Farmacología I - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MANUAL_26639.pdf · 12 Dr. Andrés Navarrete Castro la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación

Farmacología I

Guión de Prácticas

Facultad de Química, UNAM

Farmacología I

Guión de Prácticas

Andrés Navarrete CastroLiana Medina Cruz

José Luis Balderas López

Facultad de Química, UNAMDepartamento de FarmaciaClave de la materia 1408

Primera Edición 2008 D.F. Ó UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, C.P. 04510, México, Distrito Fedeal. ISBN en trámite

Prohibida la reproducción parcial o total por cualquier medio sin autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales. Impreso y hecho en México

Este material se desarrolló con el apoyo del

Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME) con la clave PE205306

Proyecto: Desarrollo de procedimientos para la enseñanza de la Farmacología Experimental basada en el principio de las 3Rs: Reducción, Refinamiento y Reemplazo de animales de laboratorio.

El contenido de este material fue revisado por los profesores de Laboratorio de Farmacología I del semestre 2007-1.

Índice

Prácticas

1. Marco conceptual del laboratorio de Farmacología ...........................................................9

2. Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50 en un sistema simulado ..........................................................................................13

3. Determinación de la concentración letal 50 (CL50) del dicromato de potasio en Artemia salina .................................................................17

4. Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio ................................23

5. Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en ratones ......................29

6. Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica ..................................35

7. Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios ......................................................39

8. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado ...............................43

9. Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano aislado ....................49

Apéndices

Apéndice I. Tabla de conversión de proporción a unidades Probit ...........................................57

Apéndice II. Técnicas de manejo e identificación de animales de laboratorio (rata y ratón) .............59

Apéndice III. Formato de Consentimiento informado ............................................................65

Apéndice IV. Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP-100 ................................67

La Farmacología es una ciencia experimental por excelencia. Los métodos utilizados para evaluar la seguridad y la eficacia de los fármacos utilizan sistemas biológicos que van desde fragmentos celulares o macromoléculas aisladas hasta poblaciones enteras. En gran parte del proceso de investigación farmacológica se utilizan animales de laboratorio íntegros. Sin embargo, la creciente sensibilidad respecto a la práctica de la experimentación en animales en la investigación y en la enseñanza de las Ciencias Biomédicas, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos de la misma son parte de un debate actual (Jukes y Chiuia, 2003).

La utilización de animales de experimentación en la enseñanza de las prácticas de diferentes asignaturas de las Ciencias Biomédicas y en especial de la Farmacología, ha venido siendo la metodología más empleada por todos los profesores de esta disciplina. Gracias a la utilización de estos animales, los estudiantes han podido apreciar los diferentes efectos y los principios de la acción farmacológica. Entre las prácticas clásicas que se han realizado en la mayoría de los laboratorios de Farmacología, algunas de ellas tienen un componente importante de crueldad y son de poca aceptación por algunos de los estudiantes. Una de las prácticas que no se puede aceptar es la determinación de la dosis letal 50 (DL50) en ratas o ratones, cuya utilidad está en duda como parámetro para estimar la seguridad de los fármacos y sustancias nuevas. Es obvio que el uso de animales era el único método del que disponían los profesores hace algunos años para enseñar esta materia. Pero en los últimos años el avance de la informática, de las tecnologías de la imagen y la disposición de líneas celulares ha permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de los animales para lograr los objetivos docentes que se plantean en las prácticas de laboratorio de Farmacología (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003; Eder et al., 2006).

Los métodos utilizados en la investigación, para la evaluación de la seguridad y/o toxicidad y en la enseñanza están en continuo progreso, ya que los científicos están en permanente búsqueda de posibles alternativas que mejoren la calidad de su trabajo. Ello es debido, en parte, a la lógica evolución de los conocimientos científicos y de sus aplicaciones tecnológicas y, en parte, a consideraciones éticas, logísticas, económicas, sociopolíticas y legales (Sterling y Rispin, 2002).

El número de animales utilizados en Europa con fines educativos es relativamente pequeño comparado con el total empleado en investigación y se ha venido reduciendo en los últimos años, pero a pesar de ello todavía se puede reducir más. En México, el uso de animales en docencia es alto, aunque no se cuenta con datos precisos de cuántos se sacrifican en cada ciclo escolar. Por otro lado, la aplicación de la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) ha sido lenta en los laboratorios de enseñanza de las Ciencias Biomédicas. En cambio, en el artículo 25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se especifica: “aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento… se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos”. En las legislaciones relacionadas con la protección de los animales de todos los países de la Comunidad Europea se considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (Russell y Burch, 1959). Este principio indica

Marco conceptual del laboratorio de Farmacología1.

Dr. Andrés Navarrete Castro12

la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el nuevo sistema aporte el mismo grado de información, de Reducir el número de animales de experimentación cuando su uso sea necesario y se presente como el único método válido y, finalmente, de Refinar las técnicas empleadas con los animales, con el fin de mejorar su eficacia o disminuir el dolor o el grado de sufrimiento infligido (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).

En el caso de la docencia, se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los procedimientos propuestos se pueden citar:

a) Modelos, maniquíes y simuladores mecánicos.

b) Películas y videos.

c) Simulaciones de ordenador y sistemas de realidad virtual.

d) Autoexperimentación en el propio individuo.

e) Experimentos con vegetales, incluyéndose hongos y algas.

f) Uso de material procedente de los rastros.

g) Estudios in vitro con líneas celulares, organismos inferiores como bacterias, nematodos, insectos o peces en etapa temprana.

h) Aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un procedimiento científico (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).

En el Laboratorio de Farmacología I se plantea el desarrollo de procedimientos experimentales y actividades en los que, bajo el principio de las “tres erres”, se reduzca, se reemplace y se refine el uso de animales de labo-ratorio para cubrir los objetivos de la enseñanza experimental de la Farmacología.

Considerando lo anterior, en el laboratorio de Farmacología se realizarán actividades de distintos tipos:

1) Simulaciones. Se realizarán recreaciones en la computadora que permita a los estudiantes la comprensión de aspectos que, sin la necesidad de repetir muchos experimentos, puedan comprender los conceptos y los procedimientos para definir parámetros farmacológicos.

2) Prácticas. Desarrollo de prácticas sencillas, con lo que se pretende conozcan técnicas y hábitos del laboratorio de Farmacología.

3) Demostraciones. En esta categoría se realizan experimentos, que debido a las siguientes razones no es posible que la realicen los estudiantes en forma individual o en grupos pequeños:

a. El experimento requiere de cierta destreza que en una o dos sesiones no es posible que las aprenda el estudiante.

b. La existencia de equipo de laboratorio en número reducido.c. El tiempo limitado para la sesión de laboratorio.

4) Autoexperimentación. Sin poner en riesgo en ningún grado la integridad y la salud de los estudiantes, se realizará una práctica para observar algunos procesos farmacocinéticos de un fármaco (Ácido acetilsalicílico).

Cualquiera que sea la modalidad que se realice, cada uno de ellos debe comprender las siguientes partes:

Manual de Farmacología I. Guión de Prácticas 13

familiarización, ejecución y discusión del procedimiento.

Con ello se pretende:

Facilitar el aprendizaje de los aspectos fundamentales de la Farmacología.•

Familiarizar a los estudiantes con el método científico en experimentos de esta disciplina.•

Enseñar técnicas y hábitos del laboratorio de Farmacología.•

Motivar a los futuros farmacéuticos hacia la investigación y el estudio de la Farmacología como área •de desarrollo profesional.

Bibliografía

Eder C, Falkner E, Nehrer S, Losert U y Schoeffl H. (2006). Introducing the concept of the 3Rs •into tissue engineering research. Altex-Alternativen Zu Tierexperimenten. 23:17-23.

Jukes N, Chiuia M. (2003). • From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE. Londres.

Meyer B, Ferrigni N, Putnam J, Jacobsen L, Nichols D, McLaughlin J. (1982). Brine Shrimp: •A convenient general bioassays for active plant constituents. Planta Medica. 45:31-34.

Russell W, Burch R. (1959). • The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen, Londres.

Tallarida R. (2000). • Drug synergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC. EUA.

Van der Valk J, Dewhurst D, Hughes I, Atkinson J, Balcombe J, Braun H, Gabrielson K, Gruber •F, Miles J, Nab J, Nardi J, Van Wilgenburg H, Zinko U y Zurlo J. (1998). Alternatives to the use of animals in higher education. ATLA 27:39-52

Vinardell P. (2003). Alternativas al uso de animales de experimentación en las prácticas de •fisiología. Boletín de la Sociedad Española de Ciencias Fisiológicas. 6 (1).

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis).

Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal.

I. Introducción

Dentro de las Ciencias Biológicas, entre ellas la Farmacología, los animales muchas veces tienen un papel central en las clases prácticas en el laboratorio. Cientos de millones son usados para experimentos o sacrificados para su disección cada año en todo el mundo.

La visión actual del uso de animales es una educación completamente humana, donde los objetivos de la enseñanza son alcanzados usando métodos alternativos, y donde la compasión, el respeto a la vida y el pensamiento crítico son valorados y desarrollados. Es una visión donde los alumnos tienen libertad de conciencia y la relación negativa con los animales ha sido transformada al pensamiento positivo en lugar de hacer un uso dañino (Jukes y Chiuia, 2006).

Un gran número de compuestos y fármacos cuenta con la determinación experimental de los valores de dosis efectiva 50 (DE50), dosis tóxica 50 (DT50) y dosis letal 50 (DL50). El cálculo de este parámetro se puede predecir mediante ecuaciones que explican el fenómeno farmacológico (Tallarida, 2000). Utilizando los valores descritos en la literatura es posible simular la adición de diferentes dosis o concentraciones de diferentes fármacos en un sistema en computadora, donde el alumno podrá construir curvas dosis-respuesta y, por lo tanto, determinar la DE50, sin el uso de animales de laboratorio.

II. Objetivos

Los objetivos de esta práctica son:

1. Determinar la ventana de actividad biológica de fármacos mediante el uso de un sistema simulado.

2. Aprender el uso de un sistema simulado en computadora.

3. Calcular la DE50 de una serie de fármacos por medio de la ecuación de Hill, con los datos obtenidos en el sistema simulado.

III. Material

a) Software

Se utilizará el software • SimCDR ver. 1.0 desarrollado ex profeso para la práctica por el M en C José Luis Balderas, de la Facultad de Química de la UNAM.

El software puede ser descargado del siguiente vínculo:

http://www.paginasprodigy.com/luisbald

Este programa deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 o posterior.

Determinación de la ventana de actividad biológica y la dosis efectiva 50 en un sistema simulado2.


IV. Procedimiento

a) Manejo del software SimCDR ver. 1.0

Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:

1) Inicio del programa y ejecución de un nuevo experimento simulado.

a) Para iniciar el programa se deben oprimir los siguientes iconos:

b) En la casilla de Fármaco se selecciona el fármaco que se utilizará en la simulación. En la ventana Información del fármaco aparecerán una breve descripción del mismo, así como su actividad farmacológica más importante.

c) Se selecciona el número de dosis así como las unidades que se emplearán, en las casillas Núm. de dosis y Unidades, respectivamente.

d) Se llenan las casillas que aparecen en la ventana Dosis a probar y se oprime el botón Calcular el % de efecto. Si alguna de las casillas anteriores está en blanco, aparecerá un mensaje de error.

e) En la ventana Resultados aparecerán las dosis que se administraron simuladamente y los porcentajes de respuesta que darían.

f) Para iniciar un nuevo experimento simulado, se deberá oprimir el botón Borrar datos o, si se prefiere, cambiar los datos en las casillas correspondientes.


V. Análisis de Resultados

1. Con los datos obtenidos en los experimentos simulados:

a) Construir las curvas dosis-respuesta de los fármacos utilizados.

b) Calcular la DE50 para la actividad principal de los fármacos utilizados mediante la Ecuación de Hill.

VI. Bibliografía

Tallarida R. (2000). Drug• Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC. EUA.

Jukes N, Chiuia M. (2003). • From Guinea Pig to Computer Mouse. 2ª Edición. InterNICHE. Londres.

Número de sesiones sugeridas: 2 sesiones (ejecución y análisis)

Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría, curva dosis-respuesta cuantal.

I. Introducción

Un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos; a su vez, se puede señalar como cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de la respuesta biológica que produce. La relación entre la respuesta biológica y la dosis o la concentración de una sustancia activa se relaciona en la llamada curva dosis-respuesta. Esta vinculación puede darse de forma graduada o la respuesta puede ser de tipo todo o nada, también conocida como cuantal.

En esta práctica se realizará un experimento en que se analizará el segundo tipo de relación curva dosis- respuesta, es decir, se analizará la curva dosis-respuesta cuantal, que debido a la forma en la que se realizará, propiamente se debe referir como la curva concentración-respuesta cuantal. Se utilizará como sistema biológico el crustáceo Artemia salina en su forma adulta y como larva o nauplio, y como sustancia de prueba al dicromato de potasio.

II. Objetivos


1. Manejar un sistema biológico alterno a los mamíferos y roedores para la determinación de una curva concentración-respuesta cuantal.

2. Realizar el cálculo de la CL50 mediante el análisis Probit.

III. Material

1. Utilizando Artemia salina adulta.

a) Material biológico

De 100 a 200 ejemplares adultos de • Artemia salina.

b) Materiales, cristalería y equipo

Un vaso de precipitado de 500 mL•

Una pipeta graduada de 2 mL•

Una pipeta volumétrica de 10 mL•

Determinación de la concentración letal 50 (CL50) del dicromato de potasio en Artemia salina 3.


24 frascos viales marcados para un volumen de 5 mL•

Una lámpara de escritorio.•

Una Pipeta Pasteur con bulbo•

Aereador con manguera y filtro•

c) Reactivos

100 mL de disolución de dicromato de potasio, K• 2Cr2O7 (50 mg/mL).Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 mL con agua destilada.

2. Utilizando nauplios de Artemia salina.


Huevecillos liofilizados de • Artemia salina.


Pecera de vidrio capacidad 2 L•

Pecera de 500 mL•

24 frascos viales marcados para un volumen de 2 mL•

Pipetas de vidrio•

Jeringas de 1 mL•

Foco sumergible de 5 W•

Termómetro para pecera•

Matraz Erlenmeyer de 1 L•

Vasos de precipitados de 100, 500 mL•

Cinco Pipetas Pasteur con bulbo•

Aereador con manguera y filtro•

c) Reactivos

100 mL de disolución de dicromato de potasio, K• 2Cr2O7 (50 mg/mL).

Disolver 5 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 mL con agua destilada.

100 mL de disolución de dicromato de potasio, K• 2Cr2O7 (12.5 mg/mL).

Disolver 1.25 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a un volumen de 100 mL con agua destilada.

500 mL de agua de mar artificial.•

Disolver 16 g de sal marina (o en su defecto cloruro de sodio, NaCl) en 500 mL de agua y colocar dos gotas de anticloro. Dejar reposar por 10 minutos y filtrar si es necesario.

Anticloro (tiosulfato de sodio, Na• 2S2O3, al 1 %).


IV. Procedimiento

1. Utilizando la Artemia salina Adulta.

a) Preparación de la Artemia salina

1) Mantener a la Artemia salina en el vaso de precipitado con aeración constante.

2) Por triplicado rotular los frascos viales con las siguientes concentraciones: 0, 4, 6, 8, 10, 12, 16 y 20 mg/mL y, coloque una marca a un volumen de 5 mL.

3) Colocar 10 artemias en cada vial con ayuda de la pipeta Pasteur como se muestra en la figura siguiente. Utilice la luz de una lámpara como fondo para facilitar el conteo. La cantidad total de agua que resulta de la adición de las artemias debe ser de aproximadamente 1 mL, si es necesario retire el excedente.

b) Adición del dicromato de potasio

1) Adicionar las siguientes cantidades de dicromato de potasio indicadas en la siguiente cuadro:

Concentración (mg/mL) Volumen de la disolución de dicromato de potasio (mL)

0 (Control) 0 4 0.46 0.68 0.8

10 1.012 1.216 1.620 2.0

Artemia Salina


2) Inmediatamente después de la adición de la solución de dicromato de potasio se incorpora la cantidad necesaria de la solución de agua de mar para llegar a un volumen final de 5 mL.

3) Dejar durante una hora en exposición bajo luz blanca.

c) Lectura de resultados

1) Al término del periodo de exposición se contarán las artemias que sobrevivieron de la siguiente manera:

a. Las artemias que presentan movimiento, aunque sea mínimo, se consideran vivas.

b. Las artemias que permanecen inmóviles, se consideran muertas.

2. Utilizando nauplios de Artemia salina.

a) Incubación de los huevecillos de la Artemia salina

1. Se arma el dispositivo de incubación como se muestra en la siguiente figura.

Pecera con dispositivos de incubación (1), aeración (2) e iluminación (3).

2. Se colocan 300 mL de agua de mar artificial en la pecera de incubación.

3. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una temperatura de 26-28°C y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de incubación.

4. Conectar los dispositivos de aeración y luz.

5. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubación con una espátula limpia y seca (aproximadamente 10 µg de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500 mL. Dejar incubar durante 48 h.

b) Preparación de los viales y realización del experimento.

A partir de este momento se seguirán los pasos a), b) y c) del experimento llevado a cabo con artemias adultas, colocando en lugar de éstas a los nauplios. Utilizar la disolución de 12.5 mg/mL de dicromato de potasio, las concentraciones finales serán 0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, y 5 mg/mL respectivamente.


V. Análisis de resultados

1. Se tabulan los datos obtenidos en el siguiente cuadro:

ni ri ni ri ni ri Σ ni Σ ri pi yi

CONTROL

ni = número de artemias utilizadas por concentración por cada repetición Σ ni = número de artemias totales utilizadas por concentración

ri = número de artemias muertas por concentración por cada repetición Σ ri = número de artemias totales muertas por concentración

pi = probabilidad por concentración (pi = Σ ri / Σ ni) yi = unidad probit calculada por tablas a partir de pi

Nota: Recuerde que las concentraciones utilizadas varian de acuerdo al estado de madurez de la artemia utilizada.

CONCENTRACIÓN (mg/mL)

DATOS FINALES1 2 3

REPETICIONES DEL EXPERIMENTO

2. Con los resultados obtenidos:

Construya la curva concentración-respuesta cuantal para el dicromato de potasio.•

Calcule la CL• 50 y sus límites de confianza del dicromato de potasio por medio del análisis Probit. Utilice la tabla de conversión de proporción a unidades Probit del Apéndice I.

3. Con la gráfica realizada y los valores calculados analice:

Los datos encontrados con respecto a los datos informados en la literatura.•

Las ventajas y desventajas de los bioensayos con respecto a los ensayos con organismos superiores.•

VI. Bibliografía

Infante S y Calderón L. (1994). • Manual de análisis probit. Colegio de Posgraduados. México.

McLaughlin J. (1991). Crow gall tumors on potato disc and Brine Shrimp lethality; two simple •bioassay for higher plant screening and fractionation. Methods in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA: 1-30.

Tallarida R. (2000). • Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC. New York.


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, cálculo de parámetros farmacocinéticos

I. Introducción

La Farmacocinética es la rama de la Farmacología que estudia el curso temporal de los fármacos a través del organismo. Comprende los procesos de absorción, distribución y eliminación de los fármacos. Este último, a la vez, comprende los procesos de excreción y biotransformación.

La curva de concentración en función del tiempo se utiliza para determinar los parámetros farmacocinéticos. La forma de la curva concentración-tiempo y los indicadores que se calculan a partir de ella, dependen de la vía de administración y del fluido biológico en el que se lleve a cabo el muestreo y análisis del fármaco. Después de una administración intravenosa es posible determinar los parámetros farmacocinéticos: constante de eliminación (k), volumen aparente de distribución (Vd), concentración plasmática al tiempo cero (Cp°), depuración total (ClT), área bajo la curva (ABC) y el tiempo de vida media (t½). Para cuando el fármaco se administra por una vía que requiere de un proceso de absorción, es decir, el paso del sitio de aplicación a la circulación general, se pueden calcular los parámetros farmacocinéticos: constante de absorción (ka), concentración plasmática máxima (Cpmax), tiempo al que se alcanza la concentración plasmática máxima (tmax), además de k, t½ y ABC.

En esta práctica, mediante el uso de un modelo de vidrio es posible hacer una simulación de la administración del fármaco por vía intravenosa o por otra que requiere de un proceso de absorción. También es posible simular la toma de muestras en sangre y en orina y, con ello, realizar los cálculos de los parámetros farmacocinéticos correspondientes a dichas simulaciones.

II. Objetivos


1. Utilizar un modelo de vidrio para simular la administración de fármacos por las vías intravascular y extravascular.

2. Calcular los parámetros farmacocinéticos para la administración intravascular y extravascular.

3. Comparar el comportamiento cinético del fármaco en función de la vía de administración.

III. Material

a) Materiales, cristalería y equipo

Dos vasos de precipitado de 500 mL con brazo recto•

Pipeta graduada de 5 mL•

Determinación de parámetros farmacocinéticos en un modelo de vidrio 4.


Perilla•

Dos vasos de precipitado de 500 mL•


Seis matraces volumétricos de 10 mL•

Un matraz volumétrico de 25 mL•

Una pipeta volumétrica de 1 mL•

Dos placas de agitación•

Dos soportes universal•

Dos pinzas con nuez•

Un embudo de separación de 1 L•

Un anillo para soporte universal•

Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL•

Un cronómetro•

24 Tubos de ensayo•

Cuatro litros de agua corriente•

Dos barras magnéticas de agitación•

Dos agitadores magnéticos•

Balanza analítica•

Espectrofotómetro•

b) Reactivos

Disolución de Rojo Congo (4 mg/mL)•

Disolver 100 mg del colorante Rojo Congo en 15 mL de agua y aforar a un volumen de 25 mL con agua destilada.

IV. Procedimiento

1. Vía intravascular

a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:


b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen durante todo el experimento.

c) Mantener la agitación constante en el vaso de precipitado A.

d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.

e) Adicionar agua corriente al vaso de precipitado A, llevándolo a un volumen muy cercano para que se inicie el goteo.

f) Adicionar 5 mL de la disolución del colorante al vaso de precipitado A. El momento en que inicia el goteo del vaso se toma como referencia para la toma de muestras.

g) Cuando inicia el goteo, inmediatamente se toma una muestra de 2 mL del vaso A.

h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A de acuerdo a los tiempos indicados en el siguiente cuadro.

Vía intravascularTiempo (min)

Vaso AAbsorbancia Concentración (mg/mL)

Control05

1015202530354045607590

120

2. Vía extravascular

a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:


b) Colocar agua corriente en el embudo de separación, mantener el mismo volumen durante el experimento.

c) Mantener la agitación constante en los vasos de precipitado.

d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.

e) Adicionar agua corriente a los vasos de precipitado, llevándolos a un volumen muy cercano para que inicie el goteo.

f) Agregar 5 mL de la solución del colorante al vaso de precipitado A. La hora en que inicia el goteo del vaso A al B se toma como referencia para la toma de muestras.

g) Cuando inicia el goteo se toma una muestra de 2 mL del vaso A y del B.

h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A y B de acuerdo al cuadro siguiente.

Vía intravascular

Tiempo (min)

Vaso A Vaso B

Absorbancia Concentración (mg/mL) Absorbancia Concentración

(mg/mL)Control

05

1015202530354045607590

120

3. Determinación de las concentraciones del colorante

a) Realizar una curva estándar del pesando 1 mg del colorante, disolverlo en agua destilada, aforar a 10 mL y continuar como se indica en el esquema siguiente:


b) Leer las absorbancias de la curva estándar y de las muestras obtenidas en los experimentos en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm.

Curva estándar de rojo congo

Tubo Concentración (mg/mL) Absorbancia

Blanco 01 3.1252 6.253 12.54 255 506 100

c) Determinar la concentración de las muestras interpolando el valor de las lecturas en la curva estándar.


1. Elaborar una gráfica por cada vía de administración, considerando el logaritmo natural de la concentración [µg/mL] contra tiempo [min].

2. Calcular los parámetros farmacocinéticos t½, Vd, k, ka, ClT, Cpmax, tmax ABC; según la vía de administración simulada.

3. Analizar la importancia de los modelos farmacocinéticos in vitro y de los parámetros farmacocinéticos calculados

VI. Bibliografía

Gumtow R, Proudfoot J y Talada A (1989). An • in vitro pharmacokinetic system for use in the undergraduate pharmaceutics laboratory: a one- and two-compartment pharmacokinetic Bench Model; the glassman patient. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 20(3):25-30.

Rowland M y Tozer T (1995). Clinical pharmacokinetics 3rd Ed. Lea and Febiger. EUA.•

Shargel L, Wu-Pong S y Yu A (2004). • Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacometría y Farmacodinamia.

I. Introducción

En esta práctica se utilizará un modelo sencillo basado en el comportamiento de los roedores al explorar un ambiente extraño. El número de levantamientos sobre sus extremidades traseras está relacionado con un estado de alerta. La disminución en esta conducta por la acción de un fármaco está relacionado con una actividad tranquilizante y en varios trabajos de investigación se ha utilizado para medir el efecto sedante de los depresores del Sistema Nervioso Central (Oliva et al., 2004; Ugalde et al., 2005; González-Trujano et al., 2006).

En esta práctica se contempla determinar la DE50 sedante de pentobarbital sódico y del etanol, utilizando el modelo de Cilindro de Exploración en ratones.

II. Objetivo

El objetivo de esta práctica es:

1. Determinar la DE50 para el efecto sedante del pentobarbital y etanol en ratón, utilizando el modelo del Cilindro de Exploración.

III. Material


Ratones ICR ó CD1 machos de 25-30 g de peso•


Cilindro de exploración (cilindro de vidrio de 11 cm de diámetro interno por 30 cm de altura) •

Jeringas de 1 mL con aguja del número 27•

Balanza para pesar animales•

Marcador de tinta indeleble•

Papel •

Cronómetro•

Contador manual•

Matraz volumétrico de 10 mL•

Seis frascos viales de 10 mL•

Determinación experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en ratones5.


c) Fármacos y reactivos

Anestesal® • (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.

Disolución de Pentobarbital sódico 3 mg/mL.•

Transfiera 0.47 mL de Anestesal® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con disolución salina.

Etanol absoluto.•

Disolución salina fisiológica (0.9%).•

Solución hidroalcohólica al 10%.•

Transfiera 50 mL de etanol a un vaso de precipitados y llévelo a un volumen de 500 mL.

IV. Procedimiento

A. Efecto sedante de pentobarbital

a) Pesado y marcaje de animales

Cada grupo de trabajo recibirá seis ratones. Marque a sus animales con el marcador de tinta indeleble en la base de la cola, péselos y registre el peso de cada animal.

b) Preparación de las disoluciones de pentobarbital sódico

Rotule seis frascos viales con las siguientes leyendas 0, 2.5, 5, 10, 15 y 30 mg/kg. Agregue la cantidad indicada en el cuadro siguiente de la disolución de pentobarbital de 3 mg/mL y de disolución salina al 0.9%(p/v):

Frasco vial Dosis (mg/kg)

Volumenes a agregar (mL)Concentración

(mg/kg)Pentobarbital (mg/kg)

Disolución salina

1 CONTROL 0 3 0

2 2.5 0.25 2.75 0.25

3 5 0.5 0.5 0.5

4 10 1 1 1

5 15 1.5 1.5 1.5

6 30 3 0 3

c) Administración del fármaco

Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada ratón. Administre por vía intraperitoneal 0.1 mL de la disolución correspondiente del fármaco o de la disolución salina por cada 10 g de peso del animal y registre el tiempo al que lo administró.


d) Desarrollo del experimento

Cilindro utilizado en la prueba de exploración.

1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.

2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor al diámetro del cilindro (pueden ser hojas recicladas).

3) Treinta minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca al animal en el cilindro de exploración.

4) Ponga a funcionar el cronómetro y registre el número de levantamientos que realiza el animal en un período de 5 minutos. Sólo una persona deberá cuantificar esta conducta para que sean analizados bajo el mismo criterio.

5) Limpie con la solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.

6) Continúe con el mismo procedimiento para los cinco animales restantes. No olvide limpiar el cilindro entre cada prueba.

7) El animal que recibió la solución salina se toma como control.

Ratón Peso (g) Dosis (mg/kg)

Tiempo (h:min) Núm. de levantamientosAdmón. Inicio Final

1 0 30 352 6 36 413 12 42 474 18 48 535 24 54 596 30 01:00 01:05

B. Efecto sedante de etanol

a) Preparación de las soluciones de etanol absoluto

Rotule seis matraces aforados de 10 mL con las siguientes leyendas 0, 500, 1000, 2000, 2500 y 3000 mg/kg. Agregue la cantidad indicada en el cuadro siguiente de etanol absoluto y afore con solución salina al 0.9% (p/v):


Frasco vial Dosis (mg/kg)

Volúmenes a agregar (mL) Concentración (mg/mL)Etanol absoluto Disolución salina

1 Control 0 10 02 500 0.63 9.37 503 1000 1.26 8.74 1004 2000 2.52 7.48 2005 2500 3.16 6.84 2506 3000 3.8 6.2 300

b) Administración del fármaco

Asigne aleatoriamente las dosis que recibirá cada animal. Administre por vía intraperitoneal 0.1mL de la solución correspondiente del fármaco o de la solución salina por cada 10 g de peso y registre el tiempo al que lo incorporó.

c) Desarrollo del experimento

1) Cerciórese de que el cilindro de vidrio está seco y limpio.

2) Coloque el cilindro sobre un trozo de papel mayor a su diámetro (pueden ser hojas recicladas).

3) Cinco minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introduzca al ratón en el cilindro de exploración.

4) Registre el número de levantamientos que realiza el animal en un período de 5 minutos. Sólo una persona deberá cuantificar esta conducta para que sean analizados bajo el mismo criterio.

5) Limpie con la solución hidroalcohólica el interior del cilindro y cambie el papel.

6) Continúe con el mismo procedimiento para los cinco ratones restantes. No olvide limpiar el cilindro entre cada prueba.

7) El animal que recibió la disolución salina se toma como control.

Ratón Peso (g) Dosis (mg/kg)Tiempo (h:min) Núm. de

levantamientosAdmón. Inicio Final1 0 5 102 6 11 163 12 17 224 18 23 285 24 29 346 30 35 40



a) Cálculo de la DE50

1) Calcule el porcentaje de efecto por cada dosis, considerando que el número de levantamientos promedio de los ratones control es igual al 0% de efecto.

2) Determine el modelo que siguen los datos obtenidos.

3) Calcule la DE50 para el efecto sedante de acuerdo al modelo determinado.

b) Cálculo de la potencia relativa

1) Calcule la potencia relativa del efecto sedante entre etanol y pentobarbital. Con la relación:

VI. Bibliografía

González-Trujano M, Martínez A, Reyes A, Reyes B y Navarrete A. (2006). Palmitote isolated •from Annona diversifolia induces an anxiolytic-like effect in mice. Planta Medica. 72(8):703-707

Oliva I, González-Trujano M, Arrieta J, Enciso-Rodríguez R y Navarrete A. (2004). •Neuropharmacological profile of hydroalcoholic extract of Valerina edulis ssp. procera roots in mice. Phytotherapy Research. 18(4):290-296.

Tallarida R. (2000). • Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC. New York.

Ugalde M, Reza V, González-Trujano M, Avula B, Khan I y Navarrete A. (2005). Isobolographic •analysis of the sedative interaction between six central nervous system depressant drugs and Valeriana edulis hydroalcoholic extract in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 57:631-639.

Potencia relativa del Etanol(P EtOH)=DE Pentobarbital

DE Etar50

50 nnol


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, vías de administración de fármacos.

I. Introducción

La respuesta farmacológica se puede ver modificada en función de la vía por la cual se administra el fármaco. Esta transformación puede consistir en un simple retraso en la acción y, en otros casos, puede cambiar o anular totalmente el efecto. Algunos pueden sufrir alteraciones en el sitio de aplicación, dando origen a nuevas moléculas que no necesariamente van a presentar la misma reacción o van a seguir la misma farmacocinética. En otros casos, debido a las propiedades fisicoquímicas, no es posible administrarlo por una vía determinada, por ejemplo, un fármaco no soluble en soluciones acuosas no es posible administrarlo por vía intravenosa. Los fármacos irritantes también limitan su aplicación por alguna vía determinada, así que la elección de la forma de administración más adecuada es importante para lograr que se consiga el efecto deseado a una velocidad y a una intensidad idóneas.

En esta práctica se evaluará la forma en la cual la vía de administración modifica la respuesta de un fármaco bien caracterizado como el pentobarbital, para el cual se medirán el período de latencia y la duración del efecto cuando se administra por distintos puntos.

II. Objetivos


1. Determinar la influencia de la vía de administración en la acción farmacológica del pentobarbital.

2. Explicar el significado del período de latencia de la acción farmacológica del pentobarbital.

III. Material


Cuatro ratas Wistar machos de 200-250 g de peso•


Jeringas de 1 y 3 mL•

Cánula para administración esofágica•

Balanza para pesar animales•

Cronómetro•

Influencia de la vía de administración sobre la respuesta farmacológica6.



Anestesal• ® (pentobarbital sódico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.

Disolución de Pentobarbital sódico 40 mg/mL. • Transfiera 6.35 mL de Anestesal ® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con disolución salina. En el invierno use una disolución de 30 mg/mL: Transfiera 4.76 mL de Anestesal® a un matraz volumétrico de 10 mL y llévelo al aforo con disolución salina.

Disolución salina fisiológica (0.9%).•

IV. Procedimiento

1) Pesado y marcaje de animales

Cada grupo de trabajo recibirá cuatro ratas. Marque a sus animales con el marcador de tinta indeleble, péselos y registre el peso de cada uno.

2) Desarrollo del experimento

a) Asigne aleatoriamente el tratamiento que recibirá cada animal: vía oral, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular y anótelo en el cuadro de abajo. Administre 0.1 mL por cada 100 g de peso de la solución del fármaco por la vía de administración que le corresponde a cada animal y registre el tiempo en el cuadro de abajo.

b) Registre el tiempo en el cual el animal pierde el reflejo de enderezamiento, que se caracteriza por el hecho que al ponerlo sobre su dorso no presenta resistencia para intentar volver a su posición natural. Este tiempo se denomina Latencia.

c) La duración del efecto corresponde al tiempo entre la pérdida del reflejo de enderezamiento y el lapso en el cual el animal vuelve a su posición natural.

d) Cubra al animal con un lienzo de franela para reducir la hipotermia producida por el fármaco.

e) Registre sus datos en el cuadro siguiente.

RataNúm.

Peso (g)

Vía de administración

Volumen a administración

(mL)

Tiempo de administración

(min)

Tiempo de administración

(min)

Efecto

Inicio (min)

Término (min)

Duración (min)

1

2

3

4



a) Construya una gráfica para el período de latencia y otro para la duración del efecto en función de la vía de administración.

b) Realice el análisis estadístico correspondiente para indicar si hay o no influencia de la vía de administración en el efecto del pentobarbital.

VI. Bibliografía

Rowland M y Tozer T. (1995). • Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger, EUA.

Shargel L, Wu-Pong S y Yu A. (2004). • Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacocinética, excreción de fármacos

I. Introducción

La eliminación de fármacos comprende dos procesos: la excreción y la biotransformación. La excreción renal es la principal vía como se desecha gran cantidad de fármacos. Cuando existe una disminución en la eliminación por esta forma puede tener complicaciones importantes, ya que se debe modificar el esquema de dosificación y la dosis.

En esta práctica se determinará la eliminación de un fármaco común, el ácido acetilsalicílico, cuantificando en la orina la cantidad de salicilatos totales excretados después de la administración de dos tabletas de 500 mg de este fármaco en voluntarios sanos.

II. Objetivos


1. Identificar a la excreción renal como uno de los procesos principales de la eliminación de fármacos.

2. Determinar la eliminación por excreción renal del ácido acetilsalicílico en voluntarios sanos, así como identificar los factores que influyen en la misma.

III. Material

a) Sujetos de estudio

Criterios de inclusión: Voluntarios adultos jóvenes sanos, de 18 a 20 años de edad, de 55-65 kg de peso, preferentemente del género masculino.

Criterios de exclusión: No entrarán en el grupo personas con problemas gastrointestinales (úlcera gastroduodenal, gastritis), historia de alergias, problemas en su función renal o intolerancia a salicilatos, mujeres con problemas de hemorragias menstruales, ni sujetos que hayan tomado salicilatos en las últimas 24 horas. Cualquiera de estas contingencias debe ser informada al profesor.

Todos los voluntarios deberán contar con el formato de Consentimiento informado, firmado por el voluntario, un testigo y los profesores de laboratorio. El original lo entregarán a su profesor y conservarán una copia (ver Apéndice III).

Excreción renal de ácido acetilsalicílico en voluntarios7.



Un matraz Erlenmeyer de 100 mL•

Cinco matraces Erlenmeyer de 50 mL•

Una gradilla•

10 tubos de ensayo de 10 mL•




Una probeta de 500 mL•




Un matraz volumétrico de 25 mL•

Seis matraces volumétricos de 10 mL•

Placa de calentamiento •

Cronómetro •

Espectrofotómetro•

Potenciómetro•


Agua potable•

Tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg•

Salicilato de sodio•

Reactivo de • Trinder para salicilatos

Se disuelven 10 g de cloruro mercúrico en 200 mL de agua destilada caliente. Cuando la disolución es completa, se enfría y se añaden 30 mL de ácido clorhídrico 1 N. Posteriormente se disuelven 10 g de nitrato férrico en la disolución y se afora a 250 mL con agua destilada.

Amoniaco acuoso (hidróxido de amonio)•

Disolución de ácido clorhídrico 0.1 N•

IV. Procedimiento

a) Preparación y toma de muestras

Rotular cinco matraces Erlenmeyer (donde se colocarán las muestras de orina) y cinco tubos de ensayo con los tiempos 0, 40, 60, 80 y 100 minutos. Anotar en el cuadro adjunto la hora en la cual se realizarán cada una de las tareas.

Obtención de la muestras se realizará de acuerdo con el cuadro siguiente.


Tiempo (min)

Hora Actividad a realizar

Desechar la primera orina. Tomar 750 mL de agua potable.

0

Colectar la orina (mínimo 100 mL). Ésta será la orina basal.

Medir su volumen y anotarlo.

Tomar dos tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg en un volumen de agua igual al orinado.

a) Poner 30 mL de esta muestra en un vaso de precipitados. Ajustar el pH a 7 ± 0.5 con Amoniaco acuoso y/o HCl al 0.1 N.

b) De esta muestra pasar 0.5 mL al tubo de ensayo correspondiente a los cero minutos.

40

Colectar la orina, medir su volumen y anotarlo.

Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo etiquetado con 40 minutos.

60


Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado con 60 minutos.

80


Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo etiquetado con 80 minutos.

100


Repetir procedimiento anterior (incisos a y b) utilizando el tubo rotulado 100 minutos.

b) Análisis de salicilato en orina

Para cada muestra de orina se cuantifica la cantidad de salicilatos excretados de acuerdo al siguiente procedimiento.

1) Calentar a ebullición los tubos de ensayo con las muestras durante 10 minutos.

2) Enfriar los tubos con agua fría

3) Añadir al tubo 2.5 mL de reactivo para salicilatos. La reacción da un color cuantificable por espectrofotometría a 525 nm.

4) Realizar una curva estándar pesando 10 mg de salicilato de sodio, disolverlo en agua destilada, aforar a 10 mL y continuar como se indica en el cuadro siguiente, utilizando matraces volumétricos de 10 mL:


Tubo núm.Volumen (mL) de disolución stock de salicilato de sodio

(1 mg/mL)

Concentración (µg/mL) Absorbancia

1 0 0

2 0.25 25

3 0.5 50

4 1 100

5 2 200

6 3 300

5) La muestra a tiempo cero será utilizada como blanco.

6) Interpolar los valores de absorbancia de las muestras en la curva estándar para obtener la concentración de salicilatos en la muestra.

7) Los resultados obtenidos se anotarán en el siguiente cuadro.

Muestra Tiempo (min) pH Volumen

(mL) AbsorbanciaConcentración

(µg/mL)Cantidad excretada de salicilatos (µg)

Cantidad excretada acumulada de salicilatos (µg)

Blanco 0

2 40

3 60

4 80

5 100


1) Construya una gráfica de cantidad excretada acumulada de salicilatos contra el tiempo y calcule la constante de excreción.

2) Calcule el porcentaje de fármaco excretado por orina en 100 minutos y compárela con la de otros voluntarios.

VI. Bibliografía

Rowland M y Tozer T. (1995). • Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger. EUA.

Shargel L, Wu-Pong S, y Yu A. (2004). • Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics. 5th Edition. McGraw-Hill Medical, EUA.

Número de sesiones sugeridas: 1 sesión (ejecución y análisis)

Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas; Farmacometría, relación dosis-respuesta gradual.

I. Introducción

Las lecciones prácticas son una parte importante de la enseñanza de la Farmacología en diversas áreas como la Medicina, la Enfermería y la Farmacia. Los experimentos in vivo e in vitro han sido ampliamente utilizados en las lecciones prácticas para ayudar a los estudiantes a adquirir habilidades en los experimentos farmacológicos, reforzando su conocimiento aprendido con las clases teóricas y los libros.

Aunque los experimentos tradicionales en animales vivos son invaluables, tienen desventajas: alto consumo de tiempo, dinero y sacrificio de ejemplares; sólo puede probarse un número limitado de fármacos en un tiempo y requieren frecuentemente de un trabajo constante e intenso.

Una variedad de software ha sido desarrollado para la enseñanza de la Farmacología en pregrado y posgrado. Evidencia previa ha mostrado que esta técnica innovadora de enseñanza, junto con los métodos de enseñanza tradicionales, facilita al estudiante el aprendizaje y mejora su desempeño en esta disciplina.

En esta sesión, se utilizará un sistema de simulación para construir curvas concentración-respuesta de agonistas, tal y como se realizarían en un modelo de órgano o tejido aislado.

II. Objetivo


1. Demostrar el efecto concentración dependiente de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la Atropina, Mepiramina y Tubocurarina sobre la actividad de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.

III. Material

a) Software

Se utilizará el software • Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2 desarrollado por la Universidad de Strathclyde, Escocia.

Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado8.


El software puede ser descargado del siguiente vínculo:

http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/2/OBSim%20V1.2%20Setup.exe

El software deberá ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 ó posterior.

IV. Procedimiento

A) Manejo del software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2

Para el uso adecuado del software se dividirá su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:

1. Inicio del programa y comienzo de un nuevo experimento

Para iniciar el programa se debe oprimir el siguiente icono:

Para comenzar un nuevo experimento:

a) Seleccione en Tissue type, el tejido Guinea Pig Ileum. Este tejido es el que será colocado dentro de la cámara de órgano aislado.

b) Oprima el botón New Experiment.

c) Oprima el botón Record, para comenzar la lectura dentro del área de registro.

d) Seleccione y aplique fármacos de la lista de agonistas o antagonistas como se indica a continuación.


2. Adición de agonistas a la cámara de órgano aislado

a) En el apartado Agonist, seleccione el agonista que se utilizará.

b) Seleccione la concentración molar que se empleará.

c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL

d) Oprima el botón Add to Organ Bath, para agregar el agonista a la cámara. Registre por 12 segundos (un cuadro en la línea de tiempo) que equivale a 3 minutos en la simulación.

e) Para curvas acumulativas, agregue la siguiente concentración de agonista. Para curvas por lotes o no acumulativas, oprima el botón Flush Reservoir to Bath, para lavar el tejido con disolución Krebs.

3. Adición de antagonistas a la cámara de órgano aislado

a) En el apartado Antagonist, seleccione el antagonista que se utilizará.

b) Seleccione la concentración molar que se empleará.

c) Introduzca en el volumen a utilizar: 0.10 mL

d) En la lista desplegable que se encuentra a la derecha del botón Add to, seleccione Organ Bath, y oprima el botón Add to para agregar el antagonista a la cámara.

4. Medición de la respuesta del tejido

Para medir la amplitud de los picos de las contracciones del tejido:

a) Oprima el botón Stop, para terminar el experimento.

b) Usando la barra de desplazamiento horizontal del área de registro, seleccione la sección que contiene las contracciones del tejido que serán medidas.

c) Arrastre el cursor de medición al punto de la gráfica de registro que será medido. La fuerza de contracción (en gramos) será mostrada debajo del cursor.

d) Se sugiere tomar al menos cinco lecturas cercanas dentro de la meseta o área de medida y obtener el promedio de las lecturas para un mejor resultado.

B) Experimentos a realizar en el software de simulación

Experimento1.

Curvas concentración respuesta de agonistas.

a) Seleccione como tejido al íleon de cobayo e inicie un nuevo experimento.

b) Seleccione a Histamina (Histamine) como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10–8 M y un volumen de 0.10 mL.

c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.

d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y se oprime el botón Add to Organ Bath.

e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan transcurrido 3 minutos de la simulación (si es que no hay contracción), se agrega la concentración de 1x10–7 M y así sucesivamente hasta agregar la concentración de 1x100 M.


f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop y se guarda el registro. Se calcula la fuerza de contracción por cada concentración agregada.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol (Carbachol).

Experimento 2.

Efecto de un antagonista en la curva concentración respuesta de agonistas


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10–8 M y un volumen de 0.10 mL.

c) Seleccione a Mepiramina (Mepyramine) como el antagonista a utilizar a una concentración de 1x10–6 M y un volumen de 0.10 mL.

d) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.

e) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y se agrega el antagonista a Organ Bath oprimiendo el botón Add to del apartado Antagonist. Se deja incubar por 3 minutos de simulación.

f) Después de terminada la incubación. Se construye la curva concentración respuesta de la Histamina como se describe en el experimento 1.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol como agonista y Atropina (Atropine) como antagonista.

h) Adicionalmente, realice el mismo experimento utilizando dos concentraciones más del antagonista, a fin de tener el efecto del antagonista a tres diferentes concentraciones, en la acción del agonista.

Nota: Se puede experimentar con combinaciones de agonistas y antagonistas con los que cuenta el software, para demostrar la selectividad de estos últimos.

Experimento 3.

Efecto relajante de antagonistas


b) Seleccione a Histamina como el agonista a utilizar a una concentración de 1x10-1 M y un volumen de 0.10 mL.

c) Oprima el botón Record para iniciar el experimento.

d) Se deja estabilizar la muestra por 3 minutos (12 segundos reales o un cuadro del área de registro) y se oprime el botón Add to Organ Bath.

e) Cuando la contracción del músculo se estabilice (se registre una meseta) o hayan transcurrido 3 minutos de la simulación (si es que no hay contracción), se construye una curva concentración respuesta con concentraciones crecientes de Mepiramina (de 1x10–8 M a 1x100 M). Tome en cuenta que ahora la fuerza de contracción disminuirá en lugar de aumentar.


f) Al terminar la curva, se oprime el botón Stop y se guarda el registro. Se calcula la fuerza de contracción por cada concentración agregada.

g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol a una concentración de 1x10–3 M y como antagonista Atropina.

Nota importante: Al igual que en los experimentos in vitro, la concentración real en la cámara de órgano aislado es 100 menor debido a la dilución 1:100 que se realiza al agregar 0.01 mL de muestra en 10 mL de disolución que contiene la cámara.


1. Con los datos obtenidos del experimento 1

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol.

b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.

c) Calcular la CE50 para la Histamina y el Carbacol de acuerdo con modelo determinado en el inciso anterior.

2. Con los datos del experimento 2

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los antagonistas utilizados.

b) Calcular la CE50 para las combinaciones de Histamina y de Carbacol con los antagonistas utilizados de acuerdo con modelo determinado en el experimento anterior.

c) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del Carbacol y de la Histamina por la presencia de sus antagonistas.

d) Con las tres curvas concentración-respuesta de los antagonistas a diferente concentración, calcule la potencia o pA2 del antagonista.

3. Con los datos del experimento 3

a) Construir las curvas concentración respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los antagonistas utilizados.


c) Calcular la CI50 (Concentración Inhibitoria media) para las combinaciones de Histamina y de Carbacol con los antagonistas utilizados, de acuerdo con modelo determinado en el inciso anterior.


VI. Bibliografía

Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. • Methods in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.

Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling. • Journal of Clinical Pharmacology. 28:388-394.

Tallarida R. (2000). • Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC, EUA.


Temas relacionados con el curso de teoría de Farmacología I: Farmacodinamia, agonistas y antagonistas; Farmacometría, relación dosis-respuesta gradual.

I. Introducción

Las preparaciones de tejidos u órganos aislados son comúnmente usadas para estudiar los efectos de un fármaco sobre un tipo específico de receptores. Estas preparaciones son también utilizadas para bioensayos, caracterización de receptores específicos o sus subtipos, para determinar la curva concentración-respuesta de un agonista y para estudiar el antagonismo entre un fármaco y otro nuevo descubierto.

El íleon de cobayo ha sido una preparación in vitro utilizada para estudiar cambios mediados por receptores, para identificar nuevos receptores, y para determinar la variación en especies producidas por fármacos anti-colinérgicos. Varios receptores, incluyendo los de histamina, los GABAérgicos y adrenorreceptores se pueden estudiar en este tipo de preparaciones.

La preparación de íleon de rata puede ser usada para enseñar los conceptos básicos del bioensayo y para demostrar la actividad espasmolítica de fármacos colinérgicos y anticolinérgicos. Las ventajas de esta pre-paración son su bajo costo y fácil implementación y manejo.

En esta práctica se utilizará la preparación de íleon de rata para determinar el efecto del Carbacol y Atropina sobre los receptores colinérgicos presentes en la preparación.

II. Objetivos


1. Demostrar el efecto concentración dependiente del Carbacol en íleon de rata.

2. Determinar el tipo de interacción farmacológica de la Atropina sobre la actividad del Carbacol en íleon de rata.

III. Material


Una rata Wistar hembra de 200-250 g de peso, con ayuno de 12 h y libre acceso al agua.•

Demostración del efecto sinergista y antagonista en un sistema de órgano aislado9.



Vaso de precipitado de 1 L•

Pipetas graduadas de 1 mL•

Seis matraces aforados de 10 mL•

Estuche de disección•

Placa de agitación•

Balanza analítica•

Polígrafo • Biopac System acoplado a una computadora con el software AcqKnowledge versión 3.7

c) Reactivos

Disolución Krebs-Henseleit • (KHS).

Composición en mM: NaCl 118, KCl 4.7, MgSO4.7H2O 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, glucosa (C6H12O6) 11.

Cantidades de las sales para preparar 1000 mL de disolución Krebs-Henseleit (KHS)D-glucosa C6H12O6 1.998 g

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO4 l 7H2O 0.2956 gDihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g

Cloruro de potasio KCl 0.351 gCloruro de sodio NaCl 6.903 g

Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 gEDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na2 l 2H2O 0.0117 g

Cloruro de calcio dihidratado CaCl2 l 2H2O 0.3677 g

Se disuelven todas las sales, una por una, en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo al último el cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitación se lleva a un volumen de 1000 mL con agua destilada.

La disolución KHS deberá tener un pH de 7.4 a 37ºC y se mantendrá con burbujeo constante de gas carbógeno (95% O2 y 5% CO2). Si presenta precipitación deberá prepararse nuevamente.

Disoluciones de Carbacol (1x10• –4, 3x10–5, 1x10–5, 3x10–6 y 1x10–6 M).

Preparación de la disolución Stock (1x10–3 M).

Disolver 1.825 mg de Carbacol en agua destilada y aforar a 10 mL.

Preparación de las disoluciones.

Una vez preparada la disolución stock deberá seguirse la serie de diluciones como se muestra en el siguiente esquema, utilizando matraces aforados de 10 ml:


Disolución de Sulfato de Atropina (1x10• –6 M).

Se pesan 1.692 mg de sulfato de atropina, se disuelven agua destilada y se afora aun volumen de 10 mL (disolución Stock). A continuación se sigue el esquema de diluciones como se indica:

IV. Procedimiento

a) Manejo del Polígrafo Biopac System

Para el manejo adecuado del Polígrafo Biopac System por medio del software AcqKnowledge, véase el Apéndice IV de esta guía.

b) Disección del íleon de rata

1) Sacrificar la rata en la cámara de CO2 o por dislocación cervical.

2) Abrir el abdomen y realizar la disección del íleon. La localización del íleon se muestra en el siguiente esquema.


3) Disecar una longitud aproximada de 10–12 cm de íleon, lavarlo con disolución KHS hasta que la luz intestinal quede libre materia orgánica.

4) Cortar segmentos de aproximadamente 1 cm de largo y colocarlos en disolución KHS, con burbujeo continuo de gas carbógeno.

c) Montaje de la preparación

1) Cada preparación se suspenderá en una cámara para órgano aislado con ganchos de alambre de nicromel, que se incrustan en el tejido. Uno de los extremos se fija a la cámara y el otro al transductor de fuerza conectado al Polígrafo Biopac System, de acuerdo a las siguientes figuras:


2) Cada cámara deberá contener 10 mL de solución KHS con burbujeo constante de gas carbógeno a una temperatura de 37±1 ºC.

3) El tejido se somete a una tensión inicial de 1 g dejándolo estabilizar por 20 minutos, con un lavado intermedio a los 10 minutos.

4) Realizar dos estimulaciones con 100 µL de Carbacol (1x10-4 M) a intervalos de 20 minutos, con un lavado intermedio a los 10 minutos Después de cada estimulación se lava el tejido con solución KHS dos veces para eliminar al Carbacol.

Nota: La concentración real en la cámara de órgano aislado es 100 veces menor debido a la dilución (1:100).

5) El cronograma de los pasos 2 a 4 es el siguiente:

Tiempo corrido (min) Actividad

0 Inicio(Oprimir el botón Start)

10 Lavado con KHS

20 Estimulación 1 yLavado con KHS

30 Lavado con KHS

40 Estimulación 2 yLavado con KHS

50 Lavado con KHS60 Lavado con KHS70 Inicio de las evaluaciones

d) Curva acumulativa concentración respuesta del Carbacol

1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1 mL de Carbacol 1x10-6 M (disolución 1). Las siguientes disoluciones se agregarán sucesivamente en el momento en que la disolución anterior alcance una meseta de contracción.

Disolución Concentración de Carbacol1 1x10–6 M2 3x10–6 M3 1x10–5 M4 3x10–5 M5 1x10–4 M

2) Después de evaluar se lava el tejido por dos veces con disolución KHS dejando reposar por periodos de 10 minutos entre cada uno.

e) Efecto de la Atropina en la acción del Carbacol

1) Estando estable el tejido, se registra una línea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1 mL de Atropina 1x10–6 M.

2) Se deja incubar el tejido con la Atropina durante 5 minutos y posteriormente se realiza la curva acumulativa concentración-respuesta, como se indicó en el inciso e).



1. Para analizar los datos es necesario descargar el software AcqKnowledge 3.9 Demo en la siguiente dirección electrónica:

http://www.biopac.com/Demos.asp?did=4&PCDemoResearch=Y

Es necesario registrase para descargarlo, y debe instalarse como indican las instrucciones del sitio web.

Con ayuda del software y de su profesor deberá llenar el cuadro de datos anexa.

1 2 3 4

Basal

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4

Basal

1

2

3

4

5

6

MUESTRA / CANAL

TABLA DE DATOS DEL EXPERIMENTO

EXPERIMENTO 1. CARBACOL

EXPERIMENTO 2. CARBACOL + ATROPINA (1X10-6 M)

NÚM.CONCENTRACIÓN

(M) CARBACOLLOG [CONC (M)]

MUESTRA / CANAL

NÚM.CONCENTRACIÓN

(M) CARBACOLLOG [CONC (M)]

2. Con los datos obtenidos:

a) Construir las curvas concentración respuesta de Carbacol y de Carbacol+Atropina.


c) Calcular las CE50 para el Carbacol y para Carbacol+Atropina, de acuerdo con el modelo determinado en el inciso anterior.


d) Calcular cuántas veces se disminuyó el efecto del Carbacol por la presencia de la Atropina.

e) Determinar el tipo de interacción de la Atropina sobre la acción del Carbacol.

VI. Bibliografía

Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. • Methods in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.

Schwinghammer T y Kroboth P. (1988). Basic concepts in pharmacodynamic modeling. • Journal of Clinical Pharmacology. 28:388-394.

Tallarida R. (2000). • Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC, EUA.

Tabla de conversión de proporción (pi) a unidades probit (yi)

pi 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

0.00 --- 2.673 2.945 3.119 3.249 3.355 3.445 3.524 3.595 3.659

0.10 3.718 3.773 3.825 3.874 3.920 3.964 4.006 4.046 4.085 4.122

0.20 4.156 4.194 4.228 4.261 4.294 4.326 4.357 4.388 4.417 4.447

0.30 4.476 4.505 4.532 4.561 4.588 4.615 4.642 4.669 4.695 4.721

0.40 4.747 4.773 4.798 4.824 4.849 4.874 4.900 4.925 4.950 4.975

0.50 5.000 5.025 5.050 5.075 5.100 5.125 5.151 5.176 5.202 5.227

0.60 5.253 5.279 5.305 5.331 5.358 5.385 5.412 5.439 5.467 5.495

0.70 5.524 5.553 5.582 5.612 5.643 5.674 5.706 5.739 5.771 5.806

0.80 5.841 5.878 5.915 5.954 5.994 6.036 6.080 6.126 6.175 6.227

0.90 6.282 6.341 6.405 6.476 6.555 6.645 6.751 6.881 7.054 7.327

pi 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009

0.97 6.88 6.896 6.911 6.927 6.944 6.960 6.978 6.996 7.014 7.034

0.98 7.054 7.075 7.097 7.121 7.145 7.171 7.198 7.227 7.258 7.291

0.99 7.327 7.366 7.409 7.458 7.513 7.576 7.652 7.748 7.879 8.091

Tabla de convensión de proporción a unidades ProbitApéndice I.

I. Manejo del ratón.

Los ratones, así como la mayoría de los animales de laboratorio, pueden ser levantados por su cola. La base de la cola es sujetada entre los dedos pulgar e índice y el roedor entonces es levantado en posición vertical. Esta técnica resulta útil para manejar y trasladar a los ratones distancias cortas. Se debe tener cuidado de no sujetarlo por la punta de la cola ya que podría escalar la misma y morder la mano (figura 1 y 2).

Figura 1. Forma correcta de manejar un ratón Figura 2. Forma incorrecta de manejar un ratón

Para la inmovilización del ratón con el objetivo de administrarle un fármaco o sustancia, se procederá de la siguiente manera:

Se toma al ratón como se explicó anteriormente, y el peso del cuerpo del roedor es apoyado sobre la reja de la caja (figura 3), se toma ahora la cola del ratón por medio del dedo meñique y con los dedos índice y pulgar se toma de la piel de la nuca (figura 4 y 5). Se voltea y se levanta la mano, de manera que el vientre quede expuesto (figura 6 y 7). Una buena inmovilización evita que el ratón se voltee o se mueva al momento de la administración.

Técnicas de manejo e identificación de animales de laboratorio (rata y ratón)Apéndice II.


Figura 3. Figura 4.

Figura 5. Figura 6.

Figura 7.


Una vez inmovilizado el ratón se puede proceder a la administración del fármaco o sustancia, teniendo cuidado de sujetarlo firmemente.

II. Manejo de la rata

La rata debe manejarse por la base de la cola y evitar levantarla de esta manera por mucho tiempo debido a los movimientos que realiza (figura 8). El traslado se realizará de esta manera en distancias muy cortas y no se deberá sujetar por la punta de la cola.

Figura 8. Forma correcta de manejar a una rata.

Para la inmovilización de la rata de laboratorio existen muchas técnicas. A continuación se explicarán las más utilizadas.

Técnica 1.

Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la izquierda se coloca el cuello de la rata entre los dedos medio e índice. La rata entonces es sujetada por las extremidades anteriores y el abdomen sin hacer presión sobre el cuello (figura 9, 10 y 11). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la mano izquierda para dejar expuesto el vientre (figura 12 y 13). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la mano derecha para dejar expuesto el vientre.

Figura 9. Figura 10. Figura 11.


Figura 12. Figura 13.

Técnica 2.

Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la mano izquierda se coloca el cuello de la rata entre los dedos pulgar e índice (figura 14 y 15), de manera que los dedos queden a la altura de las extre-midades anteriores. Con el movimiento natural de la mano, se cierra ésta de manera que las extremidades anteriores de la rata queden cruzadas, se levanta y se sujeta la cola con la mano derecha para dejar expuesto el vientre (figuras 16, 17 y 18).

Figura 14. Figura 15. Figura 16.

Figura 17. Figura 18.


III. Marcaje del ratón y la rata

La técnica recomendada para el marcaje de ratones y ratas en el Laboratorio de Farmacología se realiza en la cola del animal por medio de un marcador indeleble, siguiendo la clave que se muestra en las figuras 19 a 25. Esta técnica se recomienda cuando se utilizan pocos animales y en experimentos muy cortos en duración.

Figura 19. Marcaje en la cola con marcador. Figura 20. Ratón marcado con el número 1.

Figura 21. Ratón marcado con el número 2. Figura 22. Ratón marcado con el número 3.

Figura 23. Ratón marcado con el número 4. Figura 24. Ratón marcado con el número 5.

Figura 25. Ratón marcado con el número 6.


IV. Bibliografía

Short D y Woodnott D (editores). (1963).• The A.T.A. manual of laboratory animal practice and techniques. Charles C. Thomas-Publisher, EUA: 47-57.

Formato de Consentimiento InformadoApéndice III.

I. Materiales y reactivos

Polígrafo Biopac System MP-100A-CE•

Gas carbógeno (oxigeno 95%-dióxido de carbono 5%).•

Disolución Krebs-Henseleit (• KHS)

Disolución Krebs-Henseleit (KHS)

D-glucosa C6H12O6 1.998 g

Sulfato de magnesio heptahidratado MgSO47H2O 0.2956 g

Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 0.1632 g

Cloruro de potasio KCl 0.351 g

Cloruro de sodio NaCl 6.903 g

Hidrógenocarbonato de sodio NaHCO3 2.1 g

EDTA disódico dihidratado C10H14O8N2Na22H2O 0.0117 g

Cloruro de calcio dihidratado CaCl22H2O 0.3677 g

Preparación: Se disuelven todas las sales en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo en último término al Cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitación se lleva a un volumen de 1000 mL con agua destilada.

Disolución de Acetilcolina 3x10• -5 M

Disolución de Norepinefrina 1x10• -6 M

Disolución de Carbacol 1x10• -4 M

Instructivo para el uso del polígrafo Biopac System MP-100Apéndice IV.


II. Procedimiento

A. Calibración del polígrafo.

1. Se verifica que todos los canales estén firmemente conectados y ajustados.

2. Se enciende la computadora y el polígrafo oprimiendo el botón en la posición ON.

3. Se verifica que el nivel de agua del baño recirculador cubra la resistencia y la bomba. Se enciende y deja estabilizar la temperatura en 37±1°C. Este baño proporciona el flujo de agua que mantiene la temperatura de la disolución KHS a dicha temperatura.


4. En la pantalla de la computadora se selecciona el icono

para iniciar el programa AcqKnowledge, el cual registra los datos provenientes del Polígrafo.

5. Al comenzar el programa se abre la ventana que se ilustra enseguida.

6. Para comenzar la configuración del polígrafo se selecciona en el menú la opción MP100, y posteriormente la opción Setup Channels que nos abrirá una ventana emergente.


7. En la ventana emergente Input Channels, se activan los canales que se utilizarán seleccionando las casillas Acquire, Plot y Values con √ para cada canal An.

8. Para la calibración de cada canal se selecciona primero el canal y se oprime el botón con el cual aparecerá la siguiente ventana emergente.

9. En las casillas Scale value se colocan 0 (cero) y 2 (dos) y en Units se coloca g (gramos) como se muestra a continuación.


10. Con el valor Scale value = 0, se oprime el botón y el programa automáticamente calculará el valor Input volts correspondiente a 0 g (cero). Con el valor Scale value = 2, se coloca una pesa de 2 gramos sobre el transductor y se oprime el botón , el programa entonces, automáticamente calculará el valor Input volts correspondiente a 2 g (dos gramos). Al terminar se oprime el botón OK.

Este procedimiento se repite con cada canal que se utilizará.

11. Continuando con la calibración, se selecciona en el menú la opción MP100, y posteriormente la opción Setup Acquisition.

12. Al seleccionar la opción Setup Acquisition se abrirá la siguiente pantalla emergente.


13. En la pantalla emergente Setup Acquisition, se seleccionarán las opciones Record and Save once to Disk acquisition. Posteriormente se elegirá Acquisition Sample Rate en 0.5 ó 1.0 samples /second, y en Total lengh se determinará el máximo en horas, como se muestra a continuación.

14. El Polígrafo ya está calibrado y se puede seguir con el montaje del tejido.

B. Montaje del tejido

1. Antes de montar el tejido se selecciona en el menú del software AcqKnowledge la opción MP100, y posteriormente. Show Input Values.


2. Al seleccionar abrirá una ventana emergente que muestra los valores que se registran en el Polígrafo.

En la ventana emergente se oprime el botón n y después el de Options. En esta última se seleccionan Channel numbers, Units y Values, y el tamaño de letra adecuado para su visualización (se recomienda de 14-18 puntos). Al terminar se oprime el botón OK.


3. Se realiza la disección del tejido a utilizar de acuerdo a lo reportado en la literatura. En caso de íleon o tráquea de cobayo o aorta de rata el tejido se cortará en anillos para su montaje.

4. Para aorta y traquea el tejido es sujetado por medio de ganchos de alambre Nicromel como se muestra en la figura.

Para íleon el tejido es montado de acuerdo a la siguiente figura, insertando el tejido en los ganchos:

5. Los ganchos junto con el tejido son colocados dentro de la cámara de órgano aislado previamente llena con KHS y con burbujeo constante de gas carbógeno, como se muestra a continuación.


6. Se le da una tensión a cada tejido de cada cámara, por medio del tensor del transductor de acuerdo con el siguiente cuadro.

Tejido TensiónAorta de rata 4.0 gramos

Tráquea de cobayo 1.5 gramosÍleon de rata 1.0 gramo

7. Se oprime el botón Start para comenzar el registro del experimento.

8. Al oprimir el botón Start, comenzará el registro como se muestra a continuación.


9. Para personalizar las opciones de visualización se recomienda consultar el siguiente cuadro.

BOTÓN NOMBRE DEL BOTÓN EFECTO

Scope Mode

(muestra todos los canales juntos)

Chart Mode

(muestra cada canal por separado)

Show / Hide Journal

(Muestra / oculta la ventana de anotaciones

en la parte inferior)

Show / Hide Markers

(Muestra / oculta la barra de marcadores de evento. Para agregar un marcador se oprime la tecla F9)

Show / Hide Grid

(Muestra / oculta la rejilla)


Oprimir sobre el eje

Y

Set Screen Vertical Axis

(Cambia la visualización del eje Y. Se recomienda un Scale

Setting = 1 g)

Oprimir sobre el eje

X

Set Screen Horizontal Axis

(Cambia la visualización del eje X. Se recomienda un Scale =

15 minutes)


C. Estimulación del tejido para el experimento.

1. Una vez montados los tejidos se procederá a su estimulación de acuerdo con el siguiente cuadro.

TejidoSustancia para estimulación

Concentración

Aorta de rata Norepinefrina 1x10–6 M

Traquea de cobayo Acetilcolina 3x10–5 M

Íleon de rata Carbacol 1X10–4 M

2. El cronograma de estimulación y lavado de los tejidos se realizará como sigue.

Tiempo corrido (min)

Actividad

0 Inicio (Oprimir el botón Start)

15 Lavado con KHS

30 Estimulación 1 y Lavado con KHS

40 Lavado con KHS

50 Estimulación 2 y Lavado con KHS

60 Lavado con KHS

70 Lavado con KHS

80 Inicio de las evaluaciones

3. En el minuto 80, se puede iniciar la evaluación de las sustancias de acuerdo a lo reportado en la literatura y a los objetivos establecidos.

III. Bibliografía

Estrada S, et al. (1999). Nitric oxide/c GMP mediates the spasmolytic action of 3,4’-dihydroxy-•5,5’- imethoxybibenzyl from Scaphyglottis livida. Planta Medica. 65(2):109-114.

Hsieh G, et al. (2003). YC-1 potentiates the nitric oxide/cyclic GMP pathway in corpus •cavernosum and facilitates penile erection in rats. European Journal of Pharmacology. 458:83-189.

Sánchez-Mendoza M, et al. (2007). Mechanisms of relaxant action of a crude hexane extract •of Gnaphalium liebmannii in guinea pig tracheal smooth muscle. Journal of Ethnopharmacology. 111:142–147.

Farmacología I Guión de Prácticas es una obra editada por la Facultad de Química. Se terminó de imprimir en diciembre de 2008 en los talleres de la misma.

Se tiraron 1000 ejemplares en papel bond de 36 gramos.

Tipo de impresión: Offset.

Para la composición del texto se utilizó la fuente Geometr231 BT 12 y 18 pts. normal, Geometr231 BT 13 pts. bold.

El cuidado de la edición estuvo a cargo de la Sección de Diseño Editorial, área adscrita al Departamento de Publicaciones.

Publicación aprobada por el Comité Editorial de la FQ.

Diciembre de 2008.

Diseño de interiores: Lourdes Gracia Archundia. Diseño de portada: Lic. Leticia González González.

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Farmacología I - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MANUAL_26639.pdf · 12 Dr. Andrés Navarrete Castro la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación