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CITOTOXICIDAD POR CROMO EN ENCÉFALO, MÉDULA ESPINAL, TUBO
DIGESTIVO, RIÑÓN E HÍGADO DE Betta splendens SEGÚN CONCENTRACIÓN
DETERMINADA EN LA CUENCA BAJA DEL RÍO TUNJUELO (SECTOR
CURTIEMBRES), BOGOTÁ D.C., COLOMBIA
SAMUEL ENRIQUE ESPINOSA GONZÁLEZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
GRUPO DE INVESTIGACIÓN NEUROCIENCIAS (GINUD)
BOGOTÁ D.C.
2016
CITOTOXICIDAD POR CROMO EN ENCÉFALO, MÉDULA ESPINAL, TUBO
DIGESTIVO, RIÑÓN E HÍGADO DE Betta splendens SEGÚN CONCENTRACIÓN
DETERMINADA EN LA CUENCA BAJA DEL RÍO TUNJUELO (SECTOR
CURTIEMBRES), BOGOTÁ D.C., COLOMBIA
SAMUEL ENRIQUE ESPINOSA GONZÁLEZ
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Biología
Director
MSc. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO
Evaluador
MSc. DIANA DEL SOCORRO DAZA ARDILA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
GRUPO DE INVESTIGACIÓN NEUROCIENCIAS (GINUD)
BOGOTÁ D.C.
2016
NOTA ACLARATORIA
La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo debido a
que estas hacen parte única y exclusivamente de su autor.
Capitulo XV, artículo 117, acuerdo 029. Consejo Superior de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas, junio de 1988
4
CONTENIDO
pág.
RESUMEN 8
ABSTRACT 8
INTRODUCCIÓN 9
1. PLANTEAMIENTO 11
1. 1. PROBLEMA 11
1. 2. JUSTIFICACIÓN 11
1. 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 12
1. 3. 1. Rio Tunjuelo. 12
1. 3. 2. Espectrofotometria. 14
1. 3. 3. Cromo. 15
1. 3. 4. Betta splendens. 16
1. 3. 5. Evidencia de cambios histológicos. 18
1. 4. OBJETIVOS 19
1. 4. 1. General. 19
1. 4. 2. Específicos. 19
1. 5. DELIMITACIÓN 19
2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS 20
2. 1. MATERIALES O RECURSOS 20
2. 1. 1. Equipos. 20
2. 1. 2. Reactivos. 20
5
2. 1. 3. Vidriería. 20
2. 1. 4. Otros materiales 20
2. 2. UBICACIÓN DEL ÁREA 20
2. 2. 1. Área de campo. 20
2. 2. 2. Área de laboratorio. 21
2. 3. PROCEDIMIENTOS 22
2. 3. 1. Análisis químico de las muestras de agua. 22
2. 3. 2. Sometimiento. 23
2. 3. 3. Histotécnia. 25
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS. 26
3.1. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE AGUA POR ESPECTROFOTOMETRÍA 26
3.1.1 Curva de calibración. 26
3.1.2. Concentración de cromo hexavalente. 27
3.2. CULTIVO DE LOS PECES. 29
3.2.1. Betta splendens machos. 29
3.2.2. Betta splendens hembras. 30
3.2.3. Sometimiento. 32
3.3. CAMBIOS HISTOLÓGICOS. 33
3.3.1 cambios a nivel de sistema nervioso central (encéfalo y medula espinal) 33
3.3.2 cambios a nivel de tubo digestivo 35
3.3.3 cambios a nivel de riñón 37
3.3.4 cambios a nivel de hígado 38
4. CONCLUSIONES. 40
6
REFERENCIAS 41
LEGISLACIÓN 42
BIBLIOGRAFÍA 43
7
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
TABLAS
1. Taxonomía completa de Betta splendens (NCBI) 17
2. Absorbancias para la realización de la curva de calibración 26
3. Concentración de cromo hexavalente en cada una de las muestras de agua 27
FIGURAS TOMADAS DE OTROS MEDIOS
1. Recorrido del rio Tunjuelo 13
2. Cargas contaminantes del rio Tunjuelo 13
3. Dimorfismo de Betta splendens 16
FIGURAS TOMADAS POR EL AUTOR
4. Autoapomorfía de Betta splendens 17
5. Cauce del rio Tunjuelo 21
6. Cuenca baja del rio Tunjuelo 21
7. Laboratorios de biología y química 22
8. Espectrofotómetro y celdas 23
9. Tratamiento con azul de metileno 24
10. Adecuación del acuario de sometimiento 25
11. Micrótomo 26
12. Curva de calibración 26
13. Betta splendens machos 29
14. Beta splendens hembras 30
15. Acuario de sometimiento 32
16. Corte transversal de lóbulo óptico 34
17. Corte transversal de mesencéfalo 34
18. Corte transversal de tallo cerebral 35
19. Corte transversal de medula espinal 35
20. Corte transversal de intestino 36
21. Corte transversal de riñón 37
22. Infiltración de bilis en los organismos con el sometimiento 39
23. Parénquima hepático 39
8
RESUMEN
Actualmente, los vertimientos de cromo por el sector industrial de las curtiembres, son
considerados como uno de los grandes problemas de impacto ambiental, concretamente por la
contaminación de las fuentes hídricas, debido a los daños que este metal causa en los diferentes
ecosistemas y en los organismos que allí habitan. A lo largo de la cuenca baja del río Tunjuelo se
evidencian grandes concentraciones de este metal que inherentemente está ocasionando
alteraciones a nivel fisiológico en las comunidades aledañas; para la realización de este estudio y
como referencia se tomaron varias poblaciones del pez Betta splendens, las cuales se cultivaron y
se sometieron a la concentración promedio de cromo (73.53 PPM), determinada mediante un
análisis de espectrofotometría de muestras de agua provenientes del río. Para la evaluación de la
citotoxicidad se realizaron cortes histológicos de sistema nervioso (encéfalo y médula), tubo
digestivo, riñón e hígado y se compararon con los cortes de los organismos control encontrando
las posibles diferencias mediante un análisis microscópico, determinando procesos patológicos
como la Gliosis, las hiperplasias, la glomérulonefritis, y los daños del parénquima hepático,
poniendo así en manifiesto la toxicología de este metal.
PALABRAS CLAVES: Toxicología ambiental, citotoxicidad, histología, histopatología,
espectrofotometría.
ABSTRACT
Actually, the dumping of chromium by industry of the tanneries are considered as one of
the major problems of environmental impact, specifically the contamination of water sources due
to the damage this metal causes in different ecosystems and the organisms that live there. Along
the lower basin of the river Tunjuelo large concentrations of this metal which is inherently
causing alterations to physiological level in the surrounding communities are evident; for
conducting this study and reference populations of several fish Betta splendens were taken, which
were cultured and subjected to the average concentration of chromium (73.53 PPM), determined
by spectrophotometry analysis of water samples from the river. For evaluation of cytotoxicity
histological sections of nervous system (brain and spinal), gastrointestinal tract, kidney and liver
were performed and compared with cuts of controlling agencies to find any differences through
microscopic analysis, determining pathological processes such as gliosis, hyperplasias,
glomerulonephritis , and damage the liver parenchyma , thereby manifest the toxicology of this
metal.
KEYWORDS: Environmental Toxicology, cytotoxicity, histology, histopathology,
spectrophotometry.
9
INTRODUCCIÓN
Desde los años 50, la implementación de cromo como insumo en la industria del curtido de
pieles, es una actividad que se realiza continuamente en la capital del país, aunque existe una
legislación que determina la cantidad de estos vertimientos, se ha evidenciado que estas empresas
ya sea por acciones políticas y/o tráfico de intereses no cumplen con esto. Generalmente esta
industria utiliza sales de cromo y otros compuestos que generan efluentes líquidos muy tóxicos,
que deberían ser removidos por ciertas técnicas y no dirigirse a la cuenca de los ríos.
El cromo se puede encontrar como cromo hexavalente (Cr6+
) en forma de ion cromáto y
como cromo trivalente (Cr3+
) que es más estable y menos toxico, en la mayoría de los casos el
nivel de cromo total que se encuentra en los cuerpos de agua es bajo (10µg/l), sin embargo se
evidencia que los vertimientos superan este límite (25 µg/l). estudios cartográficos determinaron
que en la localidad de Tunjuelito, se encuentra el 90% de las curtiembres de la ciudad de Bogotá,
representadas en más de 350 empresas que realizan diferentes pasos del proceso de fabricación
del cuero, también revelaron que no solamente está expuesta la población que labora en dichos
establecimientos, sino la que vive alrededor, a lo que se le suman los problemas ecológicos tras
los vertimientos al rio, estas descargas están calculadas en más de 4000 m3/día, de los cuales un
60 a 70% provienen de la preparación de la piel, un 30 a 40% del curtido y un 5 a 10% del
acabado (Chávez, 2010). Aunque se sabe que el cromo es un metal altamente toxico, debido a
que causa procesos metaplásicos, y se conocen sus efectos por estudios de salud pública en
humanos, hay poca evidencia histológica de los daños que pueda causar en otros organismos que
posiblemente sean importantes en la comunidad ecosistémica de los ríos; al presentar muchos
vertimientos las condiciones del rio se tornan abióticas, sin embargo el rio Tunjuelo desemboca
en otros que son importantes para las actividades humanas y se evidencia que la contaminación
por cromo sucede en fuentes lejanas al lugar inicial de vertimiento por las mismas dinámicas
fluviales que transportan estos metales (Bedoya, 2007).
Hay pocas evidencias histológicas de los cambios que ocurren en los organismos que se
someten a este tipo de contaminación y que posiblemente son importantes para mantener la
estructura ecosistémica, por esta razón se determinó como se afectan las estructuras histológicas
en peces de la especie Betta splendens, que aunque generalmente no es una especie nativa de
Colombia, se considera un modelo biológico para estudios en laboratorios, lo que dinamizó dicha
investigación. Se observaron estas alteraciones citológicas a nivel de sistema nervioso central
(encéfalo y medula), tubo digestivo, riñón e hígado de los individuos de dicha especie a los que
se les realizo el sometimiento, de acuerdo a la concentración promedio de cromo que contiene el
rio y comparándolos con los organismos control, posteriormente se realizó la respectiva técnica
histológica en la instalaciones del grupo de investigación neurociencias (GINUD) de la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas; para determinar la concentración de este metal en
el rio se realizó un análisis de espectrofotometría y luego se promediaron los resultados de 18
muestras de agua colectadas en el lugar de vertimiento, para determinar así la concentración a la
cual se sometieron los peces. El sometimiento se realizó por dos meses, tiempo necesario para
que el pez realice la absorción del metal y para que se evidencien las alteraciones fisiológicas
debido a los cambios citológicos.
10
Con este trabajo se pretende, tener una evidencia histológica de los cambios que presentan
los organismos que se someten a este tipo de contaminación, debido a que hay pocos registros de
los cambios estructurales causados por metales pesados, en este caso el cromo. Además de esto se
fortalecerá el campo de la histopatología experimental y de la histología, abordando nuevos
temas que no están muy bien consolidados en estos campos, contribuyendo a nuevas
investigaciones que evidencien las apuestas políticas en cuanto a la legislación ambiental que no
tienen en cuenta las afectaciones que realmente tienen los individuos de estas poblaciones
aledañas a las industrias. El poner en practica este proyecto también impulsará este tipo de
estudios para el fortalecimiento de estos campos, los componentes y las líneas de investigación
de la ecología ambiental y se pretenderá incentivar a la comunidad académica a explorar los
daños que causa ciertas industrias al ecosistema, además de esto que se realicen actividades de
incentivación de la comunidad y que posiblemente se realicen más estudios de impacto
ambiental, restauración de zonas contaminadas por cierto tipo de contaminante y una apropiación
por este importante recurso.
11
1. PLANTEAMIENTO
1. 1. PROBLEMA
¿Cuál es la afectación histológica en sistema nervioso (encéfalo y médula), tubo digestivo,
riñón e hígado, tras someter a Betta splendens a una concentración de cromo determinada
previamente en la cuenca baja del río Tunjuelo, Bogotá D. C. Colombia?
1. 2. JUSTIFICACIÓN
Desde el punto de vista ambiental, el sector industrial de las curtiembres siempre ha sido
catalogado como altamente contaminante, debido a su alta incidencia en el deterioro de
componentes ambientales como la atmosfera, agua y suelo. El aumento del uso de algunos
metales pesados como el cromo y sustancias químicas en los procesos industriales, ha ocasionado
que gran parte de los ecosistemas acuíferos presenten un alto contenido de contaminantes
orgánicos e inorgánicos. Se sabe que la presencia de metales pesados en el ambiente acuático
causa severos daños a la biodiversidad. En consecuencia las sales de estos metales pesados,
utilizados en esta industria, son solubles en agua, no pueden ser separadas por métodos ordinarios
y son más afines a la absorción por los organismos que habitan este ecosistema; es por ello, que
se hace necesario realizar estudios en cada uno de los componentes que se ven afectados tras los
vertimientos de estos metales, entre estos el ecosistema acuático, para contribuir al mejoramiento
y restauración ecológica de fuentes fluviales naturales, evidenciando los daños causados en los
organismos que se ven expuestos a este tipo de contaminación, ya sean cambios
macroestructurales como también los cambios microestructurales y genéticos; es importante que
se muestren estos resultados, para que se puedan tomar medidas y disminuir los índices de
contaminación y el uso incorrecto de los recursos naturales.
Con la realización de este proyecto de investigación, se pretende mostrar las consecuencias
a nivel histológico y estructural, tras la exposición a una concentración de cromo en varios
órganos de Betta splendens; es imprescindible lograr esto, ya que se pone de manifiesto algunos
de los daños causados por la contaminación proveniente del sector industrial, tras el vertimiento
de esos metales a cuerpos de agua que son hábitat de muchos organismos. Este tipo de
contaminación se debe a los derivados del cromo en forma trivalente y hexavalente, que a
diferencia de este ultimo, tiene la capacidad de penetrar de forma fácil en el organismo por vía
respiratoria, oral o dérmica. El cromo presenta un gran índice de absorción a nivel de médula
ósea, bazo, ganglios linfáticos y pulmones (Molina, 2010), lo que ocasiona grandes daños en los
organismos, debido a esto se pretende también evaluar cambios en encéfalo, medula espinal, tubo
digestivo, riñón e hígado para generalizar los daños citotoxicológicos causados. La
implementación y vertido de desechos con carga de cromo, como resultados de las actividades de
esta industria, es sin duda, un problema que debe ser tratado de forma inmediata, dadas las
consecuencias de dicha contaminación a nivel ambiental y de toxicidad en los organismos.
12
1. 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1. 3. 1. Río Tunjuelo.
De acuerdo a la cartografía y ecología del rio Tunjuelo, durante hace más de 20 años,
debido al gran crecimiento demográfico que ha tenido Bogotá se le han asociado conceptos como
los de problemática social, urbana y ambiental debido a que en su cuenca habitan dos quintas
partes de la población de la ciudad que en su mayoría oscilan en los estratos 1 y 2, En sus
alrededores la ampliación del borde urbano ha ocasionado que se ocupen sus riberas y valles
haciendo que al rio Tunjuelo le den mayor relevancia y notoriedad los problemas ambientales,
derivados de las inundaciones y la contaminación que causan las industrias, aunque el río
Tunjuelo debe su importancia al hecho de que, con sus 73 kilómetros, es el río más grande que
tiene la ciudad y que con sus aguas se abasteció el primer acueducto moderno que tuvieron los
bogotanos, es el más contaminado debido a que su cuenca fue urbanizada en menos de 100 años
(Osorio, 2007).
A lo largo de su cauce pueden distinguirse tres secciones bien definidas: A. CUENCA
ALTA: sección comprendida entre su nacimiento en el páramo de Sumapaz y el embalse de La
Regadera, al poseer una pendiente muy pronunciada propia de los ríos de montaña que oscila
entre el 15% y el 3%, el drenaje de este sector es rápido, lo que ocasiona que no hayan lugares
para el estancamiento del agua, presenta flora y fauna de páramo y subpáramo lo que demuestra
que es una zona poco disturbada, esta parte de la cuenca presenta un área de 161 km2; B.
CUENCA MEDIA: es la sección comprendida entre el embalse de La Regadera y el embalse
Cantarrana (5 km debajo de Usme), presenta una pendiente promedio en este sector del 3%, que
aunque menor que la anterior, es aún suficiente para garantizar un buen drenaje, el área de la
cuenca hasta el sitio de Cantarrana es de 267 km2; C. CUENCA BAJA: es la sección
comprendida entre el sitio de canteras llamada Cantarrana y el Río Bogotá, está constituido por
dos zonas; una alta (sector Cantarrana -La Fiscala) donde el río aún presenta pendientes
superiores al 1% y capacidad adecuada para evacuar grandes crecientes, y una zona baja con
pendientes del orden del 0.05% y por consiguiente con un drenaje deficiente, Este último es el
sector La Fiscala- La Tolosa-Bosa- Río Bogotá que durante su trayecto el río cruza la avenida
Boyacá en dos puntos: uno en la entrada del relleno sanitario de Doña Juana y el segundo en el
puente que limita el Barrio San Benito y el Tunal que corresponde a la zona de mayor desarrollo
industrial a lo largo del río, generando de manera significativa diferentes vertimientos. (Ver
Figura 1) (Bedoya, 2007).
Sobre la zona baja que corresponde al sector plano del río, influyen factores de
contaminación como el producido por la extracción minera en cabeza de concretera Cemex y la
Ladrillera Santa Fe, así mismo en el barrio San Benito se encuentra la raíz de uno de los
principales problemas de contaminación del río, por la presencia de curtiembreras industriales y
artesanales, que vierten los residuos de lavado y procesamiento de cueros al Río Tunjuelo,
algunas de éstas sustancias son químicos utilizados en la coloración, como las sales de metales
pesados (cromo y cobre), hidróxido de sodio, sales de amoniaco, ácidos clorados y aceites
sulfonados, todos estos difíciles de tratar (Osorio, 2007). En el barrio San Benito el sistema de
alcantarillado generalmente se obstruye por sólidos de las aguas de desecho y las inundaciones de
13
las calles en época de lluvias se hace evidente, debido a esto se presentan también casos de
morbilidad y epidemias frecuentes como diarreas, fiebres, gripas y enfermedades de la piel, cuyas
causas posiblemente se hallen en la contaminación hídrica y atmosférica de la zona. (Ver Figura
2) (Bedoya, 2007).
Figura 1. Recorrido del rio Tunjuelo, tomado de Google Maps.
Figura 2. Cargas contaminantes del rio Tunjuelo, tomado de “Modelo de simulación de transporte
de metales pesados en la cuenca baja del rio Tunjuelo,” de J. Bedoya, 2007, P. 103.
14
1. 3. 2. Espectrofotometría. La espectrofotometría es un estudio a nivel químico de cualquier biomolécula, compuesto o
elemento, para esto se requiere de la utilización de técnicas analíticas que permitan la
determinación cualitativa y cuantitativa, así como la caracterización físico-química y biológica,
se considera uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopia,
en general, y la espectroscopia ultravioleta-visible en particular, su fundamento se basa en
identificar y cuantificar moléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de
reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado
que permite detectarlo en muestras complejas, así mismo la espectroscopia se debe a la capacidad
de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-
visible, las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia
con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un valioso
instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas (Abril, 2008).
Las moléculas pueden absorber energía luminosa para almacenarla en forma de energía
interna, esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y
bacterias; Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un
salto desde un estado energético basal o fundamental, a un estado de mayor energía (estado
excitado), y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado (Abril, 2008).
Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de
moléculas, como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una
molécula es su espectro de absorción que constituye una señal de identidad de la misma, por
último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el estado energético
fundamental; En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación
electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles, en espectrofotometría
de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible
(400-780 nm), La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm: es
una región de energía muy alta que provoca daño al ojo humano (quemadura común), los
compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas
aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región
UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de
compuestos orgánicos, diversos factores como el pH, la concentración de sal y el disolvente que
alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV, la fuente de
radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio, en la región visible apreciamos el color visible
de una solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe,
el color que absorbe es el complementario del color que transmite, por lo tanto para realizar
mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz (la
solución coloreada), la fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm (Abril et al, 2008).
Actualmente, los estudios espectrofotométricos son de gran utilidad cuando se quiere
realizar un análisis de agua, debido a que permite conocer cada uno de los componentes de las
muestras, particularmente el análisis de agua por espectrofotometría se realiza cuando se requiere
analizar muestras de agua que presentan algún grado de eutrofización o contaminación, ya que
15
permite cuantificar y cualificar cada uno de los solutos que están interaccionando en la muestra a
analizar (Severiche et al, 2013).
1. 3. 3. Cromo.
Una de las particularidades del problema de contaminación en la cuenca baja del Río
Tunjuelo, corresponde precisamente a los altos niveles de contaminación de diferente índole
donde se encuentran también, trazas de metales pesados, estas concentraciones existentes se
asocian directamente con el vertimiento de residuos de sales cromadas, provenientes de la
actividad industrial del proceso de curtido de pieles, la cual es una actividad bastante profusa en
la zona del barrio San Benito; el caso de los metales pesados, analizados como tóxicos, tienen
importantes diferencias con los contaminantes convencionales; en el caso de este tipo de tóxicos
no existen ciclos orgánicos que se puedan aprovechar para explicar su disposición en el ambiente
y el manejo adecuado de los mismos para su mitigación (Bedoya, 2007).
El cromo es un elemento que se encuentra normalmente en rocas, animales, plantas y el
suelo, puede existir en formas diferentes y éstas determinan su estado líquido, sólido o gaseoso;
el cromo (0), cromo (III) y cromo (VI) son las formas más comunes en las que se encuentra este
elemento, El cromo (0), también denominado cromo metálico, se usa en la fabricación de acero y
el cromo (III) y (VI) se utilizan en el cromado, en colorantes y pigmentos, en curtido del cuero,
en la preservación de la madera y, en cantidades pequeñas, en barrenas para la extracción de
petróleo, como inhibidores de corrosión, en la industria textil y en el tóner para fotocopiadoras; el
cromo hexavalente (Cr6+
) y el cromo metálico (Cr0) son formas producidas normalmente por
procesos industriales, mientras que las formas trivalentes predominan en organismos vivos, el
cromo trivalente (Cr3+
) es un elemento residual necesario para mantener un buen estado de salud,
ya que ayuda al cuerpo a utilizar los carbohidratos, los lípidos y las proteínas (citocromos de la
mitocondria) (Molina, 2010). El aire y el agua se contaminan con cromo (III y VI) a partir de las
actividades humanas; la concentración de cromo en el aire en forma de material particulado
puede aumentar como resultado de la quema de carbón y petróleo, la producción de acero, la
soldadura de acero inoxidable, la manufactura de productos químicos y el uso de productos que
contienen cromo; la contaminación de las aguas ocurre por la descarga de desechos derivados de
la manufactura de colorantes y pigmentos para el curtido de cueros, el suelo también puede
contaminarse, debido al depósito (sedimentación) de residuos de la industria y cenizas de carbón
provenientes de plantas generadoras de electricidad (Molina, 2010).
Aunque los niveles de cromo en agua y en aire son bajos, las personas pueden respirar aire,
tomar agua o comer alimentos que contienen cromo, o absorberlo a través del contacto de la piel
con este elemento o sus compuestos, para la población general, la ruta más probable de
exposición al cromo III es el consumo de alimentos contaminados, pues los alimentos
conservados en medios ácidos como el vinagre, en contacto con latas o utensilios de cocina de
acero inoxidable pueden contener niveles de cromo más altos, debido al escape de este material
desde el acero inoxidable, Por otra parte la exposición al cromo VI es frecuente en los ambientes
de trabajo en los que se usa este compuesto: industria de cuero, industria textil, industria petrolera
e industria de platinado entre otras; La absorción de cromo se hace fundamentalmente por tres
vías: oral, respiratoria y dérmica, al entrar en el organismo es distribuido a la médula ósea,
16
pulmones, ganglios linfáticos, y bazo, el compuesto que más fácilmente se absorbe es el cromo
VI, ya que es tomado por los eritrocitos e integrado a otras células por el sistema transportador de
sulfatos, el cromo VI se reduce en cromo III intracelularmente en las mitocondrias y el núcleo,
reductores intracelulares lo degradan en el citoplasma, esta reducción intracelular genera
intermediarios reactivos como cromo V, cromo IV y cromo III, así como radicales libres
hidroxilo y oxígeno; estas formas reactivas del cromo son susceptibles de alterar el ADN,
generalmente el 60% se elimina por vía renal, en menor grado por heces (vía biliar), cabello,
uñas, leche y sudor; en la orina encontramos fundamentalmente cromo III formando un complejo
con el glutatión que ayuda a que el cromo VI se reduzca en gran parte a cromo III. (Molina,
2010).
1. 3. 4. Betta splendens.
Este pez originario de la península de Siam; Vietnam, Laos, Tailandia y Camboya, se
conoce comúnmente como luchador siamés, o pez cambiante siamés, el dimorfismo sexual de
estos peces es bastante notorio; se observa una gran diferencia entre el macho y la hembra en el
tamaño de sus aletas (ver Figura 3); en donde el pez macho, tiene la aleta dorsal, caudal, pectoral
y anal, mucho más desarrolladas y coloridas que en la hembra, una de las curiosidades de estos
peces eran las prácticas que hacían con ellos; se propiciaba una pelea entre machos, hasta que uno
de ellos destrozara las aletas del otro, esta, es una razón importante que hace que no se pueda
dejar dos machos en un espacio pequeño como un acuario pero, en general, es pacífico con otros
peces aunque no se descarta el posible ataque a peces mucho más pequeños, adicionalmente,
basta con tener un solo macho para tres hembras, cuentan con una longitud media de entre 6,2 y
7,5 cm, su alimentación está basada en insectos de menor tamaño que ellos, son ovíparos con
construcción de nido burbuja con ayuda de su saliva, las condiciones óptimas para su
reproducción, son aguas poco profundas (con unos 25cm es suficiente), y aún mejor cuando las
aguas son cálidas y con poco movimiento (Arboleda, 2006).
Figura 3. Dimorfismo en Betta splendens. Al lado derecho se encuentra el macho, al lado
izquierdo hembra, tomado de “Crianza y producción del Betta (Betta splendens) para acuaristas
no profesionales,” de D. Arboleda, 2006, Revista electrónica de veterinaria REDVET, vol. VII, p.
3.
17
El género Betta fue descrito por Bleeker, en 1850, pertenece a la familia Belontiidae, se
encuentran en el orden Anabantiformes, ubicados en este; gracias a que presenta una
característica única (autoapomorfía); la cual consiste en la presencia de un órgano conocido como
laberinto (ver Figura 4), el que pasa por la faringe y éste les permite tomar oxígeno de la
atmósfera directamente, dicho órgano es de vital importancia para el género Betta, ya que ellos
deben estar tomando oxígeno atmosférico cada 3 minutos aproximadamente, siendo este tipo de
respiración más importante que la branquial (Sandford, 1994), Profundizando más en su
reproducción en principio se debe tener en cuenta que es necesario que sean fenotípicamente
similares, así serán más atractivos mutuamente; el macho empieza con la expulsión de burbujas,
la cual forma una masa espumosa que subirá hasta la superficie del agua, siendo esta el nido,
luego corteja a la hembra escogida, así, extiende sus aletas por debajo del nido y ella se somete a
sus requerimientos, él la envuelve con su cuerpo y liberan los huevos, los cuales son fertilizados
por el macho antes de que toquen el fondo; el macho los coge con la boca y los lleva hasta el
nido, de este modo y luego de 24 horas nacen las crías; las que el padre cuidará, la temperatura
ideal en el hábitat de Betta debe oscilar entre los 240c y los 30
0c y cuando se refiere al pH del
agua, presentar una condición entre 6 y 8 en la escala de acidez y alcalinidad. (Arboleda, 2006).
Figura 4. Autoapomorfía de Betta splendens (órgano del laberinto), en el circulo verde,
nótese la conexión de este órgano con la holobranquia.
Cellular organisms; Eukaryota; Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Deuterostomia;
Chordata; Craniata; Vertebrata; Gnathostomata; Teleostomi; Euteleostomi; Actinopterygii;
Actinopteri; Neopterygii; Teleostei; Osteoglossocephalai; Clupeocephala; Euteleosteomorpha;
Neoteleostei; Eurypterygia; Ctenosquamata; Acanthomorphata; Euacanthomorphacea;
Percomorphaceae; Anabantaria; Anabantiformes; Anabantoidei; Osphronemidae/Belontiidae;
Macropodinae; Betta; Betta splendens.
Tabla 1. Taxonomía completa del pez Betta splendens tomado de NCBI (National Center for
Biotechnology Informatión).
18
1. 3. 5. Evidencia de cambios histológicos. Los efectos adversos del cromo para la salud dependen, especialmente, del grado de
valencia que presente el elemento en el momento de la exposición y de la solubilidad del
compuesto, las únicas formas de importancia en toxicología son el cromo VI y el cromo III, una
exposición de corta duración al cromo III puede causar irritación mecánica en los ojos y en el
tracto respiratorio, si se presenta inhalación se presenta tos; el cromo (VI) es un peligro para la
salud de los humanos, sobre todo para la gente que trabaja en la industria del acero y textil; La
gente que fuma tabaco también puede tener un alto grado de exposición a este elemento; El
cromo (VI) es conocido porque causa varios efectos sobre la salud: cuando se encuentra como
compuesto en los productos de la piel, puede causar reacciones alérgicas, por ejemplo, erupciones
cutáneas; después de ser respirado el cromo (VI) puede causar irritación de la nariz y sangrado de
ésta, otros problemas de salud que son causados por el cromo (VI) son: erupciones cutáneas,
malestar de estómago y úlceras, problemas respiratorios, debilitamiento del sistema inmune, daño
en los riñones e hígado, alteración del material genético, cáncer de pulmón y muerte;
normalmente, el cromo produce dermatitis, por lo general, debido a una exposición en el
ambiente ocupacional, siendo la industria del cemento una de las principales fuentes, de igual
forma, la inhalación de vapor con compuestos de cromo (VI) puede ocasionar irritación del
sistema respiratorio, daños en los pulmones y síntomas de tipo asmático, la ingesta de sales de
cromo (VI) puede ocasionar lesiones graves o, incluso, la muerte; Asimismo, el cromo en forma
de polvo puede ocasionar llagas en la piel, los compuestos de cromo (VI) pueden ocasionar
quemaduras en los ojos y se estima que del 1 al 3% de la población general presenta alergia al
cromo (Molina, 2010).
El cromo hexavalente posee dos características que explican el grado de toxicidad: La
primera de ellas, las membranas celulares son permeables al cromo VI, pero no al cromo III y en
la segunda característica el cromo VI se reduce a cromo III en el interior de las células, tanto en
las mitocondrias como en el núcleo; la literatura reporta que los compuestos de cromo VI
produce cáncer; Los compuestos de cromo están clasificados en el grupo 1 de elementos
carcinógenos, de acuerdo con la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer
(IARC: Intrernational Agency for Research on Cáncer); los compuestos de cromo VI, se deben
considerar carcinógenos potenciales según lo establecido en la Norma 29 (CFR 1910.1200) de la
Administración de Seguridad y Salud Ocupacional (OSHA: Occupational Safety and Health
Administratión). Asimismo, OSHA ha determinado, basada en la mejor evidencia posible, el
nivel permisible de exposición al cromo VI es 5 microgramos por metro cúbico de aire en un
promedio de 8 horas de trabajo, sangre y orina son usados comúnmente para el monitoreo
biológico de los trabajadores expuestos al cromo y son, por tanto, las pruebas estándar para la
evaluación de la exposición, otras técnicas para el monitoreo son la evaluación de la
concentración de cromo en el aliento condensado y la evaluación de cromo en los eritrocitos, que
permite evaluar los biomarcadores inflamatorios y se puede utilizar para investigar el tejido de
algunos órganos como los pulmones en trabajadores expuestos al cromo; el cromo en orina y
cromo en plasma son los biomarcadores ideales de una exposición reciente, mientras el cromo en
eritrocitos puede representar una fracción del cromo VI, el cual alcanza el flujo sanguíneo en una
forma no reducida y por esto depende de la dosis inhalada en el aire representada por el cromo
condensado en aliento exhalado, el cromo medido en eritrocitos puede contribuir
significativamente al biomónitoreo tradicional dando información específica en el órgano
objetivo e integrando el conocimiento con la toxicocinética del cromo (Molina, 2010).
19
1. 4. OBJETIVOS
1. 4. 1. General
Determinar la citotoxicidad por cromo, en sistema nervioso (encéfalo y médula), tubo
digestivo, riñón e hígado de Betta splendens, realizando cortes histológicos para encontrar las
posibles diferencias estructurales a nivel citológico.
1. 4. 2. Específicos
Analizar químicamente las muestras de agua provenientes de la cuenca baja del rio
Tunjuelo, en cuanto a los niveles de cromo, mediante análisis de espectrofotometría visible.
Determinar la concentración de sometimiento de cromo, que se le aplicará a Betta
splendens, a partir de los valores promedio obtenidos por espectrofotometría.
Comparar histológicamente el encéfalo, medula espinal, tubo digestivo, riñón e hígado de
los organismos control y los organismos sometidos a cromo.
1. 5. DELIMITACIÓN
Con respecto a la elaboración de este trabajo solo se trabajaron estos órganos (encéfalo,
medula espinal, tubo digestivo, riñón e hígado) debido a que son los que permitieron observar las
alteraciones sufridas y delimitaron el trabajo. Además de esto como se quiso evidenciar la
citotoxicidad por cromo solo se analizó este metal en las muestras de agua, razón por la cual no
se realizaron otros análisis en las muestras de agua provenientes del rio.
20
2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
2. 1. MATERIALES O RECURSOS
2. 1. 1. Equipos.
Casetes para micrótomo (1 caja)
Equipo de disección (1)
Espectrofotómetro Genesys 10s uv-vis (1)
Microscópio Leica ICC50 (1)
Micrótomo Leica RM2235 (1)
Filtro elite biofoam (1)
Termostato HL-25 (1)
Entrada de aire aleas AP-2000 (1)
Estereoscopio (1)
Baño flotador Leica HI1210 (1)
Dispensador de parafina Leica EG1120 (1)
Pinza para inclusión Leica EGF (1)
2. 1. 2. Reactivos.
Ácido nítrico (HNO3)
Ácido sulfúrico 50% (H2SO4)
Agua desionizada
Alcohol 70% - 96%
Dicromato de potasio (K2Cr2O7)
Difenilcarbazida 0.5% (C13H14N4O)
Eosina
Gelatina química (Gelatina sin sabor)
Hematoxilina
Resina (Entellan)
Solución de formol bufferizado al 10%
Agua amoniacal
Xilol
Parafina histoplast
Azul de metileno
Albendazol
Azitromicina
2. 1. 3. Vidriería.
Agitadores
Frascos color ámbar
Láminas y lamillas
Vasos de precipitado (100-500 ml Pirex)
Tren de tinción
Acuarios
Probeta (100-500ml Scott duran)
2. 1. 4. Otros materiales.
Instrumentos de bioseguridad
Nevera de icopor
Alimento comercial para peces
Vasos plásticos de 14 onzas
Papel aluminio
Bolsas negras de basura
2. 2. UBICACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
2. 2. 1. Área de campo. El río Tunjuelo ésta ubicado en el sur de la ciudad de Bogotá capital de Colombia, en los 4°
37’ y 60’’ norte, y 74°, 13’ y 60’’ oeste, hace parte de la hidrografía del río Bogotá
desembocando en él a una altura de 2510 msnm, La cuenca baja pasa principalmente por el
centro urbano de Bogotá, se inicia en la zona de las canteras hasta su desembocadura; presenta
una temperatura media de 17° C, (SDA-grupo de trabajo minería , 2013 ); los muestreos de agua
se realizaron en el barrio San Benito en el cauce del rio que atraviesa el puente de la avenida
Boyacá (Ver Figura 5), allí se realizó una colecta de 18 muestras en horas crepusculares (7:00 a
21
8:00 pm), en los respectivos frascos color ámbar de 20 ml y almacenados en una nevera de icopor
a una temperatura baja.
Figura 5. Cauce del rio Tunjuelo que atraviesa por debajo del puente de la avenida Boyacá.
2. 2. 2. Área de laboratorio.
Las muestras recolectadas en la cuenca baja del río Tunjuelo (ver Figura 6) se analizaron en
los laboratorios de química y biología ubicados en la Facultad de Ciencias y Educación de la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas en la carrera 4 No. 26 B – 54 (ver Figura 7),
donde se efectuó la medición de la concentración de cromo en el agua colectada. En estos
mismos laboratorios se realizó el proceso histológico, cortes, disecciones, micropreparados y
elaboración de montajes de los diferentes tejidos.
Figura 6. Cuenca baja del río Tunjuelo a nivel del barrio san Benito, obsérvese las curtiembres al
lado izquierdo.
22
Figura 7. Laboratorios de biología y química, facultad de ciencias y educación, universidad
distrital Francisco José de Caldas.
2. 3. PROCEDIMIENTOS
2. 3. 1. Análisis químico de las muestras de agua.
La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones
biológicas y químicas, el espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación
absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una
que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia (abril et al, 2008). Para esto se tuvo en
cuenta la técnica propuesta por Severiche y González (2013) la cual fue modificada para el
presente estudio; Se realizó un análisis de 18 muestras de agua provenientes de la cuenca baja del
rio Tunjuelo, específicamente en la zona aledaña a las curtiembres del barrio San Benito, en el
cauce del rio que atraviesa la avenida Boyacá; esta zona es la que está más contaminada debido a
las descargas de esta industria. Para este estudio, se realizó el análisis exclusivamente en cromo
hexavalente que es el mayor producto de los vertimientos mediante un análisis de
espectrofotometría visible con un espectrofotómetro Genesys 10s uv-vis (ver Figura 8a)
determinando las absorbancias y concentración del compuesto. Esta prueba se realizó en el
laboratorio a donde se llevaron las muestras previamente colectadas en frascos de vidrio color
ámbar de 20 ml, tomadas en diferentes estratos del cuerpo de agua en los efluentes de las
curtiembres hacia el rio y almacenadas en una nevera de icopor a 4°c, posteriormente las
muestras fueron filtradas (papel filtro) y acidificadas con una solución de ácido sulfúrico (0.2
ml), luego se prepararon las soluciones para el análisis, las cuales fueron: 1. Una solución stock
pesando 14.14 mg de dicromato de potasio (K2Cr2O7) y se diluyeron en 100 ml de agua
desionizada y se acidifico con ácido nítrico (HNO3) hasta un pH ≤ 2; 2. Una solución de
difenilcarbazida pesando 150 mg de 1,5 difenilcarbazida (C13H14N4O) diluyéndola en 50 ml de
acetona; y 3. Una solución acida mezclando partes iguales de ácido sulfúrico con agua
desionizada (1:1). posteriormente se realizó una curva de calibración con la solución stock
realizando diluciones seriales hasta obtener concentraciones de 0,25 hasta 4,0 ppm, esto teniendo
23
en cuenta que en 1 ml de la solución hay 50 µg de cromo hexavalente, a cada uno se le agrego
1ml de la solución de difenilcarbazida, se dejó reposar por 10 minutos para desarrollar color,
luego se pasaron por el espectrofotómetro y se obtuvieron las absorbancias que se digitaron en el
programa Microsoft office Excel para graficar la curva y así obtener la ecuación de la pendiente y
el R2 que son valores que ayudan a conocer la eficacia de la curva. Simultáneamente se
prepararon las muestras de agua para el análisis, para esto fue necesario realizar diluciones
seriales para que la concentración entrara dentro de los valores de la curva de calibración,
después de realizar las respectivas diluciones, se les agrego 1 ml de la solución de
difenilcarbazida y se dejó reposar 10 minutos para desarrollar color. Tanto las muestras como las
diluciones para la curva de calibración se leyeron a 540 nm con celdas de 5cm de paso óptico.
(Ver Figura 8b)
Figura 8. A. Izquierda: Espectrofotómetro Genesys 10s uv-vis para la determinación de cromo.
B. Derecha: celdas utilizadas propias del equipo.
2. 3. 2. Sometimiento.
El valor de cromo hexavalente para la realización del sometimiento de los peces Betta
splendens se calculó de acuerdo a los valores obtenidos con las pruebas de espectrofotometría
visible; así, se tomó un valor promedio de las concentraciones obtenidas en cada muestra
colectada en la cuenca baja del rio Tunjuelo, para esto se tomaron 1.2 gramos de dicromato de
potasio (K2Cr2O7) y se disolvieron en 15 litros de agua que es la cantidad a la que se cultivaron
los peces. Este sometimiento se realizó por 2 meses calendario; debido a que estos peces son
tropicales y en la mayoría de los casos son importados, se realizó adicionalmente un tratamiento
antimicrobiano y antiparasitario utilizando azitromicina (15 mg) y albendazol (15 mg)
respectivamente antes de realizar el sometimiento con el dicromato de potasio, según lo
propuesto por Rojas et al, 2012. Además de esto, siempre que se realizaba el mantenimiento y
limpieza del acuario (cada 4 días) se sometían a los peces a un tratamiento con azul de metileno
24
(ver figura 9) evitando así el crecimiento de agentes patógenos y conservando a los organismos
en buenas condiciones. Como se sabe la presencia de virus, bacterias, hongos y/o parásitos
puedes afectar la estructura tisular y se pueden ver afectados los resultados, siendo de vital
importancia realizar estos tratamientos presometimiento.
Figura 9. Tratamiento con azul de metileno de los peces cada 4 días, mientras se realizaba
la limpieza del acuario.
Las medidas con las cuales se construyó el acuario fueron 12,25 cm de alto y 37 cm de
ancho y largo, estas medidas se utilizaron para conocer la capacidad que tiene el acuario
(12,25x37x37/1000), los peces Betta splendens necesitan de aguas poco profundas que tengan
una mayor área para su movilidad y para sobrevivir, razón por la cual el acuario fue más ancho y
largo que alto. el sometimiento se realizó en el mismo acuario para esto se utilizaron vasos
plásticos de 14 onzas a los cuales se les realizaron varios orificios para que circulara el agua, allí
se almacenaron los machos, y las hembras estaban ocupando el espacio restante del acuario,
aunque para el mantenimiento de estos peces no es necesario la entrada de aire al agua, se utilizó
una entrada de aire aleas ap-2000, para generar un flujo de agua que no permitiera que el reactivo
de sometimiento se sedimentara, además se utilizó un filtro elite biofoam para que el alimento
sobrante que se les daba dos veces al día, no afectara la calidad del agua y así las condiciones
sépticas de la prueba; este filtro no afecto la absorción del dicromato de potasio (K2Cr2O7)
debido a que este ya está disuelto en agua y no es lo suficientemente especifico para capturar
iones como los del cromo, los peces se cultivaron a una temperatura de 28°c. (Ver Figura 10)
25
Figura 10. Adecuación del acuario de sometimiento, obsérvese el filtro con la entrada de
aire en la parte superior y el termostato al lado izquierdo, los Betta machos se encuentran en
vasos de 14 onzas y las hembras nadando libremente.
2. 3. 3. Histotécnia.
Después de realizar el sometimiento de Betta splendens, se procederá a realizar la técnica
histológica que consiste en 6 pasos fundamentales para la obtención de los micropreparados: el
primero es la fijación de los órganos a trabajar, para esto se debe realizar una disección muy
cuidadosa con ayuda de un estereoscopio para no dañar los órganos, luego se agregan a una
solución de formol bufferizado al 10%, se dejan por 24 horas y apenas se cumplan este tiempo se
realizó otro cambio de formol para así sacar moléculas que interfieran con la técnica y se de una
fijación eficiente (las muestras de tejido nervioso se dejaron en fijador 8 días y luego se realiza el
recambio, por el tamaño de la ´pieza se realizó una descalcificación del cráneo y columna
vertebral con acido nítrico al 10 % durante 4 horas), luego cada órgano se coloca en un casete
para micrótomo este proceso se debe realizar hasta el momento de la deshidratación; el segundo,
es la deshidratación se realiza tras someter al órgano o tejido a concentraciones crecientes de
alcoholes desde 70% hasta 96% , el tercero es el aclaramiento o diafanización en el cual se
colocan los órganos en Xilol. Tanto la deshidratación como el diafanizado o aclarado se realiza
dejando los órganos mínimo media hora y los reactivos deben estar a una temperatura de 70 °C.
el cuarto, es la inclusión en parafina, procedimiento por el cual se somete al órgano o tejido a
parafina caliente para su infiltración en el, es necesario realizar el proceso dos veces garantizando
la efectividad de este paso, luego se procede a realizar el bloque con los casetes para micrótomo,
incluyendo el órgano o tejido y cubriéndolo totalmente de parafina con el dispensador de parafina
Leica EG1120 y con ayuda de la pinza para inclusión Leica EGF a 45 °C; En el quinto paso se
procede a realizar los cortes con el micrótomo Leica RM2235 (ver Figura 11) aproximadamente
de 3 a 5 micras, simultáneamente a medida que van saliendo los cortes se van colocando en un
baño flotador Leica HI1210 que contiene gelatina química (gelatina sin sabor) que evita que el
corte se doble sobre sí mismo; posteriormente y como sexto paso se procede a hacer la tinción
comenzando con una rehidratación con xiloles para extraer la parafina restante y con alcoholes
para hidratar nuevamente el tejido, luego se procede a utilizar hematoxilina y eosina como
26
tinciones fundamentales (se utiliza agua amoniacal para permitir la eficacia de la absorción de los
colorantes), posteriormente se vuelven a pasar por Xilol y alcohol esta vez para retirar los
sobrantes de la tinción y se procede a poner la resina y montar la laminilla. Y por ultimo se
procede a la evaluación microscópica de los tejidos fijados. (Técnica modificada de (Ross et al,
2008), (Estrada et al, 1982), (Montuenga et al, 2015))
Figura 11. Micrótomo para la realización de micropreparados animales.
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS.
3.1. ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE AGUA POR ESPECTROFOTOMETRÍA.
3.1.1 Curva de calibración.
Tabla 2: absorbancias para la realización de la curva de calibración.
Siempre que se necesita realizar un análisis por espectrofotometría se deben llevar las
soluciones a una concentración mínima para que el equipo pueda realizar un buen registro, sí las
muestras están muy saturadas la radiación de luz no alcanza a pasar por los filtros del equipo y no
se puede medir la absorbancia ni transmitancia del compuesto a analizar. En este caso se analizó
la absorbancia para cromo hexavalente, las muestras se diluyeron tomando un rango de 0.25 a 4
% usando la solución stock de dicromato de potasio (K2Cr2O7). Teniendo en cuenta que esta
solución tiene una concentración de 71.1 PPM de cromo hexavalente, se realizó el registro
espectrofotométrico con celdas de 5cm de paso óptico a 540 nm de radiación, se obtuvieron las
ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN
0,048 0,25
0,106 0,5
0,234 1
0,495 2
0,748 3
0,988 4
27
absorbancias que se muestran en la tabla 2. Con estos resultados se procedió a realizar la curva de
calibración en el programa Microsoft office Excel, obteniendo un gráfico de absorbancia vs
concentración (Figura. 12). Una vez que está listo el grafico, con ayuda del mismo programa se
calculó la línea de tendencia (pendiente de la recta) y el R2, ecuaciones necesarias para
determinar la concentración de cada una de las muestras.
Figura 12. Curva de calibración.
Una vez determinada la ecuación de tendencia (pendiente de la recta) y el R2, se procede a
realizar la tabla de concentraciones (tabla. 3) utilizando los siguientes datos: la pendiente de la
recta que nos muestra la siguiente ecuación y=0.2527x-0.0162, en donde Y: es la concentración
final de la muestra de agua y X: es la absorbancia real del compuesto, y el R2 que es necesario sea
cercano a 1, en este caso el R2 es 0.9998 lo que da confiabilidad a la prueba.
3. 1. 2. Concentración de cromo hexavalente.
Una vez determinada la ecuación de pendiente de la recta y el R2, se procedió a realizar la
tabla de concentraciones, que se muestra a continuación: (Tabla 3) para cada una de las muestras
se realizó un registro con y sin el reactivo colorimétrico: la difenilcarbazida, este procedimiento
delimita el resultado debido a los interferentes que pueden tener las muestras de agua, calculando
la absorbancia real por medio de la resta de la absorbancia con la difenilcarbazida y la
absorbancia sin la difenilcarbazida. Luego la absorbancia real se multiplica por el factor de
disolución (FD) que se les realizo a cada una de las muestras, la concentración se obtiene
despejando la ecuación de la pendiente.
Muestras
de agua
Absorbancia sin
difenilcarbazida
Absorbancia con
difenilcarbazida
FD Absorbancia
real
concentración Concentración *
FD
1 0,028 0,758 4 0,730 2,953 11,812
2 0,029 0,411 4 0,382 1,576 6,303
y = 0,2527x - 0,0162 R² = 0,9998
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
abso
rban
cia
concentración
28
3 0,044 0,693 4 0,649 2,632 10,529
4 0,040 0,415 4 0,375 1,548 6,192
5 0,026 0,411 4 0,385 1,588 6,351
6 0,037 0,399 4 0,362 1,497 5,987
7 0,028 0,424 4 0,396 1,631 6,525
8 0,033 0,385 4 0,352 1,457 5,828
9 0,035 0,363 4 0,328 1,362 5,448
7,219
1 0,046 0,905 40 0,859 3,463 138,536
2 0,043 0,92 40 0,877 3,535 141,385
3 0,040 0,937 40 0,897 3,614 144,551
4 0,045 0,841 40 0,796 3,214 128,564
5 0,045 0,933 42 0,888 3,578 150,283
6 0,034 0,953 40 0,919 3,701 148,033
7 0,039 0,968 40 0,929 3,740 149,616
8 0,052 0,946 40 0,894 3,602 144,076
9 0,044 0,745 40 0,701 2,838 113,526
139,841
Tabla 3: concentración de cromo hexavalente en cada una de las muestras de agua.
La concentración promedio de las muestras de agua provenientes del rio Tunjuelo es de
73.53 PPM, la concentración en el sitio de vertimiento es de 139.841 PPM esta concentración se
diluye cuando entra al agua a 7.219 PPM debido al caudal del rio. El ministerio de ambiente y
desarrollo sostenible en su resolución 0631 establece que la concentración para los vertimientos
de cromo por parte del sector industrial de las curtiembres debe ser de 0,50 mg/l (PPM) en
conformidad con el artículo 5 de la ley 99 de 1993, el artículo 28 del decreto 3930 de 2010, y el
articulo 1 del decreto 4728 de 2010. Como se evidencio en este estudio los vertimientos son muy
altos lo que indica un alto grado de contaminación por parte de estas curtiembres. los principales
procesos que se dan a nivel de esta industria son el recurtido y teñido de pieles finas, cueros y
pieles sin depilar, incluye las operaciones tales como: descarnadura (extracción de grasa y tejidos
subcutáneos), raspado (igualar la piel por proceso de cepillado del lado de la carne), curtido,
engrase, blanqueado, esquilado (corte), depilado y teñido de pieles y cueros con pelo; producción
de cueros curtidos (cueros imputrescibles) y adobados o recurtidos (cueros con procesos más allá
del curtido con excepción del engrasado); fabricación de cueros engamuzados, apergaminados,
charolados, metalizados, grabados; fabricación de cueros regenerados y fabricación de juguetes
caninos de carnaza (Poveda, 2005). Este alto índice de contaminación viola los parámetros del
artículo 49 de la constitución política donde se establecen los parámetros básicos del saneamiento
ambiental por parte del Estado, los artículos 79 y 80 de la constitución política donde se obliga al
estado a proteger la diversidad e integridad del ambiente, fomentar la educación ambiental para
prevenir y controlar los factores del deterioro ambiental, establecer e imponer sanciones legales y
exigir la reparación de los daños causados; se evidencia también el incumplimiento de los actores
ambientales como el ministerio de ambiente y desarrollo sostenible en el artículo 28 del decreto
29
3930 de 2010, modificado por el artículo 1 del decreto 4728 de 2010 donde se fijan los parámetro
y valores límites máximos permisibles que deben cumplir los vertimientos puntuales a las aguas
superficiales y los sistemas de alcantarillado público; y además el artículo 5 de la ley 99 de 1993
donde se establece la regulación de las condiciones generales para el saneamiento del medio
ambiente y dictar las regulaciones de control y reducción de la contaminación hídrica en todo el
territorio.
3. 2. CULTIVO DE LOS PECES.
3. 2. 1. Betta splendens machos.
A B
D C
30
Figura 13. Betta splendens machos.
3. 2. 2. Betta splendens hembras
E
F G
B A
31
Figura 14. Betta splendens hembras.
D
F
E
G
C
32
Tanto los peces Betta hembras y machos enumerados con las letras A, B, C son los
organismos a los que no se les realizó el sometimiento (organismos control), el resto de los
organismos se les realizo el sometimiento que se describe a continuación.
3.2.3. Sometimiento
Para la realización del sometimiento se tomaron 1.2 gramos de dicromato de potasio
(K2Cr2O7) y se disolvieron en 15 litros de agua que es la capacidad del acuario (ver figura 15),
para que los peces reaccionaran mejor a esta alta concentración, se realizó un sometimiento
parcial así: un día en el acuario de sometimiento y un día en agua limpia, dos días en
sometimiento y un día en agua limpia y así sucesivamente hasta los 4 días que se les realizó el
mantenimiento, después de que los peces estaban “aclimatizados” se realizó el sometimiento total
hasta cumplir los dos meses. Fue de vital importancia bloquear la entrada de luz al acuario, esto
se realizó forrando el exterior del acuario con papel aluminio y bolsas negras de basura con el
objetivo de mantener constante el ion hexavalente del cromo; el cromo es un elemento
fotosensible cuando se diluye en agua lo que puede afectar el grado de valencia (CSEM, 2011),
esta es una de las razones por la cual la toma de las muestras se realizó a horas crepusculares.
Figura 15. Acuario de sometimiento.
En los dos meses que se realizó el sometimiento se observaron cambios etológicos
delimitados por la expansión de las branquias, a pesar de que realizaban apneas más constantes
33
(en menos de tres minutos) las branquias siempre estaban expuestas, también se presentaron
cambios en la motricidad y coordinación del nado de los peces en los cuales la respuesta
muscular era diferente y tardía (nadaban baca abajo y respondían lentamente a estímulos tanto
táctiles como alimenticios); la competitividad de los machos se redujo, ya no mostraban signos
de territorialidad como los que mostraban sin el sometimiento (apertura opercular, expansión de
aletas, formación del nido burbuja).
3.3 CAMBIOS HISTOLÓGICOS.
3.3.1 cambios a nivel de sistema nervioso central (encéfalo y medula espinal)
La expansión de las branquias y las apneas constantes permiten determinar la respuesta
fisiológica de estos peces ante la hipoxia, la hipoxia generalizada en neuronas se evidencia
porque la respuesta de las células es contraerse y hacerse basófilas, la cromatina comienza a
condensarse y fracturarse razón por la cual el núcleo se observa de aspecto granular (Stevens et
al, 2009) (ver figura 17c). En las células de la neuroglia no se evidencian cambios estructurales
importantes, sin embargo se evidencia un aumento en las poblaciones microgliociticas y
oligodendrociticas que reciclan la mielina (ver figura 17b) en mayor proporción que la
poblaciones astrociticas respectivamente, al verse comprometidas las neuronas, el sistema
fagocítico se activa y se produce proliferación asociada de las células glía, proceso que se conoce
como Gliosis y que es un diagnostico histológico de un daño a nivel neuronal (Bibbo et al, 2008).
Después de la lesión o necrosis neuronal, la curación a través de la formación de tejido de
granulación y cicatrización fibrosa generalmente no se produce debido a la relativa falta de
fibroblastos en el sistema nervioso central (ver figura 16b). Inicialmente aparece una respuesta
exudativa, con activación de la microglía local y el reclutamiento de monocitos fagocíticos que
fagocitaran el tejido muerto. Esta fase continúa con la proliferación de astrocitos para formar una
cicatriz astrocítica. Si existe una necrosis tisular extensa la respuesta gliocítica puede ser
insuficiente para reparar todo el defecto quedando un espacio lleno de líquido y rodeado por
células glía (Stevens et al, 2009). Según la ontogenia, en el sistema nervioso central de los peces
los cuerpos neuronales, somas, o sustancia gris se ubican mas cerca a los ventrículos cerebrales y
poseen neuronas granulares (ver figura 17a), razón por la cual la Gliosis solo se observa a este
nivel, también se puede determinar por el aumento de poblaciones microgliociticas a nivel del
tallo cerebral (ver figura 18b) que el cromo presenta también una mayor absorción a nivel de el
liquido cefalorraquídeo que al estar contaminado con este metal es propenso a tener
concentraciones bajas de oxigeno y producir oxidación del medio extracelular razón por la cual el
transporte a través de la membrana y a su vez los potenciales se ven afectados, esta es una de las
razones del aumento astrocítico que fortalece la barrera hematoencéfalica (ver figura 19b). Con
este sometimiento, en los tejidos no se observan alteraciones tumorales como los neurogliomas:
glioblastoma multiforme, oligodendrogliomas, astrocinomas y microgliomas, aunque mayores
exposiciones a este metal si las pueden causar y siendo así las células presentarían un núcleo
redondeado uniforme y se evidenciaría un citoplasma vacuolado perinuclear (Milikowski, 2013).
34
Figura 16. Corte transversal de lóbulo óptico 40x H&E. A. corteza cerebral del organismo
control, B corteza cerebral del organismo con el sometimiento, obsérvese la infiltración de
células glía (flechas).
V
A
B
A
B
V
C
35
Figura 17. Corte transversal de mesencéfalo, H&E A. corteza cerebral del organismo control 40x,
obsérvese las neuronas granulares (flechas) cercanas al tercer ventrículo (V) (acueducto de
Silvio), B corteza cerebral del organismo con el sometimiento 40x, obsérvese la mayor
infiltración de oligodendrocitos (núcleos redondos y oscuros). C. respuesta neuronal ante la
hipoxia: neurona normal (flechas rojas), neurona mas basófila (flechas verdes) 100x.
Figura 18. Corte transversal de tallo cerebral 40x H&E. A. organismo control. B. organismo con
el sometimiento, obsérvese mayor infiltración microgliocítica (núcleos alargados) y
oligodendrocítica (núcleos redondos y oscuros).
Figura 19. Corte longitudinal de medula espinal 100x H&E. A. organismo control. B organismo
con sometimiento, obsérvese mayor cantidad de astrocitos (flechas)
3.3.2 cambios a nivel de tubo digestivo
El sistema digestivo de los peces está compuesto por boca, faringe, un corto esófago,
estómago e intestino, este último no esta diferenciado debido a la presencia de ciegos pilóricos
cuya función es la absorción, generalmente presentan como glándulas anexas un hígado
bilobulado, páncreas indiferenciado y en algunos casos dependiendo del tipo de alimentación una
vesícula biliar no muy grande (Storer et al, 2010). los peces de la especie Betta splendens no
poseen vesícula biliar en este caso el hígado es el encargado de producir las enzimas peptídicas y
las sustancias de desecho como la bilirrubina y la biliverdina después de la eritrólisis o hemólisis,
A
A
B
B
36
solo cuando sean necesarias. Solo se realizaron cortes de intestino, los otros órganos, por el
tamaño de los peces, son de difícil acceso y es muy complicado sacarlos en la disección sin
dañarlos, el intestino de los peces esta compuesto por una capa mucosa (enterocitos formando
criptas), una capa submucosa (fibroblasto/fibrocitos), y una capa muscular (musculo liso visceral
o unitario), en estas capas por ontogenia del sistema linfático en peces, no se evidencia la
presencia de nódulos linfoides asociados a las mucosas (ver figura 20a) y cuando se encuentran
se considera como un proceso patológico. La manifestación linfoide en la capa submucosa del
intestino de los peces a los que se les realizo el sometimiento permite determinar la presencia de
una hiperplasia linfoide (ver figura 20b), estas hiperplasias constituye un pequeño porcentaje de
patologías malignas del sistema digestivo en especial del intestino, se distinguen
histológicamente por la presencia de linfocitos polimórficos envueltos en una estructura fibrosa
de tejido conectivo y también se evidencia la presencia de macrófagos con núcleo alargado (ver
figura 20c); a diferencia de los linfocitos normales en esta hiperplasia se observan los linfocitos
con el núcleo granular y abundante citoplasma (Bibbo et al, 2008). Generalmente estos linfomas
se originan a nivel del tejido conectivo y pueden seguir su crecimiento hasta llegar a ulcerar la
mucosa, algunos cambios regenerativos pueden afectar las celular epiteliales hasta llegar a
infiltrar todo el intestino, la presencia de ciertos patógenos pueden potenciar estos proceso como
citomegalovirus, Giardia y Helicobacter, así como ciertas toxinas y sustancias ajenas como el
cromo, pero por la misma función absortiva del intestino el cromo siempre esta infiltrándose en
los tejidos submucosos potencializando el desarrollo de esta patología, en este caso si se
evidencia una cicatrización fibrosa debido a que esta malformación ocurre a nivel del tejido
conectivo (Stevens et al, 2009).
A
B
C
M
S
Ms
Cp
37
Figura 20. Corte transversal del intestino H&E. A. organismo control 40x. Capa mucosa M, capa
submucosa S, capa muscular Ms. B. organismo con el sometimiento 40x, observes la
acumulación linfoide en la submucosa (circulo). C. detalle de la acumulación linfoide 100x.
Capsula de tejido conectivo Cp, linfocitos polimórficos (flechas).
3.3.3 cambios a nivel de riñón
Los riñones de los peces además de cumplir la función metabólica de excreción y
osmorregulación, también realizan el proceso de hematopoyesis, debido a la ausencia de medula
ósea, razón por la cual es importante observar como es la reacción de estos órganos ante ciertas
sustancias como el cromo, la excreción la realizan un par de riñones mesonéfros y el principal
desecho nitrogenado es la urea (ureotélicos), las nefronas están compuestas por un glomérulo
pero el sistema de túbulos no están muy desarrollado (Storer et al, 2010). En los organismos con
el sometimiento se observa un aumento en el numero de macrófagos (ver figura 21b y 21c), no se
observan alteraciones citológicas estructurales importantes en los glomérulos renales,
posiblemente, debido a que el cromo no se puede filtrar muy bien en los tejidos renales, la
infiltración de macrófagos en la corteza renal se conoce como glomérulonefritis cortical y puede
ser diagnostico de una posible insuficiencia renal, este daño es irreversible y al verse afectado el
glomérulo, se pueden pronosticar daños en los demás componentes del sistema urinario, aunque
no solo en este, sino también cambios irreversibles a nivel de las células precursoras de la
hematopoyesis, al haber un aumento de macrófagos, posiblemente haya un daño en los podocitos
glomerulares por la acumulación de inmunoglobulinas debido a una repuesta inmune mediada
por estas células, cualquiera que sea el mecanismo de daño del glomérulo, el sistema inmunitario
altera toda la función metabólica renal y frena la diferenciación de las células precursoras que
formaran las células sanguíneas (Bibbo et al, 2008). En los cortes no se observan las células
hematopoyéticas pero se relaciona también con un daño a este nivel.
A
B
38
Figura 21. Corte transversal de riñón H&E. A. Organismo control 40x. B organismo con el
sometimiento, obsérvese los macrófagos (flechas, núcleos alargados regulares) 40x.C detalle de
los macrófagos en la corteza renal (flechas) 100x.
3.3.4 cambios a nivel de hígado
El hígado de los peces realiza funciones importantes en los procesos de desintoxicación,
pero también realiza una función importante en la homeostasis de las células sanguíneas, proceso
que se conoce como eritrólisis o hemólisis, que en vertebrados superiores lo realiza el bazo
(Torres et al, 2010), el reciclaje de las proteínas de los eritrocitos es esencial para suplir una
perdida de aminoácidos, el grupo Hemo es una reserva extracelular de hierro y ayuda a catalizar
productos de desecho como la bilirrubina (Cardellá, 2007); tras realizar la disección de los
organismos con el sometimiento se evidencio la presencia de un pigmento verde alrededor del
hígado (ver figura 22), la presencia de este pigmento indica que el hígado esta produciendo una
mayor cantidad de bilis que se esta infiltrando en los demás tejidos, la sobreproducción de esta
bilis esta acompañada de enzimas peptídicas que si se vierten fuera del hígado comienzan a
romper proteínas importantes como las de la membrana celular en un proceso conocido como
autodigestión (Bibbo et al, 2008) pero estos cambios también se evidencian en el parénquima
hepático, la presencia de este jugo biliar comienza a destruir el tejido conectivo que da soporte a
todo el órgano (fibras colágenas, elásticas y en particular las fibras reticulares) (ver figura 23b),
este es el único órgano de los estudiados en donde no se evidencia una activación de los
macrófagos (células de Kupffer), debido a que las vías de acceso de estas células al órgano son
las fibras ya mencionadas que por acción de las bilis se autodigieren, en los hepatocitos no se
evidencian cambios, pero estos al producir mayor cantidad de bilis permiten evidenciar que el
cromo esta alterando la función eritrocitaria y el periodo de vida de los eritrocitos se hace mas
corto, debido a que este metal impide la captación de oxigeno en ellos y así su función en la
respiración celular (Rojas et al, 2012).
C
39
Figura 22. Infiltración de bilis en los organismos con el sometimiento (circulo).
Figura 23. Parénquima hepático 40x H&E. A. organismo control, obsérvese las fibras (flechas).
B. organismo con el sometimiento.
A
B
40
4. CONCLUSIONES.
La importancia de la utilización de peces como organismos de prueba para ensayos de
toxicidad radica en su ubicación y función en los ecosistemas acuáticos, además de que
ocupan diferentes posiciones tróficas en los ecosistemas, al ser organismos vertebrados se
consideran como buenos exponentes para comparar, comprender e interpretar los cambios
en organismos como el hombre.
La importancia de la utilización de peces del orden Anabantiformes en ensayos de
toxicidad radica en la importancia del órgano de laberinto el cual impide una muerte
rápida de los organismos, no sería lo mismo realizar este estudio con individuos que solo
realicen una respiración branquial.
Los análisis químicos de las muestras de agua demuestran que los actuales vertimientos
del sector industrial de las curtiembres en el rio Tunjuelo son muy altos, la contaminación
no solo de cromo sino de los otros componentes del vertido están afectando sistémica,
funcional, y ecológicamente las poblaciones aledañas, y aunque estos vertimientos causen
condiciones abióticas en los ríos es de vital importancia conocer estudios que busquen la
restauración ecológica de los mismos.
Se evidencia mediante el análisis histológico los daños fisiopatológicos que le genera a
los peces estar expuestos a este tipo de contaminante, podemos comprender como se
comportan las células y los tejidos y debido a esto establecer los daños causados.
El sometimiento con la concentración promedio de cromo genera procesos patológicos
importantes, entre ellos, la hiperplasia linfoide evidenciada en el intestino confirma los
daños cancerígenos que puede llegar a causar este contaminante y que posiblemente
también pueda desarrollarse en personas que estén constante mente expuestas al cromo.
Seguir generalizando estos estudios de histopatología experimental permitirá contrarrestar
el impacto ambiental que causan ciertas industrias, siendo de vital importancia ya que
permite tener pruebas suficientes del daño que estas causan al ecosistema que es hábitat
de todos.
41
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