ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

“Evaluación de la citotoxicidad y

genotoxicidad producida por el aluminio en

linfocitos de la carpa (Cyprinus carpio)”

T E S I S Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

P R E S E N T A:

M . E N C . S A N D R A G A R C Í A M E D I N A

MÉXICO D.F. 2009

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Este trabajo se realizó en los laboratorios de Toxicología Acuática, Departamento de Farmacia y en el

de Genética, Departamento de Morfología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto

Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Eduardo Madrigal Bujaidar y de la Dra. Marcela Galar

Martínez.

El presente trabajo fue posible gracias al apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(Proyecto 57321, Evaluación de la toxicidad producida por metales pesados (Al, Hg y Fe)

encontrados en la presa Madín, Edo. Méx., sobre una especie de interés económico Cyprinus carpio).

Dedicatoria

A mis padres, gracias su apoyo, amor, aliento y por estar siempre conmigo.

A mis hermanas y hermano, por su apoyo y su cariño. En especial a Lucero, gracias por bridarme tu

ayuda y conocimientos.

Agradecimientos

La colaboración de los miembros del comité: Dr. Eduardo Madrigal Bujaidar, Dra. Marcela Galar

Martínez, Dra. Araceli Amaya Chávez, Dra. Rosa Isela Álvarez González, Dra. Elizdath Martínez

Galero y al Dr. Eduardo Madrigal Santillán.

La colaboración de la Dra. Edith Cortés Barberena del Laboratorio de Biología Celular y Citometría

de Flujo de la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa.

A la Central de Instrumentación de Espectroscopia de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas,

IPN, en particular a la Especialista en Microscopía Ma. Esther Sánchez Espindola.

La colaboración y apoyo brindado por mis compañeras del Laboratorio de Toxicología Acuática de la

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, principalmente a Ana Valdés Alanís y Amparo Celene Razo

Estrada.

“Nunca desistas de un sueño, solo trata de seguir las señales que te lleven hasta él.”

Tesis Doctoral

Contenido

Abreviaturas ....................................................................................................................4

Índice de figuras .............................................................................................................6

Índice de tablas ...............................................................................................................8

Resumen ..........................................................................................................................9

Abstract ......................................................................................................................... 11

I. Introducción ............................................................................................................ 13

I. 1. Aluminio .............................................................................................................. 14

I. 1. 1. Propiedades fisicoquímicas y aplicaciones del aluminio .............................. 14

I. 1. 2. El aluminio en los ambientes acuáticos. ........................................................ 15

I. 1. 3. Efectos tóxicos del aluminio. ........................................................................ 16

I. 1. 4. Efectos tóxicos del aluminio en peces........................................................... 18

I.2. Estudios en linfocitos para evaluar efectos tóxicos en peces. .......................... 19

I.3. Ciclo celular. .......................................................................................................... 20

I.4. Apoptosis ............................................................................................................... 23

I.5. Genotoxicidad ....................................................................................................... 24

I.6. Estrés oxidativo ..................................................................................................... 25

I.7. Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) var. rubrofuscus............................................... 27

II. Justificación. ........................................................................................................... 29

III. Hipótesis. ............................................................................................................... 30

IV. Objetivo general. ................................................................................................... 31

IV. 1. Objetivos particulares. ..................................................................................... 31

V. Material y métodos. ................................................................................................ 32

V. 1. Colecta y mantenimiento de la carpa (Cyprinus carpio var. rubufruscus)........ 32

V. 2. Diseño experimental . ........................................................................................ 32

V. 2. 1. Anestesia y obtención de la muestra de sangre de las carpas. ................... 34

V.2.1.1. Toma de muestra .......................................................................................... 34

V.2.1.2. Preparación de la muestra ........................................................................... 35

2

V.3. Ensayo de estrés oxidativo . .............................................................................. 36

V. 3. 1. Evaluación del grado de lipoperoxidación . ................................................ 36

V. 3. 2. Evaluación del nivel de oxidación de proteínas .......................................... 36

V. 3. 3. Evaluación del daño al ADN por estrés oxidativo ..................................... 37

V. 3. 4. Evaluación de la actividad de la superoxido dismutasa ............................. 37

V. 3. 5. Evaluación de la actividad de la catalasa . .................................................... 38

V. 3. 6. Evaluación de la actividad de la glutatión peroxidasa ................................ 38

V.4. Ensayos citotóxicos. ............................................................................................ 39

V. 4. 1. Evaluación del ciclo celular. ......................................................................... 39

V. 4. 2. Evaluación de la apoptosis ............................................................................ 40

V. 5. Ensayos genotóxicos. ........................................................................................ 41

V.5. 1. Evaluación del daño al ADN por citometría de flujo ................................. 41

V. 5. 2. Evaluación del daño al ADN por electroforesis unicelular (cometa). ...... 41

V.6. Análisis estadístico. .............................................................................................. 43

VI. Resultados. ............................................................................................................ 44

VI. 1. Identificación de la población celular. ............................................................ 44

VI. 2. Efecto del aluminio sobre el estrés oxidativo . .............................................. 45

VI. 2. 1. Efecto del aluminio sobre el grado de lipoperoxidación. ........................ 45

VI. 2. 2. Efecto del aluminio sobre los niveles de proteínas oxidadas. .................. 46

VI. 2. 3. Evaluación del daño al ADN por estrés oxidativo ................................... 47

VI. 2. 4. Efecto del aluminio sobre la actividad de la superóxido dismutasa. ....... 49

VI. 2. 5. Efecto del aluminio sobre la actividad de la catalasa. ............................... 51

VI. 2. 6. Efecto del aluminio sobre la actividad de la glutatión peroxidasa ........... 52

VI. 2. 7. Relaciones de la actividad enzimática ......................................................... 53

VI.3. Evaluación de la citotoxicidad .......................................................................... 53

VI. 3. 1. Efecto del aluminio sobre el ciclo celular .................................................. 53

VI. 3. 2. Apoptosis ....................................................................................................... 55

VI. 4. Genotoxicidad ................................................................................................. 60

VII. Discusión ............................................................................................................. 63

VII. 1. Efecto del aluminio sobre el de estrés oxidativo ......................................... 63

3

VII. 2.Citotoxicidad ..................................................................................................... 67

VII. 3.Genotoxicidad .................................................................................................. 69

VIII. Conclusiones ..................................................................................................... 74

IX. Bibliografía ............................................................................................................. 75

4

Abreviaturas

ADN ácido desoxirribonucleico

Al aluminio

ANOVA análisis de varianza

ARN ácido ribonucleico

ATP adenosín trifosfato

CAT catalasa

CDK cinasas dependientes de ciclina

CEM coeficiente de extinción molecular

CF citometría de flujo

CV coeficiente de variación

DI índice de DNA

DMSO dimetil sulfóxido

DNPH 2,4-dinitrofenilhidracina

EDTA ácido etilendiaminotetraacético

EE error estándar

ENDO III endonucleasa III

ROS especies reactivas de oxígeno

Fe hierro

FITC isocianato de fluresceína

FPG formamidopirimidina glicosilasa

FSC luz dispersa frontal

GPx glutatión peroxidasa

GR glutatión reductasa

GSSH glutatión reducido

HEPES 4 (2-hidroxietil) – 1 ácido piperazina etano sulfonico

ID índice de daño al ADN

IP ioduro de propidio

LMP límite máximo permisible

5

LPO lipoperoxidación

MDA malondialdehído

NADPH nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida

PBS amortiguador de fosfatos salino

pH potencial de hidrogeno

POx proteínas oxidadas

PT proteínas totales

RL radicales libres

SH sulfhidrilo

SOD superóxido dismutasa

SSC luz dispersa lateral

TdT desoxinucleotidil transferasa terminal

TUNEL marcación de cortes terminales con dUTP-biotinilados mediada por

TdT

6

Índice de figuras

Número Titulo Página 1 Ciclo celular. 21

2. Cyprinus carpio var. rubrofuscus. 27

3. Diagrama de Flujo de los ensayos de toxicidad con el Al. 33

4. Zona de punción para obtener la sangre de la vena/arteria

caudal en carpa 34

5. Análisis de los linfocitos aislados de las muestras de sangre de

carpa usando FSC/SCC. 44

6. Niveles de LPO observados en linfocitos de carpa expuesta a Al. 46

7. Niveles de proteínas oxidadas observados en linfocitos de carpa

expuesta a tres diferentes concentraciones de Al. 47

8. Determinación del daño al material genético por el ensayo cometa. 48

9. Niveles de daño oxidativo al material genético observados en

linfocitos de carpa expuesta a Al. 49

10. Actividad de la SOD en linfocitos de carpas expuestas al aluminio. 50

7

Número Titulo Página 11. Actividad de la CAT en linfocitos de la carpa expuesta a Al,

0.05, 120 y 239.42 mg/L. 51

12. Actividad de la GPx en linfocitos de carpa expuesta a diferentes

concentraciones de Al. 52

13. Porcentaje de linfocitos en G0/G1 en los grupos experimentales

probados. 56

14. Linfocitos en fase G2 de los peces expuestos a 0.05, 120 y

239 mg/L de Al. 56

15. Porcentaje de células en fase S en los diferentes grupos evaluados. 57

16. Porcentaje de células en fase sub G1 en los diferentes grupos

expuestos a Al. 58

17. Determinación de la apoptosis por TUNEL en linfocitos de carpa. 59

18. Porcentaje de células apoptóticas en los diferentes grupos evaluados. 59

19. Análisis de CF del CV de la células en fase G0/G1 de linfocitos

expuestos a Al . 60

20. Determinación del daño al ADN por el ensayo cometa en

linfocitos expuestos a Al. 62

8

Índice de tablas

Número Titulo Página

1. Relación de la actividad de la SOD/CAT y SOD/GPx en los

linfocitos de carpa expuesta a diferentes concentraciones de Al 54

2. Índice de ADN obtenido por CF en linfocitos de peces

expuestos a Al. 61

9

Resumen

El aluminio es uno de los elementos más abundantes de la naturaleza, es utilizado en diversas

industrias, por lo que, se puede encontrar contaminando ecosistemas acuáticos, produciendo

daños a la biota asociada. Por ejemplo, en peces el aluminio produce hipoxia, hipercapnia,

acidosis metabólica y paro respiratorio. Respecto al daño sobre el ADN y citotoxicidad, existe

poca información en literatura consultada, sin embargo, este tipo de estudios son indispensables

para identificar el o los mecanismos por los que actúa.

La carpa (Cyprinus carpio) es un pez comúnmente empleado en cultivos comerciales y se ha

propuesto como un organismo de prueba para ensayos toxicológicos por su importancia

económica y amplia distribución geográfica.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto citotóxico y genotóxico del aluminio, así

como su posible relación con el estrés oxidativo en linfocitos de la carpa común (Cyprinus carpio).

Para esto, se expusieron a los organismos a diferentes concentraciones del metal (0.05, 120,

239.42 mg/L) durante 12, 24, 48, 72 y 96 h. Pasado el tiempo de exposición se obtuvieron

muestras sanguíneas y se separaron los linfocitos. La apoptosis se determinó mediante la técnica

de marcaje in situ del ADN fragmentado (TUNEL) y por citometría de flujo. Además con esta

última técnica, también se analizó el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular y el daño

cromosómico mediante la variación del contenido del ADN celular. También, se evaluó el daño

al material genético empleando el ensayo cometa. Finalmente se determinaron los niveles de

lipoperoxidación, proteínas oxidadas y oxidación al ADN, así como la actividad de la superoxido

dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa.

10

Los resultados mostraron que el aluminio produjo una notable inducción de la apoptosis, lo que

se asoció con cambios significativos en la distribución del ciclo celular, caracterizados con la

pérdida de células G0/G1 y aumento en G2 y S. Así mismo, se presentó un incremento en el daño

al material genético tanto a nivel cromosómico como rompimientos en las cadenas de ADN. En

cuanto al estrés oxidativo el aluminio modificó la actividad de las enzimas antioxidantes,

incrementó el grado de lipoperoxidación y provocó la oxidación de proteínas y ADN. Estos

resultados ponen en manifiesto la fuerte genotoxicidad y citotoxicidad producida por el aluminio,

así como su relación con el estrés oxidativo.

11

Abstract

Aluminum is one of the most abundant elements of nature, and is used in many industries, so it

can contaminate water bodies, causing damage to the associated biota. For example, in fish

exposed to aluminum may induce hypoxia, hypercapnia, metabolic acidosis and respiratory

failure. There is little information about damages on DNA and cytotoxicity in consulted

literature; however, such studies are essential to identify the source or mechanisms by which it

operates. In the other hand, the carp (Cyprinus carpio) is a commonly used fish in commercial

cultures and it has been proposed as a test organism in toxicity assays since its economical

importance and wide geographical distribution.

The aim of the present work is to evaluate the citotoxic and genotoxic effect of aluminum, as

well as its possible relation to oxidative stress on lymphocytes of the common carp (Cyprinus

carpio). Specimens were exposed to three different concentrations of Al (0.05, 120 and 239.42

mg/L) for 12, 24, 48, 72 y 96 h. Apoptosis was determined by terminal deoxynucleotidyl

transferase mediated dUTP-biotin nick end labelling method and flow cytometry. In addition to

this latter technique, the percentage of cells in each phase of the cell cycle and the damage

chromosome by varying the cellular DNA content were also analyzed. We also evaluated damage

to genetic material using the comet assay. Lipid peroxidation, oxidized protein content, DNA

oxidation and the activity of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were

measured.

The results showed that the lowest concentration of aluminum employed (0.05 mg/L) did not

produce apoptosis in the lymphocytes at the first exposure hours (12 to 48 h). But with time and

12

concentration increasing, a remarkable induction of apoptosis was observed, which was

associated with significant changes in cell cycle distribution, characterized by loss of cells in

G0/G1 and increased in G2 and S. Likewise, high increments in DNA damage at chromosomic

level and double-strand breaks were present in lymphocytes exposed to aluminium. With regard

to oxidative stress, aluminum modifies antioxidant enzymes activity, increases lipidperoxidation

degree and produced protein and DNA oxidation. This work manifests the stronger genotoxic

and cytotoxicity caused by aluminum, probably mediated by induction of oxidative damage.

13

I . I n t r o d u c c i ó n

La contaminación ambiental por metales es uno de los más importantes problemas en el mundo.

Los efectos ambientales de estos contaminantes se han incrementado debido a su uso excesivo

en los procesos industriales, químicos y agrícolas, afectando una gran variedad de organismos

vivos (Chandran et al., 2005).

Los metales se han identificado como los contaminantes más peligrosos en los ecosistemas

acuáticos debido a su persistencia, ya que a diferencia de otros xenobióticos no se pueden

biotansformar, por lo que se acumulan en los diferentes compartimentos acuáticos, potenciando

así su toxicidad (Martínez – Tabche et al., 2000). Los organismos acuáticos se exponen a estos

xenobióticos por las vías oral, dérmica e inhalatoria, a través del alimento, el agua y los

sedimentos. La absorción, acumulación y toxicidad de estos iones y moléculas depende de las

condiciones y concentraciones de exposición, así como de sus especies químicas (Newman et al.,

2001; Baird, 2001).

Dentro de los metales más comúnmente estudiados, se encuentran el mercurio, el plomo, el

arsénico y el cadmio, mismos que han demostrado una gran capacidad tóxica. Otros metales,

como el zinc, el cobre y el hierro aunque son esenciales para los organismos, a altas

concentraciones suelen causar efectos tóxicos (Nordber, 2001; Friberg et al., 1979). En general,

los efectos de estos xenobióticos se deben a que alteran los sistemas enzimáticos celulares, así

como a su interacción con biomoléculas como el ácido desoxiribonucleico, proteínas y lípidos,

además de que son capaces de dañar los mecanismos de regulación de iones (Páez, 1996).

14

Otro metal que se encuentra en los ecosistemas acuáticos es el aluminio, su toxicidad es muy

variable debido a la complejidad de las formas fisicoquímicas que se presentan en solución, por

lo que algunos autores no lo consideran potencialmente tóxico. Sin embargo, en condiciones

especiales como en pH ácidos, suelen formarse especies monoméricas inorgánicas altamente

tóxicas. Actualmente la acidez es muy común en los cuerpos de agua, debido a los vertidos

urbanos e industriales, así como a la lluvia ácida (Poleó y Hytterød, 2003).

I.1. Aluminio

I.1. 1. Propiedades fisicoquímicas y aplicaciones del

aluminio

El Al se localiza en el grupo III A de la tabla periódica, pertenece a la familia de los metales y en

estado puro posee un color plateado característico. Tanto su punto de ebullición (2467 °C) como

de fusión (600 °C) es alto. Su densidad (2.7 g/cm3) es mucho más ligera que la de otros metales.

Es un metal muy electropositivo y altamente reactivo. En contacto con el aire, se forma

rápidamente con una capa dura y transparente de óxido de aluminio que resiste la posterior

acción corrosiva (Schmitz, 2006).

El Al es uno de los elementos más abundantes de la naturaleza, se encuentra combinado con

oxígeno, flúor, sílice, etc., pero nunca en estado metálico. Se emplea en cantidades mucho

mayores que cualquier otro metal no ferroso. En la industria sus usos son extensos, por ejemplo

en la producción de contenedores, en la industria eléctrica y de la construcción, en la

elaboración de medicamentos, alimentos y cosméticos. En particular el sulfato de aluminio se usa

en la industria papelera como mordente, en la elaboración de herbicidas, así como en el

15

tratamiento de aguas (Schmitz, 2006; Callister, 2007).

El Al es un elemento al que se le desconoce una importancia biológica. Sin embargo, sus

propiedades químicas son similares a las de otros dos grupos de elementos con actividad

biológica, por lo que puede sustituirlos fácilmente. El primero de éstos incluye a los metales

divalentes como el magnesio y calcio; el segundo grupo se refiere a los trivalentes como el cromo

y hierro. La inhabilidad de cambiar su valencia le permite tener una conformación geométrica

estable, por ello es capaz de formar enlaces con grupos hidroxilo, oxigeno, nitrógeno y fosfatos

(Martin, 1997).

I.I.2. El aluminio en los ambientes acuáticos

Si bien el Al se encuentra en forma natural en los cuerpos de agua, su exceso se debe

principalmente al vertido de efluentes agrícolas, industriales y domésticos, así como a la lluvia

ácida y al tratamiento de aguas (Michailova et al., 2003; Poleó et al., 2003; Wauer et al., 2004).

En el tratamiento de agua durante la sedimentación de materia orgánica, se agregan agentes

coagulantes como el sulfato de aluminio; éste altera las características superficiales de los sólidos

en suspensión de modo que se adhieren los unos a los otros y precipitan. Debido a este proceso,

se ha observado que al potabilizar el agua empleando sulfato de aluminio, la concentración del Al

se incrementa de 0.016 hasta 1.17 mg/L (DeVoto y Yokel, 1994).

Las concentraciones del Al en el agua dependen de sus propiedades fisicoquímicas, por ejemplo,

a pH de 6 - 8 es poco soluble, pero su solubilidad se incrementa en condiciones ácidas o

alcalinas. Las especies inorgánicas monoméricas del Al son consideradas más toxicas en su forma

16

acuosa (Al3+, AlOH2+, Al(OH)+2) y la proporción de estas formas varía dependiendo del pH y

la temperatura del agua. La formación de complejos con dichas especies iónicas disminuye su

toxicidad y suelen formarse compuestos inorgánicos y salicilatos, así como con materia

orgánica. La fuerza de estas uniones está mediada por el pH y la temperatura (Poleó y

Hytterød, 2003).

En México, la presencia de Al en estados como Baja California Sur, Campeche, Michoacán y

Tabasco suele estar por arriba del Criterio de Calidad del Al para la protección de la vida acuática

el cual es de 0.05 ppm para agua dulce y de 0.2 ppm para agua marina (SEMARNAP, 2000). El

laboratorio de Toxicología Acuática de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas y la

Universidad del Estado de México analizaron las concentraciones del metal en la presa Madín,

localizada en el Estado de México, los resultados mostraron tanto en el agua como en el

sedimento altas concentraciones del metal (120 ppm y 239.42 ppm respectivamente).

I.1.3. Efectos tóxicos del aluminio

En una gran diversidad de especies, principalmente en mamíferos, se ha demostrado que el Al es

inmunotóxico, neurotóxico, nefrotóxico, hepatotóxico y hematotóxico (Ward et al., 2006; Klein,

2005; Stacchiotti, 2006).

Los mecanismos de toxicidad del Al son desconocidos; sin embargo, se ha propuesto que éste es

un agente oxidante indirecto y su capacidad de formar complejos con diversos grupos

funcionales como los SH, puede producir daños en biomoléculas como lípidos, proteínas y

ácidos nucleicos. Además, este metal es capaz de sustituir iones como calcio, potasio,

magnesio, hierro, cobre y zinc en las células (Becaria et. al., 2002; Wu et. al., 2005; Vázquez et. al.,

17

2000; Goyer, 1997).

Respecto a su actividad genotóxica, los datos encontrados hasta el momento sugieren que el Al

puede inducir indirectamente daño al ADN ya que modifica la estructura de la cromatina,

generar especies reactivas de oxígeno o por medio de la ADNasa que es liberada cuando hay

daño en las membranas lisosomales (Banasik et al., 2005; Lankoff et al., 2006). También se ha

observado que puede ocasionar daño debido a su interacción directa con el ADN. La formación

de ADN-Al3+ ha sido detectada por medio de espectroscopía de fluorescencia y calorimetría en

células de timo bovinas (Wu et al., 2005). Dicho fenómeno puede deberse a que el aluminio es

atraído fuertemente al grupo fosfato del ADN, especialmente al material genético rico en adenina

y timina (tejido cerebral) como resultado de su alta densidad electrónica (Lukiw, 2001).

Además, el Al puede generar estrés oxidativo indirectamente debido que es capaz de estimular la

lipoperoxidación mediada por Fe y desencadenar una cascada de generación de RL. Se ha

demostrado que estos RL son capaces de activar y habilitar los factores nucleares de

transcripción (NF-kB) induciendo genes que desencadenan procesos pro-inflamatorios y

apoptóticos, por lo que el aluminio es citotóxico (Lukiw, 2001). También se ha observado que

puede alterar las el ciclo celular en linfocitos humanos, siendo más sensible a sus efectos durante

la fase G0/G1 que la S o G2 (Banasik et al, 2005). En diferentes células expuestas a este metal se

provoca un incremento en la expresión del gen p53, lo que sugiere que las rutas intrínsecas

dependientes de éste son responsables de la apoptosis inducida por el Al (Johnson et al, 2005).

18

I.1.4. Efectos tóxicos del aluminio en peces

En diversos estudios realizados en peces expuestos a Al se han observado diversos efectos

nocivos sobre las branquias. El aumento en la producción de mucosidad en esta zona, modifica

la osmoregulación y los procesos respiratorios de los peces y algunos autores atribuyen a este

fenómeno el cambio de conducta que suele presentarse en estas condiciones (Exley et al., 1997;

Ward et al., 2006). Uno de los cambios de conducta más evidentes es la reducción del nado (se

mantienen estáticos) como consecuencia de un bajo nivel de oxígeno y energía. Si las

concentraciones del Al no se reducen en pocos días, el organismo muere (Allin y Willson, 2000).

Otros de los efectos que como consecuencia de la exposición a Al se observan en las branquias

son hipoxia, hipercapnia, acidosis metabólica y por último, paro respiratorio.

El aumento en la concentración plasmática de glucosa y la disminución de cloro en plasma se

han presentado en peces como el Salmon truta L y también son atribuidos a la interacción del Al

con las branquias (Royset et al., 2005). La hiperglicemia va acompañada de una reducción de

glucógeno hepático como consecuencia del estrés ocasionado por el metal (Wedneyer et al.,

1990).

Dentro de los cambios hematológicos presentados por peces expuestos al toxón se incluyen un

incremento del hematocrito y fluctuaciones del volumen corpuscular medio. Se ha reportado

también microcitosis debida a la presencia de eritrocitos inmaduros, lo que indica un efecto sobre

los tejidos hematopoyéticos. Lo anterior ocasiona una reducción de las células rojas sanguíneas y

decremento en la concentración de hemoglobina (Bhagwant y Bhikajee, 2000). Las alteraciones

morfológicas de eritrocitos es otro de los efectos observados en peces como el pez gato, estos

19

efectos se atribuyen a la fragilidad del citoesqueleto y defectos en la estructuras de las proteínas

ocasionadas por el Al (Nasker et al., 2006).

Por último, el Al es neurotóxico en varias especies de peces, principalmente en salmónidos, ya

que se ha observado que son extremadamente sensibles al metal. La histopatología de su tejido

cerebral es similar a la observada en humanos expuestos al metal que presentan patologías

características de la enfermedad de Alzheimer (Exley, 1996).

I. 2. Estudios en linfocitos para evaluar efectos tóxicos en peces

Al igual que en los eritrocitos, este xenobiotico es capaz dañar a las células blancas sanguíneas,

por lo que se presenta una disminución en la actividad inmunológica, aunque existen pocos datos

en este respecto (Ward et al., 2006).

Aunque los estudios citotóxicos y genotóxicos en linfocitos no se aplica de manera rutinaria en

los peces su interpretación es de gran ayuda para evaluar el estado de salud de los organismos y

los efectos de los contaminantes.

Los linfocitos pueden variar en tamaño (4.5 a 12 m de diámetro) dependiendo de la especie. En

su morfología domina el núcleo con solo una pequeña brecha del citoplasma basofílico en el cual

se encuentran pocas mitocondrias y ribosomas. El número de estas células varía dependiendo de

la especie, en promedio se ha cuantificado que un organismo sano cuenta con cerca de 12 x

103/mm3. La principal función de estas células es actuar como un mecanismo inmune específico

por medio de la producción de anticuerpos (Moyle y Cech, 1999).

20

Como los linfocitos se pueden obtener con facilidad en gran número, son células ideales para

determinar los efectos tóxicos de agentes contaminantes. En circulación se encuentran en fase de

no división G0/G1, por lo que al cultivarlos es fácil estimular su división mitótica. Otra razón

para que estas células se puedan emplear en estudios toxicológicos es que poseen una amplia

distribución, ya que son capaces de recircular entre la sangre y los tejidos extravasculares

(linfocitos T), por ello pueden reflejar los efectos de la exposición en cualquier área del

organismo (Hudson et al., 1998).

En la literatura existen pocos trabajos que demuestran, tanto in vitro como in vivo, daños sobre las

poblaciones de linfocitos en distintas especies de peces, en respuesta a agentes contaminantes,

pero se han reportado efectos producidos por plaguicidas, hidrocarburos policíclicos aromáticos

y metales (Harford et al., 2005; Reynaud et al., 2003; Reynaud et al., 2004; Reynoud y Deschaux,

2005; Betoulle et al., 2002; Dethloff et al., 1999; Dethloff et al., 2001).

I.3. Ciclo celular

El ciclo celular es el proceso por el cual la célula crece y duplica todas sus estructuras, incluyendo

la información gética, para finalmente dividirse y dar origen a dos células hijas idénticas que

repiten el proceso (fig. 1). Este empieza a partir de una célula que posee una cantidad muy baja de

ATP, por lo que, la célula inicia una acumulación de ATP e incrementa su tamaño, eventos que

ocurren durante la fase G1 que es la parte más larga del ciclo. Una vez que la célula tiene

suficiente ATP y un tamaño adecuado se comienza la síntesis de ADN (replicación). En esta

etapa denominada S, se obtiene una copia del ADN original. El proceso de síntesis consume

una gran cantidad de ATP, por lo que es necesario un segundo periodo de acumulación de

21

energía, denominada fase G2. La energía adquirida de la fase G2 es empleada para el proceso de

mitosis. La progresión ordena de las células a través de las diversas fases depende de las ciclinas,

las CDK e inhibidores de las CDK. Las CDK se encuentran presentes en el ciclo celular, sin

embargo, solo se activan al ser fosforiladas tras la unión de las ciclinas. En contraste, las ciclinas

se sintetizan durante fases específicas del ciclo. Se han identificado más de 15 ciclinas; entre estas

tenemos las D, E, A y B, las cuales se unen a las CDK4, 2, 2, 1 respectivamente, en las etapas G1,

S, G2 y M. La actividad de los complejos ciclina-CDK está regulada por los inhibidores de CDK.

Existen dos clases principales, las familias Cip/Kip (p21, p27 y p57) y las INK4/ARF, su

función es la de inactivar los complejos ciclina-CDK (Kumar et al., 2005).

Fig. 1. Ciclo celular. Fuente: Kumar et al., 2005

22

El ciclo celular depende de la eficiencia en la transición de sus fases. Durante procesos de estrés,

es común que las células entren en pausa (puntos de control) hasta que se repara o, si el daño es

excesivo, la célula recibe instrucciones de morir por muerte celular programada (apoptosis). El

primer punto se presenta en G1/S en este momento se definen las condiciones adecuadas para la

replicación, etapa que se denomina G1 – “arrest”. Si existe un daño al ADN, los sistemas de

reparación se activan, retrasando la progresión del ciclo; si el daño es irreparable, se activan las

vías apoptóticas. Esto impide la replicación de células que tienen daños en el material genético

como mutaciones o rompimientos cromosómicos. El segundo punto se presenta en G2/M,

donde se establece si el proceso de replicación del ADN fue exitoso y en caso negativo se

desencadenan eventos para eliminar estas células (G2-“delay”). Cuando se activan los procesos de

reparación del ADN durante la replicación, la fase S avanza muy lentamente, mientras que si se

interfiere con los procesos mitóticos, suele presentarse una pausa en la metafase para prevenir

una distribución asimétrica de los cromosomas. Para funcionar adecuadamente, los puntos de

control incluyen sensores daño, como proteínas de la familia RAD, y traductores, las familias

CHK cinasa. Las moléculas efectoras de los puntos de control difieren dependiendo del la etapa,

en G1/S, la detención del ciclo celular depende principalmente por p53, que induce al inhibidor

del ciclo celular p21. La detención del ciclo de la célula por el punto de contro G2/M implica

mecanismos dependientes e independientes de p53. No obstante, la prolongación del tránsito en

el ciclo celular contribuye a la supresión del crecimiento celular (Kumar et al., 2005; McCollum et

al., 2006).

23

I.4. Apoptosis

La apoptosis o muerte celular programada es un proceso fisiológico, diferente al de la muerte por

necrosis. En esta última las células se lisan como resultado de lesiones agudas. En contraste, la

apoptosis es un proceso activo que se caracteriza por una disminución del tamaño de la célula,

donde se condensa la cromatina y se mantiene la integridad de la membrana formando “cuerpos

apoptóticos”, los cuales son reconocidos por fagocitos y posteriormente eliminados.

El daño al ADN induce la expresión de la proteína p53. El incremento en la actividad del P53

provoca la expresión de las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 (Bax y PUMA), las

cuales tienen como blanco la mitocondria en donde se induce al citocromo C. Este compuesto

sale de la mitocondria y activa la cascada de caspasas, las cuales desencadenan los procesos

apoptóticos (Macip et al., 2003).

La célula apoptótica presenta es redonda u oval y tiene un citoplasma fuertemente eosinófilo,

con fragmentos de cromatina nuclear densa. La constricción celular y la formación de cuerpos

apoptóticos tienen un comienzo abrupto y una duración corta. En promedio, los cuerpos

apoptóticos suelen permanecer en tejidos de mamíferos un lapso de 2 horas hasta que son

fagocitados y degradados. Por otro lado, la apoptosis, al contrario de la necrosis, no induce una

respuesta inflamatoria, por lo que se dificulta su detección desde el punto de vista histológico.

Debido a esto, uno de los métodos que suelen usarse para la identificación de células en

apoptosis es el marcaje in situ del ADN fragmentado o técnica de TUNEL (Formigari et. al.,

2007). Esta técnica se basa en el marcaje de los extremos 3’OH libres generados durante la

fragmentación del ADN en la muerte apoptótica. El marcaje se hace con nucleótidos acoplados a

24

FITC, debido a la enzima TdT (Negoescu et al., 1997).

I. 5. Genotoxicidad

La Genética Toxicológica puede definirse como el estudio de los xenobióticos que inducen

cambios en el material genético y contempla dos aspectos:

1. Identificar los contaminantes que puedan alterar al ADN.

2. La consecuencia de la progresión y expresión del daño al ADN en genes mutados,

que pueden ser hereditarios.

La detección y cuantificación de dichos eventos puede emplearse como biomarcadores en

organismos expuestos.

Esta disciplina debe de enfocarse en tres niveles:

1. Identificar el grado y frecuencia de las enfermedades genéticas.

2. Evaluar los posibles agentes que puedan generar un daño genético.

3. Estudiar los mecanismos de acción de los tóxicos que causan desórdenes genéticos

(van der Oost et al., 2003).

Muchos contaminantes pueden causar lesiones en el ADN de organismos acuáticos, incluyendo

rompimientos, modificaciones en las bases y entrecruzamientos, causando efectos adversos en la

estabilidad del ecosistema, por lo que en los últimos años, técnicas como el ensayo cometa y la

determinación del contenido del ADN, así como la identificación de aneuploidias por

25

citometría de flujo, han resultado excelentes herramientas para detectar daños al ADN en

especies acuáticas (Bihari et al., 2003; Kim y Hyun, 2006).

En el caso del ensayo cometa se puede evaluar el daño al ADN en células individuales,

incluyendo rompimientos simples o dobles, sitios álcali lábiles y la escisión incompleta de los

eventos de reparación. Esta técnica posee una alta sensibilidad, por lo que es ampliamente usada

en el área de genética toxicológica y como biomarcador ambiental (Guecheva et al., 2001).

También se han incorporado al ensayo endonucleasas para detectar bases oxidadas, como la

FPG y la ENDO III, dichas enzimas reconocen a las bases nitrogenadas púricas y pirimídicas

oxidadas respectivamente (Migliore et al., 2002).

Mediante la CF se pueden evaluar los daños causados en el ADN, al ciclo celular y la inducción

de apoptosis utilizando flourocromos en solución capaces de unirse estequiométricamente al

ADN y ARN de las células. Estas sustancias se intercalan en la doble hebra de los ácidos

nucleicos (ioduro de propidio, bromuro de etidio, naranja de acridina, etc), por lo que es posible

evaluar el contenido de ADN y las diferentes fases del ciclo celular (Castillo et al., 1999).

I. 6. Estrés oxidativo

Tanto el daño al ADN como la citotoxicidad se han relacionado con un aumento en la

producción de especies reactivas de oxígeno, en particular, en estudios realizados en carpas se ha

observado una alta sensibilidad en biomarcadores de estrés oxidativo como resultado de la

exposición a diversos contaminantes ambientales (como metales, plaguicidas e hidrocarburos)

(Huang et al., 2007; Oruc y Usta, 2007).

26

Las ROS incluyen al peróxido de hidrógeno, radical óxido nítrico, radical anión superóxido,

radical hidroxilo y peroxinitrito. Dichas especies se han relacionado con la regulación de eventos

celulares, tales como la activación de factores de transcripción, expresión de genes, la

diferenciación y proliferación celular (Park et al., 2007).

Las ROS se puede forman de la reducción univalente del oxígeno durante la respiración celular

en la mitocondria. Estos compuestos son extremadamente reactivos, ya que su generación puede

dar como resultado daños en biomoléculas, tales como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, por

lo que el organismo ha desarrollado sistemas antioxidantes que regulan la cantidad de ROS. Este

sistema antioxidante incluye enzimas como la SOD, CAT, GPx y GR, entre otras. También

existen compuestos antioxidantes no enzimáticos como el glutatión, acido ascórbico, -

carotenos, - tocoferol, etc. (Sureda et al., 2006).

El desbalance entre la producción de ROS y las defensas antioxidantes es denominado estrés

oxidativo. Este fenómeno genera cambios importantes a nivel bioquímico y fisiológico, por lo

que existen biomarcadores tanto enzimáticos como moleculares que son usados en la evaluación

de la toxicidad de diferentes xenobióticos ambientales en peces (Almroth et al., 2005). Dentro de

los parámetros evaluados se encuentran los niveles de LPO, actividad de enzimas antioxidantes

(SOD, CAT, GPx), oxidación de proteínas (formación de carbonilos reactivos), contenido total

de glutatión (Chen et al., 2006; Song et al., 2006; Lushchak et al., 2005; Arabi, 2004).

27

I. 7. Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) var. rubrofuscus

La carpa común, variedad rubrofuscus (fig. 2) es un pez de agua templada a semifría, que soporta

poco oxígeno y altos niveles de pH, amoniaco, nitratos, nitritos y fosfatos. Este organismo fue

introducido en México en los años 60’s debido a la conveniencia de cultivar una especie

comestible barata y de fácil manejo.

La carpa barrigona, como es llamada frecuentemente, es una variedad bentónica, come tanto

animales como vegetales (omnívora). Fue desarrollada a partir de la carpa común con el objetivo

de obtener una mayor cantidad de carne. Comúnmente es empleada en cultivos comerciales y se

ha propuesto como un organismo de prueba para ensayos toxicológicos por su importancia

económica y amplia distribución geográfica (Aguilera et al., 1986).

Figura 2. Cyprinus carpio var. rubrofuscus.

Su clasificación taxonómica fue realizada por Linnaeus en 1758 y se muestra a continuación:

Nombre común: Carpa barrigona.

Orden: Cypriniformes

28

Superfamilia: Cyprinoidea

Familia: Cyprinidae

Género y especie: Cyprinus carpio.

Variedad: rubrofuscus.

29

II. Justificación

En las últimas décadas las concentraciones de aluminio se han incrementado significativamente

en el ambiente, en particular en los ecosistemas acuáticos (Allin y Wilson, 2000). Este metal llega

a los cuerpos de agua a través de los desechos de las plantas de tratamiento de agua, así como de

las descargas industriales y domésticas, y posteriormente entra en contacto con los organismos

acuáticos.

Por otro lado, la carpa es un pez de importancia comercial, por lo que si este organismo es capaz

de bioconcentrar contaminantes, puede ser una fuente de exposición importante para las

poblaciones que lo ingieren.

Existen pocos datos del efecto tóxico del aluminio en los linfocitos de peces, en particular

enfocados a la citotoxicidad y genotoxicidad. La mayoría de estos estudios se han realizado en

mamíferos, sin embargo, la evaluación y caracterización de los efectos tóxicos de este metal en la

carpa permitirá predecir y regular la disposición de este agente contaminante en los cuerpos de

agua.

30

III. Hipótesis

El aluminio es un agente prooxidante indirecto en mamíferos, por lo que es probable que

también produzca estrés oxidativo en carpas, y que este efecto se refleje en modificaciones en los

niveles de oxidación de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, y en la actividad de enzimas

antioxidantes como la superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa.

Si el aluminio produce estrés oxidativo en carpas es posible que actúe como agente citotóxico y

genotóxico, por lo que se incrementara el número de células apoptóticas en estos organismos,

producirá modificaciones en las etapas del ciclo celular y daños al material genético.

31

IV. Objetivo general

Determinar los efectos citotóxico y genotóxico producidos por el Al3+ en linfocitos de la carpa

barrigona (Cyprinus carpio, var. rubrofuscus).

IV. 1. Objetivos particulares

Establecer si el aluminio produce estrés oxidativo en linfocitos de carpas expuestas

durante 96 h, mediante la determinación de biomarcadores de estrés oxidativo.

Determinar el efecto citotóxico producido por el aluminio en linfocitos de carpas

expuestas durante 96 h, mediante la determinación del porcentaje de células apoptóticas.

Evaluar el efecto genotóxico producido por el aluminio en linfocitos de carpas expuestas

durante 96 h, mediante la determinación del daño al ADN por medio del ensayo cometa

y por CF.

32

V. Material y métodos

V. 1. Colecta y mantenimiento de la carpa (Cyprinus carpio var.

rubufruscus)

Las carpas se transportaron del centro acuícola carpícola de Tezontepec de Aldama, Hidalgo a la

Ciudad de México. Se aclimataron y distribuyeron en peceras de vidrio de 120 L (12 peces en

cada una). Se colocaron sistemas de filtración para mantener el agua limpia y favorecer la

circulación y aireación. Se mantuvieron a temperatura ambiente, con ciclos de luz obscuridad

natural y se alimentaron diariamente con alimento de alta calidad para tilapias (Pedregal Silver

CorpMR).

El peso de los organismos empleados para los estudios fue de 201.71 + 7.8 g y una longitud de

18.39 + 0.31 cm.

V. 2. Diseño experimental

Los peces fueron aclimatados por dos semanas antes de la realización del estudio.

Posteriormente, se formaron 4 lotes de 6 carpas cada uno en acuarios de plástico de 20 L de

capacidad, con aireación constante y ciclos de luz-oscuridad naturales y fueron expuestas a

diferentes concentraciones de sulfato de aluminio: 0.05, 120.00 y 239.42 mg/L, la primera

representa el LMP del criterio ecológico de la calidad de agua para la protección de vida acuática

(SEMARNAT, 2000), y a las ultimas son equivalentes a las encontradas en el agua y sedimentos

de un embalse mexicano (presa Madín) respectivamente. También se contó con un grupo testigo.

Transcurridas 12, 24, 48, 72 y 96 h, se obtuvieron muestras de sangre por punción de la

arteria/vena caudal, los linfocitos se separaron y se evaluó el estrés oxidativo, la citotoxicidad y la

33

genotoxicidad (fig. 3).

Figura 3. Diagrama de flujo de los ensayos de toxicidad con el Al.

34

V.2.1. Anestesia y obtención de la muestra sanguínea de las carpas

Una vez transcurrido el tiempo de exposición, los peces se introdujeron en un contenedor donde

se anestesiaron por inmersión. El anestésico empleado fue xilocaína a una concentración de 0.02

mg/mL (AztraZeneca).

V.2.1.1. Toma de muestra

Cada pez anestesiado se colocó en posición lateral y se procedió a realizar la punción de la

vena/arteria caudal con una jeringa de 5 mL, humedecida con heparina (PROPARIN® 5000).

La punción se realizó lateralmente, cerca de la base del pedúnculo caudal, a la altura de la mitad

de la aleta anal, en posición ventral a la línea lateral (fig. 5).

Una vez obtenida la sangre (1-1.5 mL), el pez se colocó en un contenedor con agua limpia, se

bombeó agua a través de la boca hasta su recuperación y se regresaron al acuario.

Figura 4. Zona de punción para obtener la sangre de la vena/arteria caudal en carpa.

35

V.2.1.2. Preparación de la muestra

Los linfocitos de las muestras sanguíneas se separaron utilizando un gradiente de sedimentación

para células monoclonales (Lymphoprep - Gybco) utilizando una proporción de 1.5:1; para

después centrifugar a 900 g durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron con PBS (Sigma) y

se centrifugaron a 1000 g por 10 minutos a 4°C dos veces. El botón de linfocitos se conservó

dependiendo del tipo de estudio.

Para la determinación de los biomarcadores de estrés oxidativo y proteínas totales el botón de

células (proveniente de 1.5 mL de sangre) se suspendió con PBS hasta obtener una

concentración de 1 x 109. Posteriormente las células se homogenizaron con un ultrasonicador

(Cole Parmer) durante 5 min y se conservaron a –70°C hasta el día de su análisis.

Se comprobó que las células separadas fueran linfocitos mediante una tinción de hematoxilina

(Merck) y obteniendo los histogramas de FCS contra SSC de las células analizadas por CF. El

FCS identifica la superficie celular y el tamaño, mientras que SSC indica la complejidad interna y

la granularidad de la célula.

Para la evaluación de la genotoxicidad y citotoxicidad el botón (proveniente de 1.0 mL de sangre)

se disolvió en PBS (1 x 106) y se dividió en tres partes: para el ensayo cometa se tomaron 100 L

de linfocitos y se adicionaron 100L de suero fetal bovino con DMSO al 15% (Sigma) y se

conservó a –70 °C hasta su análisis. Para la apoptosis se tomaron 100 L de los linfocitos y se

mezclaron con 1 mL de la solución conservadora del kit para citología líquida (Productos

Biológicos de México). Finalmente, para el estudio de citometría de flujo se adicionaron a 100 L

36

de la suspensión celular a 1 mL de etanol a 4°C. Tanto para determinación de apoptosis por

TUNEL y las muestras para CF se conservaron a 4 °C hasta el día de su análisis.

V.3. Ensayo de estrés oxidativo

V.3.1. Evaluación del grado de lipoperoxidación

El grado de LPO se cuantificó mediante la determinación de la concentración de MDA – uno de

los productos finales de la LPO – por el método de Buege y Aust (1979). Se tomaron 300 L de

los linfocitos y se completaron a 1mL con buffer Trizma-acido clorhídrico pH 7.4, se agregaron

2 mL del reactivo ácido tricloroacético al 15 % (w/v) con ácido tiobarbitúrico al 0.375 %

(Sigma). Posteriormente se calentó a 37°C durante 45 min, se dejó enfriar y se removió el

precipitado por centrifugación a 3000 rpm durante 5 min (Beckman Coulter, Allegra® 64R). Se

determinó la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro visible/UV (Beckman Coulter,

DU® 800) a 535 nm contra un blanco de reactivo. Los resultados se expresaron en mM de

MDA /mg proteínas/g tejido usando el CEM del MDA el cual es de 1.56 x 105 M-1cm-1.

V.3.2. Evaluación del nivel de oxidación de proteínas

El contenido de POx se determinó mediante el procedimiento de Levine et al. (1994), modificado

por Floor y Wetzel (1998) y Parvez y Raisuddin (2005). Se tomaron 300 L de la suspensión de

linfocitos y se centrifugaron a 12,500 rpm por 15 min; posteriormente, se tomaron 100 L del

sobrenadante y se adicionaron 150 l de 10mM de DNPH (Sigma)/2M acido clorhídrico

(Merck). Se incubó durante 1 h a oscuridad. Después de la incubación se adicionaron 500L de

ácido tricloroacético al 20 % y se dejó reposar durante 15 min a 4 °C. El precipitado de las

37

proteínas se colectó por centrifugación a 11,000 rpm por 3 min. El botón se lavó tres veces con

etanol–acetato de etilo 1:1 (Tecsiquim) y posteriormente se disolvió en 150 L de una solución

de guanidina (6M, pH 2.3, Sigma) y se incubó a 37 °C por 30 min. La absorbancia se determinó

a 366 nm. Los resultados se expresaron en mM o nM de carbonilos reactivos (C=O)/mg

proteínas usando el CEM el cual es de 21 000 M-1 cm-1.

V.3.3. Evaluación del daño al ADN por estrés oxidativo

La oxidación del ADN se evaluó mediante la determinación de los sitios sensibles a la FPG y la

ENDO III mediante el ensayo cometa modificado por Lankoff et al. (2006). El procedimiento

del ensayo se siguió tal como se indica en el inciso V.2.3.2., con la única diferencia que después

de la lisis, las muestras se lavaron con un amortiguador de 40mM HEPES, 0.1M de cloruro de

potasio, 0.5 mM EDTA a pH 8.0 (Sigma) y 0.2mg/mL de suero fetal bovino durante 5 min. Se

incubaron las laminillas con 50 L de FPG o ENDO III a 1g/mL (Sigma) durante 45 minutos

a 37 °C. Cada enzima se incubó por separado y se contó con un control interno para cada grupo,

el cual se incubó con 50 L del amortiguador de lavado.

El nivel de sitios sensibles a FPG o ENDO III se obtuvo por la diferencia de los índices de daño

entre los núcleos que se incubaron con las enzimas y el control interno.

V.3.4. Evaluación de la actividad de la superóxido dismutasa

Se utilizó el método de Misra y Fridorich (1972), en donde la habilidad de la SOD para inhibir

la autooxidación de la adrenalina a pH 10.2, es la base de la prueba. Se centrifugaron 50 L de los

linfocitos ozonificados a 12, 500 rpm durante 15 min. a 4 °C. Se tomaron 20 L del

38

sobrenadante y se le adicionaron 130L de una solución amortiguadora de carbonatos (50 mM

de carbonato de sodio y 0.1 mM EDTA a pH 10.2, Sigma). Se agregaron 100L de 30 mM de

adrenalina, y se determinó la absorbancia a 480 nm, a los 30 seg y 5 min. La cantidad de SOD se

calculó por medio de una curva patrón empleando un estándar de Zn/Cu SOD (Sigma), el

intervalo de la concentración fue de 2.19 a 13.39 unidades de SOD.

V.3.5. Evaluación de la actividad de la catalasa

Se utilizó el método de Radi et al. (1991), en el cual la actividad de la CAT es medida por la

descomposición de 20 mM de H2O2 a 240 nm. Una alícuota de 50 L de linfocitos ozonificados

se centrifugó a 12,500 rpm a 4 °C durante 15 min. A 20L del sobrenadante se le agregó 1 mL

de la solución amortiguadora de aislamiento (0.3 M de sucrosa, 1 mM EDTA, 5 mM HEPES y 5

mM de fosfato de potasio monobásico, Sigma) y 0.2 mL de la solución de 20 mM de H2O2

(Tecsiquim). Posteriormente se determinó la absorbancia a 240 nm, a 0 y 60 seg. La actividad de

la enzima se calculó por medio del coeficiente de extinción; CEM del H2O2=0.043 mM-1 cm-1.

V.3.6. Evaluación de la actividad de la glutatión peroxidasa

Para la determinación de la actividad de la GPx se empleó el método de Paglia y Valentine

(1967), el cual consiste en medir la descomposición de 0.12 mM de NADPH a 340 nm. Se

tomaron 100L de linfocitos que estuvieron previamente ozonificados (15 min) y centrifugados

(12,500 rpm a 4°C durante 15min). Se completaron a 1mL con una solución amortiguadora de

reacción (5M de fosfato de potasio dibásico, 5M de fosfato de potasio monobásico, 3.5 mM

GSSH, 1mM de azida de sodio, 2 unidades de GR, 0.12mM NADPH, pH 7.0, Sigma). Se

39

agregaron 0.2 mL de una solución de 20 mM de H2O2. Posteriormente se determinó la

absorbancia a 340 nm, a 0 y 60 seg. La actividad de la enzima se calculó por medio del CEM del

NADPH = 6.2 mM-1 cm-1.

Los parámetros bioquímicos hasta aquí descritos se relacionaron con la cantidad de proteínas

totales, determinadas mediante el método de Bradford (Bradford, 1976).

Con los valores de la actividad de las enzimas se calculó el valor de la relación SOD/CAT y

SOD/GPx para establecer la relación entre los sistemas antioxidantes (Formigari et al., 2007).

V.4. Ensayos citotóxicos

V.4.1. Evaluación del ciclo celular

Las células se filtraron a través de una malla de nylon de 30 m, posteriormente se tiñeron con 5

g/mL de IP en PBS con 50 g/ml RNasa libre de DNasa (Sigma). Estas fueron incubadas en

hielo en condiciones de oscuridad durante 30 minutos. El contenido de ADN se determinó

detectando la fluorescencia del IP de 20000 eventos por muestra utilizando un citómetro de flujo

FacScan (Beckton Dickinson) usando una lámpara fría de argón láser con longitud de onda de

excitación de 488 nm y un filtro de 560 nm. Antes de cada análisis se calibró el aparato con un

estándar de núcleos de eritrocitos de pollo (Beckton Dickinson), se realizaron mínimo 5 replicas

y se procedió al análisis solo cuando el CV del estándar fue menor a 2. Se determinó el

porcentaje de células en las fases G1/G0, G2 y S en cada muestra por medio del programa

CellQuest (versión 3.0.1).

40

V.4.2. Evaluación de la apoptosis

La apoptosis de los linfocitos obtenidos de los peces expuestos se demostró mediante la técnica

denominada TUNEL, utilizando el kit ApopTag Fluorescein S7110 (CHEMICON).

Se tomaron 300 L de las células en la solución conservadora y se centrifugaron a 3000 rpm

durante 5 min a 4°C. El botón se resuspendió en 50 L de la solución de montaje (kit citología

liquida - PBM). Se tomó 1 L de la suspensión celular y se colocó en un portaobjeto con

polilisina (Sigma), se secó la preparación a 60°C durante 5 minutos. Una vez seco el material

celular, se fijó con acetona fría por 10 min y se hidrató colocando las laminillas en xileno, alcohol

absoluto, alcohol al 96, al 80, al 70, al 60, al 50 % (Tecsiquim) y finalmente en agua por 30 seg.

en cada solución.

Una vez que las células fueron hidratadas, se realizó un pretatamiento con proteinasa K (20

g/mL, Bioline) por 10 min y se lavó la muestra tres veces con PBS durante 10 min, se eliminó

el exceso del líquido, se adicionaron 60 L del amortiguador de equilibrio del kit (ApopTag

Fluorescein) y se dejó reposar por 10 min. La solución de la enzima TdT se adicionó a las

células (65 L por muestra) y se incubó en una cámara húmeda por 1 h a 37°C. Se detuvo la

reacción con un amortiguador de lavado por 10 min a temperatura ambiente. Se lavaron las

muestras tres veces con PBS durante 1 min y se agregó el conjugado anti-FITC (65 L por

muestra) para el marcaje de las células apoptóticas, incubándose en una cámara húmeda por 30

min a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Se lavó la muestra 4 veces con PBS por 2 min

a temperatura ambiente. Finalmente se contrastó el marcaje con IP (1.5 g/mL). Las laminillas

41

se observaron en un microscopio de fluorescencia (Zeiss) con un sistema de captura de Media

Cybernetics y un filtro de 450-490 nm.

El testigo positivo de apoptosis se obtuvo tratando a una muestra de linfocitos con DNasa I (1

g/mL), mientras que el testigo negativo se consiguió tratando una muestra de linfocitos igual

que las del ensayo, pero no se le aplicó la solución de la enzima TdT. La apoptosis se expresó

como el número de células TUNEL positivas por cada 100 células.

También se determinó la apoptosis por medio de la técnica Subpico G0 por CF (ver V.4.1.).

V. 5. Ensayos genotóxicos

V.5.1. Evaluación del daño al ADN por citometría de flujo

Con las células analizadas por CF se determinó el CV del contenido de ADN en el pico G1/G0

de cada muestra. El nivel de ploidía en los linfocitos fue determinado por el DI. El DI es

utilizada para obtener estimaciones cuantitativas de la relación entre el contenido de ADN de

individuos afectados y diploides controles y se define como la proporción de la media de la

fluorescencia del canal G1/G0 de las células afectadas (linfocitos expuestos al Al) dividida por la

media de la fluorescencia del canal G0/G1 de la población de referencia (testigo) (Bihari et al.,

2003).

V.5.2. Evaluación del daño al ADN por electroforesis unicelular (cometa)

Se descongelaron las muestras a temperatura ambiente y se centrifugaron a 3000 rpm; al botón se

disolvió con 100 L de PBS. Posteriormente se determino la viabilidad de las células, con azul de

42

triptano al 0.4% y se prepararon las laminillas para el ensayo como se describe a continuación.

A un portaobjetos se adicionó una primera capa de 100 L de agarosa normal al 1%. Después se

mezclaron 10 L de la suspensión de linfocitos con 75 L de agarosa de bajo punto de fusión al

0.75% y 75L de esta mezcla se colocaron sobre la primera capa de agarosa.

Para la liberación del ADN se colocaron las laminillas por 1 hr a 4 °C en un vaso de copplin con

la solución de lisis (2.5 M de cloruro de sodio, 10 M EDTA, 10 mM de Trizma, 10% DMSO, 1%

Triton y pH 10, Sigma). Posteriormente, se colocaron en la cámara de electroforesis durante 20

min con una solución alcalina (300 mM de hidróxido de sodio, Merck y 1 mM EDTA) a un pH

de 13. Se realizó la electroforesis a 300 AMP, 25 Volts y pH>13 por 20 min y finalmente, el

proceso se detuvo con un amortiguador de neutralización (0.4 M de trizma base) a un pH 7.4

(Tice et al, 2000).

El ADN se tiñó con 50 L de bromuro de etidio y se observó. La medición se realizó en un

microscopio de fluorescencia (Zeiss) con el programa Imge-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics) y

un filtro de onda de 450-490 nm. Se realizaron 100 mediciones por tratamiento y se obtuvo el

daño por medio del ID, el cual es la relación de la longitud de la cola del cometa y el diámetro

nuclear.

43

V. 6. Análisis estadístico

Para los biomarcadores de estrés oxidativo se aplicó el ANOVA paramétrica y la comparación

múltiple de Tukey con una P< 0.05, excepto en la determinación del daño oxidativo en ADN.

En el caso de los resultados del análisis del ciclo celular, el DI por CF y el CV del pico G1/G0, el

porciento de células apoptóticas y el ID por el ensayo cometa, así como la diferencia de índices

en la determinación de oxidación del ADN, se realizó la prueba de ANOVA no paramétrica de

Kruskal–Wallis y la comparación múltiple de Dunn con P<0.05 en el programa Sigmastat

versión 2.03.

44

VI. Resultados

VI.1. Identificación de la población celular

Para la confirmación de la población celular se correlaciono los parámetros FCS (tamaño) contra

SSC (complejidad celular) por CF, estas medidas nos permiten identificar la población celular

analizada. Como se puede observar en la figura 5, la mayoría de las células son linfocitos, con una

cantidad mínima de células contaminantes (menos del 0.01%), principalmente monocitos.

Figura 5. Análisis de los linfocitos aislados de las muestras de sangre de carpa usando FSC/SSC.

45

VI.2. Efecto del aluminio sobre el estrés oxidativo

VI.2.1. Efecto del aluminio sobre el grado de lipoperoxidación

Los resultados que se obtuvieron en la evaluación de la oxidación lipídica (LPO) producida

por el Al, se presentan en la figura 6. Dicha figura fue construida con el promedio de seis

individuos por grupo.

La primera barra representa al testigo, y como se puede observarse, la LPO osciló con

valores de 0.0659 a 0.177 M MDA/mg PT en los tiempos analizados (12, 24, 48, 72 y 96

h), lo cual sugiere que los valores basales de la LPO de los linfocitos de la carpa se

encuentran es este intervalo.

Con respecto a los grupos tratados con Al, la concentración de 0.05 mg/L, la LPO se

comportó de manera similar al testigo a las 12 y 24 h después de la exposición, sin

embargo, a partir de las 48 h y hasta las 96 h, la concentración de MDA se incrementó

significativamente, duplicando el valor del testigo. Para el grupo expuesto a 120 mg/L se

observó un aumento significativo a partir de las 48 h y hasta las 96 h, los niveles de LPO

fueron hasta cuatro veces mayores que los observados en los testigos. Finalmente en los

organismos expuestos a 239.42 mg/L se presentaron altos niveles de LPO a partir de las

12 h y estos siguieron incrementándose en los tiempos posteriores probados.

Los datos anteriores sugieren que el Al, en las concentraciones y tiempos evaluados

producen LPO y por lo tanto, actúa como un agente oxidante.

46

Figura 6. Niveles de LPO observados en linfocitos de carpa expuesta a Al.

Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA y Tukey (p<0.001).

VI.2.2. Efecto del aluminio sobre los niveles de proteínas oxidadas

En la figura 7 se observa los niveles de oxidación en proteínas, en cuanto a los linfocitos

del grupo testigo estos presentaron una oxidación basal entre 0.0305 y 0.0463 nM de

carbonilos/mg proteínas para los tiempos evaluados.

En la concentración de 0.05 mg/L de Al en los primeros tiempos (12, 24 y 48 h) se

presentaron niveles similares a los mostrados en los testigos, sin embargo, a las 72 y 96 h

se observó un incremento significativo de aproximadamente cuatro veces mayor en

comparación con el testigo. En el caso de las otras dos concentraciones (120 y 239.42

* * *** * *

*

*

**

*

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

12 24 48 72 96

Niv

ele

s d

e L

PO

(

MM

DA

/mgP

T)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

47

mg/L), se presentó un incremento notable en los niveles de proteínas oxidadas a partir de

las 12 h. Dicho aumento es cuatro y seis veces más que los presentados por el testigo, esta

conducta se mantuvo hasta las 96 h.

Esto nos sugiere que el Al en los tiempos y concentraciones evaluadas esta propiciando la

oxidación de las proteínas.

Figura 7. Niveles de proteínas oxidadas observados en linfocitos de carpa expuesta a tres diferentes concentraciones de Al.

Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA y Tukey (p<0.001).

VI.2.3. Evaluación del daño al ADN por estrés oxidativo

La determinación de la oxidación al material genético se realizó mediante el ensayo de cometa

modificado, empleando enzimas que ponen en evidencia las lesiones oxidativas (fig. 8).

*

*

* *

**

**

**

**

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

12 24 48 72 96

Niv

eles

de

pro

teín

as o

xid

adas

(n

Mca

rbo

nilo

s/m

gpro

teín

as)

Tiempo (H)

TESTIGO

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

48

Figura 8. Determinación del daño al material genético por el ensayo cometa a 96 h.

En la figura 9 se muestra el daño al material genético por estrés oxidativo, las barras azules

representan al tratamiento con ENDO, mientras que las barras rojas indican los sitios sensibles a

FPG. El primer grupo de barras representan los cuatro grupos probados a las 12 h, se puede

observar que existe un incremento significativo en el grado de daño a las bases puricas y

pirimidicas conforme aumenta la concentración. Este comportamiento es similar para los otros

tiempos probados, con excepción a los linfocitos expuestos a 0.05 mg/L de Al, estos

presentaron un incremento con diferencia significativa respecto a su testigo en la oxidación de las

bases pirimidicas a partir de las 48 h, mientras que para las bases puricas, sí fue significativo

desde las 12 h.

49

Estos resultados nos sugieren que el aluminio puede generar una oxidación en el ADN.

Figura 9. Niveles de daño oxidativo al material genético observados en linfocitos de carpa expuesta a Al.

Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

VI.2.4. Efecto del aluminio sobre la actividad de la superóxido dismutasa

En la figura 10 se presenta la actividad de la SOD en los linfocitos de la carpa expuesta a

tres diferentes concentraciones de Al. La actividad de la SOD en los linfocitos testigos

oscila entre 1926 a 2542 unidades/mg proteínas en los diferentes tiempos evaluados.

Comparando estos niveles, se observó un decremento significativo en la actividad de esta

*

**

*

**

*

*

**

*

*

*

* *

*

* *

*

** *

*

*

*

*

**

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9Te

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0.05

mg/

L A

l

120

mg/

L A

l

239.

42 m

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Al

Test

igo

0.05

mg/

L A

l

120

mg/

L A

l

239.

42 m

g/L

Al

Test

igo

0.05

mg/

L A

l

120

mg/

L A

l

239.

42 m

g/L

Al

Test

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0.05

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L A

l

120

mg/

L A

l

239.

42 m

g/L

Al

Test

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0.05

mg/

L A

l

120

mg/

L A

l

239.

42 m

g/L

Al

12 24 48 72 96

Dañ

o a

l AD

N (∆

índ

ice

s)

Tiempo (H)

ENDO

FPG

50

enzima a partir de las 12 h en todas las concentraciones probadas. Este comportamiento se

mantuvo durante las 96 h de forma concentración y tiempo dependiente. La actividad

disminuyo aproximadamente él 50%para la concentración de 0.05 mg/L, del 70% para

120 mg/L y del 93% en el grupo de 239.42 mg/L. Esto siguiere que el Al afecta la función

de la SOD, por lo que, se puede acumular radicales libres, que a su vez oxiden a las

diferentes biomoléculas.

Figura 10. Actividad de la SOD en linfocitos de las carpas expuestas al Al.

Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA y Tukey (p<0.001).

**

* **

*

**

**

*

* *

* *

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

12 24 48 72 96

Act

ivid

ad d

e la

SO

D (

Un

idad

es/m

gPT)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

51

VI.2.5. Efecto del aluminio sobre la actividad de la catalasa

La actividad de la CAT se presenta en la figura 11, el primer grupo de barras representan los

niveles de los linfocitos testigos, los cuales, se encuentran en un rango de 0.265 a 0.314 mM

H2O2/mg PT. En cuanto a los grupos expuestos a aluminio, se observó un incremento a partir

de las 12 h (el doble que la presentada por el testigo) en la concentración de 120 mg/L, en

cambio, para los organismos expuestos a 0.05 mg/L, el aumento de la actividad se presentó a

partir de las 24 h. En ambas concentraciones el incremento fue tiempo dependiente. Para la

concentración de 239.42 mg/L de Al se observó un aumento de la actividad de la CAT por

arriba del testigo del 213% a 48 h. Sin embargo, a 72 y 96 h se presentó un decremento por

debajo del testigo de alrededor del 80% de la actividad de la enzima.

Figura 11. Actividad de la CAT en linfocitos de la carpa expuesta a Al, 0.05, 120 y 239.42

mg/L. Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA y Tukey (p<0.001).

**

*

*

* *

*

*

*

** *

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

12 24 48 72 96

Act

ivid

ad d

e la

CA

T (m

M H

2O2/m

gPT)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

52

VI.2.6. Efecto del aluminio sobre la actividad de la glutatión peroxidasa

La actividad de la GPx se presenta en la fig. 12, los niveles que se presentaron en los testigos

entre los tiempos probados fueron de 0.0189 a 0.0231 mM NADPH/mg PT. En los organismos

expuestos a 0.05 mg/L se observó un incremento de la actividad de la enzima desde las 12 h; a

las 24 h el aumento fue hasta cuatro veces más que la actividad presentada en el testigo. A las 48

h se presentó una disminución de la actividad, dicho efecto aun se encuentra por arriba del

testigo (2 veces más). Tanto para las 72 y 96 h la actividad de esta enzima se mantuvo entre los

mismos valores que los testigos. Para los linfocitos de los peces expuestos a 120 y 239.42 mg/L

de Al se observó una disminución de la actividad de la GPx a partir de las 48 h., que siguió

presentándose en forma tiempo dependiente hasta las 96 h.

Figura 12. Actividad de la GPx en linfocitos de carpa expuesta a diferentes concentraciones de Al.

Cada valor representa la media de seis organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA y Tukey (p<0.001).

*

*

*

* * ** * *

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

12 24 48 72 96

Act

ivid

ad d

ela

GP

x (m

MN

AD

PH

/mgP

T)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

53

VI.2. Relaciones de la actividad enzimática

En la tabla 1 se presenta la relación entre la actividad de las enzimas SOD/CAT y SOD/GPx. Se

puede observar, que para las concentraciones de 0.05 y 120 mg/L de Al la proporción

SOD/CAT disminuye; lo mismo ocurre en la relación SOD/GPx para ambas concentraciones

los primeros tiempos de exposición; seguida de un aumento para los últimos tiempos.

En la concentración de 239.42 mg/L, se presentó una disminución del cociente SOD/CAT

hasta las 48h., seguido de un incremento a las 72 y 96 h. Para la relación SOD/GPx se presentó

una disminución hasta las 24 h, para después presentar fluctuaciones entre las 48, 72 y 96 h.

VI.3. Evaluación de la citotoxicidad

VI.3.1. Efecto del aluminio sobre el ciclo celular

Se comparó el porcentaje de células en fase G0/G1 entre los grupos probados (fig. 13)

observándose que en los linfocitos de los peces expuestos a 0.05 mg/L de aluminio se presentó

una disminución de las células del 46% a las 24 h en comparación con el testigo, para las 48, 72 y

96 h no se mostró una diferencia significativa. Para las células del grupo expuesto a 120 mg/L Al

a 96 h se observó una disminución en el porcentaje de células de alrededor del 22%.

En el caso de las células de los peces expuestos a 239.42 mg/L de Al en todos los tiempos se

presentó una disminución del porcentaje de células tiempo dependiente del 33, 66, 66, 56 y 64%

para 12, 24, 48, 72 y 96 h respectivamente, siendo significativo a partir de las 24 h.

En la figura 14 se observa el porcentaje de células en G2 para los grupos expuestos a aluminio.

54

Tabla 1. Relación de la actividad de la SOD/CAT y SOD/GPx en los linfocitos de carpa

expuesta a diferentes concentraciones de Al.

Tiempo (H) SOD/CAT SOD/GPx

Media EE Media EE

0.0

5 m

g/

L

12 2597.586 434.479 47260.024 9214.986

24 333.815* 15.861 24071.225* 10580.997

48 185.103* 6.606 18251.367 2537.723

72 147.117* 7.091 44513.011* 5379.108

96 81.623* 7.263 68311.43* 19108.716

120

mg

/L

12 310.852 45.081 93894.96 17503.892

24 181.656* 31.091 80150.084 8425.635

48 54.255* 7.362 266454.057* 54084.695

72 20.481* 1.053 512229.004* 67162.402

96 11.089* 0.377 996136.498* 248157.256

239.4

2 m

g/

L

12 1173.205 457.784 55485.996 6294.316

24 1072.259 328.409 27819.27* 5699.253

48 229.104* 38.581 84170.051* 13773.516

72 1373.496* 288.504 53925.407* 8233.811

96 2293.373 1053.781 408585.115* 56051.308

* Diferencia significativa con respecto al tiempo anterior, prueba comparación multiple Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

55

En la concentración más baja (0.05 mg/L) se presentó un incremento del porcentaje de células

en G2 del 320% con respecto al testigo a las 24 h, para los tiempos posteriores no se mostró una

diferencia significativa entre las células del grupo tratado y el testigo. En los organismos

expuestos con 120 mg/L de Al se presentó una disminución del 50% y 40% de células en esta

fase con respecto al testigo a las 72 y 96 h, respectivamente. Para los primeros tiempos de

exposición (12, 24, y 48 h) no se encontró diferencia significativa. En el caso de los linfocitos de

los peces expuestos a 239.42 mg/L de Al se manifestó un incremento del 227% a las 12 h,

seguida de una disminución del 46 y 57% a las 72 y 96 h.

En la figura 15 se presenta el porcentaje de células en fase S del ciclo celular. En ella se observa

que para los peces expuestos a 0.05 mg/L del metal los linfocitos en fase S se incrementaron un

192 y 180% a las 24 y 48 h, para los demás tiempos probados no se presentó una diferencia

significativa con respecto al testigo. En la concentración de 120 mg/L de Al se detectó una

disminución del 80 y 72% a las 72 y 96 h. En el caso del último grupo expuesto se manifestó un

incremento del 163 y 160% en las células en fase S a 12 y 24 h, en cambio a en tiempos siguientes

se mostró una disminución del 54, 62 y 67 % a las 48, 72 y 96 h.

VI.3.2. Apoptosis

La apoptosis se evaluó por CF a través de la determinación del subpico G1 (fig. 16). Para los

organismos expuestos a 0.05 mg/L de Al se observó un aumento del 196% a las 96 h. En el

grupo de peces expuestos a 120 mg/L del metal, al igual que en la concentración anterior, se

percibió un incremento del 318 y 299 % con respecto al testigo a las 72 y 96 h, respectivamente.

56

Figura 13. Porcentaje de linfocitos en G0/G1 en los grupos experimentales probados. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

Figura 14. Linfocitos en fase G2 de los peces expuestos a 0.05, 120 y 239 mg/L de Al. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

*

*

*

* *

**

0

10

20

30

40

50

60

70

80

12 24 48 72 96

Cé

lula

s e

n G

0/G

1(%

)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L

239.42 mg/L Al

*

* *

*

**

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

12 24 48 72 96

Cé

lula

s e

n G

2 (%

)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L

239.42 mg/L Al

57

Figura 15. Porcentaje de células en fase S en los diferentes grupos evaluados. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

En la concentración de 239.42 mg/L de aluminio se advirtió un incremento en la proporción del

subpico G1 tiempo dependiente a partir de las 24 h en comparación a las células del grupo

testigo (272%, 441%, 500% y 446% a las 24, 48, 72 y 96 h respectivamente).

Por otra parte, el número de las células en apoptosis fue determinado también por medio de la

técnica denominada TUNEL (fig. 17). Las células negativas a TUNEL presentan una coloración

roja, mientras que en las células positivas se observa una coloración verde y en ocasiones naranja

debido a la competencia de la fluorescencia del marcaje FITC y el IP. Estos resultados se

presentan en la figura 18. Como puede observarse, en los organismos expuestos a 0.05 y 120

mg/L de Al se presentó un incremento en el porcentaje de células en apoptosis a las 72 y 96 h de

aproximadamente 513 y 756% más que el observado con el testigo para la primera concentración

*

*

* *

*

*

* * *

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

12 24 48 72 96

Cél

ula

s en

S (

%)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L

239.42 mg/L Al

58

y de 650 y 652% para la segunda concentración. En cambio para los linfocitos de los peces que

fueron tratados con 239.42 mg/L se mostró un incremento tiempo dependiente desde las 12

hasta la 96 h de 333, 583, 871, 966 y 1093% en comparación al testigo.

Figura 16. Porcentaje de células en fase sub G1 en los diferentes grupos expuestos a Al.

Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

*

*

**

**

*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

12 24 48 72 96

Cél

ula

s en

Su

b G

1(%

)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L

239.42 mg/L Al

59

Figura 17. Determinación de la apoptosis por TUNEL en linfocitos de carpa.

Figura 18. Porcentaje de células apoptóticas en los diferentes grupos evaluados. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

*

*

*

*

*

*

*

*

*

0

10

20

30

40

50

60

12 24 48 72 96

% A

po

pto

sis

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

60

VI.4. Genotoxicidad

El análisis por CF de los perfiles de ADN reveló que el CV de la media del pico G0/G1 de las

muestras de linfocitos aumentaron para todas las concentraciones de Al y tiempos probados con

respecto al grupo testigo (fig. 19). La variación dependió de la concentración del metal y el tiempo

de exposición. Para el grupo expuesto a 0.05 mg/L de Al se observó un incremento en los CV a

las 12, 24 y 48 h del 25, 16 y 26% con respecto a sus correspondientes testigos. En la

concentración de 120 mg/L se presentó un incremento en todos los tiempos probados del 38,

13, 23, 14 y 22%. Para 239.42 mg/L se mostró un mayor CV con relación al observado en el

testigo desde las 12 hasta las 96 h (38, 32, 23, 20 y 17% respectivamente).

Figura 19. Análisis de CF del CV de la células en fase G0/G1 de linfocitos expuestos a Al. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

** *

*

**

**

* *

**

*

0

2

4

6

8

10

12

12 24 48 72 96

CV

Tiempo (H)

TESTIGO

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

61

Los niveles de ploidia en los linfocitos expuestos a aluminio fueron determinados por medio del

DI (tabla 2); idealmente, el DI de una población diploide es 1, sin embargo, la mayoría de los

reportes permiten un rango de 0.95 – 1.05 (Bihari, et al., 2003). En este estudio, se observó que

en la concentración de 0.05 mg/L de Al se presentó un incremento del DI desde las 12 hasta las

48 h, a las 72 h se encuentra dentro del intervalo de diploidia, y a las 96 h disminuye. En los

organismos expuestos a 120 mg/L se presentó un comportamiento similar a la concentración

anterior en los primeros tiempos de exposición; a las 72 h una disminución por debajo de 1 para

después presentar un DI similar al observado a las 12 h. En el caso de 239.42 mg/L a las 12 h el

DI se encuentra dentro del intervalo diploide, en los demás tiempos se observan disminuciones y

aumentos entre los diferentes tiempos.

Tabla 2. Índice de ADN obtenido por CF en linfocitos de peces expuestos a Al

Tiempo de exposición

0.05 mg/L Al 120 mg/L Al 239.42 mg/L Al

Media EE Media EE Media EE

12 1.43 0.705 1.229 0.362 1.031 0.253

24 2.449 0.954 1.914 1.475 0.858 0.147

48 3.542 1.73 2.058 0.706 1.153 0.187

72 0.999 0.499 0.631 0.212 0.725 0.0875

96 0.804 0.197 1.287 0.297 1.624 0.417

El daño al material genético se determinó por medio del ensayo cometa (fig. 20), donde se

observó un incremento concentración y tiempo dependiente en los grupos expuestos,

principalmente en los linfocitos de los peces expuestos a las concentraciones altas. Para la

concentración de 0.05 mg/L se mostró un aumento con diferencia significativa con respecto al

testigo, del 6, 16, 42 y 43 % a las 12 h (sin diferencia significativa), 24 h, 48 h y 72 h. A las 96 h,

se presentó una disminución del daño del 28 %; sin embargo, éste se mantiene por arriba del

62

testigo. En el grupo de 120 mg/L de Al, se demostró un incremento en la genotoxicidad con

diferencia significativa en comparación al testigo del 17, 24, 59, 63 y 89% a las 12, 24, 48, 72 y

96 h respectivamente. Por último en la concentración de 239.42 mg/L el resultado de esta

prueba fue similar al grupo anterior, encontrándose un aumento significativo con respecto al

testigo del 22, 53, 73, 77 y 139 % en los diferentes tiempos probados (12, 24, 48, 72 y 96 h).

Figura 20. Determinación del daño al ADN por el ensayo cometa en linfocitos expuestos a Al. Cada valor representa la media de cinco organismos; + EE. *, Indica la diferencia significativa con respecto a su testigo, prueba de ANOVA no paramétrica de Kruskal-Wallis y Dunn (p<0.050).

*

* **

**

**

*

*

*

* *

*

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

12 24 48 72 96

Índ

ice

de

dañ

o a

l AD

N (

cau

da/

nú

leo

)

Tiempo (H)

Testigo

0.05 mg/L Al

120 mg/L Al

239.42 mg/L Al

63

VII. Discusión

VII.1. Efecto del aluminio sobre el estrés

oxidativo

El nivel de LPO se incrementó en todos los grupos tratados con Al, siendo este incremento

dependiente de la concentración y tiempo de exposición. Diversos estudios han demostrado que

este metal es capaz de desplazar al Fe de varias biomoléculas e incrementar su concentración

intracelular y en consecuencia promover la reacción de Fenton (Amador et. al, 2001; Dua y Gill,

2001; Yousef, 2004). Por otro lado, el Al puede dañar directamente a la mitocondria y afectar el

transporte de electrones en la cadena respiratoria (Stohs y Bagchi, 1995; Bondy y Cambell, 2001).

En ambos casos la formación de ROS se ve incrementada, lo que explica el incremento en LPO.

Además, Nesse y Garbossa (2001) observaron que este metal interactúa con los fosfolípidos de

las membranas de eritrocitos in vitro, formando espacios que permiten que agentes oxidantes

entren con más facilidad y dañen a la membrana.

Las defensas antioxidantes pueden ser inducidas por varios contaminantes ambientales

(Bebianno et al., 2005), entre ellos los metales pesados (Vlahogianni et al., 2007), bajo condiciones

prooxidantes. Inicialmente, su actividad puede incrementarse para contrarrestar el estrés

oxidativo, pero exposiciones prolongadas conducen a su depleción, dañando finalmente a

biomoléculas básicas tales como proteínas y DNA. En este estudio, la actividad de las enzimas

antioxidantes se vio modificada en los organismos a todas las concentraciones probadas. En el

caso de la SOD, se observó una disminución tiempo y concentración dependiente. Yousef et al.

(2007) encontraron una respuesta similar en eritrocitos humanos y espermatozoides de conejo

expuestos in vivo a este metal. Es posible que las ROS producidas por la exposición al Al, hayan

64

afectado directamente a la SOD oxidandola, o bien que su síntesis se haya visto alterada, por lo

que su actividad se vio disminuida.

Por otro lado, la actividad de la CAT y la GPx se incrementó durante los primeros tiempos de

exposición, y posteriormente disminuyo con la concentración más alta. Diversos autores

mencionan que, en particular, enzimas como CAT y GPx presentan una activación en células

sanguíneas al ser expuestas in vitro al Al (Kiss y Hollósi, 2001; Martín, 1996). Es posible que el

incremento inicial se deba a un mecanismo de defensa de las células probadas a fin de

contrarrestar el estrés oxidativo (Vlahogianni et al., 2007; Valko et al. 2005; Micic et al., 2003), pero

al incrementarse la concentración, estas enzimas hayan sido dañadas directamente por las ROS

producidas por el Al. Yousef et al. (2007) y González et al. (2004) encontraron resultados

similares y concluyen que el grado de inactivación depende de la dosis y del tiempo de

exposición.

De manera general, la defensa antioxidante inicia con la SOD (Hansen et al., 2006), que cataliza la

conversión del radical anión superóxido a peróxido de hidrógeno. Posteriormente, la CAT y la

GPx convierten éste a agua. En este estudio, la actividad de la SOD se vio disminuida, por lo que

se esperaba una menor actividad de la CAT y GPx. Sin embargo, el organismo tiene otras fuentes

de producción de peróxido de hidrógeno, tales como los macrófagos y células microgliales,

durante procesos inflamatorios y siendo el Al un agente inflamatorio, se podría explicar el

incremento de la actividad de estas enzimas.

La relación SOD/CAT y SOD/GPx también puede considerarse como índice de estrés

oxidativo. Para las dos concentraciones más bajas (0.05 y 120 mg/L) la proporción SOD/CAT

65

disminuyó, este comportamiento puede ser un indicio de la activación de las enzimas

antioxidantes debido a la presencia de ROS. En el caso del cociente SOD/GPx, se observó un

aumento en ambos grupos. Cuando este fenómeno se presenta puede ser un reflejo del aumento

de las ROS y sugieren que las enzimas no son eficientes para contrarrestar el daño de las ROS

(Formigari et al., 2007). En los peces expuestos a 239.42 mg/L de Al inicialmente se presentó

una disminución de ambas relaciones (SOD/CAT y SOD/GPx), posiblemente como resultado

del efecto para contrarrestar el daño oxidativo que se generaba. Sin embargo, al aumentar el

tiempo de exposición ambas proporciones presentaron un incremento, posiblemente porque el

sistema antioxidante enzimático de los linfocitos ya no pudo contrarrestar la producción de las

ROS. Estos resultados coinciden con el incremento en la oxidación de proteínas, LPO y DNA

producidas por esta concentración.

Las POx son el principal producto de la acción de radicales libres ya sea generados por iones

metálicos u otros agentes (Shacter, 2000). En el presente trabajo, el Al aumentó la producción de

proteínas oxidadas en los linfocitos de las carpas expuestas a 120 y 239 mg/L a partir de las 12 h

y este comportamiento se mantuvo hasta las 96 h. En la concentración de 0.05 mg/L también se

observó un incremento en la generación de proteínas oxidadas pero en menor magnitud y solo a

partir de las 48 h. No existen antecedentes de este efecto con respecto a este metal, pero sí de

otros contaminantes metálicos, como el sulfato férrico en peces dorados (Bagnyukova, 2006). La

oxidación de proteínas conduce a la pérdida de grupos sulfhídrilo y al reacomodo en la

resonancia de los aminoácidos, modificando su función y por lo tanto la integridad del

organismo (Parvez y Raisuddin, 2005; Burcham, 2007). Es posible que las proteínas oxidadas

encontradas en este estudio correspondan a las enzimas antioxidantes (SOD, CAT y GPx), lo

66

que explicaría el decremento en su actividad.

La oxidación del ADN puede generar mutaciones relacionadas con la inflamación, la apoptosis,

el envejecimiento y en mayor medida con enfermedades neurodegenerativas y el cáncer (Evans y

Cooke, 2007). La determinación de las bases oxidadas del ADN puede realizarse mediante el

ensayo de cometa empleando enzimas específicas. Las dos enzimas que se usan comúnmente

son la ENDO III y la FPG, que reconocen pirimidinas y purinas oxidadas, respectivamente.

Ambas enzimas están involucradas en las etapas iniciales de la reparación por escisión del ADN,

eliminando bases específicas dañadas y creando sitios apurínicos y apirimídicos. La ENDO III

remueve anillos saturados o fragmentos de pirimidas oxidadas, mientras que la FPG elimina

anillos abiertos de purinas oxidadas, incluida la 2,6-diamino-4-hidroxi-5-N- metil

formamidopirimida y la 7,8-dihidro-8-oxo-2 desoxiguanina (8-oxo-G) (Hook y Lee, 2004;

Lankoff et al., 2006; Poplawski et al., 2009).

Los resultados encontrados en el presente trabajo indican que el aluminio genera tanto purinas

como pirimidas oxidadas en función del tiempo y concentración. No se observó diferencia

significativa entre las bases púricas y pirimidicas oxidadas, aunque para la concentración de 0.05

mg/L de Al, la oxidación en la pirimidas se detectó a partir de las 48 h, mientras que el daño de

las bases púricas se presentó desde las 12 h. Diversos autores mencionan que la oxidación

producida por el aluminio en las bases pirimídicas es más eficientemente reparado que en las

púricas, por lo que suele no ser detectado en el ensayo cometa. En cuanto a las concentraciones

de 120 y 239.42 mg/L fueron tan altas que no podemos observar una diferencia entre los

tratamientos de las enzimas, sin embargo en ambas se incremento los ID en función de la

concentración y del tiempo. Aunque existen pocas investigaciones con respecto a la detección

67

de la oxidación de ADN por ensayo cometa en peces, esta prueba puede ser una herramienta

eficiente en el estudio de la evaluación de riesgos ambientales, debido a su especificidad y

sensibilidad (Valavanidis et al., 2006; Dhawan et al., 2009).

VII.2. Citotoxicidad

El análisis del ciclo celular y la apoptosis nos permite entender las características normales y

anormales de las células, dilucidar los mecanismos bioquímicos involucrados en la replicación de

éstas y comprender los mecanismos de acción de posibles sustancias citotóxicas, tales como el

aluminio. Estos estudios por lo general permiten determinar la tasa a la cual las células cambian

de un estado a otro en la proliferación, por ejemplo, el patrón en el cual las células pasan de la

fase G1 del ciclo celular a la fase S o G2/M ó regresan a un estado de reposo (G0), la velocidad a

la que esto ocurre y cómo la apoptosis regula estas transiciones (Lucretti et al., 1999; Cossarizza et

al., 2005).

En el presente estudio, el aluminio provocó cambios importantes en las fases del ciclo celular

(disminución del porcentaje de células en fases G0/G1, incrementos en G2 y S), así como el

incremento de la apoptosis (aumento en el porcentaje de células en el subpico G1 y de células

positivas al ensayo del TUNEL). El cambio que se presentó en dichas etapas fue dependiente de

la concentración y tiempo probado. Resultados similares fueron observados por Micîc et al.

(2001) en branquias de mejillones expuestos a 3-n- dibutil estaño y por Wang et. al (2004), en

diversas líneas celulares de peces expuestas a arsenico. Sin embargo, estos últimos investigadores

no encontraron incremento en el número de células apoptóticas por la efectiva participación de

las proteínas CDC2/ciclina B1en la regulación del ciclo celular. Es posible que en el caso de los

68

linfocitos de peces expuestos a Al, estas proteínas se hayan afectado, por el estrés oxidativo, por

lo que no pudieron evitar la apoptosis. Por otro lado, en el presente trabajo, él número de células

apoptóticas se incrementó en función de la concentración probada. En este sentido Gou et al.

(2001) observaron que la concentración del aluminio puede influir en la apoptosis de astrocitos y

este efecto está relacionado con la fase del ciclo celular que se encuentra presente.

La transición del ciclo celular depende de la eficiencia de los puntos de control del ciclo y la

capacidad que tiene el sistema para reparar los daños producidos por xenobióticos (Micîc et al.,

2001). Los resultados obtenidos en esta investigación (perdida de células en fase G0/G1,

acumulación o disminución de células en G2 y S, así como la presencia de células en apoptosis),

indican que probablemente existe un daño considerable a los sistemas de control y reparación

celular. El mecanismo por el cual el aluminio afecta al ciclo celular, además de la desregulación de

los puntos de control aun no está claro. Los principales estudios se han realizado en mamíferos

y plantas, en los que se ha observado que este metal es capaz de afectar proteínas tales como las

quinasas dependientes de ciclinas, factores de transcripción (p21, p53), factores de crecimiento,

proteínas proapoptóticas (Bax) y antiapoptóticas (Bcl-2), entre otras. Sin embargo, los resultados

indican que el Al produjo estrés oxidativo en los linfocitos de las carpas expuestas a este metal,

oxidando proteínas, así como las bases púricas y pirimídicas. Es probable entonces que las

proteínas encargadas de la regulación del ciclo se hayan oxidado, produciendo un desbalance en

el mismo y un incremento en la apoptosis. Diversos autores relacionan la muerte celular con

daño a la mitocondria, que es un blanco ya establecido del aluminio. Este efecto produce

modificaciones en el potencial de membrana, aumento de calcio y oxígeno intracelualr, inhibición

de la respiración y agotamiento de energía (ATP), provocando cambios importantes en la

69

homeostasis celular, entre ellos la apoptosis. A su vez, estos efectos desencadenan estrés

oxidativo, afectando al ciclo celular, así como también al ADN y a los sistemas de reparación

(Guo y Liang, 2001; Rodriguez et. al., 2002; Yamamoto et al., 20002; Banasik et al., 2005; Lankoff

et al., 2006; Lima et al., 2007; Valadez -González et al., 2007; Zheng et al., 2007; Rounds y Larsen,

2008; Verstraeten y Aimo, 2008; Bharathi et al., 2008; Bartosz, 2009).

Por otro lado, es importante mencionar que el daño producido por el Al no se limita a la

afectación directa de los linfocitos. Probablemente otros órganos, involucrados en la producción

de dichas células en los peces, como por ejemplo, el bazo, hígado y riñón también estén siendo

dañados. Diversos autores mencionan que en mamíferos, este metal afecta a los órganos antes

mencionados debido a que daña enzimas tales como la glutatión trasferasa y la N-acetil-beta-D-

glucosamidasa, genera estrés oxidativo y produce alteraciones histopatológicas, por lo que se

pueden afectar procesos importantes tales como la hematopoyesis (Mahieu et al., 2003; Günter et

al., 2006; Kutlubay et al., 2007). Probablemente en los peces estos efectos y órganos dañados

también se presenten, lo que explicaría también los resultados obtenidos.

VII.3. Genotoxicidad

La CF es un método fácil y rápido utilizado en la biología molecular, se puede emplear para

detectar daños a nivel cromosómico. La variación en el contenido de ADN nuclear entre las

células dentro de un individuo se mide como el CV en torno a la media de todas las células en la

fase G0/G1 del ciclo celular, altos CV nos indican una desigualdad del contenido de ADN que se

distribuyen en las células hijas después de la división celular (Bihari et al., 2003; Hays y McBee,

70

2007). En este trabajo se observó que en los linfocitos de las carpas expuestas al Al, el CV se

incrementó en función del tiempo de exposición y de la concentración utilizada. Existen diversos

estudios que demuestran que el incremento de los CV se debe a la presencia de contaminantes

tales como metales, plaguicidas, hidrocarburos y materiales radiactivos (Dalla et al., 1998; Bihari et

al., 2003; Hays y McBee, 2007). Bissett et al. (2009), relacionaron aumentos de los CV con

incrementos en aberraciones cromosómicas en ostras cultivadas en Lavona Bay, Texas,

sugiriendo como agente causal a los tóxicos presentes en el ecosistema estudiado, entre los que se

encontraba el Al.

La CF también nos permite detectar el daño al material genético por medio de la determinación

del DI este parámetro nos permite identificar los niveles de ploidias, comparando el contenido

de ADN de los organismos expuestos con una población de referencia (testigo). Se considera

una célula diploide (sin daño) a aquella que presenta un DI entre 0.95 a 1.05 (Bihari et al., 2003).

Esta medición se realiza de manera rutinaria para identificar posibles tumores en tejidos

humanos, sin embargo, también puede ser una herramienta útil para la evaluación de riesgos

genotóxicos en poblaciones acuáticas (Bickham et al., 1988; Thomas et al., 2002; Hays y McBee,

2007; Bissett et al., 2009).

Los resultados referentes al DI de los linfocitos de carpas expuestas al Al, muestran que este

metal produce modificaciones a dicho parámetro (aumentos y disminuciones tiempo y

concentración dependientes), lo que refleja un incremento en el número de aneuploidías. Otro

tóxico que presenta un comportamiento similar es el cadmio, que puede inducir aneuploidías en

diversas células. Este xenobiótico provoca una mayor frecuencia de células con un menor

71

número de cromosomas de lo normal en fibroblastos humanos; y en testículos de rata un

aumento dosis dependiente en el incremento de cromosomas (Seoane et al. 2002; Hays y McBee,

2007).

La aneuploidías pueden ser el resultado de agentes aneugénicos y clastogénicos que provocan

interferencia mitótica. Sin embargo, pueden no observarse en células neoplásicas, como

consecuencia de la inflamación del tejido o la destrucción y regeneración de éstos, por lo que se

hace necesaria la combinación de la determinación del DI por CF con otros ensayos genéticos

tales como el cometa, convirtiéndose en excelentes herramientas para detectar agentes

genotóxicos (Bihari et al., 2003).

El ensayo cometa es una prueba que nos permite detectar diversos tipos de daños en el material

genético, en este contexto, los linfocitos de los peces expuestos a Al, presentaron un incremento

de los índices de daño al ADN a tiempo y concentración dependiente. Otros investigadores han

encontrado resultados similares con respecto al aluminio. Lankoff et al. (2006) demostraron que

en linfocitos humanos este metal es capaz de producir rompimientos del ADN y acumulación de

las células en fase S del ciclo celular. En organismos acuáticos como peces y sanguijuelas se

demostró por medio del ensayo cometa, que muestras de agua y sedimento contaminadas con

Al, generan un daño importante al material genético y que independientemente de la

concentración, el tiempo de exposición es esencial. Mihaljevic et al. (2009), mencionan que a

corto plazo el Al produce daño al ADN por interacción directa, mientras que el efecto a largo

plazo es resultado de modificaciones bioquímicas y fisiológicas, tales como estrés oxidativo y

muerte celular, provocadas también por el metal en cuestión.

72

Las alteraciones genéticas detectadas con en el ensayo cometa son daños primarios que puede ser

reparados fácilmente. Sin embargo, y en términos de riesgo, es interesante determinar la

proporción de daño en el ADN generado a nivel cromosómico. En este contexto, la

determinación del CV y los DI por CF evidencio que existen daños a este nivel, demostrándose

que el Al es un agente genotóxico.

El mecanismo de acción del Al aún no es del todo claro, no obstante se sabe que tiende a

acumularse en las mitocondrias, los lisosomas y el núcleo principalmente. Además, por ser una

base de Lewis débil, (un catión trivalente), es capaz de interaccionar con biomoléculas como

ácidos nucleicos, grupos fosfatos del ATP, proteínas fosforiladas y grupos carboxílicos. Debido a

esto, es posible que también se afecten los sistemas de reparación del ADN, en particular

enzimas relacionadas con la reparación de esta biomolécula, tales como la ADN ligasa. Diversos

estudios han demostrado que este metal forma complejos con el material genético y estimula la

glicación de la histona H1 en el sitio de unión de los nucleótidos, afectando la capacidad de

organización de la cromatina. Además, se une al grupo fosfato del ADN y al nitrógeno 17 de la

guanina, en particular, en la posición de pares ricos de guanina y citocina. A bajas

concentraciones se ha comprobado que él Al forma supercoloides irreversibles con el ADN,

provocando un desenrrollamiento del mismo, mientras que a altas concentraciones se observó

disminución de la tasa de replicación. Esta diferencia entre las concentraciones y los mecanismos

nos explica las variantes en la respuesta entre las concentraciones evaluadas, no solo a nivel

genético, sino en particular a lo observado en la citotoxicidad (Rodríguez et al., 2002; Yamamoto

et al., 2002; Mohanty et al., 2004; Banasik et al, 2005; Lima et al., 2007; Valadez – González et al.,

73

2007; Zheng et al., 2007; Bharathi et al., 2008; Verstraeten et al., 2008).

El daño del ADN es un proceso en equilibrio, es decir, las lesiones están siendo formadas y

reparadas constantemente. Por lo tanto, cualquier daño observado a esta biomolécula en el

momento de la toma de la muestra, indica que el equilibrio se ha alterado, desplazándose más

hacia la acumulación de daño, como consecuencia de un aumento en el número de eventos

dañinos de ADN o una disminución de la reparación del mismo (Theodorakis et al., 2000).

Al observar los resultados de las diferentes pruebas de genotoxicidad, en particular el DI por CF,

se puede suponer que los procesos de reparación o mecanismos para evitar el daño al ADN

están activos. Tal es el caso de la concentración más baja, en donde los altos niveles de daño al

material genético coinciden con el incremento en la apoptosis y la modificación de las células en

G0/G1, G2 y S, pero se observa claramente que los sistemas enzimáticos antioxidantes (SOD,

CAT y GPx) tratan de compensar la producción de radicales libres, quienes probablemente son

los responsables del daño. Resultados similares fueron observados en los linfocitos de las carpas

expuestas a las concentraciones de 120 y 239.42 mg/L; sin embargo, el daño presentado es

mayor y la célula no es capaz de compensarlo. Estos resultados coinciden con los observados en

plantas de tabaco expuestas a Al, en donde se desencadenó una cascada de señales que dieron

como resultado la activación de la apoptosis por vía intrínseca, generando estrés oxidativo y

fragmentación al ADN (Yamamoto et al., 2002; Bharathi et al., 2008; Bartosz, 2009). Por otro

lado, Mihaljevic et al. (2009) mencionan que el Al posee un proceso de absorción bifásico, con

una fase no lineal rápida superpuesta a una lineal dependiente del tiempo, lo que explicaría las

diferencias encontradas entre las concentraciones probadas.

74

VIII. Conclusiones

El Al es un agente citotóxico debido a que modificó la distribución del ciclo celular e incrementó

la proporción de células apoptóticas en los linfocitos de carpa común (Cyprinus carpio). El metal

también es un agente genotóxico, ya que se observaron daños al material genético y un

incremento en las frecuencias de aneuploidias.

Es probable que ambos efectos estén relacionados con el estrés oxidativo, ya que el Al modificó

las actividades de las enzimas antioxidantes (SOD, CAT y GPx) y se incrementó la oxidación de

lípidos, proteínas y ADN. Para todos los efectos evaluados el grado de daño dependió de la

concentración y el tiempo de exposición.

75

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