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Trabajo de Diploma
“Obtención de un biocatalizador termoestable a partir de
la levadura Pichia pastoris GS115 TmInv para la
producción de azúcares invertidos”
Autor: Félix M. Echemendía Pérez.Tutores: MSc. Duniesky Martínez García.
Ing. Enrique Pérez Cruz.Dr. Iván Rodríguez Rico.
2009 – 2010
Facultad de Química FarmaciaDepartamento de Ingeniería Química
Resumen
ResumenLos azúcares invertidos son edulcorantes con igual proporción de glucosa y fructosa,
elaborados por hidrólisis ácida o enzimática de una solución de sacarosa. Entre las
enzimas que hidrolizan la sacarosa se encuentran las β-fructosidasas o invertasas. En
este trabajo se estudió el crecimiento de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv que
expresa la invertasa de Thermotoga maritima. La mejor condición de fermentación fue un
cultivo discontinuo con 10 g/L de sacarosa inicial y un flujo de aire de 1 vvm, seguido de
un incremento exponencial con el que se alcanzó una productividad de 1,34 g/Lh, un
rendimiento de 0,47 g de biomasa/g de sacarosa, y una actividad enzimática intracelular
de 2341,1 U/g. La mejor proporción de inmovilización en alginato de sodio fue con 300 g/L
de biomasa, esta rindió perlas con una actividad enzimática de 0,329 ± 0,014 U/perla. Se
ensayó la inmovilización de células vivas e inactivadas por calor, obteniéndose en ambos
casos perlas con igual actividad, pH óptimo de 5,5 y temperatura óptima de 90ºC. Los
valores de KM para las células libres y las inmovilizadas, vivas e inactivadas fueron de
40,20, 137,26 y 141,84 mM, respectivamente. La Vmax fue de 0,500 mmol/min g para las
células libres y de 0,044 y 0,048 mmol/min g para las células inmovilizadas vivas e
inactivadas, respectivamente. Basados en los valores de KM y Vmax de las células
inactivadas inmovilizadas, se aplicó una ecuación de diseño para el cálculo del tiempo de
hidrólisis, esta ecuación es aplicable hasta una concentración de 1,16 M, a partir de la
cual se observó inhibición por sustrato. Después de 16 lotes discontinuos, el
biocatalizador retuvo más de 80% de actividad.
Abstract
Abstract
The invert sugars are sweeteners that contain equal proportions of glucose and fructose
and are produced by acid hydrolysis or enzymatic hydrolysis of sucrose solution. Among
the enzymes that hydrolyze sucrose are the β-fructosidases or invertases. In this study,
the growth of Pichia pastoris strain GS115 TmInv expressing Thermotoga maritima
invertase. The best fermentation condition was a batch culture with 10 g/L of initial
sucrose and air flow of 1 vvm, followed by an exponential increase which reached a
productivity of 1.34 g/Lh, yielding 0.47 g biomass/g sucrose, and intracellular enzyme
activity of 2341.1 U/g. The best ratio of immobilization in sodium alginate was 300 g/L of
biomass, these yielded pearls with an enzymatic activity of 0.329 ± 0.014 U/bead. Were
tested for immobilization of living cells and inactivated by heat, without observing
differences in activity, or the pH optimum 5.5 and the optimum temperature of 90ºC. KM
values for free cells and immobilized live and inactivated were 40.20, 137.26 and 141.84
mM, respectively. The Vmax was 0.500 mmol/min g for free cells and 0.044 and 0.048
mmol/min g for immobilized live and inactivated cells, respectively. Based on the values
of KM and Vmax of the immobilized inactivated cells, we found a design equation for
calculating the time of hydrolysis, this equation is applicable to a concentration of 1.16 M,
from which was observed substrate inhibition. After 16 batches, the biocatalyst retained
more than 80% of activity.
Abreviaturas
ABREVIATURAS
µmax: Velocidad específica de crecimiento máxima
ART: Azúcares reductores totales
CIGB: Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
DNSA: Ácido dinitro salicílico
KM: Constante de Michaelis
min: Minutos
MM: Medio mínimo
p/v: Relación peso/volumen
p: Probabilidad
P: Productividad
rpm: Revoluciones por minuto
TLC: Cromatografía de capa fina
U: Unidad.
ufc: Unidades formadoras de colonias
v/v: Relación volumen/volumen
Vmax: Velocidad máxima
vvm: Volumen de aire por volumen de medio por minuto
Yx/s: Rendimiento biomasa-sustrato
Índice
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................ 3
2.1 AZÚCARES INVERTIDOS...................................................................................................................... 32.2 EMPLEO INDUSTRIAL DE AZÚCARES INVERTIDOS ............................................................................... 42.3 NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE INVERTASAS .......................................................................... 52.4 INVERTASA DE THERMOTOGA MARITIMA ............................................................................................. 82.5 PICHIA PASTORIS COMO SISTEMA DE EXPRESIÓN ............................................................................... 112.6 INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS.......................................................................................................... 112.7 INMOVILIZACIÓN DE INVERTASAS POR ATRAPAMIENTO ................................................................... 14
3. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................................ 16
3.1 CLON DE PICHIA PASTORIS ................................................................................................................ 163.2 MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................................................ 163.3 PREPARACIÓN DE INÓCULOS ............................................................................................................ 163.4 CONDICIONES DE CULTIVO A NIVEL DE FERMENTADOR .................................................................... 163.5 DETERMINACIÓN DE PESO SECO ....................................................................................................... 183.6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA............................................................................. 183.7 DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA Y EL PH........................................................... 193.8 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES................................................................... 193.9 INMOVILIZACIÓN.............................................................................................................................. 193.10 DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE INMOVILIZACIÓN............................................................... 203.11 CINÉTICA ENZIMÁTICA ................................................................................................................... 203.12 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA .................................................................................................... 203.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS ................................................................................. 21
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................................................... 22
4.1 ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE P. PASTORIS GS115 TMINV ..................... 224.1.1 Cultivos discontinuos............................................................................................................... 224.1.2 Cultivos discontinuos incrementados. ..................................................................................... 24
4.2 INMOVILIZACIÓN CELULAR DE LA CEPA PICHIA PASTORIS GS115 TMINV ......................................... 284.2.1 Efecto de la cantidad de biomasa inmovilizada. ..................................................................... 284.2.2 Efecto de la viabilidad en la actividad del biocatalizador. ..................................................... 29
4.3 DETERMINACIÓN DE LAS CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL BIOCATALIZADOR ................................ 304.3.1 Efecto del pH en la actividad de células libres e inmovilizadas.............................................. 304.3.2 Efecto del pH en la actividad residual de las células inmovilizadas. ...................................... 314.3.3 Efecto de la temperatura en la actividad de células libres e inmovilizadas. ........................... 324.3.4 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática residual de células inmovilizadas......... 334.3.5 Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacción....................................... 344.3.6 Determinación de parámetros cinéticos. ................................................................................. 344.3.7 Determinación del tiempo de reacción en un reactor discontinuo tipo tanque agitado.......... 364.3.8 Estabilidad operacional de la enzima inmovilizada................................................................ 39
CONCLUSIONES.................................................................................................................................... 42
RECOMENDACIONES.......................................................................................................................... 43
BIBLIOGRAFÍA...................................................................................................................................... 44
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓNLos azúcares o siropes invertidos son edulcorantes de color pálido elaborados por
hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática de una solución de azúcar blanca refinada. Los
azúcares invertidos contienen igual proporción de azúcares reductores: glucosa y fructosa.
Estos siropes se emplean en la industria alimenticia especialmente en la preparación de
dulces, compotas y refrescos. Los azúcares invertidos son una alternativa atractiva al
empleo de la sacarosa debido a su mayor poder edulcorante, a su aplicación como
líquidos y a su estabilidad en los alimentos ácidos y bebidas.
Las invertasas típicas nombradas β-fructosidasas (β-D-fructofuranosido fructohidrolasa,
EC 3.2.1.26) son definidas como enzimas que hidrolizan la sacarosa en glucosa y fructosa.
Las β-fructosidasas en dependencia de sus sustratos preferidos suelen nombrarse en la
literatura como sacarasas, invertasas, fructanasas, inulinasas o levanasas. Las invertasas
pueden aislarse de levaduras, bacterias, insectos y plantas, y presentan una gran
diversidad en cuanto a pesos moleculares y propiedades físicas.
Thermotoga maritima es una bacteria termófila que se aisló originalmente a partir de
sedimentos marinos geotérmicos. La invertasa de Thermotoga maritima (BfrA) hidroliza
sacarosa, rafinosa, inulina y polímeros de fructosa con un enlace terminal β-(12) unido a
una molécula de glucosa, liberando fructosa en cada caso. Entre las propiedades más
importantes de esta enzima se encuentra que tiene una temperatura óptima de 90-95°C
(en ensayos de 10 minutos) y es extremadamente insensible a la termoinactivación.
La inmovilización de enzimas y células ofrece ventajas técnicas y económicas, tales como
la reducción de costos de las biocatálisis, debido a su posible reuso, fácil separación de
las mezclas de reacción y la posibilidad de usar alta actividad enzimática por volumen de
reactor, comparado con preparaciones de enzimas solubles. La inmovilización, ha sido
usada para la obtención de siropes invertidos, ya sea por inmovilización de invertasas o
por inmovilización de microorganismos que expresen estas invertasas de forma natural.
El desarrollo de cepas de levadura que expresan de forma recombinante la invertasa
termoestable de Thermotoga maritima, secretada de forma constitutiva al periplasma
celular, permite contar con un microorganismo de alta actividad enzimática. La
inmovilización de esta levadura, permitiría lograr una biotecnología de hidrólisis continua
de la sacarosa y obtener un sirope invertido durante la producción azucarera, que compita
económicamente y en calidad con los licores fructosados de maíz.
Introducción
2
Atendiendo a estos antecedentes y a la necesidad de desarrollar un biocatalizador capaz
de transformar eficientemente la sacarosa en azúcar invertido, similar a las que se
comercializan en el mercado internacional, se propuso el siguiente objetivo general.
Obtener un biocatalizador termoestable a partir de la cepa Pichia pastoris GS115TmInv que expresa la invertasa de Thermotoga maritima.
Para cumplir este objetivo general se plantean los siguientes objetivos parciales:
- Establecer condiciones de cultivo de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv a
nivel de fermentadores de 5 L.
- Obtener un biocatalizador a partir de la inmovilización en alginato de calcio
de las células de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv.
- Establecer las condiciones de operación del biocatalizador para la inversión
de la sacarosa.
- Aplicar una ecuación de diseño capaz de describir los datos cinéticos
experimentales.
Revisión Bibliográfica
3
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Azúcares invertidosEntre los ingredientes que contienen azúcar los más comunes y utilizados en los
alimentos son la sacarosa, los edulcorantes de maíz, jarabes, azúcar invertido y la miel.
La sacarosa se produce naturalmente como producto de la polimerización de la glucosa y
la fructosa por un enlace glucosídico. Este disacárido no reductor proporciona muchas
cualidades funcionales deseables en términos de dulzura, textura, y capacidad de
transformarse entre los estados amorfo y cristalino, entre otros. La hidrólisis de la
sacarosa resulta en azúcar invertido que contiene glucosa, fructosa y sacarosa (si no está
100% invertido). El grado de inversión de la sacarosa controla las propiedades
funcionales del sirope final (Chinachoti, 1995).
Los azúcares o siropes invertidos son edulcorantes de color pálido elaborados por
hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática de una solución de azúcar blanca refinada. Los
azúcares invertidos contienen igual proporción de azúcares reductores: glucosa y fructosa.
La fructosa es más dulce que la sacarosa (Tabla 2.1). En estudios comparativos de
dulzura, en el que se fijó la dulzura de la sacarosa en 100, la fructosa tenía una dulzura de
140 y la glucosa de 74 (Krause y Mahan, 1984). Esto contrasta con las estimaciones
comunicadas por Hannover y White, 1993, en su estudio, la dulzura de la sacarosa se fijó
en 100; la fructosa, sin embargo, tenía una dulzura de sólo 117, mientras que una mezcla
50:50 de la fructosa y la sacarosa tuvo una dulzura de 128. A pesar de estas diferencias
todos los trabajos coinciden en que la fructosa es el más dulce de todos los carbohidratos
de origen natural. Esta es la razón principal de que la fructosa se use en la elaboración de
productos alimenticios y bebidas.
La fructosa, y los ingredientes que contienen fructosa, como el sirope de maíz y el azúcar
invertido generalmente presentan múltiples propiedades funcionales que son utilizadas en
los alimentos y bebidas. Estas propiedades funcionales se pueden atribuir a las
propiedades químicas o físicas de la propia fructosa, o a la interacción de la fructosa con
la comida o bebida del sistema.
Tanto el sirope de maíz como el de azúcar invertido tienen las mismas propiedades
funcionales, donde la principal es la prevención de la cristalización del azúcar. La
diferencia fundamental es el grado de dulzura, el sirope de maíz es menos dulce.
Revisión Bibliográfica
4
Tabla 2.1 Dulzor relativo de diferentes azúcares y siropes con respecto a la sacarosa
Edulcorante Dulzor relativo a la sacarosa
Sacarosa 100
Dextrosa 70-80
Fructosa 140
70-DE sirope de maíz de 70-75
Sirope de maíz de alta conversión 65
Sirope de maíz de conversión regular 50
Maltosa 30-50
Sirope maíz de alta concentración de fructosa 90% 120-160
Sirope maíz de alta concentración de fructosa 55% >100
Sirope maíz de alta concentración de fructosa 42% 100
Azúcar invertida > 100
Sorbitol 50
2.2 Empleo industrial de azúcares invertidosLa sacarosa de caña de azúcar o remolacha azucarera ha sido parte de la dieta humana
desde hace siglos. La sacarosa sigue siendo el punto de referencia contra el cual se
miden otros edulcorantes. Sin embargo, la sacarosa ha planteado importantes problemas
tecnológicos en ciertas aplicaciones: se hidroliza en los sistemas ácidos, cambiando la
dulzura y el sabor característicos del producto, y es un ingrediente granular que debe ser
disuelto en agua antes de su uso en muchas aplicaciones. Por otra parte, la caña de
azúcar es un cultivo tradicional de regiones ecuatoriales. La disponibilidad y el precio del
azúcar fluctúan ampliamente en respuesta a la inestabilidad política y a los cambios
climáticos. Los siropes fructosados son una alternativa atractiva a la sacarosa debido a su
aplicación como líquidos y a su estabilidad en los alimentos ácidos y bebidas. Al ser
líquidos los siropes invertidos pueden ser bombeados de los vehículos de entrega a los
tanques de almacenamiento y mezcla, requiriendo solamente la simple dilución antes de
su uso.
Entre las principales propiedades funcionales de los azúcares invertidos se encuentran:
Excelente conservante de alimentos.
Proporcionan cuerpo y cohesión.
Previenen la cristalización de la sacarosa en los siropes combinados.
Emulsión estabilizadora.
Revisión Bibliográfica
5
Disminuyen el punto de congelación.
No se cristalizan durante el almacenamiento.
Mantienen los productos alimenticios blandos y frescos.
Principales empleos del azúcar invertido en la industria alimentaria:
Producción de confitería y dulces.
Ingrediente principal de caramelos duros hervidos.
Mezclado con azúcar para la fabricación de caramelos con sabor y chocolatería.
Galletas con glucosa.
Mermeladas, jaleas, gomas de mascar y las frutas en conserva.
Siropes para productos de la industria panadera.
Helados.
Empleo en la industria farmacéutica:
Se utiliza en jarabes para la tos y tónicos basados en vitaminas. Es ingrediente principal
de pastillas contra la tos y actúa como agente de granulación para el revestimiento de
tabletas.
Empleo como saborizante:
Agente saborizante y humectante en el tabaco de mascar.
Saborizante y preservante en formulaciones de refrescantes bucales.
Mejora la calidad de conservación de tabaco.
Sustituto de la Miel
2.3 Nomenclatura y clasificación de invertasasLa sacarosa (α-D-glucopiranosil β-D-fructofuranosido), es uno de los productos más
abundantes en la naturaleza, no sólo es el principal compuesto derivado de la fotosíntesis
y la molécula predominante de translocación de carbono en la mayoría de las plantas,
sino que también desempeña un papel central en sus funciones biológicas y en las
respuestas al estrés medioambiental Vargas y Salerno, (2010). En las plantas, la glucosa
y la fructosa están implicadas en las vías de señalización en las que la concentración de
sacarosa funciona como un sensor clave de la situación nutricional de las plantas, y por
tanto, la invertasa juega un papel fundamental en el control de la diferenciación celular y
el desarrollo. Aunque los animales, incluido el hombre, muestran una marcada preferencia
por dietas que contienen sacarosa, sus genomas no codifican para invertasas. En su
lugar, utilizan una enzima diferente y no relacionada para hidrolizar la sacarosa, la
sacarosa-glucosidasa (EC 3.2.1.48). Los genomas de los microorganismos del intestino
Revisión Bibliográfica
6
humano como Bacteriodes thetaiotamicron (Xu et al., 2003) y Bifidobacterium longum
(Schel et al., 2002) poseen genes de invertasa, lo que demuestra que estos organismos
se benefician del consumo de sacarosa por los seres humanos.
La utilización de sacarosa como fuente de carbono y energía depende de la ruptura del
enlace α-1-β-2-glucosídico, por la acción de invertasas que hidrolizan el disacárido de
forma irreversible en glucosa y fructosa.
Existen dos tipos de enzimas que hidrolizan la sacarosa: las invertasas típicas nombradas
β-fructosidasas (β-D-fructofuranosido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26) y las glucosidasas α-
1,4-glucosidasas (α-D-glucosido glucohidrolasa, EC 3.2.1.20) y oligo α-1,6-glucosidasas
(EC 3.2.1.20) con una amplia gama de especificidad de sustratos.
Las invertasas pueden clasificarse en dos clases según su actividad, inicialmente
diferenciada por su pH óptimo in vitro: (i) invertasas ácidas (Ac-InVS, EC 3.2.1.26, β-
fructofuranosidasas) con un pH óptimo característico entre 4,5 y 5,0 y (ii) invertasas
alcalinas/neutras (A/N-InVS) con un pH óptimo en el rango de 6.5-8.0 (Tymowska-Lalanne
y Kreis, 1998; Sturm A, 1999)
Las invertasas son definidas como enzimas que hidrolizan la sacarosa en glucosa y
fructosa. Algunas invertasas son reportadas como altamente específicas para la sacarosa,
como la invertasa alcalina de zanahoria (Lee y Sturm, 1996), pero la especificidad estricta
para un sustrato es una excepción entre estas enzimas. Contrariamente, la mayoría de las
β-fructosidasas tienen una especificidad relativamente amplia de sustratos y pueden
hidrolizar no solo la sacarosa sino también enlaces β-fructosídicos en uno o más de los
siguientes sacáridos: sacarosa 6-fosfato, rafinosa, inulina, levana, (Kunst et al., 1974;
Schmid et al., 1982; Martin et al., 1987; Blatch y Woods, 1993; Wanker et al., 1995; Lee y
Sturm, 1996). En dependencia de sus sustratos preferidos las β-fructosidasas suelen
nombrarse en la literatura como sacarasas, invertasas, fructanasas, inulinasas o
levanasas.
Las invertasas se encuentran en la familia GH32 de las glicosil hidrolasas según la
clasificación basada en la secuencia (afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY). Esta familia, que incluye
más de 370 miembros de origen vegetal, fúngico y bacteriano, no sólo contiene invertasas,
sino también otras como fructofuranosidasas tales como inulinasa (EC 3.2.1.7), levanasa
(EC 3.2.1.65), y exo-inulinasa (CE 3.2.1.80), y transfructosidasas como la
sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (EC 2.4.1.99) y fructano:fructano 1-
fructosiltransferasa (EC 2.4.1.100). (Alberto et al., 2004)
Revisión Bibliográfica
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Las glucosil hidrolasas o glucosidasas son un amplio grupo de enzimas que muestra una
gran variedad de plegamientos de proteínas y de especificidades de sustrato. Ellas
comparten una característica común, dos sitios críticos de residuos ácidos, que
constituyen el mecanismo catalítico responsable de la rotura de enlaces glucosídicos. En
la invertasa de levadura se han identificado de forma experimental estos dos residuos
invariables como un aspartato situado cerca del N-terminal que actúa como nucleófilo y un
glutamato que actúa como el ácido/base general (Reddy y Maley, 1996). La hidrólisis
enzimática de enlaces glucosídicos tiene dos posibles resultados estereoquímicos,
inversión o retención de la configuración anomérica. La invertasa es una enzima de
retención. Sin excepción conocida hasta la fecha, el mecanismo molecular aparece
conservado entre los miembros de una misma familia basada en la secuencia. El análisis
de la secuencia acoplado a comparaciones estructurales ha revelado similitudes
significativas entre los representantes de diferentes familias, acompañadas de una
conservación de la maquinaria catalítica y el resultado estereoquímico de la reacción, lo
que refleja una antigua divergencia de un antepasado común para adquirir nuevas
especificidades de sustrato. Las familias relacionadas, de forma evolutiva, estructural y en
su mecanismo de acción, se agruparon en un nivel superior jerárquico llamado "clanes"
(Alberto et al., 2004).
La combinación de análisis y el modelado de homología han permitido predecir que, como
miembro de la familia glucosidasa GH32, la invertasa mostraría seis plegamientos de
hojas de hélices relacionados con la neuraminidasa del virus de la influenza. Sin embargo,
reportes sobre la estructura tridimensional de la levanasacarasa de Bacillus subtilis de la
familia GH68 revelaron que había un nuevo plegamiento hélice de cinco hojas, que sólo
se ha descrito anteriormente para tachylectin (Beisel et al., 1999) y para la familia L-
arabinanase GH43 de Cellvibrio japonicus (Nurizzo et al., 2002). Recientes análisis de
secuencia han revelado la existencia de motivos de secuencia conservados en las
familias glucosidasas GH32, GH43, GH62 y GH68, lo que sugiere una posible relación
estructural entre estas familias (Naumoff, 2001) a pesar de los mecanismos opuestos en
GH32 y GH68 (de retención) y GH43 (inversión). Cabe señalar que, debido a la rápida
mutarotación de furanosas, es muy difícil de determinar experimentalmente el curso
estereoquímico de la reacción catalizada por furanosidasas como las L-
arabinofuranosidasas de la familia GH43. Sin embargo, tres informes independientes, han
llegado a la conclusión de que las enzimas de la familia GH43 operaran por un
Revisión Bibliográfica
8
mecanismo de inversión. El mecanismo que prevalece en la familia GH62 no se conoce
(Alberto et al., 2004).
2.4 Invertasa de Thermotoga maritimaEntre más de 50 especies diferentes de hipertermófilos procariotas conocidos (aquellos
con temperatura óptima de crecimiento de al menos 80ºC) solo algunos se han descrito
que pertenecen al dominio Bacteria (Sterrer, 1996). Se cree que estos organismos
resistentes a altas temperaturas retienen características ancestrales en sus biomoléculas
y rutas metabólicas.
Thermotoga maritima es una bacteria que no forma esporas, en forma de bacilo,
estrictamente anaerobia y heterotrófica. Se aisló originalmente a partir de sedimentos
marinos geotérmicos. Su temperatura óptima de crecimiento es de aproximadamente
80ºC (176ºF). Filogenéticamente Thermotoga parece ser uno de los más antiguos linajes
en Eubacteria. El genoma de Thermotoga es un único cromosoma circular de
aproximadamente 1,8 megabases de tamaño, que codifica para un estimado de 1,877
proteínas. Puesto que el genoma de Thermotoga tiene el mayor porcentaje (24%) de los
genes similares a los genes archaea, Thermotoga puede llegar a ser un sistema ideal
para estudiar la organización de dominio e identificación de nuevas estructuras de
proteínas en Eubacteria y Archea, por lo que este microorganismo se ha convertido en
modelo de estudio de bacterias hipertermofílicas.
La cepa tipo de Thermotoga maritima, cepa MSB8 (DSM 3109), es capaz de utilizar varios
mono-, oligo- y polisacáridos (Huber y Stetter, 1992).
El primer reporte que describió la secuencia del gen y las propiedades enzimáticas de la
β-fructosidasa de Thermotoga maritima data de 1998 (Liebl et al., 1998). El gen bfrA de la
enzima invertasa codifica para 432 residuos de aminoácidos que generan un polipéptido
de alrededor de 50 kDa., con una secuencia significativamente similar a otras β-
fructosidasas. Sobre la base de su estructura primaria BfrA puede ser asignada a la
familia 3.2 de las glicosil hidrolasas.
La invertasa de Thermotoga maritima (BfrA) hidroliza sacarosa, rafinosa, inulina y
polímeros de fructosa con un enlace terminal β-(12) a una molécula de glucosa,
liberando fructosa en cada caso. Los enlaces α-glucosidicos no son atacados por esta
enzima.
Todos los sustratos de BfrA tienen en común una fracción fructosilo unida por enlace β -
(21) o β-(26) a las partes remanentes de los sacáridos. Por otra parte, el enlace
Revisión Bibliográfica
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glicosídico β-(21) entre la unidad fructosilo y una de las unidades glucosilo de la
melizitosa [α-D-glucopiranosil-(13)-β-D-fructofuranosil-(21)-α-D-glucopiranosa], que
es equivalente a los enlaces escindidos por BfrA en sacarosa o la rafinosa, no es
hidrolizado. Esta observación indica que la unidad fructosilo debe tener una ubicación
terminal dentro del sustrato sacarídico, que es válido para todos los sustratos de BfrA
enumerados anteriormente, y que la función de la enzima se hace a través de un
mecanismo de corte tipo exo-β-fructosidasa.
BfrA muestra similar eficiencia catalítica para la hidrolisis de la sacarosa y de la inulina
con valores kcat/Km alrededor de 4.1 x 104 M-1s-1 y 3.1 x 104 M-1s-1 respectivamente (a
75°C, pH 5.5). BfrA tiene una temperatura óptima de 90-95°C (en ensayos de 10 minutos)
y fue extremadamente insensible a la termoinactivación. Durante 5 h a temperaturas hasta
80°C y pH 7, la enzima retuvo hasta el 85% de su actividad inicial. Así, BfrA es la β-
fructosidasa más termoestable descrita hasta la fecha (Liebl et al., 1998).
Figura 2.1 Representación de las unidades monoméricas de la invertasa de T. maritima:Extremo N terminal en forma de β-propela con cinco hojas (enumeradas de I-V) y el C-terminalmódulo β-sandwich.
Una molécula de invertasa de T. maritima está compuesta por dos módulos individuales,
un módulo catalítico de cinco hojas en forma de β-propela (residuos 1-295) unido por 10
residuos a un módulo C-terminal β-sandwich (residuos 306 a 432) (Figura 2.1). La enzima
se agrupa en un conjunto de seis moléculas bi-modulares, este es organizado en tres
dímeros individuales, que muestra cada uno una doble simetría. Los tres dímeros no
están relacionados por ningún grupo de puntos de simetría, sino por rotaciones no
simétricas y traduccionales. El dímero se organiza en torno a un pseudo eje, que pone en
contacto el dominio β-sandwich del monómero A con el dominio β-propela del monómero
B y viceversa. La enzima tiene un perfil correspondiente a un tamaño de 30 kDa. Las
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investigaciones de dispersión de luz dinámica indican que la invertasa de T. marítima es
un monómero en la solución.
El centro activo catalítico está ubicado en un extremo de la cavidad en el centro de la β-
propela con una abertura en forma de embudo hacia la superficie molecular. Este tiene
una topología de bolsillo, que es plenamente coherente con el modo de acción
estrictamente exo de la enzima sobre el polímero de fructosa de la inulina (Liebl, et al.,
1998). La presencia de tres grupos carboxilato de los residuos de dos aspartato (Asp-17 y
Asp-138) y un glutamato (Glu-190) ubicados en el centro de la depresión, generan una
carga altamente negativa en el centro activo. Reddy y Maley (1996) han demostrado que
el Asp-23 de la invertasa de levadura (Asp-17 en la invertasa de T. maritima) es el
nucleófilo catalítico, mientras que el Glu-204 (Glu-190 en la invertasa de T. maritima) es el
ácido/base general (Reddy y Maley 1996). Además de las dos regiones que contienen la
maquinaria catalítica, el alineamiento de múltiples secuencias de la familia GH32 ha
revelado un número de zonas de aminoácidos altamente conservadas. La inspección de
la estructura tridimensional permite definir las posibles funciones de estos residuos
altamente conservados.
Los residuos del C-terminal de la invertasa de T. maritima (de 306 a 432) componen un
plegamiento individual β-sandwich formado por dos láminas de seis cadenas. Este módulo
está conectado al módulo catalítico a través de una conexión corta de 10 residuos que se
envuelve alrededor del β-Sandwich. Contrariamente al módulo catalítico, que puede ser
fácilmente alineado con todos los demás miembros de la familia glucosidasa GH32, el
módulo C-terminal de la invertasa de T. maritima no reveló una similitud estadísticamente
significativa de su secuencia con regiones equivalentes de otras proteínas de la familia
GH32.
La diferencia del módulo C-terminal de la invertasa de T. maritima, con respecto a los
demás miembros de la familia GH32, sugiere que tal vez este módulo ha perdido su
función en la invertasa de T. maritima. Por otra parte, este módulo podría haber
evolucionado en esta invertasa para preservar la estabilidad a altas temperatura, incluso
si su función ancestral se ha perdido. Las proteínas de organismos hipertermófilos
frecuentemente adoptan un estructura tanto modular como multimérica. Estas dos
características complementarias se cree que incrementan la estabilidad a altas
temperaturas mediante el enmascaramiento de regiones más débiles en la superficie de la
proteína (Alberto et al., 2004).
Revisión Bibliográfica
11
2.5 Pichia pastoris como sistema de expresiónLas levaduras, junto con las bacterias, son los organismos más utilizados en estudios
biotecnológicos. Pichia pastoris se ha convertido en un eficiente sistema de expresión de
genes heterólogos. Diversos factores han contribuido a su rápida aceptación; como el
hecho de contar con promotores de Pichia pastoris como el derivado del gen de la enzima
alcohol oxidasa I (POAX1), que permite la expresión inducible o el derivado del gen de la
enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (PGAP), que permite la expresión
constitutiva. Generalmente la expresión de genes foráneos en levadura es bajo el control
de promotor de la alcohol oxidasa, el cual se induce con metanol, sin embargo, en
algunas situaciones no es conveniente el uso de este inductor para la expresión de genes
ya que el metanol comúnmente deriva de la industria petroquímica y no sería una fuente
de carbono aceptable para la producción de ciertos productos alimenticios e ingredientes
como los azúcares invertidos. En estos casos el uso de PGAP es una alternativa atractiva
para la producción de proteínas heterólogas en Pichia pastoris. Estudios en frascos de
cultivo han demostrado que en presencia de glucosa el promotor PGAP es
significativamente más fuerte que el POAX1 en cultivos con metanol (Waterham et al., 1997;
Careghino y Cregg, 2000). Contrario a Pichia, las plantas poseen una gran cantidad de
invertasas endógenas que dificultan y enmascaran los estudios de caracterización de
fructosiltransferasas y por otra parte, los patrones de glicosilación de esta levadura, a
diferencia de los de S. cerivisiae, se acercan más a los encontrados en plantas (Cregg et
al., 1993).
El hecho de que Pichia pastoris sea considerado un microorganismo GRAS, (Generally
Regarded as Safe) generalmente considerado como seguro, por la American Food and
Drug Administration (FDA) (Domínguez et al., 1998), lo convierte en un candidato ideal
para la expresión de invertasas para la obtención de azúcares invertidos con fines
alimenticios.
Distintos tipos de invertasas a partir de diferentes especies de plantas han sido
expresadas en Pichia pastoris para su caracterización molecular y funcional (Nagaraj et
al., 2005; Chen, 2009)
2.6 Inmovilización de célulasUno de los mayores avances en la optimización de procesos biotecnológicos descansa
en la tecnología de la inmovilización, tanto de enzimas como de células. Esta tecnología
constituye una excelente herramienta en la industria para llevar a cabo conversiones
Revisión Bibliográfica
12
biocatalíticas eficientes y económicas, al acelerar reacciones químicas con gran
especificidad (Konstantin et al., 2000).
La inmovilización de un biocatalizador es un proceso en el que se confina o localiza el
biocatalizador en una región definida del espacio, manteniendo al mismo tiempo la
actividad catalítica deseada y que puede ser reutilizado repetidamente. Una característica
general de cualquier sistema con biocatalizadores inmovilizados es que el transporte de
sustratos y productos se produce por mecanismos difusionales.
La inmovilización de catalizadores presenta una serie de ventajas:
- Utilización continua del biocatalizador. Las células inmovilizadas se quedan fácilmente
retenidas en el interior del reactor, mientras se mantiene un flujo de entrada y salida del
líquido. Esto permite operar elevadas cantidades en reactores continuos, por encima del
límite de lavado observado con células libres. En el caso de procesos en discontinuo, la
inmovilización permite la reutilización del biocatalizador (Willaert et al., 1996).
- Aumento considerable de la concentración del biocatalizador. Esto, junto con el uso de
elevadas cantidades conduce a un aumento de la productividad del fermentador.
- Reducción de contaminaciones accidentales del proceso. Al estar las células
contaminantes en suspensión, se pueden eliminar mucho más eficientemente. De igual
manera se pueden eliminar continuamente los metabolitos tóxicos y los productos
inhibitorios.
La utilización de biocatalizadores inmovilizados también presenta algunos inconvenientes:
- La actividad enzimática puede ser afectada tanto por las condiciones en que se lleve a
cabo la inmovilización como por el entorno de las enzimas, diferente del habitual.
- La velocidad de difusión de sustratos y productos dentro del sistema de biocatalizadores
puede limitar su actividad y eficacia si dicha velocidad es más lenta que la velocidad de
transformación que se está llevando a cabo.
- La inmovilización implica una nueva etapa en el proceso y esto aumenta la complejidad
y costo, con lo cual deberá verse compensado con aumentos de productividad y tiempos
de operación más largos.
Como se muestra en la Figura 2, los tipos de inmovilización se dividen en cinco grandes
grupos en función del mecanismo en que se basan (Arroyo, 1998):
- Adsorción. Se produce por interacción de tipo iónico o fuerzas de atracción débiles sobre
la superficie del soporte. Se conoce como inmovilización pasiva.
- Enlace covalente. En este caso, la interacción biocatalizador-soporte se debe a un
verdadero enlace químico, en este caso de naturaleza covalente.
Revisión Bibliográfica
13
- Enlaces cruzados y autoinmovilización. En este grupo no existe soporte, la
inmovilización se consigue mediante interacción directa, normalmente subsiguiente a
algún otro método (enlace covalente o por procesos de floculación).
- Atrapamiento. Se forma una estructura tridimensional de forma que el catalizador queda
atrapado en el interior. Esta matriz tridimensional debe permitir la retención de las células
en el interior y una fácil difusión de sustratos y reactivos.
- Microencapsulación o membranas perforadas. El biocatalizador se inmoviliza en el
interior de un espacio limitado por una membrana. Las microcápsulas se producen en
presencia del biocatalizador que queda incorporado en el interior. Y en las membranas
perforadas, el biocatalizador se introduce en el interior de un sistema con membranas
previamente formadas.
Figura 2.2 Principales tipos de inmovilización de biocatalizadores.
La elección del soporte adecuado dependerá de distintos factores, tales como el costo,
toxicidad, facilidad de preparación, estabilidad mecánica, biocompatibilidad y resistencia a
la biodegradación.
La inmovilización por atrapamiento en alginato de calcio es una técnica comúnmente
utilizada en la producción de azúcares invertidos sobre la base de su fácil operatibilidad y
conservación de la capacidad de catálisis.
La inmovilización por atrapamiento incluye el uso de geles de origen natural que se
forman por redes iónicas. El polímero más utilizado en este caso es el alginato de sodio.
El ácido algínico es un constituyente de las algas marinas y es producido por las algas
marrones de Phaeophyceae. Hay varias fuentes comerciales de este ácido,
principalmente Macrocystis pyrifera, y especies de Laminaria y Ascohylum.
El ácido algínico es un copolímero no ramificado de ácido β-D-manurónico y ácido α-L-
gulurónico unidos por enlaces 1 4 glicosídicos. La mayoría de los ácidos algínicos
+
+
+
+
+Adsorción Enlace Enlaces Atrapamiento Encapsulación
Covalente Cruzados
Revisión Bibliográfica
14
constan de bloques homopoliméricos de ácidos D-murámicos (M) y L-gulurónico (G) que
son enlazados por otras cadenas poliméricas de longitud aleatoria que alternan, aunque
no de manera estricta, secuencias de los dos ácidos (M y G). La mayoría del alginato
utilizado se encuentra como sal de sodio (Thu et al., 1996).
La formación de geles y soluciones se consigue por interacción del alginato con cationes.
Los alginatos con elevado contenido de G tienen gran afinidad por iones divalentes, tales
como Ca2+, Sr2+ y Ba2+. El más utilizado es el ion Ca2+, que cuando se difunde en la
solución actúa primeramente sobre los bloques G y luego sobre los M, formando enlaces
cruzados. La estructura del gel de alginato de calcio que se forma es una red polimérica
tridimensional inerte con espacios intersticiales, relativamente grandes, interconectados.
Las dimensiones de estos espacios varían con el tipo de alginato utilizado (Thu et al.,
1996).
La inmovilización, en general, ha sido usada para la obtención de siropes invertidos, ya
sea por inmovilización de invertasas o por inmovilización de microorganismos que
expresen estas invertasas de forma natural (Akgöl, et al., 2001; Tanriseven y Dogan,
2001; Bahar y Tuncel, 2002; Danisman et al., 2004; Amaya-Delgado et al., 2006; Emregül
et al., 2006; Sanjay y Sugunan, 2006; Kotwal y Shankar, 2009).
2.7 Inmovilización de invertasas por atrapamientoEl uso de invertasas inmovilizadas para la hidrólisis continua de sacarosa puede ser
ventajoso porque los cambios producidos en el pH como consecuencia de la
inmovilización pueden ser explotados para prevenir la formación de oligosacáridos por la
actividad transferasa asociada con la enzima soluble. Debido al alto potencial comercial
de la enzima, se han hecho varios intentos para obtener preparaciones de invertasas
inmovilizadas que sean activas y estables, adecuadas para su aplicación industrial.
Estudios con células de levadura que contienen actividad invertasa revelan que cuando
son atrapadas en geles de poliacrilamida y tratadas por γ-irradiación, estas retienen el
85% de su actividad inicial sin cambios en los valores cinéticos como consecuencia de la
inmovilización. Además en un reactor de lecho empacado, las células inmovilizadas
hidrolizan sacarosa por un mes sin pérdida significativa de su actividad (D'Souza y
Nadkarni, 1980).
Ghosh en 1990 comparó células de levadura inmovilizadas en poliacrilamida en forma de
perlas y en polímeros irregulares y demostró las ventajas del uso de esferas ya que tenían
un volumen de intrusión más alto, mayor superficie y mayor área de poro que los soportes
Revisión Bibliográfica
15
irregulares. Imágenes al microscopio electrónico de barrido de los preparativos de células
inmovilizadas revelaron una distribución uniforme de las células dentro de la matriz. El
atrapamiento amplió el pH óptimo de 3,5-5,5 y también aumentó la temperatura óptima a
60°C cuando se comparó con las células libres (pH 4,5 y 55°C). Las células inmovilizadas
mostraron una mayor estabilidad térmica pues conservaban el 93% de su actividad inicial
a 70°C mientras que las células libres mostraron sólo el 61% de su actividad.
En un esfuerzo por integrar el crecimiento celular y la inmovilización, Chang et al. (1996)
atrapó células cultivadas a alta densidad de S. cerevisiae recombinante con actividad
invertasa en las cápsulas de alginato. Las inmovilizaciones preparadas con clones
productores de invertasa exhibieron actividad ligeramente superiores a las células libres.
Además, las células atrapadas mostraron buen almacenamiento y estabilidad operativa.
Los protoplastos de la cepa de levadura altamente productora de invertasa,
Saccharomyces cerevisiae IFO0309, atrapados en geles de alginato de estroncio
pudieron secretar invertasa.
Rossi-Alva y Rocha-León (2003) estudiaron células mutantes de S. cerevisiae libres y
atrapadas en alginato de calcio con respecto a su patrón de crecimiento y la actividad
invertasa, utilizando la represión enzimática de la glucosa, así como la capacidad de
consumo de glucosa como criterios para la selección de mutantes. Entre ellas, las células
atrapadas previamente cultivadas en la matriz produjeron una mayor actividad.
Curiosamente, la cepa de las células mutantes Q6R2 atrapadas en alginato de calcio
produjo una alta actividad de la invertasa utilizando glucosa y sacarosa como fuente de
carbono. La inmovilización mostró buena estabilidad operacional y de almacenamiento.
Basándose en estos resultados, los autores concluyeron que las células de levadura
atrapadas disminuyen la capacidad de consumir azúcar y pueden ser empleadas para la
producción de sirope de azúcar invertido.
El uso de invertasa intracelular de Cladosporium cladosporioides auto-inmovilizada como
un sistema de bajo costo para estudiar los parámetros cinéticos de la enzima, así como
las condiciones operativas para la hidrólisis de la sacarosa mostró un incremento en la
Km aparente y Vmax y esto se atribuyó a las barreras difusionales (Almeida et al. 2005).
Materiales y Métodos
16
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Clon de Pichia pastorisSe utilizó la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv que presenta insertado en su genoma 4
copias del casete de expresión pGAP-TmINV-tAOX y 2 copias de pPICZ-AOXlinker-
pGAPTmINV ambos con el gen codificante para la enzima β-fructosidasa del
microorganismo Thermotoga maritima, bajo el promotor pGAP, de la gliceraldehído 3-
fosfato deshidrogenasa y fusionado a la señal de secreción del factor α de
Saccharomyces cerevisiae. El clon de la cepa Pichia pastoris GS115 InvTm fue
suministrado por el laboratorio Interacciones Plantas Microorganismos del CIGB Habana
3.2 Medios de cultivoYPG: Extracto de levadura 10 g/L; peptona 20 g/L y glucosa 20 g/L. Para medio sólido se
empleó agar 15 g/L.
Medio mínimo (MM): El cual contiene 22 g/L de NH4SO4, 18,2 g/L de K2HPO4, 7,5 g/L de
MgSO4 7H2O, 0,5 g/L de CaCl2 2 H2O. Las vitaminas y trazas que se añadieron a este
medio se prepararon y usaron como recomiendan d’Anjou y Daugulis (2001). El pH del
medio se ajustó a 5,5. La fuente de carbono para el MM fue azúcar refino a 50 g/L o 10
g/L, en ambos casos se añadió extracto de levadura 5 g/L.
3.3 Preparación de inóculosLa cepa de Pichia pastoris se creció en placas petri con medio YPG sólido a 30ºC, por 48
horas. Una colonia aislada se tomó a partir de esta placa y se utilizó para inocular 250 mL
de medio MM, en todas las condiciones con azúcar refino 50 g/L. El elermeyer se incubó
por 24 horas, a 28ºC, a 250 rpm en zaranda orbital INFORS. El cultivo completo se añadió
al fermentador.
3.4 Condiciones de cultivo a nivel de fermentadorLas fermentaciones discontinuas se realizaron en un fermentador INFORS HT de 7,5 L
totales y un volumen de trabajo de 5 L. Los siguientes parámetros se fijaron y registraron
durante todo el cultivo a través del Software Iris V 5.0: agitación 500 rpm, pH 5,5
controlado por NH3OH (28% (v/v)) y H3PO4 (40% (v/v)) y temperatura 28ºC, en
dependencia del experimento el flujo de aire utilizado fue de 3 L/minuto (1 vvm) o de 0,6
L/min (0,2 vvm), a lo largo de todo el cultivo se registró la concentración de oxígeno
disuelto. El cálculo de µmax se realizó siguiendo el procedimiento de Lineweaver-Burk,
Materiales y Métodos
17
graficando el recíproco de la velocidad específica de crecimiento contra el recíproco de la
concentración de sustrato.
El volumen inicial de fermentación fue de 3 L de medio mínimo (MM) con azúcar refino a
las cantidades anteriormente mencionadas. Se inoculó el fermentador con 250 mL del
inóculo crecido en zaranda. Se tomaron muestras cada 1 hora para la determinación de
los parámetros cinéticos y la actividad enzimática.
Los cultivos discontinuos incrementados se dividen en dos etapas, la primera llamada
fase discontinua y la segunda fase de alimentación estéril.
Se inoculó el fermentador con 250 mL del inóculo crecido en zaranda. En la primera etapa
de la fermentación se fijó la agitación en 500 rpm y la aireación en 1 vvm (flujo de 3 L/min)
y se utilizó como fuente de carbono azúcar refino 10 g/L. Una vez transcurridas 22 horas
de cultivo, se comenzó la segunda etapa se aumentó la agitación a 900 rpm y el flujo de
aire hasta 6 L/minuto (2 vvm) y se alimentó el cultivo con 1,5 L de incremento (sacarosa
al 500 g/L). Se siguieron las siguientes estrategias de incremento: Flujo exponencial
µteSoSfsYx
µXoVoF
)(/. Y un flujo lineal ktFoF . Los parámetros y valores se
muestran en la tabla 3.1.Tabla 3.1 Parámetros y valores utilizados para los cultivos discontinuos incrementados
Parámetro Símbolo Valor
Volumen inicial Vo 3 L
Biomasa inicial (peso seco) Xo 8,5 g/L
Velocidad específica de crecimiento µ 0,1 h-1
Rendimiento biomasa sustrato Yx/s 0,75 g células/g sacarosa
Concentración de sustrato en el incremento Sf 500 g/L
Concentración de sustrato en el fermentador So 10 g/L
Constante de tiempo k 1,75
Flujo inicial Fo 0,015 L/h
El rendimiento Yx/s se determinó)(
/SfSo
XoXfsYx
donde Xf y Xo (g/L) concentración
celular final e inicial, respectivamente, So y Sf (g/L) concentración de sustrato inicial y final,
respectivamente. La productividad P se determinót
XoXfP
donde Xf y Xo (g/L)
concentración celular final e inicial, respectivamente, t es tiempo total de cultivo.
Materiales y Métodos
18
3.5 Determinación de peso secoSe pesaron tubos eppendorf de 1,5 mL en una pesa digital analítica. Se añadió 1 mL de
las muestras de cultivo en cada tubo previamente pesado. Se centrifugó a 7 000 rpm
durante 10 minutos, se eliminó completamente el sobrenadante del cultivo y se secó a
100ºC durante 24 h, se pesó cada tubo con la biomasa del cultivo en una pesa digital
analítica. El peso seco en g/L fue la diferencia entre el tubo con la biomasa y el tubo vacío
por 1000. A cada muestra se le realizó la medición por triplicado.
3.6 Determinación de la actividad enzimáticaPara la determinación de la actividad enzimática extracelular se tomaron 200 µL del
sobrenadante de las muestras o sus diluciones, a esto se le añadieron 200 µL de tampón
sacarosa 240 mM en acetato de sodio a 0,1 M, pH 5,5. La mezcla se incubó a 60ºC por 15
minutos.
Para la determinación de la actividad enzimática intracelular se resuspendió en 500 µL de
agua una muestra, de precipitado de cultivo equivalente al volumen de la relación 20/peso
húmedo. De dicha resuspensión se tomaron 5 µL de muestra, a esto se le añadieron 195
µL de agua y 200 µL de tampón sacarosa 240 mM en acetato de sodio a 0,1 M, pH 5,5. La
mezcla se incubó a 60ºC por 15 minutos.
En ambos casos se utilizó como blanco una mezcla de 200 µL de agua y de tampón
sacarosa 240 mM en acetato de sodio a 0,1 M, pH 5,5. La mezcla se incubó a 60ºC por 15
minutos.
Para la determinación de la actividad en las células inmovilizadas se tomaron 25 perlas y
se incubaron en 10 mL de una solución de sacarosa 120mM en tampón de acetato de
sodio 0,05 M, pH 5,5, se incubó a 60ºC, con agitación lenta y se tomaron muestras cada
15 minutos por 45 minutos. Y se calculó la diferencia de fructosa liberada entre los
diferentes tiempos. Como blanco se utilizó la solución de sacarosa.
En todos los casos a 400 µL de las muestras o sus diluciones se les adicionó 400 µL de
DNSA y se incubaron por 5 minutos a 100ºC, se enfriaron en hielo por 5 minutos Se
tomaron 100 µL y se colocaron en una placa Costar de 96 pozos y se leyó la absorbancia
a 550 nm en un lector de placas Fotómetro-Fluorímetro PR-521. Se utilizó como patrón
una curva de glucosa y fructosa en cantidades equimolares.
Una unidad de enzima (U) representa la cantidad de invertasa que libera 1 mol de
fructosa por minuto a velocidades iniciales de la reacción en una solución de sacarosa a
120mM en tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC.
Materiales y Métodos
19
3.7 Determinación del efecto de la temperatura y el pHPara la determinación del efecto de la temperatura o el pH, se realizaron experimentos en
cada condición utilizando células libres e inmovilizadas. En el caso de las células libres se
tomó 1 g de biomasa y se resuspendió en 10 mL de CaCl2 2H2O 0,04 M, de esta
resuspensión se tomaron 100 µL y se incubaron en 100 µL de una solución de sacarosa
en el tampón correspondiente para una concentración final de sacarosa de 120 mM. Para
las células inmovilizadas se tomó 1 g de perlas en 10 mL de sacarosa 120 mM en el
tampón correspondiente. En el efecto del pH se utilizaron para pH 4 y 5 tampón acetato
0,05 M y para pH entre 6 y 8 tampón fosfato 0,01 M y se fijó la temperatura a 60ºC; en el
caso del efecto de la temperatura se utilizó tampón acetato 0,05 M, pH 5,5 y se varió la
temperatura entre 30 y 90ºC.
El efecto de la temperatura y el pH en la actividad residual se determinó incubando a las
diferentes temperaturas en tampón acetato 0,05 M, pH 5,5 sin sacarosa o en los
tampones a diferentes pH a 60ºC sin sacarosa, por 15 horas. Posteriormente se
determinó la actividad enzimática de las células inmovilizadas.
3.8 Determinación de azúcares reductores totalesEn todos los casos a los 200 µL de las muestras o sus diluciones se les adicionó 200 µL
de HCL a 6 M y se incubaron por 10 minutos a 100ºC, luego se les adicionó 800 µL de
NaOH a 2,5 M y 200 µL de DNSA y se incubaron por 5 minutos a 100ºC, se enfriaron en
hielo por 5 minutos. Se tomaron 100 µL y se colocaron en una placa Costar de 96 pozos y
se leyó la absorbancia a 550 nm en un lector de placas Fotómetro-Fluorímetro PR-521.
Se utilizó como patrón una curva de glucosa y fructosa en cantidades equimolares.
3.9 InmovilizaciónEl cultivo discontinuo incrementado se centrifugó a 3000 rpm, por 30 minutos, a 4ºC, y se
separó la biomasa del sobrenadante; 300 g de biomasa se resuspendieron en agua hasta
completar un volumen de 1L. Esta resuspensión se mezcló con alginato de sodio (de
Laminaria hyperborea, rica en residuos de ácido gulurónico; BDH) 2% (p/v) con agitación
vigorosa 13500 rpm, con homogenizador Ultra-Turrax T25 LKA. Una vez homogeneizada
la mezcla se dejó gotear con ayuda de una bomba peristáltica LKB a un flujo de 20
mL/minuto en una solución de CaCl2 2H2O 0,04 M la cual se mantuvo con agitación lenta,
el volumen de esta solución es diez veces el volumen de la mezcla células-alginato. Una
vez formadas las perlas se mantuvieron agitándose en la solución de cloruro de calcio por
2 horas. Luego se escurrieron las perlas y se les adicionó el mismo volumen de una
Materiales y Métodos
20
solución de CaCl2 2H2O 0,04 M y se mantuvieron 2 horas a temperatura ambiente con
agitación suave. Las perlas resultantes se incubaron 2 horas en una solución de sacarosa
al 60% (p/v) en una relación de 750 mL de solución por kg de biocatalizador. Las perlas
se escurrieron y se almacenaron en solución fresca de sacarosa a 4ºC.
En los casos que se indique las células se resuspendieron en la misma proporción que la
antes mencionada y se calentaron por 30 minutos a 60ºC.
En los casos que se indique se ensayaron las siguientes concentraciones de biomasa
para la inmovilización, 50, 100, 200, 300 y 400 g/L.
3.10 Determinación de la eficiencia de inmovilizaciónSe tomaron muestras del cloruro de calcio donde se goteó la mezcla células alginato,
antes de cambiar la solución, para determinar la eficiencia de inmovilización del
sobrenadante de cultivo; 200 µL de estas muestras se mezclaron con 200 µL de tampón
sacarosa 240 mM en acetato de sodio a 0,1 M, pH 5,5. La mezcla se incubó a 60ºC por 15
minutos. La eficiencia (%) se calculó por la diferencia entre la actividad total inmovilizada
menos la actividad libre en cloruro de calcio, dividido por la actividad total inmovilizada,
multiplicado por 100.
3.11 Cinética enzimáticaDe las células inmovilizadas se tomaron perlas en las siguientes proporciones peso:
volumen 1:10 y 1:5 se incubaron en soluciones de sacarosa a las siguientes
concentraciones 0,29; 0,58; 0,87; 1,16; 1,46; 1,73; 2,04 y 2,3 M a 100 rpm y la
temperatura a 60ºC. Se tomaron muestras cada 1 hora durante 10 horas, para determinar
por DNSA los azúcares reductores liberados y realizar cromatografías en capa fina. La
determinación de velocidad máxima y Km se realizó sobre la base del cálculo de las
velocidades iniciales en relación con la concentración inicial de sacarosa, según la
expresión de Lineweaver-Burk.
3.12 Cromatografía en capa finaLas cromatografías en capa fina se realizaron en placas de sílica-gel 60 (Merk, Alemania).
Las muestras se diluyeron hasta 5ºBrix. y se aplicó 1 µL a la placa, como solvente de
corrida se utilizó acetona 90% (v/v). Se realizaron 5 corridas y los compuestos fructosados
se observaron después de asperjar la placa con una solución saturada de 1-butanol, urea
3% (p/v) y etanol absoluto 5% (v/v) e incubarla a 100ºC por 15 minutos.
Materiales y Métodos
21
3.13 Análisis estadístico de los resultadosLa comparación entre las pendientes del tiempo real y el tiempo teórico para la
comprobación de la ecuación de diseño se realizó por un análisis de regresión lineal de
las pendientes según Sigarroa (1985), con ayuda del programa Microsoft Excel. Las
determinaciones de diferencias significativas entre tratamientos se realizaron mediante
análisis de varianza completamente aleatorizado. La comparación múltiple de medias se
hizo con la prueba de Student-Newman-Keuls. Todos los análisis estadísticos se
facilitaron con el uso del programa COSTAT 2.04.
Resultados y Discusión
22
4. Resultados y discusión
4.1 Establecimiento de las condiciones de cultivo de P. pastoris GS115 TmInv
4.1.1 Cultivos discontinuosSe estudió el efecto de la concentración inicial de sustrato y la aireación en el rendimiento
y productividad celular de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv. La figura 4.1 muestra los
cambios en la concentración de peso seco de las células y de azúcares reductores a 50 y
10 g/L de sacarosa. En ambos casos el cultivo se caracteriza por una fase de latencia
larga entre 20 y 16 horas, seguida de una fase exponencial que termina entre las 30 y 24
horas para 50 y 10 g/L de sacarosa inicial, respectivamente. La aireación influyó en el
crecimiento tanto a 50 como a 10 g/L de sacarosa inicial, pues a 0,2 vvm solo se
alcanzaron 11,2 y 6,4 g/L respectivamente, mientras que a 1 vvm el peso seco final fue de
18,4 g/L para 50 y 12,5 g/L para 10 g/L de sacarosa.
Figura 4.1 Relación entre peso seco y concentración de azúcares reductores totales (ART)contra el tiempo, en la fase exponencial de cultivos discontinuos. A) Concentración inicial desacarosa 50 g/L B) Concentración inicial de sacarosa 10 g/L. Los símbolos abiertos representan laconcentración de ART y los cerrados el peso seco. Los datos representan la media aritmética detres repeticiones de cada determinación analítica. La dispersión de los datos con relación a lamedia fue menor del 5%.
De igual forma se analizó la expresión intracelular de la β-fructosidasa recombinante en
todas las condiciones de cultivo ensayadas (Figura 4.2). En general, se observa expresión
de la enzima en toda la fase exponencial. A 50 g/L de sacarosa inicial se obtuvo mayor
actividad aunque fue variable a lo largo del cultivo, con una disminución seguida de un
aumento, mientras que a 10 g/L la actividad tendió a disminuir. En ambos casos se obtuvo
mayor actividad intracelular a 0,2 vvm. La cepa Pichia pastoris GS115 carece de actividad
Fermentaciones con 50 g/L de sacarosa
0
5
10
15
20
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Tiempo de cultivo (h)
Pes
o se
co (g
/L)
051015202530354045
AR
T (g
/L)
1 vvm 0,2 vvm 1 vvm 0,2 vvm
Fermentaciones con 10 g/L de sacarosa
0
24
68
1012
14
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Tiempo de cultivo (h)
Pes
o se
co (g
/L)
0
2
4
6
8
10
12
AR
T (g
/L)
1 vvm 0,2 vvm 1 vvm 0,2 vvm
AB
Resultados y Discusión
23
invertasa propia, por lo que no puede metabolizar la sacarosa, razón por la cual el
crecimiento de la cepa recombinante en esta fuente de carbono depende de la expresión
constitutiva de la enzima invertasa de Thermotoga maritima. La invertasa permite la
hidrólisis de la sacarosa del medio de cultivo y la incorporación de la glucosa y la fructosa
al metabolismo de la levadura.
Figura 4.2 Actividad intracelular en la fase exponencial del cultivo. A) Concentración inicial desacarosa 50 g/L B) Concentración inicial de sacarosa 10 g/L. Una unidad representa la cantidadde invertasa por gramo de peso húmedo celular que libera 1 mol de fructosa por minuto en 45minutos de reacción en una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato de sodio 0,05 M,pH 5,5, a 60ºC.
La tabla 4.1 muestra diferentes parámetros asociados al crecimiento de los cultivos
discontinuos, determinados al final de la fase exponencial. A una concentración inicial de
sacarosa de 50 g/L los resultados obtenidos dan como mejor variante la de 1 vvm, debido
a que se obtuvo un peso seco de biomasa de 13,7 g/L superior a los 9,9 g/L obtenidos a
0,2 vvm; a 1 vvm la µmax fue de 0,135 h-1, el rendimiento Yx/s de 0,43 g células/g
sacarosa y una productividad celular P de 0,47 g/Lh, mientras que a 0,2 vvm estos valores
fueron inferiores, con una µmax de 0,130 h-1, un Yx/s de 0,38 g células/g sacarosa y una
P de 0,34 g/Lh.
Tabla 4.1. Parámetros asociados al crecimiento en los cultivos discontinuos
Concentración vvmTiempo decultivo (h)
Pesoseco(g/L)
µmax(h-1)
Yx/s(gcel/gsac)
P(g/Lh)
Sacarosa 50 g/L 1 29 13,7 ± 5,4 a 0,135 ± 0,007 0,43 ± 0,04 a 0,47 ± 0,19 a
0,2 29 9,9 ± 1,2 0,130 ± 0,003 0,38 ± 0,03 0,34 ± 0,09
Sacarosa 10 g/L 1 23 7,6 ± 7,4 b 0,156 ± 0,023 0,75 ± 0,20 b 0,32 ± 0,10 a
0,2 23 4,5 ± 2,1 0,160 ± 0,015 0,76 ± 0,16 0,20 ± 0,03Los datos representan la media de tres réplicas ± la desviación estándar. Letras diferentes denotandiferencias significativas entre ambas concentraciones iniciales de sacarosa a 1 vvm para losvalores de peso seco, rendimiento y productividad (prueba de Student-Newman-Keuls, p≤0,05).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
20 22 24 26 28 30 32Tiempo de cultivo (h)
Act
ivid
ad in
trac
elul
ar (U
/g)
1 vvm 0,2 vvm
0
200
400
600
800
1000
1200
16 18 20 22 24 26
Tiempo de cultivo (h)A
ctiv
idad
intr
acel
ular
(U/g
)
1 vvm 0,2 vvm
AB
Resultados y Discusión
24
A una concentración inicial de 10 g/L a 1 vvm se alcanzó un peso seco de 7,6 g/L y una P
de 0,32 g/Lh superiores a los 4,5 g/L y 0,20 g/Lh alcanzados a 0,2 vvm. A 1 vvm la µmax
fue de 0,156 h-1 y el rendimiento Yx/s de 0,75 g células/g sacarosa, mientras que para 0,2
vvm la µmax fue de 0,16 h-1 y el Yx/s de 0,76 g células/g sacarosa.
El análisis estadístico del rendimiento y productividad obtenidos a 1 vvm con 50 y 10 g/L
de sacarosa dio como resultado que no existían diferencias significativas en cuanto a la
productividad, pero sí en cuanto al rendimiento (p≤0,05), el cual fue superior con 10 g/L de
sacarosa, basado en estos resultados se escogió esta condición para realizar cultivos
incrementados.
4.1.2 Cultivos discontinuos incrementadosCon el propósito de aumentar la disponibilidad de biomasa celular con alta actividad
invertasa se desarrollaron cultivos discontinuos incrementados siguiendo dos estrategias
de incremento, una exponencial y otra lineal. En ambos casos los cultivos se realizaron
como se describe en el acápite 3.4 de materiales y métodos.
El flujo exponencial se realizó sustituyendo en la siguiente ecuación
µteSoSfsYx
µXoVoF
)(/los valores determinados en los cultivos discontinuos,
obteniéndose teF 1.0007,0 .
Con el incremento exponencial durante las primeras y últimas 5 h de incremento, la
concentración de azúcares reductores totales se mantuvo por encima de 2 g/L, el resto
del tiempo de incremento se mantuvo entre 1 y 2 g/L. La concentración celular se
incrementó a lo largo del cultivo con una concentración final de 72,8 g/L de peso seco.
La velocidad específica de crecimiento disminuyó, contrario a lo esperado ya que el
diseño del flujo exponencial se calculó para mantener constante una velocidad específica
de crecimiento de 0,1 h-1. Para las fermentaciones de Pichia pastoris se recomienda que
el oxígeno disuelto se mantenga por encima del 20% para garantizar el crecimiento
celular (Higging y Cregg, 1998). A partir de las 40 h de cultivo, con las condiciones de
aireación utilizadas, el oxígeno disuelto era limitante ya que encontraba por debajo del 5%,
esto pudiera explicar la disminución de la velocidad específica de crecimiento.
En la figura 4.3 B se aprecia que la actividad intracelular es superior a la actividad
extracelular y varía en relación con la concentración de azúcares reductores presente en
Resultados y Discusión
25
el medio. La máxima actividad intracelular referida a peso húmedo, fue de 740 U/g y se
alcanzó a las 54 h de cultivo.
En el cultivo discontinuo incrementado de forma lineal, el flujo de la alimentación se
realizó utilizando la siguiente ecuación ktFoF y sustituyendo el flujo inicial de
incremento de 0,015 L/h resulta tF 75,1015,0 . Los resultados del cultivo
incrementado lineal, se muestran en la figura 4.4. La concentración celular se incrementó
a lo largo del cultivo hasta alcanzar 99 g/L de peso seco y la velocidad específica de
crecimiento disminuyó (Figura 4.4 A). En la figura 4.4 B se aprecia que en las primeras 5 h
de incremento la concentración de azúcares reductores totales se mantuvo por encima de
Figura 4.3 Comportamiento cinético en la fase de alimentación del cultivo discontinuoincrementado de forma exponencial. Relación entre: A) Flujo de alimentación, peso seco yvelocidad específica de crecimiento contra el tiempo de cultivo. B) Actividad enzimáticaintracelular, actividad enzimática extracelular y concentración de azucares reductores totalescontra el tiempo de cultivo. Una unidad de enzima (U) representa la cantidad de invertasa quelibera 1 mol de fructosa por minuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a120 mM en tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC. Los datos representan la mediaaritmética de tres repeticiones de cada determinación analítica. La dispersión de los datos conrelación a la media fue menor del 5%.
020406080
100120140
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Tiempo de cultivo (h)
Fluj
o de
alim
enta
ción
(mL/
h) P
eso
seco
(g/L
)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
Velo
cida
d es
pecí
fica
decr
ecim
ient
o (h
-1)
Flujo (mL/h)Peso seco (g/L)µ (h-1)
0100200300400500600700800
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Tiempo de cultivo (h)
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a
0
5
10
15
20
AR
T (g
/L)
Actividad intracelular (U/g)
Actividad extracelular (U/mL)
ART (g/L)
A
B
(h-1)
Resultados y Discusión
26
0
2040
60
80100
120
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Tiempo de cultivo (h)
Fluj
o de
alim
enta
ción
(mL/
h) P
eso
seco
(g/L
)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Velo
cida
d es
pecí
fica
decr
ecim
ient
o (h
-1)
Flujo de alimentación (mL/h)Peso seco (g/L)µ (h-1)
0
100
200
300
400
500
600
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 46 47 48 49 50 51 52 53 54
Tiempo de cultivo (h)
Act
ivid
ad e
nzim
átic
a
0
2
4
6
8
10
AR
T (g
/L)
Actividad intracelular (U/g)Actividad extracelular (U/mL)ART (g/L)
A
B
(h-1)
2 g/L mientras que en las 10 últimas horas se mantuvo entre 1 y 2 g/L. La actividad
intracelular es superior a la actividad extracelular y disminuye en las primeras 10 h de
incremento, manteniéndose constante hacia el final del cultivo. La actividad intracelular
referida a peso húmedo al final del cultivo fue de 283 U/g.
Figura 4.4 Comportamiento cinético de la fase de alimentación del cultivo discontinuoincrementado de forma lineal. Relación entre: A) Flujo de alimentación, peso seco y velocidadespecífica de crecimiento contra el tiempo de cultivo. B) Actividad enzimática intracelular, actividadenzimática extracelular y concentración de azucares reductores totales contra el tiempo de cultivo.Una unidad de enzima (U) representa la cantidad de invertasa que libera 1 mol de fructosa porminuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato desodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC. Los datos representan la media aritmética de tres repeticiones decada determinación analítica. La dispersión de los datos con relación a la media fue menor del 5%.
En la tabla 4.2 se resumen los principales resultados a las 54 h de cultivo de ambas
formas de incremento, en cuanto a peso seco, rendimientos, productividad y actividad
enzimática. Tanto con el incremento exponencial como lineal se observó que no existía
dependencia lineal entre el crecimiento celular y la actividad intracelular, con el
incremento exponencial la actividad intracelular fue 2,36 veces mayor, 2341 U/g, pero se
Resultados y Discusión
27
obtuvo un menor rendimiento biomasa-sustrato de 0,47 g de células/ g de sacarosa y una
menor productividad en biomasa de 1,34 g de células/Lh, mientras que con un incremento
lineal el rendimiento fue superior, de 0,60 g de células/ g de sacarosa y la productividad
de 1,80 g de célula/Lh sin embargo la actividad intracelular referida a peso seco fue de
990 U/g.Tabla 4.2 Resultados experimentales de los cultivos discontinuos incrementados
Tipo deincremento
Peso seco(g/L)
Yx/s(g/g)
P(g/Lh)
Actividadextracelular
(U/mL)
Actividadintracelular
(U/g)
Actividadintracelular
Total (U)
Exponencial 72,8 0,47 1,34 416,7 2341,1 170432,1
Lineal 99,2 0,60 1,80 54,8 990,0 98208,0
Una unidad de enzima (U) representa la cantidad de invertasa que libera 1 mol de fructosa porminuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato desodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC. Los datos representan la media aritmética de tres repeticiones decada determinación analítica. La dispersión de los datos con relación a la media fue menor del 5%.
Estos resultados sugieren que la expresión constitutiva de la invertasa de T. maritima en
P. pastoris permite que la enzima se acumule en el periplasma celular y sea capaz de
hidrolizar la sacarosa presente en el medio de cultivo y utilizarla como fuente de carbono.
A pesar de que no existe un mecanismo que relacione la expresión del promotor
constitutivo pGAP con los valores de sacarosa en el medio de cultivo, la actividad
intracelular varía en dependencia de la concentración de azúcares reductores totales
(ART) en el medio de cultivo, un incremento que mantenga la concentración de ART a
valores por encima de 2 g/L favorecen la acumulación enzimática. Esto pudiera estar
relacionado con el hecho de que una mayor concentración de sacarosa en el medio
implica una mayor concentración de sustrato que hidroliza la invertasa recombinante
aumentando la concentración de azúcares reductores que entra a la célula. Estudios
previos han demostrado que el empleo de glucosa como fuente de carbono al utilizar el
pGAP favorece la expresión de proteínas bajo este promotor (Waterham et al., 1997).
Los resultados obtenidos muestran que al final del incremento exponencial se acumulan
los ART en el medio de cultivo, coincidiendo con una mayor actividad enzimática
intracelular. A pesar de que la concentración celular en estas condiciones fue menor
permite obtener 1,74 veces más actividad enzimática intracelular total que con el
incremento lineal. Por esta razón se escogió el incremento exponencial para obtener la
biomasa a partir de la cual se inmovilizará para producir un biocatalizador con alta
actividad invertasa.
Resultados y Discusión
28
4.2 Inmovilización celular de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv
4.2.1 Efecto de la cantidad de biomasa inmovilizadaLa cantidad de células que se pueden atrapar en el gel de alginato es muy variable. La
mayor limitación que se presenta con el aumento de la cantidad de células que se
inmoviliza es la baja resistencia mecánica del gel al atrapar grandes cantidades de células
en bajas concentraciones de alginato. Por otra parte la disminución de la porosidad
incrementa las limitaciones difusionales, que afectan el transporte de reactivos y
productos, tanto entre el medio líquido y las perlas, como en el interior de las mismas (Thu
et al., 1996; Freeman y Malcolm, 1998).
Con el objetivo de evaluar el efecto de la cantidad de biomasa inmovilizada en la actividad
enzimática se inmovilizaron 50, 100, 200, 300 y 400 gramos de biomasa fresca de Pichia
pastoris TmInv por litro de agua con 2% (p/v) de alginato de sodio. En todas las
condiciones se obtuvieron perlas esféricas de estructura consistente y un diámetro
aproximado de 2 milímetros. La eficiencia de inmovilización varió entre el 99,7 y el 96,4%
con el aumento de biomasa inmovilizada (Figura 4.5).
Figura 4.5 Variación de la eficiencia de inmovilización y de la Actividad con el aumento de labiomasa inmovilizada. Una unidad de enzima (U) representa la cantidad de invertasa por perlaque libera 1 mol de fructosa por minuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a120 mM en tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC. Los datos representan la media detres réplicas ± la desviación estándar. Letras diferentes denotan diferencias significativas entre lasactividades de las diferentes cantidades de biomasa inmovilizada (prueba de Student-Newman-Keuls, p≤0,05).
La mayor actividad enzimática se obtuvo a 300 g/L de biomasa con la que se alcanzaron
0,329 ± 0,014 U/perla, observándose diferencias significativas con respecto a la actividad
0,0000,0500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,400
50 100 200 300 400
Biomasa húmeda inmovilizada (g/L)
Activ
idad
Enz
imát
ica
(U/p
erla
)
94
95
9697
98
99
100
Efic
ienc
ia d
ein
mov
iliza
ción
(%)
b bc
d c
a
Resultados y Discusión
29
del resto de los biocatalizadores con las demás concentraciones de biomasa. Para esta
condición se alcanzó una actividad específica de 16 U/g de biocatalizador.
4.2.2 Efecto de la viabilidad en la actividad del biocatalizadorLa inmovilización de células vivas para la hidrólisis de sacarosa puede provocar liberación
de CO2 debido al metabolismo celular. Los gases liberados causan canalizaciones en los
reactores basados en camas empacadas. Por esta razón se ensayó la influencia de
inmovilizar células vivas y células inactivadas por temperatura. Para ello las células se
incubaron a 60 y 70ºC en varios tiempos y se determinó la viabilidad y la actividad
enzimática. Como se observa en la tabla 4.3 la actividad enzimática no se afecta con las
temperaturas y los tiempos empleados. Sin embargo la viabilidad desciende 11 órdenes
tanto a 60 como a 70ºC a partir de los 30 minutos de incubación.
Tabla 4.3 Cinética de la influencia de la temperatura en la viabilidad y la actividad invertasa
intracelular
60ºC 70ºCTiempo (min.) U/g ufc/mL U/g ufc/mL
0 319,1 147 x 1013 351,1 8,5 x 1013
15 410,7 12 x 104 553,5 36 x 102
30 438,3 43 x 102 579,5 15 x 102
60 439,1 36 x 102 621,5 11 x 102
ufc: unidades formadoras de coloniasU Representa la cantidad de invertasa por gramo de célula que libera 1 mol de fructosa porminuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato desodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC.
Se ensayó la inmovilización de 300 g/L de células inactivadas a 60ºC por 30 minutos, el
biocatalizador resultante se comparó con el obtenido con células vivas. Como se aprecia
en la figura 4.6 el análisis de varianza de la actividad enzimática mostró que no existían
diferencias significativas entre ambos biocatalizadores.
Resultados y Discusión
30
Figura 4.6 Comparación de la actividad invertasa de los biocatalizadores de células vivas einactivadas. Una unidad representa la cantidad de invertasa por perla que libera 1 mol defructosa por minuto en 45 minutos de reacción en una solución de sacarosa a 120 mM en tampónacetato de sodio 0,05 M, pH 5,5, a 60ºC. Letras iguales denotan que no existen diferenciassignificativas entre las Actividades de las perlas de células vivas e inactivadas (prueba de Student-Newman-Keuls, p≤0,05).
4.3 Determinación de las condiciones de operación del biocatalizadorPara el uso eficiente del biocatalizador es necesario el control de numerosos parámetros
como pH, temperatura, concentración de sustrato y producto que influyen en la actividad
de las enzimas y células inmovilizadas.
4.3.1 Efecto del pH en la actividad de células libres e inmovilizadasEn las células inmovilizadas en alginato de calcio el pH puede tener influencia tanto sobre
la actividad y estabilidad enzimática como en la estabilidad del polímero de alginato. El
efecto del pH en las células libres e inmovilizadas vivas e inactivadas se examinó a 60ºC
durante 45 minutos, con sacarosa a 120 mM. El pH se varió entre 3 y 8, para pH 3, 4 y 5
se utilizó tampón acetato 0,05 M y para pH entre 6 y 8 se utilizó tampón fosfato 0,05 M
(Figura 4.7).
En todas las condiciones el pH óptimo estuvo entre 5 y 6 lo que coincide con la literatura
que reporta un pH óptimo de 5,5 para la β-fructosidasa de Thermotoga maritima (Liebl et
al., 1998). La β-fructosidasa de otros microorganismos también tienen un pH óptimo de
5,5 (Alvaro-Benito et al., 2004; Guimaraes et al., 2007; Rajoka y Yasmeen, 2005). En las
condiciones ensayadas se obtuvo para las células inmovilizadas inactivadas un pH óptimo
entre 5 y 7, y para las inmovilizadas vivas el óptimo fue de 5 aunque se observó una
meseta entre 6 y 8. Las células libres presentaron un pH óptimo de 6.
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,45
Células vivas Células inactivadas
Act
ivid
ad E
nzim
átic
a (U
/per
la)
aa
Resultados y Discusión
31
86
88
90
92
94
96
98
100
102
2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Act
ivid
ad re
sidu
al (%
)
Células inmovilizadas vivas
Células inmovilizadasinactivadas
Figura 4.7 Efecto del pH en la actividad enzimática de las células libres e inmovilizadas. LaActividad relativa está expresada con relación al valor de mayor actividad enzimática (100%) paralas células libres e inmovilizadas. La actividad se realizó en una solución de sacarosa a 120 mM, a60ºC, para pH 3, 4 y 5 se utilizó tampón acetato 0,05 M y para pH entre 6 y 8 se utilizó tampónfosfato 0,05 M. Los valores representan la media de tres réplicas. La dispersión de los datos conrelación a la media fue menor del 5%.
4.3.2 Efecto del pH en la actividad residual de las células inmovilizadasEl análisis del efecto del pH en la actividad residual se realizó incubando las células
inmovilizadas por 24 horas a 4ºC a los diferentes pH (Figura 4.8). La actividad residual
máxima para las células vivas inmovilizadas fue a pH 5 mientras que para las células
inactivadas inmovilizadas se retuvo más de un 96% de actividad en un rango de pH de 3 a
6 lo que sugiere que la inmovilización crea microambientes en el interior del gel que
favorecen la retención de la actividad enzimática en un mayor rango de pH.
Figura 4.8 Efecto del pH en la actividad residual de células inmovilizadas. Las célulasinmovilizadas se incubaron durante 24 horas a 4ºC a los diferentes pH (para pH 3, 4 y 5 se utilizótampón acetato 0,05 M y para pH 6 y 7 tampón fosfato 0,05 M). Luego de incubadas se midió laliberación de fructosa en una solución de sacarosa a 120 mM, tampón acetato de sodio 0,05 M pH5,5 a 60ºC, 45 minutos. La Actividad residual está expresada con relación al pH donde se alcanzóla mayor actividad enzimática (100%). Los valores representan la media de tres réplicas. Ladispersión de los datos con relación a la media fue menor del 5%.
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5 6 7 8 9pH
Act
ivid
ad re
lativ
a (%
)
Células libres vivas Células libres inactivadas
Células inmovilizadas vivas Células inmovilizadas inactivadas
inactivadas
Resultados y Discusión
32
4.3.3 Efecto de la temperatura en la actividad de células libres e inmovilizadasEl efecto de la temperatura en la actividad enzimática relativa se estudió en un rango de
temperatura entre 30 y 90ºC por intervalos de 15 a 45 minutos. La temperatura de máxima
actividad de la β-fructosidasa, tanto para las células vivas libres como para las células
inactivadas inmovilizadas fue de 90ºC. Estas presentaron un comportamiento similar en la
actividad relativa, mientras que la temperatura óptima para las células vivas inmovilizadas
fue entre 80 y 90ºC (Figura 4.9). La temperatura máxima reportada para la actividad
invertasa Thermotoga maritima es de 95ºC (Liebl et al., 1998). Se ha hecho énfasis en
que esta enzima es la más termoactiva y termoestable de las invertasas reportadas. Su
temperatura óptima es 30ºC por encima de otras β-fructosidasas (Alvaro-Benito et al.,
2004; Rajoka y Yasmeen, 2005; Guimaraes et al., 2007). La termoestabilidad de esta
enzima puede estar relacionada con una estructura tridimensional compacta con una
densidad de empaque que puede contribuir a la termoestabilidad de las proteínas
(Jaenicke, 1991); además la invertasa de T. maritima presenta un módulo C-terminal
diferente a los demás miembros de la familia GH32, que podría haber evolucionado para
preservar la estabilidad a altas temperaturas (Alberto et al., 2004).
Figura 4.9 Efecto de la temperatura en la actividad relativa de células libres e inmovilizadasvivas e inactivadas. La actividad relativa está expresada con relación al valor de mayor actividadenzimática (100%) para las células libres e inmovilizadas. El efecto de la temperatura en laactividad de las células libres e inmovilizadas se midió durante 45 minutos a 30, 40, 50, 60, 70, 80y 90ºC, con una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5. Losvalores representan la media de tres réplicas. La dispersión de los datos con relación a la mediafue menor del 5%.
0
20
40
60
80
100
120
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura (ºC)
Act
ivid
ad re
lativ
a (%
)
Células vivas inmovilizadasCélulas inactivadas inmovilizadasCélulas vivas libres
Resultados y Discusión
33
4.3.4 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática residual de célulasinmovilizadasLa figura 4.10 muestra el análisis del efecto de la temperatura en la actividad residual de
las células inmovilizadas vivas e inactivadas. La actividad se determinó a las 15 horas de
haber incubado las perlas a 60, 70, 80 y 90ºC y se comparó la actividad con la de perlas
almacenadas a 4ºC, la determinación de actividad a las perlas se realizó como se
describe en materiales y métodos. La mayor actividad residual se observó a 60ºC tanto
para las perlas de células inactivadas como para las de células vivas, con 100 y 68%
respectivamente. Para ambas condiciones la actividad residual disminuyó
progresivamente a medida que se aumentó la temperatura hasta 90ºC, donde la actividad
residual fue de 37% en las células inactivadas y 30% para las vivas. Uno de los
principales objetivos productivos y económicos que se persigue con la inmovilización es el
re-uso del biocatalizador, por lo que lograr una mayor estabilidad enzimática es
importante cuando se pretende utilizarlo repetidamente. Por esta razón la temperatura
escogida para la producción de siropes invertidos fue de 60ºC donde existía mejor
relación fructosa liberada / porcentaje de actividad perdida en el tiempo. Además, la
operación del biocatalizador a esta temperatura presenta ventajas como menor
probabilidad de contaminación microbiana y mayor difusión de la sacarosa. Por otra parte
el trabajo a estas temperaturas evita procesos de evaporación para la concentración de
los siropes finales, pues permite trabajar a concentraciones superiores a 70ºBrix.
Figura 4.10 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática residual de célulasinmovilizadas vivas e inactivadas en el tiempo. El efecto de la temperatura en la actividadresidual de las células inmovilizadas se midió después de incubar las perlas en sacarosa al 60% y0,05 M a 4, 60, 70, 80 y 90ºC durante 15 horas. Luego de incubadas se midió la liberación defructosa en una solución de sacarosa a 120 mM en tampón acetato de sodio 0,05 M, pH 5,5 a 60ºC.La Actividad residual está expresada con relación a la fructosa liberada por células inmovilizadasalmacenadas a 4ºC. Los valores representan la media de tres réplicas.
0
20
40
60
80
100
120
4ºC 60ºC 70ºC 80ºC 90ºC
Temperatura
Act
ivid
ad re
sidu
al (%
)
Células Vivas inmovilizadas
Células Inactivadas inmovilizadas
Resultados y Discusión
34
05
1015202530354045
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Concentración de sacarosa (M)
Velo
cida
d (µ
mol
/min
g)
Células Vivas inmovilizadas
Células inactivadas inmovilizadas 0
100
200
300
400
500
600
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Concentración de sacarosa (M)
Velo
cida
d (µ
mol
/min
g)
Células libres
4.3.5 Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de reacciónPara evaluar el efecto de la concentración de sustrato en la actividad enzimática de la
invertasa, se determinó la velocidad inicial a diferentes concentraciones de sacarosa,
como se aprecia en la figura 4.11.
Tanto para las células libres como inmovilizadas hasta una concentración de 0,31 M la
enzima está alejada de la posibilidad de saturación y la velocidad es proporcional a la
cantidad de sustrato, resultando una reacción de primer orden. Entre las concentraciones
de 0,31 y 1,17 M la velocidad es constante la enzima está saturada y representa una
reacción de orden cero. A concentraciones superiores a 1,17 M la velocidad disminuye
con el aumento de la concentración de sacarosa, lo que sugiere una inhibición por
sustrato. Un comportamiento muy similar se ha reportado por Combes y Monsan (1983) y
Straathof et al. (1986). Este efecto se ha atribuido a la disminución de la concentración de
agua (Bowski et al., 1971), la inhibición de sustrato (Combes y Monsan, 1983) y la
agregación de sustrato (Bock y Lemieux, 1982). A partir de estos resultados se decidió
caracterizar el biocatalizador determinando los parámetros cinéticos basados en la
ecuación de Michaelis-Menten en el rango de linealidad, hasta una concentración inicial
de sustrato de 0,58 M.
Figura 4.11 Efecto de la concentración inicial de sustrato en la velocidad de reacción. Serealizaron mediciones de las velocidades iniciales a pH 5,5 a 60ºC utilizando 0,45 g de perlas decélulas inmovilizadas o 0,002 g de células libres en 10 mL de las soluciones de sacarosa.
4.3.6 Determinación de parámetros cinéticosLos parámetros cinéticos para la hidrólisis de la sacarosa por la β-fructosidasa
recombinante de T. maritima en las células libres e inmovilizadas se calcularon según
Lineweaver-Burk (Figura 4.12).
Tanto los valores de KM como Vmax fueron similares para la invertasa presente en las
células vivas e inactivadas inmovilizadas. Sin embargo los valores de KM fueron 3,4 veces
superiores para la enzima de células inmovilizadas que para la enzima de células libres,
Resultados y Discusión
35
esto muestra una mayor afinidad de la invertasa por la sacarosa en las células libres; la
Vmax para la actividad invertasa de las células libres fue 0,500 mmol/min g de biomasa,
mientras para las células vivas e inactivadas inmovilizadas fue de 0,044 y 0,048 mmol/min
g de biocatalizador, respectivamente, estas diferencias en los parámetros cinéticos
pueden deberse a que en el caso de las células inmovilizadas la interacción enzima
sustrato y la velocidad de reacción están controladas por la difusión debido a la viscosidad
de la solución de sacarosa.
Figura 4.12 Parámetros cinéticos para la hidrólisis de la sacarosa por la β-fructosidasarecombinante de T. maritima. Los parámetros cinéticos KM y Vmax se determinaron gráficamentepor la ecuación de Lineweaver-Burk utilizando los datos de las mediciones de las velocidadesiniciales a pH 5,5 a 60ºC utilizando 0,45 g de perlas de células inmovilizadas o 0,002 g de célulaslibres en 10 mL de las soluciones de sacarosa. (A) Células inactivadas inmovilizadas. (B) Célulasvivas inmovilizadas. (C) Células libres.
y = 2,9503x + 0,0208R2 = 0,9131
0,000,020,040,060,080,100,120,14
-0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04
1/S (mM -1)
1/V
(g m
in/µ
mol
)
Vmax=0,048 mmol/min gKM=141,84 mM
y = 3,0748x + 0,0224R2 = 0,9618
0,000,020,040,060,080,100,120,14
-0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04
1/S (mM -1)
1/V
(g m
in/µ
mol
)
Vmax=0,044 mmol/min gKM=137,26 mM
y = 0,0824x + 0,002R2 = 0,9904
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
-0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,03 0,041/S (mM -1)
1/V
(g m
in/µ
mol
)
Vmax= 0,500 mmol/min gKM=40,20 mM
A
B
C
Resultados y Discusión
36
4.3.7 Determinación del tiempo de reacción en un reactor discontinuo tipo tanqueagitadoA partir de los parámetros cinéticos calculados según Michaelis-Menten para el
biocatalizador se utilizó la ecuación de diseño para un reactor discontinuo tipo tanque
agitado según Levenspiel, 1985. Esto se realizó con el objetivo de calcular el tiempo de
reacción (T ) necesario para que se hidrolice el sustrato hasta una concentración SA, en
condiciones de operación isotérmicas, en reacciones discontinuas.
La ecuación 1 describe un sistema discontinuo de volumen constante.
AS
A
A
AO r
dS
W
V
S 0
(1)
Teniendo en cuenta la ecuación de velocidad de Michaelis-Menten
A
AA SKm
SVr
max (2)
Despejando T de la ecuación 1 se obtiene
A
A
A S
S A
A
S
A
AAO r
dS
W
V
r
dSS
W
V
00
(3)
Sustituyendo 2 en 3 e integrando se obtiene
max
00
max
lnV
SS
S
S
V
Km
W
V AA
A
A (4)
Donde T es el tiempo de reacción (min), V volumen (L), W peso del biocatalizador (g), SA
concentración de sacarosa (mol/L), rA velocidad de reacción (mol/min g), SA0
concentración inicial de sacarosa (mol/L), KM constante de Michaelis (mol/L), Vmax
velocidad máxima (mol/min g).
Para corroborar esta ecuación se evaluaron dos relaciones peso de perlas (g): volumen
de reacción (mL), 1:10 y 1:5 y se calculó el porcentaje de hidrólisis de sacarosa midiendo
la fructosa liberada cada 1 hora durante 10 horas a concentraciones iniciales de sacarosa
entre 0,29 M (100 g/L) y 1,75 M (600 g/L), a pH 5,5; 60ºC y agitación 100 rpm (Figura
4.13).
Resultados y Discusión
37
1:10
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10Tiempo (h)
Hid
rólis
is (%
)
1:5
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10Tiempo (h)
Hid
rólis
is (%
)
0,29M
0,87M
1,16M
1,46M
1,75M
Figura 4.13 Porcentaje de hidrólisis de sacarosa. Se tomaron muestras cada una hora durante10 horas de reacción realizada con las células inactivadas inmovilizadas. La reacción se realizóutilizando las relaciones peso de perlas (g): volumen de reacción (mL), 1:10 y 1:5 a lasconcentraciones de sacarosa mostradas, a pH 5,5, a 60ºC y agitación 100 rpm.
A la hora de reacción con la relación 1:5 se hidrolizó el 100 % de sacarosa a la
concentración inicial de 0,29 M. A las 10 h de reacción para la relación 1:10 solo se había
alcanzado el 100% de hidrólisis a las concentraciones iniciales de sacarosa entre 0,29 y
1,16 M, mientras que para la relación 1:5 hubo hidrólisis total hasta la concentración 1,46
M.
En la figura 4.14 se observa una cromatografía en capa fina para las muestras tomadas a
las 10 horas de reacción en las diferentes concentraciones de sacarosa con la relación
1:5, se observa una hidrólisis total de la sacarosa hasta una concentración de 1,46 M.
Resultados y Discusión
38
Figura 4.14 Cromatografía de capa fina de las muestras tomadas a las 10 horas de reacciónrealizadas con las células inactivadas inmovilizadas en sacarosa. La reacción se realizóutilizando 10 g de perlas en 50 mL de sacarosa a diferentes concentraciones, a pH 5,5, a 60ºC yagitación 100 rpm. Los carriles representan el patrón (P) de azúcares fructosa (F), sacarosa (GF),1-kestosa (GF2), nistosa (GF3), un control de sacarosa (C). Las líneas de la 1-6 representan,respectivamente, las concentraciones 0,29; 0,58; 0,87; 1,16; 1,46; 1,75 M.
Basado en los resultados obtenidos en las cinéticas de reacción con las dos cantidades
de biocatalizador ensayadas, se calculó el tiempo teórico para la concentración de
sacarosa remanente SA obtenida a los diferentes tiempos de reacción. El cálculo del
tiempo teórico se realizó según ecuación 4 utilizando los valores de KM= 141 mmol/L y
Vmax= 48 µmol/min g, determinados en el acápite 4.3.6 calculados para 1 g de
biocatalizador. En la tabla 4.4 se aprecia que la diferencia entre el tiempo real y el tiempo
teórico calculado para ambas cantidades de biocatalizador es menor de 1 hora hasta 1,46
M, a partir de esta concentración la predicción de la ecuación de diseño se aleja del
tiempo real en más de 1 hora. Además, se realizó un análisis de regresión lineal de las
pendientes del tiempo real y el tiempo teórico contra la concentración de sacarosa. Este
análisis se efectuó para las concentraciones iniciales de sacarosa en las que se tomaron
F
GF
GF2
GF3
P C 1 2 3 4 5 6
Resultados y Discusión
39
3 o más muestras en las relaciones 1:10 y 1:5. En ambas relaciones se obtuvo que a
partir de 1,46 M existían diferencias significativas entre las pendientes. Esto se debe a
que en la ecuación de diseño no se tuvo en cuenta el efecto de inhibición por sustrato que
se observa a estas concentraciones.
Tabla 4.4 Comprobación de la efectividad de la ecuación de diseño para las relaciones 1:10 y1:5 a diferentes concentraciones de sacarosa
1:10 0,29 M 0,87 M 1,16 M 1,46 M 1,75 MT r T t T r- T t T t T r- T t T t T r- T t T t T r- T t T t T r- T t
0,25 0,48 +0,23 0,36 +0,11 0,69 +0,44 0,18 -0,07 0,15 -0,100,5 0,73 +0,23 0,57 +0,07 1,12 +0,62 0,52 +0,02 0,32 -0,18
0,75 1,00 +0,25 0,82 +0,07 1,38 +0,63 0,79 +0,04 0,46 -0,291 1,26 +0,26 0,96 -0,04 1,66 +0,66 1,07 +0,07 0,57 -0,432 1,90 -0,10 2,65 +0,65 1,83 -0,17 1,03 -0,973 2,52 -0,48 3,45 +0,45 2,65 -0,35 1,59 -1,414 3,54 -0,46 4,28 +0,28 3,41 -0,59 2,30 -1,705 4,92 -0,08 3,58 -1,42 2,84 -2,166 6,16 +0,16 4,11 -1,89 3,24 -2,767 4,49 -2,51 3,69 -3,318 4,91 -3,09 3,94 -4,069 5,26 -3,74 4,24 -4,7610 5,58 -4,42 4,34 -5,66
T r tiempo real (h)T t tiempo teórico (h)Los espacios en blanco significan que a ese tiempo la hidrólisis era el 100%
4.3.8 Estabilidad operacional de la enzima inmovilizadaUna de las ventajas del uso de biocatalizadores inmovilizados es la posibilidad de su uso
continuo o su reutilización. Con el objetivo de evaluar la posibilidad de su uso repetido, se
estudió la estabilidad de la β-fructosidasa recombinante de T. maritima utilizando las
mismas perlas en 16 reacciones discontinuas de 12 horas, con una relación 1:5 de peso
de perlas (g), volumen de solución (mL), en sacarosa 55ºBrix y melaza 70ºBrix a 60ºC, a
1:5 0,29 M 0,87 M 1,16 M 1,46 M 1,75 MT r T t T r-Tt T t T r- T t T t T r- T t T t T r- T t T t T r- T t1 1,09 +0,09 1,03 +0,03 0,81 -0,19 0,67 -0,332 1,99 -0,01 1,81 -0,19 1,55 -0,45 1,26 -0,743 2,44 -0,56 2,13 -0,87 1,80 -1,204 2,51 -1,49 2,20 -1,805 3,06 -1,94 2,48 -2,526 2,88 -3,127 3,16 -3,848 3,43 -4,579 3,54 -5,4610 3,97 -6,03
Resultados y Discusión
40
pH libre y con una agitación de 100 rpm. Como se observa en la figura 4.15 en los 3
primeros lotes ocurre una disminución del porcentaje de inversión con respecto al lote 1,
sin embargo estos valores se estabilizan hasta el lote 16, reteniendo más de un 90% de la
actividad inicial en la sacarosa y más de un 80% en la melaza. El pH se midió al final de
cada lote de reacción y se mantuvo en 5,5 ± 0,2 tanto para sacarosa como para melaza.
La disminución de actividad en los primeros lotes pudiera explicarse por la reducción de
tamaño que sufren las perlas al deshidratarse en ambas soluciones, las perlas pierden
entre el 13,3 y el 23,5% de su peso inicial en sacarosa y melaza, respectivamente. La
reducción del tamaño de los poros de las perlas provoca un aumento en la resistencia
difusional a la permeabilización del sustrato, resultados similares han sido encontrados en
estudios de deshidratación de geles de alginato (Shin et al., 2004).
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Número de reacciones
Act
ivid
ad re
sidu
al (%
)
Sacarosa 55ºBrix Melaza 70ºBrix
Figura 4.15 Actividad residual de la β-fructosidasa de células inactivadas inmovilizadas. Serealizaron 16 reacciones discontinuas en sacarosa y melaza a 55 y 70ºBrix respectivamente, conuna relación 1:5 de peso de perlas (g), volumen de solución (mL). La actividad es relativa al primerlote (100). Las reacciones se realizaron durante 12 h a 60ºC, pH libre y con agitación a 100 rpm.Los valores representan la media de tres repeticiones del ensayo. La dispersión de los datos conrelación a la media fue menor del 5%.
Resultados y Discusión
41
El análisis cualitativo de los lotes con cromatografía de capa fina (TLC) muestra un patrón
similar de sacarosa y fructosa en los diferentes lotes tanto para la sacarosa como para la
melasa (Figura 4.16), excepto para el primer lote donde se aprecia menor intensidad en la
banda de sacarosa y mayor en la de fructosa.
La inmovilización en alginato de calcio de la invertasa de pared celular de levadura se
mostró estable durante 16 ciclos realizados por 8 días (Milovanovic, 2007). Torres et al.,
2002 inmovilizaron invertasa en Sepabeads y obtuvieron una actividad residual de
aproximadamente 80% después de 50 horas. D’Souza y Godbole, (2002) reportaron 69%
de retención de actividad con invertasa inmovilizada en cáscara de arroz después de 30
min a 60ºC. Sin embargo la actividad y estabilidad de la enzima inmovilizada es
altamente dependiente del protocolo de inmovilización y de la geometría del soporte.
Otros protocolos de inmovilización pudieran rendir resultados diferentes en cuanto a la
actividad y estabilidad de la enzima (Goulart et al., 2008).
B 1 4 8 12 16 P B 1 4 8 12 16
F
GF
GF2
GF3
Figura 4.16 Cromatografía de capa fina de los lote en sacarosa y melaza de las célulasinmovilizadas. La reacción se realizó utilizando 10 g de perlas en 50 mL de sacarosa a 55ºBrix ymelaza a 70ºBrix, a pH libre, a 60ºC y agitación 100 rpm. Los carriles representan los lotes 1, 4,8, 12 y 16 con las materias primas indicadas y el patrón de azúcares fructosa (F), sacarosa (GF),1-kestosa (GF2), nistosa (GF3).
Sacarosa Melaza
Conclusiones
42
CONCLUSIONES- La inmovilización de la cepa Pichia pastoris GS115 TmInv permite obtener un
biocatalizador termoestable capaz de producir azúcares invertidos.
- La mayor expresión de la enzima invertasa se alcanza al cultivar la cepa Pichia pastoris
GS115 TmInv en cultivos discontinuos incrementados de forma exponencial a 10 g/L de
sacarosa inicial y un flujo de aire de 1 vvm.
- Las condiciones de inmovilización y operación establecidas permiten realizar 16
reacciones discontinuas manteniendo más de un 80% de estabilidad enzimática.
- La ecuación de diseño utilizada describe el comportamiento cinético del biocatalizador
hasta una concentración de sacarosa de 1,16 M.
Recomendaciones
43
RECOMENDACIONES- Experimentar variantes de alimentación en los cultivos discontinuos incrementados que
permitan un aumento en el rendimiento, productividad y actividad enzimática intracelular.
- Aplicar una ecuación de diseño que permita describir el comportamiento cinético a
concentraciones inhibitorias de sacarosa.
- Ensayar condiciones de operación en continuo del biocatalizador.
Bibliografía
44
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