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EMPLEO DE DESECHOS QUERATINOSOS PARA LA BIORREMEDIACION
DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS.
CGPI 20050273
DIRECTORA DEL PROYECTO:
DRA. LUZ IRENE ROJAS AVELIZAPA
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1.0 INTRODUCCION 1.1 Contaminación por hidrocarburos en México
En México, existe una gran cantidad de sitios contaminados con hidrocarburos, los
cuales presentan diferentes niveles de contaminación. Saval (1998) reportó que en Tabasco
solamente existen aproximadamente 7200 hectáreas de tierra afectadas; de las cuales más del
90% se encuentran localizadas en pantanos o zonas inundables, lo cual dificulta el acceso de
maquinaria y equipo para su tratamiento.
Entre las principales fuentes de contaminación que han sido identificadas se encuentran
los lodos de perforación; hidrocarburos provenientes de tuberías corroídas o tomas
clandestinas; tiraderos de desechos, residuos de petroquímicas y refinerías (Adams et al.,
1999). Los niveles y tipo de contaminación varían según la fuente de hidrocarburos y la
antigüedad de la misma. Rodríguez (1997), reportó que en un derrame, la mancha de
contaminación puede abarcar hasta 5 hectáreas con una concentración de hidrocarburos de
30% en la porción más contaminada, y concentraciones menores a su alrededor.
Debido al grave problema de contaminación que presenta el país, se han buscado
tecnologías apropiadas y de bajo costo para limpiar estos sitios y eliminar definitivamente los
contaminantes allí presentes. En este contexto, las tecnologías biológicas de remediación se
reconocen actualmente como unas de las opciones más seguras y viables (Saval, 1998).
1.2 Bioremediación
La bioremediación se define como un proceso biológico, que utiliza microorganismos con
el fin de convertir los compuestos químicos dañinos, en compuestos menos tóxicos o atóxicos
para los seres vivos (Cookson, 1995). Esta alternativa biológica ha resultado ser una solución
costeable y efectiva para la limpieza de sitios contaminados con hidrocarburos (Cho, et al.,
2000; Heitzer & Sayler, 1993).
En la remediación de sitios contaminados se emplean diferentes tecnologías, tales como
bioventeo, fitorremediación, biolabranza, birreactores, composteo, etc., sin embargo, también
puede llevarse a cabo de forma natural en el medio ambiente, a través de procesos de
dispersión, adsorción y volatilización de los contaminantes, y acción biológica, a estos
procesos se les conoce en su conjunto como atenuación natural (Hooker & Skeen, 1996).
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Antes de elegir alguna de las tecnologías mencionadas, es preferible realizar un estudio
de factibilidad para caracterizar las propiedades del sitio. Estas pruebas permiten seleccionar y
optimizar las condiciones de degradación del contaminante en cuestión. Dicho estudio consta
de dos aspectos principales: la caracterización de las propiedades físico-químicas del
contaminante y del material a tratar (suelo, lodo, sedimento); y la determinación del potencial
de los microorganismos del sitio para degradar a los hidrocarburos blanco.
Con base en los estudios de factibilidad, se puede entonces elegir también alguna(s) de las
estrategias de bioremediación, como son la bioaumentación y/o la bioestimulación (Vogel,
1996). La bioaumentación es el proceso de introducir microorganismos para incrementar o
acelerar la degradación de los contaminantes. Se aplica cuando la población microbiana del
sitio o sistema contaminado (in situ o ex situ) es limitada, los microorganismos adicionados
pueden provenir de la misma población autóctona o bien exógenos. Los microorganismos
inoculados deben adaptarse al suelo, sobrevivir, crecer y demostrar su capacidad degradativa
(Kerr, 1994).
La bioestimulación consiste principalmente en la adición de nutrientes y la introducción
de oxígeno o aceptores de electrones al sitio en donde reside la contaminación, de manera que
pueda favorecerse o incrementarse la actividad biológica responsable de la degradación de los
contaminantes orgánicos (Riser, 1998).
1.3 Utilización del composteo en la biodegradación de hidrocarburos
El composteo es una tecnología que ha sido muy utilizada en el tratamiento de suelos
contaminados con petróleo por lo que existen numerosos reportes que involucran dicho
proceso. En la tabla 1 se describen algunas investigaciones realizadas, mencionando el residuo
orgánico utilizado.
Como puede observarse, el uso de residuos orgánicos utilizados en composteo
favorece la biodegradación de hidrocarburos, sin embargo, hasta el momento el efecto de estos
materiales sobre el proceso no son concluyentes. Algunos autores (Semple, et al., 2001;
Carmichael & Pfaender, 1997; Rhodes, et al., 1994a; Rhodes, et al., 1994b) confieren al
residuo la propiedad de proveer una mejor aireación al suelo, nutrientes y/o biota.
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Tabla 1. Procesos de composteo utilizados en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo
Residuo
orgánico
Observaciones Referencia
Hojas de maple y alfalfa
El composteo se realizó en un suelo contaminado con petróleo (7000 mg/Kg suelo) a escala de laboratorio. Los resultados mostraron una disminución del 50% del petróleo durante los primeros 105 días. Después de 180 días se observó una degradación de hidrocarburos alifáticos (60%), aromáticos (54%) y compuestos polares (83%). Después de 287 días, el 73% del petróleo había sido degradado.
Beaudin, et al., (1996)
Estiércol de caballo
El desecho se utilizó para ayudar a degradar los sedimentos de una estación de petróleo, y los residuos de una refinería. Se observó una degradación del 78 al 93% después de 4.5 meses.
Kirchmann & Ewnetu, (1998)
Hojarasca verde, estiércol de vaca, yeso y nutrientes
Se estudió la degradación de los hidrocarburos totales del petróleo en un suelo, 3100±1270 mg/Kg. Después de 6 meses de tratamiento, la concentración de hidrocarburos totales disminuyó a 730 mg/Kg.
Turlouh, (2001)
Paja de trigo, estiércol de pollo y yeso
Se demostró la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos de un 20 a 60% después de 54 días de tratamiento.
Sasek, et al., (2003)
El uso de materiales orgánicos no solo se limita a procesos de composteo, otros
materiales de importancia son los que se utilizan en la limpieza de derrames, los cuales tienen
la característica de presentar una alta capacidad de adsorción y/ absorción. En algunas
ocasiones estos materiales llegan a ser reutilizados o bien solo son confinados y/o incinerados
provocando una mayor contaminación al medio.
1.4 Utilización de absorbentes en la remoción de hidrocarburos
Debido a la problemática que representa la contaminación por hidrocarburos, se han
desarrollado varios procesos para removerlos de áreas contaminadas; entre ellos, la
recuperación por absorbentes es uno de los procesos más promisorios, ya que los absorbentes
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además de remover el petróleo, también son utilizados para aumentar la superficie de contacto
entre el hidrocarburo y los microorganismos, para así favorecer el proceso de degradación.
Existen numerosos materiales celulósicos comercialmente disponibles para la
bioremediación de ecosistemas acuáticos contaminados con petróleo (Ericsson, et al., 1985).
Estos materiales absorben el petróleo incorporándolo dentro de su matriz y aumentando la
superficie de contacto de forma significativa. Sin embargo, también se ha empezado a
enfatizar el uso de residuos no industrializados como son las plumas de pollo, las cuales se han
utilizado como absorbentes de hidrocarburos en áreas que no tienen un fácil acceso a equipo
de limpieza y personal, tal es el caso de derrames en las costas que presentan abundante
vegetación (Breitenbeck & Grace, 1998).
En un estudio realizado por Breitenbeck & Grace (1998), se comparó la capacidad de
absorción de cuatro absorbentes comerciales ricos en N, y dos naturales también ricos en N
(bagazo 5.1% de N y plumas de pollo 14.1 % de N). Los resultados indicaron que todos los
materiales fueron capaces de absorber petróleo por lo menos cinco veces su peso. La pluma de
pollo fue el material que absorbió la mayor cantidad de petróleo (7.1g/g pluma). También se
notó que además de excelente absorbente, los desechos de plumas mejoraban ligeramente la
degradación microbiana del petróleo, este estudio se realizó en microcosmos que contenían
material contaminado con 43,400 mg HTPs/Kg suelo y una relación suelo:residuo de 20:1, en
este estudio se observo que después de 90 días de incubación el tratamiento con bagazo
mejoró la degradación de hidrocarburos totales en un 99%, mientras que tratamiento con
plumas de pollo lo mejoró en un 86%.
Existen muy pocos reportes sobre el uso de plumas de pollo en bioremediación
(Breitenbeck & Grace, 1998). Es posible que la degradación de hidrocarburos pueda
incrementarse sí los microorganismos involucrados en la degradación de hidrocarburos posean
además la actividad proteolítica (queratinolítica) para penetrar a la matriz del absorbente.
1.5 Utilización de los desechos avícolas queratinosos
Las plumas de pollo son generadas principalmente por las plantas procesadoras de aves y
las granjas avícolas. Estas representan una gran fuente de contaminación, pues constituyen
entre el 5 y el 7% del peso total de las aves procesadas (Onifade et al., 1998; Santos et al.,
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1996). En México, la producción de pollo en 1995 fue de 1,200,000 toneladas en canal y
1,500,000 toneladas en pie (Claridades agropecuarias, 1995), lo que generó un total de
189,000 toneladas de plumas.
Uno de los pocos usos que se han dado a las plumas es para la obtención de
hidrolizados utilizados como suplemento en la alimentación avícola, sin embargo, presentan
una baja digestibilidad y deficiente contenido de aminoácidos esenciales como metionina y
triptófano (Baker, 1981; Dalev et al., 1997). Por otro lado, también pueden ser convertidas en
fertilizantes, pegamento, películas, o ser usadas para la producción de aminoácidos como
serina, cisteína y prolina (Papadopolous et al., 1986).
Considerando que el volumen de producción es elevado, y que las plumas están
constituidas en un 90% por queratina, este desecho representa un sustrato potencial para la
obtención de compuestos de mayor valor agregado, o bien puedan ser utilizadas con algún
beneficio ambiental como la bioremediación por composteo, utilizando microorganismos
degradadores de queratina o directamente enzimas queratinolíticas.
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2.0 OBJETIVO GENERAL
Investigar el efecto de la adición de desechos queratinosos en la biodegradación de
hidrocarburos, mediante bacterias previamente seleccionadas por su capacidad
hidrocarbonoclasta y queratinolítica, provenientes de la biota nativa de un suelo contaminado.
2.1 Objetivos Específicos
a) Averiguar qué proporción de la biota nativa presente en un suelo contaminado,
presenta capacidad para degradar hidrocarburos del petróleo y poseen actividad de
queratinasa.
b) Averiguar si la biodegradación de hidrocarburos del petróleo, se incrementa por la
adición de desechos queratinosos, utilizando microorganismos con las capacidades
referidas previamente.
c) Identificar por análisis del 16S rDNA a los componentes del cultivo mixto
queratinolítico responsables de la degradación de hidrocarburos.
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3.0 METAS
1. Caracterizar fisicoquímicamente el suelo problema, procedente del campo petrolero
“Paredón 31” ubicado en el estado de Tabasco.
2. Extraer con solventes orgánicos las fracciones del petróleo presente en el suelo y
analizarlas para identificar los compuestos presentes en cada una, por espectroscopia
de infrarrojo, cromatografía de gases y cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas, según sea el caso.
3. Aislar y caracterizar la biota nativa heterótrofa aerobia presente en el suelo problema
(hongos y bacterias), utilizando medios de enriquecimiento.
4. Evaluar mediante pruebas tamiz, la actividad queratinolitica y degradadora de
hidrocarburos de los microorganismos que constituyen dicha biota.
5. Seleccionar en base a los resultados anteriores, a aquellos microorganismos que reúnan
capacidad queratinolítica y que además degraden hidrocarburos.
6. Identificar bioquímicamente a los microorganismos seleccionados.
7. Realizar cinéticas de producción de queratinasas en un medio sintético adicionado de
desechos plumas al 6% para cada uno de los microorganismos.
8. Analizar los resultados para establecer un consorcio microbiano con los
microorganismos más queratinolìticos y degradadores de hidrocarburos, así como con
los más queratinoliticos y degradadores de hidrocarburos.
9. Realizar cinéticas de crecimiento de los consorcios en un medio mineral adicionado de
los hidrocarburos al 40% de su capacidad de retención en los residuos al 6% con el
objetivo de seleccionar el tiempo de viabilidad de los consorcios.
10. Evaluar la degradación de hidrocarburos realizada por el consorcio durante el tiempo
seleccionado anteriormente, en un medio mineral adicionado del residuo ( pluma) al
6% impregnado con diferentes concentraciones de hidrocarburo seleccionadas éstas en
base a las capacidades de retención del mismo, así como evaluar la degradación del
hidrocarburo sin el residuo.
11. Analizar los resultados para seleccionar la concentración de hidrocarburos.
12. Evaluar la adsorción de los hidrocarburos del petróleo en los residuos de plumas.
13. Realizar cinéticas de degradación de hidrocarburos, en un medio mineral adicionado de
los hidrocarburos con la concentración seleccionada más los desechos de plumas y el
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consorcio microbiano seleccionado, evaluando cuenta viable, actividades enzimáticas,
consumo de nutrientes (nitrógeno y fósforo), pH, proteína soluble y pérdida del
residuo.
14. Identificar cada uno de los aislados que componentes de el cultivo mixto
( queratinolítico) mediante el análisis de 16S rDNA.
4.0 HIPÓTESIS
La adición de desechos queratinosos en medio liquido y suelo, mejora la interacción
entre los hidrocarburos del petróleo y la microbiota presente, así como también incrementa las
condiciones nutrimentales, permitiendo un más rápido crecimiento microbiano, lo que
propiciará una mayor biodegradación de los contaminantes por los microorganismos
degradadores de hidrocarburos, que poseen también una capacidad queratinolítica.
5.0 JUSTIFICACIÓN
En la presente investigación se pretenden utilizar las plumas molidas de pollo, para
favorecer la degradación de los hidrocarburos presentes en un suelo contaminado, debido a
dos factores principalmente:
• Estos residuos han sido reportados como absorbentes de hidrocarburos y/o metales, sin
embargo, poco se ha investigado, sobre su posible biodegradación con petróleo
impregnado dentro de su matriz. Además, tampoco se han utilizado en procesos de
composteo para favorecer la degradación de hidrocarburos del petróleo.
• La disponibilidad de estos residuos en nuestro país es alta, se tienen cifras de
disponibilidad de unas 189,000 toneladas de plumas por año, que a su vez ocasionan
una grave contaminación.
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6.0 MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Suelo contaminado
Para aislar y seleccionar a los microorganismos se utilizaron 12 muestras de suelo
contaminado con hidrocarburos del petróleo provenientes del Campo petrolero “Paredón 31”
ubicado en el Estado de Tabasco.
6.2 Desechos queratinosos
Se utilizaron plumas molidas de pollo como fuente de queratina, las cuales se
limpiaron manualmente de basuras y cuerpos ajenos, se lavaron al chorro de agua y se dejaron
secar al sol. Después se molieron en un molino eléctrico de cuchillas (Willey), y las partículas
se tamizaron a través de una malla del tamaño 20.
La presente investigación se dividió en varias etapas, a continuación se describen las
que han sido cubiertas.
6.3 Etapa 1
La investigación hasta este momento se encuentra dividida en dos etapas. La primera
consistió en el aislamiento de microorganismos con capacidad queratinolitíca y degradadora
de hidrocarburos, provenientes de los suelos contaminados.
6.3.1 Caracterización fisicoquímica de los suelos
Los datos sobre las características físicas y químicas de las muestras de suelo utilizadas
en este estudio fueron proporcionados por la Dra. Norma Gabriela Rojas Avelizapa del
Instituto Mexicano del Petróleo.
6.3.2 Cultivo de enriquecimiento, aislamiento y caracterización morfológica de la biota
proveniente de los suelos 6.3.2.1 Enriquecimiento en medio líquido
Para obtener la biota heterótrofa aerobia de los suelos contaminados se realizaron
cultivos en medios selectivos, caldo papa dextrosa y caldo nutritivo para hongos y bacterias
respectivamente. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25
ml de medio adicionado de 2.5 g de suelo, la incubación se realizó durante 24-48 h para
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bacterias y 120 h para hongos con una agitación de 180 rpm y 28 ºC. Paralelamente y con el
fin de aislar selectivamente a la biota capaz de degradar hidrocarburos (hidrocarbonoclastas)
y/o residuos, se utilizaron cultivos conteniendo 25 ml de medio mineral formulado a base de
0.3g de KNO3, 0.02g de FeCl3, 0.2g de MgSO4.7H2O, 0.1g de CaCl2, 1g de K2HPO4 por litro
y ajustado a un pH 7, adicionado de carapacho de camarón al 6%, petróleo ligero al 0.5% y 2.5
g de suelo, además también se utilizaron cultivos con 25 ml de medio mineral adicionado con
plumas de pollo al 6%, petróleo al 0.5% y 2.5 g de suelo e incubados a las mismas
condiciones. La biota presente en los residuos se obtuvo utilizando caldo nutritivo y caldo
papa dextrosa.
6.3.2.2 Crecimiento en medio sólido
La biota nativa heterótrofa se cuantificó mediante siembra por dilución en placa. En el
caso de bacterias se utilizó agar nutritivo y para hongos se utilizaron placas de agar papa
dextrosa, la incubación se realizó a 28 ºC durante 24 h para bacterias y 120 h para hongos. En
el caso de las bacterias hidrocarbonoclastas (capaces de degradar hidrocarburos), se aislaron
mediante estría en placas de agar noble conteniendo el medio mineral antes mencionado y un
papel filtro impregnado de hidrocarburos, el cual se colocó en la parte interna de la caja. La
incubación se realizó durante 7 días a 28ºC.
6.3.2.3 Morfología colonial y microscópica de la biota nativa hidrocarbonoclasta
Una vez habiendo separado los cultivos, se realizó una observación de las características
morfológicas de las colonias después de 36 h de incubación a 28ºC, tales como: tamaño,
pigmento, forma, bordes, elevación, superficie, luz reflejada, luz transmitida, consistencia y se
realizó tinción de Gram. Para los hongos se observó color del micelio vegetativo y aéreo así
como producción de pigmento.
6.3.3 Selección primaria de bacterias con capacidad querainolitica y degradadora de
hidrocarburos 6.3.3.1 Evaluación semicuantitativa de la actividad queratinolítica
Esta actividad se evaluó creciendo a las cepas nativas aisladas previamente, en un
medio adicionado con lana molida y teñida con azul brillante de remazol. Las fibras de lana
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fueron lavadas y tratadas con sulfito de sodio 0.3M. Después se tiñeron con azul brillante de
remazol al 1%. El color se fijó con dicromato de potasio al 3% y ácido tartárico al 3%. El
exceso de colorante fue removido lavando primero con agua caliente y luego con etanol. La
lana teñida y seca se molió en un molino Willey con una malla 40 y se adicionó al 0.4% al
medio mineral. La actividad de queratinasa se midió en los sobrenadantes de los cultivos a una
absorbencia de 585 nm debido al color liberado en el medio, por la acción lítica de las cepas
positivas después de un periodo de 24 h de incubación. Como control positivo se utilizó a S.
marcescens WF.
6.4 Etapa 2
La segunda etapa consistió en el estudio de las actividades enzimáticas de los
microorganismos seleccionados previamente en medio líquido, así como la conformación de
los consorcios (selección secundaria) y el estudio de degradación de hidrocarburos. En la
Figura 2 se muestra de forma resumida las actividades realizadas en esta etapa, las cuales son
detalladas a continuación.
6.4.1 Evaluación de actividades enzimáticas en medio líquido
6.4.1.1 Preparación de inóculo
El inóculo se preparó en matraces Erlenmeyer de 125 ml; utilizando 25 ml de medio
mineral adicionado con plumas de pollo o carapacho de camarón al 6% e inoculado con una
asada del microorganismo a evaluar. Los matraces se incubaron a 28ºC y 180 rpm realizando
un pase cada 24 h durante tres días, tomando 0.1 ml del cultivo y sembrándolo en medio
fresco, con el fin de tener células jóvenes. En el caso de la evaluación del consorcio se
cultivaron los aislados de la misma forma y al momento de inocular los matraces para la
cinética, en un matraz estéril se adicionaron 3 ml de cada uno de los cultivos con los diferentes
aislados y éste ultimo sirvió para inocular con 0.1 ml los matraces pertenecientes a las
cinéticas de actividades enzimáticas.
6.4.2 Estudio de viabilidad de los aislados en medio con hidrocarburos-residuo ó
hidrocarburos
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Para establecer el tiempo de duración de los estudios de degradación, se realizaron
cinéticas de crecimiento de un aislado proteo-quitinolitico y de un queratinolítico, en matraces
Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de medio mineral adicionado de hidrocarburos a una
concentración equivalente al 40% de la capacidad de retención de las plumas de pollo. O bien
utilizando únicamente el hidrocarburo como fuente de carbono a la misma concentración.
Cada 12 h durante 30 días se evaluó el crecimiento de los microorganismos por dilución en
placa.
6.4.4 Selección de la concentración de hidrocarburos a estudiar
Para evaluar las diferentes concentraciones de hidrocarburos, se prepararon series de 5
matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio mineral, plumas de pollo al 6% e
hidrocarburos al 5, 10, 20, 30 y 40% de la capacidad de retención de los residuos, estos
matraces fueron inoculados con el consorcio respectivo o con el aislado que presentó mayor
actividad enzimática. Los matraces fueron incubados a 180 rpm durante 12 días a 28ºC.
La degradación de los hidrocarburos se evaluó al inicio y al final del periodo de
incubación, extrayendo el hidrocarburo residual del medio de cultivo, mediante una extracción
liquido-liquido en un embudo de separación utilizando diclorometano como solvente y el total
del contenido del matraz Erlenmeyer, el extracto orgánico obtenido se concentró a sequedad
utilizando un rotavapor Vacuubrand CVC2 a una presión de 990 mbar y una temperatura de
40 ºC, los hidrocarburos totales del petróleo (HTP) obtenidos fueron resuspendidos en
diclorometano para su análisis por cromatografía de gases, inyectando 1 µl de muestra en un
cromatógrafo Agilent Technologies serie 6850 GC System, utilizando una columna capilar
HP-1 de metil siloxano cuyas dimensiones son 30 m x 320 µm x 0.25 µm y un detector de
flama (FID). El equipo operó bajo las siguientes condiciones: rampa de temperatura 30ºC/1
min., 30º-100 ºC/ 15min., 100º-200 ºC/7 ºC/min., 200º-250 ºC/6 ºC/min, temperatura de
inyector 250 ºC, detector 280 ºC, se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1.5
ml/min.
La remoción de hidrocarburos totales se determinó por diferencias en áreas bajo la curva
interpolando en una curva tipo de concentraciones conocidas realizada con el mismo petróleo.
Con el fin de evaluar las pérdidas abióticas, también se evaluó la degradación al inicio y al
final del tratamiento en matraces control que contenían las diferentes concentraciones de
petróleo y el residuo y que no fueron inoculados.
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6.4.5 Estudio de crecimiento del consorcio, actividad de queratinasa, pérdida del residuo y evaluación de la degradación de hidrocarburos
Las cinéticas se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml
de medio mineral más 6% de plumas molidas como fuente de queratina, 40% de la capacidad
de retención de hidrocarburos por el residuo (64,800 ppm) y 0.1 ml de inóculo del consorcio,
los matraces se incubaron a 28°C y 180 rpm. Cada 12 h durante 30 días se realizó la cuenta de
bacterias hidrocarbonoclastas, evaluación de actividad queratinolítica (ver 6.4.1.3), pérdida del
residuo (gravimétricamente) y degradación de hidrocarburos (ver 6.4.4).
6.4.7 Análisis estadístico
Todos los experimentos fueron realizados por duplicado, por lo que los datos de las
graficas mostradas corresponden a valores promedio. El calculo de las correlaciones de
Pearson, el Análisis de Variancia y la comparación entre grupos (Tukey) se realizó utilizando
el programa Sigma-Stat versión 2.0.
6.4.6 Estudios de biodegradación
Para evaluar el efecto de la adición de plumas de pollo sobre la biodegradación del
petróleo, se preparó una serie experimental en matraces Erlenmeyer de 125 ml, conteniendo
25 ml del medio mineral, sé adicionó el residuo queratinoso (6 % w/v) y se esterilizó a 121ºC
y 15 psi. Posteriormente se adicionaron 64,800 mg/L de petróleo estéril (40% de la capacidad
de retención de las plumas de pollo). Una vez preparados los matraces, estos fueron
inoculados con 0.1 ml del cultivo mixto e incubados a 28 ºC, 180 rpm durante 30 días. Cada 6
h durante los primeros 3 días; cada 12 h durante los siguientes 6 días y finalmente cada 3 días
durante los últimos 21 días, se retiraron tres matraces para realizar los análisis
correspondientes. Los análisis fueron cuenta viable, degradación de hidrocarburos, adsorción
del petróleo en el residuo queratinoso, evaluación de los hidrocarburos remanentes,
degradación del residuo queratinoso, actividad queratinolítica, contenido de nitrógeno y
fósforo, contenido de productos ninhidrina positivos y pH.
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Paralelamente se prepararon cuatro series experimentales como controles: 1) mismas
condiciones sin la adición del residuo queratinoso, 2) mismas condiciones sin adición de
petróleo, 3) y 4), los anteriores pero éstos no fueron inoculados.
6.4.7 Biodegradación del petróleo
La degradación de los hidrocarburos se determinó mediante la cuantificación de los
hidrocarburos totales del petróleo (HTP’s), extrayendo el hidrocarburo residual del medio de
cultivo de cada uno de los matraces, para lo cual, se realizó una extracción liquido-liquido en
un embudo de separación utilizando diclorometano como solvente y el total del contenido del
matraz Erlenmeyer. El extracto orgánico obtenido se concentró a sequedad utilizando un
rotavapor Vacuubrand CVC2 a una presión de 990 mbar y una temperatura de 40 ºC. Los
HTP’s obtenidos fueron resuspendidos en diclorometano para su análisis por cromatografía de
gases (CG-FID), inyectando 1 µl de muestra en un cromatógrafo Agilent Technologies serie
6850 GC System, utilizando una columna capilar HP-1 de metil siloxano cuyas dimensiones
son 30 m x 320 µm x 0.25 µm y un detector de flama (FID). El equipo operó bajo las
siguientes condiciones: rampa de temperatura 30ºC/1 min., 30º-100 ºC/ 15min., 100º-200 ºC/7
ºC/min., 200º-250 ºC/6 ºC/min, temperatura de inyector 250 ºC, detector 280 ºC y se utilizó
helio como gas acarreador a un flujo de 1.5 ml/min. La concentración de HTP’s se determinó
por diferencias en áreas bajo la curva interpolando en una curva tipo de concentraciones
conocidas (0-14,000 mg/L) realizada con el mismo petróleo.
Con el objetivo de cuantificar la biodegradación neta de HTP’s en los sistemas
adicionados con residuo queratinoso, se evaluó el contenido de hidrocarburos del petróleo
adsorbido a este residuo.
6.4.8 Hidrocarburos del petróleo adsorbidos al residuo queratinoso
Después del proceso de extracción liquido-liquido, el residuo queratinoso seco fue
sometido a una extracción liquido-sólido utilizando un equipo Soxhlet, la extracción se llevo a
cabo durante 8 h utilizando diclorometano como solvente, los extractos orgánicos obtenidos
fueron analizados concentrados y aforados a un volumen de 5 ml para su posterior análisis por
CG-FID.
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6.4.9 Identificación de los HTP’s remanentes
Para la identificación de los HTP’s remanentes, el extracto orgánico conteniendo los
HTP’s fue fraccionado de acuerdo al protocolo reportado por Arce-Ortega et al., 2004. Las
fracciones obtenidas fueron analizadas por cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas (CG-MS) en un HP 6890 y GC-MS 5973 utilizando una columna capilar MS-5. Se
utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 0.9 ml/min. La temperatura del inyector fue
280ºC, la programación del horno fue 80 ºC durante 1 min, 80-240 ºC a 15 ºC/min, 240-280ºC
a 7ºC min-1, y 2 min a 2 80°C. Para la identificación del tipo de hidrocarburos presentes se
utilizó un estándar UST rango diesel (Supelco).
6.4.10 Biodegradación del residuo queratinoso
La biodegradación de las plumas de pollo se cuantificó gravimétricamente mediante
pérdida de peso, una vez que los HTP’s fueron extraídos del residuo, las plumas de pollo
fueron secadas y pesadas.
6.4.11 Actividad queratinolítica
La actividad queratinolítica fue cuantificada utilizando el método de sustrato teñido
(Cedillo, 1998), haciendo reaccionar, en tubos Ependorff, 20 mg de lana teñida con azul
brillante de remazol suspendida en 0.5 ml de solución amortiguadora de glicina-NaOH, 0.2M
pH 9, con 1 ml del sobrenadante del cultivo, ésta mezcla fue incubada a 37ºC durante 1 h. La
reacción enzimática se detuvo al sumergir los tubos en un baño con agua a temperatura de
ebullición durante 15 min. Posteriormente los tubos se dejaron en reposo a 7ºC por 30 min, y
se centrifugaron a 10,000 rpm durante 15 min. Las absorbancias de los sobrenadantes se
leyeron a 590 nm. La actividad se expresó en unidades de queratinasa por ml (UQ/ml),
definiéndose una unidad como la cantidad de enzima necesaria para solubilizar el sustrato
teñido y producir un incremento de 0.01 en la absorbancia, bajo las condiciones
experimentales utilizadas. Los tubos testigos se prepararon usando el sobrenadante del cultivo,
con la enzima inactivada previamente por inmersión en un baño con agua en ebullición por 15
min.
6.4.12 Determinación de nitrógeno y fósforo
17
El contenido de fósforo fue determinado en los sobrenadantes utilizando la técnica de
Bray and Kurtz (Goijberg, 1996). El contenido total de nitrógeno fue cuantificado mediante el
método de micro-Kjeldahl (AOAC, 1970) en los sobrenadantes y en el remanente del residuo
queratinoso.
6.4.13 Determinación de proteína soluble
El contenido de proteína soluble fue determinado en los sobrenadantes libres de células
utilizando el método de Bradford (Bradford, 1976), y haciendo uso de una curva tipo de
albúmina serica de bovino (0-300 µg/ml).
6.4.14 Determinación de productos ninhidrina positivos
El contenido de productos ninhidrina positivos fue cuantificado de acuerdo al método
de Harding (Block & Weiss, 1956), el cual se basa en la reacción de ninhidrina con grupos
amino primarios para formar el complejo púrpura denominado “purpura de Ruhemann”, por lo
tanto, su determinación cuantifica los posibles aminoácidos presentes, en este caso como
resultado de la degradación del residuo queratinoso
Esta determinación se realizó en tubos de vidrio, a los cuales se adicionaron 5 ml de los
sobrenadantes de cada matraz y se colocaron en un baño de agua a ebullición durante 15 min
para precipitar las proteínas residuales. Posteriormente, los sobrenadantes fueron
centrifugados a 7000 rpm durante 15 min, 1.9 ml de cada uno de los sobrenadantes
centrifugados y 0.1 ml del reactivo de ninhidrina (5 partes de ninhidrina al 1 % en piridina y 1
parte de ácido acético glacial a ebullición durante 5 min) fueron adicionados a otros tubos, los
cuales fueron posteriormente incubados en un baño con agua a ebullición durante 20 min y
después incubados a 4ºC durante 15 min., el complejo púrpura formado fue determinado
mediante absorbancia a 570 nm. Los resultados fueron interpolados en una curva de leucina
con una concentración de 0 a 300 µg/ml.
6.4.15 Determinación de pH
El pH se determinó en los sobrenadantes de los cultivos a 25ºC utilizando un
potenciómetro marca Oakton.
18
6.4.16 Análisis estadístico
Los datos obtenidos fueron procesados mediante análisis de variancia ANOVA
utilizando el método de Tukey o de Student Newman-Keuls. La correlación de los resultados
fue analizada por correlación de Pearson. Tales resultados fueron considerados significativos
cuando la probabilidad fue P<0.05. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa
Sigma Stat, version 2.0 para Windows.
65 Identificación de cada uno de los aislados que conforman el cultivo mixto
6.5.1 Extracción de ácidos nucleicos totales (ANT) de cada uno de los aislados que componen el cultivo mixto
En matraces conteniendo 5 ml de caldo Luria-Bertani (1.0 % Triptona, 0.5 % de extracto
de levadura y 1.0 % NaCl) a pH 7.0 se crecieron cada uno de los aislados de forma
independiente, inoculando una asada del aislado y dejando incubar 24 h a 28 ºC y 180 rpm.
Transcurrido este tiempo, se centrifugó el contenido de los matraces a 5500 rpm durante 2 min
a temperatura ambiente, la pastilla obtenida se resuspendió en agua desionizada (por cada 30
µl de biomasa empaquetada resuspender con 100 µl de agua) y se adicionó un volumen igual
de fenol (fenol equilibrado con Tris-HCl, pH 8.0), se mezcló en vortex durante 2 min, se
centrifugó el contenido a 12000 rpm por 5 min a 4ºC y se recuperó el sobrenadante en un tubo
de polipropileno 1.5 ml, al cual se le adicionó un volumen de cloroformo y se mezcló en
vortex durante 30 s con el objetivo de extraer el fenol, inmediatamente se centrifugó a 12000
rpm por 5 min a 4ºC. El sobrenadante se recuperó en un tubo de polipropileno de 1.5 ml, en el
cual se precipitó el DNA con 1/10 de volumen de CH3COONa 3.0 pH 5.2 y 2 volúmenes de
etanol absoluto. Los ANT precipitados se empastillaron centrifugando los tubos a 12000 rpm
durante 30 min a 4ºC, posteriormente el sobrenadante se eliminó y se dejó secar al aire cada
uno de los tubos conteniendo los ácidos nucleicos totales. Por ultimo la pastilla se resuspendió
en 50 µl de buffer TE 1X (Tris-HCl 0.5 M pH 8 y EDTA 1mM) pH 8.0.
6.5.2 Caracterización de los ANT extraídos por fraccionamiento en gel de agarosa al 1.0 % contrastando con bromuro de etidio.
La preparación del gel de agarosa al 1.0 % se realizó de la siguiente forma: 0.2g de
agarosa se disolvieron en 20 ml de TBE 0.5X (5.4g Tris base, 2.75g de ácido bórico, 0.37g
19
EDTA) mediante calentamiento, la gelificación se realizó en el molde de geles adicionando
0.5 µl de bromuro de etidio (1 mg/ml). La electroforesis se realizó utilizando TBE 0.5X, en
cada uno de los pozos se adicionó un volumen de 10 µl de muestra (muestra + 2 µl de buffer
de carga (azul de bromofenol al 0.25 % y glicerol al 30 %). El corrimiento se llevó a cabo a
112 volts durante 50 min aproximadamente.
6.5.3 Cuantificación de ácidos nucleicos totales
El DNA se cuantificó haciendo una dilución de la muestra en agua (2 µl de muestra +
98 µl de H2O) usando un tubo Eppendorff Biophotometer, la dilución se leyó a 260 nm. Se
considera que 1 U A260 = 50 µg / ml (Rochelle, 2001).
6.5.4 Amplificación de la región 16S rDNA
Se obtuvieron los productos de PCR (Polimerase Chain Reaction) utilizando primers
universales (Rivas, et al., 2004), la reacción se realizó en un volumen de 50 µl, adicionando
buffer de PCR 1X, 10 ng de DNA molde, 0.2 µM de cada primer (U1F 5’–
CTYAAAKRAATTGRCGGRRRSSC-3’ y U1R 5’-CGGGCGGTGTGTRCAARRSSC-3’),
0.2 µM de cada desoxinucleotido (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2.5 mM de MgCl2 y 2.5 U de
TAq polimerasa. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Gene Amp PCR System
2400 bajo las siguientes condiciones: precalentamiento a 94ºC durante 5 min,
desnaturalización a 94ºC durante 30 seg, alineamiento a 52ºC durante 30 seg, alargamiento a
72ºC durante 30 seg y un tiempo de permanencia final de 7 min a 72ºC, este ciclo se repetió
35 veces. Una vez finalizada la reacción de PCR, se determinaron los productos por análisis
cualitativo en un gel de agarosa al 1%.
6.5.5 Clonación del producto obtenido en PCR
La clonación se llevó a cabo utilizando el TOPO TA Cloning kit for Sequencing de
invitrogen de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Se transformaron células competentes
de E. coli, para lo cual, se adicionaron en un tubo Eppendorff 0.5 a 4 µl del producto fresco de
PCR, 1 µl de solución salina, agua estéril hasta llegar a un volumen final 5 µl y por ultimo se
adicionó 1 µl del vector TOPO; se mezcló vigorosamente y se incubó la mezcla durante 5 min
a temperatura ambiente (22-23ºC), posteriormente la mezcla (PCR -TOPO construido) se
20
colocó en un baño de hielo y se llevó a cabo la transformación, adicionando 2 µl de la mezcla
anterior a un vial con la cepa TOPO10 químicamente competente de E. coli, el vial se agitó
vigorosamente y se dejó incubar en hielo durante 5 a 30 min, transcurrido este tiempo se
realizó un choque térmico de las células durante 30 seg a 42 ºC sin agitación e inmediatamente
después se regresaron los tubos en hielo y se adicionaron 250 µl de medio S.O.C (Triptona
2%, Extracto e levadura, 0.5%, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM y
glucosa 20 mM) a temperatura ambiente, se taparon herméticamente y se dejaron incubar de
forma horizontal durante 1 h a 37 ºC y 200 rpm. Posteriormente, en placas de agar Luria-
Bertani conteniendo 25 µg de kanamicina/ml (preincubadas a 37ºC) se extendieron 10–50 µl
de las células transformadas, las placas se dejaron incubando a 37 ºC durante 18 h.
6.5.6 Secuenciación de clonas positivas
Se realizó la extracción del plasmido mediante lisis alcalina, para lo cual se tomaron 1-
5 colonias transformadas y se cultivaron toda la noche a 37ºC en 3 ml de medio Luria-Bertoni
conteniendo 50 µg de kanamicina/ml. Se centrifugaron los cultivos anteriores a 14,000 rpm
durante 30 seg a 4ºC y se eliminó el mayor volumen posible del sobrenadante con pipeta
Pasteur o punta de micropipeta, la pastilla se resuspendió totalmente en 150 µl de solución de
lisis alcalina I (50 mM de glucosa, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0) mediante vortex y
se adicionaron 100 µl de la solución fresca de lisis alcalina II (0.2 N NaOH, 1% w/v SDS), se
cerró el tubo y se mezcló mediante inversión, posteriormente los tubos fueron colocados en
hielo durante 5 min. Transcurrido el tiempo, se adicionaron 200 µl de la solución de lisis
alcalina III (5M acetato de potasio 60 ml, ácido acético glacial 11.5 ml, H2O 28.5 ml) y
nuevamente se mezcló por inversión varias veces, se dejaron reposar de 3-5 min en hielo y se
centrifugó el lisado bacteriano a 14,000 rpm durante 5 min a 4ºC, el sobrenadante se transfirió
a un tubo nuevo y se adicionaron 20 µg/ml de RNasa dejándose a temperatura ambiente
durante 30 min. Después, se adicionó un volumen igual de fenol:cloroformo y se mezcló con
vortex, se centrifugó la emulsión a 14,000 rpm durante 2 min a 4 ºC y se trasfirió la fase
superior acuosa a un tubo nuevo.
La recuperación del DNA plasmídico se llevó a cabo precipitando los ácidos nucleicos
del sobrenadante mediante la adición de 2 volúmenes de etanol y 1/10 de volumen de
CH3COONa 3.0 M a temperatura ambiente, la solución se mezcló suavemente y se dejó
21
reposar 2 min a temperatura ambiente. Posteriormente se centrifugaron los tubos a 14, 000 rpm
durante 30 min a 4ºC y se retiró el sobrenadante con cuidado. Se adicionaron al pellet 500 µl
de etanol al 70 %, se cerró el tubo y se agitó suavemente para posteriormente centrifugarse a
14,000 rpm durante 5 min a 4ºC; el sobrenadante se eliminó con una pipeta Pasteur y los tubos
se dejaron abiertos a temperatura ambiente hasta que el etanol se evaporara (5-10 min). Por
ultimo se disolvió el ácido nucleico en 50 µl de TE (pH 8.0). Una vez obtenido el DNA, éste
se cuantificó y analizó de forma cualitativa en un gel de agarosa al 1%.
Posteriormente se llevó a cabo la reacción de amplificación utilizando el Big Dye
Terminador v 3.1 Cycle Sequencing kit. Para lo cual, 8 µl de la mezcla de reacción, 500 ng de
DNA, 19 pmol de primer M13 y agua desionizada necesaria para completar un volumen de 20
µl se mezclaron en un tubo de microcentrífuga, la reacción se llevó a cabo en un
termociclador Gene Amp PCR System 2400 bajo las siguientes condiciones: precalentamiento
a 96ºC durante 5 min, desnaturalización a 96ºC durante 10 seg, alineamiento a 50ºC durante 5
seg, y alargamiento a 60ºC durante 4 min , durante 25 ciclos.
Las reacciones de PCR obtenidas fueron purificadas adicionando 5 µl de EDTA 125
mM pH 8 y 60 µl de etanol absoluto, la mezcla obtenida fue incubada a temperatura ambiente
durante 30 min, posteriormente se centrifugó a 14,000 rpm durante 20 min y se procedió
inmediatamente a eliminar todo el sobrenadante con micropipeta, y finalmente la pastilla se
lavó dos veces con 250 ml de etanol al 70%. Por ultimó las reacciones fueron analizadas y
secuenciadas por ABI-PRISM.
Las secuencias obtenidas fueron depuradas y analizadas mediante BLAST haciendo uso
de las bases de datos del GenBank y del Ribosomal Data Base.
7.0 RESULTADOS Y DISCUSION.
7.1 Caracterización fisicoquímica de los suelos contaminados
Se utilizaron 12 muestras de suelos contaminados con hidrocarburos del petróleo tanto
para el aislamiento de la biota de interés como para estudiar las características fisicoquímicas
del suelo, las cuales indican las condiciones nutricionales y/o ambientales del mismo. La
Tabla 2 resume los datos de los parámetros analizados.
Tabla 2. Características fisicoquímicas de los suelos provenientes del campo petrolero
“Paredón 31”, Tabasco, México.
22
Suelo HTP
mg/Kg H %
pH MO %
N %
P %
Bacterias heterótrofas
UFC/ml
Bacterias hidrocarbonoclastas
UFC/ml PE1A 62,139 44.51 8.15 3.48 0.04 5.08 8.45X107 1.25X107 PE2A 174,753 29.30 7.88 8.97 0.04 4.35 7.45X107 7.72X106 PE4A 17,128 26.47 7.81 8.04 0.13 9.44 3.30X108 5.34X107 PE5A 72,521 35.54 10.24 1.6 0.02 3.87 2.45X106 4.89X105 PE6A 13,020 11.99 7.65 2.66 0.09 5.81 5.14X107 1.15X107 PE7A 2,465 12.01 7.42 ND 0.03 1.94 1.13X106 9.54X105 PE8A 49,477 16.7 7.49 1.6 0.06 6.53 4.65X107 2.57X107 PE9A 582 14.83 7.46 0.41 0.02 2.42 7.35X106 5.69X106 PE11A 1,183 22.75 7.42 1.66 0.03 1.69 7.58X106 5.92X106 PE12A 10,809 22.17 7.80 3.82 0.01 2.66 4.23X105 5.67X103 PE13A 54,139 32.78 7.65 3.24 0.02 2.90 9.37X107 7.06X106 TAM ND ND 6.84 ND ND ND 5.36X107 4.12X107 HTP-Hidrocarburos totales del petróleo, H- humedad, MO- materia orgánica, N- nitrógeno; P- fósforo; ND-no determinado.
Como puede observarse en la primer columna de la Tabla 2, el contenido de
hidrocarburos en los suelos utilizados fue variable, sin embargo, al parecer esta característica
no alteró el numero de bacterias heterótrofas o hidrocarbonoclastas presentes, ya que en suelos
con un bajo contenido de hidrocarburos como el PE9A la población fue similar a otros como
el PE2A o PE11A, o en su defecto fue menor que en suelos con un mayor contenido de
hidrocarburos, tales como el suelo PE1A, PE2A o PE13A. Margesin, et al., 2003, al estudiar
las características de suelos alpinos también encontraron una falta de correlación entre el
numero de microorganismos degradadores de hidrocarburos y el nivel de contaminación. En
cuanto al resto de las características fisicoquímicas; pH, materia orgánica, nitrógeno y fósforo
éstas tampoco mostraron alguna relación con respecto a la biota presente. Además, cabe
mencionar que en todas las muestras de suelo, con excepción del PE5A, el pH se encontró
cerca de la neutralidad, lo cual indica condiciones favorables para la biota del suelo. En el caso
del contenido de N y P, se han reportado relaciones de 10/1 a 2/1 de estos nutrientes que
favorecen el crecimiento de la biota en el suelo, así como la degradación de hidrocarburos
presentes, en este caso todos los suelos utilizados presentaron una deficiencia de N, lo cual
podría sugerir una pérdida de la biota nativa con el paso del tiempo.
7.2 Aislamiento y caracterización morfológica de la biota hidrocarbonoclasta
Como se mencionó en materiales y métodos, el enriquecimiento se llevó a cabo en
medio mineral adicionado de hidrocarburos y carapacho de camarón, o hidrocarburos y
23
plumas de pollo; por lo que se lograron aislar dos grandes grupos de bacterias, aquellas que
crecieron en el medio con carapacho e hidrocarburos (grupo A) y aquellas que crecieron
utilizando plumas e hidrocarburos como fuente de carbono (grupo B), siendo todas ellas
hidrocarbonoclastas. En las Tablas 3 y 4, se muestran los resultados correspondientes a la
morfología colonial y microscópica de los aislados, los cuales fueron nombrados
arbitrariamente, así como el perfil obtenido en cuanto a las enzimas evaluadas, que más
adelante serán detalladas.
Como puede observarse, el número de bacterias hidrocarbonoclastas aisladas en cada
uno de los suelos fue diferente. El total de aislados fue de 109 bacterias, de las cuales 59
pertenecieron al grupo A y 50 al grupo B. Cabe mencionar que también se aislaron 2 hongos,
los cuales no fueron estudiados.
24
Tabla 3. Aislados obtenidos del medio de enriquecimiento conteniendo hidrocarburos del petróleo 0.5 % y carapacho de camarón 6% Aislado A.P A.Q A.K H.Cl Gram Morfología macroscópica
PE1A-a + + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca, lisa, húmeda, butirosa, convexa, 2-3 mm PE1A-b - - - + Bacilo largo G(-) Lobulada, transparente, cremosa, lisa, suave, húmeda, convexa, 2 mm PE1A-c + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE1A-d + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, lisa, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-a + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca traslucida, lisa, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-b + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE2A-c + - + + Bacilo corto G(-) Lobulada, naranja translucida, seca, dura, rugosa, 2-3 mm PE2A-d + - + + Bacilo corto G(-) Lobulada, naranja translucida, seca, dura, rugosa, 2-3 mm PE4A-a - - - + Bacilo corto G(-) Circular, amarillo translucido, convexa, húmedo, lisa, suave, 2-3 mm PE4A-b - + + + Bacilo largo G(+) Circular, amarillo mate, convexa, húmedo, lisa, suave, 2-3 mm PE4A-c + + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 1 mm PE4A-d + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE4A-e + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE4A-f - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 1 mm PE4A-g - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 2 mm PE4A-h + + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 1 mm PE4A-i - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, plana, lisa húmeda, suave, 2-3 mm PE4A-k - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, plana, lisa húmeda, suave, 1 mm PE5A-a + - + + Bacilo corto G(-) Lobulada, naranja translucida, seca, dura, rugosa, 2-3 mm PE5A-b - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 2-3 mm PE5A-c + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE5A-d - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca mate, plana, lisa húmeda, suave, 2-3 mm PE5A-e - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca mate, plana, lisa húmeda, suave, 2-3 mm PE5A-f + - + + Bacilo corto G(-) Lobulada, naranja translucida, seca, dura, rugosa, 2-3 mm PE6A-a + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE6A-b + - + + Bacilo corto G(-) Lobulada, naranja translucida, seca, dura, rugosa, 2-3 mm PE6A-c - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, naranja translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 2 mm PE6A-d + + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarillo translucido, convexo, húmedo, butirosa, 3-4 mm PE7A-a - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 1-2 mm PE7A-b + - + + Bacilo largo G(+) Arborescente, blanca, húmeda, mate, plana, dura. PE7A-c + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE7A-d - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, convexa, lisa húmeda, suave, 2-3 mm PE7A-e + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, lisa, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm A.P: Actividad proteolítica; A.Q: Actividad quitinolítica; A.K: Actividad queratinolítica; H. Cl: Actividad Hidrocarbonoclasta. (-): Ausencia; (+) Presencia.
25
Continuación Tabla 3
Aislado A.P A.Q A.K H.Cl Gram Morfología macroscópica PE8A-a + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE8A-b - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla ocre mate, lisa, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-c - - + + Coco G(+) Circular entera, rosa mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-d + - + + Bacilo corto G(+) Circular entera, rosa mate, lisa, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-a + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE9A-b + - + + Bacilo largo G(+) Arborescente, blanca, húmeda, mate, plana, dura. PE9A-c + - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-d + - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-e - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-f + - + + Bacilo largo G(+) Arborescente, blanca, húmeda, mate, plana, dura. PE9A-g - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-a + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE11A-b - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-c - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-d - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-a - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 2-3 mm PE12A-b - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-c - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-d - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-e - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-f - - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 2-3 mm PE13A-a + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE13A-b + - + + Bacilo largo G(+) Arborescente, blanca, humeda, mate, plana, dura. PE13A-c + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE13A-d - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE13A-e - - - + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm
A.P: Actividad proteolítica; A.Q: Actividad quitinolítica; A.K: Actividad queratinolítica; H. Cl: Actividad Hidrocarbonoclasta. (-): Ausencia; (+) Presencia.
26
Tabla 4. Aislados obtenidos del medio de enriquecimiento conteniendo hidrocarburos del petróleo 0.5 % y plumas de pollo 6% Aislado A.P A. Q A.K H. Cl Gram Morfología
PE1A-1 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE1A-2 + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE1A-3 + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE1A-4 + - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-1 + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-2 + - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarillo translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-3 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE2A-4 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE4A-1 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE4A-2 + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE4A-3 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE5A-1 - - + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE5A-2 + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE5A-3 + + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE5A-4 + + + + Actinomiceto PE6A-1 + - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE6A-2 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE6A-3 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE6A-4 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE6A-5 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE6A-6 - - + + Bacilo corto G(+) Circular entera, naranja mate, lisa, húmeda, butirosa, convexa, 2-3 mm PE7A-1 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE7A-2 + - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE7A-3 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE7A-4 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE7A-5 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-1 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-2 + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE8A-3 + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE8A-4 - - + + Bacilo corto G(+) Circular entera, naranja mate, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-5 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE8A-6 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-1 - + + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE9A-2 - + + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm A.P: Actividad proteolítica; A.Q: Actividad quitinolítica; A.K: Actividad queratinolítica; H. Cl: Actividad Hidrocarbonoclasta. (-): Ausencia; (+) Presencia
27
Continuación Tabla 4
Aislado A.P A. Q A.K H. Cl Gram Morfología PE11A-1 + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-2 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-3 - - + + Bacilo largo G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE11A-4 - - + + Actinomiceto PE11A-5 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE12A-1 + + + + Bacilo largo G(+) Dentada, blanca, lisa, húmeda, mate, plana, suave 4-5 mm PE12A-2 + - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE13A-1 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE13A-2 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm PE13A-3 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca, lisa, húmeda, butirosa, convexa, 2-3 mm PE13A-4 - - + + Bacilo corto G(-) Circular entera, amarilla translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm TAMAA - ND + + Coco G(+) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm TAMBB + ND + + Bacilo corto G(-) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm TAMCC + ND + + Bacilo largo G(+) Circular entera, amarilla mate, húmeda, suave, convexa, 1 mm TAMDD + ND + + Bacilo corto G(-) Circular entera, verde translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm TAMEE + ND + + Bacilo corto G(-) Circular entera, verde translucida, húmeda, suave, convexa, 1-2 mm TAMFF - ND + + Bacilo corto G (+) Circular entera, blanca translucida, húmeda, suave, plana, 1-2 mm A.P: Actividad proteolítica; A.Q: Actividad quitinolítica; A.K: Actividad queratinolítica; H. Cl: Actividad Hidrocarbonoclasta. (-): Ausencia; (+) Presencia.
28
28
Es importante resaltar que un 77% de los aislados fueron bacilos Gram (-) y el 23%
correspondió a bacilos y cocos Gram (+). Al respecto, se ha identificado una alta frecuencia
de bacterias Gram negativas en suelos contaminados. Margesin et al., 2003, reportaron la
presencia mayoritaria de genes provenientes de bacterias Gram negativas (P. putida alkB,
xylE, y ndoB y Acinetobacter alkM) en suelos alpinos donde la concentración de
hidrocarburos era alta (50 a 70 %), indicando que estos organismos se habían enriquecido
bajo condiciones de elevada concentración de contaminación. También mostraron una
correlación positiva (P < 0.001) entre el nivel de contaminación y el numero de genotipos
que contenían genes de P. putida y Acinetobacter sp. Sin embargo no existió una relación
significativa entre la concentración de hidrocarburos totales de petróleo y el numero de
genotipos provenientes de bacterias Gram positivas (Rhodococcus alkB1 and alkB2 y
Mycobacterium nidA).
7.3 Selección primaria de bacterias con capacidad queratinolitica y degradadora de hidrocarburos
Otra característica que se buscó en los aislados fue la presencia de queratinasa, la
cual se evaluó midiendo la absorbancia del color liberado en el medio de cultivo debido a la
acción de la enzima sobre lana teñida. En las figuras 1a y 1b se observa que un gran
número de aislados presentaron esta actividad, sobre todo aquellos provenientes de los
medios de enriquecimiento con plumas de pollo. El criterio de selección se basó en elegir a
los aislados que presentaron mayor lectura de absorbancia, puesto que indica una mayor
actividad, así como en el análisis de las posibles cepas similares. Los aislados
seleccionados fueron 12: PE1Ac, PE1Ad, PE4Ac, PE6Ad, PE9Ab, PE9A2, PE11A4,
PE11A5, TAM AA, TAM CC, TAM EE y TAM FF. Cabe mencionar que con excepción
del aislado “PE11A4 ” que es un actinomiceto, todos las demás son bacterias.
29
29
Figura 1a. Aislados del grupo A que presentaron actividad queratinolítica (absorbancia 595
nm) en medio líquido con lana teñida como fuente de carbono.
Figura1b. Aislados del grupo B que presentaron actividad queratinolítica (absorbancia 595
nm) en medio líquido con lana teñida como fuente de carbono.
Cabe mencionar que también se aisló la biota heterótrofa aerobia de los residuos
(CAR y PLU, Tabla ), sin embargo, debido a que estos no presentaron la capacidad de
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
PE1A
a
PE1A
c
PE1A
d
PE2A
d
PE4A
b
PE4A
c
PE4A
d
PE4A
e
PE4A
h
PE5A
a
PE5A
c
PE6A
a
PE6A
b
PE6A
d
PE6A
e
PE7A
b
PE7A
c
PE7A
e
PE8A
a
PE8A
d
PE9A
a
PE9A
b
PE9A
c
PE9A
f
PE11
Aa
PE13
Aa
PE13
Ab
PE13
Ac
A i s l a d o s
Abs
orba
ncia
585
nm
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
PE1A
1
PE1A
2
PE1A
3
PE1A
4
PE2A
1
PE2A
2
PE2A
3
PE2A
4
PE4A
1
PE4A
2
PE4A
3
PE5A
1
PE5A
2
PE5A
3
PE5A
4
PE6A
1
PE6A
2
PE6A
3
PE6A
4
PE6A
5
PE6A
6
PE7A
1
PE7A
2
PE7A
3
PE7A
4
PE7A
5
PE8A
1
PE8A
2
PE8A
3
PE8A
4
PE8A
5
PE8A
6
PE9A
1
PE9A
2
PE11
A1
PE11
A3
PE11
A4
PE11
A5
PE12
A1
PE12
A2
PE13
A1
PE13
A2
PE13
A3
TA
M A
A
TA
M B
B
TA
M C
C
TA
MD
D
TA
ME
E
TA
M F
F
A i s l a d o s
Abs
orba
ncia
535
nm
30
30
degradar hidrocarburos fueron eliminados y no se continúo con su estudio. En la Tabla 5, se
muestra la frecuencia de actividades enzimáticas de los aislados obtenidos de los suelos, así
como de aquellos que provienen de los residuos.
Tabla 5. Frecuencia de actividades enzimáticas de interés en los aislados obtenidos provenientes de diferentes suelos contaminados con petróleo
Suelo Enriquecimiento en:
Medio mineral + plumas de pollo + hidrocarburos de
petróleo.
Total Aislados hidrocarbonoclastas
Aislados queratino-líticos
PE1A 4 8 8 7 PE2A 4 8 8 5 PE4A 3 13 13 8 PE5A 4 10 10 6 PE6A 6 10 10 10 PE7A 5 10 10 8 PE8A 6 10 10 8 PE9A 2 9 9 6 PE11A 5 9 9 6 PE12A 2 8 8 2 PE13A 4 9 9 7 TAM 4 5 5 5 CAR 0 5 0 4 PLU 4 4 0 3 Total 54 118 109 85
De forma general los estudios referentes a suelos contaminados se han enfocado en
otras enzimas como son fosfatasas, �-glucosidasa, oxidoreductasas deshidrogenasas,
fosfomonoesterasa y lipasas y han sido propuestas como indicadores para medir el grado de
contaminación de los suelos, sin embargo, la enzima mayoritariamente distribuida entre la
población microbiana proveniente de suelos contaminados ha sido la proteasa y la fosfatasa
(Vepsalainen & Niemi, 2002), lo cual es reiterado en los resultados obtenidos en esta
investigación, donde la frecuencia de aislados proteoliticos fue más alta en comparación
con la de quitinolíticos, los cuales no son muy fáciles de encontrar en suelos, debido a que
el sustrato que es la quitina se encuentra distribuida principalmente en crustáceos, algas,
insectos y hongos.
31
31
7.4 Producción de queratinasas
En este estudio, la actividad queratinolítica de cada uno de los 12 aislados
seleccionados previamente fue evaluada en cinéticas de 120 h, utilizando como testigos a S.
marcescens WF y Bacillus thuringiensis-121 (Pérez-García., 2002). En la Figura 2 se
muestran los resultados obtenidos, donde pueden observarse los distintos perfiles de
actividad que presentaron los aislados. La mayoría de los aislados alcanzó su máxima
actividad entre las 12 h (TAM AA) y las 36 h (TAM EE) de incubación, y el nivel de
actividad fue muy diferente entre ellos, el aislado denominado TAM EE cuya máxima
actividad fue de 80 UK/ml superó a la actividad de Bt-121 (60 UK/ml) la cual es
considerada como una cepa altamente queratinolítica (Pérez-García., 2002), los demás
aislados aunque no superaron esta actividad también presentaron actividades considerables
que van desde las 10 UK/ml hasta las 50 UK/ml.
Figura 2. Producción de queratinasa de los aislados provenientes de los suelos
contaminados con petróleo.
Por lo anterior, el consorcio con capacidad queratinolítica estuvo conformado por
los 12 aislados seleccionados. En la Figura 3 se muestra la curva de actividad que presentó
el consorcio durante una cinética de 120 h utilizando medio mineral adicionado de plumas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120
Tiempo (h)
Act
ivid
ad q
uera
tinol
ítica
(UK
/ml)
PE1Ac PE4Ac PE1Ad PE6Ad PE9Ab
PE9A2 S. marcecens TAM DD TAM AA TAM CC
TAM FF TAM EE Bt-121
32
32
de pollo, en dicha figura puede observarse que la máxima actividad queratinolítica fue
alcanzada a las 36 h superando con apenas 6 UK/ml, el nivel de actividad que tuvo el
aislado TAM EE (77 UK/ml) considerado como el más queratinolítico de los 12, con esto
puede verse que la actividad que presentó el consorcio no es la suma de las actividades de
cada uno de los aislados, lo cual hace suponer que no todos los aislados manifiestan la
misma actividad mostrada de forma independiente que dentro del consorcio.
Figura 3. Cinética de actividad queratinolítica del consorcio aislado cultivado a 28°C y
180 rpm en medio mineral adicionado de plumas de pollo al 6 %.
Resumiendo, con base en las actividades evaluadas se decidió conformar dos
consorcios con todos los aislados seleccionados en las pruebas tamiz, por lo tanto los
consorcios estuvieron conformados por los aislados PE1Ac, PE1Ad, PE4Ac, PE6Ad,
PE5A3, PE5A4, PE9A1 y PE9A2 en el caso del consorcio proteo-quitinolítico y por
PE1Ac, PE1Ad, PE4Ac, PE6Ad, PE9Ab, PE9A2, PE11A4, PE11A5, TAM AA, TAM CC,
TAM EE Y TAM FF por el consorcio queratinolítico.
7.5 Capacidad de adsorción de hidrocarburos por los residuos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120
Tiempo (h)
Act
ivid
ad q
uera
tinol
ítica
(UK
/ml)
33
33
En el mercado existen una serie de adsorbentes que son utilizados en la remoción de
hidrocarburos, los cuales presentan capacidades de adsorción desde 1 hasta 16 g petróleo/g
sorbente (Ro, et al., 1998). Sin embargo, estos sorbentes representan también una fuente de
contaminación, por lo que se ha pretendido utilizar sorbentes de tipo orgánico, los cuales
tienen ventajas tales como biodegradabilidad, bajo costo y bajo impacto sobre los
ecosistemas entre otras. Debido a lo cual, la importancia de conocer la capacidad de
adsorción de cada uno de los residuos utilizados, aunque estos no se hayan reportado como
secuestrantes de petróleo en derrames.
Como se mencionó en materiales y métodos, la capacidad de adsorción fue
determinada gravimétricamente. La capacidad de adsorción del carapacho de camarón fue
de 0.8 g petróleo/g, mientras que la de pluma de pollo fue de 2.7 g petróleo/ g.
Cabe mencionar que con esta concentración de petróleo adsorbida en los residuos,
estos físicamente se observaban saturados, lo cual provocó un apelmazamiento, que en
pruebas preliminares no fue posible disgregar, por lo que se probaron distintas
concentraciones de petróleo en base a su capacidad de adsorción en donde los residuos no
perdieran sus características físicas. De esta forma se eligió el 40% de la capacidad de
retención de los residuos como máxima; 64,800 ppm en el caso de plumas de pollo y
19,200 ppm en los cultivos con carapacho de camarón.
7.7 Degradación de hidrocarburos a diferentes capacidades de adsorción
Una vez evaluado el tiempo de viabilidad de al menos uno de los aislados de cada
consorcio, se decidió seleccionar un tiempo de 12 días para evaluar la degradación de
hidrocarburos, debido a que durante este periodo se presentó la fase logarítmica. Por lo
tanto, se evaluó la degradación de hidrocarburos al tiempo inicial y al tiempo final del
tratamiento (12 días) utilizando medio mineral adicionado de carapacho de camarón o
plumas de pollo al 6% con diferentes concentraciones de hidrocarburo que correspondieron
al 5, 10, 20, 30 y 40% de la capacidad de retención e inoculando el consorcio respectivo o
el aislado PE4Ac que fue el que presentó mayor actividad enzimática tanto proteo-
quitinolítica como queratinolítica, esto último con el objetivo de comparar el efecto de la
presencia de todos los aislados en la degradación de los hidrocarburos.
34
34
Cabe mencionar que las concentraciones de hidrocarburos equivalentes a las
capacidades de adsorción de los residuos fueron: 5%, 2,400 ppm; 10%, 4,800 ppm; 20%,
9,600 ppm; 30% 14,400 ppm y 40%, 19,200 ppm, en el caso de carapacho de camarón y,
5%, 8,100 ppm; 10%, 16,200 ppm; 20%, 32,400 ppm; 30%, 48,600ppm y 40%, 64,800
ppm en el caso de plumas de pollo. En la Figura 5 se muestran los resultados obtenidos de
la degradación de hidrocarburos a diferentes concentraciones por el aislado PE4Ac, en
dicha figura se muestra la concentración teórica de petróleo adicionado, la concentración de
petróleo cuantificada en sistemas abióticos que representa la concentración de petróleo
disponible, pues la concentración está disminuida por efecto de las pérdidas por adsorción y
evaporación entre otras, y la concentración de petróleo residual después del tratamiento de
12 días.
Figura 5. Degradación de hidrocarburos del petróleo sorbidos a diferentes concentraciones
en carapacho de camarón utilizando el aislado PE4Ac.
0
4000
8000
12000
16000
20000
5% 10% 20% 30% 40%
Capacidad de retención (%)
Petr
óleo
(ppm
)
Petróleo adicionado petróleo disponible Petróleo residual t =12 d
35
35
En la Figura 5 puede observarse que la perdida abiótica debida al manejo de la
muestra o producida por una fuerte adsorción al residuo no fue constante en todas las
concentraciones, sino que presentó una correlación positiva, es decir a mayor concentración
de hidrocarburos existió una perdida abiótica mayor; sugiriendo que el error experimental
fue constante, este efecto posiblemente solo se debió a la interacción entre el residuo y el
petróleo. Se ha visto que los procesos de adsorción son afectados tanto por las propiedades
del sorbente (tamaño de partícula, contenido de materia orgánica) como por las propiedades
del sorbato (solubilidad, grupos funcionales que reaccionen químicamente con el sorbente,
etc) o bien por factores ambientales como temperatura o contenido de humedad (Allen-
King et al., 1996), en este caso las condiciones de los diferentes tratamientos fueron las
mismas, por lo que ninguna de las propiedades anteriores afectó la adsorción entre
tratamientos, la única variable que se tuvo fue la concentración de hidrocarburos. El
comportamiento que se presentó en el intervalo experimental fue similar al de una isoterma
tipo de Langmuir, mostrando una correlación lineal de Pearson de 0.970, lo cual sugiere
que entre mas saturado se encuentre el residuo, todos los microporos se inundan de
hidrocarburo y su extracción o desorción se dificulta.
En cuanto a la degradación de hidrocarburos, cabe mencionar que la concentración
de petróleo residual que se muestra en la figura es un valor neto, es decir la pérdida abiótica
fue restada. En la Figura 5 también se observa que la máxima degradación de hidrocarburos
se presentó al utilizar la concentración de 14,400 ppm equivalente al 30% de la capacidad
de retención del residuo, dicha degradación de petróleo fue de 7,454 ppm, y presentó
diferencia significativa (P<0.001) con respecto a las degradaciones obtenidas en el resto de
los tratamientos.
Otra evaluación que se realizó fue la degradación de diferentes concentraciones de
hidrocarburos utilizando pluma como absorbente. En la Figura 6 se muestran los resultados
obtenidos utilizando el aislado PE4Ac.
36
36
Figura 6. Degradación de diferentes concentraciones de hidrocarburos del petróleo sorbidos en plumas de pollo utilizando el aislado PE4Ac.
En la Figura 6 puede observarse que el comportamiento de la pérdida abiótica fue
distinto al observado en el carapacho de camarón, es este caso la perdida fue constante en
todos los tratamientos, la correlación de Pearson entre la concentración de hidrocarburos y
la perdida abiótica fue tan solo de 0.482, lo que sugiere que no existe una interacción
dependiente entre la concentración de hidrocarburos y el sorbente. En cuanto a la
degradación puede observarse, que ésta no presentó correlación con respecto a la
concentración de hidrocarburos, pero se obtuvo mayor degradación en el tratamiento con
48,600 ppm equivalente al 30% de la capacidad de petróleo sorbido en la pluma; dicha
degradación fue de 22,963 ppm, y presentó diferencia significativa (P<0.05) con respecto a
la degradación obtenida en los otros tratamientos.
En la Figura 7 se muestra la degradación del petróleo causada por acción del
consorcio queratinolitico y puede observarse que al igual que en el caso anterior, la perdida
abiótica se mantuvo constante en todos los tratamientos independientemente de la
concentración de hidrocarburos presente, lo que indica que al utilizar la pluma como
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
5% 10% 20% 30% 40%
Capacidad de retención (%)
Petró
leo
(ppm
)
Petróleo adicionado Petróleo disponible Petróleo residual t=12 d
37
37
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
5% 10% 20% 30% 40%
Capacidad de retención (%)
Petr
óleo
(ppm
)
Petróleo adicionado Petróleo disponible Petróleo residual t=12 d
sorbente y el petróleo como sorbato no se presentó un comportamiento de adsorción como
el de Lagmuir.
Figura 7. Degradación de diferentes concentraciones de hidrocarburos del petróleo sorbidos en plumas de pollo utilizando el consorcio queratinolítico.
La degradación de hidrocarburos por el consorcio (Figura 7), mostró una
correlación lineal con respecto a la concentración de los diferentes tratamientos (Pearson =
0.996) y por lo tanto se vio favorecida en el tratamiento con 64,800 ppm (40% de la
capacidad de retención de las plumas d e pollo), degradando 35,617 ppm de hidrocarburos,
además la degradación fue significativamente diferente a la de los otros tratamientos
(P<0.035).
De acuerdo con los resultados obtenidos es importante resaltar las diferencias
encontradas entre el uso de los dos residuos, así como de los dos consorcios. Como pudo
observarse, cada uno de los residuos presentó diferente capacidad de adsorción, lo que
provocó que las concentraciones de hidrocarburo basadas en las capacidades de adsorción
de los residuos resultaran diferentes en los tratamientos, la decisión de manejar así las
38
38
concentraciones se basó como ya se mencionó anteriormente, en permitir que las
características físicas del residuo se mantuvieran, ya que de rebasar el 40% de la capacidad
de adsorción de cada uno de los residuos se presentaban alteraciones tales como un fuerte
apelmazamiento del residuo en el caso de las plumas o un lavado del carapacho con el
mismo medio mineral por efecto de la agitación. Además, también se observó que la
degradación de hidrocarburos se vio favorecida en forma significativa por la acción de los
consorcios, sin embargo, también existió diferencia significativa entre ellos; en el caso del
uso del consorcio proteo–quitinolitico la degradación se favoreció con la concentración de
14,400 ppm de las cuales se degradaron 9,590 ppm y en el caso del consorcio
queratinolítico la degradación se favoreció con la concentración de 64,800 ppm
degradándose 35,617 ppm. Con el análisis de estos resultados, se tomó la decisión de
elegir únicamente a las plumas de pollo como residuo, así como al consorcio
queratinolítico, para los estudios siguientes.
7.8 Estudio cinético del consorcio queratinolítico en un medio con pluma de pollo e hidrocarburos
En este estudio se evaluó el efecto de la presencia del residuo sobre la degradación de
hidrocarburos en medio líquido, para lo cual se realizaron tres cinéticas bajo las mismas
condiciones teniendo como única diferencia la presencia de las combinaciones pluma-
hidrocarburo, hidrocarburo solo y pluma sola, la pluma se utilizó al 6%, y el hidrocarburo a
64,800 ppm. Las evaluaciones realizadas fueron: cuenta viable, actividad queratinolítica,
pérdida del residuo y degradación de hidrocarburos.
En la Figura 17 se muestran las curvas de crecimiento del consorcio en los diferentes
medios. Es claro observar como el consorcio alcanzó su mayor crecimiento en menor
tiempo, en el medio que contuvo únicamente pluma, alcanzando una población de 8.8
unidades de log a las 30 h. En el caso del medio con plumas e hidrocarburo, la curva de
crecimiento se observa un poco desplazada con respecto a la anterior, alcanzando su
máxima población (7.8) a las 48 h de incubación, mientras el crecimiento poblacional en el
medio con hidrocarburos se vio significativamente afectado pues su máximo crecimiento
fue de 7.3 y se presentó hasta los 8 días de incubación, con esto se muestra que la
presencia del residuo favoreció el crecimiento del consorcio.
39
39
Figura 8. Cinética de crecimiento del consorcio utilizando pluma, petróleo y la mezcla de
ambos como fuente de carbono.
La evaluación de la actividad queratinolítica del consorcio se muestra en la Figura 9
donde puede observarse que en el medio con pluma se obtuvo una mayor actividad en un
periodo de tiempo más corto (91.5 UK/ml a las 36 h), mientras que el sistema enzimático
del consorcio en el medio con pluma e hidrocarburo obtuvo 72.45 UK/ml a los 3 días de
incubación, con este resultado se resalta que la presencia de petróleo afectó ligeramente el
crecimiento del consorcio y a sus enzimas queratinolíticas. Además se observó una
correlación entre el crecimiento del consorcio en su fase exponencial y la actividad de las
queratinasas, tanto en el tratamiento con petróleo y plumas (Pearson =0.943) como en el
tratamiento con plumas (Pearson =0.976), lo cual indica que durante el crecimiento fue
necesario degradar a las plumas para obtener energía.
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UK
/ml
Pluma Pluma+HC
Figura 9. Actividad queratinolítica del consorcio utilizando pluma sola y petróleo más
pluma como fuente de carbono.
Debido a la acción de las enzimas queratinolíticas el residuo sufrió pérdidas las
cuales, fueron cuantificadas, en la Figura 10 se muestran los resultados obtenidos.
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Tiempo (dias)
(%) R
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Pluma c/i Pluma+Petróleo c/i Pluma s/i Pluma +Petróleo s/i
Figura 10. Pérdida del residuo por acción del consorcio utilizando pluma sola y petróleo
más pluma como fuente de carbono, “c/i” con inóculo, “s/i” sin inóculo.
Además de mostrar en la Figura 10 la pérdida del residuo por efecto del crecimiento
del consorcio también se muestra la pérdida sufrida en los tratamientos que no fueron
inoculados, esto es, la pérdida abiótica debida al manejo de las muestras, como puede
observarse, está pérdida fue mínima pues tan solo se perdió como máximo el 0.6 %w del
residuo original, además haciendo el balance de masa con estos resultados fue posible
calcular la concentración de petróleo sorbido fuertemente en el residuo (400 ppm ±200), el
cual no fue posible recuperar por medio de la exhausta extracción con diclorometano. Cabe
mencionar que esta concentración de petróleo no disponible fue considerada en los
subsiguientes cálculos. Por otro lado, se observó que en los tratamientos inoculados se
presentó una pérdida considerable del residuo, principalmente durante los primeros 10 días
de incubación lo cual correlacionó altamente con la fase de crecimiento exponencial
durante las primeras 72 h (tratamiento con plumas, Pearson = 0.895; tratamiento con
plumas+HC, Pearson = 0.921), además se observó una pérdida superior del residuo (46 %)
en el tratamiento donde éste se suministró como única fuente de carbono, mientras que en
el tratamiento donde se utilizó residuo y petróleo como fuente de carbono la pérdida del
42
42
residuo sólo fue del 30% al término de los 30 días de incubación, lo cual sugiere que la
demanda necesaria de carbono utilizada en el crecimiento del consorcio fue proporcionada
por ambas fuentes.
Con el fin de conocer el efecto de la presencia de plumas de pollo en el medio de
cultivo como una fuente adicional de carbono y como sorbente, se evaluó la degradación de
hidrocarburos en los diferentes tratamientos, Es importante destacar que se evalúo la
pérdida en controles abióticos, la cual osciló entre 1800 y 3500 ppm, incluyendo el petróleo
no desorbido, las pérdidas por manejo de muestra y/o la pérdida en procesos de
evaporación, dicha pérdida fue considerada en los resultados obtenidos en la degradación
biótica.
En la Figura 11 se presentan los resultados netos de la degradación de hidrocarburos
provocada por el crecimiento del consorcio queratinolítico en los medios con hidrocarburo,
y con pluma de pollo adicional al hidrocarburo. Los resultados importantes que pueden
deducirse de la figura 11 es que el consorcio presentó un diferente comportamiento de
degradación del petróleo en cada uno de los medios, en el caso del medio conteniendo
hidrocarburos y residuo, la degradación fue mayor por lo menos durante los primeros 12
días, mostrando una degradación de 17,200 ppm durante los primeros 3 días, 48,400 ppm a
los 6 días, 54, 600 ppm a los 9 y 55,800 ppm a los 12 días, mientras que en el medio que
contuvo únicamente hidrocarburos la degradación fue de 2,000, 11,600, 33,500 y 45,500
ppm, respectivamente.
Transcurrido el tiempo de incubación se observó que ambas curvas de degradación
se comportaron de forma asintótica no mostrando diferencia significativa en la degradación
a partir de los 12 días y durante el resto del tratamiento (P>0.050), esto es, la degradación
significativa de hidrocarburos ocurrió solamente durante los primeros 12 días de
tratamiento en ambos casos. Sin embargo, la diferencia de degradación ocurrida entre
tratamientos fue significativa (P<0.001) durante casi todo el periodo de incubación, la
excepción fue solo entre los días 16 y 20, lo que significa que la presencia del residuo
favoreció de forma significativa la degradación de hidrocarburos acelerando el proceso.
43
43
Figura 11. Degradación de hidrocarburos por acción del consorcio queratinolítico
Cabe mencionar que durante los primeros 12 días de tratamiento también existió la
mayor pérdida del residuo (Figura 10), se presentó la máxima actividad enzimática (Figura
9), y se presentó el máximo crecimiento del consorcio (Figura 8), presentando un
coeficiente de correlación de Pearson >0.9 entre todos los casos al menos durante los
primeros 9 días de tratamiento, con estos resultados se sugiere que la biodegradación de
hidrocarburos y del residuo ocurrió de forma simultanea.
Como se ha mencionado anteriormente, el uso de plumas de pollo para favorecer la
degradación de hidrocarburos no esta muy documentado (Breitenbeck & Grace, 1998), y
además solo se discute el proceso de degradación de los hidrocarburos ignorando la
transformación que sufren los residuos durante el tratamiento.
En la presente investigación los resultados han mostrado que tanto los hidrocarburos
de petróleo como el residuo se degradan de forma paralela, por lo que ha surgido el interés
de investigar de forma adicional a lo planeado la existencia de alguna interacción
enzimática con la degradación de hidrocarburos o bien si solo es un fenómeno de
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superficie o de de nutrientes lo que provoca que los residuos favorezcan la degradación de
hidrocarburos y además en este caso particular se degraden simultáneamente.
7.9 Efecto del residuo queratinoso sobre la biodegradación de hidrocarburos
El principal objetivo de esta etapa del proyecto fue evaluar la degradación de los
hidrocarburos del petróleo en presencia y en ausencia del residuo queratinoso. Sin embargo,
también fue de vital importancia evaluar otros parámetros durante las cinéticas, con el fin
de dar respuesta al comportamiento observado en cada uno de los tratamientos. A
continuación se muestran los resultados obtenidos.
7.9.1 Crecimiento del cultivo mixto queratinolítico
La adición del residuo modificó la curva de crecimiento del cultivo queratinolítico,
las figuras 12a, 12b y 12c muestran el comportamiento del cultivo mixto en medio liquido.
El cultivo queratinolítico presentó la capacidad de crecer en los medios conteniendo
una o ambas fuentes de carbono, sin embargo la curva de crecimiento del cultivo se vio
afectada por la fuente de carbono utilizada. Cuando el cultivo queratinolítico utilizó el
residuo queratinoso como única fuente de carbono (figura 12a) presentó su fase
exponencial durante los primeros 2 días y alcanzó una cuenta microbiana de 108 UFC/ml al
iniciar su fase estacionaria, mientras que, cuando utilizó petróleo como fuente de carbono,
la fase exponencial tuvo lugar durante los primeros 8 días alcanzando una cuenta de 107
UFC/ml. Es decir, la velocidad de crecimiento del cultivo mixto fue menor cuando utilizó
petróleo como única fuente de carbono (0.047 h-1) que cuando utilizó únicamente el residuo
(0.255 h-1). Cuando ambas fuentes fueron adicionadas al medio (residuo queratinoso y
petróleo), la fase exponencial del cultivo mixto se presentó durante los primeros 2.5 días
de incubación y la velocidad de crecimiento observada fue intermedia (0.182 h-1) al
compararla con las obtenidas para cada una de las fuentes.
Se ha reportado que la presencia de hidrocarburos del petróleo tanto en agua como
en suelo provoca un decremento en la población de la microbiota nativa, debido a algunos
factores químicos y físicos, tales como toxicidad, disminución en la disponibilidad de
nutrientes, formación de zonas anaerobias, disminución de la capacidad de agua disponible,
entre otros (Dibble & Bartha, 1979).
45
45
Figura 12. Cinética de crecimiento del cultivo mixto queratinolítico y degradación de
hidrocarburos de petróleo en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (1a): residuo queratinoso, (1b): petróleo y (1c): residuo queratinoso + petróleo. UFC: Unidades formadoras de colonias, HTP’s: Hidrocarburos Totales del petróleo
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Crecimiento
(b) Crecimiento
HTP’s
(c)
Crecimiento
HTP’s
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7.9.2 Biodegradación de hidrocarburos del petróleo
Las figuras 12b y 12c presentan los resultados de la degradación neta de los
hidrocarburos totales del petróleo (HTP) en cada uno de los tratamientos durante los 30 días
de incubación, esto es, los datos reportados que se presentan fueron corregidos por las
perdidas abióticas obtenidas en los controles sin inocular (1800 – 3500 ppm) y también por
la cantidad de petróleo absorbido en las plumas de pollo (600-900 ppm).
Los resultados demostraron que la adición del residuo queratinoso presentó
diferencia significativa (p<0.05) en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo en
comparación con el control sin la adición del residuo queratinoso. La presencia del residuo
(figura 12c) aceleró e incrementó la biodegradación. Durante los primeros 12 días de
incubación el tratamiento sin residuo (figura 1b) mostró una disminución de 35,600 ppm de
HTP's, mientras que el tratamiento con residuo con ambas fuentes, residuo más petróleo
(figura 1c) mostró una disminución de 55,400 ppm durante el mismo tiempo. La velocidad
de degradación de HTP's se incrementó significativamente debido a la presencia del
residuo queratinoso. La velocidad de degradación fue de 2967 ppm de HTP's/día
utilizando el petróleo como única fuente de carbono, mientras que la velocidad de
biodegradación de HTP's utilizando el residuo y el petróleo fue de 4620 ppm de HTP/día.
Estas velocidades se presentaron únicamente durante los primeros 12 días de incubación,
después, las curvas de degradación comenzaron a presentar un comportamiento asintótico y
por lo tanto la biodegradación no fue significativamente diferente.
Un fenómeno comúnmente reportado en la biodegradación de petróleo es un patrón
de dos fases, caracterizado por una primera fase de degradación rápida y una segunda fase
de degradación lenta. La explicación que se le ha dado al cambio de velocidades de
degradación es que la fase inicial o rápida se encuentra mediada por la utilización
bacteriana de los compuestos más fácilmente disponibles y es la fase gobernada por las
actividades enzimáticas. La fase lenta, se ha sugerido que es gobernada por la velocidad de
disolución de algunas partículas en las que se encuentra absorbido el petróleo (Admon, et
al., 2001 & Alexander, 2000). Sin embargo, no solo esta ultima fase se ve afectada por la
lenta desorción del contaminante en las partículas secuestrantes sino también por el
desbalance de nutrientes o la liberación de compuestos tóxicos (Frankenberg, 1992).
47
47
En el presente estudio, la biodegradación de HTP's durante la primera fase ó rápida
de degradación ocurrió durante los primeros 12 días mostrando una correlación positiva
r>0.9 con el crecimiento del cultivo queratinolítico, lo anterior sugiere que la disminución
en la concentración de hidrocarburos fue debida a su utilización como fuente de carbono
por el cultivo mixto. Considerando la baja concentración de hidrocarburos adsorbidos al
residuo queratinoso durante todo el periodo de incubación (600-900 ppm), la segunda fase
de degradación probablemente no fue mediada por la adsorción de los hidrocarburos del
petróleo al residuo queratinoso.
7.9.3 Identificación de los hidrocarburos remanentes
Los hidrocarburos del petróleo extraídos por el método de Soxhlet (sólido-liquido) y
aquellos provenientes del extracto orgánico fueron fraccionados de acuerdo al protocolo de
Arce-Ortega, 2004 y analizados por CG-EM.
Los análisis por CG-EM demostraron que la fracción alifática fue la mas abundante
representando el 94.5% de la totalidad de los HTP´s presentes, Los compuestos alifáticos
identificados se encuentran en el intervalo de C10 a C28. Los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP’s) y sus similares heteroatomos con azufre (HAP’s) representaron el 3.2
y 1.4% respectivamente, mientras que los asfaltenos extraídos previamente con hexano
fueron el 0.8% de los HTP’s.
La fracción alifática, además de haber sido la más abundante de los HTP's que
componen el petróleo en estudio, también fue la que presentó la mayor degradación. La
figura 13 muestra los perfiles cromatograficos de la fracción alifática antes y después de 15
días de incubación con y sin residuo queratinoso. Al inicio de la incubación ambos
tratamientos (con y sin residuo) mostraron un perfil cromatográfico idéntico (figura 2a,
13c), sin embargo, después de 15 días de tratamiento, los perfiles fueron cambiando para
cada uno de ellos. El tratamiento al que se le adicionó petróleo como única fuente de
carbono mantuvo el mismo perfil cromatográfico después de 15 días de incubación,
aparentemente todos los compuestos fueron degradados en una proporción similar y por lo
tanto conservó un mismo perfil (figura 13d), mientras tanto, el tratamiento adicionado con
petróleo y residuo queratinoso mostró un perfil cromatográfico diferente después de 15 días
48
48
de incubación, los compuestos en el intervalo de los C18 y C28 fueron favorablemente
degradados (figura 13b).
Es importante mencionar que el análisis de las fracciones alifáticas provenientes
tanto de los hidrocarburos adsorbidos como de los no adsorbidos al residuo, mostraron el
mismo patrón de degradación, descrito anteriormente. Es decir, la diferencia entre los
perfiles cromatograficos en el sistema adicionado con petróleo y residuo queratinoso no se
debió a la adsorción de algunos hidrocarburos al residuo queratinoso sino a que
probablemente el residuo queratinoso favoreció su biodegradación a través de otros
mecanismos.
Figura 13. Perfiles cromatograficos de la fracción alifática obtenida a partir de los HTP's recuperados después de los tratamientos incubados a 28 ºC y 180 rpm
(a): Sistema conteniendo petróleo y residuo queratinoso como fuentes de carbono (tiempo = 0 días) (b): Sistema conteniendo petróleo y residuo queratinoso como fuentes de carbono (tiempo = 15 días) (c): Sistema conteniendo petróleo como única fuente de carbono (tiempo = 0 días) (d): Sistema conteniendo petróleo como única fuente de carbono (tiempo = 15 días)
Existe poca información referente a la degradación de un grupo particular de
compuestos provocado por la presencia de alguna fuente de carbono compleja. Tan solo,
Kastner & Mahro, 1996 y Sasek, et al., 2003, reportaron que la adición de composta
mejoró la degradación de HAP’s en un suelo contaminado debido al incremento de
nutrientes, así también Namkong, et al., 2002 reportaron la degradación preferencial de n-
4.00 6.00 8.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00040008000
1200016000200002400028000
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Abundance
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4.00 6.00 8.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.000100002000030000400005000060000700008000090000
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Abundance
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4.00 6.00 8.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.000100001500020000250003000035000400004500050000
Time-->
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Time-->
Abundance
24.00 24.00
24.00
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49
alcanos en un suelo contaminado con diesel debido a la adición de materia orgánica.
También se ha reportado que la adición de quitosana, quitina y queratina incrementa la
biodegradación de HTP’s (Setti et al., 1999).
La degradación preferencial de compuestos alifáticos con número de átomos de
carbono C18 a C28 (Figura 13b) probablemente se deba a un menor grado de ramificación en
comparación con los C10 a C17. Solano et al., 1999, reportaron que después de un
tratamiento de biodegradación de gasolina, los componentes residuales fueron alcanos
altamente ramificados con carbonos terciarios y cuaternarios, los cuales resultaron ser
remanentes por su alta ramificación.
Entre los HAP’s identificados en el petróleo en estudio encontraron compuestos del
tipo 2,3,5-trimetil-naftaleno, fenantreno, antraceno y criseno, así como metil-
dibenzotiofeno perteneciente a los compuestos azufrados, sin embargo su biodegradación
no fue detectada en ningún sistema.
7.9.4 Biodegradación del residuo queratinoso
Al igual que el petróleo, el residuo queratinoso fue degradado. Las figuras 14a y
14b muestran la pérdida de peso del residuo. Al igual que el petróleo, el residuo
queratinoso fue degradado en mayor porcentaje durante los primeros 12 días de incubación.
El residuo fue degradado 42% cuando fue utilizado por el cultivo mixto como única fuente
de carbono (figura 14a), mientras que cuando fue suministrado junto con el petróleo (figura
14b), solamente se degradó en un 20%. Esto es, el residuo queratinoso presentó menor
degradación cuando el petróleo estuvo presente y no representó competencia para la
degradación de los HTP's, al contrario, la presencia del residuo favoreció la degradación de
los HTP's y ambos fueron degradados paralelamente.
Es importante mencionar que probablemente, una de las razones en el incremento de
la degradación de HTP's por efecto de la presencia del residuo queratinoso se debió a que el
cultivo mixto posee la actividad enzimática especifica para degradar la queratina,
componente del cual esta constituido el residuo en un 90 %.
50
50
Figura 14. Degradación del residuo queratinoso (plumas de pollo) y actividad queratinolítica evaluados en la cinética de degradación de HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (14a): residuo queratinoso, (14b): residuo queratinoso + petróleo.
7.9.5 Evaluación de la actividad queratinolítica
Durante la biodegradación del residuo queratinoso, la actividad queratinolítica se
expresó en ambos tratamientos (figuras 14a, 14b). La mayor actividad se expresó al
segundo día de incubación en el medio con residuo como única fuente de carbono (figura
14a), mientras que en el medio con petróleo y residuo, la mayor actividad fue expresada
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Actividad queratinolítica
Actividad queratinolítica
Contenido de residuo queratinoso
Contenido de residuo queratinoso
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durante el cuarto día de incubación. Esto es, el petróleo ocasionó que la expresión de la
actividad queratinolítica se retrasara en relación a la expresión en el cultivo con el residuo
queratinoso como única fuente de carbono. El análisis de resultados mostró que la actividad
queratinolitica tiene una correlación positiva (r> 0.9) con la degradación del residuo en
ambos medios (con y sin petróleo), así como con el crecimiento del cultivo queratinolítico.
Lo anterior sugiere, que tanto el petróleo como el residuo fueron degradados por el cultivo
mixto al mismo tiempo.
Muchos autores han reportado el incremento en la biodegradación de hidrocarburos
debido a la adición de una gran cantidad de fuentes de carbono adicionales, tales como
paja de trigo, estiércol de pollo (Sasek, et al., 2003), quitosana, quitina, queratina (Setti, et
al., 1999) o mediante el uso de fertilizantes de liberación prolongada (Hu, et al., 2005). Sin
embargo el uso de estos materiales se ha realizado con conocimiento limitado de las
posibles consecuencias, puesto que algunas veces pueden resultar recalcitrantes o pueden
absorber el compuesto blanco y evitar su degradación. Por eso, es importante que el
material adicionado sea biodegradable y a su vez permita la degradación del contaminante
blanco.
7.9.6 Cuantificación de proteína soluble y aminoácidos
Como resultado del crecimiento microbiano y del proceso de degradación, el medio
de cultivo presentó cambios en su composición, estos posiblemente fueron ocasionados por
la acumulación de productos y/o por el consumo de otros.
En la presente investigación, se evaluó el contenido de proteína soluble en los
sobrenadantes libres de células, las figuras 15a, 15b y 15c muestran los resultados
obtenidos. Los sistemas conteniendo el residuo queratinoso (figura 15a y 15c) presentaron
mayor contenido de proteína soluble que el cultivo conteniendo únicamente petróleo como
fuente de carbono (figura 15b). La mayor acumulación de proteína soluble en los sistemas
con residuo se presentó durante los primeros tres días de incubación, al igual que la fase
exponencial de crecimiento del cultivo mixto (figura 12a y 12c) y que la mayor
biodegradación del residuo (figuras 14a y 14b). En el caso del cultivo con petróleo como
única fuente de carbono, éste presentó una máxima acumulación de proteína soluble
durante los primeros 12 días de incubación, lo anterior correlacionó con el crecimiento del
52
52
cultivo (r> 0.9) (figura 12b), debido que este cultivo no tuvo otra fuente de proteína, la
única proteína cuantificada proviene de la lisis de las mismas células. En los sistemas con
residuo, la proteína soluble evaluada puede provenir tanto de las células como de la
biodegradación del residuo.
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Amino ácidos
(b) Proteína
Amino ácidos
(c) Proteína
Amino ácidos
Figura 15. Proteina soluble y contenido de aminoácidos evaluados en la cinética de
degradación de HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (15a): residuo queratinoso, (15b): petróleo y (15c): residuo queratinoso + petróleo.
54
54
La alta correlación positiva r>0.9 entre la biodegradación del residuo queratinoso,
el crecimiento microbiano y el contenido de proteína soluble durante los primeros tres días
de incubación en los cultivos conteniendo residuo y petróleo, sugiere que el residuo
queratinoso fue utilizado como fuente de carbono y energía por el cultivo mixto
queratinolítico y que la proteína soluble es el resultado de la biodegradación del residuo
queratinoso y del crecimiento microbiano.
La presencia de proteína soluble en los sobrenadantes indicó de forma indirecta la
biodegradación del residuo, y así mismo su presencia representa una fuente de carbono
secundaria que puede ser utilizada.
Con el objetivo de conocer el grado de degradación del residuo queratinoso y el
consumo de proteína soluble, se cuantificó el contenido de aminoácidos. Las figuras 15a,
15b y 15c muestran los resultados obtenidos. En el cultivo conteniendo petróleo como
única fuente de carbono (figura 15b), los productos ninhidrina positivos fueron detectados
después de 12 días de incubación y aunque antes en el sobrenadante se detectó proteína
soluble, ésta no fue metabolizada hasta aminoácidos. Después de12 días, la proteína
comenzó a degradarse, este resultado podría explicar el porque después de 12 días el
contenido de HTP's no fue significativamente diferente; sin embargo la fase estacionaria de
crecimiento del cultivo mixto se mantuvo. Es decir, después de 12 días de incubación el
cultivo mixto queratinolítico probablemente se mantuvo utilizando algunos peptidos y
aminoácidos como fuentes de carbono y energía.
En el caso del cultivo con únicamente residuo queratinoso como fuente de carbono
(figura 15a), la acumulación de posibles aminoácidos comenzó desde los dos primeros días
de incubación, es decir la queratina de las plumas de pollo comenzó inmediatamente a ser
degradada produciendo algunos polipéptidos solubles cuantificados como proteína, así
como aminoácidos. El mismo comportamiento se presentó cuando ambas fuentes de
carbono (residuo queratinoso y petróleo) fueron adicionadas (figura 15c). Sin embargo, el
contenido de productos ninhidrina positivos en el cultivo conteniendo residuo como única
fuente de carbono (figura 15a) comenzó a disminuir a partir del día 12; mientras que en el
cultivo con residuo y petróleo, el contenido de productos ninhidrina positivos se mantuvo
casi constante hasta el final al igual que el contenido de proteína, probablemente debido a la
55
55
presencia de otros compuestos provenientes de la degradación del petróleo que pudieron
soportar el crecimiento microbiano.
7.9.7 pH, contenido de N y P
Otros factores que pueden ayudar a entender el comportamiento del proceso de
biodegradación son el pH, oxigeno, temperatura, presencia de nutrientes, calidad, cantidad
y biodisponibilidad de los contaminantes, ya que éstos afectan directamente la velocidad de
degradación de hidrocarburos.
. El intervalo de pH optimo comúnmente reportado para la degradación de
hidrocarburos se encuentra entre 6.5-8.0 (Morgan & Watkingon, 1989). Sin embargo,
Dible & Bartha (1979) concluyeron que un pH de 7.7-7.8 es el optimo para la degradación
de hidrocarburos y que valores menores puede dar como resultado inhibición parcial de la
degradación. En el presente estudio, el pH se mantuvo alrededor de 7.0 cuando solo se
adicionó petróleo, sin embargo, cuando el residuo queratinoso fue adicionado junto con el
petróleo, el pH del medio se alcalinizó ligeramente (pH 8) durante los primeros 8 días de
incubación, y cuando el residuo queratinoso fue utilizado como única fuente de carbono, el
pH también incremento a 8 durante los primeros 2 días de incubación. El incremento de pH
en los sistemas conteniendo el residuo queratinoso puede deberse a la biodegradación de la
queratina (Zerdani, et al., 2003). El cambio de pH en los sistemas fue otra forma indirecta
de corroborar la actividad metabólica del cultivo mixto, además que éste correlacionó
positivamente con la actividad queratinolítica y la biodegradación del residuo.
El contenido de nitrógeno (N) y fósforo (P) es sumamente importante en cualquier
proceso de biodegradación, algunos autores han reportado niveles específicos de estos
nutrientes en los que se mejora y se acelera la biodegradación de hidrocarburos, algunos de
ellos son 100/10/1, 120/10/1 (Morgan & Watkinson, 1989). Sin embargo, la
biodisponibilidad también es importante, ya que algunas veces se ha reportado que la
fertilización no incrementa la biodegradación del contaminante o puede inhibirla (Faday &
Overton, 1995).
Las figuras 16a, 16b y 16c muestran el contenido de N y P en los tres sistemas de
tratamiento durante el periodo de incubación. El contenido de nutrientes provienen de la
propia composición del medio, el P principalmente proviene del composición del medio
56
56
mineral, mientras que el contenido de N no solo proviene de la composición del medio
sino también proviene del residuo queratinoso, el cual contiene 15% de N, por lo tanto, el
cultivo conteniendo solo petróleo como fuente de carbono (figura 16b) presentó el mas bajo
contenido de N.
El contenido promedio inicial de P en los tres sistemas fue 130 m/l, este contenido
disminuyó rápidamente durante los 2 primeros días de incubación en los sistemas
conteniendo el residuo queratinoso (figuras 16a y 16c). La disminución de P correlacionó
positivamente (r >0.9) con la fase logarítmica del cultivo queratinolítico en estos
tratamientos.
La disminución del contenido de P durante los 2 primeros días de incubación en el
cultivo conteniendo solamente residuo queratinoso fue de 85%, mientras que en el cultivo
conteniendo petróleo y el residuo, la disminución fue del 75%. Por otro lado, el cultivo con
petróleo como única fuente de carbono (figura 16b) presentó una disminución del 70%
durante los primeros 12 días y esta disminución correlacionó con la fase exponencial del
cultivo mixto
La disminución considerable en el contenido de P en los tres sistemas provocó un
desbalance en la relación N/P a pesar de que el nitrógeno también fue consumido.
Las figuras 16a, 16b y 16c muestran el contenido de N total durante el periodo de
degradación de hidrocarburos. El contenido de N total fue 8000 mg/l en los sistemas con
residuo queratinoso (figure 16a y 16c), mientras que en el cultivo con petróleo como única
fuente de carbono, el contenido de N fue de 75 mg/l (figure 16b). Lo anterior ocasionó que
las proporciones iniciales de N/P fueran 100/1.5 y 100/175 respectivamente.
Los resultados mostraron que una de las funciones atribuidas al residuo
queratinoso, fue el mejoramiento en la interacción cultivo microbiano-petróleo. Sin
embargo, al parecer no es la única función ya que también se le puede atribuir un papel
importante en el aporte de N.
57
57
Figura 16. Contenido de nitrógeno y fósforo evaluados en la cinética de degradación de
HTP’s en medio liquido conteniendo como fuente de carbono (16a): residuo queratinoso, (16b): petróleo y (16c): residuo queratinoso + petróleo.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Time (days)
Fos
foro
(mg/
l)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Nitr
ogen
o to
tal (
mg/
l)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Time (days)
Fos
foro
(m
g/l)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Nitr
ogen
o to
tal (
mg/
l)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (dis)
Fosf
oro
(mg/
l)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000N
itrog
eno
tota
l (m
g/l)
(a)
(b)
(c)
Nitrógeno
Fósforo
Fósforo
Nitrógeno
Nitrógeno
Fósforo
58
58
El contenido de N total fue cuantificado mediante la suma de dos determinaciones
parciales, una en el sobrenadante y la otra en el residuo queratinoso remanente. Los
resultados de estas dos determinaciones mostraron que el contenido de N en los
sobrenadantes de los sistemas con residuo queratinoso, se incrementó durante el periodo de
incubación, lo cual fue atribuido a la liberación de N durante la biodegradación del residuo
queratinoso, mientras que el contenido de N evaluado únicamente en el residuo remanente
mostró disminución. La concentración neta de este nutriente mostró un perfil de
disminución (figuras 16a y 16c). El mayor consumo de N se presentó durante la fase
logarítmica de crecimiento del cultivo mixto, y por lo tanto del periodo en el que se llevó a
cabo la mayor biodegradación de los hidrocarburos de petróleo, mostrando una correlación
de r >0.9.
A pesar de que ambos nutrientes (N y P) fueron consumidos durante el periodo de
degradación, la relación N/P no fue constante, lo cual posiblemente influyó en la eficiencia
de degradación de hidrocarburos, aunque cabe mencionar que las proporciones iniciales de
estos nutrientes no fueron las óptimas que se han reportado para la biodegradación de
hidrocarburos, debido al alto contenido de nitrógeno aportado por el residuo queratinoso.
Sin embargo, se ha reportado que la utilización de absorbentes o materia orgánica rica en
N incrementa la biodegradación de los contaminantes (Thomas et al., 1992).
7.10 Identificación de los aislados que conforman el cultivo mixto
La identificación de cada uno de los aislados que conforman el cultivo mixto
queratinolítico se realizó mediante la secuenciación de un fragmento del 16s rDNA
amplificado por los primers UniRev-UniFor. La figura 17 muestra la localización del
producto amplificado dentro del 16s RNA de E. coli.
59
59
Figura 17. Esquema de la secuencia 16S rDNA de E. coli indicando los productos de amplificación por los primers (Brosius, et al., 1978).
Después de clonar y secuenciar el producto de PCR obtenido usando los primers
universales, se llevó a cabo el análisis BLAST utilizando la base de datos del Gen Bank. La
tabla 6 muestra los resultados obtenidos.
UniFor-UniRev amplified regionFBac-RBac 341bp
FBac RBac UniFor UniRev
UniFor-UniRev amplified regionFBac-RBac 341bp
FBac RBac UniFor UniRev
60
60
Tabla 6. Identificación de bacterias hidrocarbonoclastas mediante el análisis de un fragmento del 16S rDNA
Aislado Identidad
(%) pb No. de
acceso Store (bits)
E Gaps Microorganismo
6d 98.9 472/477 AY841799 898 0 1/477 Stenotrophomonas maltophilia
EE 99.7 448/449 DQ228956 882 0 0 Pseudomonas aeuroginosa
FF 98.9 472/477 AY841799 898 0 0 Stenotrophomonas maltophilia
1d 98.5 467/474 DQ124701 844 0 5/474 Stenotrophomonas sp
4c 99.1 472/476 AM110964 912 0 0 Stenotrophomonas sp.
9-2 98.7 467/473 AF005016 874 0 2/473 Nocardioides fulvus 98.7 467/473 AF00507 874 0 2/473 Nocardioides luteus 98.7 467/473 AF005001 874 0 2/473 Nocardioides albus 97.6 462/473 AY148082 835 0 2/473 Nocardioides sp.
1c 98.6 483/490 DQ219340 916 0 0 Bacillus sp. 98.6 483/490 DQ207856
2 916 0 0 Bacillus cereus
98.6 483/490 AE017355 916 0 0 Bacillus thuringiensis serovar konkurian
98.6 483/490 AE017225 916 0 0 Bacillus antrhacis 98.6 483/490 AY425946 916 0 0 Bacillus cereus
9b 99.1 467/471 AY37.357 902 0 0 Bacillus mycoides 99.1 467/471 AF506057 902 0 0 Bacillus sp. 98.7 465/471 DQ207562 886 0 0 Bacillus cereus 98.7 465/471 AE017355 886 0 0 Bacillus thuringiensis 98.7 465/471 AE017334 886 0 0 Bacillus antrhacis
11-4 98.7 469/475 AY278907 894 0 0 Bacillus sp. 98.31 467/475 AJ422145 872 0 2/475 Bacillus barbaricus 97.7 464/475 AY686594 854 0 0 Bacillus holodurans 97.7 464/475 AY960115 854 0 0 Bacillus clausil
CC 99.4 470/473 AY745849 914 0 0 Bacillus sp. 99.4 470/473 AY523411 914 0 0 Bacillus catenulatus
99.4 470/473 AY904033 914 0 0 Bacillus kuguryoae 99.4 470/473 AY550276 914 0 0 Bacillus cibi 99.1 470/474 AJ583158 900 0 0 Bacillus indicus
AA 99.1 473/477 AB188213 906 0 1/477 Micrococcus sp 98.9 472/477 AJ717368 906 0 1/477 Micrococcus lacteos
98.9 472/477 AM15892 906 0 1/477 Micrococcus indicus
61
61
El resultado del análisis BLAST mostró que las 11 bacterias hidrocarbonoclastas
queratinoliticas, fueron identificadas con un alto porcentaje de identidad utilizando la base
de datos del Gen Bank (Tabla 6). Sin embargo, algunas de ellas presentaron identidades con
más de una especie (aislados: 9-2, 1c, 9b, 11-4, CC, AA).
Hasta el momento solo se puede decir que se han identificado los géneros
Micrococcus, Stenotrophomonas., Bacillus, Nocardiodes y Pseudomonas. Las bacterias del
genero Bacillus, Pseudomonas y Micrococcus han sido ampliamente reportadas como
degradadoras de hidrocarburos de petróleo tanto en la biorestauración de suelos como en el
tratamiento de efluentes. Mientras que el género Stenotrophomonas y Nocardiodes ha sido
encontrado con menor frecuencia.
Con el objetivo de complementar la identificación e intentar disminuir el número de
posibles especies, se amplificará el mismo DNA con otros primers que reconocen el inicio
de la secuencia 16S para posteriormente clonar y secuenciar. Además se completará el
análisis de resultados con otras pruebas especificas para discernir entre especies cercanas,
como lo es el grupo de Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus antrhacis, donde la
prueba final para su identificación se basa en que B. antrhacis presenta cápsula, B.
thuringiensis la formación de un cristal bipiramidal y B. cereus ninguna de las dos
anteriores.
62
62
8.0 CONCLUSIONES
� Durante la cinética de degradación de hidrocarburos del petróleo, se observó que la
velocidad de crecimiento del cultivo queratinolítico se incrementó por la presencia
del residuo queratinoso, y además en este sistema con petróleo y residuo, la
degradación de HTP’s fue significativamente mas alta que en el sistema adicionado
únicamente con petróleo.
� El periodo de mayor degradación de hidrocarburos en ambos sistemas (con y sin
residuo), se presentó durante los primeros 12 días de incubación, mismo tiempo en
que se presentaron las fases logarítmicas de los cultivos queratinoliticos, se
presentaron variaciones significativas en el consumo de N y P, y se detectó la
producción de proteína soluble. Así también, la expresión de la actividad
queratinolítica, la degradación del residuo, la producción de aminoácidos y la
variación del pH fueron parámetros que se modificaron de manera significativa en
el sistema con petróleo y residuo. Estos parámetros correlacionaron (r>0.9) entre si
en cada uno de los sistemas.
� Los géneros identificados mediante análisis del 16S rDNA de las bacterias
hidrocarbonoclastas queratinolíticas fueron Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas,
Nocardiodes y Stenotrophomonas. Lo tres primeros géneros han sido ampliamente
reportados en los procesos de degradación de hidrocarburos tanto en la
biorestauración de suelos como en el tratamiento de efluentes. Mientras los géneros
Stenotrophomonas y Nocardiodes han sido encontrados con menor frecuencia.
63
63
9.0 BIBLIOGRAFIA Adams, S.R.H., Dominguez, R.V.I. & Garcia, H.L. 1999. Potencial de la bioremediación de
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