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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

SERVICIO SOCIAL

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/NOMBRE: Cortés Espinosa Diana Verónica.

MATRICULA: 92330028.

JLiCENCIATURA: Ingeniería Bioquímica Industrial. /D iv i s ión Ciencias Biológicas y de la Salud

Unidad Iztapalapa.

TRIMESTRE LECTIVO OTOÑO '96.

HORAS A LA SEMANA: 20 HORAS

JTITULO DEL PROYECTO : VELECCION DE BASIDIOMICEITS EN CULTIVO SUPERFICIAL EN PLACA CAPACES DE DECOLORAR UN

EFLUENTE DE LA INDUSTRIA PAPELERA"

/NOMBRES DEL ASESOR Dra. Araceli Tornasini C.

PUESTO Y ADSCRIPCION: Profesor Titular "C" del Departamento de Biotecnologia de Ciencias Biológicas y de la Salud de la Universidad Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa.

LUGAR DONDE SE REALIZA EL SERVICIO: Departamento de Biotecnología

FECHA DE INICIO: 20 DE DICEMEiRE DE 1996. Laboratorio 157.

/FECHA DE TERMINACION: 20 DE JLJNIO DE 1 9 9

CLAVE: 1 BI: ,Oc>.( .y>

Araceli Tornadni C. Profa. Titular "C" Droaitamento de Bioteniologia de 6BS. Universidad Autónoma Metropolitana unidpd Mapalapa.

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Ssle~cion de Bacidiomiceles

JUSTIFICACION.

En la actualidad el tratamiento de aguas residuales es de gran interés e investistigación. En México, cerca del 90% de las aguas de desecho de la actividad industrial proviene de cuatro grandes industrias (Poggi y col., 1989), estas son: en orden de descargas anuales: la industria del azúcar (620 Mm3/año), la del acero (38 Mm3/año) y la del petróleo y refinados (3 I Mm3/año). La industria Mexicana de la pulpa y el papel, genera alrededor del 12% del volumen de agua de desecho industrial. El primer efluente en el proceso de pulpeo de la etapa de extracción alcalina y de blanqueo es la principal fuente de color. Los compuestos responsables del color son los fragmentos poliméricos, clorados y altamente oxidados de la lignina. Además por su contenido elevado de cloro (3kg de clorolignina/ton de papel blanqueado) son tóxicos (Galeno y col., 1990), bioacumulables y se fijan en el tejido adiposo (Bergbauer y col., 1992). Estos desechos pueden ser tratados por métodos biológicos (lagunas aereadas, Iodos activados, etc.) para reducir la demanda biológica de oxígeno @BO), pero la eficiencia de esos métodos depende de la temperatura ambiente (Pellinen y col., 1988). El color ocasionado por la clorolignina de alto peso molecular, no es removida de los efluentes completamente por estos métodos. Los procesos fisicos y químicos (como la ultrafiltración y adsorción con carbono) remueven compuestos de alto peso molecular, color, toxicidad, sólidos suspendidos y demanda química de oxígeno @QO), pero la demanda biológica de oxígeno (DBO) y compuestos de alto peso molecular, no son removidos eficientemente (Milstein y col., 1987, Pellinen y col., 1988), además tiene un costo alto por unidad de volumen de agua residual tratada y son dificiles de manejar (Joyce y col., 1984; Galeno y col., 1990). Una alternativa al tratamiento de efluentes provenientes de la industria papelera, con el fin de eliminar el color y degradar algunos compuestos tóxicos clorados, es por métodos biológicos los cuales podrían ser empleados a futuro, especificamente, el empleo de hongos de pudrición blanca. Se tienen estudios de la degradación de la lignina con el hongo de pudrición blanca, Phanerochaete chrysosporium principalmente, sin embargo, se conocen otros basidiomicetes Trametes versicolor, Lentinus edodes, Pleurotus osfreatus que también realizan la decoloración y degradación de estos compuestos. Este trabajo, el cual forma parte de un convenio de colaboración entre el CiNVESTAV-iPN y la UAMI, consiste en cultivar diferentes bacidiomicetes capaces de decolorar y degradar compuestos fenólicos (cloroligninas, monómeros fenólicos y otros compuestos aromáticos) en cultivo superficial en caja utilizando el efluente al loo%, agar bacteriológico y extracto de malta (EM) 0.5% y sin EM para posteriormente hacer una selección de la cepa más eficiente, la cual podría ser utilizada en procesos de tratamiento de efluentes como los de la industria papelera.

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Seleccioo de Bacidiomiceler

INTRODUCCION.

Durante el blanqueado del papel ocurren reacciones complejas que involucran clorinación, oxidación y desmetilación de las unidades fenilpropano de la lignina. Estas reacciones dan lugar a la formación de un grupo estructuralmente diverso de compuestos los cuales son detectados en cantidades variables en un amplio rango de pesos moleculares en los efluentes. Entre los microorganismos que degradan los compuestos aromáticos por vía aerobia, se tienen hongos filamentosos del grupo basidiomicetes, como los de pudrición de madera blanca y café. Los hongos bacidiomicetes de pudrición blanca son los biodegradadores mas activos de polimeros complejos aromáticos como la lignina que es el segundo más abundante en la naturaleza transformandola a COZ y agua. Estos hongos excretan peróxido de hidrógeno y una mezcla de peroxidasas, las cuales catalizan la oxidación por radicales libres y depolimerización de la lignina. Los productos de bajo peso molecular, posteriormente sufren modificaciones y son metabolizados a C02 (Crawford y col., 1980). El peróxido de hidrógeno es producido por oxidasas localizadas entre la pared celular y la membrana, probablemente utilizando la glucosa resultante de la degradación de la celulosa. Reportes anteriores (Bumpus y col. y Eaton, 1985) indican que el hongo de pudrición blanca Phunerochaete chrysosporiurn degrada una gran variedad de compuestos orgánicos recalcitrantes persistentes en el medio ambiente; entre los compuestos que son biodegradados estan dioxinas, bifenoles policlorados, cloroanilinas, benzopirona, lindano, DDT y otros compuestos orgánicos clorados, por lo que estos hongos son importantes dentro de las investigaciones de biorremediación. Después de muchas investigaciones se han logrado reunir un grupo de evidencias que demuestran que estos hongos son de los más versátiles de los microbios por .su habilidad para mineralizar un amplio rango de xenobióticos. P. chrysosporiurn es el más extensamente estudiado, encontrando que mineraliza fundamentalmente este tipo de contaminantes.

Además estos hongos presentan ciertas ventajas, en primer lugar ellos son capaces de mineralizar una gran variedad de tóxicos xenobióticos; estos hongos existen en el medio ambiente natural; tienen la capacidad de oxidar sustratos que tienen una baja solubilidad debido a que los complejos enzimáticos que tienen que ver con la oxidación de algunos contaminantes. Otra razón importante es que el sustrato preferido para el crecimiento de este tipo de hongos puede ser mazorca de maíz, bagazo de caña, cáscara de cacahuate, los cuales son económicos y fáciles de manejar para adicionarlos como nutrientes en el medio; y finalmente, como estos hongos crecen por extensión hifal a través del suelo, estos pueden llegar a los contaminantes que se encuentran dispersos en el suelo.

Diana V. Cortes Efoinosa

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Cdeccion de Baiidiomicslss

Los hongos requieren de un sustrato como glucosa u otra fuente de carbono de fácil asimilación para su crecimiento, La lignina es degradada una vez terminado el metabolismo primario, momento que coincide con la carencia en el medio de un macronutriente en particular carbono o nitrógeno; lo que se relaciona con la ligninolisis debido a la formación de sistemas enzimáticos capaces de degradar compuestos para obtener su fuente de carbono.

En la degradación de la lignina u otros compuestos de tipo aromático por hongos de pudrición blanca, se tienen implicadas cuatro clases de enzimas: ligninasa, lacasa, manganeso peroxidasa y enzimas que producen peróxido de hidrógeno. El sistema enzimático de P. chrysosporium que degrada lignina es producido durante la fase del metabolismo secundario. Varias de las oxidaciones xenobióticas catalizadas por estos hongos se realizan por estos sistemas enzimáticos provocando la decoloración del efluente. Las peroxidasas extracelulares lignina peroxidasas (LIP), manganeso peroxidasa y laccasas son componentes claves de el sistema enzimático que degrada la lignina. El potencial de los hongos para la biorremediación in situ tiene como atributo su habilidad para degradar una variedad de xenobióticos químicos por medio de un mecanismo radial de liberación mediado por peroxidasas extracelulares. El sistema ligninolítico de estos microorganismos se desarrolla a partir del momento en que el hongo se encuentra en metabolismo secundario m r k y Fenn, 1982). La ligninasa es probablemente la enzima que cataliza la oxidación extensiva de las unidades fenólicas y no fenólicas en la lignina, mientras que la lacasa y la manganeso peroxidasa oxidan unicamente las unidades fenólicas de la lignina (Kirk y col., 1988). Las lignina peroxidasas son de interés particular desde el punto de vista de la degradación de contaminantes, las cuales tienen un potencial redox muy alto, oxidando compuestos que otras peroxidasas no lo pueden hacer. Ambas peroxidasas (ligninasas y manganeso peroxidasas) fueron descubiertas en P. chrysoqoriurn (Tien y Kirk,1983; Glenn y Gold, 1983). La laccasa no es producida por este hongo pero fué encontrada en otras especies, tales como P. ostreatus y L. edodes. La Lacasa es una enzima fenol peroxidasa estracelular que contiene cobre en su sitio activo y cataliza la oxidación de o- y p- difenoles generando radicales fenoxi (Sannia y col. 1991). Se han examinado varios tipos de hongos para observar la producción de ligninasas, manganeso peroxidasas y lacasas para la degradación de lignina. Todas estas enzimas fueron encontradas en Trametes gibbosa y 7: hirsuta. Solo manganeso peroxidasa y lacasa fueron producidas por Pycnopoms cinnabarinus, Coriolopsis polyzona y Ganoderma valesiacum. Todos estos hongos decoloraron Poly B-411 e indulina AT en placas con medio limitado en nitrógeno, empleando cada hongo diferentes de metabolismo (F. Nemd y co1.,1991).

Diana V. Conk Espinosa

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Seleccion de Bacidiomiceles

Algunos otros hongos de pudrición blanca además del I? cb?y.soSporitrm pueden hacer la decoloración, por lo que ya han sido publicados algunos usos de estos hongos para el biopulpeo, bioblanqueado y tratamiento de efluentes de fábricas de papel. Para obtener la mejor especie se han usado nuevos procesos biotecnológicos, las cuales se han seleccionado por rápido crecimiento y alta capacidad de degradación; uno de los hongos que resultó eficiente fue I,. edodes, removiendo el 75% de color en 5 días, en medio liquido sin fuente de carbono adicional, observandose mayor eficiencia que el conocido P. chry.sosporium.

El objetivo de este trabajo es dereminar la capacidad de los basidiomicetos para decolorar el efluente de la industria papelera y seleccionar el que resulte más eficiente.

Diana V. Cort6a Espín-

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Seleccion de Bacidiomiceler

ANTECEDENTES

Se planteó el tema de tesis de maestría "Estudios de la decoloración de aguas de pulpeo con Phunerochuele chrysosporzum: cultivos en medio superficial y sólido" en base a los estudios previos desarrollados en el proyecto "Estudios de la biodegradación de compuestos policlorofenólicos provenientes de aguas residuales de pulpeo", llevados a cabo en el CiNVESTAV, así como en función de los estudios de fermentación sólida realizados en la UAM-I.

En dichos estudios (Bañuelos y col., 1993; Campos, 1993 y Bañuelos, 1994), se empleó el hongo P. chrzsosporium fi-298) en cultivo líquido para la disminución de color de las aguas residuales de la industria de pulpeo, se mostró que:

1) El hongo fué capaz de disminuir el color en un 87%, a una concentración del efluente del 60% complementado con sales minerales.

2) Se observó que la disminución de color fue ocasionada por la adsorción de color y por la acción de las enzimas ligninolíticas las cuales presentan su máxima actividad a los 7 días de cultivo.

3) Los estudios realizados por cromatografia de gases sobre este efluente (60%), revelaron la presencia de varios compuestos clorofenólicos, de los cuales se han identificado sólo 3 en mayor concentración

Por otro lado, en el Departamento de Biotecnología de la UAM-I se han realizado numerosos estudios de fermentación en estado sólido, como ennq@cimiento proteínico de la yuca, producción de enzimas y de metabolitos secundarios como antibióticos (Barrios, 1988). Se han realizado estudios de control para la utilización de diversos soportes como bagacillo de caña y amberlita. Estos estudios se han llevado a cabo con hongos filamentosos como A. niger y P. chrysosporzum (h-298 de CDBB-500), se cultivo en este material de fermentación para ser usado en el tratamiento de efluentes de la industria papelera. Paralelamente a este trabajo, se están desarrollando estudios con P. chrysosporium encaminados al tratamiento de plásticos y de coloyhtes azo, así como para la producción de composta. ;L

Diana V. Cortb Espinosa

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Sels~cion de Bacidiomiceles

OBJETIVOS.

En base a estos estudios se tienen como objetivos:

- Determinar la velocidad de crecimiento radial de las cepas en cultivo superficial usando efluente adicionado o no con EMA.

-De*erminar el grado de deco&ión del efluente obtenido con cada una de las cepas, en cultivo superficial usando efluente adicionado o no con EMA.

-Seleccionar la cepa que resulte más eficiente, tomando como criterio la velocidad de crecimiento radial y la capacidad para decolorar el efluente.

Diana V. Caribs Espinosa

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BASlDlOMICETO

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pH I TEMPERATURA

Seieccion de Bacidiomiceles ....

Pieurotus usireatus

MATERIALES Y METODOS

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1 . MlCROORCANTSMOS

Lenlinus edodes

Se utilizaron 3 cepas diferentes de Phunerochuefe chrysosporium (h-298, h-686, A-594), 1 cepa de Trrrmetes versicolor, 3 cepas de Lenitnus edodes y 6 cepas de Pleurolus oslrenlus

5.0 ambienle

2. EFLUENTE

Se utilizó agua residual proveniente de la etapa de blanqueo de una industria papelera, el cual se filtró a través de papel filtro de poro grueso y se almacenó a 4OC en la oscuridad.

3. MEDIOS DE CULTWO

3.1. CULTIVO PARA ACTIVAR AL HONGO.

Se realizó en cajas de Petri. Se preparó el medio con agua destilada, adicionando extracto de malta agar (EM) al 2% y agar bacteriológico al 1.5% ajustando en pH según el Óptimo de cada cepa. El medio se esterilizó a 15 Ib/pulg* por I5 min, se inoculó y se incubó en forma invertida a las temperaturas correspondientes a cada cepa. (tabla 1).

3.2. METODOS DE CULTIVO SUPERFiCIAL.

El método se realizó en cajas de Petri. Se prepararon dos medios usando efluente sin diluir y el otro medio con efluente diluido al SO%, ambos medios se prepararon con EM a 0.5% y sin EM, se ajustó el pH con HCI según el óptimo de cada cepa. El medio se esterilizó a I S Ib/pulg* por 15 min y se incubó a las temperaturas óptimas correspondientes a cada cepa

Diana V C o r k Esp-

8

4.CONSERVACION DE LAS CEPAS

4.1. CONGELACION

- Se preparó EM al 2% más agar bacteriológico al 1.5% en cajas de Petri. - Se inoculó el medio en el centro con el hongo en forma micelial y se incubó durante 48 h - Se cortaron bocados de medio EMA con hongo de 0.60 cm de diámetro. - Se colocaron los bocados en viales estériles (5 bocadodvial) y se adicionó 1.5 ml de

- Los viales se taparon perfectamente bien y se sellaron con parafilm y se almacenaron a

- Para la recuperación de los cultivos se tomó un bocado de uno de los viales y se colocó

solución de glicerol al 25% previamente esterilizado.

-70°C.

en placas con el mismo medio de cultivo y se incubó por 48 h a las condiciones adecuadas para cada cepa.

4.2. PETROLATO

P.

Ib

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Seleccion de Bacidiomicsles

- Se preparó medio EMA al 2% más agar bacteriológico al 1.5% en tubos de ensaye gruesos tapados con tapones de gasa con algodón. El medio se esterilizó a 15 Ib/pulg2 por 15 min.

una superficie mayor para crecer a los hongos.

40 h aproximadamente a las condiciones necesarias para cada diferente cepa.

- Los tubos una vez esterilizados se pusieron a solidificar en forma inclinada para tener

- Los tubos se inocularon con un pedazo pequeño de agar con hongo y se incubaron por

- Se agregaron 25 mi de petrolato a cada tubo de tal forma que el petrolato cubriera el medio 1 cm arriba de éste, los tapones se cubrieron perfectamente bien con parafilm. - Los tubos se almacenaron a 4°C en refrigeración. - Para recuperar los cultivos se tomó un pedazo del medio con hongo conservado en los

tubos y se inoculó en placas con el mismo medio de cultivo. Se incubó a las condiciones óptimas dependiendo del hongo. Una vez crecido se hizo un segundo pase en placas para liberar al hongo completamente del petrolato y pudiera adquirir nuevamente su actividad.

DIPM V. Coi16s Espinosa

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Selection de Bacidiorniceles

5. TECNICAS ANALlTlCAS

5.1. CRECIMIENTO

a). Crecimiento radial

Se midió el diámetro directamente en las cajas cada 4 h aproximadamente. Se realizaron las mediciones con un Vemier las cuales se expresaron en mm

b). Determinación delpeso seco

El medio de cultivo de las cajas se transfirió a matraces de 250 ml, se adicionaron 200 ml de agua destilada, se fundió en un homo de microondas, se filtró al vacío, se lavó con agua caliente y se secó a 65°C durante 24 h. Por diferencia de peso se calculó el peso seco de la biomasa.

5.2 DECOLORACION.

Principio.

El color se determinó por espectrofotometna en un espectrofotómetro UV-160. El método para medir color fue el de cobalto-platinato, siendo la unidad de color, el producido por 1 mg de platinoílitro en forma de ión cloroplatinato (Fresenius y col. 1988).

Las unidades de color se calcularon con la ecuación

UC = J500 x Abs muestra) 0.137

Donde: UC = Unidades de color 500 = Unidades de color de una solución estándar de cobalto platino. Abs = Absorbancia de la solución estándar de 500 unidades de color. O. 137 =Factor obtenida de la cima patrón

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Selsccian de Bacidiomioies

Preparación de las muestras

Se transfirió el medio de cultivo de las cajas de Petri a matraces de 250 mi y se les adicionó 100 ml de agua destilada, los matraces se taparon con tapones de algodón. Se metieron a fundir dentro de una autoclave sin válvula a 92OC, hasta que no existieron burbujas en el medio. Las muestras se centrifugaron a 7 500 rpm a 4OC durante 15 min, se colectó el sobrenadante y se ajustó el pH a 7.5, debido a que a este pH los compuestos cromóforos (ligninas y sus derivados) están en equilibrio, y a pH más ácidos o más alcalinos ocurre la ionización de los grupos fenólicos. Se leyó la absorbacia en el espectrofotónietro a 465 nm, usando como blanco agua destilada.

Para determinar el porcentaje de coloración:

UCC --- 100% de coloración UCM --- X % de coloración

Donde: UCC = unidades de color del control UCM = Unidades de color de la muestra

% de decoloración = 100% - X % de coloración de la muestra

Diana V. Cod& Espin-

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Seleccim de üacidiomiidss ........

RESULTADOS Y DISCUSION

CRECIMIENTO RADIAL

Para realizar la medición del crecimiento radial de todas las cepas analizadas se fijaron 40 h de incubación con las condiciones óptimas necesarias para cada cultivo, estas horas se consideraron debido a que es el tiempo promedio en que una cepa activa de P. chrysosporzum llena con micelio joven una caja de petri con EM al 2% con Al3 al 1.5%, por lo tanto, esto se tomó como referencia para medir la velocidad de crecimiento de todas las cepas ya que para la selección el crecimiento radial es uno de los parámetros importantes a considerar.

Se usaron dos medios uno con EM al 0.5% y el otro sin EM, con efluente al loo%, observandose que en el medio con EM al 0.5% se presentó una velocidad de crecimiento mayor (2 cddía) y sin EM se obtuvo una velocidad de crecimiento de 1.5 c d d í a por lo que se descartó el medio sin EMA (graf 1).

CRECIMIENTO RAüiAL EN EFLUENTE AL 100% CON M A O.!% Y 0%

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O J I : I I : : : I : : I " X M N & - e (D

TIEMPO ( h )

GmEn No. 1 : Crecjmipato radial deP. cbymqonum h-298 M efluuite al 100% con EMA (0.5% y 0%)

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3

Celeccion de üacidiomiceles

Se realizó una fermentación sumergida con P. chrysosporium en efluente diluido al 50% en a p a destilada se observó un aumento en el crecimiento del hongo y mayor decoloración, por lo tanto, se probaron medios con efluente diluido al 50% y sin diluir, ambos con EM al 0.5% y AB al 1.5%, obteniendose mejores resultados de crecimiento radial en el medio con efluente al 50% con una velociadad de crecimiento de 2.5 ctddía y para el medio con efluente al 100% de 1.9 c d d í a presentandose una diferencia de 0.6 c d d í a (Graf. 2). Las curvas que se muestran en está gráfica son para P. chrysosporium h-289 pero se hizo para todos los diferentes géneros presentandose un comportamiento muy similar.

CRECIMIENTO RAWAL

25 - 2 o 15

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+ElluentealOO%y EMA054

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N TIEMPO (hJ

GmRen 2:Comparación de las CUNW de crocuniento radial deP. chrysosporium h-298 en efluente al 100% y 50% con EMAalOS%mSS AB 1.5%

El medio que finalmente se trabajó con todas las cepas fué el que contenía EM ai 0.5% con efluente diluído al 50% debido a los resultados obtenidos por los diferentes medios probados.

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Csleccion de Bacidiomiceles .... .. .

En el medio seleccionado y tomando en cuenta el tiempo de incubación (40 h) las cepas de Pleurotus ostreaius, I,. edmies presentaron un crecimiento casi nulo teniendo una velocidad de crecimiento promedio de 0.3 cm/día seguidos por el T. versicolor que presentó una velocidad de crecimiento de 0.5 cm/día Por lo tanto, en comparación con el P. chrysosporium que tiene una velocidad de crecimiento de 2.5 cm/día y debido a que para hacer la selección de las cepas uno de los parámetros que se consideran de gran importancia es el crecimiento radial los tres géneros anteriores fueron descartados y se continuó trabajando con las tres diferentes cepas de P. chrysosporim ( h-298, A-594 y h-686), que fueron las que dieron mejores resultados (Graf. 3).

CRECIMIENTO RADlAL

4.50 - 4.00 - 350

+T. versicolor t P. chrysosporiurn ; 1.00

0.00 c I O 24 36 40 48 72 96

TlEMW (h)

Oráfica No. 3: Cmp-ii6n del crecimiento radial entre los tres géneros analizados paca la selección en efluentediluidosl 50%mEMal0.5%yagar1.S0h

Diana V. C o r k Espinosa

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Seleccian de Eacidiomcstes

SELECCION DE LOS P. chysosporium

a) Crecimiento radial.

Se prepararon 7 cajas por cepa las cuales contenían EMA al 0.5% y 1.5% de AB con efluente al 50% y se les midió crecimiento radial; después que invadieron completamente las cajas se dejaron incubando hasta cumplir 110 horas. De estas cajas se tomaron 3 para medir decoloración, 3 cajas para cuantificar biomasa por peso seco y una sirvió como blanco, la cual no se inoculó pero se incubó el mismo tiempo para que sirviera como referencia para la cuantificación del porciento de decoloración.

Phanerochaete ch ysosporiurn h-298

Para calcular la velocidad de crecimiento radial se midió cada 4 h aproximadamente el diámetro del micelio formado por el hongo en las cajas con medio de EMA 2% más AB al 1 5% ya que este medio es óptimo para el crecimiento de hongos, lo cual sirvió como base para poder comparar la iduencia del efluente sobre la velocidad de crecimiento radial en el medio de cultivo con EMA al 0.5% más Ai3 al 1 5% con efluente al 50% como disolvente.

Los diámetros se midieron con un vernier y los resultados obtenidos se dividieron entre dos para poder sacar el crecimiento radial del hongo, se hizo lo mismo con todas las cepas. Los resultados obtenidos en ambos medios se observan en la grafica 4.

-CON EFLUENTE -1

Gratia No. 4 Comparación del wecúiiiato radial (an) P. chrysosporrurn h-298 en EM 2% en agua y EM 0.5% en efluente

Diana V. Cod& Espinosa

15 I_. II. ..

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Sei-on de Bacidiomiceles

En la curva sin efluente se observa que la cepa de P. chry.Yo.vporitrm h-298 invadió la caja a las 32 horas con el medio que contenía EM al 2% en agua, alcanzando un crecimiento radial máximo de 4.2 cm en 32 horas, lo cual corresponde a una velocidad de crecimiento de 3 c d d í a

En la curva que obtuvo con el medio con efluente al 50% se observa que el hongo presentó un crecimiento máximo de 4.2 cm a las 40 h de incubación, lo que corresponde a una velocidad de 2.5 cddía , por lo tanto se observa claramente que la presencia del efluente en el medio provoca una disminición en la velocidad de crecimiento del hongo. Presentandose una diferencia entre las dos velocidades de 0.5 cddia .

Phanerochaete chrysosporium h-686

CRECIMIENTO RAMAL

4 . m 4 . m

0.000 + O 9 19.5 24.5 29 37 45

TlEM Po (h)

Grpfles No. 5: Cmnparacián del cr&enM radial de Phanerochaere chrysosporlum h-686 a 109 medras F.MA al 2% s h eflucnte yEM0.5%candlucnt~al50%ambascon 1 5 % d e A B

En la curva sin efluente se observa que la cepa de P. chrysosporium h-686 invadió la caja a las 30 horas con el medio que contenía EM al 2% en agua, alcanzando un crecimiento radial máximo de 4.2 cm en 30 horas, lo cual corresponde a una velocidad de crecimiento de 3.3 cddía .

16

Selection de üacidiomiceles ........

La curva que se obtuvo con el medio con efluente al 50% muestra que el hongo presentó un crecimiento máximo de 4.2 cm a las 42 h de incubación, lo que corresponde a una velocidad de 2.38 cddía, por lo tanto, se observa claramente que la presencia del efluente en el medio provoca una disminición en la velocidad de crecimiento del hongo de 1 cddía .

Phanerochaetc chrysasporium A-594

CRECIMIENTO RAMAL

; 2.500 - 2.000 0

0.500

; 2.500 - 2.000 0

0.500

D -m- CON ELUENT

En la curva sin efluente se observa que la cepa de P. ch?ysosporrium A-594 que el hongo invadió la caja a las 27 horas con el medio que contenía EM ai 2% y Ai3 al 1.5% en agua, alcanzando un crecimiento radial máximo de 4.2 cm, lo cual corresponde a una velocidad de crecimiento de 3.63 cddía .

La curva que se obtuvo con el medio con efluente al 50% muestra que el hongo presentó un crecimiento máximo de 4.2 cm a las 39 h de incubación, lo que corresponde a una velocidad de 2.6 cddía, por lo tanto, se observa claramente que la presencia del efluente en el medio provoca una disminición en la velocidad de crecimiento del hongo de lcddía .

Diana V. ca16. Espinosa

17

Selection de boidiomicelss

Haciendo una comparación entre las tres cepas de P. chrysosporirrm en el medio con efluente al 50% y 0.5% de EMA se obtuvieron los siguientes resultados que se muestran a continuación en la gráfica 6.

CRECIMIENTO RAMAL

... 4 1

t h-686

P

0.5 O k - t i - - H i

O 19 23 29 39 41

TiEhiFO(h)

GraBer No. 6 Comparción de crecimiento radial de las ires cepas de P. chrysospotium en medio cm dlunite al 50% yEMcmO.5%y IS%de AB.

No se observaron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento que fueron de 2.5 cddía, 2.38 cddía, 2.6 ctnídía para las cepas de P. chrysosporium h-298, h-686 y A- 694 respectivamente.

Para hacer el calculo de la veIocidad de crecimiento se obtuvieron mediciones de 7 cajas por cepa, para poder tener un control del crecimiento, presentandose un crecimiento muy similar en todas las cajas.

Diana V. Cort(n Espinooa

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Seleccion de ñacidiorniceles

DECOLORACION Y BIOMASA

a) BIOMASA.

La biomasa producida por caja, después de 110 h de incubación, se cuantificó de acuerdo a la técnica de peso seco por filtración al vacío que se menciona en la parte de metodología y los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2 Donde la cepa h-686 presentó la mayor cantidad de biomasa.

A-594 O 0225 Tibia 1: Cantidad & bimiasa (u) iiducida L las 110 h de Uicubantm a 39%

la cual se cuantificó por la t k ca de peso seco por fillracibn al vado

b) DECOLORACION

El color se determinó por espectroscopia, por el método de cobalto-platino como se menciona en la parte de metodología.

Las unidades de color se calcularon con la ecuación UC = (500 x Abs muestra)/0.'137 y el porciento de decoloración de las muestras se calculó tomando como el 100% las unidades de color encontradas en la caja que se tomó como blanco de la siguiente manera:

100 - Unidades de color de la muestra x 100 = % DECOLORACION [ Unidades de color del control 1 El porcentajes de decoloración obtenidos para P. chrysosporium fueron del 22.45%, 53.7% y 12.6% para las cepas h-298, h-686 y A-594 respectivamente. Para poder comparar la eficiencia de degradaciión y poder seleccionar una de las cepas, se calculó la decoloración específica, es decir, %decoloración/mg biomaca h. P. chyrsosporzum h-298 presenta una decoloración específica de 6.07%decoloraci6n/mg h, h-686 de 11J0Adecol/g h y A-594 de 5.11% deeol./g b.

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Seleccion de Bacidiornicetes ......

CONCLUSION.

Se puede decir que el crecimiento en efluente al 100% si afecta la velocidad de crecimiento de los hongos al igual que la presencia y ausencia de EM en I cdd ía aproximadamente. Por lo tanto, el medio que dió mejores resultados y fué seleccionado el medio con efluente diluido al 50% con EM 0.5%.

Aunque la cepa A-594 presentó la mayor velocidad de crecimiento al realizarle la técnica de decoloración y peso seco se obtuvieron los resultados más bajos; sin embargo, P. chrysosporium h-686 fué la cepa que presentó la velocidad de crecimiento menor pero fué la que presentó los mejores resultados en la decoloración del efluente y por consiguiente la que produjo la mayor concentración de biomasa

Debido a que las variables principales para la selección de la cepa fueron el porciento de decoloración, el crecimiento radial y producción de biomasa, la cepa seleccionada fué P. chryvo.vorium h-686 por los resultados expuestos anteriormente.

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Seleccioi~ de Bacidiomiceles

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A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la):

del Departamento de: Biotecnología de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud asesoro el Siguiente Servicio Social:

bra. Aracelí Tomasini Campocosio

TITULO: de decolorar un efluente de la industria papelera"

"Selección de basidiomicetes en cultivo superficial en placa capaces

ALUMNO: Cortés Espinosa Diana Verónica

MATR~CULA: 92330028

LICENCIATURA: Ingeniería Bioquímica Industrial

PERIODO: Diciembre 20, 1996 a Junio 20, 1997

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a siete de Octubre de mil novecientos noventa y siete.

A T E N T A M E N T E

M. EN C. ARTURO PRECIADO LÓPEZ SECRETARIO ACADÉMICO