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Universidad de Los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Laboratorio de Genética y Química Celular
Utilización de microsatélites en el estudio de la resistencia de
árboles seleccionados de cacao (Theobroma cacao L.) a la
enfermedad “Mancha de Agua” (Phytophthora megasperma)
Br. Victor Hugo Mora Rivas
Mérida, 2009
Trabajo Especial de Grado presentado como parte de los requisitos exigidos
para optar al título de Licenciado en Biología.
Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes
Bajo la cotutoría de
Dra. Maria Marcano de Segovia (ULA)
Ing. MSc. Raisa Rumbos (INIA)
A mi amado padre, que desde el cielo me bendice.
A mi querida madre y hermanas: razones imperecederas
de mi vida cuyo amor, devoción, estímulo, confianza y alegría
han sabido darme siempre.
Las amo!
RESUMEN
El cacao (Theobroma cacao L.) es un cultivo íntimamente ligado a la cultura Venezolana, sin
embargo aporta junto con otros países, solo el 1% de la producción mundial del grano. El cacao
venezolano, reconocido a nivel mundial por sus excelentes cualidades aromáticas procede del
árbol de tipo criollo, considerado también el más sensible a plagas y enfermedades. Una de las
enfermedades que afectan a las plantaciones de cacao en la zona Sur del Lago de Maracaibo,
así como en las zonas productoras del Estado Sucre, es la llamada “Mancha de agua”, causada
por Phytophthora megasperma, que ocasiona sobre los frutos una mancha de color marrón
claro, de bordes regulares definidos que puede llegar a cubrir toda la mazorca, pudiendo
afectar de manera directa a las semillas. Recientemente se han utilizado marcadores
moleculares para localizar en el mapa de ligamiento genético, factores implicados en la
resistencia de plantas a enfermedades. En este trabajo se evaluó la resistencia de plantas de
cacao a P. megasperma, inoculando mazorcas desprendidas, en cámara húmeda, con un
inóculo de 1x105 zoosporas/ml, mediante aspersión en gotas finas; así mismo se realizó un
estudio de asociación entre marcadores microsatélites y la resistencia a la enfermedad. La
variabilidad de los resultados confirma la naturaleza poligénica de la resistencia en las plantas
seleccionadas de cacao a Phytophthora megasperma. También se encontró variabilidad en la
respuesta de resistencia en cultivares criollos, mostrando algunos de ellos cierta resistencia a la
enfermedad. El análisis genotípico de la población demostró la baja heterocigosis de la misma,
estando conformada principalmente por cultivares con una alta frecuencia del alelo criollo. El
análisis de asociación entre marcadores y la resistencia permitió encontrar 5 microsátelites
asociados con la resistencia, mTcCIR17 (GL 4), mTcCIR189 (GL8), mTcCIR8 (GL 9), mTcCIR229 y
mTcCIR223 (GL 10), los cuatro primeros reportados en estudios previos como ligados a la
resistencia en distintas progenies de cacao, a diversas especies de Phytophthora y en regiones
coincidentes con genes RGA y GDA, y el último asociado al color del cotiledón.
Palabras clave: Theobroma cacao, resistencia, Phytophthora megasperma, análisis de
asociación.
ABREVIATURAS
SSR Marcador microsatélite
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
AZ Medio agar zanahoria
ADN Ácido desoxirribonucleico
QTLs Quantitative Trait Loci
cM CentiMorgan
GL Grupo de Ligamiento
DDL Desequilibrio de Ligamiento
AFC Análisis Factorial de Correpondencias
TAE Buffer TAE. Tris, ácido acético y EDTA
EDTA Ácido etilendiamino tetracetico
dNTP Desoxirribonucleótido trifosfato
K número de subpoblaciones (STRUCTURE)
DGA Genes análogos de defensa en las plantas
RGA Genes análogos de resistencia en las plantas
INDICE DE CONTENIDO
I. INTRODUCCIÓN 1
1. Descripción del cacaotero 1
Taxonomía y botánica del cacaotero 1
Condiciones ecológicas del cacaotero 4
Diversidad del cacao Venezolano 4
Importancia económica del cacao en Venezuela 5
Principales enfermedades del cacao en Venezuela 6
2. Descripción del patógeno causante de la enfermedad “Mancha de Agua” en cacao 8
La enfermedad “mancha de Agua” en cacao 8
Enfermedades causadas por Phytophthora spp. en cacao 10
Taxonomía de Phytophthora spp. 11
Ciclo de vida típico de Phytophthora spp 12
3. Genética de la resistencia de plantas a enfermedades 14
Concepto de enfermedad 14
Las interacciones planta-patógeno 15
Especificidad de las interacciones planta-patógeno 15
Activación y mecanismos de defensa 18
Pruebas biológicas de resistencia realizadas en plantas de cacao a diversos
patógenos. 20
4. Uso de marcadores moleculares en el estudio de la resistencia a enfermedades en
cacao 22
Tipos de marcadores moleculares 22
Microsatélites ó SSRs 23
Marcaje de caracteres importantes en el mejoramiento de cultivos 25
Estudios de ligamiento entre marcadores y resistencia a enfermedades en
cacao causadas por especies de Phytophthora 27
JUSTIFICACIÓN 28
HIPÓTESIS 29
OBJETIVOS 29
Objetivo general 29
Objetivos específicos 29
II. MATERIALES Y MÉTODOS 30
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inóculo de Phytophthora
megasperma. 30
Ubicación y características del sitio de recolección del patógeno 30
Aislamiento y caracterización de Phytophthora megasperma 31
2. Selección de las plantas y cosecha de las mazorcas a evaluar 32
3. Evaluación de la resistencia/susceptibilidad de frutos de cacao al hongo P.
megasperma 33
4. Evaluación del Genotipo 35
Selección de marcadores microsatélite 35
Optimización Extracción del ADN, amplificación, electroforesis y visualización de
microsatélites 36
Lectura e interpretación de geles 36
5. Análisis de datos 37
Análisis del genotipo 37
Análisis de la estructura en la población original. 37
Análisis del Fenotipo 38
Análisis de Asociación 38
III. RESULTADOS 39
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inoculo de P. megasperma 39
Aislamiento del Phytophthora megasperma 39
Caracterización de P. mergasperma 39
2. Evaluación de la resistencia de las mazorcas de cacao a P. megasperma 42
3. Análisis de microsatélites 49
Extracción y cuantificación del ADN 49
Amplificaciones por PCR de microsatélites 50
Geles de Poliacrilamida y tinción con Nitrato de Plata. 50
4. Análisis de Genotipo 52
Frecuencias Alélicas por Locus 52
Frecuencias Genotípicas por Locus 53
Heterocigosis Observada por locus 55
Heterocigosis Observada de cada Individuo 56
Análisis de la Estructura de la Población 57
Análisis del número de subpoblaciones 58
Selección de la población no estructurada 58
5. Análisis de Asociación 60
IV. DISCUSION 61
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inóculo de P. megasperma 61
2. Evaluación de la resistencia de plantas seleccionadas a P. megasperma 62
3. Análisis del Genotipo 64
4. Estudio de la estructura de la población 65
5. Análisis de asociación entre marcadores microsatélites y la resistencia a P.
megasperma. 66
V. CONCLUSIONES 71
VI. RECOMENDACIONES 73
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74
ANEXOS 85
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Árbol de cacao 3
Figura 2. Localización de las principales enfermedades de cacao en las zonas
productoras de Venezuela 7
Figura 3. Mazorca de cacao con síntoma típico de la enfermedad “Mancha de Agua" 9
Figura 4. Ciclo de vida típico de especies de Phytophthora 13
Figura 5. Modelo “gen por gen” 17
Figura 6. Variación del modelo “gen por gen” 18
Figura 7. Esquema de un microsatélite con repeticiones (CAC)n 24
Figura 8. Región Sur de Lago de Maracaibo. Sitio de recolección del patógeno 30
Figura 9. Muestreo de las mazorcas de cacao en campo 32
Figura 10. Aspersión en gota fina del inoculo de P. megasperma 34
Figura 11. Mancha ocasionada por la germinación de solo una zoospora de P.
megasperma 40
Figura 12. Cultivo de P. megasperma en medio agar zanahoria 41
Figura 13. Características morfológicas de las estructuras internas del micelio de P.
megasperma 41
Figura 14. Cultivares altamente resistente a la infección por P. megasperma 43
Figura 15. Cultivares con resistencia media a la infección por P. megasperma 43
Figura 16. Cultivares con resistencia baja a la infección por P.megasperma 43
Figura 17. Distribución de frecuencias de fenotipos en la población completa (escala
de evaluación en rango de 1 a 8) 46
Figura 18. Distribución de frecuencias de fenotipos en la población completa (escala
de evaluación en rango de 1 a 3) 46
Figura 19. Niveles de resistencia en individuos criollos 47
Figura 20. Frecuencia en las respuestas de resistencia en individuos híbridos
(Población no estructurada) 48
Figura 21. ADNg extraído a partir de hojas de cacao (68 cultivares). Gel de agarosa
0,8%
49
Figura 22. Prueba de calidad del ADNg extraído. Amplificación por PCR 49
Figura 23. Amplificación por PCR de 24 marcadores microsatélites con un mismo
ADN. Gel de agarosa 1,5% 50
Figura 24. Prueba de tiempos de electroforesis de marcadores microsatélites en gel
de poliacrilamida 6% con Urea, tinción con Nitrato de Plata 51
Figura 25. Ejemplos de geles de poliacrilamida revelados con Nitrato de Plata en los
cuales se observan los alelos de microsatélites 52
Figura 26. Análisis factorial de correspondencias para la población original (68
individuos) y 15 marcadores no ligados (XlSTAT 7.5.2) 57
Figura 27. Análisis de la estructura de población (Structure) 58
Figura 28. Análisis factorial de correspondencias de la población no estructurada (42
individuos) y 15 marcadores no ligados (XlSTAT 7.5.2) 59
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Plantas seleccionadas de cacao con sus respectivas procedencias 33
Cuadro 2. Marcadores seleccionados 35
Cuadro 3. Características morfológicas y fisiológicas observada en los aislados de P.
megasperma en condiciones de laboratorio 40
Cuadro 4. Evaluación de la respuesta resistencia/susceptibilidad de mazorcas de cacao
frente a P. megasperma 44
Cuadro 5. Prueba de medias para la evaluación de la respuesta
resistencia/susceptibilidad (Test de Kruskall y Wallis) 45
Cuadro 6. Frecuencias alélicas por cada locus de microsatélite evaluado en la
población original 53
Cuadro 7. Frecuencias genotípicas por cada locus de microsatélites evaluado en la
población original 54
Cuadro 8. Heterocigocidad por cada locus de microsatélite evaluado en la población
original 55
Cuadro 9. Heterocigosis de individuos evaluados 56
Cuadro 10. Análisis de asociación entre marcadores microsatélites y resistencia a P.
megasperma. Umbral de significancia P=0.05 60
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Medios de cultivos para el aislamiento y la caracterización de P. megasperma
Anexo 2. Escala de evaluación para la prueba de resistencia/susceptibilidad en frutos de
cacao
Anexo 3. Procedimientos de laboratorio para el análisis de microsatélites
3.1. Extracción de ADN
3.2. Visualizacióndel ADN en gel de agarosa
3.3. Amplificación de microsatélites (PCR)
3.4. Visualización de microsatélites en agarosa
3.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida 6% con Urea
3.6. Tinción de geles con Nitrato de Plata
3.7. Lectura e interpretación de los microsatélites
Anexo 4. Prueba de medias para la evaluación de la resistencia/susceptibilidad de frutos de
cacao (Test de datos no paramétricos Kruskal y Wallis) (XlSTAT 7.5.2)
Anexo 5. Matriz resultante de la codificación alélica de cada individuo en los microsatélites
analizados
Anexo 6. Estudio de la estructura de la población
6.1. Resumen análisis del número de subpoblaciones (STRUCTURE)
6.2. Aportes de individuos a la conformación de las subpoblaciones
Anexo 7. Gráficos de genotipos y nivel de resistencia por cada locus de microsatélites
I. INTRODUCCIÓN
No se sabe cuándo se iniciaron exactamente las siembras de cacao en nuestro país. Sin duda
alguna y amparados en la teoría sobre el origen del cacao como proveniente de la zona
noroccidental de Venezuela, debió ser allí donde se encontraron las primeras plantas silvestres
de este fruto (Reyes y Reyes, 2000).
El cacao constituyó el primer rubro agrícola de exportación en Venezuela, siendo para 1634,
nuestro país, el mayor productor (Cartay, 1999). Durante la tercera década del siglo XX, la
depresión económica mundial, el ciclón que azotó al estado Sucre en 1933, el boom de la
explotación petrolera y la explosión de la Segunda Guerra Mundial, confluyeron en el
estancamiento y deterioro de la producción cacaotera (Reyes y Reyes, 2000).
Nuestro país aún sigue teniendo potencialidades para ser un gran productor de cacao fino de
aroma, sin embargo, la producción nacional actualmente es muy baja, debido, entre otras
razones, al relativo poco esfuerzo destinado a la obtención de cultivares mas productivos, con
resistencia a enfermedades y plagas y que conserven las calidades aromáticas propias de
nuestros cacaos Criollos.
1. Descripción del cacaotero
Taxonomía y Botánica del cacaotero
La primera descripción del árbol de cacao fue realizada por el naturalista español Francisco
Hernández en el siglo XVI (Braudeau, 1970), pero fue Linneo, en 1737, quien prefirió designarlo
Theobromae, calificativo de “manjar de los dioses”. Dentro de la descripción de Linneo (1753)
se agrupan todos los tipos de cacao actualmente cultivados.
El árbol de cacao (Theobroma cacao L.) (2n=20), pertenece a la familia Malvaceae, incluida en
el Orden Malvales, Género Theobroma (Whitlock at al., 2001) y entre todas las especies
silvestre del género (22 especies), Theobroma cacao es la única cultivada para la producción de
granos destinados a la preparación de chocolate y a la extracción de manteca de cacao (Nosti,
1961).
El cacaotero es un árbol, perennifolio, de 4 a 7 m de altura cuando es cultivado, mientras que
en estado silvestre puede alcanzar los 20 m de altura o más. El crecimiento apical particular del
tronco puede estar limitado por la formación de un verticilo terminal de 3 a 5 ramas llamado
“molinete o abanico”. El tronco tiene un hábito de crecimiento dimórfico, con brotes verticales
ortotrópicos o chupones que se forman a partir de la base del tallo (Linneo, 1753).
El sistema radical de las plantas provenientes de semilla presenta una raíz principal pivotante
que, en condiciones favorables, puede penetrar hasta más de 2 m de profundidad, de la cual se
derivan numerosas raíces secundarias especialmente en los primeros 30 cm de profundidad
(Linneo, 1753; Ramos et al., 2000).
La copa del árbol es baja, densa y extendida. Tiene hojas persistentes, simples, enteras y de
filotaxia variable en los tallos pero dística en las ramas, y con forma elíptica u oblonga. Miden
de 15 a 50 cm de largo por 4 a 15 cm de ancho, de punta larga, ligeramente gruesas, margen
liso, verde oscuro en el haz y más pálidas en el envés (Linneo, 1753).
Las flores del cacao son hermafroditas, actinomorfas y pentámeras. Es una especie cauliflora,
es decir, las flores aparecen agrupadas en “cojines florales” directamente sobre el tallo
principal y ramas, sostenidas por un pedicelo de 1 a 3 cm. Las flores miden de 0,5 a 1 cm de
diámetro y de 2 a 2,5 cm de largo y sus distintos verticilos de diferentes colores, están
dispuestos en forma de estrella (Linneo, 1753).
La forma acopada de sus pétalos tiende a encerrar las anteras, haciendo complicada su
polinización. La polinización generalmente llega a ser efectiva solo en el 1% de las flores
presentes en el árbol. Además de esto, existen problemas de autoincompatibilidad, es decir, la
incapacidad del polen de germinar en gineceos con el mismo genotipo, lo que ocurre
generalmente en cacaos originarios de la cuenca alta del amazonas con lo cual se incrementa la
polinización cruzada, mientras que los árboles de cacao de tipo criollo y forastero de otro
origen pueden autopolinizarse aceptando también la polinización cruzada (Linneo, 1753;
Ramos et al., 2000).
El fruto es una baya grande comúnmente denominada "mazorca"; carnosa, de forma oblonga a
ovada y variable en su coloración, desde amarilla hasta purpúrea. Mide de 15 a 30 cm de largo
por 7 a 10 cm de grueso, puede ser puntiaguda y generalmente presenta camellones
longitudinales (Linneo, 1753).
Cada mazorca contiene en general entre 30 y 40 semillas dispuestas en placentación axial e
incrustadas en una masa de pulpa desarrollada de las capas externas de la testa. Las semillas,
miden de 2 a 3 cm de largo y pueden tener sabor amargo o no dependiendo del tipo de cacao.
Están recubiertas por una pulpa mucilaginosa de color blanco y sabor dulce y acidulado. Todo
el volumen de la semilla en el interior está prácticamente ocupado por los 2 cotiledones de
color blanco hasta púrpura del embrión. Se les llama vulgarmente "habas" o "granos" de cacao;
son ricas en almidón, en proteínas y en materia grasa, los cuales les confieren un valor nutritivo
real (Linneo, 1753; Ramos et al., 2000).
Figura 1. Árbol de cacao.
Condiciones ecológicas del cacaotero
El árbol de cacao es originario de los bosques húmedos neotropicales de América, desde
bosque seco tropical hasta bosque premontano bajo (Ramos et al., 2000). Generalmente crece
en topografía plana u ondulada, llegando a crecer en terrenos que sobrepasan pendientes de
50%. Exige temperaturas medias diarias entre 20 y 30°C, altas condiciones de humedad y una
cubierta que le proteja de la insolación directa y de la evaporación. Las precipitaciones deben
oscilar entre 1300 a 2800 mm anuales con una estación seca corta (generalmente de 2 meses y
medio). Los suelos deben ser profundos (1 m como mínimo), fértiles y bien drenados. La altitud
donde se encuentra cultivado va desde el nivel del mar hasta los 1.250 msnm (Braudeau,
1970).
Diversidad del cacao Venezolano
Los cacaos cultivados se pueden clasificar en tres grandes grupos morfogeográficos: Forasteros,
Criollos y Trinitarios ó Deltanos.
Los cacaos Forasteros comprenden varias poblaciones encontradas en la Orinoquía, las
Guayanas y la cuenca del Amazonas. Los cacaos Forasteros del bajo Amazonas constituyen casi
la totalidad de los cacaos corrientes plantados en Brasil y en África Occidental, Malasia e
Indonesia y su producción cubre casi el 80% de la producción mundial de cacao (Reyes y Reyes,
2000).
Los cacaos de tipo Criollo, comprenden una serie cultivares, algunos de los cuales tienen alta
pureza genética como los Porcelana, cultivados mas extensamente en la cuenca sur del lago de
Maracaibo y como los Andinos y Pentágona, encontrados en zonas aisladas en la región
occidental. La denominación de cacao “Criollo” se extiende no solo a los tipos de almendras
blancas o de colores claros y grandes y redondeadas, sino a los cultivados en regiones
cacaoteras de nuestro país, que alcanzaron renombre debido a la calidad aromática de su
cacao “Criollo” (Marcano, 2007), como el famoso cacao “Criollo de Chuao”.
Existe un gran polimorfismo en la morfología de los Criollos, de modo que no sería posible
agruparlos por sus características externas. Recientemente se han denominado a los cacaos
Criollos homocigotos, Criollos “Antiguos”, como indicativo de que fueron éstos los cacaos
cultivados por los antiguos pobladores de América, y a los cacaos Criollos híbridos, como
Criollos “Modernos” (Motamayor, et al., 2002).
Los cacaos Criollos Modernos son cacaos Trinitarios o Deltanos (Reyes y Reyes, 2000), los
cuales son cultivados en la mayoría de las plantaciones de los estados Aragua, Miranda y Sucre,
constituyendo casi el 90% de los tipos cultivados del país. Son plantas híbridas originalmente
formadas a partir del cruce de Criollos y un tipo de Forastero de la cuenca Baja del Amazonas
(Motamayor et al., 2003) que, en el occidente del país, presentan mas frecuentemente
introgresiones de genotipos Criollos, y en los cultivares de oriente, introgresiones de genotipos
forasteros (Marcano, 2007).
En general, de estos grupos descritos, el cacao Criollo es el que posee mejores cualidades
aromáticas y de sabores reconocidos a nivel mundial, sin embargo, ha sido considerado
sensible a un gran número de plagas y enfermedades, en comparación con otros grupos de
cacao (Reyes y Reyes, 2000).
Importancia económica del cacao en Venezuela
Gran parte del cacao cultivado en nuestro país es exportado y continúa siendo considerado
entre los más finos de aroma del mundo, sin embargo, su participación en el mercado
internacional es prácticamente imperceptible en las estadísticas. Actualmente Venezuela
aporta solo el 0,64% de la producción mundial de cacao y el 1,21% de la superficie cultivada
mundial. La producción nacional de cacao actual es de 15.000 toneladas al año con un
rendimiento promedio de 240 kg/ha, lo que representa la mitad del rendimiento promedio
mundial. De esta producción, el 69,4% es comercializado en el mercado internacional, el 30%
se destina a la industria nacional, mientras que una cantidad insignificante es procesada por la
industria artesanal. En general todo el cacao que exporta Venezuela es considerado como
cacao aromático de alta calidad (CORPOANDES, 2009).
Las plantaciones de cacao en el país se localizan en tres regiones. La nororiental, conformada
por los estados Sucre, Monagas y Delta Amacuro que aporta cerca del 49% a la producción de
cacao seco nacional; la zona central conformada por los estados Miranda, Aragua, Carabobo y
Yaracuy que produce un 27% mientras que, la zona suroccidental compuesta por los estados
Mérida, Zulia, Táchira, Apure, Barinas y Portuguesa, produce el 24% del cacao (APROCAO,
2006).
Principales enfermedades del cacao en Venezuela
Las plantaciones de cacao, tanto en Venezuela como en el resto del mundo, se ven seriamente
afectadas por una gran diversidad de plagas y enfermedades que merman su producción y
disminuyen la calidad de su producto. Entre estas enfermedades se destacan la “Escoba de
Bruja” causada por Moniliophthora perniciosa, que afecta la producción de cacao en regiones
productoras de América del Sur, Central y de las islas del Caribe (Cunha et al., 2006),
Moniliophthora roreri, causante de “Moniliasis”, enfermedad limitante de la producción de
cacao en las zonas del centro y sur de América, incluyendo Venezuela (Opoku, et al 2002);
”Ceratocystis”, causada por Ceratocystis fimbriata, con una amplia distribución mundial (Dalva
et al., 2006), siendo en Venezuela, causante de la muerte de más de un millón de árboles de los
valiosos Criollos en los valles centrales de Aragua para la década de 1950 y, en los años 60 en
las áreas cacaoteras del estado Sucre, ocasionó la muerte de cerca de un millón de plantas
(Reyes y Reyes, 2000).
En Venezuela, desde hace mas de tres siglos, la incidencia de plagas y enfermedades ha sido un
factor determinante en la desaparición casi total de extensas áreas del cultivo, especialmente
del cacao tipo Criollo, los cuales se consideran más vulnerables a estos agentes bióticos
(Clément et al., 2003). En el año 1727, un huracán arrasó las zonas cacaoteras de las islas y
costas caribeñas, ocasionando la muerte de millones de árboles de cacao de tipo Criollo en
Jamaica, Martinica, Venezuela y Trinidad. Posteriormente en 1806, De Pons, atribuye tal
desastre a la colonización de Phytophthora palmivora agente causal de cáncer en tronco, ramas
y raíces, favorecida por las heridas ocasionadas a los árboles por el huracán.
A partir de 1940, las florecientes áreas cacaoteras de los estados Delta Amacuro y Sucre fueron
afectadas por la “enfermedad escoba de bruja”.
En las plantaciones ubicadas al Sur de Lago de Maracaibo, cuna del cacao Porcelana, el hongo
Moniliophthora roreri ha ocasionado una merma de importancia en la producción cacaotera
causando la pudrición de los frutos. Este hongo, sumado a las especies de Phytophthora que
también inciden en la zona, ha ocasionado el abandono de muchas plantaciones de cacao para
ser reemplazadas en su mayoría por el cultivo del plátano (Reyes y Reyes, 2000).
Venezuela aún se mantiene libre de plagas y enfermedades de gran impacto en otras zonas
productoras del mundo. Tal es el caso de los virus del retoño hinchado (CSSV), del moteado de
las hojas (CMLV), de la necrosis foliar (CNV) y de sus miridos transmisores Sahlbergella
singularis, Distantiella theobromae, Kryocoropsis laticollis y Helopeltis bergrothi, presentes en
África. Del hongo basidiomiceto Oncobasidium theobromae (VSD) presente en Asia y de las
plagas Conopomorpha cramerella, Critoflevia sp., Strptophlevis sp. Y Pantorhytes batessi que
azotan las zonas de Malasia e Indonesia entre otros (Reyes y Reyes, 2000).
Figura 2. Localización de las principales enfermedades de cacao en las zonas productoras de Venezuela
(Reyes y Reyes (2000) y Rumbos et al (2007))
2. Descripción del patógeno causante de la enfermedad “Mancha de Agua” en cacao
La enfermedad “Mancha de Agua” en cacao
Por muchos años, en Venezuela, se había considerado que la única especie de Phytohthora que
afectaba al cacao era P. palmivora, sin embargo la variabilidad de los caracteres morfológicos y
bioquímicos de los aislamientos condujeron a estudios etiológicos que evidenciaron que más
de una especie estaba implicada en la infección (Capriles de Reyes, 1978; Luz y Mitchell, 1989).
La enfermedad conocida como “Mancha de Agua” en frutos de cacao, es causada por el
oomycete Phytophthora megasperma Dreschler, descrita por primera vez en el Sur del Lago de
Maracaibo por Lilian de Reyes en los años 70 (Rumbos et al., 2007).
Desde hace unos años, la enfermedad “Mancha de Agua” ha ocasionado considerables
pérdidas al cultivo del cacao en algunas parcelas de la región Sur del Lago de Maracaibo
(Delgado, 1985). La enfermedad puede representar una mayor importancia económica una vez
que la parcela llega a infectarse, tomando en cuenta que el cacao es un cultivo perenne y que
las condiciones ambientales de la zona son favorables para el patógeno. Debido a esta
situación, el patógeno se encuentra ampliamente distribuido en esta zona (Delgado, 1985).
Hasta hace poco la enfermedad se encontraba localizada afectando solo la zona productora de
Sur del Lago en el estado Zulia y en menor grado al estado Mérida, sin embargo en el 2007 se
presentó el primer reporte de la Mancha de Agua en frutos de cacao, causada por
(Phytophthora megasperma Dreschler) en el sector Bohordal, Río Caribe Edo. Sucre (Rumbos,
et al., 2007)
El síntoma típico de “Mancha de agua” es una mancha de color marrón claro, que se cubre de
estructuras algodonosas en condiciones de alta humedad. La mancha progresa internamente y
las almendras, aunque estén afectadas, son fáciles de extraer (Rumbos. et al., 2007). Moreno
(2004), señala que la sintomatología del morfotipo de Phytophthora causante de “Mancha de
Agua” se presenta en los frutos, inicialmente, como una mancha pálida que rápidamente se
torna de color chocolate rojizo, que va avanzando en todos los sentidos de la mazorca y, en un
período de 12 días, llega a cubrir toda su superficie (Fig. 3). Hasta ahora no se ha reportado
daño en hojas ó tallos causado por P. megasperma (Rumbos, et al., 2007).
Figura 3. Mazorca de cacao con síntoma típico de la enfermedad Mancha de Agua.
Enfermedades causadas por Phytophthora spp. en cacao
El nombre Phytophthora significa destructor de plantas. Las especies de Phytophthora causan
una gran variedad de enfermedades devastadoras en muchos tipos diferentes de plantas que
van desde plantas ornamentales, especies vegetales anuales hasta árboles perennes (Agrios,
2005). En general todas las especies del género Phytophthora afectan a plantas dicotiledóneas
(Kamoun. 2003).
Las especies de este género incluyen biotrofos, necrotrofos, especies parasíticas de un amplio
rango de hospedadores, así como parasíticas específicas de solo un huésped (Erwin, et al.,
1998). Virtualmente cada planta dicotiledónea es afectada por una ó más especies de
Phytophthora. (Kamoun. 2003).
Los agentes patógenos pertenecientes a este género, al igual que las especies pertenecientes al
género Pythium, son capaces de afectar diversos órganos y estructuras de la planta. En general,
las enfermedades causadas por oomycetos son de dos tipos, 1) aquellas que afectan a los
órganos de la planta localizados en el suelo o que se encuentran en contacto con él, como es el
caso de raíces, tallos cortos, tubérculos, semillas y frutos carnosos depositados en el suelo, y 2)
aquellas que afectan sólo o principalmente a los órganos aéreos de la planta, particularmente
hojas, frutos y tallos jóvenes (Agrios, 2005).
Entre las especies de Phytophthora que causan enfermedades en plantas de cacao se
encuentran P. palmivora, P. megakarya, P. capsisi, P. citrophthora, P. megasperma, P.
nicotianae y P. arecae. Casi todas causantes de “pudrición parda”, enfermedad más antigua
conocida sobre el cultivo señalada por primera vez sobre cacao en 1727, en Trinidad (Tollenar,
1958). Esta enfermedad es la más importante del cultivo alrededor del mundo, causante de
pérdidas anuales que superan el 20-30% de la producción mundial de cacao, cuando las
condiciones climáticas son favorables para el patógeno (Iwaro et al., 1997; Flament et al., 2001
y Lopes et al., 2006), así mismo se estima que el 90% de los cultivares son variedades
susceptibles a estas enfermedades (Iwaro et al., 1997).
De estas especies, P. palmivora, es el patógeno más frecuente en todas las zonas cacaoteras del
mundo, causando la enfermedad de podredumbre negra, cáncer de ramas y de tronco (Iwaro
et al., 1997). La incidencia de la enfermedad cáncer del tronco en las zonas productoras de
África tuvo un dramático aumento debido al reemplazo de cultivares amelonados por
materiales híbridos más susceptibles a la enfermedad (Evans y Priori, 1987).
P. megakarya se ha descrito confinada al continente africano, afectando plantaciones de
Camerún, Ghana y Nigeria principalmente, en parte debido a las altas precipitaciones de las
zonas y a la ausencia de una estación seca, todas estas condiciones favorables para la
enfermedad. P. megakarya es considerada mucho más agresivo que P. palmivora (Evans y
Priori, 1987); otros autores aseguran que P. megakarya es la especie más destructiva y es
responsable de pérdidas que pueden exceder hasta un 50% en las zonas donde afecta (Lanaud
et al., 2003).
P. capsici es la especie de Phytophthora mas importante que afecta a las zonas productoras de
Brasil, aunque también hay incidencia de P. palmivora y P. citrophthora, siendo esta última,
considerada la especie de Phytophthora más virulenta causando podredumbre negra en cacao
(Lawrence, 1998).
Taxonomía de Phytophthora spp.
Los organismos pertenecientes al género Phytophthora, que incluye más de 60 especies (West,
et al., 2003), y al género Pythium, se incluyen en la familia Pythiaceae del Orden
Peronosporales. Este Orden se caracteriza por desarrollar un micelio con hifas no septadas, con
ramificaciones inter o intracelulares, frecuentemente con formación de haustorio. El
zoosporangio con forma ovalada se forma en el micelio, en una ramificación llamada
esporangioforo. En muchas especies, al germinar el esporangio da lugar a la formación de
zoosporas, pero en otras germina directamente formando un tubo germinativo.
La reproducción sexual se caracteriza por la fusión del oogonio y del anteridio para producir
una oospora, la cual puede germinar formando un esporangio que contiene las zoosporas o
formar el tubo germinativo directamente, esto varía dependiendo de la especie (Agrios, 2005).
Los organismos del Orden Peronosporales están incluidos en una clase única Oomycete éste
último en un único Phylum Oomycota. Por las características tan peculiares que portan los
integrantes del Phylum Oomycete, en el transcurso del tiempo han sufrido repetidas
reclasificaciones.
Actualmente las características, tanto morfológicas como fisiológicas, complementadas con la
biología molecular, permiten clasificar a estos individuos en un único reino denominado
Chromista, cuyas características principales son, organismos tanto unicelulares como
multicelulares, filamentosos o coloniales, autotrofos primariamente, algunos con filamentos
tubular o apéndices con cloroplastos en retículo endoplasmático, o ambos (Agrios, 2005).
Existen más de 500 especies diferentes de Oomycetos conocidos, la mayoría de ellos especies
patógenas de plantas, y otros de animales, hongos y protistas (Walter y West, 2007) entre
éstas, más de 60 especies de Phytophthora son terrestres y causan enfermedades en plantas y
cultivos a nivel mundial (West, et al., 2003).
Ciclo de vida típico de Phytophthora spp.
Las especies de Phytophthora poseen un ciclo de vida que usualmente es estimulado por las
condiciones ambientales. El ciclo asexual es caracterizado por la producción de un esporangio,
el cual puede germinar directamente en líquido o en superficies húmedas con el desarrollo de
un tubo germinativo (germinación directa) o por un proceso de ruptura citoplasmática en
donde ocurre la liberación de zoosporas uninucleadas y biflageladas (germinación indirecta).
Durante el ciclo asexual, el zoosporangio formado, en presencia de agua y condiciones
ambientales favorables se rompe liberando las zoosporas las cuales al entrar en contacto con
alguna superficie de la planta se enquistan, proceso que puede ocurrir en solo minutos. Una
vez que ocurre la germinación de la zoospora enquistada, esta desarrolla el tubo germinativo
con el que puede penetrar de forma directa a la planta hospedante, o bien, puede formar un
apresorio, estructura que ayuda a la unión y absorción de nutrientes del patógeno, y
posteriormente ocurre una ramificación intracelular de las hifas del patógeno en el huésped
desarrollando así el micelio (West, et al., 2003).
Ante condiciones ambientales desfavorables, ocurre la fase sexual, mediante la cual se generan
estructuras de resistencia, llamada oosporas. La oosporogenesis ocurre cuando el oogonio
(femenino) es fertilizado por la estructura masculina (anteridio) (West, et al., 2003).
Figura 4. Ciclo de vida típico de especies de Phytophthora. (Agrios, 2005).
3. Genética de la resistencia de plantas a enfermedades
Concepto de enfermedad
Las plantas se mantienen sanas o normales cuando llevan a cabo sus funciones fisiológicas
hasta donde les permite su potencial genético; estas funciones comprenden su división celular
normal, su diferenciación y desarrollo, la absorción del agua y los minerales del suelo y su
translocación por toda la planta, la fotosíntesis y la translocación de los productos
fotosintetizados hasta los órganos de utilización o almacenamiento; el metabolismo de los
compuestos sintetizados, la reproducción y el almacenamiento de las reservas alimenticias
necesarias para la reproducción o la invernación (Agrios, 2005). Las plantas presentarán
enfermedad cuando una o varias de sus funciones sean alteradas por los organismos patógenos
o por determinadas condiciones del medio.
Los procesos específicos que caracterizan las enfermedades, varían considerablemente según
el agente causal y a veces según la planta misma. Comúnmente las células y los tejidos
afectados de las plantas enfermas se debilitan o destruyen a causa de los agentes que
ocasionan la enfermedad (Agrios, 2005)
Los patógenos difieren entre sí según el tipo de planta que atacan, a los órganos y tejidos que
infectan y a la edad del mismo órgano o tejidos de una misma planta sobre la que puedan
desarrollarse. Algunos patógenos son específicos de una especie particular o de cierto género
de plantas, mientras que otros tienen un rango más amplio que incluye a muchos grupos
taxonómicos de plantas superiores. Algunos patógenos sólo se desarrollan en las raíces, otros
sobre los tallos y algunos de ellos crecen principalmente sobre las hojas, o los frutos carnosos
(Nicholas, 2004).
Las interacciones planta-patógeno
Especificidad de las interacciones planta-patógeno
Bajo condiciones naturales, las plantas interactúan con un gran número de organismos, entre
ellos, microorganismos potencialmente patogénicos, sin embargo, las plantas normalmente
permanecen sanas debido, en parte, a la manifestación de mecanismos de defensa.
La especificidad en las interacciones planta-patógeno depende tanto del genotipo de la planta
como del patógeno (Kenneth, 2002). Una interacción biotrófica se caracteriza por tener un alto
grado de especificidad y por lo general la planta aunque es afectada, mantiene sus funciones
metabólicas reguladas (Agrios, 2005), mientras que los denominados necrotróficos, producen
la muerte de las células del hospedantes obteniendo de esta forma los nutrimentos a partir del
tejido muerto. Estos organismos muchas veces utilizan diferentes toxinas capaces de degradar
el tejido de la planta y facilitar la invasión (Collinge et al., 2001).
Un patógeno puede ser menos o más patogénico para un hospedante dado. El grado de
patogenicidad se define frecuentemente como virulencia (Collinge et al., 2001). Vand der Plank
(1968) propuso que el nivel de virulencia se determina con respecto a la resistencia del
hospedante. En otras palabras, la virulencia es un concepto estrechamente ligado a la habilidad
del patógeno de superar la resistencia de la planta. Por otro lado, la resistencia vertical
(monogénica) y la resistencia horizontal (poligénica) son los extremos de todo un espectro de
niveles de resistencia (Vand der Plank, 1968). Sin embargo, en términos genéticos, virulencia se
utiliza para definir si una variante o raza de un patógeno puede o no causar enfermedad en una
variedad o cultivar determinado (Nicholas, 2004). Por lo tanto, para estudiar y comprender
cualquier interacción planta-patógeno es necesario tomar en cuenta la virulencia o avirulencia
de un patógeno siempre en relación con la resistencia o susceptibilidad del hospedante.
Se pueden reconocer dos tipos de interacciones entre las plantas y los patógenos en función de
las respuestas de la planta al ataque del agente extraño: las interacciones compatibles son
aquellas en las cuales un patógeno logra infectar y enfermar a una planta, pueden ocurrir si las
condiciones ambientales son favorables, si las defensas preformadas de la planta son
inadecuadas, si la planta falla en detectar al patógeno, e incluso si las respuestas de defensa
activadas son inefectivas. Las Interacciones incompatibles son aquellas en las cuales no hay
enfermedad porque se da un fenómeno de resistencia de la planta (Nicholas, 2004. Estos
mecanismos de resistencia pueden ocurrir por:
1. Resistencia de tipo “no hospedante”: la especie vegetal atacada no le brinda al
patógeno las condiciones necesarias para completar su ciclo de vida, o posee barreras
estructurales preformadas, o sintetiza compuestos tóxicos.
2. Mantener la infección confinada tras el reconocimiento del patógeno que está
atacando.
3. Condiciones medioambientales inestables que provocan la muerte del patógeno antes
de poder “acomodarse” al nuevo medio (Nicholas, 2004).
El modelo “gen por gen” propuesto por Flor (1971) trata de explicar estos tipos de
interacciones que se establecen entre la planta y un patógeno determinado. Este modelo
establece que cuando hay complementariedad entre un par de genes dominantes, uno del
hospedante y otro del patógeno, se establece un tipo de interacción incompatible y por lo
tanto prevalece la resistencia. Una alteración o pérdida de los genes de resistencia en la planta
o de los genes de avirulencia del patógeno, ocasionan un tipo de interacción compatible y por
lo tanto se presenta la enfermedad (Buchanan et al., 2000) (fig. 5).
Este modelo de interacción entre genes de resistencia en las plantas “R” y los genes de
avirulencia del patógeno “Avr”, se aplica solo en los casos donde el organismo patógeno sea de
tipo biotrófico y por lo tanto no cause la muerte de la planta.
Figura 5. Modelo “gen por gen” (Buchanan et al., 2000).
Para patógenos que excretan enzimas selectivas de hospedador, en donde la patogénesis es
mucho más exitosa, se ha propuesto un modelo de interacción diferente. En este nuevo
modelo la virulencia del patógeno viene dada por la expresión de una toxina funcional o
enzima que causa la enfermedad, mientras que la resistencia de la planta ocurre
predominantemente cuando esta porta dominancia en genes que expresan enzimas que
detoxifican, o producen pérdida o algún tipo de alteración en la toxina del patógeno (Buchanan
et al., 2000) (fig. 6).
Este tipo de interacción involucra una toxina dependiente de la compatibilidad, en la cual el
patógeno tipo silvestre requiere del gen Tox para la síntesis de la toxina, crucial para la
patogénesis. Cuando el gen tox es recesivo, no se desencadena la patogénesis debido a que el
alelo no es funcional. Así mismo, la dominancia del alelo R de la planta es requerido para la
detoxificación de la toxina y por lo tanto para la resistencia de la planta. La enfermedad se
produce entonces cuando la planta no es capaz de detoxificar la toxina producida por el
patógeno (Buchanan et al., 2000).
Figura 6. Variación del modelo “gen por gen” (Buchanan et al., 2000).
Activación y mecanismos de defensa
Las plantas pueden poseer mecanismos constitutivos de defensa que proveen, de forma pasiva,
resistencia contra patógenos. Los mecanismos de resistencia constitutiva o preformada se
pueden dividir en mecanismos de defensa estructurales constitutivos y mecanismos de
defensa químicos constitutivos.
La resistencia inducida es un mecanismo activo de defensa que involucra cambios en el
metabolismo provocados por la expresión diferencial de genes. Por lo tanto, para que ocurra la
inducción de la defensa, es necesaria la mediación de sistemas de reconocimiento específico,
mediante los cuales la planta reconoce la presencia del patógeno (Hutcheson, 1998).
Ciertas sustancias como carbohidratos, proteínas y pequeñas moléculas son capaces de actuar
como inductores de defensa (Agrios, 2005). Los inductores no-específicos son cualquier
sustancia que induce la activación de defensa de forma no específica. Por ejemplo, los
polisacáridos que conforman la pared celular, tanto de hongos como de las células vegetales,
son reconocidos como agentes capaces de inducir la expresión de genes de defensa en plantas
(Kenneth, 2002).
Los mecanismos de defensa, que son inducidos como consecuencia del reconocimiento
incluyen principalmente, la muerte celular por reacción hipersensible, la acumulación de
metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana, la acumulación de enzimas hidrolíticas y
la deposición de sustancias de refuerzo que evitan el avance del patógeno, entre otros
(Buchanan et al., 2000; Collinge et al., 2001).
En las interacciones raza-cultivar del tipo incompatible, muchas veces ocurre una alteración en
el metabolismo de la planta que se manifiesta con la aparición de lesiones locales necróticas en
el sitio mismo de infección. Estas lesiones son el resultado de una muerte celular programada o
reacción hipersensible (HR) (Agrios, 2005). La reacción hipersensible además está asociada a la
expresión simultánea o paralela de otros mecanismos de defensa, incluyendo la acumulación
de fitoalexinas, deposición de lignina, suberina y proteínas ricas en hidroxiprolina (Ryals et al.,
1996).
Otro mecanismo de defensa existente en plantas son las fitoalexinas, las cuales se definieron
originalmente como metabolitos secundarios con propiedades antimicrobianas y que se
producen y acumulan en plantas expuestas a microorganismos (Kenneth, 2002). Estos
compuestos normalmente se encuentran en niveles basales muy bajos en las plantas sanas,
pero su acumulación se incrementa rápidamente después del ataque de un patógeno.
Uno de los mecanismos de defensa más evidentes es la producción y deposición de sustancias
que actúan como barreras físicas evitando el avance de patógenos. La formación de ceras,
variación en el grosor de la cutícula o epidermis, así como un control sobre la apertura de los
estomas, son respuestas de las plantas que se inducen ante el ataque del patógenos evitando
su penetración. (Kenneth, 2002). La lignificación puede ser una característica constitutiva en
algunas especies pero también puede ocurrir como un proceso de refuerzo de los tejidos
cuando están sujetos a daño físico. La lignificación también se manifiesta durante la defensa
ante patógenos (Kenneth, 2002; Nicholas, 2004; Agrios, 2005).
Pruebas biológicas de resistencia realizadas en plantas de cacao a diversos
patógenos.
Diversos trabajos de investigación se han realizado para la selección y el desarrollo de tipos de
cacao con resistencia a especies de Phytophthora, especialmente a P. palmivora, mediante
métodos que permitan una evaluación temprana de los cultivares, como la inoculación de
hojas o de disco de hojas, con el patógeno (Amponsah y Asare-Nyako, 1973; Lawrence, 1978;
Braga et al.,, 1989; Phillips y Galindo, 1989; Nyassé et al.,, 1995; Iwaro et al.,, 1997; Tahi et al.,,
2000).
Iwaro et al (1997) en sus ensayos concluyen que la resistencia de plantas de cacao a la
infección por P. palmivora opera en dos estados distintos. Un primer estado de penetración, en
el que se restringe la entrada y el establecimiento del patógeno en el tejido de la planta y un
segundo estado de post-penetración en el que se reduce la tasa de diseminación y
multiplicación del patógeno en el tejido.
En sus trabajos, realizados con inoculaciones en discos de hoja y en frutos, Iwaro et al (1997)
evaluaron la resistencia de plantas de cacao a Phytophthora palmivora inoculando seis clones
Forasteros (SCA6, SCA12, CATONGO, IMC67, PA30 PA46) y seis Trinitarios (ICS1, ICS6, ICS8,
ICS40, ICS84, ICS95) del International Cocoa Genebank in Trinidad (ICG,T), concluyendo que el
análisis de correlación entre el número de características evaluadas (frecuencia de estomas,
longitud del poro estomático, contenido de cera en la pared, grosor y dureza del
exocarpo/endocarpo) y la resistencia, indican una fuerte relación entre la resistencia al
establecimiento de la lesión y el efecto de la frecuencia de estomas y longitud del poro
estomático. De este hecho deducen que el modo de penetración de P. palmivora ocurre
principalmente a través de los estomas (Iwaro et al., 1997).
Pinto et al., (2007) evaluaron la resistencia de 14 clones de cacao a aislados de P. palmivora, P.
capsisi y P. citrophthora , obtenidos de la colección del Centro de Investigación de Cacao
(CEPEC-CEPLAC), mediante la técnica propuesta por Lawrence (1978), en la cual se impregnan
trozos de papel de 3 mm con el inoculo de Phytophthora y se adhiere a la corteza del tallo y se
cubre por 18 días, para luego de este tiempo evaluar el área de lesión. De este ensayo, se
concluyó que los clones P7 y MA15 presenta altos niveles de resistencia horizontal y
estabilidad; PA30, UF650 SIAL88 y EET59 mostraron niveles intermedios, tanto de resistencia
como de estabilidad y los cultivares SPA17, OC61, PA150, SIAL505, ICS1 y R41 presentaron una
susceptibilidad alta y estabilidad intermedia o baja (Pinto et al., 2007).
Otuonye et al (2006) evaluaron la resistencia de cultivares de cacao a cuatro aislados de P.
megakarya, utilizando el test de inoculaciones (3x105zoosporas/ml) en disco de hojas,
encontrando que los cultivares T12/5, T17/11 y T86/2 fueron moderadamente resistentes,
mientras que los clones T85/5, T85/45 y T20/11 fueron cultivares moderadamente
susceptibles.
Phillips et al (2005) utilizaron ensayos de inoculaciones artificiales de una suspensión de
esporas (1.2x105 esporas/ml) de siete aislados de Moniliophthora roreri en cultivares de cacao
de la finca Suiza Experimental, Colombia.
Pound (1943) colectó árboles de cacao procedente del alto Amazonas de Perú, en donde
identificó a Scavina 1 y Scavina 12 como plantas resistentes a enfermedades. Así mismo el
cultivar Scavina 6 ha sido considerado como el cultivar más resistente de cacao, incluso más
que las variedades Catongo e ICS1, ésto observado en varios test de inoculaciones a diversas
enfermedades (Iwaro et al., 1997; Tahi et al 2000).
La inoculación de mazorcas desprendidas brinda la oportunidad de evaluar rápidamente la
resistencia a las infecciones de Phytophthora. Esta, proporciona información sobre la
resistencia a la penetración y postpenetración, basada en la frecuencia y el tamaño de las
manchas. El método es particularmente útil para la evaluación de colecciones de germoplasma
en Bancos de genes donde la inoculación de mazorcas adheridas al árbol es restringida (Phillips
y Galindo, 1989., Blaha et al.,, 2000, Iwaro et al., 2006), así mismo para evaluar la resistencia de
las plantas de cacao a patógenos cuya única zona de incidencia en la planta sea el fruto, como
P. megasperma (Rumbos et al., 2007). Numerosas investigaciones han validado las bondades
de esta prueba (Iwaro et al., 2005 y 2006).
Efombang, et al (2006), así como Kébe, et al (2006), en sus investigaciones encuentran
correlación alta en pruebas de inoculaciones en disco de hojas, con inoculaciones en mazorcas
de cacao, tanto colgantes como desprendidas a P. megakarya.
Iwaro et al (2006), evalúan la resistencia de plantas de cacao (816 accesiones) a enfermedades
causadas por especies de Phytophthora, utilizando inoculaciones en mazorcas de cacao
desprendidas en condiciones de cámara húmeda, encontrando que, de los cultivares
evaluados, el 68,9% es susceptible a la enfermedad. Una baja proporción (17,7%) es altamente
resistente, mientras que un 22,6% de los cultivares evaluados es moderadamente resistente.
4. Uso de marcadores moleculares en el estudio de la resistencia a enfermedades en
cacao
Un marcador molecular puede definirse como un punto de referencia para un cromosoma,
circunscrito a la zona más próxima al marcador y cuya herencia puede ser seguida a través de
un cruce genético, permitiendo mapear la posición de un gen (Reece, 2004)
Tipos de marcadores moleculares
Existen una gran diversidad de marcadores moleculares, en su mayoría basados en la
amplificación de fragmentos de ADN por PCR, los cuales pueden utilizar como molde a ADN
citoplasmático (cloroplasto, ADNc, mitocondrial) ó ADN nuclear. Estos marcadores son
detectados directamente en el ADN del individuo, por lo que son consistentes en los distintos
tejidos y en cualquier etapa de su ciclo de vida.
Entre los marcadores más utilizados se encuentran: Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs);
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs); Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPDs); Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs); Expressed Sequence Tags (ESTs);
Single Sequence Repeats (Microsatélites ó SSRs); Amplified Sequence Length Polymorphism
(ASLP); Sequence Characterized Amplified Region (SCAR); Cleaved Amplified Polymorphic
Sequence (CAPS); Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP); Single Primer
Amplification Reaction (SPAR), entre otros (Spooner et al., 2005).
Los marcadores de ADN poseen muchas ventajas las cuales los hacen atractivos en el estudio
de la identidad, diversidad y relaciones filiales. Entre estas ventajas, no se ven afectados por el
ambiente o por efectos pleiotrópicos, se pueden analizar a nivel de plántulas y tejidos, los
marcadores moleculares no exhiben plasticidad fenotípica, a diferencia de marcadores
morfológicos y bioquímicos los cuales pueden variar en diferentes ambientes. Existe un
número ilimitado de marcadores independientes disponibles, a diferencia de los datos
morfológicos o bioquímicos. La caracterización del ADN puede ser fácilmente definida en
estados discretos de alelos o en pares de bases de ADN. La evaluación de las características
morfológicas ó bioquímicas proporciona datos continuamente variables que se pueden ver
afectados por el método de análisis. Muchos marcadores moleculares poseen selección
neutral, esta ventaja no implica que los otros datos tradicionales usados en la caracterización
de la biodiversidad sean desfavorables; por el contrario, las características morfológicas,
ecológicas y cualquier otra “tradicional” proveen información vital acerca de la interacción del
organismo con el ambiente (Spooner et al., 2005).
Microsatélites ó SSRs
Los microsatélites son secuencias cortas repetidas generalmente de 2-6 pb que se encuentran
distribuidas al azar a lo largo del genoma en todos los organismos superiores y están
flanqueados por regiones conocidas altamente conservadas a partir de las cuales se pueden
diseñar cebadores específicos de 20-25pb para amplificarlos por PCR. Los microsatélites y sus
secuencias flanqueantes pueden ser identificados a partir de la construcción de genotecas
enriquecidas en secuencias repetidas. Se encuentran localizados en cualquier región del
genoma y su función (si la hay) es desconocida (Reece. 2004)
Figura 7. Esquema de un microsatélite con repeticiones (CAC)n.
Los tipos de repeticiones que ocurren en los microsatélites varían entre las especies. En
mamíferos las repeticiones (GT)n son las más comunes, mientras que un examen de la base de
datos de las secuencias de ADN de las plantas, revela que las repeticiones más comunes son
(AA)n y (AT)n (Phillips et al., 1995).
Entre las ventajas de los marcadores microsátelites destacan la codominancia de alelos
pudiendo distinguir individuos heterocigotos de aquellos homocigotos para un locus en
particular, su gran abundancia en el genoma de eucariotas y su distribución aleatoria en todo el
genoma. Como es una técnica basada en PCR, solo son necesarias pequeñas cantidades de ADN
(10-100 ng por reacción) así como, no se requiere ADN de alta calidad, y su reproducibilidad es
alta. Como la especificidad es en un solo locus, varios microsatélites pueden ser usados en una
reacción multiplex de PCR, así como su revelado en geles, con lo cual se disminuyen
considerablemente los costos de implementación, además de que hay posibilidad de
automatizar el sistema (Spooner et al., 2005).
Entre las desventajas de los microsatélites se encuentra los altos costos de desarrollo, si se
tratan de adecuar para especies en los cuales no existen cebadores disponibles, razón por la
cual se hace difícil implementar en grupos de plantas sin los correspondientes estudios. Las
mutaciones en los cebadores pueden resultar en la aparición de alelos nulos (No ocurre
amplificación por PCR); la posible presencia de alelos nulos aumenta con el uso de cebadores
de microsatélites generados a partir de germoplasma que no estén relacionados con las
especies utilizadas para amplificar los cebadores de microsatélites. Alelos Nulos pueden dar
lugar a una estimación sesgada de la frecuencia alélica, genotípica y una subestimación de la
heterozigosis (Spooner et al., 2005).
Marcaje de caracteres importantes en el mejoramiento de cultivos
Los mapas con alta densidad de marcadores moleculares constituyen recursos muy valiosos
para la búsqueda de regiones del genoma relacionadas con caracteres agronómicos
importantes, sean cualitativos, determinados por un solo gen, o cuantitativos, determinados
por varios genes, pudiendo en este último caso, ser localizado cada uno de los genes
implicados, como si fueran entidades independientes (Tanksley et al., 1989).
Los caracteres cuya variación fenotípica es continua y determinada por la segregación de más
de uno y a menudo por muchos loci o genes, se denominan caracteres cuantitativos y su
herencia se conoce como poligénica, así mismo a los loci individuales que controlan este tipo
de características se les denomina QTLs (“Quantitative Trait Loci”) y el procedimiento para su
localización se denomina “Análisis de QTLs” (Liu, 1998).
Muchas de las características que definen una planta, están determinadas por poligenes o
QTLs, dentro de los cuales se pueden mencionar: rendimiento, vigor, tamaño de las semillas y
resistencia a algunas enfermedades. Estos QTLs son heredados exactamente igual que los
genes mayores; ellos segregan, recombinan y exhiben ligamiento, mostrando el mismo rango
de propiedades en transmisión y acción que los genes mayores (Phillips et al., 1995). Algunos
QTLs exhiben con cierta frecuencia dominancia pura, mientras que otros, son completamente
aditivos para la misma característica y población (Phillips et al., 1995).
La identificación de marcadores moleculares relacionados con caracteres de interés exige la
disponibilidad de una población segregante, preferiblemente proveniente de padres
genotípicamente definidos, a la cual se analiza para la mayor cantidad de marcadores posibles
y a la vez se evalúa su fenotipo, parámetros de interés, para los que debe también ser
polimórfica (Liu, 1998).
El “mapeo” de QTLs busca detectar relaciones estadísticamente significativas entre un
marcador y un carácter, en una población genéticamente definida, analizándose por lo tanto,
las relaciones de ligamiento entre marcadores y caracteres. Sin embargo, en casos, en los que
no existen poblaciones experimentales, o éstas son difíciles de desarrollar, también es posible
llevar a cabo el mapeo de QTLs, como en las poblaciones naturales, en las especies arbóreas
perennes, o en poblaciones humanas, mediante los análisis de Asociación (Liu, 1998).
Los estudios de asociación entre marcadores moleculares y caracteres de importancia para la
selección de cacao ya han probado ser estrategias eficientes, en comparación con los métodos
tradicionales de análisis de Loci determinantes de caracteres Cuantitativos (QTLs), que implican
la obtención de poblaciones segregantes provenientes de cruces dirigidos entre padres con
determinada constitución genotípica, lo que puede tardar unos diez años en el caso del cacao
(Schnell, et al., 2005, Marcano, et al., 2007).
Los estudios de asociación se basan en la relación no aleatoria de alelos en una población, lo
que es conocido como Desequilibrio del Ligamiento (DDL) (Weir, 1996). Los análisis del DDL en
el genoma del cacao han revelado largos fragmentos de cromosomas (hasta 30 cM) que se
encuentran en DDL, en los cuales pueden definirse asociaciones estables entre marcadores
moleculares y caracteres de interés, siempre que la población no presente estructura
(Marcano, et al., 2007).
En el caso del cacao, una colección de pares de cebadores para más de 400 microsatélites, ha
sido desarrollada por el CIRAD, y sus secuencias y especificaciones están disponibles en la base
de datos europea de Biología Molecular EMBL. De estos microsatélites, 268 han sido
localizados en el mapa genético de referencia del cacao, por lo que constituyen excelentes
herramientas para diversos tipos de investigaciones, entre las cuales destaca la utilización de
éstos para el estudio de determinismo genético de caracteres de importancia (Pugh, et al.,
2004).
Estudios de ligamiento entre marcadores y resistencia a enfermedades en cacao
causadas por especies de Phytophthora
La resistencia a Phytophthora ha sido relacionada con varios genes, este es el caso de P.
megasperma f.sp. glycinea en soya (Diers et al., 1992) y de P. infestans en papa, aunque en este
cultivo también se ha informado de una resistencia vertical (Corné et al., 1991). En el caso del
cacao, varios autores han relacionado la resistencia a Phytophthora con la acción de varios
genes. Warren (1994) señaló la existencia de un mínimo de cinco loci heterogéneos no ligados.
Soria citado por Rocha (1974) consideró también que la resistencia estaba controlada por
varios genes, con una posible acción dominante de algunos de ellos. Spence y Bartley (1966)
igualmente señalan que algunas progenies F1 del clon SCA 6 que muestran resistencia en
Trinidad, son el producto de genes dominantes que controlan esa característica. Enríquez y
Salazar (1987) por el contrario, consideran que en la resistencia a Phytohthora están en juego
varios genes con una acción más aditiva que dominante. En forma similar, Tan y Tan (1990)
señalan que la resistencia se hereda en forma aditiva.
En general en los estudios de la resistencia genética del cacao a las enfermedades producidas
por especies del género Phytophthora, no se ha encontrado una resistencia total a la
enfermedad (Risterucci et al., 2003). En el año 2000 se reporta por primera vez, un estudio de
ubicación de genes de resistencia a Phytophthora palmivora en el genoma del cacao, en una
población de cacao Forastero (Crouzillat, et al., 2000); trabajos posteriores se han hecho en
poblaciones de cacao con diversa base genética y varias especies de Phytophthora (Flament, et
al., 2001, Clément, 2003, Risterucci, et al., 2003). Algunas de las regiones del genoma
identificadas como implicadas en la resistencia han sido coincidentes con genes análogos de
resistencia y defensa (RGA y DGA), (Lanaud, et al., 2003).
Justificación
Venezuela ha sido históricamente considerada como un país productor de cacao de alta calidad
clasificado entre los más finos. Sin embargo la producción actual de cacao de este tipo en
nuestro país no supera el 1% del cacao en grano producido en el mundo. En esta baja
productividad inciden varios factores, entre los cuales destaca el uso de variedades de bajo
rendimiento y susceptibles a plagas y enfermedades, como por ejemplo la “Mancha de Agua”,
causada por Phytophthora megasperma, enfermedad poco estudiada en cacao y cuyo único
foco de indicendia en el mundo, son las zonas productoras de Sur del Lago de Maracaibo y
parte del estado Sucre, en Venezuela.
A pesar de su rica historia y su papel significativo en el consumo humano y potencialmente en
la salud, la obtención de variedades mejoradas de cacao ha recibido relativamente poca
atención. En la actualidad se estima que sólo el 30% de las plantas cultivadas de cacao en el
mundo provienen de variedades seleccionadas (Bennett, 2003), lo que hace evidente la
necesidad de identificar plantas que presenten características de interés como altos
rendimientos y resistencia a enfermedades, siendo para Venezuela importante además,
conservar las cualidades aromáticas particulares de nuestros cacaos criollos, con el fin de
incluirlos en programas de mejoramiento genético del cultivo.
La genómica puede aportar información sobre el determinismo genético de parámetros de
interés. Los marcadores moleculares asociados a regiones del genoma implicadas en la
resistencia a enfermedades pudieran ser herramientas a ser consideradas en estrategias de
selección, lo que tiene mayor importancia en plantas perennes como el cacao. es por ello que
se plantea el presente trabajo.
Hipótesis
Si las plantas de cacao muestran algún grado de resistencia a Phytophthora megasperma
causante de la enfermedad “Mancha de Agua” en frutos de cacao, entonces se esperaría
encontrar al menos un microsatélite asociado a algún factor genético determinante de la
resistencia a esta enfermedad
Objetivos
Objetivo general
Identificar microsatélites asociados a la resistencia a Phytophthora megasperma, en plantas
seleccionadas de cacao Criollo/Criollo Moderno.
Objetivos específicos
Aislar y caracterizar Phytophthora megasperma a partir de frutos de cacao infectados,
colectados en la zona Sur de Lago de Maracaibo.
Evaluar la reacción de resistencia/susceptibilidad a P. megasperma, inoculando frutos sanos de
plantas de cacao seleccionadas.
Estudiar la estructura de la población de los individuos evaluados a partir del análisis del
genotipo, utilizando microsatélites independientes.
Hacer un análisis de asociación para buscar marcadores potencialmente incluidos en regiones
del genoma determinantes de la resistencia a la enfermedad “Mancha de Agua”.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inóculo de Phytophthora megasperma.
Ubicación y características del sitio de recolección del patógeno
El patógeno Phytophthora megasperma fue recolectado en el “Jardín Clonal” de la Estación
Local Chama ubicada en el Km. 41 vía El Vigía-Santa Bárbara, en el municipio Colón del estado
Zulia (Figura 8), que se encuentra a 54 msnm y cuyo clima se clasifica como Bosque Húmedo
Tropical, con un rango de precipitación entre 1800 a 2500 mm anuales. Las temperaturas
oscilan entre 27°C y 32°C y la evaporación alcanza 1661 mm por año, manteniéndose una
humedad relativa de 80%.
Figura 8. Región Sur del Lago de Maracaibo. Sitio de recolección del patógeno
Se seleccionaron frutos de cacao que presentaban los síntomas típicos de la enfermedad
“Mancha de Agua”. Ello se realizó durante la época de lluvias, cuando se presentan las
condiciones de alta humedad favorables para el establecimiento y la reproducción del
patógeno. Las mazorcas enfermas se separaron del árbol y se cubrieron con bolsas de papel
para su traslado al laboratorio.
Aislamiento y caracterización de Phytophthora megasperma
Las mazorcas recolectadas fueron lavadas con agua destilada estéril y posteriormente
desinfectadas superficialmente con alcohol isopropílico 90%. Una vez desinfectadas, las
mazorcas fueron llevadas a una campana de flujo laminar, donde se extrajeron trozos de 1 x 2
mm del tejido afectado de la mazorca, ubicado entre la superficie y el mesocarpo. Bajo
condiciones asépticas, se colocaron los trozos de fruto en cápsulas de Petri con medio Agar
Zanahoria (AZ) (ver composición en Anexo Nº 1) y la incubación se llevó a cabo a una
temperatura constante de 25°C y luz fluorescente continua, durante tres días.
Para obtener un aislado puro a partir de estos cultivos en crecimiento, se cortaron secciones
del medio AZ, de aproximadamente 1 a 2 mm que incluían micelio de borde, es decir, la zona
más externa del micelio con respecto a la muestra. Los trozos cortados, fueron colocados en
nuevas cápsulas de Petri con medio AZ y fueron igualmente incubados en luz fluorescente
continua a una temperatura promedio de 25°C, durante otros 5 días.
Para la caracterización del aislado, se efectuaron pruebas de crecimiento en distintos medios
de cultivos específicos para hongos. Para ello se cultivaron secciones 1 a 2 mm del aislado puro
en cápsulas de Petri con medios Agar Zanahoria, Agar Mycophil, Agar Jugo V8 y Agar Papa
Dextrosa (PDA) (ver composición en Anexo Nº 1). De cada uno de estos aislado fueron
incubadas réplicas en condiciones de luz continua y otras réplicas en oscuridad continua, a una
temperatura promedio de 25°C durante 3 días. La caracterización del aislado se realizó
contrastando las características morfológicas tanto del micelio, como de sus estructuras
internas, con un sistema de clave taxonómica de identificación específica para especies de
Phytophthora (Ho, 1981). Las cepas del patógeno aislado en medio de cultivo Agar zanahoria
(AZ), se enviaron al laboratorio de Biotecnología de IDEA, ubicado en Baruta Edo. Miranda, para
realizar el estudio molecular de identificación del patógeno.
2. Selección de las plantas y cosecha de las mazorcas a evaluar
La selección de las plantas a inocular se llevó a cabo considerando solo aquellas plantas que
para la fecha de muestreo poseían mazorcas de 3-4 meses de edad, completamente sanas y sin
ninguna marca o daño aparente. En total fueron seleccionados 68 árboles (Ver cuadro 1) en
dos localidades, 51 de éstos fueron escogidos en el Jardín Clonal de la “Colección 2000”
ubicado en la Estación Local del INIA en San Juan de Lagunillas, Parcelamiento El Estanquillo,
Municipio Sucre, Estado Mérida, ubicada a 1050 msnm y con temperatura media diaria de
23°C, humedad relativa de 74,4% y precipitaciones anuales de 540 mm. Esta colección se
mantiene con riego suplementario. Los otros 17 árboles evaluados procedían del Banco de
Germoplasma a cargo de CORPOZULIA ubicado en el Km. 41, vía El Vígia-Santa Bárbara,
municipio Colón del Estado Zulia, que se encuentra a 40 msnm de altitud y cuyos rangos de
precipitación se encuentran entre los 1800 a 2500 mm anuales, con temperaturas que oscilan
entre 27 a 32°C y humedad relativa de 80%.
Cada mazorca fue desprendida de la planta y envuelta en una lámina delgada de goma
espuma, con el fin de evitar daño mecánico al momento de manipularlas y transportarlas al
laboratorio (Figura 9).
Figura 9.Muestreo de las mazorcas de cacao en campo
3. Evaluación de la resistencia/susceptibilidad de frutos de cacao al hongo P. megasperma.
Cuadro 1. Plantas seleccionadas de cacao con su respectiva procedencia
ID Localidad
ID Localidad
ID Localidad
SJU01 INIA-San Juan
BEN21 INIA-San Juan
04 INIA-San Juan
SJU02 INIA-San Juan
BEN22 INIA-San Juan
HER2 INIA-San Juan
SJU03 INIA-San Juan
BEN23 INIA-San Juan
H3V INIA-San Juan
SJU4R INIA-San Juan
BEN24 INIA-San Juan
H3P INIA-San Juan
SJU05 INIA-San Juan
BEN26 INIA-San Juan
02 INIA-San Juan
SJU06 INIA-San Juan
BEN28 INIA-San Juan
SP10X CORPOZULIA
SJU07 INIA-San Juan
BEN29 INIA-San Juan
P.ROJO CORPOZULIA
SJU09 INIA-San Juan
BOC01 INIA-San Juan
UVI01 CORPOZULIA
SJU11 INIA-San Juan
BOC02 INIA-San Juan
SP08 CORPOZULIA
SJU12 INIA-San Juan
BOC03 INIA-San Juan
UVI13 CORPOZULIA
SJU13 INIA-San Juan
BOC04 INIA-San Juan
ABA01X CORPOZULIA
SJU14 INIA-San Juan BOC05 INIA-San Juan
CAC01 CORPOZULIA
SJU15 INIA-San Juan BOC06 INIA-San Juan
LOB13 CORPOZULIA
SJU16 INIA-San Juan BOC09 INIA-San Juan
ADJ05 CORPOZULIA
BEN01 INIA-San Juan BOC12 INIA-San Juan
UVI03 CORPOZULIA
BEN02 INIA-San Juan BOC14 INIA-San Juan
RA01 CORPOZULIA
BEN04 INIA-San Juan BOC15 INIA-San Juan
RA05 CORPOZULIA
BEN05 INIA-San Juan BOC16 INIA-San Juan
CBL04 CORPOZULIA
BEN11 INIA-San Juan BOC17 INIA-San Juan
CBL05 CORPOZULIA
BEN12 INIA-San Juan
42 INIA-San Juan
CBL06 CORPOZULIA
BEN15 INIA-San Juan
HER1 INIA-San Juan
LOB38 CORPOZULIA
BEN17 INIA-San Juan
H3BP INIA-San Juan
ABA01 CORPOZULIA
BEN19 INIA-San Juan
81 INIA-San Juan
La evaluación de la resistencia/susceptibilidad de plantas seleccionadas de cacao a P.
megasperma se realizó inoculando las mazorcas con una suspensión de zoosporas de P.
megasperma con un título de 1 x 105 zoosporas/ml. Dicha suspensión de zoosporas se obtuvo
induciendo la liberación de las mismas del zoosporangio, a partir de aislados puros de P.
megasperma en cápsulas de Petri con medio AZ de 10 días de edad, mediante un shock
térmico, colocando dichas cápsulas a 4°C por 10 minutos y luego a temperatura ambiente y
oscuridad total por otros 30 minutos (Iwaro et al, 1998). Las zoosporas liberadas fueron
observadas para su caracterización y cuantificación en una cámara de Newbauer en un
microscopio de luz.
Los frutos fueron lavados con abundante agua destilada, a fin de eliminar impurezas y cualquier
agente extraño adherido a la superficie de la mazorca y posteriormente fueron colocados
debidamente rotulados en una cámara húmeda. Las cámaras húmedas se prepararon en cajas
de plástico de 80 x 40 x 20 cm, dentro de las cuales se colocó una lámina de goma espuma de
2-3 cm de espesor y sobre ésta, una capa de papel absorbente. Estas cámaras húmedas fueron
rociadas con abundante agua destilada.
De cada planta fueron inoculadas 3 mazorcas; una mazorca de cada planta sin inocular sirvió
como tratamiento control, siendo ésta rociada sólo con agua destilada estéril. El método de
inoculación utilizado fue el de aspersión de gota fina (Figura 10).
Figura 10. Aspersión en gota fina del inoculo de P. megasperma
Una vez inoculados los frutos, las cámaras húmedas fueron cubiertas completamente con una
lámina plástica delgada (envoplast), a fin de mantener una adecuada humedad y fueron
colocadas en oscuridad durante 5 días a una temperatura constante de 24°C. La alta humedad,
así como la oscuridad son condiciones favorables para el establecimiento y la propagación del
patógeno.
Para determinar el nivel de resistencia/susceptibilidad de cada planta, se evaluó la
sintomatología de la enfermedad en la mazorca (presencia del síntoma, color y tamaño de la
mancha) mediante una escala de un rango del 1 (Altamente resistente a la penetración) al 8
(altamente susceptible) (ver anexo 2), (Iwaro et al, 2006).
4. Evaluación del Genotipo
Selección de marcadores microsatélite
Según el mapa de ligamiento genético de referencia para el cacao, desarrollado en el CIRAD
con la población de mapeo UF676 x UPA402 (Pugh, et al, 2004), se escogieron 23 marcadores
microsatélite (Cuadro 2), 16 de éstos independientes y distribuidos en los 10 grupos de
ligamiento, 7 marcadores reportados en regiones ligadas a la resistencia de cacao a especies de
Phytophthora (Crouzillat et al, 2000., Kuhn et al, 2003., Risterucci et al, 2003, Clément et al,
2003., Lanaud et al, 2003., Flament et al, 2001) y un marcador asociado al color de cotiledones
(Marcano, 2007).
Cuadro 2. Marcadores seleccionados. Microsatélites Independientes, Microsatélites ligados a
la resistencia a Phytophthora spp. y * asociado a color de cotiledones
GL SSR cM pb N° EMBL
GL SSR cM pb N° EMBL
1 mTcCIR121 32,5 138 AJ566462
6 mTcCIR255 39,1 203 AJ566576
1 mTcCIR272 36,9 258 AJ566591
6 mTcCIR291 62,8 218 AJ566609
1 mTcCIR84 54,5 136 AJ566429
7 mTcCIR190 3,8 166 AJ566518
1 mTcCIR286 68,3 119 AJ566604
7 mTcCIR7 25,9 160 AJ566
2 mTcCIR100 14,8 244 AJ566444
7 mTcCIR55 35,5 234 AJ566
2 mTcCIR268 38,8 316 AJ566588
8 mTcCIR189 46,9 150 AJ566517
3 mTcCIR120 6,3 95 AJ566461
9 mTcCIR8 52,5. 301 AJ566
3 mTcCIR82 30,6 174 AJ566428
9 mTcCIR79 94,1 108 AJ566425
3 mTcCIR167 59,2 254 AJ566496
10 mTcCIR229 11,9 307 AJ566550
4 mTcCIR222 6,5 220 AJ566543
10 mTcCIR91 51,4 186 AJ566435
4 mTcCIR17 23,4 271 AJ566
10 mTcCIR223 72,4 202 AJ566544*
5 mTcCIR109 72 162 AJ566452
GL: grupo de ligamiento. SSR: nombre del marcador. cM: ubicación en el mapa de ligamiento genético de referencia para el cacao UF676 x UPA402. Pb: tamaño del marcador. N° EMBL: acceso en la base de datos de biología molecular europea (EMBL)
Optimización de la extracción del ADN, amplificación, electroforesis y visualización de
microsatélites
A partir de hojas de las plantas de cacao seleccionadas se realizó la extracción del ADN total, de
acuerdo al protocolo propuesto por Risterucci et al, (2000). La cuantificación del ADN extraído
se realizó espectrofotométricamente, mientras que la calidad del mismo se evidenció en un gel
de agarosa 0,8% preparado en buffer de electroforesis TBE 0,5X (Anexo N° 3).
Las metodologías utilizadas para la amplificación de fragmentos de ADN, (PCR: reacción en
cadena de polimerasa), electroforesis horizontal en geles de agarosa y electroforesis vertical
en geles de poliacrilamida fueron las reportados por Risterucci et al, (2000). El revelado de los
geles de poliacrilamida se realizó con nitrato de plata (Bassam, et al. 1991). En el Anexo 3, se
presentan con detalle todos los procedimientos de laboratorio empleados.
A fin de determinar la calidad de los cebadores a utilizar, se realizaron amplificaciones de los
mismos por PCR y los productos de amplificación se observaron mediante electroforesis
horizontal en gel de agarosa 1,5%. También se realizó una prueba para determinar el tiempo
adecuado para la electroforesis vertical en geles de poliacrilamida, cargando cada 30 minutos
microsatélites de tamaño conocido amplificados por PCR y verificando su desplazamiento en el
gel vertical.
Lectura e interpretación de geles
La interpretación de resultados se hizo mediante una codificación de alelos para cada
microsatélite, considerando como genotipos de referencia, clones altamente homocigotos
encontrados en estudios previos (Marcano, 2007), BEN02 como genotipo Criollo y C1 como
genotipo Forastero del Bajo Amazonas, codificándose como “a” al alelo presente en BEN02
(Criollo) y “b” al alelo presente en C1 (Forastero), de modo que para el híbrido, la codificación
alélica es “ab” (Anexo 3.7). Con estos datos se elaboró una matriz del genotipo de cada uno de
los individuos evaluados para cada locus (Anexo 5). En algunos casos se evidenció un alelo
distinto que no correspondía a los alelos referenciales, estos fueron designados como “c”.
5. Análisis de datos
Análisis del genotipo
Con el fin de estudiar la estructura genotípica de la población, se determinaron las frecuencias
alélicas, genotípicas y heterocigosis observada para cada locus de microsatélites analizados y el
promedio para la población original, utilizando para éllo el programa GENETIX 4.03 (Belkhir et
al, 2001). Se determinó la heterocigosis observada de cada individuo y el promedio de toda la
población utilizando la herramienta Excel (Microsoft Office Excel vers. 2007).
Análisis de la estructura en la población original
Una muestra de 16 microsatélites no ligados fue seleccionada para efectuar el análisis de
estructura de la población, mediante dos estrategias: un Análisis Factorial de Correspondencia
AFC (Benzecri, 1973) que se realizó utilizando el programa XlSTAT 7.5.2, que muestra en un
gráfico, la agrupación de los individuos con similitudes genéticas en un plano de dos
dimensiones. La otra estrategia se realizó con el programa STRUCTURE (Pritchard et al, 2000), a
partir del que es posible inferir el número de subpoblaciones (K) que pudieran coexistir en la
población estudiada, bajo la presunción de Equilibrio de Hardy y Weinberg en las
subpoblaciones. Para éllo se consideró un número de 50.000 iteraciones como períodos de
procesamiento, 250.000 repeticiones y 10 análisis independientes, bajo el supuesto modelo de
“mezcla de ancestros” (“Admixture”) (Anexo 6.1)
Estos análisis permitieron identificar individuos que por su constitución genética, difieren
mucho del resto de la población. Por otra parte, se verificó el número de subpoblaciones
presentes en la población estudiada y la contribución de cada individuo a la conformación de
esas subpoblaciones (Anexo 7.2).
A partir de estos análisis se pudieron seleccionar individuos que en conjunto formaran una
población no estructurada y por ende más ajustada para un estudio de asociación entre los
marcadores microsatélites y la resistencia a la enfermedad. Con esta selección de individuos se
realizó otra prueba de AFC con el fin de constatar la pérdida de estructura en la población
seleccionada (XlSTAT 7.5.2).
Análisis del Fenotipo
A partir de los resultados de la evaluación de la resistencia a la enfermedad “Mancha de Agua”
(fenotipo) se realizó una Prueba de Medias para datos No Paramétricos, mediante la Prueba de
Kruskal y Wallis, utilizando para ello el programa XlSTAT 7.5.2 (2007)
Se adaptó la escala de evaluación de la resistencia, de los 8 niveles iniciales (Anexo 2), a tres
niveles: 1 (alta resistencia), 2 (moderada resistencia) y 3 (baja resistencia) (Iwaro et al, 2006),
esto con el fin de facilitar el análisis de asociación.
La frecuencia de individuos en cada nivel de resistencia se graficó para toda la población, para
los individuos Criollos que fueron descartados del análisis de asociación y para la población no
estructurada.
Análisis de Asociación
Tomando en cuenta la información genotípica de cada individuo, así como su nivel de
resistencia a la enfermedad, se elaboraron tablas de contingencia utilizando el programa Excel
(Microsoft Office Excel vers. 2007), para cada locus de microsatélites analizados. La información
recolectada en estas tablas fue graficada con el fin de visualizar tendencias de los genotipos
más frecuentemente susceptibles o resistentes en la población no estructurada (Anexo 7)
La asociación entre marcadores microsatélites y la resistencia a la enfermedad se determinó
mediante una Prueba de X2 para el análisis de tablas de contingencia con el método de
Pearson, considerando un umbral de significación de p≤0,05 para cada prueba (loci
microsatélites), utilizando el programa XlSTAT 7.5.2
III. RESULTADOS
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inóculo de P. megasperma
Aislamiento de Phytophthora megasperma
Se logró la recolección de muestras de mazorcas enfermas con aparente síntoma de “Mancha
de Agua”, en las cuales se observó necrosis desde la base del pedúnculo. Sobre la superficie
afectada se evidenciaron irregularidades (hipertrofia) de consistencia dura a manera de
verrugas. En el interior de la mazorca se evidenciaron halos concéntricos típicos con distinta
coloración, siendo parda en la zona afectada y clara en la zona sana, no llegando a afectar las
almendras. Al exponer el interior de la mazorca al aire, se apreció una rápida oxidación de la
misma (Figura 3).
Al ensayar diversos medios de cultivo para el aislamiento y crecimiento del patógeno, se
comprobó que el medio en el cual se apreciaba mejor respuesta, tanto en el mayor crecimiento
de micelio, como en la formación de esporangios, fue el medio agar zanahoria, tanto en
condiciones de luz como de oscuridad, seguido en menor grado por el medio agar papa
dextrosa. Los medios en los cuales se observó menor crecimiento del micelio fueron, el medio
agar jugo V8 y agar harina almidón.
Se logró determinar que en promedio, el diámetro de la lesión causada por la penetración de
una sola zoospora de P. megasperma en mazorcas de cacao es de 5,2 cm (Figura 11).
Caracterización de P. megasperma
Comparando las características del patógeno tanto del micelio como de sus estructuras
internas (fig. 12 y 13) con claves taxonómicas para especies de Phytophthora (Ho, 1981), se
logró determinar que efectivamente se trataba de P. megasperma, agente causal de “Mancha
de Agua” en frutos de cacao. El cuadro 3, resume las características generales verificadas.
Figura 11. Mancha ocasionada por la germinación de solo una zoospora de P. megasperma
Cuadro 3. Características morfológicas y fisiológicas observadas en los aislados de P. megasperma en
condiciones de laboratorio (Ho, 1981)
Micelio Hifas simples, rectas, sin septos, tamaños entre 20-40 µm, esféricas u ovoides, abundante engrosamiento de las hifas en el medio. Falta de crecimiento en el medio agar harina.
Esporangio y esporangiosporas
Producido al final de la hifa, de forma irregular , sin pedicelo, esférico u ovoide y de tamaño entre 30-50 µm
Clamidosporas Habilidad para producir clamidosporas variables en medios de cultivo, tamaño entre 25-45 µm y en posición terminal.
Zoospora Habilidad de producir zoosporas en medios de cultivos, de forma ovoide y tamaño entre 25-45 µm
Fisiología Crecimiento óptimo a 25-27°C con una temperatura máxima de crecimiento entre 30-35°C y en condiciones de oscuridad.
Los análisis moleculares realizados a los aislados, basados en el procedimiento de Cooke et al,
(1997), permitieron amplificar una única banda que concuerda con el tamaño esperado para
Phytophthora. Así mismo las secuencias Ymeg1F-2R (Schena et al, 2008), confirmaron que la
cepa corresponde a la especie P. megasperma (Rumbos, com. Personal).
Figura 12. Cultivo de P. megasperma en medio agar zanahoria
Figura 13. Características morfológicas de las estructuras internas del micelio
de P. megasperma
Se logró realizar la inducción de la liberación de las zoosporas mediante un shock término a 4°C
en los aislados puros de 10 días en medio agar zanahoria, cuantificando y ajustando dicho
inóculo de zoosporas a un título de 1x105 zoosporas/ml.
2. Evaluación de la resistencia de las mazorcas de cacao a P. megasperma
Al realizar las pruebas de inoculación de P. megasperma en mazorcas desprendidas de cacao
bajo condiciones de cámara húmeda se encontró una alta variabilidad en las respuestas, las
cuales van desde cultivares altamente resistentes a la penetración y establecimiento del
patógeno (figura 14), clasificados con los niveles 1 y 2 según la escala de resistencia; cultivares
con resistencia media, clasificados con los niveles 3, 4 y 5 (figura 15), hasta cultivares altamente
susceptibles, niveles 6, 7 y 8 (figura 16). El cuadro 4, resume las respuestas encontradas en los
cultivares evaluados, siendo la resistencia media la respuesta más abundante, seguida de la
resistencia baja y alta. Los reaislados de las mazorcas enfermas de este ensayo permitieron
determinar que se trataba de P. megasperma.
En ninguno de los casos, las mazorcas controles del ensayo (sin inóculo) se vieron afectadas por
la enfermedad ya que no presentaron síntomas de la enfermedad.
Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de la repuesta de las plantas a la
inoculación por P. megasperma, mediante una prueba de medias para datos no paramétricos
(Test Kruskal y Wallis), se aprecia que existen diferencias significativas entre los individuos
(resultados test en el anexo 4), permitiendo agrupar a los individuos en clases de resistencia
según sus similitudes. El cuadro 5, muestra dicho agrupamiento de individuos según sus
resistencia siendo el grupo I las plantas más resistentes a la penetración y establecimiento del
patógeno (SJU16, HER2, BOC14, 42, CAC01 y SJU4R) y el grupo XVIII los cultivares más
susceptibles (BEN28 y SP10X). Los grupos intermedios agrupan cultivares con resistencia media.
Figura 14. Cultivar altamente resistente a la infección por P. megasperma.
Figura 15. Cultivar con resistencia media a la infección por P. megasperma
Figura 16. Cultivares con resistencia baja a la infección por P. megasperma
Cuadro 4. Evaluación de la respuesta resistencia/susceptibilidad de mazorcas de cacao frente a P.
megasperma.
Escala de resistencia
Mazorca Escala de resistencia
Mazorca Planta 1 2 3 Promedio Planta 1 2 3 Promedio
RA01 5 5 6 5,3 BEN5 5 4 6 5,0
RA05 5 6 5 5,3 BEN11 6 5 6 5,7
CBL04 5 6 3 4,7 BEN12 5 8 7 6,7
CBL05 2 5 2 3,0 BEN15 5 6 6 5,7
CBL06 5 5 5 5,0 BEN17 5 5 6 5,3
CAC01 1 1 1 1,0 BEN19 1 1 2 1,3
ABA01 6 5 4 5,0 BEN21 6 6 6 6,0
ABA01X 1 2 2 1,7 BEN22 7 5 6 6,7
LOB13 2 5 6 4,3 BEN23 7 6 5 6,0
LOB38 6 5 6 5,7 BEN24 5 5 5 5,0
ADJ05 5 2 5 4,0 BEN26 5 5 6 5,3
UVI01 5 6 5 5,3 BEN28 8 8 7 7,7
UVI03 2 2 2 2,0 BEN29 5 5 7 5,7
UVI13 6 5 6 5,7 BOC1 5 5 5 5,0
SP08 7 7 6 6,7 BOC2 5 1 5 3,7
SP10X 8 8 8 8,0 BOC3 6 6 7 6,3
P.ROJO 8 7 7 7,3 BOC4 7 8 7 7,3
SJU1 8 8 2 6,0 BOC5 5 5 2 4,0
SJU2 5 5 6 5,3 BOC6 5 5 6 5,3
SJU3 5 5 5 5,0 BOC9 8 7 7 7,3
SJU4R 1 1 1 1,0 BOC12 6 5 6 5,7
SJU5 8 7 7 7,3 BOC14 1 1 1 1,0
SJU6 6 7 7 6,7 BOC16 5 5 5 5,0
SJU7 6 6 5 5,7 BOC17 6 5 5 5,3
SJU9 6 6 5 5,7 HER1 5 2 5 4,0
SJU11 6 6 6 6,0 HER2 1 1 1 1,0
SJU12 5 5 2 4,0 H3V 2 5 5 4,0
SJU13 2 2 2 2,0 HEBP 2 5 5 4,0
SJU14 3 3 2 2,7 HEP 5 5 5 5,0
SJU15 7 7 7 7,0 02 2 4 4 3,3
SJU16 1 1 1 1,0 04 6 5 6 5,7
BEN1 6 7 7 6,7 42 1 1 1 1,0
BEN2 2 5 5 4,0 81 5 5 6 5,3
BEN4 6 8 7 7,0
Cuadro 5. Pruebas de medias para la evaluación de la respuesta
resistencia/susceptibilidad (Test de Kruskall y Wallis)
GRUPO RANGO CULTIVAR
I A SJU16, HER2, BOC14, 42, CAC01, SJU4R II AB BEN19 III ABC ABA01X IV ABCD UVI03, SJU13, SJU14 V ABCDE 02 VI ABCDEF CBL05 VII ABCDEFG BOC2, HERBP, ADJ05, HER3V, BEN2, SJU12,
BOC05, HER01 VIII ABCDEFGH BOC16, BEN24, SJU03, HERP, CBL06, BOC01,
LOB13 IX ABCDEFGHI CBL04, BEN05, ABA01 X BCDEFGHIJ RA01, BEN26, RA05, UVI01, SJU02, BEN17,
BOC17, 81, BOC06 XI CDEFGHIJ BEN29 XII DEFGHIJ BEN11, UVI13, SJU09, BEN15, BOC12, 04,
LOB38, SJU07 XIII EFGHIJ BEN23 XIV FGHIJ SJU01, SJU11, BEN21, BEN22 XV GHIJ BEN12, BOC03 XVI HIJ SJU06, SP08, BEN01, BEN04, SJU15, XVII IJ BOC09, POR. ROJO, SJU05, BOC04 XVIII J BEN28, SP10X
En el gráfico de las frecuencias del fenotipo para la población completa (Figura 17), de acuerdo
con la escala de evaluación comprendida de 1 a 8, se aprecia que los niveles 5 y 6 son los que
poseen mayor frecuencia (17 y 14 cultivares respectivamente), seguido de los niveles 7 (11
cultivares) y 4 (9 cultivares). Así mismo se aprecia una mayor cantidad de cultivares (7) con alta
resistencia a la penetración del patógeno (nivel 1), que cultivares con alta susceptibilidad al
patógeno (nivel 8) la cual sólo se aprecia en 2 cultivares. Los niveles de resistencia en los cuales
se observó menor frecuencia de plantas fueron los niveles 2, 3 y 8.
Figura 17. Distribución de frecuencias de fenotipos en la población completa
(escala de evaluación en rango de 1 a 8)
Al adaptar la escala de evaluación a una nueva escala con 3 clases de resistencia, 1 (resistencia
alta), 2 (media) y 3 (baja), y graficar la respuesta fenotípica en la población completa (fig. 18),
se aprecia que no existen diferencia evidentes entre la repuesta de resistencia media y baja (26
cultivares), siendo estas mayores a la frecuencia de cultivares con alta resistencia (15
cultivares).
Figura 18. Distribución de frecuencias de fenotipos en la población completa
(escala de evaluación en rango de 1 a 3)
Las frecuencia en las respuestas de resistencia en cultivares criollos (Figura 19), fue mayor para
las respuesta de resistencia media (11 cultivares) y baja (10 cultivares). La resistencia alta, solo
se encontró en dos cultivares criollos HER2 y BOC15.
Figura 19. Niveles de resistencia en individuos Criollos
En cuanto a los cultivares híbridos, no se aprecia una clara tendencia en cuanto a su nivel de
resistencia a la infección por P. megasperma, siendo variable la respuesta entre los niveles 1, 2
y 3 (alta, media y baja resistencia respectivamente). Del total de plantas híbridas analizadas, el
28,6% de los cultivares exhiben una resistencia alta al patógeno, el 33,3% muestran una
resistencia media, mientras que la respuesta de resistencia baja se encuentra en un 38,1% de
los cultivares (Fig. 20).
Figura 20. Frecuencia en las respuestas de resistencia en individuos hibridos.
Nivel de resistencia
Alta Media Baja
SJU4R SJU12 SJU5
SJU13 BEN5 SJU7
SJU14 BEN17 SJU9
SJU16 BOC1 SJU11
BEN19 BOC5 SJU15
BOC14 BOC17 BEN11
42 HER1 BEN12
2 81 BEN15
ABA01X UVI01 BEN21
CAC01 LOB13 BEN22
UVI03 ADJ05 BEN23
CBL05 CBL04 BOC4
CBL06 4
ABA01 SP10X
SP08
UVI13
3. ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES
Con el fin de estudiar la estructura genotípica de la población para realizar los análisis de
asociación entre marcadores y la resistencia, se realizo los análisis con los microsatéites.
Extracción y cuantificación del ADN
Se pudo verificar que el método de extracción de ADN utilizado resultó ser efectivo, ya que se
logró purificar ADN íntegro a partir de hojas de cacao de todos los cultivares evaluados (figura
21). Así mismo el ADN extraído resulto ser de buena calidad para ser utilizado en la
amplificación por PCR de los microsatélites (figura 22).
Figura 21. ADNg extraído a partir de hojas de cacao. (67 cultivares) Gel de Agarosa 0,8%
Figura 22. Amplificación por PCR del microsatélites mTcCIR109 con ADN de los 67 cultivares en gel de agarosa 1,5%
Amplificaciones por PCR de microsatélites
Se lograron estandarizar y optimizar las condiciones de amplificación por PCR para
microsatélites. En la figura se muestra la amplificación de 24 marcadores microsatélites con un
ADN previamente comprobado de calidad para reacciones de PCR. En aquellos microsatélites
en donde no hubo amplificación, se realizaron nuevas diluciones de los cebadores a partir de
los stock concentrados hasta lograr su optima amplificación, tal es el caso de mTcCIR190, 272 y
286. (Figura 23)
Figura 23. Amplificación por PCR de 24 marcadores microsatélites con un mismo ADN. Gel de agarosa
1,5%
Geles de Poliacrilamida y tinción con Nitrato de Plata.
Se lograron estandarizar, tanto las condiciones de corrida de los geles de poliacrilamida como
la tinción de los mismos con Nitrato de Plata. La prueba de tiempos de electroforesis de estos
geles permitió determinar que el tiempo de electroforesis óptimo para la adecuada
visualización de los microsatélites estuvo entre 90-120 minutos, dependiendo del tamaño de
cada microsatélite (figura 24).
Figura 24. Prueba de tiempos de electroforesis de marcadores microsatélites en gel de poliacrilamida
6% con Urea, tinción con Nitrato de Plata.
Se observó consistencia en los resultados obteniéndose un buen revelado de los geles, en los
cuales se pudo apreciar de forma clara la resolución de los alelos de microsatélites. Así mismo,
los microsatélites coincidieron sin excepción con los tamaños esperados, esto contrastándolos
con una escalera de pesos moleculares de 50Kb (Promega), lo que permitió la adecuada lectura
alélica de los microsatélites amplificados en cada individuo (figura 25), dicha matriz de lectura
se muestra en el anexo 4.
Figura 25. Ejemplos de geles de poliacrilamida revelados con Nitrato de Plata
en los cuales se observan los alelos de microsatélites.
4. ANÁLISIS DEL GENOTIPO
Frecuencias Alélicas por Locus
Las frecuencias alélicas de los tres locus encontrados fueron 0,806 para el alelo criollo (a),
0,183 para el alelo forastero (b) y 0,028 para el tercer alelo (c). Se observó la presencia del
alelo c solo en 9 de los marcadores analizados (cuadro 6).
Cuadro 6. Frecuencias alélicas por cada locus de microsatélite evaluado
en la población original
Locus
Alelo a
Alelo b
Alelo c
mTcCIR121 0,77 0,23 mTcCIR272 0,64 0,18 0,17
mTcCIR84 0,83 0,17 mTcCIR286 0,73 0,27 mTcCIR100 0,84 0,16 mTcCIR268 0,77 0,23 mTcCIR120 0,86 0,14 mTcCIR82 0,8 0,2 mTcCIR167 0,9 0,1 0,01
mTcCIR222 0,77 0,22 0,01
mTcCIR17 0,78 0,22 mTcCIR109 0,8 0,2 0,01
mTcCIR255 0,88 0,12 mTcCIR291 0,82 0,17 0,01
mTcCIR190 0,82 0,17 0,01
mTcCIR7 0,81 0,18 0,01
mTcCIR55 0,78 0,22 mTcCIR189 0,86 0,14 mTcCIR8 0,84 0,16 mTcCIR79 0,85 0,15 mTcCIR229 0,79 0,2 0,01
mTcCIR91 0,81 0,17 0,01
mTcCIR223 0,78 0,22 Media 0,806 0,183 0,028
Frecuencias Genotípicas por Locus
Las frecuencias genotípicas por locus indican que el genotipo más frecuente en la población de
estudio es el genotipo Criollo “aa” representado con una media de 0.669, seguido del genotipo
híbrido “ab” con una media de 0,264. La menor frecuencia encontrada se observó en los
genotipos homocigotos forasteros “bb” e híbridos “ac” con medias 0,046 y 0,020
respectivamente (Cuadro 7).
Cuadro 7. Frecuencias genotípicas por cada locus de microsatélite evaluado
en la población original
Loci al 1 al 2 Frec
Loci al 1 al 2 Frec
Loci al 1 al 2 Frec
m121 a a 0,636
m167 a a 0,803
m55 a a 0,621
m121 a b 0,273
m167 a b 0,182
m55 a b 0,318
m121 b b 0,091
m167 b b 0,000
m55 b b 0,061
m121 a c 0,000
m167 a c 0,015
m55 a c 0,000
m272 a a 0,379
m222 a a 0,606
m189 a a 0,773
m272 a b 0,227
m222 a b 0,333
m189 a b 0,182
m272 b b 0,061
m222 b b 0,045
m189 b b 0,045
m272 a c 0,333
m222 a c 0,015
m189 a c 0,000
m84 a a 0,712
m17 a a 0,636
m8 a a 0,758
m84 a b 0,242
m17 a b 0,303
m8 a b 0,182
m84 b b 0,045
m17 b b 0,061
m8 b b 0,061
m84 a c 0,000
m17 a c 0,000
m8 a c 0,000
m286 a a 0,530
m109 a a 0,667
m79 a a 0,742
m286 a b 0,409
m109 a b 0,258
m79 a b 0,227
m286 b b 0,061
m109 b b 0,061
m79 b b 0,030
m286 a c 0,000
m109 a c 0,015
m79 a c 0,000
m100 a a 0,742
m255 a a 0,818
m229 a a 0,677
m100 a b 0,212
m255 a b 0,152
m229 a b 0,262
m100 b b 0,045
m255 b b 0,030
m229 b b 0,062
m100 a c 0,000
m255 a c 0,000
m229 a c 0,000
m268 a a 0,606
m291 a a 0,682
m91 a a 0,697
m268 a b 0,333
m291 a b 0,273
m91 a b 0,258
m268 b b 0,061
m291 b b 0,030
m91 b b 0,030
m268 a c 0,000
m291 a c 0,015
m91 a c 0,015
m120 a a 0,773
m190 a a 0,697
m223 a a 0,606
m120 a b 0,182
m190 a b 0,258
m223 a b 0,364
m120 b b 0,045
m190 b b 0,030
m223 b b 0,030
m120 a c 0,000
m190 a c 0,015
m223 a c 0,000
m82 a a 0,667
m7 a a 0,667
PR
OM
EDIO
a a 0,669
m82 a b 0,288
m7 a b 0,288
a b 0,264
m82 b b 0,045
m7 b B 0,030
b b 0,046
m82 a c 0,000
m7 a C 0,015
a c 0,020
Heterocigosis Observada por locus
La heterocigosis media observada por locus fue de 0,27., en un rango de heterocigosis de 0-1.
Esta heterocigosis varió entre microsatélites, en un rango que va desde 0,17 hasta 0,57. Se
encontraron en promedio 2,39 alelos en la población estudiada y 3,39 números de genotipos
probables (cuadro 8).
Cuadro 8. Heterocigosis por cada locus de microsatélite evaluado en la población original
Locus N° Alelos
N°
Genotipos
Heterocigosis
Observada
mTcCIR121 2,00 3,00 0,26
mTcCIR272 3,00 4,00 0,57
mTcCIR84 2,00 3,00 0,23
mTcCIR286 2,00 3,00 0,39
mTcCIR100 2,00 3,00 0,20
mTcCIR268 2,00 3,00 0,32
mTcCIR120 2,00 3,00 0,17
mTcCIR82 2,00 3,00 0,28
mTcCIR167 3,00 4,00 0,19
mTcCIR222 3,00 4,00 0,35
mTcCIR17 2,00 3,00 0,29
mTcCIR109 3,00 4,00 0,26
mTcCIR255 2,00 3,00 0,16
mTcCIR291 3,00 4,00 0,28
mTcCIR7 3,00 4,00 0,29
mTcCIR55 2,00 3,00 0,30
mTcCIR189 2,00 3,00 0,17
mTcCIR8 2,00 3,00 0,17
mTcCIR79 2,00 3,00 0,22
mTcCIR229 3,00 4,00 0,25
mTcCIR91 3,00 4,00 0,29
mTcCIR223 2,00 3,00 0,35
Media 2,39 3,39 0,27
Heterocigosis Observada de cada Individuo
La heterocigosis de la población en general fue baja, con valores que varían entre 0,91 la
máxima, hasta individuos homocigotos, con una media de la población estructurada de 0,280 lo
que evidencia la baja condición de híbridos en la población, sin embargo a pesar de esta baja
heterocigosis, solo el 12% se corresponde con individuos homocigotos criollos, mientras que en
ningún caso se encontraron individuos homocigotos forasteros.
Cuadro 9. Heterocigosis de individuos evaluados
Indiv Heterocig Indiv Heterocig Indiv Heterocig
SJU1 0,043 BEN21 0,304 HER2 0,000
SJU2 0,043 BEN22 0,565 H3V 0,000
SJU3 0,000 BEN23 0,174 H3P 0,000
SJU4R 0,826 BEN24 0,043 02 0,696
SJU5 0,391 BEN26 0,043 SP10X 0,087
SJU6 0,043 BEN28 0,000 P. ROJO 0,000
SJU7 0,565 BEN29 0,000 UVI01 0,913
SJU9 0,261 BOC1 0,087 SP08 0,130
SJU11 0,739 BOC2 0,043 UVI13 0,217
SJU12 0,565 BOC3 0,087 ABA01X 0,696
SJU13 0,609 BOC4 0,174 CAC01 0,261
SJU14 0,739 BOC5 0,087 LOB13 0,348
SJU15 0,261 BOC6 0,087 ADJ05 0,609
SJU16 0,522 BOC9 0,000 UVI03 0,870
BEN1 0,087 BOC12 0,087 RA01 0,087
BEN4 0,130 BOC14 0,478 RA05 0,043
BEN5 0,130 BOC16 0,087 CBL04 0,261
BEN11 0,174 42 0,348 CBL05 0,348
BEN12 0,522 HER1 0,435 CBL06 0,261
BEN15 0,174 H3BP 0,043 LOB38 0,478
BEN17 0,261 81 0,652 ABA01 0,391
BEN19 0,609 04 0,261 BEN2 0,000
Media 0,280
Análisis de la estructura de la población
En la figura 26, se presenta el AFC obtenido a partir de la población original (67 individuos) y 15
marcadores no ligados. Se observa el alto grado de solapamiento entre individuos, así como
una distribución no uniforme de los mismos, lo que demuestra la existencia de subpoblaciones
en la población original.
Figura 26. Análisis Factorial de Correspondencias para la población original (67 individuos)
y 15 marcadores no ligados (XlSTAT 7.5.2)
SJU1SJU2SJU3
SJU4R
SJU5
SJU6
SJU7
SJU9
SJU11
SJU12
SJU13
SJU14
SJU15
SJU16
BEN1BEN4
BEN5BEN11
BEN12
BEN15BEN17
BEN19
BEN21
BEN22
BEN23
BEN24BEN26BEN28BEN29
BOC1
BOC2
BOC3
BOC4BOC5
BOC6
BOC9
BOC12
BOC14
BOC15
BOC16
BOC17
42
HER1
H3BP
81
4
HER2H3VH3P
2
SP10X
P. ROJO
UVI01
SP08
UVI13
ABA01X
CAC01LOB13
ADJ05
UVI03
RA01RA05
CBL04
CBL05
CBL06 LOB38ABA01
BEN2
aa
ab
bb
ac
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
--a
xis
F2
(3
4 %
) --
>
-- axis F1 (54 %) -->
Points-rows and points-columns (axis F1 and F2: 88 %)
Análisis del número de subpoblaciones
Los resultados obtenidos mediante el programa STRUCTURE (Pritchard et al. 2000) revelan la
existencia de 2 subpoblaciones en la población original. En la figura 27, se observa la caída y
estabilización del valor de LnP(D), lo que indica el número de subpoblaciones (K) (anexo análisis
de la estructura de la población).
Figura 27. Análisis de la estructura de población (STRUCTURE)
Selección de la población no estructurada
Los resultados obtenidos a partir del análisis de subpoblaciones efectuado mediante el
programa STRUCTURE, en relación a la contribución de cada planta a la formación de estas
subpoblaciones, permitieron seleccionar una nueva lista de individuos para conformar una
población no estructurada. En total se seleccionaron 42 individuos con los cuales fue posible
realizar los análisis de asociación. Esta selección se efectuó eliminando aquellas plantas que
portaban más de 95 % del ancestro Criollo (ver anexo 5.2).
Al realizar un nuevo AFC con la población no estructurada, se evidenció la mayor segregación
de los individuos, eliminándose casi por completo el solapamiento entre estos (figura 28).
400
500
600
700
800
900
1 2 3 4 5K
LnP
(D)
Figura 28. Análisis Factorial de Correspondencias de la población no estructurada
(42 individuos) y 15 marcadores no ligados (XlSTAT 7.5.2)
SJU4R
SJU5
SJU7
SJU9
SJU11SJU12
SJU13SJU14
SJU15
SJU16
BEN5BEN11
BEN12
BEN15BEN17
BEN19
BEN21
BEN22
BEN23BOC1
BOC4BOC5
BOC14
BOC1742
HER1
4
2
SP10X
UVI01
SP08
UVI13
ABA01X
CAC01LOB13
ADJ05
UVI03
CBL04CBL05
CBL06
ABA01
aa
ab
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
--a
xis
F2
(3
4 %
) --
>
-- axis F1 (59 %) -->
Points-rows and points-columns (axis F1 and F2: 93 %)
5. Análisis de Asociación
Mediante el análisis de asociación entre los genotipos y la respuesta fenotípica de estos a la
resistencia a la infección por P. megasperma, se encontró que, de los 7 marcadores
microsatélites ligados a la resistencia a especies de Phytophthora que se evaluaron, 4
marcadores se encontraron asociados a la resistencia a P. megasperma en los individuos
seleccionados. El marcador asociado al color de cotiledones también se encontró en asociación
con la resistencia en la población de estudio. De estos marcadores asociados, mTcCIR17 se
localiza en el grupo de ligamiento 4, mTcCIR189 en el grupo de ligamiento 8, mTcCIR8 en el
grupo de ligamiento 9, mTcCIR229 y mTcCIR223 en el grupo de ligamiento 10. El resto de
marcadores analizados no mostraron asociación significativa con la resistencia a “Mancha de
Agua” (cuadro 10).
Cuadro 10. Análisis de asociación entre marcadores microsatélites y resistencia a P.
megasperma. Umbral de significancia P=0.05
LG Marcador cM X2 Grados libertad P
1 mTcCIR272 36,9 7,852 6 0,249
1 mTcCIR286 68,3 7,040 4 0,134
2 mTcCIR268 38,8 8,403 4 0,078
3 mTcCIR120 6,3 2,430 4 0,657
3 mTcCIR82 30,6 1,181 4 0,881
3 mTcCIR167 59,2 3,806 2 0,149
4 mTcCIR17 23,4 11,828 4 0,019*
5 mTcCIR109 72 12,255 6 0,057
6 mTcCIR255 39,1 1,232 2 0,540
7 mTcCIR190 3,8 1,073 2 0,585
7 mTcCIR55 35,5 2,955 4 0,565
8 mTcCIR189 46,9 9,520 4 0,049*
9 mTcCIR8 52,5. 11,273 4 0,024*
9 mTcCIR79 94,1 5,049 2 0,080
10 mTcCIR229 11,9 12,123 4 0,016*
10 mTcCIR223 72,4 9,323 2 0,009*
* Marcadores asociados (P≤0.05)
IV. DISCUSION
1. Aislamiento, caracterización y preparación del inóculo de P. megasperma
El aislamiento del patógeno se efectuó en mazorcas de cacao que presentaban los
síntomas típicos de la enfermedad Mancha de Agua. Este fué realizado durante los
meses de diciembre a marzo, época de abundantes precipitaciones en la zona, lo que
genera una alta humedad ambiental. La colecta de muestras enfermas coincidió con la
época de la cosecha, durante la cual pueden encontrarse mazorcas en estado de
madurez fisiológica; estas condiciones son favorables para el establecimiento y la
propagación de patógenos (Attard et al, 2008) y por ende para el establecimiento de la
enfermedad en la zona.
La caracterización del patógeno, tanto del micelio como de sus estructuras internas
(esporangio, esporas, clamidosporas), realizada con un sistema de claves taxonómica
específico para especies de Phytophthora (Ho, 1981) permitió determinar que
efectivamente se trataba del patógeno Phytophthora megasperma. Estas
características permiten distinguir a esta especie de las demás especies de
Phytophthora que afectan plantas de cacao en la zona, como P. palmivora.
El análisis molecular realizado a los aislados de P. megasperma usados en este trabajo
con la pareja de cebadores ITS1/ITS4 (Cooke et al, 1997), confirmó que se trataba de un
aislado perteneciente al género Phytophthora, mientras que los cebadores Ymeg1F-2R
cuya secuencia se basa en el fragmento del gen Ypt1 (Schena et al, 2008) permitió
identificar a la especie P. megasperma (Rumbos, com. Personal).
La metodología utilizada para inducir la liberación de las zoosporas resultó ser efectiva,
con un tiempo de 30 minutos a 4°C, éste concuerda con los reportados para otras
especies como P. infestans, en las cuales puede ocurrir luego de 30-60 minutos. En
algunas especies como Phytophthora palmivora, la liberación de las zoosporas sucede a
los 5 minutos de haberse inducido mediante el “shock” frío (Walter y West, 2007). El
procedimiento permitió obtener suficiente cantidad de inóculo a la concentración
deseada para llevar a cabo las pruebas de resistencia de las mazorcas a la enfermedad.
2. Evaluación de la resistencia de plantas seleccionadas a P. megasperma
La selección de las plantas a las cuales se realizó la prueba de resistencia a P.
megasperma estuvo determinada principalmente por la existencia de mazorcas en la
planta, ya que los reportes señalan P. megasperma afecta solo a mazorcas y no a otras
estructuras de la planta (Rumbos et al, 2007), a diferencia de P. palmivora la cual afecta
mazorcas, tronco y ramas de las plantas de cacao (Iwaro et al, 1997). También era
necesario que la planta tuviese al menos 4 mazorcas completamente sanas y en similar
estado de desarrollo, ya que se requiere un mínimo de tres mazorcas para que la
evaluación de resistencia a la enfermedad y la cuarta mazorca serviría como control de
la evaluación.
El estado fisiológico de las mazorcas debe estar entre 3-4 meses de edad, esto debido a
que se ha encontrado en trabajos previos que es la edad más susceptible al ataque del
patógeno (Iwaro et al, 1998., Iwaro et al, 2006). Iwaro et al (1998), estudiaron el efecto
entre la resistencia de mazorcas de cacao a Phytophthora, con el estado de maduración
de las mismas, encontrando que existen diferencias significativas en el establecimiento
y tamaño de las lesiones entre genotipos y el estado de maduración. Adicionalmente,
las mazorcas no debían presentar ningún síntoma de enfermedad, heridas debidas al
ataque de insectos o por acción mecánica, ya que esto podría afectar la evaluación de
los síntomas de la enfermedad.
Todas las condiciones antes mencionadas fueron limitantes en la escogencia de
cultivares, ya que la mayoría presentaban en sus frutos algún tipo de daño o síntoma
principalmente debido a daño por insectos, deformaciones o marcas en las mazorcas, o
a alguna herida causada cuando se realiza mantenimiento a las plantaciones.
La metodología planteada para llevar a cabo pruebas de evaluación de mazorcas de
cacao frente a P. megasperma en cámara húmeda, resultó ser efectiva, obteniéndose
resultados consistentes. Así mismo los controles del ensayo permitieron determinar la
correcta ejecución de la evaluación, ya que ninguno de estos controles resultó afectado
por la enfermedad.
La aplicación de este tipo de metodologías resulta conveniente para el estudio de la
respuesta de plantas a enfermedades en las cuales se ven afectados solo los frutos y
más aun cuando se trata de plantas que forman parte de bancos de germoplasma, en
donde, llevar a cabo pruebas biológicas en condiciones naturales de campo, resulta un
riesgo (Blaha et al., 2000).
En el caso de P. megasperma no se sabe con exactitud cuáles procesos están
implicados en el establecimiento del patógeno en la mazorca, mucho menos los genes
involucrados en la interacción que se establece entre la planta y el patógeno. Sin
embargo, se ha reportado que las zoosporas de oomycetes muestran secreción de una
proteína PcVsv1 (thrombospodin type 1); esta proteína, así como glicoproteínas tipo
mucinas y otras proteínas que se unen a la superficie del los tejidos, han sido
identificadas en estadios de preinfección en P. infestans y P. parasítica, y se presume
que están involucradas en la adhesión de la zoospora (Attard, et al. 2008).
Los resultados de la prueba de medias (test de Kruskal y Wallis) evidenciaron
diferencias entre la respuestas de los cultivares frente a la inoculación por P.
megasperma, agrupándolos en diferentes clases de resistencia, siendo el grupo I los
individuos más resistentes y el grupo XVIII el más susceptible (cuadro 5).
La variabilidad en la respuesta de los cultivares a la inoculación por P. megasperma,
sugiere que la regulación de la defensa está sujeta a factores poligénicos. Este
resultado es coincidente con diversos estudios de resistencia a Phytophthora en cacao
realizados previamente (Warren et al, 1994; Rocha et al, 1874; Lanaud et al, 2004;
Clement et al, 2003), Risterucci et al, 2003; Clément et al, 2004; Flament et al, 2001).
A pesar de que existen reportes en los cuales se sugiere que las plantas con genotipo
Criollo son muy susceptibles a enfermedades (Clément et al 2003), se encontró un alto
grado de resistencia media y en algunos casos, resistencia alta en los genotipos criollos
evaluados, contradiciendo en parte dichos reportes. Esta afirmación puede estar
influenciada por la escasez de cultivares criollos disponibles en otros países cacaoteros
para la realización de pruebas de resistencia a enfermedades, por lo que hay pocos
estudios sobre los mismos en cultivares criollos.
Recientemente se han encontrado cultivares criollos con alto grado de resistencia a la
enfermedad “Moniliasis” causada por Moniliophthora roreri (Rumbos, com. personal),
lo que afirma que los cultivares criollos también pueden exhibir resistencia a
enfermedades. En los cultivares híbridos evaluados se encontró una resistencia
variable, incluyendo niveles altos. Lo que permitiría sugerir que, en el caso de
resistencia a P. megasperma, pudiera encontrarse resistencia total, lo que no se ha
reportado para otras especies de Phytophthora en cacao (Risterucci, et al. 2003).
3. Análisis del Genotipo
El análisis genético de la población hizo evidente una baja frecuencia de híbridos entre
los cultivares evaluados; esto se demuestra por una frecuencia alélica media de 0,81
para el alelo “a” o Criollo en los loci de microsatélites evaluados. Así mismo, el análisis
de la heterocigosis media de la población se observó en 0,28.
Esta condición de baja heterocigosis de los cultivares evaluados se debe a que éstos
provienen de bancos de germoplasma de cacao Criollo venezolano en los cuales se
trata de conservar y cuidar el acervo genético del cacao Criollo y por ende, de
heterocigosis baja.
Sólo dos alelos fueron encontrados en la gran mayoría de los individuos evaluados,
siendo la media 2,39 alelos, lo que indica una baja diversidad entre los individuos
estudiados. Además, el alelo más frecuente “a” coincidió con el alelo Criollo y el
segundo alelo más frecuente “b” correspondió al de un Forastero de la cuenca Baja del
Amazonas; ésta misma estrecha base genética fue la encontrada por Motamayor et al,
(2002), para los cacaos cultivados denominados Criollos Modernos, que son producto
del cruce de solo dos padres, frecuentes en todas las zonas productoras de cacao de
Venezuela.
Incluyendo la población estudiada, árboles de poblaciones de cacao Criollo de diversa
procedencia en el occidente del país, donde se han encontrado tipos variables en
caracteres morfoagronómicos, sería una circunstancia explicable, la presencia de un
tercer alelo detectado con algunos loci de microsatélites estudiados (9 loci), que
pudiera corresponder a otro alelo propio de cultivares Criollos.
4. Estudio de la estructura de la población
El análisis de la estructura de la población, realizada mediante un AFC y mediante el
programa STRUCTURE, permitió evidenciar la existencia de dos (2) subpoblaciones. En
el primer análisis se encontró el solapamiento de un grupo de individuos (Criollos con
alta homocigosis), evidencia clara de que no existe una diferenciación genética entre
éstos, mientras que otro grupo de individuos presentó dispersión (híbridos), siendo
ésta extrema para tres árboles (LOB38, RA01 y RA05) que se consideraron fuera de
tipo.
En el análisis de STRUCTURE se confirmó que dos subpoblaciones contribuían al
establecimiento de la población original. Esta estratificación de la población, así como
la distribución desigual de la misma, resulta ser no funcional para realizar estudios de
mapeo por asociación (Flint-García et al, 2003); por esta razón, resulta difícil efectuar
un estudio de asociación con todos los cultivares seleccionados.
La presencia de estas 2 subpoblaciones justificó el ajuste de la población, a fin de
eliminar aquellos individuos que contribuían al establecimiento de esas
subpoblaciones, según los resultados obtenidos mediante el programa STRUCTURE. La
eliminación de estos individuos generó una población no estructurada, lo que fue
confirmado en un segundo AFC, en el que se aprecia una mayor segregación de
individuos y en donde se elimina casi totalmente el solapamiento entre estos,
estableciéndose así una población más adecuada para el estudio de mapeo por
asociación. Este procedimiento ha mostrado ser apropiado en previos estudios de
asociación (Marcano et al, 2007).
5. Análisis de asociación entre marcadores microsatélites y la resistencia a P.
megasperma.
De acuerdo con los resultados obtenidos del análisis de asociación entre marcadores
moleculares y la resistencia a P. megasperma, se lograron encontrar 5 marcadores
asociados en la población estudiada. El marcador mTcCIR17 en el grupo de ligamiento
4, mTcCIR189 en el grupo de ligamiento 8, mTcCIR8 en el grupo 9 y en el 10, los
microsatélites mTcCIR229 y mTcCIR223.
Al analizar las figuras den donde se muestran la relación entre genotipo y las
frecuencias de fenotipos (Anexo 7), se aprecia que el genotipo que muestra en mayor
grado la resistencia es el híbrido, mientras que el genotipo homocigoto criollo parece
no tener una relación con la resistencia.
El reporte del marcador mTcCIR17 ubicado en el cromosoma 4, es coincidente con
estudios previos, en los cuales se encontraron QTLs ligados a la resistencia a especies
de Phytophthora. Lanaud et al (2004) en sus trabajos encuentran esta región ligada a
genes candidatos RGA (Resistance Gene Analogs) de las clases N y Pto.
Los genes que confieren resistencia en las plantas se clasifican en dos grupos, uno
conformado por genes involucrados en el reconocimiento del patógeno llamados genes
RGA, y el otro grupo de genes implicados en los mecanismos de defensa de la planta
frente al reconocimiento del patógeno (genes DGA, Defense Gene Analogs) (Agrios,
2005). Los genes N aislados en tabaco, están relacionados con proteínas receptoras
citoplasmáticas que contienen dominios ricos en leucinas, mientras que los genes Pto
de tomate, son del grupo Kinasa y contienen dominios serina-treonina-kinasa (STK)
involucrados en la transducción intracelular, o están asociados a estructuras receptoras
de kinasa.
Los genes Pto en tomate, al igual que los genes N en tabaco, pertenecen al grupo de
genes RGA (Lanaud et al, 2003). Estos estudios permitieron identificar a los genes
PTSCA6/A1 ubicado en el grupo de ligamiento 4, a 23,3cM; PT172/A1 a 23,5 cM,
PTSCA6/B2 a 24,4 cM, PTSCA6/A3 a 24,7 cM y PT172/B9 a 26,7 cM, según el mapa
genético de referencia para el cacao UPA402 x UF676 (Pugh et al, 2004).
Tomando en cuenta que el marcador microsatélite (mTcCIR17) está distanciado a 23,4
cM con respecto al mismo mapa de ligamiento para el cacao, se asume que existe una
estrecha asociación entre este marcador microsatélite y los QTLs encontrados por
Lanaud et al (2003).
Clément, et al (2003) encontraron ligamiento entre marcadores y la resistencia a
Phytophthora cerca del marcador mTcCIR18 (18,7 cM) en otras poblaciones de cacao.
Cabe destacar que, en las mismas regiones del cromosoma 4 donde se encuentra la
resistencia, los autores encuentran ligamiento entre QTLs ligados a vigor y QTLs ligados
al peso de las semillas en dos poblaciones de mapeo IMC78 y DR1. Según estos
resultados, Clément et al, (2003) sugieren una relación entre la resistencia de las
plantas de cacao a especies de Phytophthora y el peso de las semillas.
Marcano, et al (2007) realizando estudios de asociación en poblaciones de cacao que
incluían desde criollos hasta forasteros, encontraron en esta región al marcador
mTcCIR213 (24,1 cM) también asociado al peso de la semilla y del fruto y, en una
población venezolana cultivada de cacao, asociados además a la pigmentación de
distintas estructuras de la planta (fruto, cotiledones y partes florales) (Marcano, 2007).
Con respecto al marcador mTcCIR189, encontrado en el grupo de ligamiento 8 y
ubicado a 46,9 cM según el mapa de ligamiento de referencia (Pugh et al, 2004),
también se encuentra coincidencia en trabajo previos, en los cuales los marcadores
cTcCIR203 (56,7 cM) y cTcCIR63 (45,1 cM) se encuentran ligados a la resistencia a
especies de Phytophthora (N´Goran et al, 1997). Estos autores también reportan QTLs
relacionados con el peso del grano (cTcCIR98; 46,5 cM) en el mismo cromosoma
bastante cercano al asociado a la resistencia mTcCIR8, lo que apoya la teoría propuesta
por Clément et al, (2003) de la relación entre la resistencia con el peso de las semillas.
En los cromosomas 9 y 10 también se encuentra coincidencia entre los marcadores
microsatélites ligados a la resistencia con QTLs reportados en otros trabajos. Lanaud et
al (2003) encuentran al DGA PR2/19 en el cromosoma 9 a una distancia de 53,4 cM de
acuerdo al mapa de ligamiento de referencia para el cacao. Este QTL se encuentra muy
cerca del marcador encontrado en este trabajo mTcCIR8 (52,5 cM), evidenciando así
una asociación entre el marcador y el gen PR2/19 implicado en la respuesta de defensa.
Una vez más se afirma la hipótesis de la asociación entre la resistencia y características
morfológicas de las semillas, cuando N´Goran et al, (1997) encuentran para el mismo
cromosoma, el marcador gTcCIR102 (59 cM) ligado a un QTL de longitud de las semillas,
al igual que Marcano, et al (2007) que reporta en esta región, varios marcadores
mTcCIR58 (60,1 cM), mTcCIR142 (47,4 cM) y mTcCIR124 (40,1 cM) asociados a
dimensiones de la semilla.
En el grupo de ligamiento 10 se encuentra asociación entre los marcadores mTcCIR229
(11,9 cM) y mTcCIR223 (72,4 cM). Reportes hechos por N´Goran et al, (1997) indican
que el marcador gTcCIR105 está ligado a la resistencia a Phytophthora spp. en zonas
muy cercanas al mTcCIR229 y Lanaud et al (2003) reportan en esta zona al gen
candidato DGA PT142/D9.
Con respecto al marcador mTcCIR223, asociado a la resistencia a P. megasperma,
Marcano (2007) lo encuentra asociado con diversos caracteres del fruto y de las
semillas, además del color de los cotiledones y de estaminodios.
Los caracteres de la semilla, como dimensiones y color, son parámetros que diferencian
individuos Criollos de Forasteros. Asi como la resistencia a Phytophthora spp. parece
estar favorecida en los híbridos, la pigmentación y el tamaño pequeño de las
almendras, son caracteres típicos de forasteros e híbridos; por el contrario, las semillas
grandes, redondeadas y no pigmentadas, son características de los Criollos, de allí la
relación estadística que puede explicar la ubicación de estos caracteres (resistencia,
dimensiones de la semilla y pigmentación), en algunas regiones genómicas
coincidentes, en las cuales estos caracteres podrían por ende, estar ligados físicamente
o estar asociados por desequilibrio del ligamiento.
Por otro lado, las antocianinas, que producen la pigmentación en diversas estructuras
del cacao, pudieran relacionarse con la resistencia bioquímica constitutiva o
preformada que actúa de manera pasiva al inicio de la infección, lo que explicaría la
resistencia del cacao a especies de Phytophthora localizada en las mismas regiones de
la pigmentación de estructuras del GL 4 y del GL 10.
CONCLUSIONES
Las características morfológicas permitieron identificar, en los aislados utilizados como fuente
de inóculo para las pruebas desarrolladas en el presente trabajo, a Phytophthora megasperma,
lo que fue confirmado mediante pruebas moleculares efectuadas en otro estudio.
La disponibilidad de plantas con el número de mazorcas adecuadas, resulta ser una limitante de
importancia para llevar a cabo pruebas de resistencia de plantas a enfermedades, mediante
inoculaciones en frutos.
La metodología utilizando inoculaciones en mazorcas desprendidas, bajo condiciones de
cámara húmeda, resultó ser eficiente como método para evaluar la resistencia de plantas de
cacao a P. megasperma.
La variabilidad fenotípica observada, confirma el carácter multigénico de la resistencia a
Phytophthora spp. Así mismo se encontró variabilidad en la respuesta fenotípica en cultivares
criollos, lo que sugiere presencia de genes que confieren cierta resistencia en estos cultivares.
Los resultados obtenidos en la resistencia de plantas evaluadas a P. megasperma indican, que
para este patógeno, podría encontrarse incluso un alto nivel de resistencia en algunos árboles
evaluados.
El análisis genotípico de las plantas permitió establecer que los individuos utilizados en el
estudio tienen en su genotipo, un alto grado de contribución del alelo criollo.
El análisis de estructura permitió identificar que 2 subpoblaciones conforman la población
original, lo cual justificó la selección de individuos para obtener una población no estructurada
adecuada para realizar estudios de asociación.
Mediante el análisis de asociación se lograron confirmar, en la población de árboles
seleccionados estudiada, 4 de las 7 regiones previamente reportadas, ligadas a la resistencia a
diferentes especies de Phytophthora y a genes análogos de resistencia y defensa.
En las plantas estudiadas de la población no estructurada, el genotipo híbrido fue encontrado
en mayor frecuencia, asociado a la resistencia.
Se logró comprobar la estabilidad de algunas regiones implicadas en la resistencia a especies de
Phytophthora, siendo éstas coincidentes en otros estudios efectuados con poblaciones de
diversa base genética, mediantes análisis de QTLs.
Se encontraron asociadas a la resistencia a P. megasperma, 2 regiones del genoma
previamente reportadas como asociadas a la pigmentación de distintos órganos de la planta de
cacao.
RECOMENDACIONES
Ensayar inoculaciones en hojas o en disco de hojas con P. megasperma y estudiar si existe una
correlación entre la enfermedad y la resistencia con el objeto de establecer pruebas tempranas
de resistencia a esta enfermedad.
En un análisis que contemplara un mayor número plantas (200-300 árboles) y un número
mayor de marcadores microsatélites (mínimo 50), se podrían identificar otras regiones
asociadas a la resistencia a la enfermedad, propias de las poblaciones venezolanas que portan
mayores introgresiones de alelos Criollos
Ampliar estos trabajos de resistencia de plantas de cacao a enfermedades, a otros patógenos
importantes del cultivo.
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ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVOS PARA EL AISLAMIENTO Y LA CARACTERIZACIÓN DE P. megasperma
Medio Agar Zanahoria
Compuesto Cantidad para 1L
Extracto de Zanahoria 200 g Agar 20 g
Licuar 200 g de zanahoria en 500 ml de agua destilada estéril. Pasar el licuado por un filtro y agregarlo en un recipiente estéril. Agregar agua destilada estéril hasta completar 1000 ml y agregar 20 g de agar. Agitar en caliente por aproximadamente 1 hora y luego esterilizar por 20 minutos.
Medio Agar Papa Dextrosa (PDA)
Compuesto Cantidad para 1L
Agua de papa 500 ml Dextrosa ó glucosa 20 g
Agar 20 g
Agregar 200 g de papa pelada picada en pequeños trozos en un recipiente con 500 ml de agua destilada. Hervir por 30 minutos agitando con una varilla de vidrio. Colar la suspensión con un filtro o colador y agregarla en un recipiente estéril. Completar con agua destilada hasta 1L y agregarle 20 g de agar y agitar por 1h en caliente. Luego agregar 20 g de glucosa y seguir agitando por 1h mas. Esterilizar por 20 minutos.
Medio Agar Mycophil
Compuesto Cantidad para 1L
Harina de soya 10 g Mycophil 36 g Dextrosa 10g
Agar 16 g
Agregar todos los componentes en agua destilada y completar hasta en 1 L, se calienta y se agita hasta que el polvo se disuelva completamente. El medio se esteriliza durante 20 minutos.
Medio agar Jugo V-8
Compuesto Cantidad para 1L
Jugo V-8 200 ml Carbonato de Calcio 3 g
Agar 20 g
Agregar a 800ml de agua destilada 200 ml de jugo de vegetales V-8, 3 g de carbonato de calcio
y 20 g de agar. La mezcla se calienta y agita hasta que los componentes se disuelvan
completamente. El medio se coloca en recipientes apropiados, los cuales se esterilizan durante 20 minutos.
ANEXO 2
ESCALA DE EVALUACIÓN PARA LA PRUEBA DE RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD EN FRUTOS DE CACAO (Iwaro et al, 2006)
ESCALA DE EVALUACIÓN
Rango Nivel de infección Clasificación de susceptibilidad
1 Sin síntomas Altamente resistente a la penetración 2 1-5 lesiones localizadas Resistente 3 6-15 lesiones localizadas Moderadamente resistente 4 >15 lesiones localizadas Parcialmente resistente/resistente a la dispersión de la
lesión 5 1-5 lesiones expandidas Parcialmente resistente/resistente a la penetración 6 6-15 lesiones
expandidas Moderadamente susceptible
7 >15 lesiones expandidas Susceptible 8 Lesiones coalescentes Altamente susceptible
ANEXO 3
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES
ANEXO 3.1. EXTRACCIÓN DE ADN
Soluciones requeridas
“Buffer” de Extracción (para 1L) Concentración Final
Tris HCL 1M pH 8 100 mM NaCL 5M 1,4 mM EDTA 0,5M 20 mM MATAB (Sigma M7635) 2% PEG 6000 (Polyethylenglycol) 1% Sulfito de Sodio 0,5%
“Buffer” de Disolución (para 1L) Concentración Final
Tris HCL 1M 50 mM NaCL 5M 0,7M EDTA 0,5M 10 mM Ajustar a pH 7
Equipos
Baño de María, centrífuga, microcentrífuga, refrigerador -20°C
Otros utensilios: Tubos de polipropileno con tapa de 25 y 50 ml, Mortero y Pistilo de porcelana, pipetas Pasteur para elaboración de ganchos de vidrio, tubos de centrifuga de 1,5 ml.
Procedimiento
Pre calentar el "buffer" de extracción previamente preparado a 74 °C en Baño de María. Pulverizar 0,5 g de tejido foliar en mortero de porcelana, utilizando Nitrógeno líquido y mezclar inmediatamente el tejido foliar con 5 ml de "buffer" de extracción hasta homogeneizar la mezcla e incubar a 74 °C, en Baño de María, durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo, añadir 5 ml de Cloroformo:Alcohol Isoamilico (24:1), mezclar bien (por inversión, 50 veces)
Equilibrar el peso de los tubos conteniendo mezcla en pares, y centrifugar a 8000 rpm durante 15 minutos, a 16 °C para luego transferir el sobrenadante acuoso a un nuevo tubo (en la campana de extracción de gases) y añadir 5 ml de Isopropanol al sobrenadante y mezclar por
inversión, hasta que se pueda visualizar el ADN. El ADN colectado se almacena a -20°C, hasta el día siguiente cuando se recupera el ADN con un gancho de vidrio y se disuelve en agua.
ANEXO 3.2. VISUALIZACIÓN DEL ADN EN GEL DE AGAROSA
Soluciones requeridas
“Buffer” de electroforesis (TBE)
Reactivo Cantidad para 1L
Tris 54g EDTA pH 8 20ml 0,5mM Acido Bórico 27,5 g TBE Gibco BRL Ultrapuro. 10X
“Buffer” de carga
EL “Buffer” de carga o de corrida proporciona densidad a la preparación de ADN, haciendo que esta profundice en el pozo, da coloración a la muestra e indica el desplazamiento del ADN durante la electroforesis. El “buffer” utilizado genera dos bandas de color azul diferentes y su velocidad de migración depende de la concentración de agarosa, del tipo de agarosa y del “buffer” de electroforesis utilizado.
Reactivo Concentración final
Tris, pH8 100mM EDTA 100mM
Azul de Bromofenol 0,25% Xylen Cyanol 0,25%
Sacarosa 50% H2O
Equipos
Equipo de electroforesis horizontal y Fuente de Poder 100V, Mesa de Luz ultravioleta, Cámara fotográfica y trípode.
Otros utensilios: Bandejas para sumergir geles en solución de tinción y agua, espátula o lámina plástica para traslado de geles.
Procedimiento
Consiste en comparar, de manera visual, la concentración del ADN de las muestras obtenidas, con ADN de concentración conocida. El sistema permite, además, comprobar la condición de degradación del ADN. Por comparación con los "standards" de concentración, se determina cuánto debe diluirse el ADN para obtener una preparación de trabajo de 2ng de ADN/µl, que es una concentración conveniente para efectuar PCR.
En un gel de agarosa 0,8%, preparado en "buffer" de electroforesis TBE 1X y agarosa de uso rutinario, se cargan 15 µl de cada una de los "Standards" de concentración y de cada muestra de ADN obtenida. Se monta el equipo de electroforesis y se aplica una corriente eléctrica de 80 Voltios, durante aproximadamente 1 hora y posteriormente se procede a la tinción con Bromuro de Etidio (15 minutos en el Bromuro de Etidio y 15 minutos en agua) y posteriormente, se fotografía el gel.
Preparación de las muestras de ADN
Compuesto Volumen
Muestra de ADN 3 µl Buffer de carga 3 µl H2O 24 µl
Preparación de "Standards" de Concentración
ADN (µl) H2O (µl) “Blue EDTA” (µl) Concentración Final (ng/µl)
1 25 4 20 2,5 23,5 4 50 5 21 4 100
10 16 4 200
ANEXO 3.3. AMPLIFICACIÓN DE MICROSATÉLITES (PCR)
Composición mezcla PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa del ADN)
Reacción (µl) Concentración final
H2O 9,5
"Buffer" 10x * 2,5 1X
dNTPs (2 mM) 0,5 80 µM
MgCl2 (25 mM) 2,0 2 mM
Cebador R (2 µM) 2,5 0,2 µM
Cebador F (2 µM) 2,5 0,2 µM
Taq Polimerasa (2U/µl) 0,5
ADN (2ng/µl) 5,0
25 µl
Perfil Térmico
Desnaturalización Inicial del ADN: 94°C 4 minutos 35 Ciclos de:
Desnaturalización: 94°C 30 segundos Acoplamiento (Tm): 46°C* 30 segundos Extensión: 72°C 1 minuto
Extensión Final : 72°C 10 minutos Conservación: 10 °C
*puede ser 46 °C ó 51 °C, dependiendo de la Tm del cebador
Equipos utilizados:
"Programmable Thermal Controller 96. Model PTC100. MJ Research Inc.” Pipeta Multicanal Pipeta automática de repetición de 10 – 250 ml
ANEXO 3.4. VISUALIZACIÓN DE MICROSATELITES EN AGAROSA
Preparación del gel de agarosa
El gel utilizado en este caso contiene 3 % de agarosa en "buffer" TBE 1X. La agarosa empleada es de uso rutinario.
Preparación de Muestras de ADN
Se añaden 3µl de "Buffer" de carga ("BlueEDTA") al producto amplificado de cada muestra y, de esta preparación, se colocan 15 µl en cada pozo del gel
Condiciones de electroforesis
El "Buffer" de electroforesis es TBE 1X. Se aplica una corriente eléctrica de 120 a 140 Voltios, durante aproximadamente 3 horas y posteriormente se coloca a incubar el gel en una solición de Bromuro de Etidio (10µg/ml).
ANEXO 3.5. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA 6% CON UREA.
Preparación de geles
Preparación de Placas de vidrio
Los vidrios se lavan con una solución de hidróxido de sodio 10% y posteriormente con abundante agua. Una vez secos bien los vidrios, se lavan 3 veces con alcohol absoluto y se dejan secar. Aplicar Repel silano con un papel absorbente al vidrio de repel sobre toda la superficie, y dejar secar 5 minutos. Al vidrio de unión del gel (bind), aplicar con un papel absorvente una solución de 5 µl de Bind + 1000 µl de ácido acético glacial. Dejar secar por 5 minutos y luego de esto esparcir alcohol absoluto con un papel absorbente.
Montar la placa A (ver Figura) sobre una superficie nivelada, con el lado tratado hacia arriba. Colocar dos láminas plásticas (separadores), del mismo grosor del peine que se colocará para colocar las muestras de ADN en el gel, a ambos lados del vidrio y, posteriormente, se coloca la placa B, con el lado tratado hacia abajo. Con pinzas metálicas en cada lado, sujetar ambos vidrios.
Preparación de la Poliacrilamida:
Mezclar 60 ml de Acrilamida 6% con Urea, con 270 ml de Persulfato de Amonio y 90ml de TEMED.
De inmediato, vaciar la mezcla en el espacio entre los dos vidrios, vertiendo la mezcla por la apertura superior de la placa B. Una vez que se llena todo el espacio entre las placas con la mezcla preparada, se coloca en la apertura superior una lámina de plástico (Regleta), con la finalidad de formar una superficie plana en el extremo superior del gel, en la que encajará el peine para el depósito de las muestras de ADN. Esperar al menos 40 minutos, para que polimerice el gel.
Soluciones requeridas
Solución de Acrilamida 6%. Preparación (Para 1 L)
A 250 ml de agua bidestilada caliente añadir la urea, poco a poco, hasta que se disuelva completamente. Añadir el TBE en la solución tibia Bajo campana de extracción de gases y por ultimo añadir la Acrilamida. Enrasar hasta 1 litro. Filtrar toda la solución y embotellar en frascos de1 L y conservar a 10 °C
Acrilamida 6% con Urea
Reactivo Cantidad para 1L
Concentración final
Acrylamide 2X Bisacrylamide 1X al 40%(Eurobio 018808)
125 ml 6 %
TBE 10X (Life Tech 15581069): 50 ml 0,5 X Urea (Merck 1.08488.1000): 453 g 7 M
H2O Bidestilada Hasta 1L
Electroforesis
Montaje del Sistema de Electroforesis
El gel es montado en el aparato de electroforesis vertical de manera que la ventanilla del vidrio B quede en el lado interior del equipo de electroforesis.
Con pinzas plásticas, se sujeta el gel a un lado del equipo,
Verter el "buffer" de electroforesis, en el depósito superior y en el inferior.
Retirar la lámina plástica del extremo superior del gel
Eliminar los restos de acrilamida y las burbujas de aire con la ayuda de una inyectadora
Colocar el peine que moldea el espacio donde va a colocarse las muestras de ADN.
Colocar los electrodos, de manera que el polo positivo corresponda a la parte inferior del gel y el negativo a la superior.
Pre corrida del gel
Esta se efectúa a 120 Wattios (2 geles), por unos 30 minutos.
Preparación de las muestras
Al volumen de producto de ADN amplificado (25 µl) se añaden 5 µl de "buffer" de corrida “Blue Formamide".
Desnaturalización de las muestras de ADN
La desnaturalización de las muestras se realiza en Termociclador a un programa de 94°C por 10 minutos, luego colocar inmediatamente en hielo.
Colocación de las Muestras en el Gel:
Con ayuda de la micropipeta, se coloca un volumen de 5-9 µl de la muestra preparada y desnaturalizada en cada pozo definido por los dientes del peine.
Condiciones de Electroforesis
El "Buffer" de electroforesis es TBE 0,5X y se aplica una intensidad de corriente de 120 Watts, para la electroforesis de dos geles de manera simultánea, durante 90-120 minutos, dependiendo del tamaño de fragmento esperado del microsatélite.
Equipo utilizado:
Equipo de electroforesis Vertical: "Dual Dedicated Height Nucleic Acid Sequencer 33 cm width. Model DDH – 400 – 33. CBS Scientific Co".
Fuente de Poder de 3000V
Termociclador para desnaturalizar el ADN
Esquemas de los vidrios para geles de poliacrilamida
Desmontaje del Gel
Una vez apagada la fuente de poder y haber desconectado los electrodos se vacía el depósito superior del "buffer" de electroforesis, luego se retira el gel, colocándolo horizontalmente sobre una superficie plana. Retirar los separadores y el peine Separar los dos vidrios por una esquina inferior. ANEXO 3.6. TINCIÓN DE LOS GELES CON NITRATO DE PLATA Soluciones requeridas
Solución de Fijación y Stop
Compuesto Volumen
Acido acético 100 ml Agua Hasta 1L
Solución de tinción
Compuesto Volumen
Nitrato de Plata 1 g Formaldehido 3 ml Aguas Hasta 1L
Solución de Revelado
Compuesto Volumen
Carbonato de sodio 30 g Thiosulfato de sodio (2%) 200 µl Formaldehido 1,3 ml Agua Hasta 1L
Procedimiento El gel es colocado en una solución de fijación durante 20-30 minutos. Luego se realiza lavados con abundante agua destilada estéril hasta que desaparezca completamente el olor a ácido acético producto de la solución de fijación. Una vez lavado, se sumerge en solución de tinción (Nitrato de Plata) por 30 minutos aproximadamente en total oscuridad ya que esta solución es fotosensible y se degrada fácilmente en presencia de luz. Una vez transcurrido el tiempo, se sumerge inmediatamente el gel en la solución de revelado hasta que se comience a apreciar la aparición de las bandas de microsatélites, cuando ésto ocurre se debe detener la reacción de revelado con una solución stop con el fin de que el gel no se queme. ANEXO 3.7. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES Tomando en cuenta genotipos de referencias tanto Criollos como Forasteros, se realiza la codificación alélica asignando como alelo a de tipo Criollo y como alelo b al de tipo Forastero, de modo que el híbrido tendrá una codificación alelica tipo ab. Otro alelo que no corresponda con el tipo Criollo ni Forastero tendrá una codificación alelica tipo c.
Figura 30. Lectura e interpretación de la codificación alelica de cada microsatélite
ANEXO 4
Individuo Genotipo
Her2 aa
Her3V aa
02 ab
SP10X aa
P. Rojo aa
UVI01 ab
SP08 Aa
UVI13 bb
C1 bb
PRUEBA DE MEDIAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD DE FRUTOS
DE CACAO (TEST DE DATOS NO PARAMÉTRICOS KRUSKAL Y WALLIS) (XLSTAT 7.5.2)
Análisis estadístico de los datos obtenidos de resistencia de las plantas de cacao a la inoculación por P. megasperma en condiciones de laboratorio. Prueba de medias para datos no paramétricos, Test Kruskal y Wallis. (XlSTAT 7.5.2)
Individuo N Means S.D. Medians
Mean
rank gl H p
ABA01 3 4 1 4 93,0 66 153,09 <0.0001
ABA01X 3 0,67 0,58 1 26,2
ADJ05 3 3 1,73 4 68,8
BEN01 3 5,67 0,58 6 165,0
BEN11 3 4,67 0,58 5 124,2
BEN12 3 5,67 1,53 6 152,2
BEN15 3 4,67 0,58 5 124,2
BEN17 3 4,33 0,58 4 105,3
BEN19 3 0,33 0,58 0 18,8
BEN02 3 3 1,73 4 68,8
BEN21 3 5 0 5 143,0
BEN22 3 5,67 2,08 5 143,5
BEN23 3 5 1 5 135,2
BEN24 3 4 0 4 86,5
BEN26 3 4,33 0,58 4 105,3
BEN28 3 6,67 0,58 7 188,0
BEN29 3 4,67 1,15 4 116,3
BEN04 3 6 1 6 171,0
BEN05 3 4 1 4 93,0
BOC01 3 4 0 4 86,5
BOC12 3 4,67 0,58 5 124,2
BOC14 3 0 0 0 11,5
BOC16 3 4 0 4 86,5
BOC17 3 4,33 0,58 4 105,3
BOC02 3 2,67 2,31 4 61,5
BOC03 3 5,33 0,58 5 154,0
BOC04 3 6,33 0,58 6 182,0
BOC05 3 3 1,73 4 68,8
BOC06 3 4,33 0,58 4 105,3
BOC09 3 6,33 0,58 6 182,0
CAC01 3 0 0 0 11,5
42 3 0 0 0 11,5
81 3 4,33 0,58 4 105,3
CBL04 3 3,67 1,53 4 91,8
CBL05 3 2 1,73 1 51,2
CBL06 3 4 0 4 86,5
H3V 3 3 1,73 4 68,8
HEBP 3 3 1,73 4 68,8
HEP 3 4 0 4 86,5
HER1 3 3 1,73 4 68,8
HER2 3 0 0 0 11,5
2 3 2,33 1,15 3 44,2
4 3 4,67 0,58 5 124,2
LOB13 3 3,33 2,08 4 87,7
LOB38 3 4,67 0,58 5 124,2
P.ROJO 3 6,33 0,58 6 182,0
RA01 3 4,33 0,58 4 105,3
RA05 3 4,33 0,58 4 105,3
SJU01 3 5 3,46 7 140,5
SJU11 3 5 0 5 143,0
SJU12 3 3 1,73 4 68,8
SJU13 3 1 0 1 33,5
SJU14 3 1,67 0,58 2 41,8
SJU15 3 6 0 6 176,0
SJU16 3 0 0 0 11,5
SJU02 3 4,33 0,58 4 105,3
SJU03 3 4 0 4 86,5
SJU4R 3 0 0 0 11,5
SJU05 3 6,33 0,58 6 182,0
SJU06 3 5,67 0,58 6 165,0
SJU07 3 4,67 0,58 5 124,2
SJU09 3 4,67 0,58 5 124,2
SP08 3 5,67 0,58 6 165,0
SP10X 3 7 0 7 194,0
UVI01 3 4,33 0,58 4 105,3
UVI03 3 1 0 1 33,5
UVI13 3 4,67 0,58 5 124,2
ANEXO 5
MATRIZ RESULTANTE DE LA CODIFICACIÓN ALÉLICA DE CADA INDIVIDUO EN LOS MICROSATÉLITES ANALIZADOS
ID
m12
1
m27
2
m8
4
m28
6
m10
0
m26
8
m12
0
m8
2
m16
7
m22
2
m1
7
m
8
m7
9
m22
9
m9
1
m22
3
SJU01 11 13 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
SJU02 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11
SJU03 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
SJU4R 12 12 12 12 12 12 12 11 12 12 12 12 12 12 22 12
SJU05 12 11 11 12 11 11 11 12 11 12 12 11 11 11 11 11
SJU06 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
SJU07 12 13 11 12 11 11 11 11 12 11 11 11 12 12 12 12
SJU09 12 12 11 11 11 12 12 12 11 12 11 11 11 11 11 11
SJU11 12 12 12 12 12 12 12 12 11 12 12 12 11 11 11 11
SJU12 11 12 11 12 11 12 11 11 12 12 11 11 12 12 11 12
SJU13 12 13 11 12 11 11 11 11 12 11 11 12 12 12 11 12
SJU14 12 12 12 12 12 12 11 12 12 11 12 11 11 12 11 12
SJU15 11 13 12 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11 11 12
SJU16 12 13 12 12 11 11 11 11 12 11 12 12 11 12 11 12
BEN01 11 13 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN04 11 13 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN05 11 12 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11
BEN11 11 13 11 11 12 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN12 12 13 11 12 11 12 11 11 12 11 11 11 12 12 11 12
BEN15 11 12 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 12 11 12
BEN17 11 13 12 11 12 11 12 12 11 12 11 11 11 11 11 11
BEN19 12 12 11 12 11 12 11 12 12 12 11 12 12 11 11 12
BEN21 11 13 11 11 12 11 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN22 12 13 12 12 11 12 11 11 12 12 11 11 11 11 11 12
BEN23 11 13 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 12 11
BEN24 11 13 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN26 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11
BEN28 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BEN29 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BOC01 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11
BOC02 11 13 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BOC03 11 13 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11
BOC04 11 13 11 12 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11 13 11
BOC05 11 11 11 12 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11
BOC06 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 12 11
BOC09 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
BOC12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11
BOC14 12 13 11 12 11 12 11 11 11 11 12 11 12 12 12 12
BOC15 11 13 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 12 11
BOC16 11 13 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11 11
BOC17 11 13 11 11 11 11 11 11 11 12 11 11 11 11 13 11
42 11 12 11 11 12 12 11 11 11 12 12 11 11 11 12 12
HER1 12 13 11 12 12 22 11 11 11 22 22 12 12 12 11 11
H3BP 11 22 22 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
81 12 13 11 22 12 12 11 12 12 13 12 22 12 22 12 12
04 11 13 11 12 11 12 11 11 11 12 12 11 11 11 11 12
HER2 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
H3V 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
H3P 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
02 11 12 11 12 12 12 12 12 11 11 12 12 12 12 11 12
SP10X 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
P.
ROJO 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
UVI01 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
SP08 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
UVI13 11 12 12 22 11 12 11 22 11 11 22 11 11 12 11 11
ABA01X 22 11 12 12 12 12 12 12 11 12 12 12 11 12 12 12
CAC01 11 11 12 12 11 12 11 11 11 11 12 11 11 11 11 11
LOB13 11 11 12 12 12 12 11 11 11 11 12 11 11 11 12 11
ADJ05 12 22 12 12 11 11 22 12 11 12 12 12 11 22 12 12
UVI03 12 12 12 12 12 12 12 22 12 12 12 12 12 12 12 12
RA01 22 22 22 22 22 22 22 12 11 22 22 22 22 22 12 22
RA05 22 22 22 22 22 22 22 22 11 22 22 22 22 22 12 22
CBL04 22 11 11 11 11 12 11 11 11 12 12 12 11 11 12 12
CBL05 22 11 12 12 11 12 11 11 11 11 12 11 12 12 11 12
CBL06 11 11 11 11 11 11 12 11 11 12 12 11 11 11 11 12
LOB38 11 12 11 12 22 22 12 12 13 11 12 22 12 33 11 12
ABA01 22 11 12 12 11 12 11 12 11 12 11 11 11 11 22 11
BEN02 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
ANEXO 6
ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DE LA POBLACIÓN.
Anexo 6.1. Resumen análisis del número de subpoblaciónes (STRUCTURE)
Para la inferencia del numero de subpoblaciones (K), se designa un valor de K cada vez que se procesa el programa, comenzando por k=1 hasta k=5. Para cada procesamiento, u valor de (Ln Prob of Data) es estimado.
Se hacen procesamientos independientes con una K mayor cada vez, hasta que los resultados de Ln Prob of Data se estabilizan.
Run parameters: Assumed model Admixture
68 individuals 15 loci 1 populations assumed 1-5 K 50000 Burn-in period 250000 Reps 10 Análisis independientes
K LnP(D)
run1 1 838,12
run2 2 671,88
run3 3 683,18
run4 4 679,88
run5 5 686,86
ANEXO 6.2. APORTE DE INDIVIDUOS A LA CONFORMACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES (STRUCTURE)
Porcentaje de ancestria de cada individuo (Ejemplo de aportede individuos a la conformación de 2 subpoblaciones. STRUCTURE)
Inferred ancestry of individuals:
Label (%Miss) : Inferred clusters
1 SJU01 (0) : 0.022 0.978
2 SJU02 (0) : 0.023 0.977
3 SJU03 (0) : 0.024 0.976
4 SJU4R (0) : 0.959 0.041
5 SJU05 (0) : 0.418 0.582
6 SJU06 (0) : 0.023 0.977
7 SJU07 (0) : 0.897 0.103
8 SJU09 (0) : 0.312 0.688
9 SJU11 (0) : 0.869 0.131
10 SJU12 (0) : 0.908 0.092
11 SJU13 (0) : 0.940 0.060
12 SJU14 (0) : 0.915 0.085
13 SJU15 (0) : 0.202 0.798
14 SJU16 (0) : 0.838 0.162
15 BEN01 (0) : 0.050 0.950
16 BEN04 (0) : 0.049 0.951
17 BEN05 (0) : 0.197 0.803
18 BEN11 (0) : 0.104 0.896
19 BEN12 (0) : 0.888 0.112
20 BEN15 (0) : 0.202 0.798
21 BEN17 (0) : 0.080 0.920
22 BEN19 (0) : 0.918 0.082
23 BEN21 (0) : 0.277 0.723
24 BEN22 (0) : 0.855 0.145
25 BEN23 (0) : 0.050 0.950
26 BEN24 (0) : 0.021 0.979
27 BEN26 (0) : 0.022 0.978
28 BEN28 (0) : 0.023 0.977
29 BEN29 (0) : 0.023 0.977
30 BOC01 (0) : 0.095 0.905
31 BOC02 (0) : 0.023 0.977
32 BOC03 (0) : 0.023 0.977
33 BOC04 (0) : 0.195 0.805
34 BOC05 (0) : 0.099 0.901
35 BOC06 (0) : 0.026 0.974
36 BOC09 (0) : 0.023 0.977
37 BOC12 (0) : 0.040 0.960
38 BOC14 (0) : 0.779 0.221
39 BOC15 (0) : 0.022 0.978
40 BOC16 (0) : 0.025 0.975
41 BOC17 (0) : 0.046 0.954
42 42 (0) : 0.316 0.684
43 HER1 (0) : 0.908 0.092
44 H3BP (0) : 0.038 0.962
45 81 (0) : 0.981 0.019
46 04 (0) : 0.333 0.667
47 HER2 (0) : 0.022 0.978
48 H3V (0) : 0.021 0.979
49 H3P (0) : 0.022 0.978
50 02 (0) : 0.924 0.076
51 SP10X (0) : 0.075 0.925
52 PROJO (0) : 0.024 0.976
53 UVI01 (0) : 0.959 0.041
54 SP08 (0) : 0.187 0.813
55 UVI13 (0) : 0.560 0.440
56 ABA01X (0) : 0.959 0.041
57 CAC01 (0) : 0.371 0.629
58 LOB13 (0) : 0.382 0.618
59 ADJ05 (0) : 0.933 0.067
60 UVI03 (0) : 0.958 0.042
61 CBL04 (0) : 0.590 0.410
62 CBL05 (0) : 0.831 0.169
63 CBL06 (0) : 0.427 0.573
64 ABA01 (0) : 0.759 0.241
65 BEN02 (0) : 0.022 0.978
ANEXO 7
Gráficos de genotipos y nivel de resistencia por cada locus de microsatélites.
(*Asociados a la resistencia a P. megasperma)
aa
abbb
0
2
4
6
8
10
12
ALTAMEDIA
BAJA
aa
ab
bb
aa
abbb
0
2
4
6
8
10
ALTAMEDIA BAJA
aa
ab
bb
aa
abbb
0
2
4
6
8
10
12
ALTAMEDIA BAJA
aa
ab
bb
Figura 31. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR272
Figura 32. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR286
Figura 33. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR268
Figura 34. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR120
aa
abbb
0
2
4
6
8
10
ALTAMEDIA BAJA
aaabbb
aa
ab0
5
10
15
ALTAMEDIA BAJA
aa
ab
aaab
bb
0
2
4
6
8
10
12
ALTAMEDIA BAJA
aa
ab
bb
aa
bb0
2
4
6
8
10
12
ALTA MEDIA BAJA
aaabbbac
a…0
5
10
15
ALTAMEDIA BAJA
aa
ab
aaab0
5
10
15
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
Figura 35. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR82
Figura 36. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR167
Figura 37. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR17*
Figura 38. Asociación entre la
resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR109
Figura 39. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR255
Figura 40. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR190
aaab
bb
0
2
4
6
8
10
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
bb
aa
bb
0
5
10
15
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
bb
aa
bb
0
5
10
15
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
aa0
5
10
15
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
aa
abbb
0
2
4
6
8
10
12
ALTAMEDIA BAJA
aaabbb
aaab0
5
10
15
ALTA MEDIA BAJA
aa
ab
Figura 41. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR55
Figura 42. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR189*
Figura 43. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR8*
Figura 44. Asociación entre la resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR79
Figura 45. Asociación entre la
resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR229*
Figura 46. Asociación entre la
resistencia y genotipo para el
marcador mTcCIR223*
