Embed Size (px)
DESCRIPTION
To elucidate the phenanthrene catabolic pathway of the PAH-degrading strain Sphingomonas paucimobilis 20006FA, through: the study of phenanthrene degradation and production of the key metabolite of phenanthrene degradation, the 1-hydroxy naftoic acid comparative proteomic analysis (performed by two dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MS)) of bacteria grown under different C-source conditions, using glucose or phenanthrene as sole carbon source
Citation preview
Lic. en Biotecnología [email protected]
Lic. en Biotecnología [email protected]
Lugar de Trabajo:
Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones
Industriales
Lic. en Biotecnología [email protected]
“La utopía está en el horizonte. Camino dos pasos, ella se aleja dos pasos. Yo
camino diez pasos y ella está diez pasos más lejos. ¿Entonces para qué sirve
la utopía? Sirve para eso, para caminar”.
Eduardo Galeano (extraída del libro “Patagonia de Pie. Ecología vs
Negociados”).
Lic. en Biotecnología
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 6
I.A. Contaminación con Hidrocarburos. ........................................................................... 6
I.A.1 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAH). ...................................................... 6
I.B Biorremediación de sitios contaminados con PAH: ................................................... 7
I.B.1 Bioaumento como estrategia para mejorar la biodegradación de PAH: .................. 8
I.B.2 Selección de inoculantes para suelos contaminados con PAH: ............................... 9
I.B.3 El fenantreno como modelo: ................................................................................. 12
I.B.4 Degradación bacteriana del fenantreno: ................................................................ 13
I.C Dilucidación de rutas metabólicas ............................................................................ 15
I.C.1 Búsqueda de metabolitos intermediarios. .............................................................. 15
1.C.2 Utilización de métodos proteómicos. .................................................................... 16
II. OBJETIVOS ........................................................................................................... 18
II.A Objetivo General ................................................................................................. 18
II.B Objetivos Específicos .......................................................................................... 18
III. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 19
MATERIALES ............................................................................................................... 19
III.A.1 Cepa utilizada ................................................................................................. 19
III.A.2 Medios de Cultivo: ......................................................................................... 19
III.A.3 Reactivos......................................................................................................... 20
III.B METODOLOGÍA .................................................................................................. 20
III.B.1 Caracterización metabólica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA:
.................................................................................................................................... 20
III.B.1.i Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno
como única fuente de carbono y energía ................................................................ 21
III.B.1.ii Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa
como única fuente de carbono y energía ................................................................ 21
III.B.1.iii Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando ácido
naftoico como única fuente de carbono y energía .................................................. 21
III.B.2 Estudio de la cinética de degradación de fenantreno en cultivos batch por la
cepa S. paucimobilis 20006FA: ................................................................................. 21
III.B.2.i Preparación del inóculo............................................................................ 22
III.B.2.ii Ensayo ..................................................................................................... 22
III.B.2.iii Determinación de la concentración de fenantreno y ácido naftoico en
MML ....................................................................................................................... 22
III.B.3 Estudio de la capacidad de degradación de ácido naftoico en cultivos batch
por la cepa S. paucimobilis 20006FA:........................................................................ 23
III.B.3.i Preparación del inóculo............................................................................ 23
III.B.3.ii Ensayo ...................................................................................................... 23
III.B.3.iii Determinación de la concentración de ácido naftoico .......................... 23
III.B.4 Estudio del efecto de Ácido Naftoico en la cinética de degradación de
Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA.......................... 23
III.B.5 Estudio del proteoma de la cepa. ........................................................................ 24
III.B.5.1 Preparación de cultivos en biorreactor ......................................................... 24
III.B.5.1.a Crecimiento en fenantreno 0.84g/l como única fuente de carbono y
energía .................................................................................................................... 24
III.B.5.1.b Crecimiento en Glucosa 2g/l como única fuente de Carbono y Energía
................................................................................................................................ 25
III.B.5.2 Lisado Celular .............................................................................................. 26
Lic. en Biotecnología
III.B.5.3 Electroforesis Bidimensional 2-D ................................................................ 26
III.B.5.4 Análisis de las Imágenes de los Geles: ........................................................ 27
III.B.5.5 Identificación de Proteínas:.......................................................................... 27
IV. RESULTADOS ...................................................................................................... 29
IV.A Caracterización metabólica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA: 29
IV.A.1 Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como
única fuente de carbono y energía .............................................................................. 29
IV.A.2 Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno
como única fuente de carbono y energía. ............................................................... 31
IV.B Estudio de la cinética de degradación de fenantreno en cultivos batch por la
cepa S. paucimobilis 20006FA: .................................................................................. 33
IV.C. Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando ácido naftoico
como única fuente de carbono y energía .................................................................... 35
IV.C.1 Estudio de la capacidad de degradación de ácido naftoico en cultivos batch
por la cepa S. paucimobilis 20006FA ......................................................................... 37
IV.C.2 Estudio del efecto de ácido naftoico en la cinética de degradación de
Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA.......................... 38
IV.D Estudio del proteoma de la cepa S. paucimobilis 20006FA: ............................. 41
V. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 44
VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................. 51
Lic. en Biotecnología
I. INTRODUCCIÓN
I.A. Contaminación con Hidrocarburos.
La contaminación con hidrocarburos se produce por su liberación accidental o
intencionada en el ambiente, provocando efectos adversos sobre el hombre y sobre el
medio ambiente de forma directa. La refinación del petróleo y su transporte son los
mayores contribuyentes de la concentración de hidrocarburos en el ambiente, ya que
provocan descargas accidentales (Kanaly y Harayama, 2000). Los derrames de petróleo
y los desechos producen diversos efectos sobre el suelo, provocando la alteración del
sustrato original en que se implantan las especies vegetales dejando suelos inutilizables
durante años (Instituto Argentino del Petróleo, 1991). Entre los hidrocarburos más
importantes desde el punto de vista toxicológico se encuentran los Hidrocarburos
Policíclicos Aromáticos (PAH), los cuales se bioacumulan en la cadena alimentaria
suponiendo un riesgo para la salud humana (Olie y col., 1977).
I.A.1 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAH).
Los PAH son un grupo químico que contienen dos o más anillos bencénicos
fusionados en arreglos lineales, angulares, o ramificados (Cerniglia y col., 1992;
Cheung y col., 2001).
Las propiedades físico-químicas de los PAH varían en función del número de
anillos y, por tanto, por su peso molecular. La reactividad química, la solubilidad en
agua y la volatilidad disminuyen con el aumento del peso molecular. Como resultado,
los PAH se diferencian en su transporte, distribución y destino en el medio ambiente y
sus efectos sobre los sistemas biológicos. La Agencia de Protección Ambiental (EPA)
ha identificado 16 PAH como contaminantes prioritarios. Esto se debe
fundamentalmente a la peligrosidad intrínseca de los PAH, debido a la toxicidad aguda
Lic. en Biotecnología
y a la toxicidad de tipo teratogénico, mutagénico y carcinogénico que presentan (La
Voie y Rice, 1988). Entre los menos fáciles de degradar se encuentran los PAH de alto
peso molecular. Las principales fuentes de producción de PAH son la combustión
incompleta de materia orgánica, la producción de gas, instalaciones de tratamiento de
madera, y la incineración de desechos (Kanaly y Harayama, 2000; Kim y col., 2003).
También los PAH se forman de manera natural durante reacciones geológicas térmicas
asociadas con los combustibles fósiles, la producción minera, y durante la quema de
vegetación en los bosques y los incendios forestales (Juhasz y col., 2000; Wilson y
Jones, 1993).
I.B Biorremediación de sitios contaminados con PAH:
Las estrategias de remediación requieren métodos fiables para identificar y
vigilar la contaminación, como así también, procedimientos eficaces para atenuar o
eliminar los contaminantes. Las estrategias de remediación físico-químicas
convencionales tales como vertederos, reciclaje, pirólisis, excavación, incineración,
utilizadas para remediar sitios contaminados son ineficientes, costosas y también
pueden conducir a la formación de productos intermediarios más tóxicos que los
contaminantes originales. Durante las dos últimas décadas, la biorremediación se ha
convertido en una alternativa más segura, ecológica, económica y viable para la
restauración de los sitios contaminados (Dua y col. 2002).
Casi todos los seres vivos están dotados con algún nivel mínimo de habilidades
tales como la desintoxicación, mineralización, transformación y/o inmovilización de
contaminantes. Sin embargo, los microorganismos y en particular, las bacterias y los
hongos, han sido extensamente estudiados y utilizados para llevar a cabo las actividades
de desintoxicación (Watanabe y Baker, 2000; Rieger y col., 2002; Peng y col., 2008;
Seo y col., 2009). Las bacterias contienen una enorme diversidad metabólica que les
Lic. en Biotecnología
permite utilizar compuestos químicos complejos como fuente de carbono y de energía
(Rieger y col., 2002; Díaz y col., 2004; Nojiri y Tsuda 2005; Seo y col., 2009).
La biodegradación de PAH se basa en la ruptura de compuestos orgánicos a
través de la biotransformación originando metabolitos menos tóxicos o inocuos para el
medio ambiente o con el fin de realizar una mineralización generando H2O, CO2
(aeróbica) o CH4 (anaeróbico) como productos finales. El alcance y la velocidad de
biodegradación depende de muchos factores, incluyendo: pH, temperatura, oxígeno, la
población microbiana, el grado de aclimatación, accesibilidad de nutrientes, la
estructura química del compuesto, edad de la contaminación, propiedades de transporte
celular y partición química en el medio de crecimiento (Singh y Ward, 2004; Vázquez-
Nuñez y col., 2009; Haritash y Kaushik, 2009). Además, los procesos físico-químicos
que controlan la partición entre la fase sólida y líquida, y la posterior accesibilidad del
soluto para los microorganismos pueden afectar la eficacia de la biorremediación de
suelos contaminados con PAH (Mihelcic y col., 1993). Debido a su alta hidrofobicidad,
los PAH tienden a interactuar con la fase no acuosa del suelo y con la materia orgánica.
Como consecuencia, se convierten en compuestos difícilmente disponibles para la
degradación microbiana, muchos microorganismos que degradan PAH, sólo pueden
hacerlo cuando estos se encuentran disueltos en el agua (Johnsen y col., 2005). La
biodisponibilidad es para los microorganismos un factor importante de selección de
especies, de este modo bacterias del mismo suelo pueden ser seleccionadas por sus
diferentes capacidades para manejar la biodisponibilidad de PAH (Mueller y Shann,
2006).
I.B.1 Bioaumento como estrategia para mejorar la biodegradación de PAH:
Una estrategia muy utilizada para incrementar la biodegradación de
hidrocarburos es el bioaumento. La estrategia de bioaumento consiste en el aumento de
Lic. en Biotecnología
las capacidades metabólicas de la comunidad microbiológica indígena por la
introducción de microorganismos, a fin de incrementar la velocidad o la extensión de la
degradación de un contaminante (El Fantroussi y Agathos, 2005). Generalmente, se
lleva a cabo a través de la introducción de poblaciones bacterianas (cepas individuales o
consorcios bacterianos) en exceso, activos y con capacidades degradadoras que puedan
llevar al contaminante a la mineralización, de tal modo que proporciona una reparación
del sitio contaminado más rápida de lo que se produce por medio la utilización de los
microorganismos indígenas (Thompson y col., 2005; Gentry y col., 2004).
I.B.2 Selección de inoculantes para suelos contaminados con PAH:
Cuando la microbiota natural no posee la capacidad para degradar
eficientemente los compuestos contaminantes, la estrategia de bioaumento, es una vía
posible para mejorar el éxito del proceso (Serrano y col., 2009). El uso de los
microorganismos autóctonos para la biorremediación de suelos contaminados es de gran
interés, ya que se espera que estos microorganismos se encuentren más adaptados al
entorno del suelo y sean capaces de establecerse luego de la entrada de un
contaminante, que los microorganismos foráneos que puedan llegar a introducirse como
inóculos microbianos para llevar a cabo la biorremediación (Amezcua-Allier y col.,
2010). Aunque, la eficacia del bioaumento es una materia en discusión, ya que se han
reportado resultados tanto positivos como negativos en su utilización, esta metodología
sigue siendo muy prometedora para la remediación de suelos con PAH. Por una parte, el
bioaumento ha demostrado su eficacia para la recuperación de sedimentos contaminados
con PAH carentes de potencial de degradación intrínseca (Major y col., 2008; Juhasz y
Naidu, 2000), mientras que otros estudios demostraron que el bioaumento no ha podido
Lic. en Biotecnología
mejorar significativamente la biodegradación en comparación con la atenuación natural
(Tam y Wong, 2008; Coppotelli y col., 2008).
Los inóculos para el bioaumento suelen ser producidos en biorreactores, siendo
la transferencia de estos cultivos al sitio contaminado la etapa crítica del proceso (Tyagi
y col., 2010). Los inóculos microbianos al ser introducidos en los ambientes
contaminados frecuentemente sufren un alto estrés en sus condiciones de crecimiento.
En estudios a campo, la población introducida comienza a disminuir poco después de
ser añadida, debido a varios factores abióticos y bióticos de estrés (Mrozika y
Piotrowska-Segetb, 2010).
Las parámetros que dificultan el crecimiento microbiano incluyen las
fluctuaciones o temperaturas extremas, contenido de agua, el pH, el potencial redox, el
agotamiento de los nutrientes, la biodisponibilidad del contaminante, o la ausencia de
los principales co-sustratos, la competencia entre la comunidad indígena y la biomasa
introducida, el uso de otros sustratos orgánicos con preferencia a los contaminantes, la
predación, y también las concentraciones de los contaminantes (Gentry y col., 2004;
Goldstein y col., 1985; Tyagi y col., 2010). Por lo que el factor clave e imprescindible
para el éxito de la bioaumentación es la selección adecuada de la cepa bacteriana para
este propósito (Thompson y col., 2005).
La selección de una cepa para ser utilizada en el bioaumento, no sólo debería
basarse por su habilidad para la degradación, sino también por las características
ecológicas relativas a la adaptación al hábitat en la cual se la quiera introducir. La
selección debe cumplir con las siguientes consideraciones: i) deben ser fácilmente
manipulables, ii) tener habilidades catabólicas excepcionales, iii) tolerancia al estrés
ambiental y a crecer en presencia de co-contaminantes (por ejemplo, metales pesados),
iv) no ser riesgosas para la salud y v) en el caso de la biorremediación de PAH deberían
Lic. en Biotecnología
tener propiedades promotoras de la biodisponibilidad para hacer más asequibles los
contaminantes al ataque bacteriano (Singer y col., 2005; Thompson y col., 2005;
Mrozika y Piotrowska-Segetb, 2009; Coppotelli y col., 2010).
La aplicación de técnicas moleculares, puede ayudar a identificar los organismos
potencialmente remediadores y descubrir lo que hace que algunas especies sean más
persistentes que otras, logrando mejorar el conocimiento sobre la diversidad microbiana
en los ambientes naturales, conduciendo al desarrollo de una colección de organismos
bien caracterizados con altas capacidades de degradación y tolerancia a una amplia
gama de productos químicos del medio ambiente y al estrés físico (Wessels Perelo,
2010).
Un esfuerzo considerable se ha centrado en la búsqueda y aislamiento de
microorganismos capaces de degradar PAH que utilicen a los mismos como fuente de
carbono y de energía (Zhao y col., 2008). El género Sphingomonas puede ser
considerado como “miembro clave” entre los géneros bacterianos degradadores de PAH
del suelo, ya que ha sido frecuentemente aislado de sitios contaminados con este tipo de
hidrocarburos (Bastiaens y col., 2000; Coppotelli y col., 2008).
En nuestro grupo de trabajo se ha estudiado ampliamente la cepa Sphingomonas
paucimobilis 20006FA, la misma fue aislada a partir de microcosmos de suelo
contaminados artificialmente con 2 g/Kg de fenantreno e incubados a temperatura
ambiente (20 ± 2 °C), seleccionada de acuerdo a su capacidad para degradar un amplio
rango de PAH (fenantreno, dibenzotiofeno y antraceno), e identificada mediante la
secuenciación del gen16s ribosomal como Sphingomonas paucimobilis (99%).
En estudios previos utilizando la estrategia de bioaumento, se ha demostrado que
la cepa se establece rápidamente en el suelo contaminado con fenantreno y que
incrementa la degradación del mismo durante los primeros 20 días de haber sido
Lic. en Biotecnología
inoculada. Luego de este lapso de tiempo, se observó un retardo en el descenso de la
concentración de fenantreno (Coppotelli y col., 2008). Se ha hipotetizado que este
retardo en la degradación de fenantreno se debe a una acumulación de intermediarios
metabólicos y no a una escasa biodisponibilidad del fenantreno, ya que más tarde la
degradación continúa hasta alcanzar los niveles del control. Al estudiar la degradación
de fenantreno en medio liquido se observó que cepa produce dos intermediarios
mayoritarios ácido 1-hidroxi-2-naftoico y ácido salicílico, demostrando que el
fenantreno es degradado por la cepa utilizando la ruta de degradación vía salicilato
(Coppotelli y col., 2010). También, se demostró que la cepa tiene dos mecanismos bien
diferenciados para hacer al fenantreno más biodisponible: i) excreción de surfactante,
facilitando la toma del fenantreno por la cepa. ii) capacidad de adherirse a los cristales
de fenantreno, aumentando la biodisponibilidad del mismo. (Coppotelli y col., 2010).
También, se ha comprobado que la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA
posee propiedades ecológicas importantes para ser utilizada como inoculante en suelo:
i) habilidad para crecer en ambientes oligotróficos, ii) producción de biosurfactantes, iii)
capacidad de adherirse a superficies y de producir biofilms, iv) capacidad de
crecimiento rápido en un rango amplio de temperatura, concentración salina y pH, v)
movilidad celular y quimiotaxis (Coppotelli y col., 2010).
I.B.3 El fenantreno como modelo:
El fenantreno es un PAH tricíclico que presenta dos regiones: Bay y K (Figura
1), altamente reactivas donde se pueden formar las principales especies carcinogénicas,
generalmente epóxidos (Correia y col. 2007; Amezcua-Allier y col., 2010), y por esta
razón, es comúnmente utilizado como sustrato modelo en estudios sobre el metabolismo
de los PAH carcinogénicos. Además, la degradación de PAH de alto peso molecular
Lic. en Biotecnología
puede ser llevada a cabo a través de los intermediarios de fenantreno (Cerniglia, 1992).
El fenantreno, se encuentra en altas concentraciones en zonas contaminadas tales como
sedimentos, suelos superficiales y sitios de desechos (Moody y col., 2001). La
degradación bacteriana de fenantreno ha sido estudiada ampliamente. Se han aislado
una variedad de cepas bacterianas con la capacidad de utilizar fenantreno como fuente
de carbono y de energía, entre ellas se encuentran: Acidovorax, Arthrobacter,
Brevibacterium, Burkholderia, Comamonas, Mycobacterium, Pseudomonas y
Sphingomonas (Pinyakong y col., 2003; Prabhu y Phale, 2003; Seo y col., 2006).
I.B.4 Degradación bacteriana del fenantreno:
La degradación bacteriana del fenantreno comienza con la incorporación de dos
átomos de oxígeno en su estructura en una reacción catalizada, por una enzima
dioxigenasa (Habe y Omori, 2003). La dioxigenación de la molécula de fenantreno es
llevada a cabo en los carbonos 9 y 10 en las bacterias Gram positivas (Vila y col.,
2001). En cambio, en las bacterias Gram negativas la dioxigenación se realiza en los
carbonos 3,4 o 1,2. El dihidrodiol resultante se convertirá por la acción de la dihidrodiol
deshidrogenasa en 3,4-dihidroxifenantreno, el cual será objeto del meta clivaje, y en los
pasos posteriores se convierte en ácido 1-hidroxi-2-naftoico. El ácido 1-hidroxi-2-
naftoico es el intermediario principal durante la degradación microbiológica de
fenantreno (Balashova y col., 2001; Mallick y col., 2007; Peng y col., 2008). El ácido 1-
Figura 2. Estructura
química de la molécula
de fenantreno.
Lic. en Biotecnología
hidroxi-2-naftoico puede ser degradado por dos vías diferentes reportadas hasta ahora.
En una de las rutas, el ácido 1-hidroxi-2-naftoico sufre descarboxilación oxidativa para
formar 1,2-dihidroxinaftaleno, que posteriormente es metabolizado por la ruta de
degradación de naftaleno vía salicilato y catecol. En la otra ruta, el ácido 1-hidroxi-2-
naftoico es metabolizado a través de la vía ácido ftálico y ácido protocatecuato
(Kiyohara y Nagao, 1978; Evans y col., 1965; Seo y col., 2007) (Figura 2).
Tanto el catecol y el ácido protocatecuato generan metabolitos terminales que
ingresan al Ciclo de Krebs, para generar energía en forma de ATP necesaria para los
procesos celulares que llevan a cabo los microorganismos (Habe y Omori 2003).
Figura 2. Rutas propuestas para la degradación de fenantreno por bacterias (Pinyakong, 2000)
Lic. en Biotecnología
I.C Dilucidación de rutas metabólicas
Como se ha dicho anteriormente, una amplia gama de microorganismos
contribuyen de manera importante a la oxidación de hidrocarburos aromáticos en los
hábitats del medio ambiente (Cerniglia, 1992). En muchos casos, se encuentra suficiente
información para esbozar, al menos en parte, las vías catabólicas de interés.
Dependiendo de los hidrocarburos aromáticos y los microorganismos estudiados, se han
reportado las vías metabólicas que llevan a la completa mineralización o a la
transformación parcial de las sustancias intermediarias de acumulación. Por lo tanto, la
biodegradación bacteriana de los PAH debe ser acompañada con el conocimiento de las
vías metabólicas, los mecanismos bioquímicos y de las enzimas implicadas en el
metabolismo celular, ya que estas ayudarán en el abordaje de la evaluación del riesgo
para determinar su impacto potencial.
En el intento de estudiar este aspecto de la contaminación ambiental, se utilizan
estrategias tradicionales que incluyen la elucidación de la estructura química de los
metabolitos y la caracterización, molecular y bioquímica, de los genes que codifican las
enzimas claves involucradas en la degradación microbiana de los hidrocarburos
aromáticos. Sin embargo, el desarrollo reciente de técnicas de alta resolución analítica y
técnicas de genómica funcional, en particular la proteómica se han convertido en
crucialmente importantes para el estudio de mecanismos de degradación de
hidrocarburos aromáticos por los microorganismos (Kim y col., 2010).
I.C.1 Búsqueda de metabolitos intermediarios.
La metabolómica estudia la colección cuantitativa total de compuestos de bajo
peso molecular (metabolitos) presentes en una célula u organismo que participan en las
Lic. en Biotecnología
reacciones metabólicas necesarios para el crecimiento, el mantenimiento y el
funcionamiento normal del mismo (Goodacre y col., 2003; Bolten y col., 2007).
La información detallada de diferenciación metabolómica es también uno de los
requisitos previos más importantes para una mejor comprensión del metabolismo de las
bacterias y de los contaminantes ambientales. Además, varios metabolitos son tóxicos
para los microorganismos a través del agotamiento de los equivalentes de reducción o
cofactores (Chang y Zylstra, 1999; Kim y col., 2004). Entender cómo un metabolito
puede interactuar con un determinado receptor o enzima, requiere el conocimiento de
los metabolitos producidos y de su persistencia en el medio ambiente. La rápida
adaptación metabólica de los microorganismos a los cambios ambientales es muy
común y es de esperar, que cambios similares ocurran también en las bacterias
degradadoras de PAH.
Una información cuantitativa y comparativa de los diferentes metabolitos
producidos, proporcionará una mejor comprensión del metabolismo de las bacterias
degradadoras de PAH, y contribuirá a mejorar el conocimiento sobre las rutas
metabólicas implicadas en la biorremediación de ambientes contaminados (Seo y col.,
2009).
1.C.2 Utilización de métodos proteómicos.
Ya que las proteínas son consideradas los principales efectores de la respuesta
biológica de un microorganismo frente a condiciones ambientales específicas, con el fin
de confirmar la vía de degradación un microorganismo puede seguir, el análisis del
proteoma (proteínas totales de un microorganismo en un determinado momento) resulta
de importancia crucial, proveyendo información para la identificación y cuantificación
de enzimas bacterianas responsables del metabolismo de los hidrocarburos policíclicos
aromáticos (Loh y col., 2008; Kim y col., 2009), de modo que estas estrategias también
Lic. en Biotecnología
contribuirán a la identificación de nuevas funciones involucradas en las complejas rutas
metabólicas relacionadas con la degradación de PAH con aplicaciones en la
biorremediación ambiental.
Lic. en Biotecnología
II. OBJETIVOS
II.A Objetivo General
El presente trabajo propone establecer la vía metabólica de degradación del
fenantreno de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA, a través del estudio de los
metabolitos producidos y de las proteínas expresadas durante la degradación.
II.B Objetivos Específicos
Estudiar en biorreactores batch la cinética de degradación de PAH de la
cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA
Elucidar el flujo del carbono mediante el estudio de los productos
intermediarios de degradación de fenantreno y la influencia de éstos sobre la
degradación del PAH
Estudiar el proteoma de la cepa en cultivos con fenantreno como única
fuente de carbono y energía.
Lic. en Biotecnología
III. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES
III.A.1 Cepa utilizada
La cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA (DQ400860) fue crecida en caldo
R3 a 28 ºC y en agitación a 150 rpm y alícuotas de 1 ml fueron almacenadas con
glicerol al 20 % v/v a – 80ºC para su preservación (Coppotelli y col., 2008).
III.A.2 Medios de Cultivo:
Caldo R2 (Reasoner y Geldreich, 1985)
Composición en g/L de agua destilada.
0.5 g de Extracto de levadura
0.5 g de Proteosa peptona
0.5 g de Ácido Casamino
0.5 g de Glucosa
0.5 g de Almidón
0.3 g de Ácido Pirúvico
0.3 g de K2HPO4
0.05 g de MgSO4
El pH se ajusta a 7,2 con una solución de NaOH ó HCl 10%, y se esteriliza en autoclave
a 121 º C durante 15 min.
Agar R2
Se agregan 15 g/L de agar (Difco) al medio de cultivo caldo R2.
Caldo R3 (Reasoner y Geldreich, 1985).
Composición en g/L de agua destilada.
1 g de Extracto de levadura
1 g de Proteosa peptona Nº3
Lic. en Biotecnología
1 g de Ácido Casamino
1 g de Glucosa
1 g de Almidón soluble
0.5 g de Piruvato de sodio
0.6 g de K2 HPO4.
0.1 g de MgSO4 .7H2O
El pH se ajusta a 7,2 con una solución de NaOH ó HCl 10%, y se esteriliza en
autoclave a 121 º C durante 15 min
Agar R3
Se agregan 15 g/L de agar (Difco) al medio de cultivo caldo R3.
Medio Mineral Líquido (MML) (Vecchioli y col., 1990)
Composición en g/l de agua destilada.
5 g de NaCl
1 g de K2HPO4
1 g de (NH4)H2PO4
1 g de (NH2)2SO4
0.2 g de MgSO4
3 g de KNO3
El pH se ajusta a 7,0 con una solución de NaOH ó HCl 10%, y se esteriliza en
autoclave a 121 º C durante 15 min.
III.A.3 Reactivos
Fenantreno (Carlo Erba, Francia),
Ácido 1-hidroxi-2-naftoico (Sigma- Aldrich, USA).
III.B METODOLOGÍA
III.B.1 Caracterización metabólica de la cepa Sphingomonas paucimobilis
20006FA:
Lic. en Biotecnología
III.B.1.i Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno
como única fuente de carbono y energía.
Los cultivos se realizaron en Medio Mineral Líquido (MML) suplementado con
0,05 g/L de extracto de levadura y 0,84g/L de fenantreno. Los cultivos se incubaron a
28ºC en agitación constante (250rpm). La cinética de crecimiento se realizó
determinando el número de UFC en R2-agar a distintos tiempos.
III.B.1.ii Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como
única fuente de carbono y energía.
Los cultivos se realizaron en MML suplementado con 0,05 g/L de extracto de
levadura y 2 g/L de glucosa. Los cultivos se incubaron a 28ºC en agitación constante
(250 rpm). La cinética de crecimiento se realizó determinando el número de UFC en
R2-agar a distintos tiempos.
III.B.1.iii Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando ácido naftoico
como única fuente de carbono y energía.
Para estudiar la capacidad de la cepa S. paucimobilis 20006FA de crecer en Ac.
Naftoico se utilizaron tres concentraciones diferentes del mismo 0.05 g/L, 0.14 g/L y
0.3 g/L. Para ello, se incubaron, por triplicado, erlenmeyers de 250 ml de capacidad
conteniendo 100 ml de MML y ácido naftoico en las concentraciones deseadas
suplementado con 0.05 g/L de extracto de levadura. Los cultivos se incubaron en
agitación a 250rpm, a 30ºC durante 96 horas. La cinética de crecimiento se realizó
determinando el número de UFC en R2-agar a distintos tiempos.
III.B.2 Estudio de la cinética de degradación de fenantreno en cultivos batch por la
cepa S. paucimobilis 20006FA:
Lic. en Biotecnología
III.B.2.i Preparación del inóculo. En todos los ensayos se inoculó el medio con S.
paucimobilis 20006FA. Para esto se deja crecer la misma over night en R3A a 28ºC. A
continuación, se realizan tres lavados con solución fisiológica. Sabiendo que 2.23
unidades de DO580 equivalen a 1x1010
UFC/ml, se mide la densidad óptica y se calcula
el volumen necesario para obtener la concentración inicial deseada en cada frasco.
III.B.2.ii Ensayo. Se adicionan frascos de 55 ml de capacidad con 500 ul de una
solución de fenantreno estéril en acetato de etilo (16,8 g/L), de modo de lograr una
concentración final de fenantreno en cada frasco de 0.84g/L, se deja evaporar el
solvente.. A continuación, se agregan 10 ml de MML suplementado con 0.05g/L de
extracto de levadura a cada frasco. Seguidamente se inocula cada frasco con 1x108
UFC/ml de la cepa. Se utilizaron controles abióticos sin inóculo. Los cultivos se
incubaron en agitación constante a 200 rpm y a 28ºC. Se realizaron determinaciones
después de 72 h y después de 161h de realizada la inoculación. Todos los ensayos se
realizaron por triplicado.
III.B.2.iii Determinación de la concentración de fenantreno y ácido naftoico en MML.
Con el objetivo de determinar y cuantificar el fenantreno degradado y el ácido naftoico
producido. Se realizaron extracciones exhaustivas, para ello se agregaron 5 ml de
acetato de etilo a cada frasco y se los dejó agitando durante 15 minutos. Posteriormente,
se trasvasó todo el contenido del frasco en un tubo, una vez visualizadas las dos fases
(orgánica y acuosa), se extrajo la fase orgánica utilizando micropipeta. La misma fue
guardada en frascos color caramelo a -20ºC. Este procedimiento de extracción fue
repetido tres veces. La determinación de las concentraciones de los químicos en los
extractos de acetato de etilo fue analizada por Cromatografía líquida de alta presión
(HPLC) en fase reversa, utilizando un cromatógrafo Waters® con una columna C18
Symetry Waters ® (15 cm x 4,6 mm de diámetro, tamaño de grano de 5 µm tamaño de
Lic. en Biotecnología
los poros 100 Å). Un gradiente lineal de 15 mM de ácido fosfórico en una solución de
agua Nanopure y metanol (20:80 a 15:95, vol/vol) durante 15 min y se utilizó un caudal
de 1 ml/min (Coppotelli y col., 2010).
III.B.3 Estudio de la capacidad de degradación de ácido naftoico en cultivos batch
por la cepa S. paucimobilis 20006FA:
III.B.3.i Preparación del inóculo. Ver sección III.B.2.i.
III.B.3.ii Ensayo. Con la finalidad de estudiar la capacidad de degradación de ácido
naftoico en dos concentraciones, se adicionan frascos de 55 ml de capacidad con una
solución 0,75 g/L de ácido naftoico en acetato de etilo, de modo de lograr una
concentración final de ácido naftoico en cada frasco de 0,05g/L y de 0,14 g/L, y se dejó
evaporar el solvente. A continuación, se agregaron 10 ml de MML suplementado con
0.05g/L de extracto de levadura a cada frasco. Seguidamente se inocula cada frasco con
1x108 UFC/ml de la cepa. Se utilizaron controles abióticos sin inóculo. Los cultivos se
incubaron en agitación constante a 200 rpm y a 28ºC, durante 24 horas. Este ensayo fue
realizado por triplicado.
III.B.3.iii Determinación de la concentración de ácido naftoico. Ver sección III.B.2.iii.
III.B.4 Estudio del efecto de Ácido Naftoico en la cinética de degradación de
Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA
III.B.4.i Preparación del inóculo. Ver sección III.B.2.i.
III.B4.ii Ensayo. Se prepararon dos frascos con diferentes concentraciones de ácido
naftoico, uno correspondiente a 0,05 g/L y otro con 0,14g/L, ambos suplementados con
0,84g/L de fenantreno. Para ello se adicionaron frascos de 55 ml de capacidad con una
solución en acetato de etilo 0,75 g/L de ácido naftoico y con una solución de acetato de
etilo 20 g/l de Fenantreno, de modo de lograr una concentración final de ácido naftoico
Lic. en Biotecnología
en cada frasco de 0,05g/L y de 0,14 g/L respectivamente y de 0,84g/l de fenantreno.
Seguidamente se inoculó cada frasco con 1x108 UFC/ml. Se utilizaron controles
abióticos sin inóculo. Los cultivos se incubaron en agitación constante a 200 rpm y a
28ºC, durante 24 horas. Este ensayo fue realizado por triplicado.
III.B.4.iii Determinación de la concentración de Fenantreno y Ácido Naftoico. Ver
sección III.B.2.iii. Los valores promedio fueron comparados mediante el análisis de
varianza simple a un nivel de p= 0,05. Todos los análisis estadísticos fueron realizados
utilizando el software 5.0 Systat® en sistema Windows®.
III.B.5 Estudio del proteoma de la cepa.
III.B.5.1 Preparación de cultivos en biorreactor:
III.B.5.1.a Crecimiento en fenantreno 0.84g/l como única fuente de carbono y
energía
III.B.5.a.i Preparación del inóculo. Ver sección III.B.2.i
III.B.5.a.ii Preparación del biorreactor. Se utilizó un bioreactor L.H. (Incelltech 210)
de 2 litros de capacidad con 1500 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de
levadura, este se esterilizó a 121ºC durante 30 minutos. El fenantreno fue agregado al
medio en forma de cristales de modo de alcanzar una concentración de 0.84g/L. El
fenantreno fue previamente esterilizado utilizando lámpara UV durante 30 minutos.
Posteriormente, se realizó la inoculación de modo tal de obtener una concentración de
2x108 células/ml dentro del biorreactor. La agitación del mismo se mantuvo constante
durante todo el ensayo a 250 rpm, con aireación 25 L/h y temperatura de incubación
constante 28ºC (±2ºC). A diferentes tiempos se midió el pH del cultivo. Los cultivos se
realizaron por duplicado.
Lic. en Biotecnología
III.B.5.a.iii Cosecha del biorreactor. El cultivo fue cosechado en la fase estacionaria de
crecimiento (96 h). y fue filtrado para eliminar los cristales de fenantreno remanentes.
El filtrado se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos, y el pellet se lavó tres veces
con agua bidestilada estéril. Las células resuspendidas en agua bidestilada, se
concentraron hasta llegar a una DO580 mayor a 20 unidades, y se mantuvieron a -80ºC
para la posterior determinación de proteínas presentes.
III.B.5.a.iv Recuento de viables. Para seguir y monitorear el crecimiento celular en el
biorreactor, se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determinó el número de UFC
en placas de Petri con R2-agar. Estas se incubaron durante 7 días.
III.B.5.1.b Crecimiento en Glucosa 2g/l como única fuente de Carbono y Energía
III.B.5.1.b.i Preparación del inóculo. Idem sección III.B.2.i
III.B.5.1.b.ii Preparación del biorreactor. Se utilizó un bioreactor L.H. (Incelltech 210)
de 2 litros de capacidad con 1500 ml de MML suplementado con 0.05g/L de extracto de
levadura, este se esterilizó a 121ºC durante 30 minutos. La glucosa se esterilizó por
separado en agua destilada y luego fue adicionada al biorreactor de modo tal que la
concentración final de glucosa en el biorreactor sea de 2g/l. Posteriormente, se realizó la
inoculación de manera que el biorreactor exhiba una concentración de 2x108 células/ml.
La agitación del biorreactor se mantuvo constante durante todo el ensayo a 250 rpm,
con aireación 25L/h y temperatura de incubación constante 28ºC (±2ºC). A diferentes
tiempos se midió el pH del cultivo. Los cultivos se realizaron por duplicado.
III.B.5.1.b.iii Cosecha del biorreactor. El cultivo fue cosechado en la fase estacionaria
de crecimiento (96 h). El cultivo se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos, y el
pellet se lavó tres veces con en agua bidestilada estéril. Las células resuspendidas en
Lic. en Biotecnología
agua bidestilada, se concentraron hasta llegar a una DO580 mayor a 20 unidades, y se
mantuvieron a -80ºC para la posterior determinación de proteínas presentes.
III.B.5.1.b.iv Recuento de viables. Idem sección III.B.1.a.
III.B.5.2 Lisado Celular
Para la preparación del lisado celular de la cepa S. paucimobilis 20006FA, a las
células cosechadas a partir de los cultivos de en glucosa y fenantreno. se les agregaron
2,5 µl de cóctel de inhibidores de proteasas y 2,5 µl de PMSF 100 mM. Los cultivos
celulares se prepararon a partir de 25 ml de los cultivos cosechados y se rompieron
utilizando un Homogeneizador de Alta presión y perlas. Luego de la ruptura los restos
celulares se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min, se lavaron dos veces con agua
bidestilada, y se resuspendieron en agua bidestilada. Las proteínas fueron solubilizadas
durante 1 h en buffer de rehidratación (urea 7M, tiourea 2 M, Tritón X-100 al 2% (p/v),
DTT 65mM (Amersham Biosciences), PMSF 1mM, 4-(2-aminoetil)-Bencenosulfonilo
fluoruro [AEBSF] 4mM y azul de bromofenol 0.002% (w/v)), luego se realizó una se
centrifugación a 8000g durante 10 minutos, reteniendo el sobrenadante. La
concentración de proteínas se determinó mediante el Ettan 2-D Kit de Quant
(Amersham Biosciences) (Perez Vidakovics y col 2007).
III.B.5.3 Electroforesis Bidimensional 2-D
Para el isoelectroenfoque (IEF), se utilizaron tiras de IPG de 18 cm en el rango
de pH 4-7 (Immobiline DryStrips, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Las
muestras se mezclaron con el buffer de rehidratación recién preparado, conteniendo una
concentración final de proteínas de 300µg en 350µl. Las proteínas solubilizadas fueron
cargadas en la tira de gradiente de pH 4-7 como fue descrito en Sanchez, y
colaboradores (1999). El IEF se realizó en una unidad Multiphor II de electroforesis
Lic. en Biotecnología
(Amersham Biosciences), utilizando el siguiente programa: 500 V de 0.01 h (1 Vh),
3500 V de 1,30 h (gradiente, 3000 Vh), 3500 V de 5,40 h (20 kVh), lo que resulta en
una tensión total de 23 kVh. Las tiras focalizadas fueron almacenadas a -80 °C hasta su
posterior uso. Para su preparación para la segunda dimensión, las tiras IPG fueron
incubadas (15 min) en 10 ml de buffer de equilibrio (50 mM Tris-Cl, pH 8,8; 6M de
urea, 30% (v / v) de glicerol, 2% (p / v) SDS, 20 mM DTT, y 0.002% (p / v) de azul de
bromofenol) seguida de una incubación (15 min) en la misma solución, pero
sustituyendo el DTT por 300 mM de acrilamida.
Después del paso de reducción/alquilación, las tiras IPG se colocaron en la parte
superior de un gel al 10% SDS-PAGE y se sella con un solución 0,5% de agarosa en
buffer de electroforesis. La electroforesis se realiza a corriente constante (25 mAmp por
gel) a 20ºC hasta que la migración frontal en el gel llegara al final del mismo, utilizando
una unidad de electroforesis PROTEAN II xi 2-D (Bio-Rad, Hercules, CA) conectado a
un baño de refrigeración II Multitemp (GE Healthcare). Las proteínas se visualizaron
por tinción con Coomasie blue G 250 (Kodak) (Gorg y col., 1988)
III.B.5.4 Análisis de las Imágenes de los Geles:
Los geles 2-D teñidos con Coomasie Blue se documentaron utilizando un
escáner ChemiDoc XRS (Bio rad, USA), y el análisis de imágenes se realizó con el
software Proteome Weaver (Definiens, Munich, Alemania). Cada condición de
crecimiento evaluada (glucosa o fenantreno) se realizó por al menos dos réplicas
independientes de geles.
III.B.5.5 Identificación de Proteínas:
Los spots seleccionados para su análisis mediante espectrometría de masas
fueron recortados del gel con un tip de micropipeta y se colocaron en un eppendorf con
50 µl de agua bidestilada para su envío a la Unidad de Proteómica de la Universidad
Lic. en Biotecnología
Complutense de Madrid (Madrid, España), donde fueron digeridos con tripsina, para su
posterior análisis mediante espectrometría de masas tipo MALDI-TOF (Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) y obtención de la huella peptídica (PMF).
La identificación de los fragmentos proteicos se realizó utilizando el algoritmo
MASCOT (Matrix Science, Boston, MA) y la base de datos NCBInr.
Lic. en Biotecnología
IV. RESULTADOS
IV.A Caracterización metabólica de la cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA:
Acorde con los resultados obtenidos por Coppotelli y colaboradores (2008), se
observó que la cepa tiene la capacidad de utilizar glucosa (C6H12O6) y fenantreno
(C14H10) como única fuente de carbono y energía. En primer lugar, se determinó la
concentración de glucosa en la cual la cepa fue capaz de alcanzar valores de biomasa
mayores a 1x1010
células/ml, para su posterior estudio del proteoma. Se analizaron
diferentes concentraciones de glucosa (datos no mostrados), determinando que la menor
concentración de glucosa capaz de obtener esos valores de biomasa fue de 2 g/L. A
partir de la concentración de glucosa obtenida, se calcularon los carbonos equivalentes
de fenantreno, obteniéndose que la concentración es de 0,84 g/L.
IV.A.1 Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando glucosa como
única fuente de carbono y energía.
Con el objetivo de determinar la capacidad de la cepa de crecer utilizando
glucosa como única fuente de carbono y energía, se realizó una cinética de crecimiento
en biorreactor en MML suplementado con Glucosa 2 g/L. El crecimiento fue
monitoreado por recuento de viables en R2A (figura 1). Como se puede observar el
crecimiento alcanzó valores de 1,58x1010
UFC/ml, después de las 46 horas de
incubación.
Lic. en Biotecnología
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
1,00E+11
0 10 20 30 40 50
Tiempo de incubación (horas)
UF
C/m
l
Durante el tiempo de incubación se midió el pH del sobrenadante del cultivo, los
resultados arrojados muestran una disminución del mismo de dos unidades luego de 40
horas incubación (figura 2).
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
pH
Figura 2. Valores de pH a través del tiempo durante el crecimiento de S. paucimobilis 20006FA
en MML suplementado con 2 g/L de glucosa a 28 ºC y 250 rpm.
Figura 1. Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 2 g/L
de glucosa a 28ºC y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva desviación
estándar de un ensayo realizado por triplicado.
Lic. en Biotecnología
IV.A.2 Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando fenantreno como
única fuente de carbono y energía.
Se determinó la cinética de crecimiento de la cepa S. paucimobilis 20006FA en
MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno. El crecimiento fue monitoreado por
recuento de viables en R2A (figura 3). Durante el crecimiento de la cepa en fenantreno
se observó la aparición de productos coloreados amarillo/naranjas (foto 1). Luego de 66
horas de incubación, el crecimiento alcanzado por la cepa fue de 2,35x1008
UFC/ml, con
una velocidad específica de crecimiento (µ) de de 0,1308 h-1
, mostrando la capacidad de
duplicarse al menos 3 veces en 17 horas en presencia de fenantreno.
Foto 1. Cultivos en biorreactor de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con
0,84 g/L de fenantreno. A) Cultivo luego de dos horas de incubación. B) Cultivo luego de 96 horas
de incubación
Lic. en Biotecnología
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo de Incubación (horas)
UF
C/m
l
Durante el tiempo de incubación se midió el pH del sobrenadante del cultivo, los
resultados arrojados muestran una disminución del mismo de una unidad luego de 44
horas incubación (figura 4).
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
0 10 20 30 40 50
Tiempo (horas)
pH
Figura 3. Cinética de Crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84
g/L de fenantreno a 28 ºC y 250 rpm. Se grafican los valores promedio y su respectiva desviación
estándar de un ensayo realizado por triplicado.
Figura 4. Valores de pH a través del tiempo durante el crecimiento de S. paucimobilis 20006FA
en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno a 28 ºC y 250 rpm.
Lic. en Biotecnología
IV.B Estudio de la cinética de degradación de fenantreno en cultivos batch por la
cepa S. paucimobilis 20006FA:
Para determinar y cuantificar la degradación de fenantreno y la generación de
ácido naftoico, se prepararon cultivos de la cepa en MML con fenantreno como única
fuente de carbono y energía. A diferentes tiempos se realizaron extracciones del
fenantreno residual presente en cada frasco y se determinaron las concentraciones del
mismo y de ácido naftoico por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC).
Tiempo (horas)% de Degradación de
Fenantreno
0 8,63
2 7,23
5 11,68
7 20,05
21 12,18
24 15,36
26 36,90
30 27,00
47 34,92
54 36,55
72 38,83
96 44,80
144 46,57
161 49,11
La tabla 1 muestra los porcentajes de degradación de fenantreno por la cepa S.
paucimobilis 20006FA. La determinación de fenantreno residual se muestra en la figura
5. La acumulación de ácido naftoico se muestra en la figura 6.
Tabla 1. Degradación de fenantreno durante el tiempo de incubación.
Lic. en Biotecnología
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 50 100 150 200
Tiempo de incubación (horas)
Fen
an
tren
o (
g/L
)
Fenantreno
(g/L)
Control
abiótico
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0 50 100 150 200
Tiempo de incubación (horas)
Ácid
o n
aft
oic
o (
g/L
)
Como se puede observar, la degradación de fenantreno llega hasta el 49,11% a
las 161 horas de incubación. Los niveles de ácido naftoico se hacen detectables a partir
de las 26 horas, alcanzando una concentración máxima de 0.166 g/L a las 161 horas de
incubación.
Figura 5. Concentración de fenantreno a lo largo del tiempo de incubación en los cultivos de S.
paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,84 g/L de fenantreno. Se grafica el valor
promedio de tres réplicas con su respectiva desviación estándar.
Figura 6. Concentración de ácido 1-hidroxi-2-naftoico a lo largo del tiempo de incubación en los
cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con con 0,84 g/L de fenantreno. Se
grafica el valor promedio de tres réplicas con su respectiva desviación estándar.
Lic. en Biotecnología
IV.C. Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA utilizando ácido naftoico
como única fuente de carbono y energía:
Se determinó la capacidad de la cepa de crecer en MML suplementado con ácido
naftoico, empleando tres concentraciones diferentes 0,05 g/L; 0,14 g/L y 0,3 g/L. Las
concentraciones elegidas rondaron los valores obtenidos durante la degradación de
fenantreno.
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo de Incubación (horas)
UF
C/m
l
En los cultivos de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con
0,05 g/L de ácido naftoico, se pudo observar que la misma fue capaz de utilizar el ácido
naftoico como única fuente de carbono y energía (figura 7). Se observó un lento
crecimiento con una fase de latencia de aproximadamente 6 horas y una fase
exponencial que duró 10 horas. Se ha podido observar que durante el crecimiento de la
cepa se produce la aparición de productos de degradación amarillos.
Figura 7. Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,05
g/L de ácido naftoico a 28 ºC y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva
desviación estándar de tres ensayos independientes, cada uno con tres réplicas.
Lic. en Biotecnología
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo de Incubación (horas)
UF
C/m
l
Cuando S. paucimobilis 20006FA fue crecida en MML suplementado con 0,14
g/L de ácido naftoico (figura 8), se pudo observar que la fase de latencia se incrementó
considerablemente hasta las 30 horas aproximadamente. Durante esta fase de latencia se
pudo divisar una disminución del recuento celular en dos órdenes de magnitud, seguida
por una fase exponencial posterior a las 31 horas de incubación. Cabe destacar que el
tiempo de incubación en este caso fue de 110 horas, casi el doble del tiempo de
incubación para la concentración de 0,05 g/L de ácido naftoico. La cosecha máxima
alcanzada por la cepa en ambas concentraciones de ácido naftoico no presenta
diferencias significativas (p≥ 0,05) con respecto la cosecha máxima alcanzada durante
el crecimiento de la misma en presencia de fenantreno como única fuente de carbono y
energía.
A partir de los datos obtenidos de las cinéticas de crecimiento en ácido naftoico,
se determinaron las velocidades específica de crecimiento (µ) de la cepa en ambas
concentraciones, los resultados obtenidos muestran que la cepa creciendo en 0,05 g/L de
Figura 8. Cinética de crecimiento de S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,14
g/L de ácido naftoico a 28 ºC y 250 rpm. Se grafican los valores promedios y su respectiva
desviación estándar de tres ensayos independientes, cada uno con tres réplicas.
Lic. en Biotecnología
ácido naftoico posee una µ=0,148 h-1
y creciendo en 0,14 g/L de ácido naftoico una
µ=0,115 h-1
.
Cuando S. paucimobilis 20006FA fue inoculada en MML suplementado con 0,3
g/L de ácido naftoico, la cepa fue incapaz de crecer y de aumentar su densidad celular,
lo que indicaría que el ácido naftoico en concentraciones altas es tóxico para las células.
IV.C.1 Estudio de la capacidad de degradación de ácido naftoico en cultivos batch
por la cepa S. paucimobilis 20006FA
Luego de determinar que la cepa posee la habilidad de crecer y utilizar ácido
naftoico como única fuente de carbono y energía, en concentraciones de 0,05 g/L y 0,14
g/L, se evaluó el porcentaje de ácido naftoico degradado por S. paucimobilis 20006FA
durante 24 horas de incubación.
En resultados arrojados por las determinaciones por HPLC, se pudo observar
que el mayor porcentaje de degradación correspondió al cultivo de la cepa en MML
suplementado en 0,05 g/L de ácido naftoico (tabla 2), mientras que la degradación
ocurrió en menor medida cuando la cepa fue crecida en MML suplementado con 0,14
g/L de ácido naftoico. Este resultado guarda estrecha relación, con el hecho de que la
cepa tiene mayor facilidad de crecimiento en bajas concentraciones de ácido naftoico.
Concentración
Ácido Naftoico
(g/l)
Porcentaje de
Degradación de
Naftoico (%)
0,05 94,40 ± 10,45
0,14 44,94 ± 8,12
Tabla 2. Degradación (%) de ácido naftoico por la cepa S. paucimobilis 20006FA, luego de 24
horas de incubación.
Lic. en Biotecnología
IV.C.2 Estudio del efecto de ácido naftoico en la cinética de degradación de
Fenantreno en cultivos batch por la cepa S. paucimobilis 20006FA:
Con el objetivo de comprobar si el retardo en la degradación de fenantreno se
debe a una acumulación de ácido naftoico que inhibe el crecimiento de la cepa, como
han hipotetizado anteriormente Coppotelli y colaboradores (2008), se hizo crecer a la
cepa en MML suplementado con ácido naftoico en las concentraciones 0,05 g/L y 0,14
g/L, adicionados con 0,84 g/L de fenantreno. Se determinaron las concentraciones
remanentes de fenantreno y ácido naftoico luego de 24 y 96 horas de incubación, por
HPLC. La degradación se comparó con un control abiótico (sin inóculo). En las figuras
9 y 10, se muestra la degradación de fenantreno en presencia de ácido naftoico. Durante
la degradación, los cultivos se tornaron color amarillo/naranja (foto 2).
Foto 2. α3: Cultivo de la cepa S. paucimobilis 20006FA en MML suplementado con 0,05
g/L de ácido naftoico y 0,84 g/L de fenantreno. Cα: Control abiótico
Lic. en Biotecnología
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
Fen
an
tren
o (
g/L
)
Control Abiótico
A 24hs
A 96hs
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
Fen
an
tren
o (
g/L
)
Control Abiótico
B 24hs
B 96hs
Como se puede observar, la degradación de fenantreno se pudo llevar a cabo en
presencia de ácido naftoico en las dos concentraciones estudiadas. En ambos cultivos la
degradación de fenantreno alcanzada fue de 12,81 %(± 2,64%) a las 24 horas y de 47,87
% (± 1,20%) a las 96 horas de incubación. Al comparar estos resultados con los
obtenidos en ausencia de ácido naftoico, se puede ver que la degradación de fenantreno
no se vio afectada significativamente (figura 11).
Figura 9. Concentración de fenantreno en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML
suplementados con ácido naftoico (0,05g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio y
la desviación estándar de tres réplicas por cultivo.
Figura 10. Concentración de fenantreno en los cultivos de S. paucimobilis 20006FA en MML
suplementados con ácido naftoico (0,14 g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor
promedio y la desviación estándar de tres réplicas por cultivo.
Lic. en Biotecnología
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
24 horas 96 horas
Tiempo de Incubación (horas)
% d
e D
eg
rad
ació
n d
e F
en
an
tren
o
Fenantreno (0,84 g/L)
Fenantreno (0,84 g/L) y
ácido naftoico (0,05 g/L)
Fenantreno (0,84 g/L) y
ácido naftoico (0,14 g/L)
Durante la incubación de estos cultivos, mientras ocurría la degradación de
fenantreno, el ácido naftoico se acumuló hasta una concentración aproximada de 0,152
g/L (± 0.040) luego de 96 horas de incubación (figuras 12 y 13).
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
Naft
oic
o (
g/L
)
Control Abiótico
A 24hs
A 96hs
Figura 11. Comparación de la degradación de fenantreno (%) en presencia y ausencia de ácido
naftoico por la cepa S. paucimobilis 20006FA.
Figura 12. Concentración de ácido naftoico durante la degradación de fenantreno por la cepa S.
paucimobilis 20006FA. Determinación luego de 24 y 96 horas de incubación en MML
suplementado con ácido naftoico (0,05g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio
y la desviación estándar de tres réplicas por cultivo.
Lic. en Biotecnología
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
Naft
oic
o g
/L
Control Abiótico
B 24hs
B 96hs
IV.D Estudio del proteoma de la cepa S. paucimobilis 20006FA:
Para dilucidar los mecanismos de biodegradación de S. paucimobilis 20006FA,
se estudió la inducción de proteínas específicas en respuesta al crecimiento en
fenantreno como única fuente de carbono y energía. El análisis comparativo del
proteoma se realizó a través de geles SDS-PAGE y 2-DE creciendo la cepa en
fenantreno y glucosa (control).
Las fracciones solubles de proteínas de S. paucimobilis 20006FA analizadas en
una dimensión mediante SDS-PAGE se muestran en la figura 14.
A través de análisis de estos geles, se pudo observar una diferencia significativa
en la expresión de proteínas cuando la cepa fue crecida en fenantreno. Las proteínas
contenidas en las bandas A, B, E y G, fueron identificadas por medio de la huella
peptídica o Peptide Mass Fingerprinting (PMF), utilizando un espectrómetro de masas
tipo MALDI-TOF/TOF, los resultados de la identificación se muestran en la tabla 3.
Figura 13. Concentración de ácido naftoico durante la degradación de fenantreno por la cepa S.
paucimobilis 20006FA. Determinación luego de 24 y 96 horas de incubación en MML
suplementado con ácido naftoico (0,14 g/L) y fenantreno (0,84 g/L). Se grafica el valor promedio
y la desviación estándar de tres réplicas por cultivo.
Lic. en Biotecnología
PM
(kDa) 1 2
G
C
E
A
66 kDa
45 kDa
30kDa
20.1 kDa
PM
(kDa) 1 2
G
C
E
A
66 kDa
45 kDa
30kDa
20.1 kDa
Protein Protein description Species
Accession No.
Theroretical
migration
Mr (Da) pI
PE glutathione S-transferase Sphingomonas chungbukensis 2316034 21518 5.52
PG ring hydroxilating dioxigenase/ Sphingomonas sp. LH128 158346882 18996 4.97
PA 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase Sphingomonas chungbukensis 4007416 37010 5.10
PC extradiol dioxygenase Sphingomonas sp. CHY-1 52207942 33416 5.40
Todas las proteínas presentaron alta homología con proteínas pertenecientes a
otras especies de Sphingomonas. Posteriormente, las fracciones solubles de proteínas de
S. paucimobilis 20006FA fueron analizadas en geles bidimensionales (2-DE) en el
rango de pH 4-7 y en el rango de peso molecular de 6.5 a 200 kDa (figura 15).
Aproximadamente 140 spots de proteínas se detectaron en los geles 2-DE.
Figura 14. Electroforesis en gel de poliacrilamida (10% SDS-PAGE) de las fracciones
solubles de proteínas de S. paucimobilis 20006FA. Calle PM: marcador de peso molecular;
calle 1: fracción soluble de proteínas durante el crecimiento en glucosa; calle2: fracción
soluble de proteínas durante el crecimiento en fenantreno. Las proteínas A, B, E y G fueron
identificadas por medio de la huella peptídica.
Tabla 3. Proteínas identificadas en cultivos de S. paucimobilis 20006FA cultivada en presencia de
fenantreno, correspondientes al gel en una dimensión.
Lic. en Biotecnología
La expresión diferencial de proteínas se pudo observar claramente, obteniéndose
los spots de interés, denominados: P6, P7, P8, P10, P11, P12, P14 y P17; los cuales se
cortaron y se identificaron por medio de PMF, utilizando un espectrómetro de masas
tipo MALDI-TOF/TOF. Los resultados de la identificación se muestras en la tabla 4.
26
56
25
57
32
82
15
42
(%)
Sequence
coverage
5.5030953158346887Sphingomonas sp. LH128
2 hydroxymuconic semialdehyde
hidrolaseP17
5.403341652207942Sphingomonas sp. CHY-1extradiol dioxygenaseP14
5.2827695110162116Sphingomonas sp. CHY-1dihydrodiol dehydrogenaseP12
5.02272804091975Sphingomonas chungbukensis4-oxalocrotonate decarboxylaseP11
5.09281422316027Sphingomonas chungbukensis2-hydroxypent-2,4-dienoate hydrataseP10
5.1134543151128Sphingomonas agrestiscatechol 2,3-dioxygenaseP8
5.123575928971850Sphingomonas sp. P2
putative 2-hydroxy-benzylpyruvate
aldolaseP7
5.10370104007416Sphingomonas chungbukensis4-hydroxy-2-oxovalerate aldolaseP6
pIMW (Da)Nº
Theoretical
migrationNCBI
Accession no.SpeciesProtein descriptionSpot
26
56
25
57
32
82
15
42
(%)
Sequence
coverage
5.5030953158346887Sphingomonas sp. LH128
2 hydroxymuconic semialdehyde
hidrolaseP17
5.403341652207942Sphingomonas sp. CHY-1extradiol dioxygenaseP14
5.2827695110162116Sphingomonas sp. CHY-1dihydrodiol dehydrogenaseP12
5.02272804091975Sphingomonas chungbukensis4-oxalocrotonate decarboxylaseP11
5.09281422316027Sphingomonas chungbukensis2-hydroxypent-2,4-dienoate hydrataseP10
5.1134543151128Sphingomonas agrestiscatechol 2,3-dioxygenaseP8
5.123575928971850Sphingomonas sp. P2
putative 2-hydroxy-benzylpyruvate
aldolaseP7
5.10370104007416Sphingomonas chungbukensis4-hydroxy-2-oxovalerate aldolaseP6
pIMW (Da)Nº
Theoretical
migrationNCBI
Accession no.SpeciesProtein descriptionSpot
21
PW (kDa)PM (kDa)
21
PW (kDa)PM (kDa)
21
PW (kDa)PM (kDa)
Figura 15. Geles 2-DE de las fracciones solubles de proteínas de S. paucimobilis 20006FA. (1)
Crecimiento en glucosa y (2) Crecimiento en fenantreno. Primera dimensión: isoelectroenfoque,
rango de pH 4-7. Segunda dimensión: SDS-PAGE 12%. Las proteínas numeradas fueron
identificadas por medio de la huella peptídica.
Tabla 4. Proteínas identificadas en cultivos de S. paucimobilis 20006FA cultivada en presencia
de fenantreno.
kk
Lic. en Biotecnología
V. DISCUSIÓN
En este trabajo se intenta elucidar la ruta de degradación de fenantreno por la
cepa Sphingomonas paucimobilis 20006FA, a través de la incursión en estrategias
metabolómicas y proteómicas. Para esto se prepararon cultivos de la cepa en MML
suplementado con fenantreno y ácido 1-hidroxi-2-naftoico como única fuente de
carbono y energía, y sobre ellos se estudió el crecimiento microbiano, la variación en la
concentración de los metabolitos iniciales e intermediarios y la expresión diferencial de
proteínas con respecto a un cultivo suplementado con glucosa como única fuente de
carbono y energía.
La información obtenida sobre las enzimas inducidas en presencia de fenantreno
sumada a la evidencia de la acumulación de ácido 1-hidroxi-2-naftoico han sido
utilizadas para proponer una ruta de degradación de fenantreno en S. paucimobilis
20006FA (figura 16)
El primer paso de la ruta propuesta comienza con dioxigenación de la molécula
de fenantreno llevada a cabo en los carbonos 3 y 4 por la extradiol dioxigenasa (P14). El
dihidrodiol resultante se convertirá por la acción de la dihidrodiol deshidrogenasa (P12)
en 3,4-dihidroxifenantreno, el cual será objeto de meta-clivaje, y en los pasos
posteriores se convierte en ácido 1-hidroxi-2-naftoico. El ácido 1-hidroxi-2-naftoico se
acumula durante la degradación bacteriana de fenantreno llevada a cabo por S.
paucimobilis 20006FA. Posteriormente, el ácido 1-hidroxi-2-naftoico es degradado por
la descarboxilación oxidativa para formar 1,2-dihidroxinaftaleno, que posteriormente es
metabolizado por la ruta de degradación de naftaleno vía salicilato y catecol, por acción
de la 2-hidroxi-bencilpiruvato aldolasa (P7), luego del cual se clivará la molécula para
formar muconato 2-hidroxi-cis,cis-semialdehído por acción de la catecol 2,3-
dioxigenasa (P8).
Lic. en Biotecnología
1-Hidroxi-2-naftoato
1,2-Dihidroxinaftaleno
Salicilato
trans-o-Hidroxibenzildenepiruvato
Salicilaldehído
P7
P14
3,4-Dihidroxifenantreno
cis-3,4-Dihidroxi-3,4-dihidrofenantreno
Fenantreno
2-Hidroxi-2H-benzo[h]cromeno-2-carboxilato
trans-4-(1'-Hidroxynaf-2'-il)-2-oxobut-3-enoato
1-Hidroxi-2-naftaldehído
P12
P14
P14
P8
cis-2-Hidroxipenta-2,4-dienoato
Catecol
4-Hidroxi-2-oxovalerato
Piruvato
Acetaldehído
+
P10 P17
P6
2-Hidroxi-cis,cis-muconato semialdehído
Figura 16. Ruta de degradación de fenantreno propuesta para la cepa S. paucimobilis 20006FA
Lic. en Biotecnología
Posteriormente, el accionar de la 2-hidroximuconico semialdehído hidrolasa,
2-hidroxipent-2,4-dienoato hidratasa y 4-hidroxi-2-oxovalerato aldolasa (P17, P10 y P6)
darán lugar a la producción de ácido pirúvico y acetaldehído, que ingresarán al ciclo de
los ácidos tricarboxílicos.
Estudios anteriores demostraron que S. paucimobilis 20006FA tiene una alta
eficiencia en la degradación de fenantreno (52.9%) cuando es crecida en Medio Mineral
Líquido (MML) suplementado con fenantreno como única fuente de carbono y energía.
Sin embargo, luego de 20 días de tratamiento, sólo ha podido mineralizar el 10% del
fenantreno inicial (Coppotelli y col., 2010). La cepa produce dos intermediarios
mayoritarios ácido 1-hidroxi-2-naftoico y ácido salicílico, demostrando que el
fenantreno es degradado por la cepa utilizando la ruta de degradación de fenantreno por
vía salicilato, como se ha descrito anteriormente para otras cepas del género
Sphingomonas (Tao y col., 2007; Willumsen y Karlson, 1996). Se ha demostrado
también que S. paucimobilis 20006FA posee la capacidad de crecer en presencia de
salicilato de sodio como única fuente de carbono y energía, indicando que la misma
posee la ruta de degradación completa de fenantreno (Coppotelli y col., 2010).
En los cultivos de la cepa en fenantreno (0.84 g/L) se observó una degradación
del 49,11% (± 8,50%), a las 161 horas de incubación (tabla 1), con la concomitante
acumulación de ácido 1-hidroxi-2-naftoico que alcanzó los niveles de 0.166 g/L luego
del mismo tiempo de incubación (figura 6), esta acumulación provocó la aparición de
color amarillo/naranja en los cultivos. La aparición de color en el medio de cultivo
donde se acumula ácido naftoico también fue observada por Tao y col. (2007). Este
intermediario es usualmente acumulado en el metabolismo de la mayoría de las
bacterias Gram negativas durante la degradación de PAH (Habe y Omori, 2003).
Estudios en Sphingomonas sp. VKM B-2434 creciendo en fenantreno como única
Lic. en Biotecnología
fuente de carbono y energía, también han demostrado que el ácido naftoico es el
principal metabolito de acumulación durante la degradación de fenantreno (Baboshin y
col., 2007).
Coppotelli y colaboradores (2008), sugirieron que la cepa podría producir un
retardo en la degradación de fenantreno en suelo debido a una acumulación de
intermediarios metabólicos. Frente al hallazgo de que el metabolito que se acumula es el
ácido 1-hidroxi-2-naftoico, se estudió la capacidad de la cepa de crecer con ese
compuesto como única fuente de carbono y energía, en tres concentraciones que
rondaron la concentración alcanzada durante los cultivos en fenantreno, encontrándose
que cuando la cepa es cultivada en bajas concentraciones de ácido naftoico (0,05g/L), la
misma es capaz de crecer mostrando una corta fase de latencia (6 horas) y una velocidad
específica de crecimiento de de µ=0,1487 h-1
(figura 7). En cambio, cuando la cepa es
crecida en ácido naftoico (0.14 g/L), se observa un incremento de la fase de latencia (30
horas) con una disminución del recuento de células durante 20 horas (figura 8), lo que
podría indicar que la concentración de ácido naftoico es tóxica para la cepa y ésta
necesita cierto tiempo para adaptarse y poder sobrevivir en esas condiciones. Cuando la
cepa es crecida en MML suplementado con altas concentraciones de ácido naftoico (0,3
g/L), no se detectó crecimiento, lo que sugiere que el ácido 1-hidroxi-2-naftoico en
concentraciones altas es tóxico para la cepa. Efectos tóxicos sobre Pseudomonas putida
PpG7 fueron observados previamente a altos niveles de salicilato (1000 mg/L), los
cuales resultaron en un aumento de la fase de latencia y una disminución de la
inducción del transcripto para la primer enzima de la vía de degradación del fenantreno
(Marlowe y col., 1999). Se sabe que varios metabolitos son tóxicos para los
microorganismos a través del agotamiento de los equivalentes de reducción o cofactores
(Chang y Zylstra, 1999; Kim y col., 2004). La citotoxicidad es la mayor responsable en
Lic. en Biotecnología
la inhibición de la degradación de PAH (Kazunga y col., 2001). La inhibición durante la
biodegradación sobre diferentes PAH puede ocurrir probablemente, debido a la
competencia de las enzimas involucradas en la oxidación, el transporte, la acumulación
subproductos citotóxicos resultantes de biodegradación, y el bloqueo de la inducción
enzimática (Bouchez y col., 1995; Juhasz y col., 2002; Van Hamme y col., 2003).
Cuando se estudió la capacidad de degradación del ácido naftoico (tabla 2) por la
cepa se pudo ver un mayor porcentaje de degradación (94,40 % ± 10,45 %), cuando la
cepa fue crecida en 0,05 g/L de ácido naftoico, esto podría deberse a que el estado
fisiológico y bioquímico de la misma se encuentra en su máxima capacidad, ya que a las
24 horas de incubación, la cepa se encuentra en su fase exponencial de crecimiento. En
cambio, cuando es cultivada en 0,14 g/L de ácido naftoico la cepa se encuentra en una
fase de latencia con disminución del número de células, y se observa que sólo pudo
degradar el 44,94% (± 8,12 %) de ácido naftoico.
Si bien durante la degradación de fenantreno se produce una disminución del pH
por la producción de metabolitos ácidos, al igual que en los cultivos en glucosa (figuras
2 y 4), se ha descartado este descenso de pH como causa de la inhibición de la
degradación de fenantreno, ya que en otros trabajos se observó que la permeabilidad de
la membrana contra moléculas hidrofóbicas puede ser aumentada en condiciones ácidas,
aumentando la concentración de sustrato en el citosol y por lo tanto la velocidad de
degradación, sobre todo en los casos en que la degradación esta limitada por una baja
concentración de sustratos (Kim y col., 2004). En nuestro caso, luego del descenso del
pH producido durante las primeras 10 horas de incubación, se pudo observar un
incremento de la velocidad de degradación de fenantreno a partir de las 20 horas de
incubación. Además Xia y colaboradores (2005) observaron que Sphingomonas sp.
ZX4 es efectiva en degradar fenantreno en un amplio rango de pH.
Lic. en Biotecnología
Para estudiar la hipótesis de la inhibición de la degradación de fenantreno y la
posible toxicidad celular producida por el ácido naftoico se prepararon cultivos en
MML suplementado con ácido naftoico en las concentraciones 0,05 g/L y 0,14 g/L,
adicionados con fenantreno 0,84 g/L, observándose que la degradación de fenantreno,
en las condiciones estudiadas, no se vio afectada por la presencia de ácido naftoico, ya
que no hay diferencias significativas en la degradación de fenantreno en presencia y
ausencia de este compuesto. Un hallazgo interesante fue que la concentración de ácido
naftoico acumulada fue similar en ambos cultivos (0,152 g/L) (figuras 12 y 13), y estos
valores no presentan diferencias significativas (p≥ 0,05) a los alcanzados en los cultivos
conteniendo fenantreno como única fuente de carbono y energía.
Marlowe y col. (2002) sostienen que las enzimas que participan en la
degradación de fenantreno pueden no participar en la degradación de los intermediarios.
Si no participan, una vez que el intermediario ácido 1-hidroxi-2-naftoico se formó,
puede cesar la inducción de la vía superior de degradación de modo de inducir la vía
requerida para el metabolismo del intermediario. Este movimiento metabólico requeriría
un período de aclimatación que permita la síntesis de las enzimas necesarias para el
metabolismo del intermediario. Una vez que el metabolismo del ácido 1-hidroxi-2-
naftoico se inició, tiene que ocurrir la inducción de la parte superior de la vía para
mantener niveles suficientes de intermediario y permitir una óptima degradación. En el
caso de la producción de ácido 1-hidroxi-2-naftoico por la cepa S. paucimobilis
20006FA parece existir una delicada regulación, estos mecanismos de inducción y
represión de las vías catabólicas superior e inferior para el fenantreno que logran
mantener la concentración del intermediario en niveles que no lleguen a resultar tóxicos
para las células.
Lic. en Biotecnología
Otra posibilidad para explicar la constancia en la concentración del
intermediario hallada es que hay un incremento de intermediarios tóxicos que siguen a
la inicial ruptura del anillo de fenantreno, resultando en una disminución de la actividad
celular. Pasado un tiempo, las células se adaptan a la toxicidad o metabolizan
lentamente los intermediarios tóxicos de modo que la concentración de estos decrece
(Sikkema y col., 1995). Después de recuperarse de la toxicidad, el metabolismo celular
podría de nuevo aumentar. De modo que parece que la influencia de los intermediarios
tóxicos podría influenciar la expresión genética hasta que las células se recuperen o se
adapten (Marlowe y col., 2002).
Lic. en Biotecnología
VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
En esté trabajo se logró elucidar al menos una de las rutas de degradación de
fenantreno en la cepa S. paucimobilis 20006FA y se ha incursionado en el estudio del
ácido 1-hidroxi-2-naftoico como posible metabolito regulador de esa ruta. En estudios
futuros, con el objetivo de conocer los mecanismos por los que ocurre esa posible
regulación se realizará el análisis del proteoma de la cepa a distintos tiempos durante la
degradación de fenantreno.
