Diseño Esperimental Articulo

7/23/2019 Diseo Esperimental Articulo.

1/7

186 Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XV No. 2 Diciembre 2013 186-192

ARTCULO CORTO

Comparacin de dos mtodos de extraccin de ADN a partir

de plantas del gnero Solanum,subgnero Leptostemonum

Comparison of two ADN extraction methods from plants belonging

Solanum genus Leptostemonum subgenus.

Isabel Cristina Cadavid Snchez*, Doris Amanda Rosero Garca*, Sandra Ins Uribe Soto*

Resumen

Se evaluaron dos mtodos para la extraccin de ADNen plantas del gnero Solanum, con el fin de obtener ADN disponibley de buena calidad para la obtencin de secuencias. El producto comercial DNeasy Plant Mini Kit se compar con unmtodo que incluye el uso de una solucin tampn de lisis. Para este ltimo mtodo tambin se evalu si el rendimientomejoraba cuando las muestras se maceraron previamente con nitrgeno lquido. Los resultados en trminos de calidad(A260/A280) no mostraron diferencias significativas entre los mtodos de extraccin (ndice < 1,5). Sin embargo, se encon-traron diferencias en la concentracin de ADNobtenida (prueba de Dunnet, p


2/7

Extraccin de ADN de Solanum 187

Introduccin

En las plantas (Reino Plantae), el gnero Solanum es

uno de los ms diversos de la familia Solanaceae, conaproximadamente 1.500 especies (Weese y Bohs,

2007). Dentro de este gnero se encuentra el subg-

nero Leptostemonum conocido como spiny Solanum

o Solanumcon espinas, en el que se incluyen plantas

caracterizadas por poseer espinas en hojas y tallos,con un nmero estimado de 350 a 450 especies (Le-

vin et al., 2006).

Entre las especies de este subgnero se encuentran

algunas de importancia econmica en la industria ali-

menticia y medicinal, relacionada con propiedadesantitumorales, antioxidantes y antimicrobianas (Chahet al., 2000; Kuo et al., 2000; Medina et al., 2009). En

este grupo de plantas tambin se reconocen plantas

hospederas o fuentes de alimento de algunas maripo-

sas con las cuales establecen relaciones ecolgicas deimportancia en estudios evolutivos (Giraldo y Uribe,

2010a, 2010b).

A pesar de la importancia de muchas de las especies

del subgnero Leptostemonuny de la relevancia de su

adecuada identificacin, su taxonoma es relativamen-te poco conocida y estudiada, lo que se relaciona con

la gran variacin morfolgica y la poca disponibilidad

de taxnomos especializados en el grupo (Spooner et

al., 2001; Miz et al., 2008; Yousaf et al., 2010). En este

sentido se considera que el uso de caracteres mole-culares, podra contribuir considerablemente en el co-

nocimiento y separacin de las especies del gneroSolanum de forma rpida, econmica y acertada. La

obtencin de ADN de buena calidad y en cantidadadecuada para la realizacin de procedimientos mo-leculares, es un aspecto fundamental para el xito de

cualquier iniciativa que apunte a la identificacin mo-

lecular de especies, como la que se adelanta con gran

xito para animales (Fazekas et al., 2009) y avanza

para plantas (Hollingsworth et al., 2009). Esta iniciati-va es conocida como cdigo de barras gentico de

especies o BARCODE (Ausubel et al., 2002; Hebert et

al., 2003).

Para el gnero Solanum,el protocolo de extraccin de

ADNreportado en la literatura corresponde al basado

en Bromuro de Cetilmetilamonio (CTAB) de Doyle yDoyle (1987) el cual se ha utilizado con buenos resul-

tados en la extraccin de ADNde otros gneros de la

familia Solanaceae y tambin en especies de la fami-

lia Juncaceae (Drabkova et al., 2002; Weese y Bohs,2007; Turci et al., 2010). Este mtodo de extraccin

aunque an se utiliza de rutina en muchos laborato-

rios, hace uso de solventes orgnicos como el clorofor-

mo, generando un riesgo relativo para la salud humana

y el ambiente principalmente por las dificultades para

su eliminacin (Valter de Oliveira et al., 2009; Niu et

al., 2010).

Productos comerciales para la extraccin de ADN

como el DNeasy Plant Mini Kit (QIAGENInc., Valen-

cia, CA, USA) son tiles y recomendados para obtener

y amplificar ADN de plantas aunque con mayores

costos (Drabkova et al., 2002; Vural, 2009). Otros

mtodos como los llamados caseros que incluyen ma-

ceracin y soluciones de lisis como el detallado por

Collins et al. (1987), son econmicos y exitosos para

la obtencin de ADN y han sido usados en organis-

mos como los insectos (Gmez et al., 2009; Marn et

al., 2012). Sin embargo, no se conoce el uso de este

mtodo para la extraccin de ADNa partir de plantas

y sera importante evaluar su utilidad en relacin con

algunas dificultades reportadas en mtodos similares,

para remover polisacridos presentes en las plantas lo

que puede afectar la calidad del ADNy disminuir el

xito de amplificacin por PCR.

En el presente estudio se evalu para lasplantas So-

lanumcon espinas, la efectividad en la extraccin de

ADNcon calidad para PCR, del mtodo de Collins et

al. (1987) en comparacin con el mtodo comercial

DNeasy Plant Mini Kit. El objetivo de este estudio

fue seleccionar el mejor mtodo de extraccin de ADN

para este grupo de plantas, en trminos de eficiencia,

costos y que representara un bajo riesgo para la sa-

lud y el medio ambiente. Es de inters de los autores

implementar el mtodo seleccionado en estudios de

taxonoma y sistemtica del gnero Solanum,incluyen-

do adems de los genes estudiados aqu, otros quese encuentran en evaluacin de acuerdo a su utilidad

taxonmica en el grupo.

Materiales y mtodos

Material vegetal y preparacin

Se procesaron en total nueve plantas del subgnero

Leptostemonum: dos ejemplares de Solanum torvum

y uno de Solanum hirtum, dos de Solanum jamaicense,

tres de Solanum pseudoluloy uno de Solanum viarum.

La identidad de las plantas se verific usando clavestaxonmicas (Whalen et al., 1981) y por comparacin

con especmenes del herbario MEDELde la Universidad

Nacional de Colombia, sede Medelln, y verificacin

con el especialista. Los especmenes se depositaron

como coleccin de referencia en el mismo herbario

MEDEL. Se utiliz como fuente para la extraccin de

ADNel tejido foliar de los nueve especmenes y se eva-

lu si existan diferencias al usar tejido fresco y/o seco.


3/7


La cantidad de material vegetal usada fue 0,1 g cuando

se encontraba fresco y 0,02 g seco, cantidad que reco-

mienda el producto comercial DNeasy Plant Mini Kit

(QIAGENInc., Valencia, CA, USA.). Se proces el tejido

fresco almacenado a temperatura ambiente y el tejido

seco, previamente se someti a una temperatura de

40 C en un horno durante tres das segn recomen-

dacin del herbario.

Extraccin de ADN

Mtodo comercial, DNeasy Plant Mini Kit (QIA-gen). Se sigui el procedimiento indicado por la casacomercial, el cual incluy una resuspencin final de la

muestra en buffer AE(QIAGENInc., Valencia, CA, USA).

La muestra se almacen a -20C.

Mtodo Collins et al. (1987) con base en solucin tam-pn de lisis.Se agreg 400 uL del tampn de lisis (0,08M NaCl, 0,16 M sucrosa, 0,06 M EDTA, 0,5% SDS, 0,1

M Tris-CL, pH 8,6) a la muestra y se homogeniz en unvial de 1,5mL. Se incub a 64C durante 30 minutos.

Posteriormente se adicion 56 uL de acetato de pota-

sio 8 M para la precipitacin de protenas. Se incub

durante 60 minutos a -20C. Despus de la incubacin

se centrifug a 3.500 rpm durante 15 min, para luego

remover el sobrenadante y pasarlo a un tubo nuevo. A

ste se le adicion 100 uL de etanol al 100% y se centri-

fug a 3.500 rpm durante 15 min. Despus de descartar

el sobrenadante, se adicion 100 uL de etanol al 75%,

el producto final se sec y se resuspendi en 100 uL de

agua ultrapura. El producto de ADNfue tratado con un

uL de RNAasa (Fermentas) a 37C durante 60 min.

Finalmente la muestra se almacen a -20C.

Mtodo de Collins et al. (1987), modificado. Se adi-cion un paso inicial de maceracin de la muestra con

nitrgeno lquido, posteriormente, la muestra pulveri-

zada se someti a los pasos descritos en el mtodo de

Collins et al (1987). El producto final se trat con un uL

de RNAasa (Fermentas) a 37C durante 60 min. Las

muestras se conservaron a -20 C hasta la cuantifica-

cin del ADNy la realizacin de la PCR.

Evaluacin de la calidad y cantidad de ADN

Se verific la extraccin del ADN genmico medianteuna electroforesis con gel de agarosa al 0,8%, usando

TBE 1 X (Tris-Borato-EDTA) y el colorante EZ-vision

(Amresco Inc., USA). Se corri a 80 V, durante 45 min.

Adicionalmente el ADN se cuantific en un NanoDrop

1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific

Inc., USA) obteniendo los datos de concentracin de

ADNen ng/uL y la relacin de absorbancias 260/280

nm como ndice de la calidad.

Finalmente la calidad del ADN extrado se verifi-

c a travs de la amplificacin de dos regiones del

ADN cloroplastdico. El espaciador intergnico del

trnH-psbA se amplific usando los oligonucletidos

psbA (5GTTATGCATGAACGTAATGCTC 3) y trnHGUG

(5CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 3) (Hamilton,

1999) y el siguiente perfil trmico: 80 C por 5min, (94

C por 30 s, 56 C por 40 s, 72 C por 1 min) por 35ciclos, 72 C por 10 min. La segunda regin amplifica-

da fue el intrn trnL, usando los oligonucletidos tab

c (5CGAAATCGGTAGACGCTACG3) y tab d (5GGG-

GATAGAGGGACTTGAAC3) (Taberlet et al., 2007) y el

perfil trmico de PCR: 95 C por 10 min, (95 C por 30

s, 50 C por 30 s, 72 C por 2 min) por 35 ciclos.

Para la amplificacin de las dos regiones se utiliz un

volumen final de 50 uL y concentraciones constantes

de otros componentes: 2 mM de MgCl2, 1 X de Bu-

ffer, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 uM de cada primer, 0,4 uL

de Taq polimerasa a 5 U/uL (Fermentas) y un uL de

ADN. Se us como control positivo, una muestra deADNextrada con DNeasy Plant Mini Kit (QIAgen),

para la cual se obtuvo resultados positivos en las am-

plificaciones previas. Los productos de PCRfueron ve-

rificados mediante electroforesis en un gel de agarosa

al 1,2% usando 5uL de la muestra y EZ-vision como

colorante, se corri a 70 V durante 45 min. Los tama-

os de las bandas fueron analizados mediante compa-

racin con el marcador de peso molecular, Generuler

100pb (Fermentas). Las reacciones de amplificacin

se repitieron dos veces, una en el ao 2010 y otra en

el ao 2012 con el fin de verificar la reproducibilidad

de los experimentos.

Anlisis estadstico

Para el anlisis estadstico se utiliz el software SPSS

para Windows, versin 15 (SPSSInc., 2008). Para cada

uno de los mtodos de extraccin, se calcularon las

medias y desviaciones estndar (DS). Para identificar

el mtodo que presenta diferencias significativas en la

concentracin y calidad de ADNse utilizaron las prue-

bas de Tukey y Dunnet (Miller, 1996). Para el anlisis

de las amplificaciones de los marcadores trnH- psbAy

trnLse determin el porcentaje de xito y se utiliz la

prueba de Chi-cuadrado (X2) para establecer si existandiferencias significativas entre los porcentajes obteni-

dos (Halos et al., 2004).

Resultados y discusin

Se logr la extraccin de ADNcon calidad para PCR

a partir de muestras frescas y secas de plantas del g-

nero Solanum (tabla 1). Estos resultados son impor-


4/7


tantes teniendo en cuenta que para la ejecucin de

estudios con marcadores moleculares y en particular

con secuencias, uno de los mtodos ms usado en la

actualidad, es importante contar con ADNde buena ca-

lidad y cantidad. Adems la realizacin de dichos estu-dios incluye muestras frescas provenientes del campo o

muestras secas como las disponibles en los herbarios o

procesadas para conservacin. En la actualidad el xitode iniciativas mundiales como la del cdigo gentico

de barras para identificar plantas, depende del ADNconel cual se inicia el proceso de identidad molecular para

el material vegetal, en particular si se considera que al-

gunos compuestos polifenlicos, azucares de cadenas

largas y otros metabolitos secundarios pueden afectar

el proceso de extraccin y amplificacin de las regionesde inters en algunas plantas (Zhu et al.2006).

Los geles de verificacin de las extracciones mostraron

productos de ADNde buena calidad y sin degradacin

(figura 1). En general, para una misma muestra no se

observ diferencias entre los protocolos, sin embargo,para una muestra procesada con el mtodo de Collinset al.(1987), se obtuvo una banda ms fuerte cuando

se macer con nitrgeno lquido que cuando ste no

se us, lo cual indica, que este procedimiento adicio-nal podra mejorar los resultados como se observ al

realizar lo mismo en un mayor nmero de muestras.

Estudios previos en plantas, mostraron que el uso del

nitrgeno lquido puede mejorar los resultados de la

extraccin (Dellaporta et al.,1983), razn por la cualse implement esta fase en el mtodo de extraccin.

Al aplicar la prueba de Tukey, los resultados obteni-

dos en la concentracin de ADN en ambos mtodo

no mostraron diferencias significativas (P > 0,05) (tabla

1), lo cual indica que en todos los casos fue posible

obtener buena cantidad de ADN, independiente del

estado de la muestra. Al comparar los resultados me-

diante la prueba de Dunett, en dnde se utiliz como

control el resultado con el mtodo comercial, aunque

se encontraron diferencias significativas (P 0,05).

Es importante resaltar que la relacin A260/A280 fue

< 1.5 (tabla 1) para los mtodos evaluados, sugiriendo

la probable presencia de contaminantes, tales como

protenas (Manning, 1991). En algunos casos fue ne-

cesario diluir la muestra a 1:100 para realizar la PCR,

debido a la alta concentracin del ADNen la muestra

y a la posibilidad de inhibidores de la PCR(tabla 1).

En cuanto a la evaluacin mediante PCRse us la am-

plificacin de dos regiones como un indicador de la

concentracin y la calidad del ADNextrado. En esteanlisis se encontraron diferencias significativas entre

los mtodos para los valores de las amplificaciones (X2,

P < 0,05). El mayor porcentaje de xito en la amplifica-

cin de la regin intrn trnLse obtuvo con el mtodo

comercial (89%) seguido por el mtodo de Collins

et al. (1987) (78%) partiendo de la muestra fresca y

macerada con nitrgeno lquido (tabla 2). Para la re-

gin trnH-psbAse obtuvo el mismo resultado en am-

bos mtodos (78%). Los resultados obtenidos con el

mtodo comercial fueron similares a los obtenidos en

otros estudios (Drabkova et al., 2002; Vural, 2009), los

cules demostraron que este mtodo produce ADN

Figura 1.Productos de extraccin de ADN (5uL) usando el mtodo de Collins et al.(1987). Cdigos de las muestras: 1, 2, 3, 4. FN:muestra fresca macerada previamente con nitrgeno.


5/7


de buena calidad para obtener productos de PCR. Es

importante tener en cuenta que la valoracin del m-

todo de extraccin a travs de este parmetro es una

de las ms importantes (Ausubel et al., 2002), raznpor la cual el hecho de obtener productos por PCRa

partir de muestras de ADNprocesadas con el mtodo

casero, permite demostrar la utilidad de este mtodo

en plantas. Adems, al comparar los mtodos evalua-

dos en trminos de costos de los reactivos, los valores

aproximados para cada mtodo son, con el mtodo

comercial de QIAGEN10.000 COPy con el mtodo de

Collins et al.(1987) 1 COP, por cada muestra. Los reac-

tivos requeridos para la preparacin de las soluciones

de trabajo del mtodo casero son mucho ms econ-

micos en comparacin de los costos del kit comercial,

lo que hace que este mtodo sea ms asequible.

Los resultados obtenidos para la regin intrntrnL, uti-

lizando muestras extradas con el mtodo Collins et al.

(1987), indicaron disminucin en el xito de PCRen

el tiempo, mientras que con el mtodo comercial los

resultados se mantuvieron estables. Esto puede deber-

se a que estas ltimas muestras fueron almacenadas

en buffer AE, suministrado en el producto comercial,

Tabla 1. Cuantificacin del ADN extrado.

MtodoConcentracin ng/ul (260nm)Valor mnimo-valor mximo

( DS)ndice de calidad (260/280)Valor mnimo-valor mximo

(DS)

C-S 185,98 - 457,1356,1 a

(90,3)1,02- 1,37

1.22 a

(0.12)

C-F 126,04- 523,9 358,5 a(148,8)

1,14-1,65 1.32 a(0.2)

C-F-N 143,44-851,6421,2 a

(238,9)0,52- 1,72

1.27 a

(0,39)

C-S-N 109.03- 436,21278,3 a

(110,8)1,09 1,48

1.27 a

(0.14)

K-F 21,89- 65,8743,9 b

(15,6)1,06-1,55

1.30 a

(0.2)

K-S 41,09-119,6968,1 b

(25,6)0,83-1,25

1.07 a

(012)

Mtodos: C: mtodo de Collins et al.(1987), K: kit DNeasy, N: muestra macerada con nitrgeno lquido. Muestra: S: hoja seca, F: hoja fresco. Valorespromedios () acompaados por la misma letra no presentan diferencias estadsticamente significativas (P > 0,05).

Tabla 2. Porcentaje de muestras con amplificacin de las regiones intrn trnLy TrnH-PsbA.

MtodoTotal amplificaciones

intrntrnLn=9

%Amplificacin

Total amplificacionesTnrH-PsbA

n=9

%Amplificacin

C-S 6 67 1 11

C-F 6 67 3 33

C-F-N 7 78 7 78

C-S-N 6 67 1 11

K-F 8 89 7 78

K-S 6 67 5 55

Mtodos: C: mtodo de Collins et al.(1987), K: kit DNeasy, N: muestra macerada con nitrgeno lquido. Muestra: S: hoja seca, F: hoja fresco.


6/7


el cual protege a las muestra de la degradacin por

ADNasas y mantiene el pH constante, brindando ma-

yor estabilidad de la muestra en el tiempo. Debido a

que las muestras con el mtodo Collins et al. (1987)

se resuspendieron en agua, se recomienda el uso debuffer TE para trabajos que requieran almacenar mues-

tras de ADNpor largos periodos de tiempo (Micklos

y Freyer, 2003). Por otro lado, se observ que para

algunas muestras procesadas con el mismo protocolo,

la amplificacin de la regin intrn trnLtuvo mejoresresultados que la regin trnH-psbA. Esto puede tener

relacin con el diseo de los oligonucletidos de la

regin trnH-psbAque al no ser especficos del grupode estudio, no permitieron obtener mejores resultados

que los observados.

Finalmente, se sugiere con base en los resultados que el

mtodo de Collins et al.(1987) permite obtener produc-

tos deseables en la extraccin de ADN, con buena canti-

dad a un menor costo y sin riesgos para la salud. El mayor

rendimiento en la amplificacin de regiones por PCRseobtuvo al macerar la muestra con nitrgeno lquido y di-

luir los productos de la extraccin (figura 2). Por lo tanto

este mtodo se recomienda para el estudio taxonmico

y sistemtico de plantas del gnero Solanum.

Conclusin

Se us con xito el producto comercial DNeasyPlant Mini Kit para extraer y amplificar ADNde plantas

del subgnero Leptostemonun. As mismo se encontr

que el mtodo de Collins et al. (1987) nunca antes

utilizado en plantas en Colombia, permiti obtener re-

sultados comparables en extraccin y amplificacin. A

partir de muestras secas o frescas y pequeas cantidades

de tejido (0,02g - 0,1g) se obtuvo entre 278,3 ng/uL y

421,2 ng/uL de ADNy se amplificaron fragmentos de las

regiones del espaciador intergnico trnH-psbAe intrn

trnL. La maceracin con nitrgeno lquido y la muestra

fresca mejoraron los resultados. A pesar de que los datos

obtenidos sugieren mejores resultados para el mtodo

comercial, el mtodo de Collins et al. (1987) es ms eco-

nmico, produce ADNde buena calidad, y un mnimo

riesgo para la salud humana y el medio ambiente. Por

esta razn se seleccion para los trabajos de la lnea de

taxonoma molecular del grupo de investigacin.

Agradecimientos

A la Direccion de Investigaciones DIMEUniversidad

Nacional de Colombia, sede Medelln, proyecto cdi-

go Quip- 2010100954 por la financiacin. y al Gru-

po de Investigacin en Sistemtica Molecular. A Jorge

Mario Vlez del Herbario de MEDELde la Universidad

Nacional de Colombia, por la colaboracin en la iden-

tificacin del material vegetal.

Referencias bibliogrficas

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G.,

Smith, J.A., Struhl, K. 2002. Short protocols in molecular biolo-

gy: a compendium of methods from Current protocols in mole-

cular biology. Hoboken. NJ: John Wiley & Sons, Inc.

Chah, K.F., Muko, K.N., Oboegbulem, S.I. 2000. Antimicrobial acti-

vity of methanolic extract of Solanum torvum fruit. Fitoterapia.

71: 187189.

Collins, F.H., Mendez, M.A., Rasmussen, M.O., Mehaffey, P.C., Be-

sansky, N.J., Finnerty, V. 1987. A ribosomal RNA gene probe

Figura 2. Productos de amplificacin del marcador trnH-psbA, ADN obtenido con el mtodo de Collins et. al. (1987) usandomuestra fresca macerada con nitrgeno lquido. Gel de agarosa al 1,2%. Carriles: M: Marcador de peso molecular de 100 pb. C+:Control positivo. A-J: Cdigos de las muestras.


7/7


differentiates member species of the Anopheles gambiaecom-

plex. The American journal of tropical medicine and hygiene.

37: 37.

Dellaporta, S.L., Wood, J., Hicks, J.B., 1983. A plant ADN miniprepa-

ration: Version II. Plant Molecular Biology Reporter. 1, 1921.

Doyle, J. 1987. A rapid ADN isolation procedure for small quantities

of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19: 1115.

Drabkova, L., Kirschner, J.A.N., Vlek,. 2002. Comparison of seven

ADN extraction and amplification protocols in historical herba-rium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter.

20: 161175.

Giraldo S, C.E., Uribe S, S.I. 2010a. Solanum hirtumas a host plant

for Mechanitis menapis menapis (Lepidoptera: Ithomiinae) in

Colombia. Revista Colombiana de Entomologa. 36: 169171.

Giraldo S, C.E., Uribe S, S.I. 2010b. Registro de Mechanitis polym-

nia(Lepidoptera: Ithomiinae) en Solanum jamaicensey ciclo de

vida en laboratorio. Revista Colombiana de Entomologa. 36:

165168.

Gmez, L.M., Giraldo, C., Lpez, A., Uribe, S. 2009. Diferenciacin

morfolgica y molecular de Oleria makrena (Hewitson) y Ole-

ria fumata (Haensch) (Lepidoptera: Ithomiinae); Molecular and

morphological differentiation of Oleria makrena (Hewitson)

and Oleria fumata (Haensch) (Lepidoptera: Ithomiinae). Neo-

tropical entomology. 38: 616623.

Halos, L., Jamal, T., Vial, L., Maillard, R., Suau, A., Le Menach, A.,

Boulouis, H.J., Vayssier-Taussat, M. 2004. Determination of an

efficient and reliable method for ADN extraction from ticks.

Veterinary research. 35: 709713.

Hamilton, M.B. 1999. Four primer pairs for the amplification of chlo-

roplast intergenic regions with intraspecific variation. Molecular

Ecology. 8: 521523.

Hoyos, R., Uribe, S., Vlez, I. 2012. Tipificacin de especmenes

colombianos de Lutzomyia longipalpis(Diptera: Psychodidae)

mediante Cdigo de Barras. Revista Colombiana de Entomo-

loga. 38: 134140.

Kuo, K.W., Hsu, S.H., Li, Y.P., Lin, W.L., Liu, L.F., Chang, L.C., Lin,

C.C., Lin, C.N., Sheu, H.M. 2000. Anticancer activity evaluation

of the Solanum glycoalkaloid solamargine: Triggering apopto-

sis in human hepatoma cells. Biochemical pharmacology. 60:

18651873.

Levin, R.A., Myers, N.R., Bohs, L. 2006. Phylogenetic relationships

among the spiny solanums(Solanum subgenus Leptostemo-

num, Solanaceae).American Journal of Botany. 93: 157169.

Manning, K. 1991. Isolation of nucleic acids from plants by differen-

tial solvent precipitation.Analytical biochemistry. 195: 4550.

Marn, M.A., Lpez, A., Uribe, S.I. 2012. Interspecific variation in

mitochondrial serine transfer RNA (UCN) in Euptychiina but-

terflies(Lepidoptera: Satyrinae): Structure and alignment. Mito-

chondrial. ADN 23: 208215.

Medina, C., Ins, C., Lobo Arias, M., Martnez, B. 2009. Revisin

del estado del conocimiento sobre la funcin productiva del

lulo (Solanum quitoenseLam.) en Colombia. Revista Corpoica:

Ciencia y Tecnologa Agropecuaria. 10: 167179.

Miller, R.G. 1996. Simultaneous Statistical Inference. McGraw-Hill.

New York, pp. 272 .

Miz, R.B., Mentz, L.A., Souza-Chies, T.T. 2008. Overview of the

phylogenetic relationships of some southern Brazilian species

from section Torva and related sections of spiny Solanum (So-

lanum subgenus Leptostemonum, Solanaceae). Genetica. 132:

143158.

Micklos DA, Freyer GA. ADN science. 2003. In: Crotty D, editor.

New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Niu, C., Kebede, H., Auld, D.L., Woodward, J.E., Burow, G., Wright,

R.J. 2010. A safe inexpensive method to isolate high quality

plant and fungal ADN in an open laboratory environment.Afri-

can Journal of Biotechnology. 7(16) : 2818-2822 .

Soto, S.I.U., Lehmann, T., Rowton, E.D., Vlez B, I.D., Porter, C.H.

2001. Speciation and Population Structure in the Morphospe-

cies Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) as Derived from the

Mitochondrial ND4 Gene. Molecular Phylogenetics and Evolu-

tion.18: 8493.

Spooner, D.M., Van Den Berg, R.G., Rivera-Pea, A., Velguth, P., Del

Rio, A., Salas-Lpez, A. 2001. Taxonomy of Mexican and Cen-

tral American members of SolanumSeries Conicibaccata (sect.

Petota). Systematic botany. 26: 743756.

Taberlet, P., Coissac, E., Pompanon, F., Gielly, L., Miquel, C., Va-

lentini, A., Vermat, T., Corthier, G., Brochmann, C., Willerslev,

E. 2007. Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA)

intron for plant ADN barcoding. Nucleic Acids Research. 35:

e14e14.

Turci, M., Sardaro, M.L.S., Visioli, G., Maestri, E., Marmiroli, M.,

Marmiroli, N. 2010. Evaluation of ADN extraction procedures

for traceability of various tomato products. Food control. 21:

143149.

Valter de Oliveira, L.F., Wallau, G.L., Silva Loreto, E.L. 2009. Isolation

of high quality ADN: a protocol combining rennet and glass

milk. Electronic Journal of Biotechnology. 12: 1112.

Vural, H.C. 2009. Genomic ADN isolation from aromatic and me-

dicinal plants growing in Turkey. Scientific Research Essays. 4:

5964.

Weese, T.L., Bohs, L. 2007. A Three-Gene Phylogeny of the Genus

Solanum (Solanaceae). Systematic Botany. 32: 445463.

Whalen, M.D., Costich, D.E., Heiser, C.B. 1981. Taxonomy ofSola-

numsection lasiocarpa. Gentes Herb.(Ithaca) 12: 41129.

Yousaf, Z., Shinwari, Z.K., Khan, M.A. 2010. Phenetic Analysis of

Medicinally Important Species Of The Genus Solanum From

Pakistan. Pakistan Journal of Botany. 42: 18271833.

TY. Zhu, B. Wang, Q.Guo, 2006. Isolate high quality DNA from va-

rieties of plant specimens with E.Z.N.A.TM plant DNA systems

from Omega Bio-Tek. 1011.

Documents

Diseño Esperimental Articulo