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ELISA

ELISA(acrnimo del inglsEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por

inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica deinmunoensayoen la cual un

antgenoinmovilizado se detecta mediante unanticuerpoenlazado a unaenzimacapaz

de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en

ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que eiste

un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un

anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada! "a

aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometrael

antgeno en la muestra!

#e usa en muc$os laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est% presente

en la muestra de sangre de un paciente! &unque el procedimiento es rutinario y sencillo,

involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura,medicin de volumen y tiempo, que si no se a'ustan correctamente puede afectar a los

pasos sucesivos y al resultado de la prueba!

"a interaccin antgenoanticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar

si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune! ero como prueba

diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer*

En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no

significa necesariamente que el paciente est enfermo! El cuerpo de una persona que $a

estado enferma y que ya se $a recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos! Esto

originara un falso positivo!

En segundo lugar, $ay personas que producen una ba'a cantidad de anticuerpos, por lo

que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso

negativo! #era el caso, por e'emplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia,

o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la

prueba, o que estn infectadas por una cepa etra+a!

En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre

antgenoanticuerpo!

En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediantecentrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda

http://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_ingl%C3%A9shttp://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpohttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:ELISA-sandwich.svghttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:ELISA-sandwich.svghttp://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgenohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpohttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometr%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_ingl%C3%A9s

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ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad! ambin,

debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee

un valor predictivo positivo ba'o en una determinada poblacin, es decir, que esa

enfermedad tiene muy ba'a incidencia en dic$a poblacin, es necesario volver a

confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico independiente!

-ormalmente, se lleva a cabo un .estern blot donde se detecta la presencia de variosanticuerpos, simult%neamente, frente a la misma infeccin en una muestra! El resultado

del .estern se considera positivo cuando aparecen al menos / bandas, que indica que /

anticuerpos diferentes est%n presentes en el su'eto frente a esa infeccin! Entonces es

cuando se diagnostica como positivo a dic$o paciente!

Este principio tiene muc$as de las propiedades de un inmunoensayoideal* es vers%til,

robusto, simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin f%cil

entre la fraccin retenida y la fraccin libre!

&dem%s se $an propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la se+al

(luminiscentes, cascadas enzim%ticas!!!) que $an permitido elevar la sensibilidad dealgunos E"0#& a la obtenida en el 10& (radioinmunoensayo) $ormonal!

Este mtodo $a tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se

precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos* diagnstico clnico,

deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda deanticuerpos

monoclonales, etc!

Contenido

2 3ispositivos empleados en E"0#& 4 5ases de un ensayo E"0#&

6 ipos de ensayos E"0#&

7 8uimioluminiscencia

/ 9arcadores enzim%ticos m%s comnmente utilizados

: rueba E"0#

< Enlaces eternos

Dispositivos empleados en ELISA

http://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Radioinmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpos_monoclonaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpos_monoclonaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpos_monoclonaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Dispositivos_empleados_en_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Fases_de_un_ensayo_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Tipos_de_ensayos_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Quimioluminiscenciahttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Marcadores_enzim.C3.A1ticos_m.C3.A1s_com.C3.BAnmente_utilizadoshttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Prueba_ELISPOThttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Enlaces_externoshttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microtiter_plate.JPGhttp://es.wikipedia.org/wiki/Inmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Radioinmunoensayohttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpos_monoclonaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpos_monoclonaleshttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Dispositivos_empleados_en_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Fases_de_un_ensayo_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Tipos_de_ensayos_ELISAhttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Quimioluminiscenciahttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Marcadores_enzim.C3.A1ticos_m.C3.A1s_com.C3.BAnmente_utilizadoshttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Prueba_ELISPOThttp://es.wikipedia.org/wiki/ELISA#Enlaces_externos

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#e $an ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las

actuales microplacas de =: pocillos de pl%stico tratado para aumentar su capacidad de

absorcin (fenmeno de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente

claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos,espectrofotmetros de lectura de placas que $an recibido el nombre de lectores ELISA!

&ctualmente se est%n desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por e'emplo con

6>7 y 2/6: pocillos, adecuados para los sistemas de ?screening? masivo de los sistemas

robotizados (@#, ?@ig$t$roug$put system?)

"os lectores ELISAson espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de

cada uno de los pocillos de la placa E"0#&! & diferencia de un espectrofotmetro

convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el

visible de manera continua, los lectores de E"0#& disponen de sistemas de filtros que

slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda! #on la que se corresponden

con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos m%s

comnmente utilizados!

Fases de un ensayo ELISA

Bajar ELISA.gif !!! Pademostracin!!!

"as 7 fases de un ensayo E"0#& son las siguientes*

1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima(peroidasa,

fosfatasa alcalina!!!)! El anticuerpo con'ugado a la enzima se emplea en losensayos directos e indirectos, sand.ic$, etc! El antgeno marcado se emplea en

ensayos de competicin de antgeno! 3ic$a unin anticuerpoenzima o antgeno

enzima $a de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de

producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o

cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de

onda de 727 nm)! #i no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin,

no se evidenciar% ningn color, interpret%ndose este resultado como un falso

negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica!

2. Unin del antgeno o del anticuerpo! a los pocillos! "a unin de anticuerpos o

antgenos se realiza con facilidad a la superficie de pl%sticos tratados que tienen

gran afinidad por protenas! &s, el procedimiento de recubrimiento de lospocillos debe realizarse cuidadosamente! #i se usa poco antgeno, se pueden

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:ELISA.jpghttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:ELISA.jpghttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Microtiter_plate.JPG

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obtener falsos positivos! or el contrario, si se usa demasiado antgeno, el eceso

dar% lugar a una reaccin falsa negativa!

3. Formacin de una o m"s capas de inmunocomplejos! En el caso del antgeno

unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo antiantgeno marcado

(E"0#& directo) o empleando un anticuerpo primario antiantgeno y unsecundario anti primario marcado (E"0#& indirecto)! Este segundo mtodo

permite la amplificacin de la se+al al poderse unir uno o m%s anticuerpos

secundarios a cada anticuerpo primario! En el caso del anticuerpo unido a la

placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado! #e ensayan

diferentes relaciones de antgeno frofrente a una cantidad fi'a de antgeno

marcado! Es el ensayo de competicin del antgeno! En esta etapa es muy

importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar

la aparicin de falsos negativos! En el caso del tiempo, si es inferior a 2/

minutos, no ocurrir% la interaccin antgenoanticuerpo y el color no ser%

evidente al final del ensayo, dando un falso negativo! or su parte, si la

temperatura de incubacin es muy ba'a, la formacin del comple'o antgenoanticuerpo tampoco se completar% en el tiempo establecido, mientras que si es

muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto

disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos!

4. #evelado de la reaccin enzim"tica! 3espus de un lavado para eliminar todos

las molculas marcadas no fi'adas en forma de inmunocomple'os se a+ade el

sustrato enzim%tico en solucin! #e de'a reaccionar y se lee la densidad ptica

(3!!) mediante espectrofotometra!

$ipos de ensayos ELISA

#e $an desarrollado mltiples variantes de ensayos E"0#& que permiten desde la

cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin

(por e'emplo en el clona'e de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la

subclase (idiotipo) de un anticuerpo! & continuacin se describen los m%s comunes!

ELISA directo(ensayo E"0#& simple de dos capas)! "as placas E"0#& se

preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospec$a se

encuentra el antgeno! #e incuban con anticuerpos marcados! 0ndican la

presencia de antgeno en la solucin analizada! Es necesario incluir controles

negativos que ser%n muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,!!!)pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado!

http://es.wikipedia.org/wiki/Fr%C3%ADohttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:PHIL_3575_lores.jpghttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:PHIL_3575_lores.jpghttp://es.wikipedia.org/wiki/Fr%C3%ADo

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&simismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el

antgeno buscado)!

ELISA indirecto! "as placas E"0#& se preparan de la misma forma a la

anterior! "os controles positivos y negativos son los mismos! El sistema de

deteccin emplea dos anticuerpos* uno primario contra el antgeno y unosecundario marcado contra el primario! "a deteccin tiene mayor sensibilidad

por presentar una amplificacin de se+al debida a la unin de dos o m%s

anticuerpos secundarios por cada primario! Es el ensayo m%s popular, como lo es

la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un

mismo sistema enzim%tico permite cuantificar una gran variedad de antgenos,

por eso es un mtodo m%s polivalente y barato, aunque se pierda algo de

precisin por tener un eslabn m%s con respecto al mtodo directo! "a dilucin

de la solucin que contiene el anticuerpo primario (por e'emplo* suero

sanguneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin

de falsos negativos, ya que si la muestra est% muy diluida no saldr% positiva si la

titulacin de anticuerpos es muy ba'a! Es decir, aunque los anticuerpos est%npresentes, la prueba no da positivo porque la concentracin de anticuerpos

especficos contra el antgeno que est% pegado en el fondo del pocillo no es

suficiente como para dar una se+al detectable!

El E"0#& indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de

anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia $umana (A0@),

agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (#03&)! #egn

esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del A0@ se

absorben como antgenos en fase slida a los pocillos! "as personas afectadas de

A0@ producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas! En

general, el E"0#& indirecto permite detectar anticuepos sricos contra A0@

desde las primeras seis semanas de una infeccin!

ELISA sndwich(Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante

inmunocomple'os)! #e trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el

pocillo con un primer anticuerpo antiantgeno! 3espus de lavar el eceso de

anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que

ser% retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo! 3espus de

un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin

con un segundo anticuerpo antiantgeno marcado! &s pues cada molcula de

antgeno estar% unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo

anticuerpo, al menos, que lo marca! Este ensayo tiene una gran especificidad ysensibilidad debido a la amplificacin de se+al que permite el segundo

anticuerpo!

%uimioluminiscencia

http://es.wikipedia.org/wiki/VIHhttp://es.wikipedia.org/wiki/SIDAhttp://es.wikipedia.org/wiki/VIHhttp://es.wikipedia.org/wiki/SIDA

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3urante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno

constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de

absorbancia en E"0#&! "os tipos de E"0#& que recurren a la quimioluminiscencia

utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones

E"0#& ordinarias! ales son los casos de la oidacin del compuesto luminol por

perido de $idrgeno y la enzima peroidasa de r%bano (@1), que producen luz!

"a luz que se genera en dic$as reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de

sensibilizar una pelicula fotogr%fica! "a medicin cuantitativa de la emisin de luz

puede $acerse mediante el uso de un luminmetro! "a venta'a de las pruebas de

quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la me'ora de la sensibilidad! En general,

el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato

cromgeno por uno que emita luz, y m%s de doscientas veces cuando se adicionan

agentes potenciadores!

&arcadores enzim"ticos m"s com'nmente utilizadosEn la tabla siguiente se recogen los marcadores enzim%ticos m%s comnmente

empleados en ensayos E"0#&, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo

de prepararlos!

Enzima #ustrato ampn

@1 (peroidasa de r%bano) 3 2B mgC4/ m" de tampn citrato sdico B!2/

9p@/; a+adir micro" de 6BD perido de $idrgeno 6BD

9 4!/ mgC4/B micro" de 39#; $asta 4/ ml con tampn citrato sdico

B!29p@:; a+adir / micro" de perido de $idrgeno 6BD

:B mgC2BB m" de tampn citrato sdico B!2 9 p@ :; a+adir 6/ micro" de

perido de $idrgeno 6BD; parar con fluoruro sdico 2!4/D; leer a 7B/ nm

3& 2B mgC4B m" de tampn ris /B m9p@

&EF >B mg en 2 m" de -,-?dimetilformamida G 4BB micro" de tampn

acetato B!2 9p@7!/; filtrar y a+adir /B micro" de perido de $idrgeno 6BD

http://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:ELISA_test_for_HIV.jpghttp://commons.wikimedia.org/wiki/File:ELISA_test_for_HIV.jpghttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PH

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& >B mgC2BB m" de agua destilada caliente; a'ustar ap@:!B con 2 m9

-a@ y a+adir 2B D por volumen de B!B/D perido de $idrgeno; parar con

4/ micro" de -a@ 2 9

& (5osfatasa alcalina) - / mgC/ m" de tampn dietanolamina@Fl B!2 9

p@=!> G2 m9 cloruro de magnesio

-&5 (&) 7 mg de fosfato de naftol en 4BB micro" de dimetilformamida en un

tubo de vidrio, () 2B mg de sal 5ast lue C 2B ml de tampn ris B!B/9p@

=!4 4 m9 cloruro de magnesio! 9ezclar & G y filtrar!

-&1 (&) 7 mg de fosfato de naftol en 4BB micro" de dimetilformamida en un

tubo de vidrio, () 2B mg de sal 1ed C 2B ml de tampn ris B!B/9p@=!4

4 m9 cloruro de magnesio! 9ezclar & G y filtrar!

F0 2 mgCm" en solucin &9 (4amino4metilpropanol)

betaH -H 4!/ mgCml en tampn fosfato sdico B!2 9p@

ureasa > mgC2!7> ml de B!B29 -a@; llevarlo a 2BB ml con agua

desionizada; a+adir 2BB mg de urea y E3& a B!4 m9; a'ustar elp@a 7!> con 2

m9 -a@ o @Fl; almacenar a 7 IF

H 0# &+adir a cada placa de E"0#& 4/ micro" de cada uno de los reactivos

siguientes en secuencia * (&) 2D (pesoCvol) gelatina en B!2 9 tampn fosfayo

p@

ioduro en B!2 9 K0 solucin stocL (en una botella oscura)!

(rue)a ELIS(*$

Jna variante de la prueba E"0#&, llamada E"0#, es capaz de detectar

cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos

especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un

anticuerpo especfico! &qu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el

anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se

valora! #eguidamente, se a+ade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin

celular que se investiga e incuba! "as clulas se disponen en la superficie de la placa, y

las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana

de las clulas secretoras, producindose un anillo de comple'os antgenoanticuerpo

alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters! 3espus, la placa se lava y

un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de

anticuerpo secretado, se a+ade y de'a que se unan! El posterior revelado del ensayo

mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado, indica la posicin

de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz!

http://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Beta-mercaptoetanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Beta-mercaptoetanolhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/PH