ACESULFANO K, SACARINA Y ASPARTAMO

ACESULFAMO K, SACARINA Y ASPARTAMOMtodo de HPLC

1. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIN

Bebidas, jugos, productos de confitera, derivados lcteos etc.

2. PRINCIPIO

Corresponde a la extraccin del edulcorante desde el alimento, posterior filtracin y cuantificacin por cromatografa liquida de alta resolucin utilizando un detector UV a 214nm.

3. MATERIAL Y EQUIPOS

3.1. Balanza analtica, con sensibilidad de 0,1mg.

3.2. Cromatografo liquido de alta presin

3.3. Columna RP-18 (5m) in Lichrocart 250-4

3.4. Detector UV con lmpara de deuterio a 214nm

3.5. Integrador

3.6. Bomba de flujo de 1ml/min

3.7. Equipo de filtracin de solvente

3.8. Equipo para filtracin de muestras y estndares.

3.9. Membrana filtrante Milipore GVWP, 47mm de dimetro, 0,22 m de poro, para la fase mvil.3.10. Membrana filtrante Milipore GVWP, 13 mm de dimetro, 0,22 m de poro, para muestras y estndares.

3.11. Material usual de laboratorio.

4. REACTIVOS

4.1. Reactivo de CARREZ I: pesar 36g hexacianoferrato de potasio trihidratado diluido en 1 litro.

4.2. Reactivo de CARREZ II: Pesar 72g de sulfato de zinc heptahidratado diluido en 1 litro

4.3. Acetonitrilo grado HPLC.

4.4. Tampn fosfato de potasio dihidrogenado (0,0125 M, pH=3,5). Disolver 1,71g de fosfato en matraz de 1 litro, ajustar a pH 3,5 con acido fosfrico al 5% en agua.

4.5. Fase mvil.

4.6. Mezclar el tampn fosfato con acetonitrilo en proporciones 87:13.

4.7. Pasar la solucin a travs de filtro Milipore GVWP de o,22 m de dimetro para desairear y retener partculas.

4.8. Solucin estndar 1,000g/ml de cada edulcorante

4.8.1. Pesar exactamente 100 mg de estndar de acesulfamo K, 100 mg de estndar de sacarina y 100 mg de estndar de aspartamo, disolver en 80 ml de mezcla etanol agua 1:1 y enrasar a 100 ml con agua destilada.

1.1. Soluciones de mezclas estndares de trabajo1.1.1. Solucin de mezcla estndar de trabajo de 100 g/ml de cada edulcorante. Se toman alcuotas de 10 ml de las soluciones estndares de 1,000 g/ml de cada edulcorante y se diluye a 100 ml con agua destilada.

1.1.2. Solucin de mezcla estndar de trabajo de 250 g/ml de cada edulcorante. Se toman alcuotas de 25 ml de las soluciones de estndares de 1,000 g/ml de cada edulcorante y se diluyen a 100 ml con agua destilada.

1.1.3. Solucin de mezcla estndar de trabajo de 500 g/ml de cada edulcorante. Se toman alcuotas de 50 ml de las soluciones estndares de 1,000 g/ml de cada edulcorante y se diluyen a 100 ml con agua destilada.

1.1.4. Pasar cada mezcla por filtro Milipore GVWP 0,22 mm de dimetro estas soluciones pueden permanecer refrigeradas a 4C por 1 mes.2. PROCEDIMIENTO.

2.1. Preparacin de la muestra:

2.1.1. Pesar exactamente alrededor de 5g de muestra previamente homogenizada, en el caso de muestras solidas o semislidas o 10 ml si son muestras liquidas.

2.1.2. Disolver la muestra en matraz aforado de 100 ml con 20 ml de agua.

2.1.3. Colocar el matraz a bao de mara a 60 C por 30 min, enfriar, poner durante 10 min a bao de ultrasonido y enfriar.

2.1.4. Agregar 10 ml de reactivo de CARREZ I y 10 ml de CARREZ II sucesivamente, luego enrasar la muestra a 100 ml (v) y agitar vigorosamente 2.1.5. Filtrar la solucin a travs de papel filtro

2.1.6. Antes de inyectar, filtrar a travs de membrana filtrante (Milipore GVWP 13 mm y de 0,22 m de poro).

2.2. DETERMINACION CROMATOGRAFICA

2.2.1. Estabilizar el equipo con la fase mvil durante 10 min a un flujo de 1 ml/min y con el detector UV a 214 nm.

2.2.2. Inyectar 20 l de cada mezcla estndar con 3 repeticiones en cada caso.

2.2.3. Hacer una curva de calibracin correspondiente, utilizando el mtodo de clculo con estndar externo de integrador, considerando los tiempos de retencin de 3,3; 4,0 y 17,9 minutos para acesulfamo de k, sacarina y aspartamo respectivamente en condiciones sealadas.

2.2.4. Inyectar 20 l de la muestra, efectuando 3 repeticiones y comparar con la curva de calibracin.

3. EXPRESION DE RESULTADOS

Utilizar el integrador del equipo con el programa de clculo de rea con estndar externo y la tabla correspondiente que contiene la curva de calibracin obteniendo directamente la concentracin (c) en ppm (g/ml) para cada edulcorante.

Para cada edulcorante C= concentracin en g/ml obtenida de la curva de calibracin.V= volumen al que se diluye la muestra (100 ml en la presente tcnica)

A= masa de la muestra en g o volumen en ml, segn el tipo de muestra.

Promediar lo valores obtenidos y expresar el resultado en un decimal.

Repetitividad: la diferencia de los resultados no deber ser superior al 5% de promedio