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Departamento de Bioquímica
Facultad de Química UNAM
0113 Aplicaciones de Bioquímica y Biología Molecular
Interacciones moleculares entre plantas y microorganismos.Diagnóstico y detección de enfermedades cuarentenarias en
MéxicoUso de técnicas moleculares
Facultad de Química
Semestre 2017-2
Dr. Javier Plasencia de la Parra
Detección Molecular de Patógenos en Plantas
• Detección de un patógeno difícil de aislar y/o mantener en cultivo (virus, micoplasmas)
• Detección e identificación de un patógeno antes de la aparición de síntomas o en plantas asintomáticas. Manejo propicio de la enfermedad.
• Detección del patógeno en material propagativo (semillas, tubérculos, bulbos, stock)
– Certificación de lotes de semillas (“libre de virus”)
– Decisión sobre el manejo del material
– Medidas cuarentenarias
• Detección de reservorios de patógenos.
• Cuantificación de la biomasa del patógeno => Resistencia
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Información sobre los síntomas permite ir delimitandola naturaleza del problema.
Es un patógeno, un plaga o un problema abiótico?- síntomas y signos de la enfermedad- información sobre el medio ambiente y el cultivo
Si se trata de un patógeno....- ¿es hongo?- ¿es bacteria?- ¿es virus?- ¿es viroide?- ¿es fitoplasma?
El primer paso: el aislamiento del agente causal
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• Si se sospecha que el agente causal es una bacteria o un hongo, pero su identidad no es clara.
• Medios diferenciales y selectivos.
• Medios diferenciales: permite observar caracaterísticas particulares de la morfología colonial del patógeno.
• Medios selectivos: permiten el crecimiento del organismo.
Medios diferenciales y selectivos
Medio King-B. Pseudomonas syringae presenta colonias fluorescentes.
Xanthomonas campestris presenta colonias “mucosas” por la producción de xantanos.
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Identificación de bacterias. Además de pruebas bioquímicas convencionales, se realizan pruebas in planta.
Erwinia cartovora causando pudrición en papa.
Pseudomonas syringaeproduce una reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco.
Identificación
de bacterias
fitopatógenas
Laboratory Guide for the Identification of Plant Pathogenic Bacteria
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Uso de plantas indicadoras para identificar virus
Ciertas especies y variedades de plantas muestran síntomas característicos al ser infectadas por un virus.
La recopilación de la información permite determinar el tipo de virus.
Inoculación mecánica, por insectos o a través de injertos.
Pruebas de síntomas de virus en plantas indicadoras.
TSWV: Tomato spotted wilt virus
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Inoculación de virus usando insectos
Transmisión de virus por injertos.
Observación de síntomas en el injerto.
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Purificación de las partículas virales a partir de tejido infectado.
– Precipitación con PEG.
– Centrifugación en gradiente de densidad.
– Cristalización.
– Cromatografía.
– Microscopía electrónica.
Observación de cuerpos de inclusión en el tejido infectado para identificar virus
Cuerpos de inclusión del virus de mosaico de la soya.
Virus en cítricos
Análisis por microscopía óptica.
Mucha experiencia para la identificación e interpretación.
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Identificación de hongos.
Aislamiento en medios selectivos, semiselectivos.
Obtención de un cultivo monoconidial.
Crecimiento en medios de cultivo indicados:
- Velocidad de crecimiento
- Presencia de micelio aéreo y color de éste
- Color de la parte posterior de la colonia
- Color de la masa de esporas.
- Tamaño de las conidias.
- Forma de las conidias.
- Forma de las células basales y apicales.
- Forma de agrupamiento de las conidias.
- Conidióforos.
- Clamidoesporas.
Aislamiento de Fusarium sp. en agar– PCNB (pentacloro-nitrobenceno)
Obtención de cultivos monospóricos. Uso de claves y manuales para la identificación de hongos.
Formación de picnidios en hoja de clavel.
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Las micotoxinas son metabolitos secundarios de bajo P.M.
Producidos por hongos filamentosos que crecen en granos pre y post-cosecha.
Métodos tradicionales de detección:
Extracción
Purificación
Análisis de la toxina (HPLC, TLC, GC)
Identificación y análisis de micotoxinas
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Los análisis cuantitativos por ELISA se deben validar contra análisis cromatográficos:
HPLC / GC-MS
Se aprovechan las propiedades espectroscópicas de algunas toxinas (fluorescencia, absorción luz UV) para su detección.
Se forman derivados para obtener un compuesto volátil (GC) o fluorescente (HPLC).
Para muchos de los métodos de diagnóstico e identificación se requiere personal entrenado y con mucha experiencia para la:
• Interpretación de los síntomas
• Identificación de un hongo
• Purificación y caracterización de un virus
• La expresión de síntomas depende de muchos factores
En cada población de patógenos hay una amplia diversidad y pueden predominar distintos genotipos que son indistinguibles morfologicamente pero que varían en:
• Virulencia
• Resistencia a fungicidas
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ADN
ARN
PROTEINA
Transcripción
Traducción
Métodos para la detección específica y de alta sensibilidad de macromoléculas
Métodos de detección de proteínas Inmunoquímicos (serológicos)
• Uso de anticuerpos para detectar e identificar patógenos.
• Rápidos, específicos, sensibles.
• Los anticuerpos detectan antígenos (generalmente proteínas) que se encuentran en la superficie del patógeno.
• Ampliamente usados para la detección e identificación de virus. También se han
desarrollado métodos para bacterias y hongos.
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En la respuesta inmune humoral de mamíferos se producen anticuerpos, que son proteínas que se unen específicamente a
antígenos que se detectaron como extraños
Anticuerpos
Estructura cuaternaria de los anticuerpos
Dos cadenas ligeras (25 kDa c/u; ~220 aa)
Dos cadenas pesadas (55 kDa c/u; ~ 440 aa)
Estabilizadas por puentes disulfuro y enlaces no covalentes.
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Especificidad
• La capacidad que tiene el sitio de unión de un anticuerpo de reaccionar con un solo determinante antigénico.
• La capacidad de una población de anticuerpos de reaccionar con un solo antígeno.
Anti-A Ab
Ag A
Anti-A Ab
Ag C
Reacción cruzada
Anti-A Ab
Ag B
Epitopo compartido
Epitopo similar
La selección del inmunogéno es fundamental en el desarrollo de un inmunoensayo
• Virus: Fracción enriquecida con partículas virales y libre de proteínas de la planta.
RNA cDNA vector de expresión Proteína recombinante
• Bacterias: Fracción del LPS altamente inmunogénica.
– Desarrollado anticuerpos policlonales/ monoclonaes específicos de especie e incluso específicos para alguna cepa particular.
• Hongos: Esporas y extractos de esporas, fragmentos de hifas, proteínas secretadas al medio de cultivo, preparaciones puras de proteínas.
Alta reactividad cruzada entre proteínas de distintas especies y géneros de hongos y también con proteínas vegetales.
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Obtención de Anticuerpos
• Anticuerpos policlonales
• Anticuerpos monoclonales (hibridomas)
• Despliegue de bacteriófagos
ELISA: Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay.
Métodos para detectar la reacción Antígeno-Anticuerpo
Prueba analítica muy versátil y sensible para la determinación cualitativa o cuantitativa de anticuerpos o de antígenos.
Hay varios formatos de ELISA pero siempre involucra la interacción específica entre un anticuerpo y un antígeno en el que uno de estos reactivos está inmovilizado a un soporte sólido.
Antígeno inmovilizado: permite medir la unión de anticuerpos específicos.
Anticuerpo inmovilizado: permite la detección y cuantificación del antígeno.
La reacción Ag-Ac es amplificada y visualizada usando reactivos conjugados a enzimas que, dependiendo del tipo de ensayo, puede ser el mismo anticuerpo que interacciona con el Ag o bien un anticuerpo secundario que reconoce al primer anticuerpo.
Un sustrato cromogénico revela la interacción que se puede cuantificar.
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ELISA: Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay.
Métodos para detectar la reacción Antígeno-Anticuerpo
Las enzimas que generalmente se utilizan para marcar a los anticuerpos son:
Fosfatasa alcalina o peroxidasa.
Antígeno Inmovilizado
Anticuerpo Primario, dirigido vs. el antígeno.
Anticuerpo Secundario, dirigido vs. el anticuerpo 1°
Ensayos directos: el anticuerpo primario está marcado.
Ensayos indirectos: el anticuerpo secundario está marcado.
El formato de ELISA permite el análisis de múltiples muestras (placas 96/384 pozos)
Lectura visual o análisis cuantitativo por espectrofotómetro (lectores multiplacas)
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Las técnicas de ELISA tienen sensibilidad comparables a los radioinmunoensayos (RIA)
Técnica Sensibilidad
Inmuno-precipitación 10 μg/ml – 1 mg/ml
Difusión radial 10 μg/ml – 1 mg/ml
Inmunofluorescencia 0.1 – 10 μg/ml
ELISA (color) 0.1 – 10 ng/ml
ELISA (quimiolum.) 0.01 – 10 ng/ml
Radioinmunoensayo 0.01 – 10 ng/ml
Desarrollo de kits de diagnóstico.
Factores a considerar:
1. Presencia de distintas cepas, razas y patovares.
2. Cultivos y variedades de plantas en la que crecen los patógenos.
3. Interferencia potencial de la sabia de la planta y componentes del suelo.
4. Bajos niveles del patógeno en las plantas y el suelo.
Formato del ensayo.
Sencillo
Robusto
Específico
Reactivos estables
Extracción a partir del tejido vegetal
Ruptura del tejido con agitador mecánico
Molienda de las muestras en nitrógeno líquido.
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Inmunoensayos de flujo lateral (Tiras reactivas)
El ensayo de flujo lateral es una técnica inmunocromatográfica en el que el fluido o extracto en el que se encuentra el analito de interés se mueve a lo largo de un soporte polimérico pasando por varias zonas donde hay moléculas inmovilizadas que se utilizan para detectar al analito.
Membranas: Nitrocelulosa, nylon, poliétersulfonato, polietileno, silica
Nanopartículas: oro coloidal, latex, selenio, carbón, liposomas.
ImmunoStrips®
MuestraAnticuerpo conjugado
Soporte plástico
Zonas o líneas de Rx
Membrana
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Anticuerpo 1
• monoclonal
• específico para elantígeno
• El Ac está unido a una partícula.
Anticuerpo 2
• monoclonal
• específico para elantígeno
• unido a la membrana.
Anticuerpo 3
• específico para el anticuerpo 1
• unido a la membrana
Immunostrip – Tiras reactivas
Algunas características de los inmunoensayos por tiras reactivas.
• Ensayo de un solo paso; no es necesario realizar lavados.
• Rápido y de bajo costo; se requiere un pequeño volumen de
muestra.
• Aplicación en campo pues no se requiere infraestructura costosa.
• Formatos versátiles que permiten desarrollo paras detección de
distintos tipos de moléculas.
• Vida de anaquel larga, a veces sin necesidad de refrigeración.
• Diseñados para pruebas individuales y no para multiensayos.
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MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSDesarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
Thermus aquaticus
TaqDNA Polimerasa
El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente
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Reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR)
• Primers, cebadores o iniciadores (sinónimos)
• DNA polimerasas termoestables
– Taq pol
– Pfu pol
– Vent pol
• Ácido nucleico a analizar
– Generalmente DNA
– Puede ser RNA, si se añade un paso extra de transcripatasa reversa
Características de los cebadores
• Tipos de cebadores
– Específicos
– Al azar
• Longitud de los cebadores
– Temperatura de alineamiento
– Especificidad
• Composición de nucleótidos
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Se requieren varios controles en la reacción de PCR
• Blanco de reacción (todos los componentes, excepto DNA molde.– Control para descartar contaminaciones
exógenas
• Control Negativo– Controls para determinar la especificidad de la
reacción de amplificación– Contiene todos los componentes de la reacción
y un DNA que carece de la secuencia blanco.
• Control Positivo– Controls de especificidad y sensibilidad– Contiente todos los componentes de la reacción
y DNA que contiene la secuencia blanco.
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104 bp
Análisis de los productos de la reacción de PCR punto final por electroforesis horizontal
PCR tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)
• La reacción de PCR es cualitativa (+/-) o estimar niveles relativos del DNA blanco, según el diseño experimental.
• Otro formato de la rección de PCR en el que se añade una sonda (secuencia corta de DNA) o un fluoróforo que detecta los productos de amplificación de la reacción.
• El desarrollo de la reacción y la síntesis de los productos se sigue en tiempo real en termocicladores equipados con detectores de fluorescencia.
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MODEL OF SINGLE AMPLIFICATION
PLOT
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 5 9
13
17
21
25
29
33
37
41
Ct
Rn
Baseline
Muestra
Sin DNA
Curva de amplificación por PCR, tiempo real
# de ciclos
Señal
PCR punto final vs. PCR tiempo real
Las moléculas del fluoróforo se unen en el surco menor del DNA
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Threshold fluorescence level
Threshold cycles for each sample
PCR cuantitativa (qPCR)
• Se establece un nivel umbral de fluorescencia segúnla señal y el fondo.
• Una vezestablecido ese umbral, se determina el cicloen el cual se observa una señaldetectable porencima del umbral.
LightCyclerRoche
iCyclerBioRad
7700Applied Biosystems
5700Applied Biosystems
FluorTrackerStratagene
FluorImagerMolecular Dynamics
real-time
real-time real-timereal-time PCR
hardware
Hay varios modelos de equipos de RT-
PCR
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Ventajas y Limitaciones de la reacción de PCR
• Específica
• Simple, rápida,
• Bajado costos
• Sensible, amplificación a partirde cantidades bajasde DNA
• No es indispensable que el DNA estéintegro
• Flexible
Su alta sensibilidad la hace susceptible a contaminación
Complejidad en el diseño de cebadoresespecíficos
DNA polimerasastermoestables, sensibles a inhibiciónpor contaminantes de la muestra.
