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REVISIÓN DE ENZIMAS PRESENTES EN LA MIEL Ibagué, 28 de septiembre 2010 INTRODUCCIÓN La miel es una sustancia natural producida por las abejas que tiene como base el néctar de las flores, según Ajlouni y Sujirapinyokul, 2010, su composición es ampliamente influenciada por la región y las condiciones climáticas, así como el sustrato (flores) de las que proviene. La miel como producto natural contiene diferentes enzimas, entre las más importantes podemos encontrar enzimas como amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas y fosfatasas. De acuerdo a lo establecido por Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el 2007, la miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas, que sirven como base para determinar la calidad del producto, entre estos se destacan como lo indica Vold!ich y Rajchl (2009) la actividad de diastasas (α-β- amilasas) y la relación directa de esta enzima con el contenido de Hidrometilfurfural (HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en 2007, indican aldulteracion por adicion de diferentes copuestos

Enzimas presentes en la miel de abejas (Revision)

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Revision bibliografica tipo extenso, acerca de las principales enzimas presentes en la miel de abejas

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REVISIÓN DE ENZIMAS PRESENTES

EN LA MIEL

Ibagué, 28 de septiembre 2010

INTRODUCCIÓN

La miel es una sustancia natural producida por las abejas que tiene como base el

néctar de las flores, según Ajlouni y Sujirapinyokul, 2010, su composición es

ampliamente influenciada por la región y las condiciones climáticas, así como el

sustrato (flores) de las que proviene. La miel como producto natural contiene

diferentes enzimas, entre las más importantes podemos encontrar enzimas como

amilasas, invertasas, glucosidasas, catalasas y fosfatasas. De acuerdo a lo

establecido por Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en el

2007, la miel como cualquier producto alimenticio debe cumplir con ciertas normas,

que sirven como base para determinar la calidad del producto, entre estos se

destacan como lo indica Vold!ich y Rajchl (2009) la actividad de diastasas (α-β-

amilasas) y la relación directa de esta enzima con el contenido de Hidrometilfurfural

(HMF) que según Ureña Varela, Arrieta Bolaños, Umaña, Zamora y Arias Echandi en

2007, indican aldulteracion por adicion de diferentes copuestos tales como: azucar

invertido, jarabe de maíz de alta fructosa, e inclusive la inclusión de enzimas

foráneas; o por sobrecalentamiento y envejecimiento de una muestra de miel.

DIASTASA (α-, β-, γ-, AMILASA)

La α-amilasa (1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa o glucogenasa) tiene la función de

romper las cadenas de almidón al azar produciendo dextrinas y β-amilasa (1,4-α-D-

glucano-maltohidrolasa o amilasa sacarogénica) como se muestra en la grafica:

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Grafica 1: Reacción de la amilasa. Enzimas presentes en la miel (2010)

Según Said Ajlouni y Puripast Sujirapinyokul (2010) el codex alimentario en el año

2010 propone dos indicadores de calidad para la miel, el 5-hidroximetilfurfuraldehido

y la amilasa (número diastasico). Esto ocurre porque la miel es usualmente calentada

para facilitar su procesamiento y mantener su calidad, pero el excesivo tratamiento

con calor genera la formación de HMF, así como la inactivación de las enzimas, lo

que reduce la calidad de la miel. De la misma manera la adición de componentes

como lo mencionan M. Voldrich, A. Raichl, H. Cizkova y P. Cuhra en el 2009, tales

como adición de sacarosa, almidón hidrolizado, jarabe de maíz de alta fructosa o

incluso azucar de mesa, reducen el numero diastasico, pero esta adulteración puede

ser enmascarada por la adción de amilasas foráneas, por ejemplo la amilasa usada

en panadería.

Métodos de detección y cuantificación

Existen diferentes métodos para la detección y cuantificación de la amilasa, en esta

revisión se tocaran diferentes métodos tales como:

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El método tradicional de acuerdo a M. Voldrich, A. Raichl, H. Cizkova y P.

Cuhra en el 2009, llamado procedimiento Schada, mide la actividad de la α-

amilasa, de acuerdo a la cantidad de enzima que puede convertir 0,01 gramos

de almidón hasta un punto final en una hora a 40°C. En este ensayo una

solución de almidón, la cual reacciona con el yodo para producir una solución

que servirá de patrón para la prueba. Esta reacción se explica porque el yodo

se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (en las regiones

hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la α-amilasa actúa,

degrada la amilosa, se desintegra la hélice y la solución de yodo ya no tendrá

el color establecido

Figura 1: Formación del complejo iodo-

almidón en la detección de la actividad

amilasa Imagen tomada de:

(http://chemwiki.ucdavis.edu/index.php?

title=Biological_Chemistry/Carbohydrates/

C ase_Studies/Starch_%26_Iodine)

Según Said Ajlouni y Puripast Sujirapinyokul (2010) una muestra de miel

tratada con calor (5 gramos) es disuelta en 15 ml de agua mili-Q y 5 ml de una

solución buffer de acetato (pH 5.3), es tranferida a un frasco volumétrico de 50

ml que contiene 3ml de solución de cloruro de sodio y se diluye a volumen.

Usando una pipeta volumétrica, 10 ml de solcion de miel son transferidos a un

frasco de 50 ml y colocados en baño de agua a 40°C con un segundo frasco

que contiene 10 ml de solución de almidon al 1%. Despues de 15 minutos, 5

ml de la solución de almidon son agregados a la solución de miel, mesclados y

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temporizados. En intervalos periódicos, por pirmera vez en 5 minutos, alicotas

de 0,5 ml de la mezcla son mezclados con solución de yodo y 22 ml de agua

Mili-Q, e inmediatamente medidos a 660 nm contra un blanco de agua. Una

grafica de absorvancia contra tiempo es usada para determinar el tiempo tn, al

que una absorvancia de 0,235 fue alcanzada.

El número diastasico se calcula siguiendo los patrones de la Comisión Internacional

de Miel (2002), de acuerdo al método Phabedas es el siguiente:

Figura 2: Cálculo del número diastasico. Comisión Internacional de Miel. 2002

INVERTASA

La invertasa (β-D-fructofuranoisdasa, sacarasa, fructohidrolasa), es la enzima

encargada de catalizar la hidrolisis de sacarosa según lo menciona Kotwal y Shankar

(2009), esta enzima se encuantra presente ne las glándulas hipofaringeas dela abeja

de la miel (Apis mielifera), la hidrólisis genera una mezcla equimolar de glucosa y

fructosa, esta es tan dulce como la sacarosa debido al alto grado de dulzura de la

fructosa, lo que indica un incremento del contenido de azucar sin producir

cristalización, asi una de las aplicaciones comerciales más importantes de la

invertasa es la producción de azucares no cristalizables. Debido a su naturaleza

higroscópica, el azucar invertida es usado como humectante en la manufactura de

dulces de centro suave. Esta enzima también es usada en la degradación de

azucares que serán objeto de fermentación, creación de mieles artificiales. El único

inconveniente es el alto valor de producción de esta enzima, la cual en su mayoría es

extraída de bacterias, pero estas poseen muchos inconvenientes como la poca

estabilidad frente a cambios de pH o temperatura.

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Para su determinación y cuantificación, según lo establecido por la comisión

internacional de miel 2002, el procedimiento es el siguiente: 5 gramos de miel en una

solución de buffer (fosfato acido de potasio KH2PO4 y fosfato acido de sodio

dihidratado Na2HPO4.2H2O), y se lleva a 25 ml en un frasco, para luego tratarla en

baño de agua a 40°C por 5 minutos. La prueba se basa en la transformación del

sustrato p-nitrofenil-α-D-gucopiranosa (pNPG) a glucosa y p-nitrofenol y esta

actividad es medida a 400 nm por fotometría.

El cálculo del número diastasico se realiza de acuerdo a lo establecido en la

siguiente ecuación:

Figura 4: Cálculo del número invertasico. International Honey Commission

2002

GLUCOSIDASAS

De acuerdo a Low et al 1988, (mencionado por Pontoh, y Low 2002), proponen que

el origen de esta enzima puede darse en la abeja de la miel, la enzima β-glucosidasa

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esta presente en los sacos de miel y los órganos segregan enzimas digestivas en la

boca. Muchas glándulas descargan secreciones en las partes bucales, por ejemplo

las torácicas, de la cabeza y las glándulas hipofaringeas. En los insectos, la β-

glucosidasa se subdivide en tres clases de acuerdo al sustrato. La clase I incluye

enzimas con actividad β-glucosidasa y aril β-glucosidasa, estas enzimas tiene la

capacidad hidrolizar celubiosa, lactosa, β-p-nitrofenil-glucosidasa (β-PNPG), β-p-

nitrofenilgalactosidasa (β-PNPGal), β-p-nitrofenilfructosidasa (β-pPNPFru) y otros

sustratos similares. La clase 2 incluye solo los que poseen actividad glicosil β-

glucosidasa, sin embargo ella solo puede hidrolizar sustratos con celubiosa y lactosa.

La clase 3 incluye enzimas con solo actividad aril (o alkil) β-glucosidasa, estas

enzimas tiene una actividad similar a la β-PNPG.

La acción de la β-glucosidasa trae consigo la producción de peróxido de hidrogeno

(H2O2), el cual aporta el componente antibacterial a la miel, y este producto se usa

para determinar la presencia de glucosidasas, mediante la producción de peroxido de

hidrogeno. Se toma una muestra de 10 gr de miel y se diluye en 40 ml de agua Mili.Q

a una temperatura de 20ºC. luego de una hora se mide el máximo de peroxido de

hidrogeno producido mediante Marckoquant hydrogen-peroxide testtrips Nr. 10.011.

Se compara el color de la tira con la escala de 0 a 25 mg de peroxido/litro, este valor

se multiplica por 5 para determinar la cantidad de microgramos de peroxido, creados

por 1 gramo de miel en una hora

FOSFATASA ACIDA

Según Alonso-Torre, Cavia, Fernandez-Muino, Moreno, Huidobro y Sancho 2008, la

fosfatasa acida es una enzima que muestar valores relacionados con la fermentación

de la miel, esta enzima presenta una resistencia menor al calor que la diastasa,

invertasa y glucosa oxidasa. La determinación de lo actividad fosfatasa acida es

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hecha mediante un método que determina el fosforo inorgánico producido por β-

glicerol fosfato incubando las muestras 2.25 horas a 35°C.

La actividad fosfatasa acida es determinada por el método de Gunter y Burckhart

1967 (mencionado por Alonso-Torre et al. 2008), este esta basado en la reacion

entre le 4 nitrofenilfosfatode disodio y agua en un pH catalizado por la fosfatasa

ácida. El monto de 4-nitrofenol porducido es medido por espectofotometria a 400 nm.

La actividad es calculada como miligramos de fosforo por 100 gramos de miel en 24

horas.

Figura 5: Cálculo de la actividad de la fosfatasa ácida. Alonso-Torre et al. 2008

CATALASA

Esta enzima tiene una relación directa con el contenido de glucosa oxidasa, ya que el

papel de esta enzima según Weston en el 2000, se encarga de degradar le peróxido

de hidrogeno y convertirlo en agua y oxigeno. Esta enzima se encuantra presente en

el néctar de las flores, pero la cantidad es mínima en comparación con la presente en

el polen, lo que indica que una alta concentración de polen en la miel, tendrá una

relación directa con la disminución del peróxido de hidrogeno.

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REFERENCIAS

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Zamora y María Laura Arias Echandi. Evaluación de la posible adulteración

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con mieles artesanales provenientes de apiarios específicos.

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8. Roderick J. Weston. The contribution of catalase and other natural

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