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Diversidad génica y grupos de compatibilidad vegetativa en Fusarium oxysporum causante de marchitez en agave (Agave tequilana Weber var. azul)

Genetic diversity and vegetative compatibility groups in Fusarium oxysporum cause of wilt symptoms in agave (Agave tequilana Weber var. azul)

MARTÍN EDUARDO ÁVILA-MIRANDA1*, CAROLINA LEÓN-CAMPOS1, JUAN JOSÉ PEÑA-CABRIALES5, MARTHA ALICIA RODRÍGUEZ-MENDIOLA3, NORMA ALEJANDRA MANCILLA-MARGALLI4, FABIOLA GONZÁLEZ-PÉREZ1 & CARLOS ARIAS-CASTRO2

1Laboratorios de Fitopatología Molecular, 2Análisis Instrumental Bioquímico, 3Biotecnología Vegetal y 4Bioquímica Vegetal. DEPI del Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jalisco. Km 10 Carretera a San Miguel Cuyutlán, Tlajomulco de Zuñiga, Jal. CP 45640. México.5Laboratorio de Microbiología Ambiental. CINVESTAV Campus Guanajuato. Km 9.6 Libramiento Norte, Irapuato, Gto. México.*avilamiranda@yahoo.com

RESUMEN

Veinticinco cepas de Fusarium oxysporum, aisladas del tallo de plantas de agave con o sin síntomas de marchitez, se analizaron en su diversidad mediante: Secuencia del fragmento intragénico ITS1; Marcador molecular de DNA BOX-PCR y Grupos de Compatibilidad Vegetativa. La secuencia del ITS1 indicó que, a pesar de que todos los aislados se identifi caron previamente como F. oxysporum, una mutación puntual en la secuencia de quince de ellas hace que difi eran claramente respecto a secuencias reportadas para este fragmento en cepas fi topatogénicas de F. oxysporum en la base de datos del GenBank. Sin embargo, la secuencia de nueve cepas coincide ampliamente con las secuencias de F. oxysporum de diferentes formae speciales. El análisis de disimilaridad de sus huellas BOX-PCR indicó que doce de las dieciséis cepas evaluadas mostraron huellas génicas similares y forman parte de un mismo grupo de diversidad y las nueve restantes formaron un grupo diferente. Se determinó la presencia de dos Grupos de Compatibilidad Vegetativa, integrados con sólo cepas del grupo de diecisiete aislados; las nueve cepas restantes no evidenciaron compatibilidad vegetativa. Este estudio indicó que existe un grupo de cepas de F. oxysporum, dentro de las que se incluyen dos positivas a pruebas de patogenicidad capaces de inducir síntomas de marchitez en agave, que constituyen una población homogénea producto de co-evolución patógeno-hospedero.

PALABRAS CLAVE: Marchitez del agave, BOX-PCR, ITS1, Tequila.

ABSTRACT

Twenty fi ve strains of Fusarium oxysporum obtained from stems of agave (Agave tequilana Weber var. azul) plants with and without wilt symptoms, where analyzed in their diversity with: ITS1 sequence, DNA molecular marker BOX-PCR and Vegetative Compatibility Groups. ITS1 sequence indicated that in spite of all isolates where previously identifi ed like F. oxysporum, a punctual mutation on fi fteen of them make that differ from the most of seventy reports of plant pathogenic F. oxysporum complex reported in the GenBank. On the other hand, the taxonomic report of nine of them where very coincident with more of seventy reports included different formae speciales. The dissimilarity analysis of BOX-PCR fi nger prints indicted that sixteen teen of them, where very similar included the fi fteen with the punctual mutation and the other nine strains conform other similarity group. Two vegetative compatibility groups where conformed with only strains of the fi fteen group with the punctual mutation.This work evidence that exists a group of F. oxysporum strains, included two positive to patogenicity test to agave, capable to induce wilt symptoms, that constitute an homogeneous group that could be result of plant-pathogen co-evolution.

KEYWORDS: Agave wilt, BOX-PCR, ITS1, Tequila.

ISSN 0016-5301Gayana Bot. 69(Número Especial): 40-48, 2012

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Diversidad génica en Fusarium oxysporum. AVILA-MIRANDA, M.E. ET AL.

INTRODUCCIÓN

En el cultivo de agave (Agave tequilana Weber var. azul), que es la materia prima para la elaboración del tequila, existe una seria limitante para su producción que es la enfermedad denominada “marchitez del agave” o “pudrición del tallo” (Aceves 1999; CRT 2005). De acuerdo a reportes del Consejo Regulador del Tequila A.C., dentro de la zona autorizada para la siembra de agave no existían en 2008 regiones libres de la enfermedad y en zonas como Cienega, Centro y Tequila, su incidencia alcanzó hasta el 40% de las plantas establecidas (CRT 2008 y Flores 2010). Desde hace algunos años, se considera al hongo Fusarium oxysporum Schltdl. f.sp. vasinfectum W.C. Snyder & H.N. Hansen como su agente causal (Luna 1998). Los fi topatógenos de esta especie afectan de manera casi específi ca los haces vasculares del xilema, provocando enfermedades denominadas marchiteces, además, tienen un limitado número de especies vegetales hospederas (Beckman 1987 y Kistler 2001). Para su identifi cación, por ser insufi cientes sólo sus características morfológicas, se agrega invariablemente el criterio de fi topatogenicidad. (Hawksworth 1995). A esta especialización patogénica se le denomina formae speciales (f. sp.), por ejemplo, los aislados de F. oxysporum f. sp. lycopersici afectan principalmente al cultivo de tomate, F. oxysporum f. sp. vasinfectum afecta al cultivo de algodón y F. oxysporum. f. sp. dianthi afecta al cultivo de zanahoria, entre cerca de 100 formas especiales reportadas (Armstrong & Armstrong 1981). Considerando que en las plantas de agave con incidencia de “marchitez”, es muy frecuente encontrar, asociado a este síntoma, la presencia de una fuerte necrosis en la base del tallo y la corona, que es un síntoma poco común de inducirse por aislados patogénicos de F. oxysporum, en el año 2005, se procedió a corroborar la patogeneicidad de un grupo de aislados de F. oxysporum obtenidos de tallo de plantas de agave. El estudio anterior corroboró en invernadero, la inducción de una marchitez de tipo vascular en plantas de agave procedentes de cultivo in vitro, evidenciándose que ciertas cepas infringían fuerte daño en los haces del xilema, pero sin provocar la necrosis masiva de raíces observadas en campo (López 2008). Adicionalmente, se apreció una virulencia cepa-dependiente, que concuerda con reportes de aislados de F. oxysporum con hábitos de endófi tos que son capaces de colonizar tallos de plantas no susceptibles, sin inducir síntomas (Macia-Vicente et al. 2008, Summerell & Leslie 2004).

Desde los años 80´, en más de 30 formae speciales de F. oxysporum, se han realizado estudios sobre diversidad en Grupos de Compatibilidad Vegetativa (GCV) y se basan en el hecho de que las hifas de dos aislados diferentes pueden anastomosarse y fusionarse para formar heterocariontes estables; estas cepas, se dice, son vegetativamente compatibles y pertenecen al mismo GCV. La compatibilidad

vegetativa tiene bases multigénicas y puede utilizarse para identifi car grupos de aislados que compartan alelos comunes de estos genes vic. Estudios detallados indican que aislados de F. oxysporum que pertenecen al mismo GCV, típicamente poseen haplotipos multigénicos muy similares o idénticos, por lo que pueden ser buenas herramientas para evidenciar linaje clonal, similaridad génica o ambos (Keith & Correll 2001).

La población de una forma especial de F. oxysporum puede conformar con sólo un GCV, como en el caso de F. oxysporum de la f. sp. albedenis, conglatinans o canariensis, asumiéndose que constituyen una población clonal monofi lética. Sin embargo, en otras formas especiales como F. o. f. sp. cubense, melonis olycopersici, se aprecia la misma diversidad respecto a clonalidad, pero con dos o más linajes, lo que da lugar a la conformación de varios GCV dentro de ésta (Kistler et al. 1998).

El presente estudio se encaminó a comparar la secuencia del segmento intragénico ITS1 de veinticinco aislados de F. oxysporum, así como defi nir su diversidad génica analizando huellas BOX-PCR obtenidas de ADN total, con el fi n de encontrar evidencia de homología entre aislados de F. oxysporum que están provocando marchitez, que permitiera diferenciarlos de aislados endófi tos. Así mismo, como un complemento a este análisis y como apoyo a futuros estudios epidemiológicos, se buscó defi nir la existencia de grupos de compatibilidad vegetativa entre estos veinticinco aislados de F. oxysporum, considerando que previamente en algunos de ellos se había corroborado su fi topatogenicidad como causa de marchitez de tipo vascular en agave.

MATERIALES Y MÉTODOS

ORIGEN DE LOS AISLADOS DE F. OXYSPORUM

Los veinticinco aislados de F. oxysporum que sirvieron como base para este estudio se obtuvieron de tejido vascular de tallos de 131 plantas de agave con diferente nivel de severidad del síntoma de marchitez, que estaban localizadas en ocho campos comerciales en cuatro municipios del estado de Jalisco y dos municipios del estado de Nayarit en el occidente de México (Tabla I). Los aislados fueron purifi cados como cultivos monospóricos y previamente había sido corroborada su ubicación taxonómica a especie, aplicando las metodologías reportadas por Booth (1971) y Leslie & Summerell (2006).

SECUENCIACIÓN DEL FRAGMENTO ITS1De los 25 aislados de F. oxysporum se obtuvo micelio sembrándolos en cajas de Petri con medio papa dextrosa agar (PDA), cubierto superfi cialmente con una película de celofán dulce estéril, lo que permitió colectar con una aguja de disección el micelio formado sobre el celofán, después de diez días de crecimiento. Se extrajo ADN del micelio,

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realizando una doble extracción con fenol-cloroformo, eliminado el ARN presente incubándolo por 30 min con la enzima RNAsa A (Invitrogen Cat. 12091-021). Enseguida se amplifi có el fragmento ITS1, utilizando el iniciador ITS1 con la secuencia 5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’ y el iniciador ITS2 con la secuencia 5’ GCTGCGTTCTTCATCGATGC 5’ (Glass & Donaldson 1995), realizando la amplifi cación en un termociclador Corbett® modelo Palm Cicler con un programa de amplifi cación cuyas condiciones fueron: 94 ºC por 2 min; treinta ciclos de 94 ºC por 1’, 58 ºC por 1’ y 72 ºC por 1’ y un paso fi nal de 66 ºC por 4 min. Para todos los fragmentos amplifi cados se obtuvo una alícuota de 50 μl de producto de PCR, este producto fue purifi cado utilizando el kit para purifi cación de producto de PCR QIAquick® (Cat. 28106), con el fi n de mejorar las características del fragmento amplifi cado y proceder a su secuenciación. Los fragmentos purifi cados fueron enviados para su secuenciación a la Unidad de Servicios Genómicos, del Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad en CINVESTAV-campus Guanajuato, México. Después de recibidos los electroferogramas, los archivos fueron analizados con el programa BioEdit ver. 4.8.9 Sequence Alignment Editor NC University, lo que permitió obtener archivos FASTA de las mismas. Secuencias de ciento setenta bases de las del fragmento ITS1 fueron comparadas con las de Fusarium disponibles en las bases de datos del GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés), con el fi n de obtener reportes taxonómicos de estas secuencias, con base a su homología

con las reportadas en esta base de datos, utilizando el programa BLASTN, con la opción de secuencias altamente similares (MEGABLAST). Para lograr conocer las regiones conservadas y diversas dentro de las secuencias obtenidas, se alinearon todas éstas, utilizando el programa BioEdit sequence alignment editor con la aplicación Clustal W para alineamiento múltiple (Hall 1999).

GRUPOS DE COMPATIBILIDAD VEGETATIVA

Con el fi n de determinar la presencia de grupos de compatibilidad vegetativa entre los veinticinco aislados de F. oxysporum, a partir de los aislados silvestres, se procedió a generar mutantes nit- que fueran incapaces de utilizar nitrato como única fuente de nitrógeno. Para esto, los aislados se cultivaron en un medio basal, adicionado con un 1,5% de clorato de potasio (McCallum et al. 2001). Después de estar creciendo por algunos días, se detectaron en la periferia de la colonia áreas de crecimiento micelial con una morfología de crecimiento abultado, que contrastaban con el micelio escaso y delgado que se observó inicialmente en la colonia. Estas áreas de crecimiento aparente normal eran potencialmente zonas de crecimiento de micelio mutado, muy probablemente nit-, esto se corroboró cultivando un fragmento de este micelio en medio basal adicionado con 3 g de nitrato de sodio (Sigma® S8170) por litro, como única fuente de nitrógeno; si en este medio se observaba crecimiento micelial lento y escaso, se consideraba que la cepa era nit-. Para cada aislado se trató de generar dos tipos de mutantes nit-, que se clasifi caron de acuerdo al

TABLA I. Relación de aislados de Fusarium oxysporum obtenidos de tejido del tallo de plantas de agave (Agave tequilana Weber var. azul), ubicadas en campos agrícolas comerciales con alta incidencia de marchitez de zonas productoras de los estados de Jalisco y Nayarit en el occidente de México.

TABLE I. List of Fusarium oxysporum isolates obtained from agave (Agave tequilana Weber var. azul) plants stem in commercial crops with high incidence of agave wilt in production zones of Jalisco and Nayarit states, in west México.

CLAVE PREDIO Y MUNICIPIO CLAVE PREDIO Y MUNICIPIO F Bajío Sur, Arenal, Jal. U Novillero, Tala, Jal.J Las Lajitas, Teuchitlán, Jal. 21 Novillero, Tala, Jal.K Novillero, Tala, Jal. 22 Las Lajitas, Teuchitlán, Jal.L Novillero, Tala, Jal. 23 El Zapote, Acatic, Jal.M Bajío Sur, Arenal, Jal. 24 El Zapote, Acatic, Jal.N Barrosas, Sta. Ma. del Oro, Nay. 25 Las Lajitas, Teuchitlán, Jal.Ñ Novillero, Tala, Jal. 26 El Zapote, Acatic, Jal.O Sta. Rosa, Tepic, Nay. 27 La Cañada, Tala, Jal.P Ojo Zarco, Magdalena, Jal. 29 Ojo Zarco, Magdalena, Jal.Q Bajío Sur, Arenal, Jal. 30 Las Lajitas, Teuchitlán, Jal.R La Cañada, Tala, Jal. 31 El Zapote, Acatic, Jal.S Las Lajitas, Teuchitlán, Jal. 34 Bajío Sur, Arenal, Jal.T La Cañada, Tala, Jal.

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uso de dos fuentes de nitrógeno alternas, mutantes nit1 se consideraba a los que crecían normalmente en medio basal adicionado con nitrito de sodio (Sigma® S2252), lo mismo que en medio basal adicionado con hipoxantina (Sigma® H9377); y mutantes nitM se consideraban aquellos que crecían normalmente en medio basal adicionado con nitrito de sodio, pero tenían crecimiento lento y escaso en medio adicionado con hipoxantina, esto basado en la metodología propuesta por Leslie & Summerell (2006). De cada mutante se generó un cepario sobre papel fi ltro estéril, colonizado por el micelio esporulado de la cepa al crecer en medio basal adicionado con nitrito de sodio, estos fragmentos de papel fi ltro se mantuvieron secos a 4ºC. Para obtener suspensiones conidiales de los mutantes, para actividades posteriores, se cortaba un círculo de aproximadamente 5 mm de diámetro del papel fi ltro colonizado por la cepa de interés y se sumergía en 1 ml de agua destilada estéril en un tubo tipo eppendorf estéril, agitando en vortex por 1 min (McCallum et al. 2001).

Para evaluar la compatibilidad vegetativa, primeramente se confrontaron entre sí los mutantes nit1 y nitM de cada una de las cepas, que deberían ser autocompatibles, en caso de que no se presentara la autocompatibilidad, se volvían a generar estos mutantes. Posteriormente se realizó la confrontación entre todos los mutantes nit1 y todos los nitM de los diferentes aislados. Esta confrontación se realizó en placas estériles de poliestireno de 96 cavidades (Corning Costar®3595) con pozos de 200μl de capacidad, distribuidos en 12 columnas y 8 fi las, en las que todas sus cavidades se llenaban con 100μl de medio de cultivo basal adicionado con nitrato de sodio, y ya solidifi cado, se adicionaban 20 μl de la suspensión conidial de un mutante nit1 que se colocaba en todas las cavidades de una columna determinada y 20 μl de conidias de un mutante nitM, que se colocaba en las todas cavidades de una fi la. Después de sembrada, la placa tenía la combinación de las conidias de 11 mutantes nit1 que se confrontaban con las conidias de 7 mutantes nitM, ya que como control, a la última columna, sólo se le adicionaban las conidias de los 7 mutantes nitM y a la última fi la sólo se le adicionaban las conidias de los 11 mutantes nit1. Se asumía que existía compatibilidad vegetativa entre los mutantes nit1 y nitM, cuando en la cavidad en la que se habían combinado las conidias de las dos cepas mutantes se apreciaba un crecimiento micelial abundante, lo que evidenciaba que se había revertido la mutación al formarse células heterocariontes. Por el contrario, si el crecimiento micelial dentro del pozo era evidentemente limitado y translucido, se asumía que las cepas eran incompatibles. Los últimos pozos de cada fi la o columna, contenían sólo las conidias de un nit1 o un nitM, respectivamente, que invariablemente deberían conservar su crecimiento escaso, lo se consideraba como control de su condición de nit-. Las placas fueron evaluadas en tres ocasiones, a los 5, 7 y 9 días de haberse sembrado, registrando las características

de los crecimientos en las cavidades en cada fecha. Los mutantes nitM o nit1 de cada aislado fueron individualmente confrontados contra los mutantes nit1 y nitM del resto de los aislados, determinando de esa manera los grupos de compatibilidad vegetativa.

HUELLAS GÉNICAS BOX-PCR

Aun cuando veintiuno de los aislados de F. oxysporum habían sido previamente analizados con el marcador molecular de ADN REP-PCR, con el iniciador BOXA1R con la secuencia 5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG3-’, en este estudio se volvieron a analizar los 25 aislados con la variante que en esta ocasión la tinción se realizó con el colorante para DNA SYBRSafe® (Invitrogen S33102) a razón de 1μl del colorante por cada 10 ml de volumen del gel de electroforesis previo a su gelifi cación. La amplifi cación se realizó con el termociclador antes mencionado, utilizando el protocolo propuesto por Rademaker & De Brujin (1997) que inicia con un paso de incubación de 7 min a 94 ºC; 30 ciclos de 1 min a 94 ºC; 1min a 53 ºC y 8 min a 65 ºC; terminando la reacción con un paso de 16 min a 65 ºC. Las huellas génicas se obtuvieron realizando una electroforesis a 4 ºC por 22 h, a 40 mA y 40V con TAE al 0,5%. Se utilizó un gel de agarosa al 2% de 15 x 17 cm elaborado con TAE al 1%. Las amplifi caciones fueron visualizadas utilizando un transiluminador de luz azul DarkReader®. Las imagenes de las huellas génicas fueron digitalizadas utilizando una cámara Canon® A640 con fi ltro ámbar a 480 nm. El análisis de la disimilaridad de las huellas se realizó a partir de una matriz de presencia –ausencia, determinando el tamaño de las bandas en una huella, respecto al marcador de peso molecular de 1 kb plus de Invitrogen®. Esta matriz estandarizada fue analizada con el programa NTSYSpc ver 2.02 de Applied Biostatic, Inc. con el método de agrupamiento UPGMA y coefi ciente de distancia promedio Manhatan.

RESULTADOS

DIVERSIDAD EN EL FRAGMENTO ITS1Con los iniciadores ITS1 e ITS2 se amplifi có un fragmento de un tamaño aproximado de 220 pb, que corresponde al fragmento intragénico ITS1. Las secuencias fueron agregadas a la base de datos del GenBank con la clave BankIt1404255 y los siguientes números de acceso: FoF HQ530540, FoJ HQ530541, FoK HQ530542, FoL HQ530543, FoM HQ530544, FoN HQ530545, FoNn HQ530546, FoO HQ530547, FoP HQ530548, FoR HQ530549, FoQ HQ530550, FoS HQ530551, FoT HQ530552, FoU HQ530553, Fo21 HQ530554, Fo22 HQ530555, Fo23 HQ530556, Fo24 HQ530557, Fo25 HQ530558, Fo26 HQ530559, Fo27 HQ530560, Fo29 HQ530561, Fo30 HQ530562, Fo31 HQ530563, Fo34 HQ530564. Al comparar la secuencia de este fragmento con

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la base de datos de hongos del GenBank, el análisis indico que las cepas J, K, L, N, Ñ, O, P, R, U, 21, 22, 24, 25, 29 y 31, de manera generalizada, tenían alta similitud con solo 2 a 4 secuencias reportadas como hongos incluidos dentro del complejo Fusarium oxysporum. Por su parte, la secuencia del fragmento ITS1 de los aislados F, M, Q, S, T, 23, 26, 27, 30 y 34, tenía por lo general alta similitud con la secuencia de hasta 79 hongos reportados como pertenecientes al complejo F. oxysporum; adicionalmente el reporte asociaba alta similitud de estas cepas con 5 o 6 reportes específi cos a formas especiales de F. oxysporum, donde se incluían las f. sp. gladioli, loti, lentis, vasinfectum, cubense, strigare y lycopersici. Comparando entre si el fragmento ITSI de las veinticinco secuencias alineadas, se detectó que en la mayor parte de la secuencia, salvo algunas deleciones, las cepas eran idénticas, sin embargo se aprecia en la Tabla II que en la base ubicada en la posición 18 de esta secuencia, se detectó una mutación puntual que consistía en la presencia de una Adenina para 15 de los aislados y una Citosina en esta misma posición para el restante grupo de 10 aislados. Esta información contrastaba con las secuencias reportadas

para aislados de F. oxysporum, ya que en éstas, comúnmente se encontraban una citosina en esta posición, tomando como referencia la base de datos de hongos de la NCBI.

GRUPOS DE COMPATIBILIDAD VEGETATIVA

Se obtuvieron mutantes nit1de los 26 aislados de F. oxysporum del cepario y se obtuvieron sólo 17 mutantes nitM a partir de este mismo grupo de aislados. Al hacerse la confrontación de los mutantes nit1 con los mutantes nitM, en placas de 96 pozos con medio adicionado con nitrato, se apreció la compatibilidad entre aislados que se presenta en la Tabla III. Esta concentración de resultados de confrontación indica la presencia de dos grupos de compatibilidad vegetativa entre los 25 aislados; uno de ello denominado grupo grande, incluye a las siguientes trece cepas: J, K, L, N, Ñ, O, R, U, 21, 22, 24, 25 y 31. Y un segundo grupo, denominado grupo P, incluye a esta cepa y a la cepa 29. Adicional a los grupos de compatibilidad, se puede apreciar que un grupo de diez cepas no evidenciaron compatibilidad con ningún otro aislado, este grupo incluyó las cepas F, M, Q, S, T, 23, 26, 27, 30 y 34.

TABLA II. Secuencia de los primeros nucleótidos del fragmento ITS1 del aislado “F” de Fusarium oxysporum, donde se puntualizan las diferencias de este respecto al mismo segmento de veinticuatro aislados adicionales de la misma especie, todos obtenidos de tallo de agave (Agave tequilana Weber var. azul). La secuencia restante para completar el fragmento fue similar en todos los aislados.

TABLE II. Sequence of fi rst nucleotides of ITS1 fragment of “F” isolate of Fusarium oxysporum and differences in sequence respect to twenty four additional isolates of the same specie, all of them obtained from agave (Agave tequiana Weber var. azul) stem. The complement of the sequence in the segment was similar in all of them.

10 20 30 40 50 60FoF_pITS4 CCCCTGTGAA CATACCACTT GTTGCCTCGG CGGATCAGCC CGCTCCCGGT AAAACGFoJ_pITS1 AFoK_pITS1 AFoL_pITS1 AFoM_pITS1FoN_pITS1 AFoN~_pITS1 AFoO_pITS1 AFoP_pITS1 AFoR_pITS1 -AFoQ_pITS1FoS_pITS1FoT_pITS1 TFoU_pITS1 -AFo21_pITS1 AFo22_pITS1 AFo23_pITS1 -Fo24_pITS1 AFo25_pITS1 AFo26_pITS1Fo27_pITS1Fo29_pITS1 AFo30_pITS1 ATAGCTFo31_pITS1 AFo34_pITS1

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TABLA III. Concentrado de resultados de confrontaciones entre mutantes nit- (incapaces de utilizar nitrato como fuente de nitrógeno), generados a partir de cepas de Fusarium oxysporum aislados de tallo de agave (Agave tequilana Weber var. azul), subclasifi cados en nit1 y nitM, en el cual se pueden identifi car dos grupos de compatibilidad vegetativa, de acuerdo a observaciones de reversión del fenotipo mutante en placas con medio basal adicionado con nitrato.

TABLE III. Concentrate results of confrontations between nit- (nitrate nonutilizing mutants) generated from Fusarium oxysporum isolates obtained from agave (Agave tequilana Weber var. azul) stem, classifi ed in nit1 and nitM. In it can be identifi ed two vegetative compatibility groups with the reversion of the mutant phenotype in basal media added with nitrate.

MU

T

A

N

T

E

S

nit

M

MUTANTES nit1

F J K L M N Ñ O P Q R S T U 21 22 23 24 25 26 27 29 30 31 34

F a

J

K Cb C C C C C C C C C C C C

L C C C C C C C C C C C C C

M

Ñ C C C C C C C C C C C C

O C C C

P C C

R C C C C C C C C C C C C C

S

U C C C C C C C C C C C C C

22 C C C C C C C C C C C C

23

24 C C C C C C C C

29 C C

30 C

a Cepas no compatibles.b Cepas compatibles.

HUELLAS GÉNICAS OBTENIDAS CON EL PRIMER BOXA1RAl realizar la amplifi cación con el primer BOXA1R, en su electroforesis se evidenciaron bandas amplifi cadas en un rango de las 180 a las 2.200 pb usando como referencia el marcador 1 Kb Plus de Invitrogen® (Figs. 1-2), en estas huellas se aprecia claramente que existen aislados con huellas casi idénticas que contrastan con las huellas de bandeo principalmente más pequeño en pares de bases o algunas con patrón de bandeo de fragmentos mayores. La cepa 30 parece compartir un patrón de bandeo intermedio entre los dos patrones descritos. Al generarse el dendrograma para grafi car la disimilaridad entre huellas, se confi guraron

varios grupos de diversidad considerando un coefi ciente de disimilaridad superior a 0,49 como se muestra en la Figura 3. En este dendrograma se aprecia la conformación de un grupo, muy similar, integrado por las cepas K, L, N, Ñ, O, P, R, U, 21, 22, 24 y 25; en este mismo grupo, pero con una disimilaridad mayor, se ubican las cepas J, 30, 29 y 31. El resto de los grupos está conformado por las cepas F, M, Q, S, T, 23, 26, 27y 34; que aun cuando las cepas M y S son muy similares, en general los grupos tienden a ser muy diversos considerando el análisis de las huellas génicas generadas con BOX-PCR.

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FIGURA 2. Huellas génicas generadas por el marcador molecular de ADN BOX-PCR a partir de otro grupo aislados de Fusarium oxysporum obtenidos de tallos de plantas de agave (Agave tequilana Weber var. azul) de diferentes predios comerciales de producción, en donde se aprecian diferencias evidentes en el patrón de bandeo de algunos de ellos respecto al marcador de peso molecular 1 kb plus de Invitrogen®.

FIGURE 2. Genetic fi nger prints obtained by BOX-PCR molecular DNA marker from other group of Fusarium oxysporum isolates of stem of agave (Agave tequilana Weber var. azul) in commercial crops, in it is appreciated different banding patterns in some of them and respect to DNA leader 1 kb plus of Invitrogen®

FIGURA 1. Huellas génicas generadas por el marcador molecular de ADN BOX-PCR a partir de aislados de Fusarium oxysporum obtenidos de tallos de plantas de agave (Agave tequilana Weber var. azul) de diferentes predios comerciales de producción, en donde se aprecia la similitud de patrones de bandeo de algunos de ellos respecto al marcador de peso molecular 1 kb plus de Invitrogen®.

FIGURE 1. Genetic fi nger prints obtained by BOX-PCR molecular ADN marker from Fusarium oxysporum isolates of stem of agave (Agave tequilana Weber var. azul) in commercial crops, in it is appreciated that there are banding similitude between some of them and respect to DNA leader 1 kb plus of Invitrogen®.

FIGURA 3. Dendograma de disimilaridad de veinticinco aislados de Fusarium oxysporum obtenidos de tallos de agave (Agave tequilana Weber var. azul), después de haber sido amplifi cados con el marcador molecular de ADN BOX-PCR. Con un coefi ciente de 0,49 se aprecian agrupamientos entre los que sobresale uno conformado por dieciséis huellas muy similares entre sí.

FIGURE 3. Dissimilarity clustering of twenty-fi ve isolates of Fusarium oxysporum from stem of agave (Agave tequilana Weber var. azul) plants, obtained with BOX-PCR molecular DNA marker. At 0.49 coeffi cient there is a clustering with sixteen isolates with very similar fi nger prints.

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fi topatológico y deberán contrastar claramente con las cepas no patogénicas presentes en suelo o bien, también deben tener diferencia con cepas endófi tas, que aun cuando tengan la capacidad clara de colonizar el sistema vascular del agave, actúen solamente como aislados endófi tos de estas plantas, como al parecer es el papel que desempeñan las cepas F, M, S, T, Q, 23, 27, 30 y 34 en coincidencia con lo reportado por Lori et al.(2004), que observaron un comportamiento similar en F. oxysporum f. sp. dianti. Esta información nos abre la posibilidad de que si se exploran otras áreas del genoma de estos aislados mediante técnicas moleculares, se pueda identifi car y diferenciar plenamente los aislados patogénicos a agave, de endófi tos y no patógenos, a partir de muestras de suelo y plantas asintomáticas, que serían muy útiles en estudios futuros de epidemiología de la marchitez del agave; en programas de certifi cación material vegetativo sano para nuevas plantaciones o bien en estudios encaminados a lograr identifi car germoplasmas resistentes o tolerantes a este importante fi topatógeno del agave.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen ampliamente el apoyo de la Dirección General de Educación Tecnológica por el soporte económico brindado con el proyecto 735.05-P; a las empresas Tequila Herradura S.A. y Tequila Sauza, así como a Langebio del CINVESTAV campus Guanajuato por los valiosos apoyos brindados para la realización de este trabajo.

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DISCUSIÓN

F. oxysporum es una especie de hongo que en suelo desempeña múltiples papeles ecológicos y es génicamente muy variable; sin embargo, cuando se comporta como fi topatógeno, dentro del grupo de aislados patogénicos a un hospedero que conforman una forma especial, en la mayoría de las veces se ha evidenciado una homología génica conformada por relativamente pocos GCV (Leslie & Summerell 2006). Lo anterior se explica, según Keith & Correll (2001), porque debido a que en esta especie no se ha descrito un estado sexual, los genes vic, responsables de la compatibilidad vegetativa entre aislados, en vez de ser azarosamente heredados, su transferencia se realiza de manera clonal, principalmente. Por lo tanto, en F. oxysporum la compatibilidad vegetativa es comúnmente tomada como base para estudios donde se busca determinar especifi cidad de hospederos, relaciones fi logenéticas y diversidad de poblaciones. En el trabajo que aquí se reporta, veinticinco aislados de F. oxysporum, todos obtenidos de tallos de plantas de agave con diferentes niveles de síntomas de marchitez, fundamentan que su genoma es tan homogéneo que, de las veinticinco cepas, trece conforman un mismo grupo de compatibilidad vegetativa y dos aislados más son vegetativamente compatibles, conformando adicionalmente un segundo GCV. Esta homología es adicionalmente soportada con dos metodologías basadas en herramientas de biología molecular, de naturaleza muy diferente. Las huellas génicas BOX-PCR, que previamente se han reportado como herramientas efi cientes para sustentar estudios de diversidad en hongos y bacterias (Healy et al. 2005, Kistler et al. 1991), en este estudio demuestran que los aislados que pertenecen a uno u otro GCV cuentan además con una huella génica muy semejante, cuando se amplifi caron fragmentos repetidos del genoma utilizando el iniciador BOXA1R. De la misma manera, cuando se secuenció el fragmento intragénico ITS1, nuevamente, una mutación puntual de un solo nucleótido es sufi ciente para que una determinada cepa sea incluida o excluida de un grupo de más de setenta reportes del complejo F. oxysporum, algunos de ellos reportados incluso con la certeza de que pertenecen a una determinada forma especial fi topatógena. El análisis de comparación con la base de datos de nucleótidos del GenBank nos parece indicar que los aislados de F. oxysporum, que llevan en su genoma esta mutación, no habían sido introducidos en esta base de datos, y este cambio en secuencia es nuevamente una clara evidencia de la homología génica entre un grupo de aislados con cualidades para colonizar tejido del tallo de plantas de agave. Las evidencias de homología génica antes discutidas permiten apoyar la hipótesis de que los aislados previamente reportados como fuertemente patogénicos a A. tequilana Weber var. azul como las cepas 24 y “O”, son genéticamente similares a las cepas K, L, N, Ñ, R, U, 21, 22 y 25, de las cuales no se conoce plenamente su comportamiento

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Recibido: 18.10.10Aceptado: 17.12.10