rosa de Osos Santana Capiro

20FB Boyacá Turmequé Siguineque Criolla

87MY Nariño Ipiales Suras Criolla


105

Tabla 11. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVX.


17FB Antioquia Santuario El Carmelo Capiro



22COL Antioquia La Unión El Vergel Capiro

23COL Nariño Pasto Cubijan Parda pastusa

27BM Cundinamarca Zipaquirá Venta larga Criolla

28BM Cundinamarca Zipaquirá Venta larga Criolla

29BM Boyacá Soracá Quebrada vieja Unica

50MY Nariño Pasto La Victoria Parda pastusa

51MY Nariño Pasto La Victoria Nevada

52MY Nariño Pasto Cruzloma Capiro



58MR Antioquia Carmen de Viboral Aldana abajo Nevada

Tabla 12. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PVS.



26FB Antioquia Sonsón Tasajo Criolla

55MY Antioquia La Unión Vallejuelito Criolla

56MY Antioquia Sta Rosa de Osos El Roble Capiro

57MY Cundinamarca Villapinzón Quincha Esmeralda

58MY Cundinamarca Villapinzón Chasques Criolla

59MY Cundinamarca Villapinzón Bosabita Esmeralda





65MY Boyacá Siachoque Jurubita Suprema

66MY Antioquia Sta Rosa de Osos El Roble Criolla

67MY Antioquia Carmen de Viboral Aldana Abajo Nevada

68MY Antioquia Santuario Valle de María Capiro

106

Tabla 13. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP del virus PYVV.


13MED Antioquia Sonsón Tasajo Capiro


23FB Antioquia Carmend de Viboral Capiro

27UN Cundinamarca Facatativá Criolla

28UN Antioquia La Unión El Vergel Capiro

54MR Antioquia La Unión

Buena

Vista Capiro


91MY Nariño Pasto Obonuco Criolla



Tabla 14. Procedencia de las secuencias obtenidas para la región CP y TGB2 del virus

PMTV.

Código Departamento Municipio Vereda Variedad Región del

genoma

11MED Control positivo ELISA CP

70MR Antioquia La Unión La Cabaña Criolla CP

71MR Antioquia La Unión Vallejuelito Capiro CP

71MY Cundinamarca Madrid Los Árboles Capiro CP

72MY Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro CP

9MED Control positivo ELISA TGB2

66MR Antioquia La Unión La Cabaña Criolla TGB3

67MR Antioquia La Unión Vallejuelito Capiro TGB4

70MY Boyacá Ventaquemada Capellanía Capiro TGB5

5.5.1. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PVY

Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVYF y PVYR arrojaron los amplicones del

tamaño esperado de ~480 pb (Figura 18). El análisis utilizando 33 secuencias de este virus

107

y de 20 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVY representando

diferentes razas de este virus (PVY-O, PVY-C, PVY-N, PVY-NTN y PVY-NWilga) y

orígenes geográficos diferentes, indicaron niveles de identidad para la región estudiada

superiores al 89%; siendo evidente la relación entre las mayoría de cepas obtenidas en este

estudio y aquellas clasificadas como N y NTN, con las cuales compartieron niveles de

identidad superiores al 96%. Por otra parte las identidades entre cepas Colombianas de

PVY fueron superiores al 95% en todos los casos, con una gran proporción de cepas

compartiendo niveles superiores al 98%. Las cepas de referencia con menores niveles de

identidad (89 al 92%) con respeto a las cepas Colombianas fueron aquellas representantes

de las razas PVY-O y PVY-C, aunque tambien esto ocurrió con algunas PVY-NWilga y

PVY-N (Tabla 15).

Figura 18. Amplicones obtenidos con los cebadores PVY F y PVYR (480 pb) a partir de tejido foliar de

plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: Q El Roble, 3: U El Roble, 4: V

Santana, 5: W Santana, 6: Control negativo.

108

PV

Y5

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D6

ME

D7

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D8

ME

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BM

20

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M2

1C

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35

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38

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109

El análisis filogenético utilizó 454 posiciones, 291 de las cuales resultaron constantes, 92

variables pero no informativas y 71 informativas para el método de máxima parsimonia. El

dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,78, Índice de Retención (RI) de

0,89 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,22 y separó las cepas de PVY bajo análisis en

tres cluster (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 89%;

además de un cuarto clado conteniendo dos cepas de Irán, pero con un bajo soporte de

Bootstrap (59%). El grupo I incluyó 29 cepas de PVY obtenidas en este estudio de cultivos

de papa de los cuatro departamentos evaluados, presentando un muy bajo número de

cambios entre sus integrantes (<9); mientras que el clado II agrupó a cuatro cepas de PVY

obtenidas en cultivos del oriente de Antioquia con el conjunto principal de cepas de

referencia de las razas PVY-NTN y PVY-N, además de un aislamiento del tipo H

procedente de EEUU. El tercer grupo no incluyó ninguna cepa secuenciada en este estudio,

y estuvo conformado por cepas de referencia de las razas PVY-O, PVY-C, PVY-N y

PVYN-Wilga, pero no PVY-NTN. Finalmente, la secuencia del Potyvirus Pepper mottle

virus (PepMV) presentó valores de identidad cercanos al 70% con respecto a las secuencias

de los aislamientos de PVY, ubicándose por fuera de los grupos detallados (Figura 19), lo

cual confirmó su utilidad como grupo externo para el análisis.

110

Figura 19. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVY

obtenidos de cultivos de papa de Colombia y otros países del mundo. Método de máxima parsimonia

utilizando la opción Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y

los valores de Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.

111

5.5.2. Afinidades filogenéticas de aislamientos de PYVV

Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR produjeron

amplicones del tamaño esperado de ~758 pb (Figura 20). El análisis utilizando 10

secuencias de este virus obtenidas en el presente estudio y 10 secuencias referencia

previamente depositadas en el GenBank de cepas de PYVV procedentes de cultivos de

papa de Colombia y Perú, indicó niveles de identidad para la región de la cápside viral

estudiada superiores al 99 % en todos los casos. Por otra parte las identidades entre cepas

de PYVV y aquella utilizada como grupo externo del Lettuce infectious yellows virus

(LIYV), especie tipo del género Crinivirus, alcanzó niveles de identidad inferiores al 45%

(Tabla 16).

Figura 20. Amplicones obtenidos con los cebadores PYVVCPF y PYVVCPR (758 pb) a partir de tejido

foliar de plantas de papa de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: AVUni Unión, 3: AVF4

Facatativá, 4: Control negativo.

112

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.

113




0,90 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,0 y agrupó las cepas de PYVV bajo análisis en

un gran clado soportado por un 100% de valor de bootstrap. Este clado incluyó

indistintamente cepas de referencia previamente secuenciadas de Colombia y Perú y los 10

aislamientos evaluados en este trabajo. La secuencia del crinivirus LIYV se ubicó

externamente al clado de PYVV con un alto número de cambios con respecto al clado

principal (Figura 21).

114

Figura 21. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PYVV

obtenidos de cultivos de papa de Colombia y Perú. Método de máxima parsimonia utilizando la opción

Heuristic search del programa PAUP 4,0b. Los cambios se indican en la parte superior y los valores de

Bootstrap (> 50%) en la parte inferior de las ramas.

115

5.5.3. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVS

Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVSCPF y PVSR generaron los amplicones del


y 12 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PVS de diferentes

orígenes geográficos, indicaron niveles de identidad para la región estudiada superiores al

76%. Los porcentajes de identidad encontrados entre algunas cepas Colombianas de PVS

presentan un alto nivel de identidad (99%) (ej. 24FBPVS y 26FBPVS), mientras que en

otros casos este valor tan sólo alcanzó el 77%. Los aislamientos 57MYPVS, 58MYPVS y

65MYPVS fueron los que compartieron mayores niveles de identidad (>94%) con respecto

a las secuencias de referencia de diferentes países (EEUU, Escocia, China, Siria,

Alemania), mientras que el aislamiento de referencia más distante correspondió al obtenido

de Vltava (República Checa) (AJ863510), que en ningún caso compartió niveles superiores

al 87%. El virus Carnation latent virus (CLV), virus tipo del género Carlavirus utilizado

como grupo externo en el análisis, tan sólo presentó niveles de identidad cercanos al 46%

con respecto a las cepas de PVS (Tabla 17).

116

Figura 22. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF y PVSR (629 pb) a partir de tejido foliar de

plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: P3 Pasto-La Victoria, 3:P4

Pasto-La Victoria, 4: P4 2 Pasto-La Victoria, 5: PEF Sta Bárbara, 6: IPesp Ipiales-Saguarán, 7: IP4 Ipiales-

Suras, 8: Control negativo.


variables pero no informativas y 169 informativas para el método de máxima parsimonia.

El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,74, Índice de Retención (RI)

de 0,86 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,26 y separó las cepas de PVS en dos clados

principales (I, II) fuertemente soportados por valores de bootstrap (98 y 99%). El grupo I

incluyó 12 cepas de PVS obtenidas en este estudio de cultivos de papa de Antioquia,

Cundinamarca y Nariño, además de una cepa de referencia de Vltava (PVS raza A). Sin

embargo, al interior de este clado, se presentaron dos subgrupos fuertemente soportados por

valores de Bootstrap superiores al 99% y con un alto número de cambios entre ellos, que se

manifiestan en porcentajes de identidad inferiores al 80% entre las secuencias de sus

integrantes. En el clado II, se agruparon las secuencias de tres aislamientos de PVS

procedentes de la sabana Cundiboyacense (57MY, 58MY y 65MY) con 11 aislamientos de

117

referencia obtenidos del GenBank, siendo evidente un menor nivel de variabilidad al

interior de este grupo, pues todos los integrantes compartieron porcentajes de identidad en

la secuencia estudiada superiores al 93% (Figura 23).

118

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0,7

86

0,4

25

56

MY

0,9

41

0,9

39

0,9

39

ID0,8

09

0,8

02

0,9

31

0,9

50,9

60,8

42

0,7

86

0,8

04

0,7

86

0,7

82

0,7

84

0,8

07

0,8

07

0,7

98

0,7

98

0,7

92

0,7

92

0,7

90,7

84

0,7

86

0,7

88

0,7

63

0,7

92

0,4

39

57

MY

0,7

94

0,7

96

0,7

98

0,8

09

ID0,9

93

0,7

95

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05

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15

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57

0,7

57

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69

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73

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75

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68

0,9

68

0,9

43

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39

0,9

58

0,9

60,9

60,9

54

0,9

52

0,9

52

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78

0,9

33

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62

58

MY

0,7

88

0,7

90,7

92

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02

0,9

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ID0,7

88

0,7

99

0,8

09

0,7

51

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55

0,9

95

0,7

67

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71

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73

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70,9

70,9

46

0,9

41

0,9

60,9

62

0,9

62

0,9

56

0,9

54

0,9

54

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73

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35

0,4

6

59

MY

0,9

46

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39

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42

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31

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95

0,7

88

ID0,9

50,9

62

0,8

53

0,7

90,7

90,7

95

0,7

86

0,7

88

0,7

95

0,7

95

0,7

90,7

88

0,7

86

0,7

86

0,7

84

0,7

72

0,7

80,7

82

0,7

66

0,7

90,4

27

61

MY

0,9

64

0,9

58

0,9

38

0,9

50,8

05

0,7

99

0,9

5ID

0,9

87

0,8

47

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78

0,8

01

0,7

87

0,7

78

0,7

80,7

99

0,7

99

0,7

95

0,7

91

0,7

87

0,7

89

0,7

87

0,7

80,7

83

0,7

85

0,7

62

0,7

85

0,4

29

62

MY

0,9

77

0,9

70,9

50,9

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15

0,8

09

0,9

62

0,9

87

ID0,8

59

0,7

90,8

11

0,7

98

0,7

90,7

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0,8

09

0,8

09

0,8

04

0,8

0,7

98

0,7

98

0,7

96

0,7

90,7

92

0,7

94

0,7

73

0,7

96

0,4

35

63

MY

0,8

40,8

34

0,8

57

0,8

42

0,7

57

0,7

51

0,8

53

0,8

47

0,8

59

ID0,8

65

0,7

53

0,8

59

0,8

48

0,8

50,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

57

0,7

63

0,7

53

0,7

53

0,7

45

0,7

53

0,7

51

0,7

82

0,7

63

0,4

1

64

MY

0,7

71

0,7

69

0,7

88

0,7

86

0,7

57

0,7

55

0,7

90,7

78

0,7

90,8

65

ID0,7

55

0,9

37

0,9

35

0,9

39

0,7

67

0,7

67

0,7

65

0,7

67

0,7

67

0,7

55

0,7

55

0,7

51

0,7

55

0,7

53

0,8

34

0,7

65

0,4

17

65

MY

0,7

90,7

92

0,7

94

0,8

04

0,9

93

0,9

95

0,7

90,8

01

0,8

11

0,7

53

0,7

55

ID0,7

67

0,7

71

0,7

73

0,9

73

0,9

73

0,9

46

0,9

43

0,9

60,9

64

0,9

64

0,9

58

0,9

56

0,9

56

0,7

78

0,9

35

0,4

6

66

MY

0,7

84

0,7

82

0,7

94

0,7

86

0,7

69

0,7

67

0,7

95

0,7

87

0,7

98

0,8

59

0,9

37

0,7

67

ID0,9

58

0,9

62

0,7

75

0,7

75

0,7

75

0,7

82

0,7

78

0,7

67

0,7

67

0,7

63

0,7

67

0,7

65

0,8

52

0,7

82

0,4

21

67

MY

0,7

69

0,7

71

0,7

92

0,7

82

0,7

73

0,7

71

0,7

86

0,7

78

0,7

90,8

48

0,9

35

0,7

71

0,9

58

ID0,9

95

0,7

80,7

80,7

80,7

82

0,7

80,7

71

0,7

71

0,7

67

0,7

71

0,7

69

0,8

65

0,7

86

0,4

21

68

MY

0,7

71

0,7

73

0,7

92

0,7

84

0,7

75

0,7

73

0,7

88

0,7

80,7

92

0,8

50,9

39

0,7

73

0,9

62

0,9

95

ID0,7

82

0,7

82

0,7

82

0,7

84

0,7

82

0,7

73

0,7

73

0,7

69

0,7

73

0,7

71

0,8

67

0,7

88

0,4

25

Sco

10,7

88

0,7

86

0,7

96

0,8

07

0,9

68

0,9

70,7

95

0,7

99

0,8

09

0,7

66

0,7

67

0,9

73

0,7

75

0,7

80,7

82

ID1

0,9

56

0,9

62

0,9

64

0,9

73

0,9

73

0,9

58

0,9

64

0,9

64

0,7

88

0,9

50,4

58

Sco

20,7

88

0,7

86

0,7

96

0,8

07

0,9

68

0,9

70,7

95

0,7

99

0,8

09

0,7

66

0,7

67

0,9

73

0,7

75

0,7

80,7

82

1ID

0,9

56

0,9

62

0,9

64

0,9

73

0,9

73

0,9

58

0,9

64

0,9

64

0,7

88

0,9

50,4

58

Ch

10,7

86

0,7

84

0,7

92

0,7

98

0,9

43

0,9

46

0,7

90,7

95

0,8

04

0,7

66

0,7

65

0,9

46

0,7

75

0,7

80,7

82

0,9

56

0,9

56

ID0,9

43

0,9

52

0,9

48

0,9

52

0,9

35

0,9

48

0,9

43

0,7

98

0,9

35

0,4

45

Ger 1

0,7

82

0,7

84

0,7

86

0,7

98

0,9

39

0,9

41

0,7

88

0,7

91

0,8

0,7

57

0,7

67

0,9

43

0,7

82

0,7

82

0,7

84

0,9

62

0,9

62

0,9

43

ID0,9

43

0,9

48

0,9

52

0,9

31

0,9

43

0,9

43

0,7

88

0,9

41

0,4

45

Sco

30,7

78

0,7

80,7

82

0,7

92

0,9

58

0,9

60,7

86

0,7

87

0,7

98

0,7

63

0,7

67

0,9

60,7

78

0,7

80,7

82

0,9

64

0,9

64

0,9

52

0,9

43

ID0,9

58

0,9

58

0,9

41

0,9

50,9

50,7

86

0,9

37

0,4

45

US

A 1

0,7

78

0,7

80,7

82

0,7

92

0,9

60,9

62

0,7

86

0,7

89

0,7

98

0,7

53

0,7

55

0,9

64

0,7

67

0,7

71

0,7

73

0,9

73

0,9

73

0,9

48

0,9

48

0,9

58

ID0,9

95

0,9

50,9

87

0,9

91

0,7

75

0,9

41

0,4

51

Sy

ria0,7

75

0,7

78

0,7

82

0,7

90,9

60,9

62

0,7

84

0,7

87

0,7

96

0,7

53

0,7

55

0,9

64

0,7

67

0,7

71

0,7

73

0,9

73

0,9

73

0,9

52

0,9

52

0,9

58

0,9

95

ID0,9

50,9

91

0,9

91

0,7

80,9

46

0,4

56

US

A 2

0,7

69

0,7

71

0,7

75

0,7

84

0,9

54

0,9

56

0,7

72

0,7

80,7

90,7

45

0,7

51

0,9

58

0,7

63

0,7

67

0,7

69

0,9

58

0,9

58

0,9

35

0,9

31

0,9

41

0,9

50,9

5ID

0,9

46

0,9

46

0,7

73

0,9

21

0,4

56

US

A 3

0,7

71

0,7

73

0,7

80,7

86

0,9

52

0,9

54

0,7

80,7

83

0,7

92

0,7

53

0,7

55

0,9

56

0,7

67

0,7

71

0,7

73

0,9

64

0,9

64

0,9

48

0,9

43

0,9

50,9

87

0,9

91

0,9

46

ID0,9

91

0,7

80,9

37

0,4

53

US

A 4

0,7

73

0,7

75

0,7

78

0,7

88

0,9

52

0,9

54

0,7

82

0,7

85

0,7

94

0,7

51

0,7

53

0,9

56

0,7

65

0,7

69

0,7

71

0,9

64

0,9

64

0,9

43

0,9

43

0,9

50,9

91

0,9

91

0,9

46

0,9

91

ID0,7

78

0,9

37

0,4

56

Ger 2

0,7

57

0,7

57

0,7

73

0,7

63

0,7

78

0,7

73

0,7

66

0,7

62

0,7

73

0,7

82

0,8

34

0,7

78

0,8

52

0,8

65

0,8

67

0,7

88

0,7

88

0,7

98

0,7

88

0,7

86

0,7

75

0,7

80,7

73

0,7

80,7

78

ID0,7

82

0,4

35

Ch

20,7

78

0,7

80,7

86

0,7

92

0,9

33

0,9

35

0,7

90,7

85

0,7

96

0,7

63

0,7

65

0,9

35

0,7

82

0,7

86

0,7

88

0,9

50,9

50,9

35

0,9

41

0,9

37

0,9

41

0,9

46

0,9

21

0,9

37

0,9

37

0,7

82

ID0,4

6

CL

V-

Irela

nd

0,4

33

0,4

31

0,4

25

0,4

39

0,4

62

0,4

60,4

27

0,4

29

0,4

35

0,4

10,4

17

0,4

60,4

21

0,4

21

0,4

25

0,4

58

0,4

58

0,4

45

0,4

45

0,4

45

0,4

51

0,4

56

0,4

56

0,4

53

0,4

56

0,4

35

0,4

6ID

Sco

1: G

U144327.1

; Sco

2: G

U144325.1

; Ch

1: A

J889246.1

; Ger 1

: Y15625.1

; Sco

3: G

U144330.1

; US

A: F

J813512.1

; Sy

ria: A

B364946.1

; US

A 1

: S45593.1

; US

A 3

: FJ8

13514.1

; US

A 4

: FJ8

13513.1

; Ger 2

: AJ8

63510.1

; Ch

2: A

Y687337.1

; CL

V- Ire

lan

d: X

52627.1

Tab

la 1

7. M

atriz de id

entid

ad p

ara cepas d

el viru

s PV

S en

cultiv

os d

e pap

a de C

olo

mbia y

el Mun

do.

119

Figura 23. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVS

obtenidos de cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción



120

5.5.4. Afinidades filogenéticas de aislamientos PLRV

Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PLRVF y PLRVR generaron los amplicones del


y 14 secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PLRV de diferentes

orígenes geográficos, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al

97%. Estos valores se presentaron tanto entre cepas obtenidas de cultivos de papa de los

cuatro departamentos colombianos evaluados, como con respecto a las cepas de referencia

utilizadas. El virus Cereal yelow dwarf virus (CYDV), un polerovirus utilizado como grupo

externo en el análisis, presentó niveles de identidad cercanos al 77% con respecto a las

cepas de PLRV incluidas en el estudio (Tabla 18).

Figura 24. Amplicones obtenidos con los cebadores PLRVF y PLRVR (330 pb) a partir de tejido foliar de

plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: V2 Villapinzón, 3:V7

Villapinzón, 4: V8 Villapinzón, 5: Z3 Zipaquirá, 6: O4 Madrid, 7: O6 Madrid, 8: Control negativo.

121




0,83 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,12 y agrupó en un sólo clado (100% bootstrap)

todas las cepas de PLRV, incluyendo las obtenidas en este estudio y aquellas de referencia,

no presentándose ningún subgrupo interno soportado con altos valores de bootstrap (Figura

25).

122

PLRV

1BM

1C2B

M2C

3BM

4BM

4C5B

M5C

6BM

6C7B

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0,7710,774

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India: AF539791.1; C

an: D13954.1; S.K

or: U73777.1; C

zcheRep: EU

313202.2; Fran 1: AF453394.1; N

eth: X77322.1; C

h 1: FJ859021.1; Ch 2: FJ859015.1; C

h 3: EF063711.1; Fran 2: OP- A

F453389.1; Fran 3: Zim

13- AF453388.1; Fran 4: C

U87- A

F453393.1; Fran 5: FR1- A

F453391.1;

Fran 6: NO

IR- A

F453390.1; CY

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123

Figura 25. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PLRV




124

5.5.5. Afinidades filogenéticas de aislamientos PVX.

Las pruebas de RT-PCR con los cebadores PVXF y PVXR produjeron los amplicones del


procedentes de cultivos de papa de Colombia y 20 secuencias de referencia obtenidas del

GenBank de cepas de PVX representando diferentes razas de este virus y orígenes

geográficos diferentes, indicó niveles de identidad para la región estudiada superiores al

76%; presentándose un grupo de 11 cepas que compartieron niveles de identidad superiores

a 94% entre ellas y con el conjunto principal de las cepas de referencia utilizadas en el

análisis. Las otras cepas colombianas (29BM, 23Col, 53MY), presentaron identidades

menores con respecto al grupo principal, variando desde 86% al 77%, destacándose que las

cepas 23Col y 53MY no compartieron niveles superiores al 80% con ninguno de los otros

aislamientos analizados. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como

grupo externo (Cymbidium mosaic virus, CyMV) con relación a las cepas de PVX fue

inferior al 48% (Tabla 19).


variables pero no informativas y 181 informativas para el método de máxima parsimonia.

El dendrograma presentó un Índice de Consistencia (CI) de 0,73, Índice de Retención (RI)

de 0,72 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,27 y separó las cepas de PVX bajo análisis en

tres clados (I, II, III) fuertemente soportados por valores de bootstrap superiores al 92%,

siendo el grupo I mayoritario al contener 11 cepas de Colombia y 18 de referencia, mientras

que el clado II tan sólo contiene dos cepas (23Col y 53MY), al igual que el clado III, que

125

incluye dos cepas de referencia del Reino Unido. Adicionalmente, dentro del clado I, se

presentó el aislamiento 29BM como un cluster individual, pero no soportado por el análisis

de bootstrap (Figura 27).

Figura 26. Amplicones obtenidos con los cebadores PVXF y PVXR (562 pb) a partir de tejido foliar de

plantas de papa de cuatro departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 9: AVOP Carmen de Viboral, 10:

MRijk Santuario, 11: P Carmen de Viboral, 12: Control negativo.

126

PV

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74

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Tab

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127

Figura 27. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PVX




128

5.5.6. Afinidades filogenéticas de aislamientos PMTV

Las pruebas de RT-PCR para el virus PMTV se realizaron con dos pares de cebadores:

PMTVF4 y PMTVR4 que produjeron los amplicones del tamaño esperado de ~417 pb

(Figura 28) y H360 y C819 que a su vez produjeron los amplicones del tamaño esperado de

~460 pb (Figura 30). El análisis para el primer par de cebadores se hizo empleando tres

secuencias de este virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una

secuencia obtenida por inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba

y siete secuencias de referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando

diferentes orígenes geográficos. Los resultados indicaron niveles de identidad para la región

TGB2 superiores al 97% entre los aislamientos colombianos; siendo la excepción la cepa

70MY, que presentó niveles superiores al 86% con respecto a las cepas Colombianas y a las

de referencia. El nivel de identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo

externo Beet soil-borne virus (BSBV) con relación a las demás cepas fue inferior al 67%

(Tabla 20).




0,82 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,03 y agrupó las cepas de PMTV en estudio con

las de referencia en un clado fuertemente soportado por un bootstrap de 100%. Dentro de

este clado se ubicaron dos cluster soportados por valores de boostrap superiores al 70%,

donde el primero agrupó el aislamiento correspondiente al post-ELISA del kit Bioreba con

cepas de Suecia y Reino Unido, mientras que el segundo agrupó dos de las cepas

129

Colombianas (66MR y 67MR) con cepas de Dinamarca y República Checa. Por otro lado,

la cepa 70MY se localizó por fuera del clado como un cluster individual, no soportado por

el análisis bootstrap (Figura 29).

Figura 28. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 y PMTVR4 (417 pb) a partir de tejido de raíz

de N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La

Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control

negativo.

130

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74

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do.

131

Figura 29. Árbol filogenético basado en secuencias parciales del TGB2 viral para aislamientos de PMTV

obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción



132

Para el segundo par de cebadores, el análisis se realizó empleando cuatro secuencias de éste

virus procedentes de cultivos de papa de Colombia, junto con una secuencia obtenida por

inmuno-captura post-ELISA del control positivo del kit de Bioreba y 15 secuencias de

referencia obtenidas del GenBank de cepas de PMTV representando diferentes orígenes

geográficos. Dicho análisis indicó niveles de identidad para la región CP superiores al 98%;

con excepción de los aislamientos 71MY y 72MY, los cuales presentaron niveles

superiores al 76% respecto a las otras cepas Colombianas y a las de referencia. El nivel de

identidad de la secuencia de referencia utilizada como grupo externo Beet soil-borne virus

(BSBV) con relación a las demás cepas, fue inferior al 59% (Tabla 21).

Figura 30. Amplicones obtenidos con los cebadores H360 y C819 (460 pb) a partir de tejido de raíz de N.

benthamiana de tres departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4:

RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10, 7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.

133

PM

TV

11

ME

D7

0M

R7

1M

R7

1M

Y7

2M

YF

in 1

Fin

2F

in 3

Fin

4F

in 5

Can

CzR

1S

wD

en

1T

hai

Den

2J

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Pol

CzR

2

Den

3

BS

BV

-

Ch

ina

11

ME

DID

0,9

85

0,9

90,7

63

0,7

66

11

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

11

0,9

92

10,9

95

0,9

97

10,5

91

70

MR

0,9

85

ID0,9

95

0,7

56

0,7

58

0,9

85

0,9

85

0,9

87

0,9

87

0,9

87

0,9

87

0,9

87

0,9

87

0,9

90,9

80,9

82

0,9

80,9

85

0,9

87

0,9

90,5

96

71

MR

0,9

90,9

95

ID0,7

61

0,7

63

0,9

90,9

90,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

90,9

90,9

87

0,9

90,9

90,9

92

0,9

90,5

96

71

MY

0,7

63

0,7

56

0,7

61

ID0,9

92

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

63

0,7

60,7

60,7

61

0,7

60,7

61

0,7

63

0,7

60,5

91

72

MY

0,7

66

0,7

58

0,7

63

0,9

92

ID0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

66

0,7

60,7

60,7

63

0,7

70,7

63

0,7

66

0,7

60,5

91

Fin

11

0,9

85

0,9

90,7

63

0,7

66

ID1

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

11

0,9

92

10,9

95

0,9

97

10,5

91

Fin

21

0,9

85

0,9

90,7

63

0,7

66

1ID

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

11

0,9

92

10,9

95

0,9

97

10,5

91

Fin

30,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

ID1

11

11

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

Fin

40,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

1ID

11

11

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

Fin

50,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

11

ID1

11

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

Can

0,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

11

1ID

11

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

CzR

10,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

11

11

ID1

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

Sw

0,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

11

11

1ID

10,9

90,9

95

10,9

97

11

0,5

91

Den

10,9

95

0,9

85

0,9

90,7

61

0,7

63

0,9

95

0,9

95

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

ID0,9

90,9

92

0,9

90,9

95

0,9

97

10,5

93

Th

ai

0,9

95

0,9

80,9

85

0,7

58

0,7

61

0,9

95

0,9

95

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

92

0,9

9ID

0,9

87

0,9

90,9

90,9

92

0,9

90,5

86

Den

20,9

92

0,9

82

0,9

87

0,7

61

0,7

63

0,9

92

0,9

92

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

90,9

9ID

0,9

90,9

92

0,9

95

0,9

90,5

91

Jap

0,9

97

0,9

82

0,9

87

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

95

0,9

90,9

90,9

9ID

0,9

92

0,9

95

0,9

90,5

91

Pol

0,9

95

0,9

85

0,9

90,7

61

0,7

63

0,9

95

0,9

95

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

10,9

90,9

92

0,9

9ID

0,9

97

10,5

88

CzR

20,9

97

0,9

87

0,9

92

0,7

63

0,7

66

0,9

97

0,9

97

11

11

11

10,9

90,9

95

10,9

97

ID1

0,5

91

Den

30,9

95

0,9

85

0,9

90,7

61

0,7

63

0,9

95

0,9

95

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

0,9

97

10,9

90,9

92

0,9

90,9

95

0,9

97

ID0,5

88

BS

BV

-

Ch

ina

0,5

91

0,5

96

0,5

96

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

91

0,5

90,5

90,5

91

0,5

90,5

88

0,5

91

0,5

9ID

Fin

1: A

M503617.2

; Fin

2: A

M503631.1

; Fin

3: A

M503632.1

; Fin

4: A

M503626.1

; Fin

lad

5: A

M503623.1

; Can

: AY

327117.1

; CzR

1: D

Q102381.1

; Sw

: AJ2

43719.1

;

Den

1: A

F487407.4

; Th

ai: E

U016676.1

; Den

2: A

Y196094.2

; Jap

: D16193.1

; Po

l: GQ

503252.1

; CzR

: AF

393507.1

; Den

3: A

F487408.2

; BS

BV

- Ch

ina: E

F545141.1

Tab

la 2

1. M

atriz de id

entid

ad p

ara cepas d

el viru

s PM

TV

(CP

) de C

olo

mb

ia y el M

un

do.

134




0,98 y un Índice de Homoplasia (HI) de 0,01 y agrupó las cepas de PMTV en estudio en

dos clados (I y II) furtemente soportados por valores de bootstrap del 100%. En el primer

clado (I) se agruparon las cepas 70MR y 71MR junto con todas las cepas de referencia,

mientras que en el segundo clado (II) se agruparon las cepas Colombianas 71MY y 72MY

procedentes del altiplando Cundiboyacense (Figura 31).

135

Figura 31. Árbol filogenético basado en secuencias parciales de la cápside viral para aislamientos de PMTV

obtenidos cultivos de papa de Colombia y el Mundo. Método de máxima parsimonia utilizando la opción



136

5.6. Secuencias parciales de los genomas virales

En la tabla 22 se describen los aislamientos y las regiones secuenciadas para la

caracterización parcial de los genomas de los virus estudiados en este trabajo.

Tabla 22. Aislamientos de los virus en estudio y secuencias parciales de sus genomas.

Muestra Codigos

secuencias Vereda Municipio Departamento Virus

Región

secuenciada

Ceja

38MY, 40MY,

42MY, 44MY,

46MY, 48 MY

La Lomita La Ceja Antioquia PVY 5' UTR, P1, CP, 3'

UTR

Carmen

39MY, 41MY,

45MY, 47MY,

49MY,

Aldana Abajo Carmen de

Viboral Antioquia PVY

5' UTR, P1, CP, 3'

UTR

Ceja 59MR, 62MR,

64MR La Lomita La Ceja Antioquia PVX

RdRp parcial al 3',

TGB1 parcial 5',

TGB3 parcial 3', CP

Carmen

58MR, 60MR,

61MR, 63MR,

65MR

Aldana Abajo Carmen de

Viboral Antioquia PVX

5' UTR, RdRp

parcial al 5' y 3', CP,

TGB 1 parcial al 5',

TGB3 parcial al 3'

Carmen 67MY Aldana Abajo Carmen de

Viboral Antioquia PVS CP, 3' UTR

Santuario 68MY Valle de María Santuario Antioquia PVS CP, 3' UTR

Ip4 11-15 87MY Suras Ipiales Nariño PLRV CP parcial

TV2 11-15 20FB Siguineque Turmequé Boyacá PLRV CP parcial

P4AV 90MY, 94MY Obonuco Pasto Nariño PYVV CP, CPm

Ip1AV 92MY, 96MY Saguarán Ipiales Nariño PYVV CP, CPm

R25

70MR, 78MR,

84MR, 81MY,

66MR, 68MR,

82MY

La Cabaña La Unión Antioquia PMTV

CP, CPRT, TGB1

parcial, TGB2,

TGB3, CRP

Rvalle

71MR, 85MY,

67MR, 69MR,

83MY

Vallejuelito La Unión Antioquia PMTV

CP parcial, CPRT

parcial, TGB1

parcial, TGB2,

TGB3 parcial, CRP

5.6.1. Secuencias parciales del genoma de PMTV

Para la amplificación de algunas regiones del genoma del virus PMTV, se tomaron dos

aislamientos del municipio de La Unión, (Antioquia) (Tabla 22) y se realizaron las

137

reacciones de RT-PCR como se indicó en la metodología, empleándose para ello los

cebadores dirigidos al ARN2 (CP) C810 - H360 (Figura 30), H360 – PMTV2017R (Figura

32), PMTV759F – PMTV1552R (Figura 33), PMTV1948F – 123end (Figura 34) y los

cebadores dirigidos al ARN3 (TGB) PMTVF4 – PMTVR4 (Figura 28), PMTV5 USA

RNA3 – PMTV7 USA RNA3 (Figura 35) y PMTVF4 – 123end (Figura 33). Los cebadores

dirigidos al ARN 1 (RdRP) FURO-Hel – 123end, no fueron exitosos para las cepas

evaluadas en este estudio, ya que las secuencias de los amplicones obtenidos de ~2800 pb y

de ~350 pb, no estuvieron relacionadas con el genoma de PMTV o correspondian a una

región ya secuenciada de TGB, respectivamente (Figura 34). Cabe resaltar que a partir de la

secuencia obtenida con la combinación de cebadores H360 – PMTV2017R se realizó el

diseño de los cebadores PMTV759F – PMTV1552R, utilizados en las pruebas de qRT-

PCR.

138

Figura 32. Amplicón obtenido con los cebadores H360 y PMTV2017R (2000 pb) a partir de tejido de raíz de

N. benthamiana de dos departamentos de Colombia. 1: Marcador 100pb, 5: Control negativo, 6: RValle La

Unión, 7: R36 La Unión, 8: R25 dilución.

Figura 33. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTVF4 – 123end (1067 pb) (carriles 2 a 4) y

PMTV759 – PMTV1552R (817 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en

sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:

Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.

139

Figura 34. Amplicónes obtenidos con los cebadores Furo-Hel – 123end (2722 pb) (carriles 2 a 4) y

PMTV1948F – 123end (448 pb) (carriles 5 a 7), a partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrado en

sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador 100pb, 2: R25 La Unión Ant, 3: RValle La Unión Ant, 4:

Control negativo, 5: R25 La Unión Ant, 6: RValle La Unión Ant, 7: Control negativo.

Figura 35. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV5 USA RNA3 y PMTV7 USA RNA3 (647 pb) a

partir de tejido de raíz de N. benthamiana sembrada en sustrato infestado con S. subterranea. 1: Marcador

100pb, 2: R25 La Unión, 3: R36 La Unión, 4: RValle La Unión, 5: R25 dilución 1/10, 6: R36 dilución 1/10,

7: RValle dilución 1/10, 8: Control negativo.

140

El ensamblaje de las secuencias para cada ARN obtenido, se realizó con relación a los

genomas completos de PMTV de diferentes orígenes geográficos. Así, para el aislamiento

R25 se encontraron identidades superiores al 98% en la secuencia de nucleótidos para el

fragmento de CP (ARN2) hacia el extremo 5‟ (Figura 36), e identidades del 99% cuando se

empleó la secuencia de aminoácidos (Tabla 23). Para el fragmento de CP hacia el extremo

3‟ y con respecto al genoma de referencia (NC 003724), se encontraron identidades

superiores al 97% para nucleótidos y de 95% cuando se usaron aminoácidos en las

comparaciones (Tabla 24).


región CP secuenciada para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Tabla 24. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del segundo fragmento de la

región CP secuenciado para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP

AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden ID

NC_003724.1 PMTV Sweden 1,00 ID

AM503633.1 PMTVCP Finland 0,99 0,99 ID

DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID 0,99

R25 PMTVCP 0,99 0,99 0,98 0,99 ID

Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP




DQ102381.1 PMTVCP Czech R 1,00 1,00 0,99 ID

R25 PMTVCP 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP





R25 PMTVCP 0,98 0,98 0,97 0,98 ID

Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw SwedenNC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R R25 PMTVCP





R25 PMTVCP 0,97 0,97 0,95 0,97 ID

141

Figura 36. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa R25 de PMTV

respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para R25, uno cercano al

extremo 5‟ (707884MRPMTVCP 384-1836) y el segundo cercano al extremo 3‟ (78MR81MYPMTVCP

1853-2959).

707884M

RPM

TV

CP: 3

84 »

1836

78M

R81M

YPM

TV

CP: 1

853 »

2959

NC

_003724.1

Pota

tom

op-to

pviru

sR

NA

3: 1

» 3

138

1500

1000

1500

2000

2500

3000

gi 2

0373119 re

f NC 0

03724.1

3134 bp

CP

RT

CP

142

Para la misma cepa, las secuencias obtenidas para la región TGB (ARN3) se compararon

con cinco secuencias completas del GenBank, presentándose indentidades superiores al

97% con respecto a los genomas de referencia en nucleótidos y del 94% para aminoácidos

(Tabla 25). La secuencia comparada corresponde a un fragmento parcial de TGB1, TGB2,

TGB3 y CRP (Figura 37).

Tabla 25. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento secuenciado

de la región TGB para la cepa R25 de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Para el caso de la región CP de la cepa RValle de PMTV, se obtuvieron dos fragmentos de

tamaños menores a los alcanzados para la cepa R25, que abarcaron además la región CPRT

hacia el centro del genoma (Figura 38). El análisis se hizó utilizando las mismas secuencias

genómicas de referencia que se emplearon para R25, e indicó para el primer fragmento

(CP), identidades del 99% en las secuencias de nucleótidos y 100% para aminoácidos

(Tabla 26). Para el segundo fragmento (CPRT) las identidades para las secuencias de

nucleótidos fueron del 98%, mientras que para aminoácidos estuvieron por encima del 97%

(Tabla 27).

Nucleótidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB

NC_003725.1 PMTVTGB Sweden ID

AY187010.1 PMTVTGB Denmark 0,97 ID

D30753.1 PMTVTGB UK 0,98 0,97 ID

DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic 0,97 1,00 0,97 ID

AJ277556.1 PMTVTGB Sweden 1,00 0,97 0,98 0,97 ID

R25 PMTVTGB 0,98 0,98 0,97 0,98 0,98 ID

Aminoácidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzRp AJ277556.1 PMTVTGB Sw R25 PMTVTGB



D30753.1 PMTVTGB UK 0,96 0,93 ID

DQ144451.1 PMTVTGB CzechRepublic 0,94 1,00 0,93 ID


R25 PMTVTGB 0,95 0,95 0,94 0,95 0,95 ID

143

Figura 37. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa R25de PMTV con

respecto a la secuencia de referencia NC 003725.

6668M

R82M

YPM

TV

TG

B: 1

426 »

2747

NC

_003725.1

PM

TV

TG

B: 1

» 2

966

1500

1000

1500

2000

2500

gi 2

0373121 re

f NC

003725.1

2964 bp

TG

Bp

1

TG

Bp

2

TG

Bp

3

CR

P

144


región CP secuenciado para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Tabla 27. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos del fragmento de la región

CPRT secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Para el análisis de la región TGB de la cepa RValle, se evaluaron además cinco cepas de

referencia que contenian la porción del genoma comprendida entre TGB1 parcial a CRP

(Figura 39). El análisis de dichas secuencias demostró identidades superiores al 97% para

nucleótidos y del 94% para aminoácidos (Tabla 28).

Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP





RValle PMTVCP 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP





RValle PMTVCP 1,00 1,00 1,00 1,00 ID

Nucleotidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP





RValle PMTVCP 0,98 0,98 0,98 0,98 ID

Aminoácidos AJ243719.1 PMTVCP Sw Sweden NC_003724.1 PMTV Sweden AM503633.1 PMTVCP Finland DQ102381.1 PMTVCP Czech R RValle PMTVCP





RValle PMTVCP 0,98 0,98 0,97 0,98 ID

145

Tabla 28. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región TGB

secuenciada para la cepa RValle de PMTV y otros aislamientos del mundo.

Nucleótidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB



D30753.1 PMTVTGB UK 0,98 0,97 ID

DQ144451.1 PMTVTGB Czech R 0,97 1,00 0,97 ID


RValle PMTVTGB 0,98 0,97 0,97 0,97 0,98 ID

Aminoácidos NC_003725.1 PMTVTGB Sw AY187010.1 PMTVTGB Den D30753.1 PMTVTGB UK DQ144451.1 PMTVTGB CzR AJ277556.1 PMTVTGB Sw RValle PMTVTGB



D30753.1 PMTVTGB UK 0,96 0,93 ID

DQ144451.1 PMTVTGB Czech R 0,96 1,00 0,93 ID


RValle PMTVTGB 0,96 0,95 0,94 0,95 0,96 ID

146

Figura 38. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de la cepa RValle de PMTV con

respecto a la secuencia de referencia NC 003724. Se observan dos fragmentos de CP para RValle, uno

cercano al extremo 5‟ (71MR 384-843) y el segundo cercano al extremo 3‟ (85MY 1081-1838).

gi 20373119 re

f NC 0

03724.1

3134 bp

CP

RT

CP

71M

R-H

360-C

819R

VA

LLE: 3

84 »

843

85M

YPM

TV

RV

ALLE: 1

081 »

1838

NC

_003724.1

Pota

tom

op-to

pviru

sR

NA

3: 1

» 3

134

1500

1000

1500

2000

2500

3000

147

Figura 39. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región TGB de la cepa RValle de PMTV

con respecto a la secuencia de referencia NC 003725.

gi 2

037

3121 ref N

C 00

372

5.1

2964 bp

TGB

p1

TGB

p2

TGB

p3

CR

P

6769MR

83MY

PMTV

TGB

RV

ALLE: 1416 » 2749

NC

_003725.1PMTV

TGB

: 1 » 2968

1500

10001500

20002500

148

5.6.2. Secuencias parciales del genoma de PVY

Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVY se utilizaron dos

aislamientos del departamento de Antioquia (Tabla 22), encontrándose secuencias de

óptima calidad para los amplicones obtenidos con las combinaciones de cebadores PVYc –

PVYd, PVYCPF – PVYCPR, PVYF – 3ntr, PVYF – 3ntrC (Figura 40), PVYCPF – 3ntr,

PVYCPF – 3 ntrC (Figura 41).

Figura 40. Amplicones obtenidos a partir de tejido foliar de papa de dos cepas de PVY del departamento de

Antioquia, con los cebadores PVYc – PVYd (967 pb) carriles 7 a 9; PVYCPF – PVYCPR (827 pb) carriles 10

a 12; PVYF – 3ntr (1061 pb) carriles 13 a 15; PVYF – 3ntrC (1061 pb) carriles 16 a 18. 1: Marcador 100pb,

7: Ceja, 8: Carmen, 9: Control negativo, 10: Ceja, 11: Carmen, 12: Control negativo, 13: Ceja, 14: Carmen,

15: Control negativo, 16: Ceja, 17: Carmen, 18: Control negativo.

149

Figura 41. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYCPF – 3ntr (1219 pb) carriles 5 a 7, PVYCPF –

3ntrC (1219 pb) carriles 8 a 10, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia.

1: Marcador 1Kb, 5: Ceja, 6: Carmen, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negativo.

El análisis de las secuencias ensambladas se realizó con cada una de las cepas

individualmente y con 11 genomas completos de PVY depositados en el GenBank. Así,

para la región P1 y parte del 5‟NTR de la cepa Ceja (Figura 42), se encontraron identidades

del 99% en nucleótidos con cepas de las razas PVY-N y PVY-NTN y superiores al 99%

para aminoácidos (Tabla 29). Para el mismo aislamiento se obtuvieron dos secuencias

diferentes de la región CP. En la primera secuencia se obtuvo además de la región CP, una

porción del extremo 3‟NTR (Figura 43), que compartió identidades superiores al 95% en

nucleótidos con cepas de las razas PVY-NTN y PVY-N de Europa, USA y Canada y

superiores al 97% en aminoácidos (Tabla 30). La otra secuencia de CP obtenida para dicho

aislamiento (Figura 44), compartió identidades superiores al 97% con cepas de las razas

PVY-N y PVY-NTN para nucleótidos y del 98% para aminoácidos (Tabla 31).

150


para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.

Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY

AF237963.2 PVYnnp Italy pepper ID

AF522296.1 PVYN Egypt 0,88 ID

AJ585195.1 PVY UK 0,89 0,95 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,70 0,71 0,71 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,90 0,96 0,95 0,72 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,70 0,71 0,71 0,99 0,71 ID

AJ889866.1 PVY NTN Poland 0,82 0,83 0,84 0,86 0,83 0,86 ID

AJ889867.1 PVYN-Wi Germany 0,82 0,83 0,85 0,86 0,83 0,86 0,98 ID

U09509.1 PVYC Canada 0,89 0,97 0,95 0,71 0,96 0,71 0,82 0,82 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,71 0,71 0,71 0,91 0,72 0,91 0,83 0,83 0,71 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 ID

Ceja PVY 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 0,99 ID

Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSA38MYPVY



AJ585195.1 PVY UK 0,88 0,94 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,68 0,68 0,69 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,88 0,94 0,95 0,69 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,68 0,68 0,69 0,99 0,68 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,87 0,95 0,93 0,68 0,93 0,68 0,81 0,81 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,67 0,67 0,67 0,89 0,67 0,88 0,79 0,79 0,66 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,69 0,68 0,70 1,00 0,69 0,99 0,84 0,85 0,68 0,89 ID

Ceja PVY 0,68 0,68 0,69 1,00 0,69 0,99 0,84 0,84 0,68 0,89 1,00 ID

151


para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.


para la cepa Ceja de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo




AJ585195.1 PVY UK 0,92 0,98 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,93 0,99 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,99 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,90 0,92 0,92 0,93 0,92 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,93 0,98 0,97 0,98 0,98 0,92 0,92 0,98 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,90 0,90 0,89 0,91 0,90 0,96 0,96 0,91 0,90 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,91 0,90 0,90 0,91 0,90 0,97 0,97 0,91 0,90 0,98 ID

Ceja PVY 0,90 0,91 0,91 0,91 0,91 0,95 0,95 0,91 0,91 0,96 0,96 ID

Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY



AJ585195.1 PVY UK 0,94 0,98 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,95 0,99 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,95 0,99 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,96 0,98 0,97 0,98 0,98 0,94 0,94 0,98 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,94 0,94 0,93 0,95 0,94 0,98 0,98 0,94 0,93 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 0,99 0,96 0,94 0,99 ID

Ceja PVY 0,94 0,95 0,94 0,95 0,95 0,97 0,97 0,95 0,94 0,97 0,98 ID




AJ585195.1 PVY UK 0,90 0,97 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,91 0,98 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,91 0,98 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,89 0,91 0,91 0,91 0,91 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,91 0,97 0,96 0,97 0,98 0,91 0,90 0,97 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,88 0,89 0,88 0,89 0,89 0,96 0,96 0,89 0,89 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,89 0,89 0,89 0,89 0,89 0,97 0,97 0,90 0,89 0,98 ID

Ceja PVY 0,89 0,91 0,90 0,91 0,91 0,99 0,99 0,91 0,90 0,96 0,97 ID

Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACeja PVY



AJ585195.1 PVY UK 0,93 0,97 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,94 0,98 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,98 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,93 0,94 0,93 0,94 0,93 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,95 0,98 0,96 0,97 0,97 0,93 0,92 0,97 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,91 0,93 0,92 0,93 0,92 0,98 0,98 0,93 0,91 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,93 0,94 0,93 0,94 0,93 0,99 0,99 0,94 0,93 0,99 ID

Ceja PVY 0,92 0,94 0,93 0,94 0,93 0,99 0,98 0,94 0,92 0,98 1,00 ID

152

Figura 42. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región P1 de PVY de la cepa Ceja respecto a

la secuencia de referencia AJ584851.1.

38MY

PVY

: 23 » 892

AJ584851.1PV

YstrainN

UK

: 1 » 9651

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

gi 209395183 gb FJ2

14726.1

9773 bp

P1

HC

-Pro

P3

6K

1C

I6

K2N

Ia-V

Pg

NIa

-Pro

NIb

CP

153

Figura 43. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto

a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.

42444648M

YPV

Y: 8

610 »

9658

AY

166867.1

PV

YN

Canada: 1

» 9

703

AY

884983.1

PV

YN

US

A: 1

» 9

703

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

gi 2

09395183 g

b F

J214726.1

9773

bp

P1

HC

-Pro

P3

6K

1C

I6

K2N

Ia-V

Pg

NIa

-Pro

NIb

CP

154

Figura 44. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Ceja respecto

a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.

40M

YPV

YC

P: 8

575 »

9310

AJ585342.1

PV

YN

TN

UK

: 1 »

9647

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

gi 2

09395183 g

b F

J214726.1

9773

bp

P1

HC

-Pro

P3

6K

1C

I6

K2N

Ia-V

Pg

NIa

-Pro

NIb

CP

155

Nucleotidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY



AJ585195.1 PVY UK 0,93 0,98 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,93 0,99 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,94 0,99 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,92 0,94 0,93 0,94 0,94 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,94 0,99 0,98 0,99 0,99 0,94 0,94 0,99 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,91 0,91 0,90 0,92 0,91 0,96 0,96 0,92 0,91 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,92 0,91 0,91 0,92 0,91 0,97 0,97 0,92 0,92 0,98 ID

Carmen PVY 0,92 0,94 0,93 0,94 0,94 0,99 0,99 0,94 0,94 0,96 0,97 ID

Aminoácidos AF237963.2PVYnnpItalyAF522296.1PVYNEgyptAJ585195.1PVYSASA110UKAJ584851.1PVYstrainNUKAJ585196.1PVYSCRIOUKAJ585342.1PVYNTNUKAJ889866.1PVYNTNPolandAJ889867.1PVYWilgaGermanyU09509.1PVYcommonCanadaAY166867.1PVYNCanadaAY884983.1PVYNUSACarmen PVY



AJ585195.1 PVY UK 0,95 0,99 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,96 0,99 0,99 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,96 0,99 0,99 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,96 0,96 0,95 0,97 0,96 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,97 1,00 0,98 0,99 0,99 0,96 0,96 0,99 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,94 0,95 0,94 0,95 0,94 0,98 0,98 0,95 0,94 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,96 0,96 0,95 0,97 0,96 0,99 0,99 0,96 0,96 0,99 ID

Carmen PVY 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,98 0,98 0,95 0,95 0,98 0,99 ID

El análisis de los ensambles para la cepa Carmen, mostró dos tipos de asociación con

secuencias de referencia para la región CP. La primera (CP y 3‟NTR) se dió con secuencias

de las razas PVY-NTN (Figura 45), presentando identidades del 99% para nucleótidos y del

98% en aminoácidos (Tabla 32). El segundo fragmento de CP al igual que el fragmento

correspondiente a la región P1 y 5‟NTR (Figura 46), se asoció con secuencias de referencia

de la raza PVY-N de USA y Canadá, con identidades para CP del 96% para nucleótidos y

del 97% cuando se evaluaron aminoácidos (Tabla 33). En el caso de la región genómica P1,

se encontraron identidades del 94% para nucleótidos con respecto a una cepa Canadiense

de PVY-N y del 93% para aminácidos (Tabla 34).


para la cepa Carmen de PVY y su comparación con otros aislamientos del mundo.

156








AJ585195.1 PVY UK 0,91 0,97 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,92 0,99 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,93 0,99 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,89 0,91 0,90 0,92 0,91 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,92 0,98 0,96 0,97 0,98 0,91 0,91 0,97 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,89 0,89 0,89 0,90 0,89 0,96 0,96 0,90 0,90 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,90 0,89 0,89 0,90 0,90 0,97 0,98 0,90 0,89 0,97 ID

Carmen PVY 0,90 0,90 0,90 0,91 0,91 0,96 0,96 0,91 0,91 0,96 0,96 ID




AJ585195.1 PVY UK 0,94 0,97 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,95 0,98 0,98 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,95 0,98 0,98 0,99 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,96 0,98 0,97 0,98 0,98 0,95 0,95 0,98 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,93 0,94 0,93 0,95 0,94 0,97 0,97 0,94 0,93 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,95 0,95 0,94 0,96 0,95 0,99 0,99 0,96 0,95 0,98 ID

Carmen PVY 0,94 0,95 0,94 0,95 0,95 0,97 0,97 0,95 0,94 0,97 0,98 ID




AJ585195.1 PVY UK 0,90 0,95 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,70 0,72 0,71 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,90 0,95 0,95 0,72 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,70 0,72 0,71 0,99 0,72 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,90 0,97 0,95 0,71 0,96 0,71 0,83 0,83 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,71 0,71 0,71 0,91 0,72 0,91 0,82 0,83 0,71 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,70 0,71 0,71 0,99 0,72 0,99 0,86 0,86 0,71 0,91 ID

Carmen PVY 0,72 0,72 0,71 0,92 0,73 0,91 0,82 0,82 0,72 0,94 0,91 ID




AJ585195.1 PVY UK 0,88 0,94 ID

AJ584851.1 PVYN UK 0,69 0,69 0,70 ID

AJ585196.1 PVYO UK 0,88 0,94 0,94 0,69 ID

AJ585342.1 PVYNTN UK 0,69 0,69 0,69 1,00 0,69 ID



U09509.1 PVYC Canada 0,87 0,94 0,93 0,69 0,93 0,68 0,82 0,82 ID

AY166867.1 PVYN Canada 0,68 0,67 0,68 0,89 0,68 0,88 0,78 0,78 0,67 ID

AY884983.1 PVYN USA 0,69 0,69 0,70 1,00 0,69 0,99 0,84 0,84 0,69 0,88 ID

Carmen PVY 0,69 0,67 0,68 0,90 0,68 0,90 0,78 0,79 0,67 0,93 0,90 ID

157

Figura 45. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de PVY de la cepa Carmen

respecto a la secuencia de referencia AJ585342.

gi 209

3951

83 gb FJ2

147

26.1

9773 bp

P1

HC

-Pro

P3

6K1

CI

6K2N

Ia-VP

g

NIa-P

roN

IbC

P

AJ585342.1PV

YN

TNU

K: 1 » 9647

454749MY

PVY

: 8738 » 9617

1500

10001500

20002500

30003500

40004500

50005500

60006500

70007500

80008500

90009500

158

Figura 46. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones CP y P1 de PVY de la cepa

Carmen respecto a las secuencias de referencia AY884983 y AY166867.

gi 209395183 gb FJ2

14726.1

9773 bp

P1

HC

-Pro

P3

6K

1C

I6

K2N

Ia-V

Pg

NIa

-Pro

NIb

CP

39MY

PVY

: 55 » 922

41MY

PVY

: 8617 » 9272

AY

166867.1PVY

NC

anada: 1 » 9704

AY

884983.1PVY

NU

SA

: 1 » 9704

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

159

5.6.3. Secuencias parciales del genoma de PVX

Para el estudio de las secuencias parciales del genoma de PVX se utilizaron dos cepas del

departamento de Antioquia (Tabla 22), realizándose las reacciones de RT-PCR con las

combinaciones de cebadores PVX1F – PVX1651R, PVX3130F – PVX4495R, PVX5476F -

PVX6415R y PVX5476F – PVXR (Figura 47).

Figura 47. Amplicones obtenidos con los cebadores PVX5476F-PVXR (749 pb) carriles 5 a 7, PVX1F-

PVX1651R (1651 pb) carriles 8 a 10, PVX3130-PVX4495 (1365 pb) carriles 11 a 13, PVX5476F-PVX6415R

(939 pb) carriles 14 a 16, a partir de tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1:

Marcador 100pb, 5: Carmen, 6: Ceja, 7: Control negativo, 8: Ceja, 9: Carmen, 10: Control negaativo, 11:

Ceja, 12: Carmen, 13: Control negativo, 14: Ceja, 15: Carmen, 16: Control negativo.

Las secuencias ensambladas se contextualizaron respecto a la secuencia de referencia

EU021215. De la cepa Ceja se obtuvieron dos fragmentos, los cuales correspondieron al

extremo 3‟ de la región que codifica para RdRp y TGB3-CP parcial hacia el extremo 5‟

(Figura 48). El análisis de las secuencias, que empleó siete genomas de referencia, indicó

identidades superiores al 95% para nucleótidos y al 98% para aminoácidos para la región

160

RdRp (Tabla 35). El fragmento TGB3-CP, presentó identidades igualmente superiores al

95% para nucleótidos y del 100% para aminoácidos con respecto a cepas de PVX de China

y Taiwan (Tabla 36).

Tabla 35. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región RdRp secuenciada

para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.

Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX

EF423572.1 PVX China ID

M72416.1 PVX Russia 0,95 ID

M38480.1 PVX Russia 0,95 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,96 0,96 0,96 0,97 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,95 0,95 0,97 0,99 ID

AB056719.1 PVXbs Japan 0,95 0,95 0,95 0,97 0,97 0,97 ID

Ceja PVX 0,95 0,95 0,95 0,96 0,95 0,95 0,95 ID

Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX



M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

AB056719.1 PVXbs Japan 0,98 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Ceja PVX 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 ID

161

Tabla 36. Matriz de identidad de nucleótidos y aminoácidos de la región CP secuenciada

para la cepa Ceja de PVX y su comparación con otros aislamientos del mundo.

Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX



M38480.1 PVX Russia 0,96 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,97 0,96 0,96 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,96 0,96 0,98 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,97 0,96 0,96 0,97 0,98 ID

AB056719.1 PVXbs Japan 0,95 0,95 0,95 0,96 0,97 0,96 ID

Ceja PVX 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,95 ID

Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCeja PVX



M38480.1 PVX Russia 0,98 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,97 0,97 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 1,00 0,98 0,98 0,99 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,97 0,97 0,98 0,99 ID

AB056719.1 PVXbs Japan 0,98 0,96 0,96 0,97 0,98 0,97 ID

Ceja PVX 1,00 0,98 0,98 0,99 1,00 0,99 0,98 ID

162

6264M

R-P

VX

: 3185 »

4472

59M

R-P

VX

5476F-P

VX

R: 5

485 »

6226

EU

021215.1

PV

X: 1

» 6

436

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

gi 1

54816334 g

b E

U021215.1

64

35

bp

Rd

Rp

TG

B1

TG

B2 T

GB

3C

P

Figura 48. Contextualización de las secuencias obtenidas para una región parcial de RdRp y CP de la cepa

Ceja de PVX, respecto a la secuencia de referencia EU021215.

163

De la cepa Carmen de PVX, se obtuvieron tres fragmentos correspondientes al 5‟NTR-

RdRp parcial, RdRp parcial hacia el 3‟ y TGB3 parcial al 3‟-CP-3‟NTR (Figura 49). Para el

primer framento se encontraron identidades del 97% para nucleótidos con secuencias de

cepas de China y con una cepa de la raza PVX-bs de Japón, mientras que para la secuencia

de aminoácidos las identidades fueron superiores al 98% en todos los casos (Tabla 37).

Para el segundo fragmento de RdRp, las identidades correspondieron al 95% para

nucleótidos con excepción de las razas PVX-os y PVX-bs, las cuales fueron del 94%. Para

aminoácidos fue muy similar, siendo las identidades de 99% y 98%, respectivamente

(Tabla 38). Por último, el fragmento que correspondió al extremo 3‟ del genoma de PVX,

mostró identidades del 97% para nucleótidos con cepas de Rusia e Iran y del 100% para

aminoácidos (Tabla 39).

Tabla 37. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 5‟NTR-RdRp


mundo.

Nucleotidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX



M38480.1 PVX Russia 0,97 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,97 0,97 0,96 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,96 0,96 0,95 0,99 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 0,97 0,97 0,97 0,97 0,98 0,98 ID

Carmen PVX 0,97 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,97 ID

Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX



M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,98 0,99 1,00 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00 0,99 ID

Carmen PVX 0,99 0,99 0,98 0,99 0,99 0,98 0,99 ID

164

Tabla 38. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟ RdRp


mundo.

Tabla 39. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región 3‟TGB3-CP-

3‟NTR secuenciada para la cepa ¨Carmen¨ de PVX y su comparación con otros

aislamientos del mundo.




M38480.1 PVX Russia 0,95 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,96 0,96 0,96 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,96 0,96 0,96 0,97 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,95 0,95 0,97 0,99 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 0,95 0,95 0,95 0,97 0,97 0,97 ID

Carmen PVX 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,94 0,94 ID

Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX



M38480.1 PVX Russia 0,99 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,99 0,99 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 0,98 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Carmen PVX 0,99 0,99 0,99 0,99 0,98 0,98 0,98 ID




M38480.1 PVX Russia 0,96 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,97 0,96 0,96 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 0,97 0,96 0,96 0,98 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,96 0,96 0,96 0,97 0,98 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 0,95 0,95 0,95 0,96 0,97 0,96 ID

Carmen PVX 0,96 0,97 0,97 0,97 0,96 0,96 0,95 ID

Aminoácidos EF423572.1PVXChinaM72416.1PVXRussiaM38480.1PVXRussiaFJ461343.1PVXIranAF272736.2PVXTaiwanAB056718.1PVXosJapanAB056719.1PVXbsJapanCarmen PVX



M38480.1 PVX Russia 0,98 1,00 ID

FJ461343.1 PVX Iran 0,99 0,98 0,98 ID

AF272736.2 PVX Taiwan 1,00 0,98 0,98 0,99 ID

AB056718.1 PVX os Japan 0,99 0,98 0,98 0,99 0,99 ID

AB056719.1 PVX bs Japan 0,98 0,97 0,97 0,98 0,98 0,98 ID

Carmen PVX 1,00 0,98 0,98 0,99 1,00 0,99 0,98 ID

165

Figura 49. Contextualización de las secuencias obtenidas para las regiones 5‟NTR-5‟ RdRp parcial, 3‟RdRp

parcial y TGB3 parcial-CP-3‟NTR de la cepa ¨Carmen¨ de PVX, respecto a la secuencia de referencia

EU021215.

61M

R-P

VX

1F: 7

1 »

728

63M

R-P

VX

3130F-P

VX

4495R

: 3184 »

4480

58-6

0-6

5M

R: 5

491 »

6391

EU

021215.1

PV

X: 1

» 6

438

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

gi 1

54816334 g

b E

U021215.1

64

35 bp

Rd

Rp

TG

B1

TG

B2 T

GB

3C

P

166

5.6.4. Secuencias parciales del genoma de PVS

Para el estudio de secuencias parciales del genoma de PVS, se emplearon cebadores

dirigidos a la región CP PVSCPF-PVSCPR (Figura 50), para dos cepas del departamento

de Antioquia (Tabla 22) realizándose las reacciones de RT-PCR como se describió en la

metodología.

Figura 50. Amplicones obtenidos con los cebadores PVSCPF-PVSCPR (1288 pb) carriles 12 a 20, a partir de

tejido foliar de papa de dos cepas del departamento de Antioquia. 1: Marcador 1 Kb, 12: Control negativo, 13:

Vergel Sta Rosa de Osos, 14: Estación Berrio Sta Rosa de Osos, 15: El Roble Sta Rosa de Osos, 16: Sta Ana

Sta Rosa de Osos, 17: Buena Vista La Unión, 18: Vía Sonsón La Unión, 19: Valle de María Santuario, 20:

Valle de María Santuario2.

De las dos cepas estudiadas, se obtuvieron dos fragmentos de CP (Figura 51), cuyo análisis

indicó identidades para el primer fragmento de 86% y 87% para nucleótidos, en las cepas

de Carmen y Santuario, respectivamente. Para el caso de aminoácidos, ambas cepas

tuvieron identidades del 92% con respecto a un aislamiento del virus obtenido en Alemania

(Tabla 40). Para el segundo fragmento, que comprendió a CP-3‟NTR, las identidades

167

fueron del 90% para nucleótidos y de 97% para aminoácidos con la cepa de referencia

(Tabla 41).


para las cepas Carmen y Santuario de PVS y su comparación con otros aislamientos del

mundo.

Tabla 41. Matriz de identidad para nucleótidos y aminoácidos de la región CP-3‟NTR

secuenciada para las cepas Carmen y Santurio de PVS y su comparación con otros


Nucleotidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP

AJ863509.1 PVS Germany ID

AJ863510.1 PVS Germany 0,79 ID

FJ813512.1 PVS USA 0,96 0,79 ID

FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,79 0,99 ID

Carmen PVSCP 0,78 0,86 0,78 0,78 ID

Santuario PVSCP 0,78 0,87 0,78 0,78 1,00 ID

Aminoácidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP



FJ813512.1 PVS USA 0,96 0,85 ID

FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,85 0,99 ID

Carmen PVSCP 0,87 0,92 0,88 0,88 ID


Nucleotidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP



FJ813512.1 PVS USA 0,95 0,86 ID

FJ813513.1 PVS USA 0,96 0,86 0,98 ID

Carmen PVSCP 0,82 0,90 0,84 0,83 ID


Aminoácidos AJ863509.1PVSLeonaGermanyAJ863510.1PVSVltavaGermanyFJ813512.1PVSWaDefUSFJ813513.1PVSId4106USCarmen PVSCPSantuario PVSCP



FJ813512.1 PVS USA 0,98 0,99 ID

FJ813513.1 PVS USA 0,99 1,00 0,99 ID

Carmen PVSCP 0,96 0,97 0,96 0,97 ID


168

Figura 51. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP-3‟NTR de cepas Carmen y

Santuario de PVS, respecto a las secuencias de referencia AJ863510 y AJ863509.

68M

Y-P

VS

CPF: 7

162 »

7712

67M

Y-P

VS

CPF: 7

162 »

7754

67M

Y-P

VS

CPR

: 7801 »

8335

68M

Y-P

VS

CPR

: 7828 »

8335

AJ8

63509.1

PV

SLeonaG

erm

any: 1

» 8

480

AJ8

63510.1

PV

SV

ltavaG

erm

any: 1

» 8

480

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

gi 2

26359395 g

b FJ8

13513.1

8485 bp

Rd

Rp

25

kD

a

12

kD

a

7 k

Da C

P

11

kD

a

169

5.6.5. Secuencias parciales del genoma de PLRV

Para PLRV no se contó con cebadores que flanquearan otras regiones del genoma

diferentes a la usada para el análisis filogenético. Es por ello que sólo se contextualizaron

con respecto a un genoma de referencia (AF453388) dos de las secuencias obtenidas para la

región que codifica CP (Tabla 22) (Figura 52). Se emplearon siete genomas completos de

diferentes orígenes geográficos y razas del virus para el análisis de las secuencias,

mostrando identidades superiores al 98% para nucleótidos con las secuencias obtenidas. En

el caso de las identidades para aminoácidos, la cepa ¨Siguineque¨ tuvo identidades del 99%

con aislamientos de las razas PLRV-Noir, PLRV-CU87 y una cepa de Egipto, mientras que

la cepa ¨Suras¨ presentó identidades del 98% con respecto a dichos aislamientos (Tabla 42).

Tabla 42. Matriz de identidad para nucleótidos y aminácidos de la región parcial de CP

secuenciada para las cepas Siguineque y Suras de PLRV y su comparación con otros


Nucleótidos AF453388.1 PLRV Zim13 FranciaAF453389.1 PLRV OP SpainAF453390.1 PLRV Noir FranceAF453391.1 PLRV Fr1 FranceAF453392.1 PLRV CIP01 FranceAF453393.1 PLRV CU87 CubaAY138970.1 PLRV EgyptSiguineque PLRV Suras PLRV

AF453388.1 PLRV Zim13 Francia ID

AF453389.1 PLRV OP Spain 0,99 ID

AF453390.1 PLRV Noir France 0,99 0,99 ID

AF453391.1 PLRV Fr1 France 1,00 0,99 0,99 ID

AF453392.1 PLRV CIP01 France 0,99 0,99 0,99 0,98 ID

AF453393.1 PLRV CU87 Cuba 0,99 0,99 1,00 0,99 0,99 ID

AY138970.1 PLRV Egypt 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Siguineque PLRV 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 0,99 ID

Suras PLRV 0,98 0,98 0,99 0,98 0,98 0,99 0,98 0,99 ID

Aminoácidos AF453388.1 PLRV Zim13 FranciaAF453389.1 PLRV OP SpainAF453390.1 PLRV Noir FranceAF453391.1 PLRV Fr1 FranceAF453392.1 PLRV CIP01 FranceAF453393.1 PLRV CU87 CubaAY138970.1 PLRV EgyptSiguineque PLRV Suras PLRV

AF453388.1 PLRV Zim13 Francia ID

AF453389.1 PLRV OP Spain 0,98 ID

AF453390.1 PLRV Noir France 0,99 0,99 ID

AF453391.1 PLRV Fr1 France 0,99 0,97 0,98 ID

AF453392.1 PLRV CIP01 France 0,99 0,98 0,99 0,98 ID

AF453393.1 PLRV CU87 Cuba 0,99 0,99 1,00 0,98 0,99 ID

AY138970.1 PLRV Egypt 0,99 0,99 1,00 0,98 0,99 1,00 ID

Siguineque PLRV 0,98 0,98 0,99 0,97 0,98 0,99 0,99 ID

Suras PLRV 0,97 0,97 0,98 0,96 0,97 0,98 0,98 0,99 ID

170

Figura 52. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región parcial CP de las cepas de PLRV

Siguineque y Suras, respecto a la secuencia de referencia AF453388.

AF4

53388.1

PLR

Vstra

inZ

im13Fra

nce

5865 bp

P1

P2

P5

P3

-CP

P4

P6

P7

20FB

-PLR

V: 3

652 »

3978

87M

Y-P

LR

V: 3

653 »

3978

AF453388.1

PLR

Vstra

inZ

im13Fra

nce: 1

» 5

865

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

171

5.6.6. Secuencias parciales del genoma de PYVV

Del virus PYVV se eligieron dos cepas (Tabla 22) para estudiar otra región del genoma

diferente a la región de CP que se empleó en el análisis filogenético (Figura 54). Dicha

región correspondió a la codificante para CPm en el ARN3 y se emplearon para su

amplificación mediante RT-PCR los cebadores CPm1-CPm2, obteniendo los amplicones

del tamaño esperado (Figura 53).

Figura 53. Amplicones obtenidos con los cebadores CPm1-CPm2 (2025 pb), a partir de tejido foliar de papa

de dos cepas del departamento de Nariño. 1: Marcador 100, 2: Obonuco, 3: Saguarán, 4: Control negativo.

El análisis de las secuencias se realizó comparándolas con dos genomas completos del virus

obtenidos del Perú y depositados en el GenBank (NC_006063.1 y AJ557129.1), tanto para

la región CPm (Figura 54), como para CP (Figura 55). Dicho análisis mostró identidades

del 99% para la región de nucleótidos correspondiente al 5‟ de CPm de ambas secuencias

(Obonuco y Saguarán), mientras que para aminoácidos fue del 98% (Tabla 43). El segundo

172

segmento de CPm hacia el extremo 3‟, presentó identidades para nucleótidos y aminoácidos

superiores al 98% (Tabla 44).


extremo 5‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos cepas de PYVV

del Perú.

Nucleotidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán

AJ508757.2 PYVV CPm Peru ID

NC_006061.1 PYVV CPm Peru 1,00 ID

Obonuco PYVV 0,99 0,99 ID

Saguarán PYVV 0,99 0,99 0,99 ID

Aminoácidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán






extremo 3‟de CPm secuenciada en las cepas Obonuco y Saguarán con dos aislamientos de

PYVV del Perú.

Nucleotidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán





Aminoácidos AJ508757.2PYVVCPmPeruNC_006061.1PYVVCPmPeruObonuco Saguarán





173

El análisis de la región CP mostró identidades para nucleótidos respecto a las dos

secuencias de referencia del 99% y para aminoácidos igualmente del 99% (Tabla 45).


para las cepas Obonuco y Saguarán y dos aislamientos de PYVV del Perú.

Nucleotidos NC_006063.1PYVVCPPeruAJ557129.1PYVVCPUKObonuco Saguarán

NC_006063.1 PYVVCP Peru ID

AJ557129.1 PYVVCP Perú 1,00 ID

Obonuco 0,99 0,99 ID

Saguarán 0,99 0,99 1,00 ID

Aminoácidos NC_006063.1PYVVCPPeruAJ557129.1PYVVCPUKObonuco Saguarán

NC_006063.1 PYVVCP Peru ID

AJ557129.1 PYVVCP Perú 1,00 ID

Obonuco 0,99 0,99 ID

Saguarán 0,99 0,99 1,00 ID

174

Figura 54. Contextualización de las secuencias obtenidas para CPm parcial de las cepas de PYVV Obonuco y

Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.

gi 30172189 emb AJ508757.2

3892 bp

P4

CP

mP

26

96MY

CPm

1: 967 » 1706

94MY

CPm

1: 978 » 1737

94MY

CPm

2: 2112 » 2899

96MY

CPm

2: 2133 » 2889

AJ508757.2PY

VV

CPm

Peru: 1 » 3892

NC

_006061.1PYV

VC

PmPeru: 1 » 3892

1500

10001500

20002500

30003500

175

gi 4

6518016 e

mb A

J557129.1

5339 bp

Hs

p7

0P

7

P6

0

P1

0C

P

92M

Y-P

YV

V: 4

302 »

5038

90M

Y-P

YV

V: 4

311 »

5023

NC

_006063.1

PY

VV

CPPeru

: 1 »

5339

AJ5

57129.1

PY

VV

CPU

K: 1

» 5

339

1500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Figura 55. Contextualización de las secuencias obtenidas para la región CP de cepas de PYVV Obonuco y

Sagruarán, respecto a las secuencias de referencia NC_006063.1 y AJ557129.1.

176

5.7. Diagnóstico de los virus PVY y PMTV mediante RT-PCR en tiempo real.

5.7.1. Pruebas de detección de PVY.

Las reacciones de RT-PCR (Figura 56) y qRT-PCR (Figura 57) resultaron en

amplificaciones exitosas del genoma de PVY cuando se emplearon los cebadores descritos

en la metodología (Tablas 3 y 4), obteniéndose los fragmentos de ~227pb y las curvas de

amplificación del reporte de emisión de fluorescencia esperados, respectivamente.

Al comparar los niveles de detección en tejido foliar de papa del virus PVY mediante RT-

PCR en tiempo real (qRT-PCR) con relación a RT-PCR y ELISA, se encontró que esta

metodología detectó la presencia del virus en la totalidad de las muestras evaluadas (con

excepción del control negativo), mientras que la RT-PCR convencional y la prueba de

ELISA detectaron el virus en el 88% y 63% de las muestras. El análisis estadístico arrojó

diferencias significativas al nivel del 95% entre la prueba de ELISA y qRT-PCR, pero no

entre ELISA y PCR convencional (Figura 58).

177

Figura 56. Amplicones obtenidos con los cebadores PVYF y PVYUnivR (227 pb) a partir de tejido foliar de

plantas de papa de dos departamentos de Colombia (Tabla 5). 1: Marcador 100pb, 2: P3 6-10, 3: P3 EN, 4: P4

1-5, 5: P4 AV, 6: P4 11-15, 7: P5 11-15, 8: P6 11-15, 9: P7 MR, 10: P8 AV, 11: P8 16-20, 12: Ip EF, 13: Ip

Esp, 14: Ip EN, 15: Ip MR, 16: Ip1 AV, 17: Ip2 MR, 18: Ip3 1-5, 19: Ip8 EF, 20: Ip4 AV, 21: Marcador

100pb, 22: Ip4 11-15, 23: U1, 24: U2, 25: U3, 26: U4, 27: U5, 28: U6, 29: U7, 30: U8, 31: SR1, 32: SR2, 33:

SR3, 34: SR4, 35: SR5, 36: SR6, 37: SR7, 38: SR8, 39: SR9, 40: B1. (Vease Figura 58b: muestras B2, B3 y

Control negativo).

178

Figura 57. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PVYUnivF, PVYUnivR y la sonda

PVYUniv a partir de tejido foliar de plantas de papa de dos departamentos de Colombia.

Figura 58. Porcentajes de detección del virus PVY empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de

tejido foliar de papa de los departamentos de Antioquia y Nariño.

179

5.7.2. Pruebas de detección de PMTV

Las reacciones de RT-PCR (Figura 59) y qRT-PCR (Figura 60) resultaron en

amplificaciones exitosas de PMTV empleándose los cebadores descritos en la metodología

(Tablas 3 y 4), obteniéndose los amplicones de ~816 pb y curvas de reporte de la emisión

de fluorescencia esperados, respectivamente.

Al analizar los niveles de detección en raíces de N. benthamiana sembradas en turba

inoculada con el suelo tamizado con quistosoros de S. subterranea, se encontró que la

prueba de qRT-PCR determinó la presencia del virus en el 45% de las muestras analizadas,

mientras que mediante ELISA y RT-PCR convencional se diagnosticaron 25 y 28% de las

muestras como positivas para este virus. Sin embargo, el análisis estadístico no indicó

diferencias significativas al nivel del 95% entre las tres pruebas analizadas (Figura 61). Al

observar individualmente la capacidad de las pruebas para detectar el PMTV, resultó

llamativo el hecho que algunas muestras fueran positivas para dos de las tres pruebas, e

incluso se presentaron casos en los que la prueba de ELISA detecto el virus pero no las

pruebas basadas en RT-PCR, lo cual sugiere problemas con la inhibición de las reacciones

enzimáticas o con los cebadores empleados (Tabla 46).

180

Tabla 46. Detección del virus PMTV en muestras de tejido de raíz de plantas de N.

benthamiana sembradas en turba inoculada con S. subterranea, empleando tres

metodologías (ELISA, RT-PCR, qRT-PCR).

Muestra Localidad Vereda Variedad ELISA RT-PCR qRT-PCR

C+ KIT ELISA + - +

C+ 1/5 KIT ELISA + - +

C+ 1/10- KIT ELISA + - +

C+ 1/5- KIT ELISA + - +

7 Ipiales Rosario Unica - - -

10 Pasto El Campanero

Parda

Pastusa - - -

10(1) Pasto El Campanero

Parda

Pastusa - + +

23 Zipaquirá

Páramo

Guerrero Pastos - - +

23(1) Zipaquirá

Páramo

Guerrero Pastos - + +

25 La unión La Cabaña Criolla + + +

25(1) La unión La Cabaña Criolla + + +

35 La unión - + +

36 La unión - - -

Vallejuelito La unión Vallejuelito Capiro - + +

Villapinzón Villapinzón Chasques Capiro - - -

Villapinzón(1) Villapinzón Chasques Capiro - - -

Villapinzón(2) Villapinzón Chasques Capiro - - -

Madrid Madrid Los Árboles Capiro + - +

Madrid(1) Madrid Los Árboles Capiro - - -

Madrid(2) Madrid Los Árboles Capiro - - -


Páramo

Guerrero

Parda

Pastusa - - +


Páramo

Guerrero

Parda

Pastusa - - -


Páramo

Guerrero

Parda

Pastusa - - -


Páramo

Guerrero

Parda

Pastusa - - -


Páramo

Guerrero

Parda

Pastusa - + +

Tunja Tunja Siachoque Capiro - - +

Tunja(1) Tunja Siachoque Capiro - - -



Ventaquemada Ventaquemada Capellanía Capiro + - -

ventaquemada (1) Ventaquemada Capellanía Capiro - - -

Ventaqumada(2) Ventaquemada Capellanía Capiro - - -

Ventaquemada(3) Ventaquemada Capellanía Capiro - - -

181

SRO L2 Sta Rosa de

Osos Aragón Capiro - - -

SRO L4

Sta Rosa de

Osos Aragón Capiro - - +

SRO L5

Sta Rosa de

Osos Aragón Capiro - + -

SRO L5(2)

Sta Rosa de

Osos Aragón Capiro - + -

SRO L6

Sta Rosa de

Osos Aragón Capiro + + +

SRO L7

Sta Rosa de

Osos El Tres Capiro + + +

TZ+Z+ Turmeqé Siguineque Criolla - - -


182

Figura 59. Amplicones obtenidos con los cebadores PMTV759F y PMTV1552R (816 pb) a partir de tejido

de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S. subterranea de cuatro

departamentos de Colombia (Tabla 6). a. 1: Marcador 100pb, 2: C+, 3: C+ 1/5, 4: C+1/10, 5: C+ 1/50, 6: 7, 7:

10, 8: 10 (1), 9:23, 10: 23 (1), 11: 25, 12: 25 (1), 13: 35, 14: 36, 15: Valle, 16: Villapinzón, 17: Villapinzón

(1), 18: Villapinzón (2), 19: Madrid, 20: Madrid (1), 21: Marcador 100pb, 22: Madrid (2), 23: Zipaquirá, 24:

183

Zipaquirá (1), 25: Zipaquirá (2), 26: Zipaquirá (3), 27: Zipaquirá (4), 28: Tunja, 29: Tunja (1), 30: Tunja (2),

31: Tunja (3), 32: Ventaquemada, 33: Ventaquemada (1), 34: Ventaquemada (2), 35: Ventaquemada (3). b. 1:

Marcador 100pb, 2: SRO L2, 3: SRO L4, 4: SRO L5, 5: SRO L5 (1), 6: SRO L6, 7: SRO L7, 8: TZ1Z1, 9:

Marcador 100pb, 10: Control negativo para PMTV, 11: B2, 12: B3, 13: Control negativo para PVY.

Figura 60. Gráfica de amplificación de qRT-PCR con los cebadores PMTV1948F, PMTV2017R y la sonda

PMTV1970 a partir de tejido de raíz de plantas de N. benthamiana cultivadas en suelos infestados con S.

subterranea de cuatro departamentos de Colombia

184

Figura 61. Porcentajes de detección del virus PMTV empleando ELISA, RT-PCR y qRT-PCR en muestras de

tejido de raíz de N. benthamiana cultivadas en suelos procedentes de cuatro departamentos de Colombia.

185

6. DISCUSIÓN

La papa es el cuarto cultivo de producción mundial luego del arroz, maíz y trigo, que

provee la subsistencia básica a personas de diferentes continentes y es considerado por

algunas sociedades como el segundo pan (Secor y Rivera-Varas, 2004). Sin embargo, este

cultivo es afectado por un sinnúmero de patógenos, dentro de los cuales se destacan los

virus. Dichos patógenos, se han venido reportando regularmente en los cultivos de papa del

país, incluyendo PVY, PLRV; PVX, PVS y PYVV; este último ha aumentado su

importancia en las últimas décadas por su rápida diseminación y efectos sobre el cultivo

(Guerrero, 1978; Guzman et al., 2004a; Zapata, 2004). Para los virus mencionados se han

realizado diversos estudios en el país, con el fin de evaluar su incidencia en algunas

regiones productoras o en variedades cultivadas, así como también su efecto sobre la

producción y rendimiento (Guerrero y Martinez, 1980; Sánchez de Luque et al., 1991;

Zapata, 2004; Guzmán et al., 2004a). Recientemente, como avance de este trabajo (Gil et

al., 2009), se reportaron altas incidencias para Potyvirus en los cultivos de tres regiones de

Antioquia (41 a 75%), mientras que el virus PLRV presentó niveles de 9 al 16% y PVX

sólo se encontró en la región de Marinilla-Rionegro en una proporción del 22%. Esto

enfatiza la importancia de reforzar los programas de certificación de semilla, debido a que

el agricultor emplea en la mayoría de los casos, semilla de repetición infectada por virus y

como resultado hay una degeneración continua del material de siembra y de los

rendimientos esperados del cultivo.

Por otro lado, la reciente documentación de la presencia del virus PMTV en el país (Vélez,

2007) conduce a pensar que adicional a los virus tradicionalmente estudiados y

contemplados en los programas de certificación de semilla, existen otros que son

186

prevalentes y de importancia cuarentenaria, pero que aún no se reportan debido a que no se

ha realizado una evaluación de su presencia en el país, como podría ser el caso de los virus

PVM, PAMV, AMV, APMV, PVT, APLV, entre otros y cuyo reporte se ha dado

previamente en otros países andinos y de Centro América (Salazar, 1995; Vásquez et al.,

2006).

Al realizar las evaluaciones visuales de los síntomas presentes en los cultivos de papa del

país, se trató de simular la actividad realizada por los técnicos de campo y agricultores para

determinar la presencia o no de afecciones virales. Como resultado se evidenció que no

siempre se presentan síntomas individuales, sino que éstos generalmente pueden estar

combinados y que como es bien sabido, no siempre corresponden a enfermedades virales,

por lo que son referidos en este trabajo como presumiblemente asociados a virus. Es por

esto que algunos amarillamientos y rugosidades foliares, fácilmente se pueden confundir

con síntomas virales, aunque pueden ser debidos a desórdenes fisiológicos ocasionados por

exceso en las aplicaciones de biocidas (fitotoxicidad), cambios drásticos en las condiciones

ambientales y de nutrición de los cultivos, así como corresponder a químeras genéticas.

Los cultivos en Antioquia presentaron los mayores niveles de incidencia visual para los

cuatro síntomas evaluados (AV, EF, EN, MR), lo cual estuvo acompañado por la detección

en este departamento de los mayores niveles de incidencia de los virus estudiados mediante

pruebas de ELISA. Por otro lado, los resultados obtenidos de las muestras síntomáticas

evaluadas mediante las pruebas serológicas específicas para los virus Potyvirus, PVX,

PLRV, PVS, indican que no necesariamente los síntomas observables son atribuibles a

determinados virus y que la ausencia de síntomas no representa ausencia de virus en los

cultivos. Los resultados visuales de Boyacá, Cundinamarca y Nariño fueron muy similares

187

entre ellos, al igual que las incidencias evaluadas mediante ELISA, pero con promedios

inferiores a lo encontrado en Antioquia. Sin embargo, al evaluar estos resultados es

necesario contemplar la posible ocurrencia de otros virus no determinados en este trabajo,

así como las diferencias en las variedades y épocas de muestreo para cada una de las zonas

estudiadas, ya que es es bien sabido que la temperatura, precipitación, poblaciones de

insectos vectores y estado fenológico del cultivo, entre otros factores, influyen

dramáticamente en la manisfestación de los síntomas inducidos por virus.

Un antecedente que demuestra la necesidad de realizar monitoreos regulares sobre los

cultivos de papa del país con el fin de evaluar su incidencia y de realizar estudios tendientes

a identificar nuevos virus asociados al cultivo, es el del trabajo llevado a cabo en Costa

Rica para identificar los virus de papa presentes en este país y fortalecer su programa de

certificación de semilla. Dicho estudio, contempló, la evaluación de siete virus no incluidos

en su programa de certificación de semilla y la determinación de la incidencia de seis virus

contenidos en este programa, empleando para ello pruebas de ELISA. Como resultado se

encontró que virus como PAMV y TRSV presentaron incidencias muy altas y superiores a

las de virus comúnmente estudiados (Vásquez et al., 2006). El caso de PAMV llama la

atención, debido a que no se había reportado en dicho país a pesar de ser un virus con

amplia dispersión en Centro y Suramérica, de fácil transmisión por áfidos y común asocio

con PVY (Baulcombe et al., 1993; Brunt et al., 1996; Salazar, 1995). Así mismo, se

encontró una incidencia de PMTV del 50% en muestras tomadas entre las altitudes 1800 a

2500 msnm, alturas similares a las regiones donde se siembra papa en nuestro país. Además

de estos resultados, se reportó las presencia de seis de los siete virus que aún no habían sido

documentados en Costa Rica (Vásquez et al., 2006).

188

Para el caso particular de PMTV, la literatura describe que su sintomatología en papa

incluye moteados amarillos y mosaicos en las hojas nuevas, al igual que zonas cloróticas en

forma de V y acortamiento de entrenudos hacia los brotes (síntoma del que proviene el

nombre de Mop-Top). Los síntomas en las hojas parecen estar presentes solo en climas

muy fríos y cuando el tubérculo semilla ha sido infectado con anterioridad. En algunas

variedades los tubérculos desarrollan anillos necróticos concéntricos en la superficie,

síntoma conocido como “Spraing” (Rydén et al., 1986; Rydén et al., 1989; Harrison y

Reavy 2002). Partiendo de este precedente, los muestreos en campo de nuestra

investigación, estuvieron dirijidos a la observación de dichos síntomas, especialmente en

los sitios más altos de las zonas evaluadas. Desafortunadamente, no fue posible detectar

PMTV mediante ELISA o RT-PCR a partir de tejido de papa con síntomas similares a los

descritos anteriormente, ni en raíces y tubérculos de papa afectados por S. subterranea,

hecho por el cual se decidió evaluar la presencia del virus a partir de plantas señuelo,

principalmente N. benthamiana, siguiendo los reportes planteados por Sjöberg (2006) y

Vélez (2007). De esta forma, se diagnosticó la ocurrencia del virus en al menos una

muestra de los cuatro departamentos evaluados. No obstante, persiste la pregunta sobre los

niveles de incidencia de PMTV en las diferentes regiones cultivadoras de papa del país y

sobre su efecto en la degeneración del tubérculo semilla y/o en la producción; lo cual de

resultar significativo, sería muy grave al adicionar este problema al causado por S.

subterranea, su agente vector, que puede ocasionar reducciones en rendimiento hasta del

40% (Gilchrist et al., 2009).

Para complementar el análisis de incidencia de los virus bajo estudio y obtener mayor

información sobre aquellos de los cuales no se pudo hacer análisis de incidencia, se

189

realizaron los análisis filogenéticos de los seis virus bajo estudio (PVY, PYVV, PVS, PVX,

PLRV y PMTV). En todos los casos la región del genoma utilizada para dicho análisis

correspondió a aquella que codifica para CP; aunque para el caso de PMTV se empleó

adicionalmente una fracción de la región que codifica para la proteína TGB2.

El virus PVY fue el virus del cual se obtuvo un mayor número de aislamientos para el

análisis filogenético. Dicho análisis presentó para este virus, identidades superiores al 89%

de las cepas Colombianas con respecto a las de referencia de diferentes países, lo que

demuestra que todas son variantes de la misma especie, según los criterios taxonómicos

definidos para el género Potyvirus (Glais et al., 2002b; Adams et al., 2005). De dichas

comparaciones, resultó destacado el hecho que todas las cepas secuenciadas se ubicaron en

un clado filogenético compartiendo identidades superiores al 95% con aislamientos que

representan las razas del virus PVY-N y PVY-NTN. Con respecto a las secuencias parciales

del genoma de PVY de los aislamientos del departamento de Antioquia, se encontraron

igualmente altas identidades con las razas PVY-N y PVY-NTN para la región que codifica

la proteína P1, CP y los UTR 5‟ y 3‟. Lo anterior, sugiere la posible presencia de la

enfermedad PTNRD en el país. Dicha enfermedad se caracteriza por la presencia de anillos

necróticos en los tubérculos, que pueden aparecer cuando estos se cosechan, pero más

comúnmente cuando se almacenan (Glais et al., 2002a). Debido a que en Colombia no es

una práctica usual el almacenamiento de tubérculos, los síntomas de la presencia de la

enfermedad PTNRD pueden ser confundidos o verse enmascarados por otros factores,

como los climáticos y los agrietamientos ocasionados por la herramienta de labranza e

incluso por otros patógenos en el tubérculo. Al parecer los síntomas foliares de la raza

PVY-NTN son más severos que los producidos por PVY-N, produciendo también anillos

190

en la lámina foliar (Kogovsek et al., 2008). Sin embargo, es necesario disponer de mayor

información relacionada con las secuencias de los aislamientos generadas en este estudio

para conocer con certeza las identidades taxonómicas de éstos, así como los eventos

recombinatorios que presentan y de esta forma, direccionar los estudios tendientes a

identificar la sintomatología, daño asociado a cada una de las variantes de PVY y su efecto

en los programas de certificación de semilla y mejoramiento genético que se realizan en el

país. Lo anterior permitirá conocer además, sí existe una relación entre las características

del genoma viral y la habilidad de dichas variantes para romper la resistencia a los

materiales mejorados y/o naturalamente tolerantes a este virus (Schubert et al., 2007).

El análisis filogenético del virus PYVV, mostró identidades superiores al 99% con las

secuencias de referencia de Perú y Colombia. Esto también sucedió cuando se analizó la

región que codifica para la proteína CPm del virus. Desafortunadamente, no existe mucha

información disponible de las secuencias de este virus, dificultándose la realización de

análisis de variabilidad genética. PYVV, se puede considerar un virus “exótico” y

restringido al subcontinente Suramericano, ya que aún no se ha reportado en otros lugares

del mundo, lo que a su vez lo constituye en un virus de gran importancia cuarentenaria para

los países europeos, principalmente (Lopez et al., 2006). La importancia de su infección

radica en que puede ocasionar pérdidas en el rendimiento de hasta el 50% en el cultivo de

la papa y a que, en algunos cultivares, el virus puede permanecer como una enfermedad

latente, no necesariamente causando su sintomatología típica de amarillamiento de las

nervaduras secundarias (Salazar et al., 2000). En el árbol filogenético obtenido, se aprecia

claramente que todas secuencias se agrupan en un clado y que los cambios de nucleótidos

son mínimos. Este resultado es muy similar al encontrado por Offei et al, (2004), cuando

191

compararon aislamientos de PYVV colombianos con peruanos, obteniendo 99% de

identidad de nucleótidos en todas las secuencias evaluadas. Sin embargo, un estudio más

reciente realizado por Guzmán et al, (2006), basado en RT-PCR RFLP, se encontraron tres

diferentes patrones de restricción (A, B y C) con la enzima HinfI para 18 aislamientos de

los departamentos de Antioquia, Cundinamarca y Nariño, predominando en un 80% el

patrón A. Adicionalmente, se observó que hubo combinación de patrones de restricción A

con B ó con C, indicando posibles infecciones combinadas de al menos dos diferentes

genotipos de PYVV. El patrón de restricción A sólo se observó en Nariño, mientras que los

tres patrones estuvieron presentes en las muestras de Antioquia y Cundinamarca. Estudios

independientes sugieren que PYVV se diseminó a partir de Colombia y Ecuador hacia otros

países vecinos como Perú y Venezuela (Salazar et al., 2000; Offei et al., 2004), por lo que

es posible que el nivel de variación hasta ahora encontrado, esté subestimado o mejor

representado en otras regiones del genoma diferentes a la cápside viral. En este sentido, en

un estudio realizado sobre 50 aislamientos de PYVV en S. phureja en Colombia, se

reportaron cuatro perfiles electroforéticos mediante la metodología de polimorfismo

conformacional de la cadena sencilla (SSCP) (Guzmán et al., 2009). Como se puede inferir

de estos resultados, se requiere de un estudio más profundo del virus PYVV en nuestro

país, para determinar con mayor precisión sus posibles variantes, las implicaciones

epidemiológicas de éstas y su efecto en los rendimientos de las variedades cultivadas en

Colombia.

Con respecto al análisis de secuencias del virus PVS, se presentaron valores de identidad

superiores al 76% entre las cepas Colombianas y aquellas de referencia, lo que indica un

alto grado de variabilidad en este virus. Matousek et al. (2000), describen alta variabilidad

192

entre aslamientos andinos y ordinarios de PVS (PVSA y PVSo, respectivamente), siendo

mayor cuando se comparan las regiones localizadas hacia el extremo N-terminal de la CP.

En el presente estudio, dicha variabilidad se evidencia en el árbol filogenético, en el cual

las diferentes cepas del país se agrupan con las cepas de referencia en dos clados, con altos

soportes de bootstrap. El clado I aparentemente esta relacionado con la raza PVSA, al

ubicarse allí una de las cepas características de esta raza (Vltava). Sin embargo, dentro del

mismo clado existe una gran variación entre las cepas colombianas, las que incluso se

dividen en dos subclados bien definidos. El clado II, estuvo representado por cepas

pertenecientes a PVSo junto con tres cepas del altiplano Cundiboyacense (Chikh et al.,

2008; Cox & Jones, 2010a). Cox & Jones (2010a), obtuvieron resultados muy similares a

los aquí reportados, aunque las identidades encontradas para la región CP en el presente

trabajo, resultaron aún más bajas que las indicadas por dichos autores. Respecto a la

secuenciación parcial del genoma de PVS, se obtuvo un fragmento de mayor tamaño de la

región CP para dos aislamientos del departamento de Antioquia. Uno de ellos fue obtenido

del mismo material de papa del que se obtuvo PVY (identificado como Carmen) para la

secuenciación parcial de su genoma. Los datos indicaron identidades superiores al 78% en

esta región con respecto a cepas de referencia de USA y Alemania, confirmándose así los

resultados de variación encontrados en el análisis filogenético.

En esta investigación se encontró una alta incidencia de PVY y PVS infectando papa en

Colombia, a partir de cepas con niveles importantes de variación, para ambos virus. Es por

esto, que se deben fortalecer las medidas de diagnóstico y control para estos virus,

principalmente en los programas de certificación de semilla, y especialmente considerar el

manejo de sus vectores en regiones que favorezcan su diseminación.

193

PLRV ha sido uno de los virus más estudiados y prevalentes en el cultivo de la papa a nivel

mundial, así como uno de los que probablemente causan mayores daños en el cultivo

(Solomon-Blackburn y Barker, 2001). Sin embargo, reiteradamente no se ha encontrado

una notable diferencia entre las secuencias de sus aislamientos alrededor del mundo, hecho

que se repitió en este trabajo al analizar las secuencias obtenidas de la región que codifica

para CP. El análisis filogenético mostró diferencias de máximo un 3% con respecto a las

secuencias de referencia y agrupó a todas las cepas en un solo clado. Cuando se realizó el

análisis de la contextualización de las secuencias obtenidas de PLRV respecto a los

genomas de referencia, se encontraron igualmente identidades del orden del 99% y 98%

para nucleótidos y aminoácidos respectivamente, para la cepa Siguineque, mientras que la

cepa Suras, presentó identidades del 98% y 97% para nucleótidos y aminoácidos. Según la

literatura, la varibilidad estudiada y reportada para el virus, se centra principalmente en la

región codificante para P0. Dicha región permite la discriminación entre diferentes

aislamientos del virus y la distinción en tres grupos de aislamientos, con valores de

identidad que fluctúan entre 94,7% y 98,5% (Plchova et al., 2009). Se ha planteado que los

bajos niveles de variación encontrados en este virus son posiblemente resultado de su

reciente divergencia a partir de otro virus que se especializó en la afección a papa y/o a las

fuertes presión de selección que ejerce la estrecha base genética de las variedades de S.

tuberosum cultivadas en el mundo (Guyader y Ducray, 2002; Taliansky et al., 2003). Es

necesario entonces, para conocer la verdadera variabilidad de las cepas de PLRV presentes

en el país, analizar las secuencias de las regiones hacia el extremo 5‟ del genoma del virus,

como lo es P0.

194

Para el caso del virus PVX, el análisis de las secuencias obtenidas junto con las de

referencia mostró diferentes grupos y una variabilidad relativamente baja de los

aislamientos colombianos, aunque algunos de ellos presentaron diferencias importantes con

respecto a las secuencias de referencia (86% al 77%). El árbol filogenético separó las cepas

colombianas en dos clados, siendo mayoritario el número de éstas ubicado en el clado I;

mientras que el clado II sólo estuvo conformado por dos cepas del departamento de Nariño.

En cuanto a la secuenciación parcial del genoma de PVX, los dos aislamientos utilizados

provinieron del departamento de Antioquia. La cepa Carmen, se obtuvo del mismo material

en el cual se detectaron los virus PVS y PVY utilizados en el análisis de secuencias y

denominados bajo este mismo nombre. El análisis mostró que en los dos casos las

secuencias obtenidas no presentaron un alto grado de variabilidad respecto a las secuencias

de los genomas de referencia, fluctuándo éstos valores entre 94 y 98% para nucleótidos y

98 a 100% para aminoácidos. Basados en los resultados de Yu et al, (2010), que separan las

cepas de PVX con base en secuencias de CP en dos diferentes orígenes geográficos

(Eurasia y America), y en los resultados obtenidos en este trabajo, donde se obtuvo una

separación de las cepas de referencia en los mismos grupos, se podría decir que el clado I

contiene cepas asociadas al grupo Ëurasia¨ y el clado III posee cepas asociadas al grupo

Ämerica¨. A partir de lo anterior, se puede inferir que el clado II es evidentemente un

grupo no asociado a los descritos por Yu et al, (2010), y que podría coincidir con un clado

recientemente descrito por Cox y Jones (2010b), que incluye seis aislamientos de los Andes

suramericanos. Cabe preguntarse entonces, cuales serían las implicaciones biológicas de

este grupo aparentemente diferente con respecto a la epidemiología y efecto del virus PVX

en los cultivos de papa de Colombia. Es necesario entonces, secuenciar y analizar un mayor

195

número de aislamientos del país y evaluar su grado de virulencia frente a diferentes

materiales de papa, de manera que se genere una mejor perspectiva sobre la estructura

poblacional de PVX en nuestro país.

Del virus PMTV se realizó el análisis filogenético para dos regiones del genoma

amplificadas con los cebadores H360-C819 y PMTVF4-R4, utilizados previamente por

Vélez (2007) en un estudio que incluyó muestras de diferentes regiones del país. La

primera región codifica para CP (ARN2) y la segunda para la proteína TGB2 (ARN3). En

el primer caso, dos de las cuatro secuencias de cepas colombianas (70MR y 71MR), se

agruparon en el mismo clado con las secuencias de referencia de PMTV de otros países y

compartiendo identidades superiores al 98%, mientras que las otras dos cepas (71MY y

72MY) se ubicaron en un clado independiente y con bajos niveles de identidad con respecto

al clado I (~76%). Esta situación ya había sido reportada por Vélez (2007), al encontrar que

algunos aislamientos Colombianos de PMTV presentaban identidades cercanas al 80% en

la secuencia de nucleótidos que codifica para la región de CP con relación a las cepas cuyas

secuencias se encontraban disponibles en el GenBank. Lo anterior muestra que el grado de

variación que presenta el virus, al menos en esa región del genoma, es alto para algunas

cepas de Colombia e incluso permite plantear la posibilidad de que correspondan a

diferentes especies virales del género Pomovirus. Esta situación requiere de un análisis

completo del genoma y de estudios epidemiológicos que evaluen el efecto de estas

variantes sobre la transmisión del virus, su nivel de virulencia en diferentes materiales de

papa y su distribución en la planta. Nielsen y Nicolaisen (2003), reportaron la presencia en

Dinamarca de dos grupos de PMTV basado en análisis de las secuencias de CP,

encontrando que éstos comparten 98% de identidad, pero con diferencias notables en la

196

reproducción de síntomas en plantas indicadoras. Una situación similar fue encontrada por

Mayo et al. (1996) al comparar las secuencias de CP de ocho aislamientos de PMTV

obtenidos en los Andes Peruanos y tres procedentes de Escocia. Xu et al (2004), reportaron

la presencia del virus en USA y Canadá, y altos niveles de identidad con los aislamientos

reportados hasta ese momento en Perú y Europa. Adicionalmente, en dicho trabajo se

confirmó la distribución errática del virus en la planta, recomendándose la necesidad de

tomar muestras de distintas partes de un mismo tubérculo para detectar el virus. Para el

caso de las secuencias obtenidas de la región TGB2, se obtuvieron niveles de identidad para

nucleótidos superiores al 97% para dos de las tres cepas locales, mientras que la restante

(70MY) presentó identidades cercanas al 86%. Como es de notar, las dos cepas que

mostraron marcada diferencia respecto a las demás para la región CP y esta última descrita

para la región TGB2 son de de la sabana Cundiboyacense, lo que permite suponer que en

dicha zona, es posible que se encuentren genotipos diferentes a los mundialmente

reportados para este virus. Dichas diferencias pueden estar muy relacionadas con la

variabilidad encontrada en S. subterranea en el país, la cual separa al patógeno en dos

grupos de acuerdo al tejido de donde éste se ha aislado (tubérculo o raíz). En este sentido,

recientemente Carreño (2009) evaluó la variabilidad de S. subterranea en Colombia

mediante la técnica SSCP a partir de amplicones de la región ITS, confirmando la presencia

de al menos dos grupos de aislamientos. La relación entre las diferencias encontradas entre

las poblaciones de ambos patógenos son de interés debido a que es CP y más

específicamente CPRT, la proteína relacionada con la transmisión del virus por dicho

plasmodioforido, tal como se demuestra del trabajo de Reavy et al. (1998), quienes

reportaron que el aislamiento PMTV-T, que carece de un fragmento representativo de

197

secuencia en el ARN2, no puede ser transmitido por S. subterranea, pero sí mediante

inoculación mecánica. Esta situación aparentemente se debe a la deleción de una porción de

la región CPRT del ARN2 del virus (Sandgren et al., 2001).

La contextualización en el genoma viral de las dos secuencias obtenidas en cepas de PMTV

del departamento de Antioquia, indicó que se tratan de aislamientos representativos del

genoma ordinario de PMTV y no de las variantes encontradas en el análisis filogenético.

Sus identidades para las porciones del ARN2 y ARN3 secuenciadas fueron altas (>97%)

con respecto a los genomas reportados en trabajos anteriores (Cerovska et al., 2007;

Sandgren et al., 2001), por lo que se plantea la necesidad de secuenciar dichas regiones en

al menos un aislamiento de las variantes referidas. Los resultados encontrados en esta

investigación permiten plantear que el caso de PMTV en Colombia es aparentemente

singular, dada la presencia de dos variantes genéticas, de los altos niveles de afección que

genera S. subterranea en cultivos de papa de diferentes departamentos y de las diferencias

notables en la manisfestación de síntomas de la sarna polvosa entre variedades locales

(Carreño, 2009; Gilchrist et al., 2009), situación que amerita continuar con los estudios de

dichos patosistemas.

Además del análisis de incidencia de cuatro virus de importancia económica en cultivos de

papa de Colombia y la caracterización molecular de porciones del genoma de seis virus; en

esta investigación se evaluó la posibilidad de incorporar la metología de RT-PCR en tiempo

real (qRT-PCR) como una herramienta adicional para la detección de los virus que efectan

este cultivo en nuestro país. Diversos estudios registran el aumento en los niveles de

sensibilidad para la detección virus fitopatógenos que ofrece esta técnica (Mumford et al.,

2000; Olmos et al., 2005; López et al., 2006; Kogovsek et al., 2008; Davey, 2009). Así por

198

ejemplo, Olmos et al, (2005), al evaluar la presencia de PPV directamente en áfidos,

encontraron que la qRT-PCR podría detectar niveles tan bajos como 4 copias del genoma

viral y a partir de este límite inferior su rango de acción alcanzó 4 x 108 copias. Los autores,

al comparar la sensibilidad de esta técnica con respecto a RT-PCR convencional, anidado y

ELISA, encontraron que qRT-PCR podría aún generar curvas de amplificación en

diluciones de transcritos del genoma viral tan bajas como 1:65,536,000; mientras que RT-

PCR anidado y RT-PCR convencional/ELISA lo hacían en niveles de 1:32,768,000 y

1:256,000, respectivamente. Esta situación corresponde en términos prácticos a aumentos

de sensibilidad de 100 y 1000 veces, un valor similar al encontrado por Fabre et al. (2003),

evaluando la detección de Barley yellow dwarf virus (BYDV).

El uso de la técnica de qRT-PCR en esta investigación, permitió efectivamente detectar

tanto el virus PVY como PMTV en el 100% de las muestras analizadas para el primer virus

y en el 45% para PMTV. Estas proporciones de detección fueron superiores en ambos casos

con respecto a las técnicas de ELISA y RT-PCR convencional, siendo diagnósticado el

virus PVY en un 34% más de las muestras que lo encontrado mediante ELISA y en un 9%

más con respecto a RT-PCR convencional. Similarmente, el virus PMTV fue detectado por

el qRT-PCR en una proporción superior en 20 y 17% más con respecto a ELISA y RT-PCR

convencional, respectivamente. Estudios realizados para evaluar la utilidad de la técnica de

qRT-PCR en el diagnóstico de PVY, han encontrado no sólo aumentos en los niveles de

sensibilidad de la detección, sino la posibilidad de utilizar esta metodología para la

diferenciación de las razas del virus, lo cual posibilita por ejemplo, la determinación rápida

de la proporción de cepas asociadas al PTNRD en un cultivo o región particular (Kogovsek

et al., 2008). Esta situación requiere ser evaluada en los cultivos de nuestro país, pues los

199

análisis de secuencias de este trabajo, sugieren la presencia de cepas asociadas a esta grave

enfermedad en Colombia.

En forma similar, diversos trabajos se han realizado con el fin de evaluar el potencial de

qRT-PCR para su uso en programas de certificación de tubérculo semilla de papa y la

detección de PMTV y de su vector S. subterranea en lotes de cultivo (Mumford et al.,

2000; van de Graaf et al., 2003). Davey (2009) indica que mediante qRT-PCR es posible la

detección del PMTV en bioensayos basados en tomate luego de un periodo tan corto como

dos semanas, lo cual al compararse con la metodología convencional, representa un ahorro

de tiempo cercano a dos meses. Por otra parte, Mumford et al, (2000), diseñaron cebadores

y una sonda bajo el sistema de qRT-PCR Taqman para la detección de PMTV en tejido

foliar y tubérculos de papa, encontrando que esta metodología aumenta el nivel de

sensibilidad del diagnóstico de dicho virus en 10000 veces con respecto al procedimiento

de ELISA comúnmente utilizado. De gran interés resultará ampliar la base de análisis de la

metodología planteada en esta investigación, de manera que se evalue el efecto de

inhibidores, variabilidad genética de los virus y su distribución (especialmente de PMTV),

en las plantas afectadas, con miras a incorporar estas metodologías en el programa de

certificación de semilla que regula el ICA en nuestro país. Finalmente, este experimento de

comparación de metodologías, conduce a inferir que sí la técnica ELISA presenta niveles

de sensibilidad inferiores en 100 a 10000 veces con respecto a qRT-PCR, y particularmente

en nuestro estudio de entre 20 y 34% menos, es posible que los niveles de incidencia de los

virus detectados en cultivos de papa de Colombia sean aún mayores a los encontrados en

esta investigación, lo cual resulta de gran preocupación para la agroindustria de producción

de papa en Colombia.

200

CONCLUSIONES

En esta investigación se determinó la presencia e identificación molecular de los genotipos

de los virus PLRV, PMTV, Potyvirus (PVY), PVS, PVX y PYVV en cultivos de papa de

cuatro departamentos de Colombia. Los análisis de incidencia realizados mediante ELISA

para cuatro de ellos (PLRV, PVS, PVX, Potyvirus) arrojaron resultados que indican altos

niveles infección viral en los cultivos de papa, siendo las incidencias de los potyvirus y

PVS las más altas con 72 y 40%, respectivamente, mientras que el PLRV y PVX se

encontraron en el 20 y 8% de las muestras evaluadas. Estos niveles variaron entre las zonas

evaluadas en cada Departamento, pero notablemente fueron muy superiores a las

evaluaciones de síntomas visuales realizadas, lo que sugiere la necesidad de incorporar con

mayor intensidad métodos de diagnóstico serológico y/o molecular en las evaluaciones

fitosanitarias que realizan los técnicos, gremios y entes gubernamentales de sanidad

vegetal.

Los estudios moleculares utilizando cebadores específicos para los seis virus bajo análisis,

permitieron su detección en diversos cultivos de papa de Colombia, confirmándose la

presencia del virus PMTV en al menos una de las muestras procedentes de cada

departamento incluido en la investigación. El aumento en la distribución e importancia

económica de S. subterranea, agente vector del PMTV, conduce a plantear la necesidad de

estudiar con más detalle las características propias de estos patosistemas en los

agroecosistemas paperos de los Andes Colombianos y evaluar su efecto sobre la producción

y calidad del tubérculo semilla en forma independiente y conjunta.

201

Los análisis de secuencias de la región de la cápside de los seis virus analizados,

permitieron inferir las afinidades filogenéticas de los genotipos virales afectando los

cultivos de papa en Colombia. En términos generales, se encontraron bajos niveles de

variación y diferenciación con respecto a cepas de referencia de otros lugares del mundo en

los virus PLRV y PYVV; mientras que los virus PVY y PVS resultaron con niveles

apreciables de variación, detectándose la asociación entre un alto número de cepas

colombianas de PVY con las raza PVY-NTN, responsable en el mundo de la enfermedad

conocida como PTNRD. Los virus PVX y PMTV presentaron una estructura poblacional

basada en un alto número de cepas con bajos niveles de variabilidad, pero con algunas

variantes divergentes con respecto a los genotipos de referencia mundial.

Un aporte importante de esta investigación correspondió al aumento de la información

disponible sobre las secuencias de diferentes regiones de los genomas de virus de papa en

Colombia. Dicha información se presentaba en forma marginal o no estaba disponible para

la gran mayoría virus analizados y podrá ser utilizada como base para análisis de estructura

poblacional en el ámbito científico y en forma más práctica para el diseño de técnicas de

diagnóstico ajustadas a las realidades genotípicas de estos patógenos en los cultivos de papa

del país; metodologías necesarias para el apoyo de los programas de certificación de

tubérculo semilla y para la formulación de programas de manejo integrado de las

enfermedades virales.

Los análisis de las secuencias parciales de los virus de papa estudiados en esta

investigación indican de la presencia de diferencias importantes entre cepas de una misma

especie viral; e incluso la contextualización realizada con respecto a genomas previamente

secuenciados, demostró que las diferentes regiones evaluadas para cada cepa, no

202

necesariamente estaban asociadas a un genoma de referencia en particular, lo cual sugiere

que fenómenos como la recombinación y el rearreglo interno de genes son importantes en

la definición de la estructura genética de las poblaciones de algunos de los virus. Estos

hallazgos deben ser considerados en los estudios epidemiológicos de dichos virus que se

realicen en el país.

En este trabajo se presentó y validó una metodología de qRT-PCR para la detección de los

virus PVY y PMTV en cultivos de papa de Colombia con miras a su utilización en los

programas de certificación de semilla que se adelantan en el país. La ventajas que ofrece el

establecimiento de cultivos de papa libres de patógenos virales se han demostrado en

múltiples estudios y es por esto que los principales países productores de este tubérculo han

implementado sistemas robustos de certificación de semilla, en los que se emplean diversos

métodos de diagnóstico viral que incluyen observaciones visuales de síntomas, detección

serológica y qRT-PCR. Esta última metodología viene tomando gran fuerza, gracias a que

ofrece mayores niveles de sensibilidad, agilidad en la obtención de resultados e

información sobre las características genotípicas de las variantes virales encontradas en una

región o país.

203

AGRADECIMIENTOS

El autor desea expresar su gratitud a la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín,

Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Universidad de Nariño, Fedepapa, Fritolay y

al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (proyecto 090-2007S4527-87-08, Bases

para la implementación de prácticas de exclusión de Spongospora subterranea y el

virus asociado Mop-top (PMTV) en cultivos de papa mediante el desarrollo de

herramientas de diagnóstico in situ y en laboratorio) que aportaron los recursos físicos,

humanos, técnicos y financieros para adelantar este trabajo. La investigación se realizó en

las instalaciones de los Laboratorios de Biología Celular y Molecular de la Universidad

Nacional de Colombia Sede Medellín y en el Laboratorio de Sanidad Vegetal del

Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid.

204

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ANEXOS

Anexo 1. Síntomas diferentes a AV, EF, EN y MR observados en los cultivos de papa de

cuatro departamentos de Colombia.

Anexo 2. Planta de papa infectada con S. subterranea. Se observan agallas generadas por la

infección.

228

Anexo 3. Concentración de quistosoros de S. subterranea encontrados en los suelos

empleados para la detección del virus PMTV mediante plantas señuelo.

Localidad qistosoros/ml

7 17200

10 16000

25 8200

35 89000

36 111800

SRO L2 13600

SRLO L3 21800

SRO L4 9800

SRO L5 29600

Vallejuelito 18800

23 12800

Villapinzón 24400

Madrid 44066

Zipaquirá6 10600

Tunja1 11200

TZ1Z1 20400

Ventaquemada 35400

Documents

DIAGNOSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE VIRUS … · Niveles de detección serológica de los virus Potyvirus, PLRV, PVS y PVX con respecto a los cuatro síntomas evaluados visualmente