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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICASASIGNATURA HEMATOLOGIA
Métodos del laboratorio hematológico
Docentes Dr. Eduardo GaddiDra. María Elena ChiesaDra. Ma. Alejandra Fernández AlbertiBioq. Fernando VentimigliaBioq. Mariana GonzálezBioq. Federico Remes Lenicov
La Plata, 2011
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Contenido
Instructivo para la obtención de sangre periférica por punción venosa 3
Descripción de los anticoagulantes usados en hematología 5
Obtención del frotis de sangre 7
Coloración del frotis de sangre según May Grünwald-Giemsa 7
Contadores automatizados 9
Recuentos celulares en Cámara de Neubauer 13
a) Recuento de glóbulos blancos
b) Recuento de plaquetas
Determinación de la fórmula leucocitaria: recuento diferencial de leucocitos 16
Hematocrito 18
Determinación de hemoglobina: método de la cianmetahemoglobina 20
Velocidad de sedimentación globular 26
Recuento de reticulocitos 31
Grupos sanguíneos ABO y Rh: pruebas de Coombs 35
Determinación de anticuerpos inmunes: titulación de anticuerpos 45
Hemostasia
a) Tiempo de sangría 46
b) Tiempo de coagulación 47
c) Retracción del coágulo 49
Determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada 50
Determinación del tiempo de protrombina o tiempo de Quick en una etapa 52
Cuantificación de hierro sérico y TIBC 55
Separación electroforética de hemoglobina 59
Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke 62
Diagnóstico de mononucleosis infecciosa 63
Células LE y auto-anticuerpos 65
Electroforesis de las proteínas séricas en acetato de celulosa 67
Citoquímica 71
a) Reacción de Pas (hidratos de carbono)
b) Sudan Black B (lípidos)
Determinación de fibrinógeno 74
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INSTRUCTIVO PARA LA OBTENCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA POR PUNCIÓN VENOSA
A) EN ADULTOS
1. Durante la toma de muestra deben guardarse las más estrictas normas de higiene.
2. El material descartable a usar se abrirá sólo al momento de su utilización y, una vez manipulado, no podrá guardarse nuevamente aún cuando se lo considere nuevo.
3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin.
4. Los recipientes que contienen algodón y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirán solamente al momento de usar.
5. Al momento de hacer la extracción colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrán puestos durante todo el procedimiento.
6. Antes de iniciar la toma de muestra, tener todo el material preparado pero sin abrir.
7. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizándola visualmente y por palpación. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puño para facilitar la extracción. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresión del músculo no mayor a 1 mm.
8. Una vez identificada la vena, limpiar el área circundante con algodón empapado en alcohol. Dejar secar perfectamente.
9. En este momento se romperá el sello de garantía de la aguja, se la colocará en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del émbolo.
10. La aguja se insertará en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el émbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba).
11. Después de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la punción con un trozo de algodón seco.
12. La aguja se descartará en el contenedor destinado para ese fin.
La sangre que está en la jeringa se descargará en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma.
13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.
14. En el sitio de la punción se pondrá un apósito después de controlar que no haya más sangrado.
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15. La persona que hace la extracción deberá quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. No deben ser reutilizados.
16. Si hay algún dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de muestras.
B) EN NIÑOS
1. En niños mayores de 6 meses, se recomienda hacer la extracción del brazo como en adultos, pidiéndole a un adulto que colabore en mantener inmóvil al niño, en particular el brazo.
2. En el caso de niños menores de 6 meses, se procederá a extraer la muestra del talón con una lanceta descartable. Antes de la extracción conviene calentar el talón frotándolo entre las manos para favorecer la irrigación de la zona.
3. Desinfectar con un trozo de algodón embebido en alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta, en la zona del talón indicada en el dibujo adjunto.
4. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante.
5. Secar la zona con un trozo de algodón seco y una vez que no haya sangrado, colocar una curita o apósito.
Las flechas indican los lugares de punción
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DESCRIPCIÓN DE LOS ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGÍA
Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos ni el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (generalmente no más de 24 horas incluso refrigerada a 4° C).
Los anticoagulantes más utilizados son:
EDTA (C10H16N2O8) o sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actúa mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinación de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. El K2EDTA.2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.
HEPARINA SÓDICA (o HEPARINA DE LITIO) es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panópticas un color azulado y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.
CITRATO TRISÓDICO, C6H5O7Na3, actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza para realizar las pruebas de hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1; así como para la velocidad de eritrosedimentación en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. El citrato sódico se utiliza a una concentración de 0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O).
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ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y para estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de los hematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro volúmenes de sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citrato disódico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 ml.
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OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE
Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequeña de sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o del talón (en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfología de las células.
Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ángulos (extensor), se realiza la extensión de la gota de sangre. Conservando un ángulo menor de 45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.
Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.
Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también distinta de leucocitos:
1. Zona excesivamente gruesa: se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.
2. Zona excesivamente fina: corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.
3. Zona ideal: región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.
COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE SEGÚN MAY GRÜNWALD-GIEMSA
Fundamento
Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina (colorante ácido), mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas
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presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado.
De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente, resultando en un color pardo; eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias de intenso carácter básico que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos, dando un color rojo-naranja; y los basófilos, cuya granulación específica posee sustancias de carácter ácido, que fijan colorantes básicos dando un color azul oscuro.
Reactivos
Solución May Grünwald: eosinato de azul de metileno en metanol.
Solución Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino (el azur II), y eosina (tetrabromofluoresceína).
Método
Cubrir el frotis de sangre seco con solución May Grünwald. Dejar 3 minutos. A continuación, agregar buffer fosfato pH 6.8 en proporción igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivén. Dejar 5 minutos. Volcar y cubrir el preparado con una solución de Giemsa, obtenida a razón de dos gotas del colorante por ml de agua. Dejar 10 minutos. Lavar con agua , limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodón y secar al aire.
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MÉTODOS AUTOMATIZADOS: CONTADORES HEMATOLÓGICOS
A) RECUENTO DE CÉLULAS POR MÉTODO AUTOMATIZADO
La automatización ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las células sanguíneas.
Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos, como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada, y los aparatos totalmente automatizados que sólo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo con el anticoagulante adecuado).
Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamaño u otras propiedades físicas de las células suspendidas en medio líquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes:
1. Impedancia o resistencia eléctrica.2. Dispersión de luz o campo oscuro.
1. Método de la impedancia o de la resistencia eléctrica
Es el más empleado en los autoanalizadores hematológicos. Se basa en la propiedad de las células sanguíneas de no conducir la electricidad. La sangre total es diluida en una solución de conductividad estable, las células sanguíneas así diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un área prefijada. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Cuando una célula pasa a través del orificio, se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. El número de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamaño de la célula, es posible determinar también el volumen celular.
Este método tiene algunas limitaciones. Como los impulsos eléctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema, para cada población celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error.
Las condiciones más importantes que deben tenerse en cuenta son:
1. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partícula cuando atraviesa el orificio. Si es muy elevada puede dañar las células y producir interferencias originadas por ruido electrotérmico.
2. El diámetro del orificio de apertura: debe estar en relación al tamaño de las partículas que se analizan. Debe ser perfectamente permeable, por lo general poseen un monitor de visualización que permite observar su permeabilidad
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durante el recuento. Es importante realizar periódicamente una limpieza de este orificio.
3. La concentración de la suspensión analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia, es decir, que varias células atraviesen el orificio al mismo tiempo.
2. Método de dispersión de luz
Se analiza la dispersión de luz producida por las células desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ángulos diferentes. Las células se hacen pasar individualmente a lo largo de una cámara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halógena o láser. Cada vez que una célula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que, proyectada sobre un campo oscuro, será analizada por los sensores. Estos sistemas permiten medir la concentración y el volumen celulares. Si además las células se someten a tinciones citoquímicas, se pueden determinar los diferentes tipos de leucocitos midiendo la intensidad de dicha reacción.
Causas de error en el recuento automatizado de células
Con el empleo de métodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control periódico y el calibrado diario de los instrumentos. En general, el error debido al propio método de recuento electrónico, cuando se realiza en óptimas condiciones, suele ser inferior al 1%, pero puede incrementarse por:
1. Errores de extracción:a) Dilución.b) Hemoconcentración.c) Coagulación parcial.d) Hemólisis.
2. Mala homogeneización por agitación insuficiente de la sangre.3. Uso de un diluyente incorrecto.4. Presencia de partículas extrañas en el diluyente.5. Defectos en el sistema electrónico de recuento:
a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos.b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento.c) Obstrucción de los capilares u orificios de recuento.d) Dilución incorrecta de la muestra por el líquido diluyente.e) Presencia de microburbujas, que son contadas como células.f) Contaminación por arrastre de un espécimen con el siguiente.g) Presencia de interferencias electrónicas y averías de los componentes
electrónicos del instrumento.
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Valores de referencia
Glóbulos rojos:
Edad Sexo Intervalo de referenciaRecién nacidos ambos 4,7x1012/L - 6,3x1012/L
Niños (2-12 años) ambos 4,0x1012/L - 5,3x1012/LAdultos jóvenes (12-18 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,1x1012/L
hombres 4,5x1012/L - 5,3x1012/LAdultos (19-60 años) mujeres 4,1x1012/L - 5,2x1012/L
hombres 4,6x1012/L - 5,9x1012/L
Glóbulos blancos:
Adultos 4.000 - 11.000 / mm3
Recién nacidos 10.000 - 25.000 / mm3
Niños de 1 año 6.000 - 18.000 / mm3
Niños de 4 a 7 años 6.000 - 15.000 / mm3
Niños de 8 a 12 años 4.500 - 13.000 / mm3
Plaquetas:
Edad Intervalo de referenciaAdultos 150x109/L – 400x109/L
B) DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO
El método automático de determinación del hematocrito se basa en el cálculo matemático a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el número de hematíes.
Hto = n° de hematíes x VCM
Valores de referencia
El valor de Hto varía con la edad y el sexo. Se indican los valores medios 2 DE.
Edad y sexo Hematocrito % FracciónRecién Nacidos 54 10 0,54 0,1
Niños (hasta 10 años) 38 5 0,38 0,05Mujeres (18-50 años) 42 5 0,42 0,05
Embarazadas 39 5 0,39 0,05Hombres (18-50 años) 45 5 0,45 0,05
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C) ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS
Volumen Corpuscular Medio (VCM)
VCM (fL) = Hto (fracción) / Nº GR (x1012/L)
Hemoglobina Corpuscular Media (HCM)
HCM (pg) = Hb (g/L) / Nº GR (x1012/L)
Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM)
CHCM (g/L) = Hb (g/L) / Hto (fracción)
Ancho de distribución de glóbulos rojos (RDW %)
Valores de referencia
Se indican los intervalos de referencia para adultos.
VCM (fL) HCM (pg) CHCM (g/L) RDW%80 - 96 28 - 33 33 - 36 15,8 2,9
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RECUENTO DE CÉLULAS EN CÁMARA DE NEUBAUER
A) RECUENTO DE LEUCOCITOS
1) Agregar 20 l de sangre a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solución de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de espátula de azul de metileno.
2) Homogeneizar la mezcla.
3) Cargar las cámaras de recuento. La cámara puede ser cargada con un capilar o con una micropipeta, evitando que queden burbujas para que la misma quede cargada uniformemente.
4) Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento, constatar la ausencia de burbujas y que la distribución sea regular.
5) Aplicando mayor aumento se procede al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cámara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cámara.
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6) Cálculo:
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Recuadro central
m x 10 x d= N° de leucocitos/ mm3
n
Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilución utilizada.
Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el número resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.
B) RECUENTO DE PLAQUETAS
1) Obtener sangre por punción venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos plásticos.
2) Homogeinizar bien la muestra y tomar 100 l que se colocan en otro tubo plástico que contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%. La solución hipotónica de oxalato de amonio en agua destilada induce hemólisis.
3) Incubar 10-15 min. para permitir la hemólisis.
4) Cargar la cámara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en ambiente húmedo: se recomienda colocar la cámara dentro de una cápsula de Petri conteniendo un trozo de algodón humedecido.
5) Incubar 10-15 min en atmósfera húmeda.
6) Efectuar el recuento en microscopio en el reticulado central de la cámara (el que está dividido en 400 cuadrados pequeños comprendidos en 1 mm2). Se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuación:
Recuadro central
La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.
7) Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, serán 5 cuadrados con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).
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8) Cálculo:
Sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para obtener el número de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto:
20 x 400= 1000/mm3
80 x 0,1 mm3
Donde 20 es el factor de dilución, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3.
Observaciones
Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma automatizada en contadores hematológicos o en contadores específicos, habiéndose logrado un alto nivel de precisión (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para la comprobación de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de plaquetas gigantes en las que el recuento automático no es fiable.
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DETERMINACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
La fórmula leucocitaria es un recuento relativo de los distintos tipos leucocitarios. Su interpretación siempre debe realizarse junto con la información proveniente del recuento absoluto.
La determinación de los diferentes tipos de leucocitos se realiza en un frotis coloreado por May Grünwald-Giemsa. Primero se observa a bajo aumento para tener una visión general del preparado. Luego, tras colocar una gota de aceite de inmersión, se observa la región media del extendido con un aumento de 100X para comenzar el recuento.
Para obtener un resultado confiable, es importante no clasificar y contar dos veces las mismas células. Para ello debe recorrerse el extendido siguiendo una trayectoria ordenada. Por ejemplo, dicha trayectoria se puede realizar comenzando en uno de los bordes, desplazándose 4 a 5 campos microscópicos de forma paralela a este e iniciando a continuación una recorrida transversal hasta llegar al otro borde. Allí se comienza de nuevo, recorriendo 4 a 5 campos microscópicos paralelos al borde y otra incursión transversal hasta el borde opuesto. Se clasifican como mínimo 100 leucocitos. Tener en cuenta que esta trayectoria debe quedar contenida en la zona media del extendido, ya que la morfología proporción de los leucocitos puede verse afectada en las zonas de cola y cabeza del mismo.
Valores de referencia
No hay variación de la fórmula según el sexo, pero sí según la edad.
Fórmula leucocitaria normal de un adulto
CayadosNeutrófilosEosinófilosBasófilosLinfocitosMonocitos
0-1%55-70%1-4%0-1%
20-40%4-8%
Nacimiento: 70% de neutrófilos. Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos. Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrófilos3-4 años: 50% de
linfocitos y 50% de neutrófilos. 10-12 años: valores de referencia del adulto.
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Descripción de cada uno de los elementos que componenuna fórmula normal
1. Neutrófilo: Núcleo lobulado ( 2-5 lóbulos). Los lóbulos están unidos entre sí por filamentos cromatínicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una célula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulación fina específica de color pardo rojiza.
2. Neutrófilos en cayado: Sólo se diferencia del anterior por su núcleo no lobulado en forma de C y, a veces de S . No hay una zona muy delgada de material nuclear que permita diferenciar dos lóbulos.
3. Eosinófilo: Mide aproximadamente 13 m. El núcleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo. El citoplasma es abundante y está cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las del neutrófilo y que se colorean de anaranjado.
4. Basófilos: Mide aproximadamente 10 m. El núcleo está irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relación al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamaño pudiendo quedar superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente.
5. Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma más pequeña posee sólo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son células más grandes y con citoplasma más abundante. El núcleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.
6. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamaño (18-24 m). El núcleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporción núcleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tiñe de celeste plomizo y no presenta granulaciones.
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HEMATOCRITO
Definición
El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de hemoglobina, por lo que su determinación constituye el procedimiento más simple para el diagnóstico de anemia. Así, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.
El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo capilar (micrométodo). Es una técnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. Aunque también puede emplearse un tubo de Wintrobe (macrométodo), este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisión. Ambos métodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la acción de una fuerza centrífuga. Por ello, entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura.
En la actualidad, todos los autoanalizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrónicamente difiere del obtenido por centrifugación en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %).
Tanto el Hto obtenido por microcentrifugación o por métodos automatizados, son un buen parámetro del estado de la serie eritroide. El Hto refleja la concentración y no la masa total de glóbulos rojos. Por ejemplo, en un paciente en estado de shock acompañado de hemoconcentración, el Hto. puede ser normal o alto, aún cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la pérdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco después de una hemorragia o una transfusión.
Micrométodo (microhematocrito)
Es una técnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, ser muy sencilla y poder realizarse en gran número de muestras a la vez y en muy poco tiempo.
Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm de longitud por 1 mm de diámetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechará la primera gota después de la punción.
Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 l). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando.
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Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellándolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrífuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito, que nos darán el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:
A________________100 B________________ x
donde: x: hematocrito (por ciento)A: longitud total de sangre en el capilarB: longitud de la parte corpuscular
La determinación del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01.
Causas de error
Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminución en el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma.
El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra
En muestras capilares, no descartar la primer gota produce una mezcla con los líquidos tisulares que provoca hemodilución.
En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentración.
La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posición horizontal.
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DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA: MÉTODO DE LA CIANMETAHEMOGLOBINA
Fundamento
Este método tiene como fundamento la transformación previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color característico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparándola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrón de referencia (curva de calibración). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina, que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN según el siguiente proceso:
Hemoglobina + Ferricianuro potásico metahemoglobina
Metahemoglobina + Cianuro potásico cianmetahemoglobina
Materiales
Espectrofotómetro o fotocolorímetro: Estos instrumentos deben ser calibrados periódicamente mediante la solución patrón de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)
Tubos: 12 x 100 mm. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1,5 mg/ml) o con
heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar. Pipetas volumétricas: de vidrio y de 5 ml. Pipetas automáticas: de 20 l, debidamente calibradas. Reactivo de Cianmetahemoglobina (reactivo de Drabkin):
Composición (pH 7-7,4)
Ferricianuro potásico [K3 Fe(CN) 6] 200 mgCianuro potásico [CNK] 50 mgFosfato monopotásico [KH2PO4] 140 mgDetergente no iónico* 1 mlAgua destilada hasta 1000 ml
*Detergentes no iónicos: Tritón X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.
El detergente no iónico facilita la solubilización de proteínas insolubles y acelera la transformación de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 5 min. Este reactivo debe tener un color amarillo pálido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservación utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el frío modifica el color del reactivo).
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Patrón de referencia (solución comercial): Es una solución de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentración de hemoglobina. Todo patrón de referencia de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrón primario de HiCN (detalladas en el punto siguiente).
Patrón primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarización y el control de calidad. Este patrón, es una solución muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y características fisicoquímicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64,458) y el coeficiente de extinción (44,0) de la hemoglobina. Se suministra en ampollas cerradas al vacío que contienen 10 ml de una solución de HiCN correspondiente a una concentración exacta de hemoglobina que se indica siempre en la ampolla. El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendría una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimétrica correspondiente a la ampolla. Así, si en el frasco se indica una concentración de 572 mg/l, significa que dicha solución patrón posee la misma absorbancia que la de una solución de hemoglobina de 143 g/l, si la sangre total se ha diluido 250 veces. El patrón primario posee un espectro de absorción característico con un pico de máxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexión a 504 nm. La curva de longitud de onda versus Abs, desde =750 nm a =460 nm se observa en la Fig.1, donde también se incluye la curva del reactivo. El valor de la Abs a 540 nm debe variar entre 0,400 y 0,404, y a 504 nm entre 0,248 y 0,251, según el lote y el instrumento de lectura utilizados. El cociente A540/A504 debe oscilar entre 1,60 y 1,62. Si alguno de estos parámetros se modifican, indica deterioro del patrón.
Técnica
Por un lado, se efectuará el espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig.1).
Por otro lado se determinará la concentración de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuación:
1) Conectar el espectrofotómetro.2) Homogeneizar bien la sangre mediante agitación suave con un sistema automático
(rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mínimo de 5 min o manualmente por inversión del tubo 20 veces.
3) Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.4) Mediante la micropipeta añadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene
5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operación es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.
5) Agitar el tubo con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mínimo de 5 min para que se produzca la hemólisis total y se complete la transformación de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.
6) Leer la Abs de la solución a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.
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7) Para calcular la concentración de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibración (ver más adelante), de un Standard de Hb o de una solución patrón de HiCN.
Elaboración de la curva de calibración
La gráfica de calibración tiene como finalidad calibrar el espectrofotómetro para una lectura determinada calculando la corrección existente entre los valores de Abs leídos en el aparato y los correspondientes valores de concentración de hemoglobina.
Para trazar este gráfico se preparan 5 soluciones de concentración de HiCN conocida y decreciente a partir del patrón de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (véase tabla).
TuboPatrón de
referencia de HiCN (ml)
Reactivo de Drabkin
(modificado)(ml)
Volumen final (ml)
Dilución(g/l)
Hb(g/l)*
1 3,0 0 3 0 1452 1,5 1,5 3 1:2 723 1,0 2,0 3 1:3 484 0,5 2,5 3 1:6 245 0 3,0 3 0 0
* El valor de esta concentración dependerá del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN que se emplee en el Trabajo Práctico.
La concentración de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilución y del valor indicado en la ampolla del patrón de HiCN. Una vez preparadas las soluciones patrón, se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene sólo reactivo (tubo 5) y se ajusta la Abs (100% de transmitancia).
Luego, partiendo de la solución de HiCN más diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrón. Finalmente, la relación entre los valores de Abs obtenidos y los correspondientes de concentración de hemoglobina se representan en un gráfico con los valores de Abs en las coordenadas y la concentración de hemoglobina en las abscisas (Fig. 2).
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Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina
La determinación de hemoglobina está sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a características peculiares del espécimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (50 x 109/L). No obstante, la mayoría de las veces los errores se deben a defectos técnicos en la manipulación y el análisis del espécimen.
Errores en la obtención del espécimen de sangre:1. Errores de extracción2. Empleo de anticoagulantes no recomendados3. Coagulación parcial de la sangre
Errores de la dilución:1. Empleo de pipetas automáticas descalibradas u otras pipetas sucias o
húmedas2. No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas del
capilar antes de introducirlo en el reactivo 3. Dilución incompleta de la sangre en el reactivo
Errores de la transformación de la hemoglobina en HiCN:1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformación de la
Hb en HiCN
Errores de la determinación:1. Empleo de instrumentos no calibrados2. Cubetas sucias o deterioradas3. Soluciones turbias de HiCN
Errores en la conservación del reactivo:1. Congelación del reactivo, lo que produce transformación de K3Fe(CN)6
en K4Fe(CN)6 y una oxidación parcial de la Hb.2. Conservación del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos
CN con formación exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentración de Hb obtenidos son inferiores a los reales.
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Figura 1. Espectro de absorción de la solución de HiCN y del reactivo de Drabkin
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Figura 2. Curva de calibración elaborada a partir de una solución de cianmetahemoglobina de concentración conocida.
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VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR
Fundamento
El test de velocidad de sedimentación globular (VSG) mide la sedimentación de eritrocitos en su plasma nativo.
VSG es un test no específico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crónicas como los procesos inflamatorios crónicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumática y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostáticos (para enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma múltiple). Sin embargo, en ocasiones, cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests más utilizados como screening en el laboratorio clínico. Se trata de un método sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple.
El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentación no está completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostáticas entre la superficie de los GR y diversas proteínas del plasma que favorecen (fibrinógeno y globulinas) o disminuyen (albúmina) la agregabilidad de estas células.
Desde el punto de vista físico, este fenómeno depende de los siguientes factores:
a. Tamaño de los GRb. Diferencia de densidad entre los GR y el plasmac. Viscosidad del plasma.d. Temperatura.
Estos factores se hallan relacionados entre sí a través de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relación entre la resistencia R que encuentra una partícula esférica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una velocidad v: R = 6vr
La sedimentación ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinación de los GR con formación de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un período durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentación se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente.
La etapa más importante es la primera o de aglutinación, ya que de ella dependerá la velocidad de todo el proceso. Así, cuanto más pequeños sean los agregados, más lentamente se producirá la sedimentación y viceversa.
Dado que, como se mencionó más arriba, el test también está influenciado por la forma y el tamaño de los GR, éste resulta poco confiable como un índice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.
La velocidad de sedimentación se incrementa por las altas concentraciones de fibrinógeno y otras proteínas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albúmina retarda la
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VSG. El mecanismo por el cual el fibrinógeno y las globulinas facilitan la aglutinación de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actúan disminuyendo la fuerza de repulsión que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas células se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composición proteica del plasma y especialmente de la relación entre las concentraciones de albúmina, globulinas y fibrinógeno. Así, mientras la albúmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibrinógeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibrinógeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformación menos esférica que la albúmina, lo que aumenta la constante dieléctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminución del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de éstos a agregarse y formar las llamadas “pilas de moneda”. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales proteínas plasmáticas.
Metodología
Existen dos métodos comúnmente utilizados para medir la VSG: el método de Westergren y el método de Wintrobe. Ambos métodos poseen limitaciones. El método de Westergren es menos sensible a pequeños aumentos de los factores que causan la sedimentación de los GR y puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.
El método de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG de Westergren es marcadamente elevada. Ambos métodos son altamente sensitivos a la relación entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no específico de la VSG probablemente acelerando la agregación y reduciendo las fuerzas de fricción entre los agregados en sedimentación. Se trataron de aplicar factores de corrección para anemias, pero no resultaron confiables.
Tradicionalmente, la VSG se ha determinado más frecuentemente por el método de Westergren que fue propuesto como método de referencia por el International Council for Standarization in Hematology (ICSH).
Durante los últimos años, han aparecido sistemas semiautomáticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plástico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el método de Westergren, se diferencian de éste por su carácter cerrado (recogida de los especímenes en tubos al vacío que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisión del llenado de las pipetas.
1. Método de Westergren
Es el método de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un método poco reproducible y sometido a diversas variables difíciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.
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Materiales
AnticoagulanteCitrato trisódico 109 mM en solución acuosa.Si se utiliza citrato trisódico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) preparar una solución acuosa de 32,08 g/l.
Tubo de sedimentaciónSe utilizan tubos de vidrio especialmente diseñados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un diámetro de 2.55 + 0.15 mm. El diámetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y éste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben ser aprobados por Comités de Estandarización en los diferentes países.
Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.Tubos plásticos descartables: Se fabrican tubos plásticos descartables según las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plásticos resultan inadecuados pues unen GR siendo así más susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plásticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.
GradillasLas gradillas o dispositivos de sostén están diseñados para sostener los tubos en una posición vertical inmóvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posición de los tubos sea vertical dentro de un límite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan pérdidas de sangre cuando el tubo está colocado en ella.
Técnica
1) La sangre se obtiene por punción venosa, evitando contaminación con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporción de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solución de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs si es mantenida a 4C.
2) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversión repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.
3) El tubo es colocado en la gradilla en posición estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25C), sin exposición a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, manteniéndolo exactamente 60 min.
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4) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).
Factores técnicos capaces de modificar la VSG
Causas de aumento Desviación de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el diámetro de la pipeta Elevación de la temperatura ambiente Dilución de la sangre
Causas de disminución Reducción del diámetro de la pipeta Utilización tardía de la sangre (especimen envejecido) Cambio de anticoagulante
Valores de referencia
EDAD (años) X + 2 DELímite superior
de la normalidadNiños mayores y
jóvenes0-15 5 + 10 15
Hombres adultos 17-50 4 + 3 1051-60 6 + 3 1261-70 6 + 4 14
Mujeres adultas 17-50 6 + 3 1251-60 9 + 5 1961-70 10 + 5 20
Interpretación de resultados
Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varían fundamentalmente con el sexo y en cierto grado también con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.
Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significación clínica, por lo que no se recomienda su empleo.
Existen numerosas patologías con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro
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de enfermedades principalmente relacionadas a las proteínas de fase aguda, y también en el embarazo normal y el puerperio.
Un 10% de los niños normales también presentan VSG aumentadas.
La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR (hemoglobinopatías, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardíacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.
Además de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgánica.
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RECUENTO DE RETICULOCITOS
Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporción de cinco a diez por mil hematíes. Su tamaño es el de los demás hematíes y se caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula.
El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Cuando una anemia se acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa, mientras que cuando el número es normal o disminuido se denomina arregenerativa.
En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3 días y terminan su maduración en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la sangre periférica.
El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA) y de ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4º C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos:
1. Tinción vital y microscopio óptico.2. Recuento automatizado.
El método manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variación >20%), lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a terapéuticas agresivas, pero sobretodo a los errores de índole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito.
1. Método de la tinción vital (método de referencia)
Materiales
Colorante: azul de metileno nuevo1 g cada 100 ml de solución citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de NaCl 9 g/L).
Sangre total anticoagulada con EDTA
Técnica
1) Mediante una pipeta Pasteur se añaden a un tubo de hemólisis tres gotas de solución colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de
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valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solución colorante.
2) La suspensión sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos.
3) Transcurrido este tiempo, se toma una pequeña gota de la suspensión y se extiende sobre un portaobjetos.
4) Una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersión (x1000).
5) Es necesario realizar el recuento sobre un mínimo de 1000 eritrocitos. El recuento se efectúa contando en donde los eritrocitos estén distribuidos homogéneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el número óptimo de hematíes por campo de los cuales distinguimos cuales son reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el cien por ciento el número total de hematíes contado.
Interpretación de resultados
El valor obtenido por la técnica de referencia será valido si se trata de una concentración normal de eritrocitos en sangre total. Por ello, cuando disminuye el número de eritrocitos como suele suceder en la anemia, el valor porcentual debe corregirse según el hematocrito empleando la siguiente fórmula:
Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x
Hto del paciente
Hto normal
(El hematocrito normal es el que le corresponde según edad y sexo)
En caso de anemia intensa, el número de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneración eritroblástica. Ello obedece a que la anemia se acompaña siempre de un estímulo eritropoyético compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la médula a la sangre periférica, y un acortamiento de su período de maduración intramedular, lo que supone un aumento del período de maduración periférica. Este fenómeno se caracteriza por la aparición en el examen morfológico de la extensión de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y de tonalidad azulada (policromasia)
Existe una relación inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el período de maduración periférica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud de interés clínico denominada índice de producción reticulocitaria (IPR) aplicando la fórmula siguiente:
IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente
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Período de maduración en días x Hto normal
Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoyética medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoyética (anemia arregenerativa)
Relación entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia
Hematocrito 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15Niveles de Hemoglobina (g/L) 150 133 117 110 83 66 50Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30Recuento de reticulocitos corregido (%)
1 1,8 4 7 8,3 9 10
Tiempo de maduración estimado 1 día 2 día 3 días
Índice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10
Otra técnica
Utiliza como colorante el Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el método de referencia. La mezcla sangre/colorante se incubará durante 15 minutos a 37º C. Luego de este tiempo se realizará el extendido y el recuento como se indicó antes.
2. Recuento automatizado
Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomáticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo, mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubación previa y el análisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitución del criterio morfológico inherente al método visual por el análisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometría de flujo y luz láser. Para la tinción del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o auramina.
Valores de referencia
Valor relativo (%)
Valor absoluto (x109 /L)
Recién nacido(sangre de cordón)
3,2-6,0 (4-19 años) 110-330
Niños y adultos jóvenes(4 a 19 años)
0,2-2,2 25-89
Adultos (20-50 años) MujeresHombres
0,2- 2,50,5-2,8
25-8632-97
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Variaciones patológicas
Disminución de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblástica y ferropénica) Anemias inflamatorias
Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Período neonatal Anemias hemolíticas Anemias posthemorrágicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltración neoplásica en la médula ósea) Mielofibrosis idiopática
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GRUPOS SANGUÍNEOS ABO Y Rh: PRUEBAS DE COOMBS
A) TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION
1)Preparar una suspensión de hematíes de grupo sanguíneo desconocido, al 2% en salina fresca (véase más abajo el apartado C) Preparación de la suspensión globular al 2%).
2)Agregar una gota de la suspensión globular a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn.
3)Simultáneamente controlar cada antisuero contra hematíes A1, B y O al 2%.
4) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
5)Leer primero los controles y luego las muestras problema microscópica y macroscópicamente.
6)Evaluar según los siguientes scores de lectura:+++ un gran aglutinato++ varios aglutinatos grandes++ muchos aglutinatos pequeños+ pequeños aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo+ aglutinatos visibles pero solo microscópicamenteaglutinatos conteniendo muy pocas células: tr trazas
negativo
B) TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO
1) Tomar una muestra de suero libre de hematíes.
2) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensión al 2%, de los siguientes hematíes:
a. hematíes A conocidosb. hematíes B conocidosc. hematíes del propio individuod. hematíes O conocidos
3) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4) Leer primero los controles y luego las muestras problema, microscópica y macroscópicamente.
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Interpretación de resultados
Glóbulos rojos problema
Anti A Anti B Anti AB Grupo ABO+ - + A- + + B- - - O+ + + AB
Suero problema
GR A GR B GR AB Grupo ABO- + + A+ - + B+ + + O- - - AB
C) PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN GLOBULAR AL 2%
1) Separar los hematíes del plasma y trasvasar una porción de los mismos a un tubo de Kahn.
2) Llenar el tubo con solución salina al 0,85% y centrifugar 1 min a 1000 rpm.
3) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces más, teniendo la precaución de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solución fisiológica.
4) Tomar una gota del culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solución fisiológica. Se tendrá así la suspensión al 2%.
D) SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA
1) Colocar una cantidad de sangre total igual a ¼ de gota.
2) Agregar una gota de anti-A absorbido y mezclar bien con una varilla de punta fina. También se puede utilizar un monoclonal anti-A1.
3) Al terminar de mezclar, disparar el cronómetro.
4) Rotar la placa en forma circular y observar la aparición de aglutinación dentro del minuto.
E) TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh
1) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn.
2) Adicione una gota pequeña de suspensión de glóbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra.
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3) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm.
4) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará microscópicamente con un visor y macroscópicamente.Reacciones Positiva: los hematíes D (Rho) positivos permanecerán aglutinados al
querer desprender el culot globular. Negativa: los hematíes Rh (rh) se suspenderán nuevamente sin evidenciar
aglutinación.
5) Proceda de la misma manera con los tubos controles.Controlesa. Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + antiDb. Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa +
anti-Dc. Control de seudoaglutinación: muestras de sangre + plasma de persona AB.
F) PRUEBA PARA DETECTAR Du
Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros anti–D. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs.
1) Coloque dos gotas de suero anti –D(Rho) en un tubo de Kahn. La detección de Du también se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du.
2) Agregue 1 gota de una suspensión sanguínea al 2% en solución salina.
3) Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37°C.
4) Lave los hematíes 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante.
5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana.
6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se hará macro y microscópicamente.Reacciones Positiva: los hematíes Du (Rhou) positivos permanecerán aglutinados luego
de intentar desprender el culot globular. Negativa: los hematíes Rh (rh) y Du (Rhou) negativos se resuspenderán y
no aglutinarán.
Controlesa. Prueba sobre la bondad del suerob. Prueba de su especificidadc. Prueba de seudoaglutinación
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Para el primer control positivo deben emplearse hematíes Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hematíes y evitar emplear eritrocitos D (Rho) positivos con el antígeno E (rh”) presente, dado que en tales hematíes el factor D (Rho) es más reactivo.
El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecíficas para el antígeno en cuestión (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparación del suero). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es específico y no posee ningún contaminante que pueda falsear los resultados.El tercer control es de seudoaglutinación y para ello se reemplaza el suero anti–D por suero de persona de grupo sanguíneo AB, y se lo enfrenta con los hematíes que están siendo tipificados.
G) COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS.
G.1 Prueba de Coombs indirecta
1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensión de hematíes de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el período de incubación de 1 hora a 37 °C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solución fisiológica y 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ al 2%.
2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solución fisiológica, eliminando completamente el sobrenadante en el último lavado.
3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F).
4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópica y macroscópicamente.
G.2 Prueba de Coombs directa
1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensión al 2% de hematíes problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensión de hematíes O Rh+ sensibilizados al 2%.
2) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F).
3) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana.
4) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscópica y macroscópicamente.
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Anti-A, Anti-B o Anti A,BMonoclonal
Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos ABO
SIGNIFICACION CLINICAEn el año 1900 Landsteiner descubrió que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos altamente reactivos en su superficie. También demostró que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional. Por este motivo, la tipificación de los grupos sanguíneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los demás ensayos pretransfusionales.
FUNDAMENTOS DEL METODOLos glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antígenos correspondientes, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente. La ausencia de aglutinación en todos los casos, implica grupo O.
REACTIVOS PROVISTOSAnti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por líneas celulares de hibridomas de ratón.
REACTIVOS NO PROVISTOSDe acuerdo a la técnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente:- Solución fisiológica- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos (PBS)- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS)- Albúmina Bovina 30% de Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USOLos Reactivos se proveen listos para usar.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSDesechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.
MUESTRAGlóbulos rojos o sangre enteraa) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Centrífuga- Tubos de hemólisis- Placas- Palillos mezcladores descartables
PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
PROCEDIMIENTOEn las siguientes técnicas la suspensión de glóbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solución fisiológica, PBS o LISS.
I- TECNICA EN PLACAPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa limpia, agregar 1 gota de
suspensión de glóbulos rojos. 2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y
balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinación visible microscópicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio.
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II- TECNICA EN TUBO (por centrifugación)1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis, agregar 1 gota de
suspensión de glóbulos rojos al 3-5%.
III- TECNICA EN TUBO (por sedimentación)1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemólisis, agregar 1 gota de
suspensión de glóbulos rojos al 3-5%. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la aglutinación.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas utilizadas) indica una reacción positiva.
Grupo sanguíneoAntisuero
Anti-A Anti-B Anti-A,BAB0
ABVariants débiles del grupo A como Ax
+--+
+/-
-+-+-
++-++
METODO DE CONTROL DE CALIDADEl control de calidad puede efectuarse ensayando glóbulos rojos tipificados.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOReacciones débiles pueden observarse en las siguientes situaciones:- Neonatos: los antígenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recién nacido. Por esta razón deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros.- Leucemias u otros desórdenes malignos.- Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idéntico.- Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificación de los grupos sanguíneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos químicos o con partículas de sílica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad.- Aglutininas frías: en presencia de aglutininas frías, el lavado de los glóbulos rojos 4-6 veces con solución fisiológica, resulta generalmente suficiente para obtener células aptas para la tipificación. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas células con 2 gotas de soluciónfisiológica. No debe producirse aglutinación.
PRESENTACIONAnti-A: frasco x 10 ml (Cód. 1443152).Anti-B: frasco x 10 ml (Cód. 1443154).Anti-AB: frasco x 10 ml (Cód. 1443153).
BIBLIOGRAFIA- Moore, S. et al. “Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use”. París, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59.- Widman, F.K. “Technical Manual”. 9th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8.2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.
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Anti-D (Rho)monoclonal
Reactivo para la detección de antígeno D (Rho)
SIGNIFICACION CLINICALas observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica de la detección en el laboratorio de los anticuerpos anti-D.Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno, ya sea por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido.Existen muchos otros antígenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO.
FUNDAMENTOS DEL METODOLos glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.
REACTIVO PROVISTOAnti-D (Rho): solución de anticuerpos monoclonales humanos.
REACTIVOS NO PROVISTOSDe acuerdo a la técnica empleada puede requerirse adicionalmente:- Solución fisiológica.- Suero Anti-humano (poliespecífico) provisto separadamente por Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USOAnti-D (Rho): listo para usar.
PRECAUCIONESEl reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOEl Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSDesechar el reactivo cuando se observe contaminación del mismo.
MUESTRAGlóbulos rojos o sangre enteraa) Recolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulantes.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).c) Sustancias interferentes conocidas: los glóbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situación deberá realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC).
Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)Dependiendo de la técnica que se emplee, podrán ser necesarios:- Centrífuga- Tubos de hemólisis- Placa de vidrio- Palillos mezcladores descartables
PROCEDIMIENTOI- TECNICA EN PLACAPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica. También puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear
constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación.
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II- TECNICA EN TUBOPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autólogos, o en solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente la presencia o ausencia de
aglutinación. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describió en 4). Las muestras que aún en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antígeno Du.
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du
Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos rojos en plasma o suero autólogos, o solución fisiológica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemólisis. 2) Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. 3) Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. 4) Lavar las células 3-4 veces con solución fisiológica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender
las células luego de cada lavado. 5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico), mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. 6) Agitar el tubo para despegar las células y examinar macroscópicamente.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificación de antígeno D (Rho) de glóbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinación del Du no puede efectuarse sobre glóbulos rojos sensibilizados.Pueden obtenerse resultados más rápidos y mejor visualización precalentando la placa a 45-50oC.
PRESENTACIONFrasco x 10 ml (Cód. 1443155).
BIBLIOGRAFIA- Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940.- Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959.- Widman, F.K. - “Technical Manual” - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985.- Race , R.R. and Sanger, R. - “Blood Groups in Man” - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pág. 178, 1975.
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Suero Anti-humano(poliespecífico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta
SIGNIFICACION CLINICALas experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores métodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente hacía referencia a antígenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la detección de anticuerpos en casi todos los grupos sanguíneos de importancia clínica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos:
Prueba Antiglobulina Indirecta- Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos.- Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión.- Fenotipo de glóbulos rojos.- Identificación y titulación de anticuerpos encontrados ensuero o eluatos.
Prueba Antiglobulina Directa- Diagnóstico de laboratorio de anemia hemolítica y enfermedad hemolítica del recién nacido.- Investigación de reacciones dudosas en una transfusión.- Investigación de enfermedades autoinmunes que involucran la unión de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glóbulos rojos.
FUNDAMENTOS DEL METODOEl agregado de Suero Anti-humano (poliespecífico) a glóbulos rojos que están cubiertos de inmunoglobulinas y/oFragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinación de los glóbulos rojos visible macroscópicamente.
REACTIVO PROVISTOSuero Anti-humano (poliespecífico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3.
REACTIVOS NO PROVISTOS- Reactivos para la determinación de grupos sanguíneos.De acuerdo a la técnica a emplear puede requerirse adicionalmente:- Solución fisiológica.- Solución fisiológica tamponada con buffer fosfato (PBS).- Solución fisiológica de baja fuerza iónica (LISS).
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Suero Anti-humano (poliespecífico): listo para usar.
PRECAUCIONESEl Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOEl Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSDesechar el reactivo si se observa contaminación del mismo.
MUESTRAGlóbulos rojosa) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab.c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (2-10oC). Si se utilizó heparina o EDTA, la tipificación debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 días. Si se emplean coágulos, deberá efectuarse la tipificación dentro de los 7 días de obtenida la muestra. Cuando se efectúan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extracción).Si los glóbulos provienen de coágulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
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- Centrífuga- Baño de agua a 37oC- Tubos de hemólisis
PROCEDIMIENTOI- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución salina de fuerza iónica normal).1) En un tubo de hemólisis colocar 2 gotas del suero a probar.2) Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.3) Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos.4) Lavar los glóbulos 3 veces con PBS teniendo la precaución de descartar completamente el sobrenadante y
resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del último lavado.
5) Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecífico) al botón de células. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm.
6) Resuspender las células por agitación y observar macroscópicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones débiles.
7) Los resultados negativos deben confirmarse por adición de glóbulos rojos sensibilizados con IgG débiles.
II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solución fisiológica de baja fuerza iónica).El empleo de esta solución permite reducir el tiempo de incubación a 15 minutos.Los glóbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solución una suspensión de glóbulos rojos al 3%.1) Colocar en un tubo de hemólisis 1 gota de suero a probar.2) Agregar 1 gota de glóbulos rojos a probar al 3% en LISS.3) Mezclar e incubar a 37°C durante 15 minutos en baño de agua.Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la técnica I).
III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTASe emplea para demostrar la absorción “in vivo” de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glóbulos rojos. 1) Preparar una suspensión de glóbulos rojos a probar en PBS al 3%.2) En un tubo de hemólisis colocar 1 gota de esta suspensión y continuar con los pasos 4) a 7) de la técnica I).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa observación de aglutinación (con cualquiera de las técnicas empleadas) indica una reacción positiva.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOReacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas:- Contaminación química o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba.- Lavado inadecuado de las células.- Tiempo o temperatura de incubación inadecuados.- Tiempo o velocidad de centrifugación inadecuados.- Concentración inadecuada de glóbulos rojos.- Agitación excesiva para despegar los glóbulos rojos aglutinados.Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glóbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen.
PRESENTACIONFrasco x 10 ml (Cód. 1443156).
BIBLIOGRAFIA- Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945.- Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945.- Widman, F.K. - “Technical Manual”. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pág. 376, 1985.
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DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS INMUNES: TITULACIÓN DE ANTICUERPOS
Técnica básica de titulación
1. Preparación de diluciones madres.
1) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el número de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario).
2) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solución fisiológica (SF). Colocar 0,300 ml de suero a titular en el tubo N°1.
3) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N°2.
4) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N°3. Homogeneizar y repetir la operación hasta completar las diluciones.
2. Titulación
1) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una pipeta Pasteur para cada dilución, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos.
2) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensión de hematíes al 2%. Agitar la mezcla.
3) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido.
4) Simultáneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinación y de especificidad del suero.
5) Leer los resultados macro y microscópicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilución. El grado de aglutinación se considerará según los scores anteriormente indicados.
El título es la recíproca de la dilución más alta donde se observa aglutinación . Si en la última dilución, con aglutinación, el tipo de aglutinato es tr, el título se determinará promediando dicha dilución con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N° 5 cuya dilución es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el título será (16+8)/2=12.
Controles a. Control de autoaglutinación: consiste en enfrentar dos gotas de suspensión de
hematíes a usarse con dos gotas del suero del dador de hematíes.b. Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hematíes O
con dos gotas del suero a titular.
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TIEMPO DE SANGRIA
1) METODO DE IVY
Fundamento
Esta prueba valora la capacidad hemostática global in vivo y consiste en medir el tiempo transcurrido desde la realización de una pequeña incisión cutánea hasta que cesa la hemorragia. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapón hemostático eficaz y, por ende, representa una valoración global y simultánea de la función plaquetaria (número, adhesión, agregación y degranulación plaquetaria) y de la función vascular. Respecto al factor vascular, la prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora.El método original del corte en el lóbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910 es poco sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizándolo hoy en día. En 1935, Ivy introdujo la aplicación de un manguito de presión en el brazo y la práctica de la incisión en la cara anterior del antebrazo. Este método, con la modificación introducida por Borchgrevink, que sustituye la punción con lanceta por un corte realizado con hoja de bisturí, ha demostrado una alta sensibilidad. Por último, la introducción de plantillas o dispositivos automáticos para la realización de la incisión ha venido a uniformar y aumentar la reproducibilidad.
Materiales
Dispositivos automáticos para la realización de la incisión: Simplate y Simplate II (Organon Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics).
Cronómetro.
Técnica
1) Es aconsejable colocar un esfigmomanómetro en el brazo del paciente y regular a 40 mm de Hg, manteniéndo esta presión a lo largo de toda la prueba.
2) Se extrae el dispositivo automático de su reservorio estéril y se sitúa en la parte superior de la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo.
3) Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo poner en marcha el cronómetro (el corte tendrá un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm).
4) La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión, anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba. Cuando el tiempo se alarga más de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una compresa con material hemostático.
Valores de referencia
Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patológicos.
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2) METODO DE DUKE
Fundamento
El método original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero se continúa aplicando.
Técnica
1) Se practica una incisión de 2 mm de longitud en el lóbulo de la oreja utilizando una lanceta con tope, descartable.
2) La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión, anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba.
Valores de referencia
Inferior a 5 minutos.
Interpretación de resultados
La prueba se prolonga por reducción del número de plaquetas o por alteraciones funcionales plaquetarias o plasmáticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de adhesión, agregación o degranulación plaquetarias.
Está alterado en trombocitopenias, trombopatías, trombastenias y déficit de fibrinógeno. Se observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y después de la ingesta de ácido acetilsalicílico.
En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el diagnóstico de dicha enfermedad.
TIEMPO DE COAGULACION
Fundamento
El tiempo de coagulación de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la activación intrínseca de la protrombina y el fibrinógeno.
La sangre, al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular, es capaz de coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso está en relación con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiológicos o adquiridos, que influyen en la formación de dicho coágulo.
Este tiempo de coagulación in vitro reflejará mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).
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Materiales
Tubos de vidrio, perfectamente limpios. Baño a 37C. Cronómetro.
Procedimiento
1) Obtener 3 ml de sangre por punción venosa, de primera intención y con jeringa plástica.
2) Disparar el cronómetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa.
3) Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de baño a 37C.
4) Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja de escurrirse por las paredes del tubo).
5) De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma forma con el tercer tubo.
6) Se toma como tiempo de coagulación el valor obtenido en el tercer tubo.
Valores de referencia
7-15 min a 37C.
Interpretación de resultados
El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20 como mínimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier variabilidad de los valores previamente obtenidos.
Se considera alargado un tiempo de coagulación que difiere en más de 2 min del límite superior del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD).
Se trata de un método poco sensible, pues se prolonga sólo en aquellos casos de déficit graves. Un tiempo de coagulación normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulación, pero un tiempo prolongado es siempre índice de un defecto severo de la misma, que puede deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formación del coágulo de fibrina, con excepción de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el método es mucho más sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activación por contacto y en la formación del activador intrínseco de la protrombina.
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RETRACCION DEL COAGULO
Fundamento
La retracción del coágulo depende de la actividad trombodinámica de las plaquetas, por lo que se require un número mínimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++.
Técnica
1) Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulación deben dejarse en baño a 37C durante por lo menos 3 hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retracción de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retracción por apreciación visual del tamaño del coágulo retraído y el suero libre en:
a. Normal o completab. Incompletac. No retraed. Hiperretráctil
Interpretación de resultados
Esta prueba depende del número de plaquetas, su actividad funcional y de la concentración de fibrinógeno, aunque no se relacione muy bien con el número de plaquetas (en ciertas condiciones da normal aún con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibrinógeno reducirá la retracción por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de hipofibrinogenemia.
En la trombastenia de Glanzman (alteración funcional) se observan retracciones incompletas o nulas.
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DETERMINACION DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APTT)
APTTestReactivos para la determinación del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
SIGNIFICACION CLINICAEl tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulación.Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII.También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno, no siendo así con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares.La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos.
FUNDAMENTOS DEL METODOEl ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un baño a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.
REACTIVOS PROVISTOSReactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado.Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0,025 mol/l.
REACTIVOS NO PROVISTOSAgua bidestilada o desionizada.
INSTRUCCIONES PARA SU USOCloruro de Calcio: listo para usar.Reactivo APTT, preparación:- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase.- Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37oC.- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.
PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 días en refrigerador o 30 días congelado (-20 oC). El congelado y descongelado sólo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo.
MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extracción con jeringas plásticas.b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.c) Sustancias interferentes conocidas:- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en baño a 37oC) previo a la determinación. La muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis en tubos plásticos para minimizar los efectos de activación por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Tubos de hemólisis.- Pipetas y micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa, para la observación del coágulo.
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PROCEDIMIENTOPrecalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37oC. En un tubo de hemólisis colocar:Muestra (plasma desconocido o control) 100 ulReactivo APTT (homogeneizado) 100 ulMezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37oC, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ulDisparar simultáneamente un cronómetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el baño unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo. Tomar nota del tiempo de coagulación.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLos resultados pueden expresarse de distinta forma:1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos.2) Como relación entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control.
METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal - patológico.
VALORES DE REFERENCIAEl intervalo de valores observados en individuos normalesoscila entre 33-48 segundos.Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma control.Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe.
CURVA DE CALIBRACIONEste método es útil como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante.La técnica empleada es la siguiente:1) Preparar una Solución de Trabajo de heparina en solución fisiológica cuya concentración sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.2) Preparar diluciones de esta Solución de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se deberán obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones así como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogarítmico APTT vs. Concentración de heparina.El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la gráfica, para obtener la concentración actual de heparina circulante.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA.El mecanismo de la coagulación involucra una serie de reacciones enzimáticas que pueden ser influenciadas por toda condición que afecte a los sistemas enzimáticos en general, razón por la cual se deben observar las mismas precauciones metodológicas.Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.
PERFORMANCEReproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes resultados:
Nivel D.S. C.V.45 seg62 seg
+1,1 seg+1,8 seg
2,5%3,0%
PRESENTACIONEquipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cód. 1705002).
BIBLIOGRAFIA- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematología Práctica – Ediciones Toray, 2º Edición (1970).- Wintrobe, M.M. - Hematología Clínica 3ª Edición Intermédica (1969).- Bragos, I; Rodríguez Pécora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. -“Evaluación de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial deTromboplastina Activada” - 53º Triduo Bioquímico Científico Anual; Bahía Blanca (1988).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
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DETERMINACION DEL TIEMPO DE PROTROMBINA O TIEMPO DE QUICK EN UNA ETAPA
SoluplastinTromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo
de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa
SIGNIFICACION CLINICAEl fenómeno de la coagulación puede desencadenarse por una “vía extrínseca” (lesión tisular) o por una “vía intrínseca” contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal). La determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.Por lo tanto la determinación se aplica a:- estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos;- detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca;- control de la terapéutica con anticoagulantes orales.
FUNDAMENTOS DEL METODOEste ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII).
REACTIVO PROVISTOSoluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentración final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0,1 mol/l.
REACTIVO NO PROVISTOAgua bidestilada o deionizada.
INSTRUCCIONES PARA SU USO- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37oC.- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.
PRECAUCIONESEl reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOSoluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10oC), es estable 5 días a partir del momento de su reconstitución.
MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirán 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.c) Sustancias interferentes conocidas:- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados; - hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados.Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtención, la muestra se debe congelar (a -20 oC); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este último procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37oC) previo a la determinación.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Tubos de hemólisis.- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa para la observación del coágulo.
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PROCEDIMIENTO1- Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).2- En un tubo de hemólisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro.4- Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulación, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo.5- Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medición, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLos resultados pueden expresarse de distintas formas:1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos.2- Porcentaje de Actividad Protrombínica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombínica de un pool de plasmas frescos normales.Curva de calibraciónEn tubos de hemólisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, según:
Diluciones 1:1 1:2 1:3 1:4 1:8Porcentaje de actividad (%) 100 50 33,3 25 12,5Pool plasmas normales (ml) 0,5 0,3 0,3 0,2 0,2Solución fisiológica - 0,3 0,6 0,6 1,4
Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilución, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombínica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibración, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos.
3- Razón Internacional Normatizada (R.I.N.)Para su cálculo, deberá emplearse la tabla de valores adjunta al equipo.
METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal - patológico.
VALORES DE REFERENCIAEl rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 - 100%Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango terapéutico que se puede expresar como:- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 25 - 35%
- R.I.N.: 2,4 - 2,5-
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Otras causas de resultados erróneos son:- Extracción defectuosa de sangre venosa.- Las variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.- La preincubación en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como límite máximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposición por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina.
PERFORMANCEa) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, se obtuvieron los siguientes datos:
X (n=20 D.S. C.V.11,5 seg +0,4 seg 3,5%21,2 seg +0,6 seg 2,8%
b) Comparación con método de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro método tomado como referencia, se observa:
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Reactivo X (n=60) D.S. C.V.Soluplastin 13,2 seg +0,3 seg 2,3%Referencia 12,8 seg +0,3 seg 2,3%
PRESENTACION- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cód. 1705001).- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cód. 1705005).- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cód. 1705003).
BIBLIOGRAFIA- Quick, A.J. - “Fisiología y Patología de la Hemostasis” - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).- Araldi, H.T., et al. - “Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano” – Acta Bioquím. Clín. Latinoam. XVI/1:131 (1982).- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 28: Normalización de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. Nº 610:49-56 (1977).- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Téc. Nº 658:202-223 (1981).- Suñer Casadevall, F. - “Nuevas Normas Internacionales para la Expresión del Tiempo de Quick” - Análisis Clínicos X/40:240-245 (1985).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
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CUANTIFICACIÓN DE HIERRO SÉRICO Y CAPACIDAD TOTAL DE FIJACIÓN DE HIERRO (TIBC)
Fer-colorTransferrina
Método colorimétrico para la determinación de la CapacidadTotal de Fijación de Hierro (Transferrina) del suero
SIGNIFICACION CLINICAEn el organismo humano, el hierro circula como Fe (III) unido a una proteína transportadora específica: la transferrina o siderofilina. Su función es captar el hierro de los sitios de absorción (mucosa intestinal) o depósito (sistema retículo endotelial) y llevarlo a los órganos hematopoyéticos donde es utilizado.En el individuo normal sólo la tercera parte de la transferían se satura con hierro, estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte.La actividad fisiológica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijación de hierro (TIBC).La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrágicas, y ferropénicas en general, en insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en los últimos meses del embarazo. Disminuye en cambio en la hemocromatosis, en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas, neoplásicas, nefropáticas, etc.) en las hepatopatías crónicas, y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico.
FUNDAMENTOS DEL METODOLa transferrina o proteína transportadora específica del hierro, se determina por su actividad fisiológica de captar Fe (III) a pH mayor que 7,2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitación con carbonato de magnesio. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimétricamente según la técnica de Fer-color o Fer-color AA.La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que está saturada.
REACTIVOS PROVISTOSSolución saturante: solución estabilizada de Fe (III).Adsorbente: carbonato de magnesio granulado.
REACTIVOS NO PROVISTOS- Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab.- Agua destilada.
INSTRUCCIONES PARA SU USOSolución saturante: lista para usar.Adsorbente: listo para usar.
PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOLos Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente después de retirar las porciones necesarias para el momento.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSVer el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.
MUESTRAVer el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.- Tubos de Kahn.
CONDICIONES DE REACCIONVer el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.
PROCEDIMIENTOa) Saturación de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solución saturante. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente. Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. La agitación deberá ser vigorosa y en sentido longitudinal. Centrifugar 10-15 minutos a 3.000-4.000 r.p.m. hasta obtener sobrenadante límpido o con la opalescencia propia del suero.
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b) Colorimetría: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.
CALCULO DE LOS RESULTADOSCorregir las lecturas y efectuar los cálculos de la misma manera que en la determinación de hierro sérico, multiplicando por dos el resultado final, por la dilución del suero. Habitualmente se realiza la determinación de hierro sérico juntamente con la de transferrina. En ese caso se informan tres valores: Hierro Sérico, Transferrina y Porcentaje de Saturación de la Transferrina, que se calcula de la siguiente manera:
Saturación % =Hierro sérico (ug/dl)
x 100Transferían (ug/dl)
Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de hierro sérico para el cálculo del Porcentaje de Saturación, comenzar con la Saturación de la Transferrina 30 minutos antes.
VALORES DE REFERENCIALa literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturación de la Transferrina en personas normales:Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl.Saturación de la Transferrina: 20-55%.Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab.La agitación insuficiente producirá valores falsamente aumentados de Transferrina.La concentración de Fe (III) de la Solución saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Por lo tanto, no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. Además, como la medida exacta de esta solución no es crítica, puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml.
PERFORMANCEReproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes datos:
Nivel D.S. C.V.280 ug/dl560 ug/dl
+23,2 ug/dl+28,9 ug/dl
8,29%5,16%
PRESENTACIONReactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijación de Hierro (Transferrina) (Cód. 1492002).
BIBLIOGRAFIA- Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973).- I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971).- Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971).- Rojkín, M.; Olguín de Mariani, M.; Drappo, G. y Albarracín, A.- III Congreso Argentino de Bioquímica - Buenos Aires (1975).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
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Fer-colorMétodo colorimétrico para la determinación de hierro
sérico sin desproteinizaciónSIGNIFICACIÓN CLINICAEl hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos, formando parte de la hemoglobina.La mioglobina, pigmento más importante de las células musculares, contiene hierro en su grupo hemo, y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las células del sistema reticuloendotelial de hígado, bazo, médula ósea y parénquima hepático.Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas, edad, sexo, hábitos alimenticios y actividad eritropoyética).La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más frecuentemente encontrados en la clínica médica. Ocurre con frecuencia en mujeres, particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. La otra causa más común de anemia ferropénica, es la pérdida de sangre a través del tracto gastrointestinal, a veces imperceptible, debida a hernia de hiato, úlceras gástricas o duodenales, y carcinomas de estómago y colon.Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. A veces se asocian a terapia transfusional, y otras veces a desórdenes caracterizados por una síntesis defectuosa de hemoglobina o fenómenos hemolíticos.
FUNDAMENTOS DEL METODOEl hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3,7 y en presencia de un reductor, el ácido mercaptoacético. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm.
REACTIVOS PROVISTOSReactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l.Standard: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl.Buffer succinato: solución de succinato 0,25 mol/l para pH 3,7.Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70 %.
REACTIVOS NO PROVISTOSAgua destilada.
INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo PBTS: listo para usar.Standard: listo para usar.Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato, vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. Anotar en el rótulo la fecha de preparación.
PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un año a partir de la fecha de su preparación. Antes de usar llevar a 18-30oC.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSVariaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard, indican contaminaciones ocasionales (agua, material de vidrio, etc.).Un aumento en el valor de los Blancos indicará una contaminación con hierro.
MUESTRASueroa) Recolección: debe usarse únicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reacción. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de mañana) ya que las fluctuaciones fisiológicas son significativas durante el día.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl, hiperlipemia, iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Si bien hemólisis ligeras no interfieren con este método, el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemólisis. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC).
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Espectrofotómetro o fotocolorímetro.- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.- Tubos de fotocolorímetro.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
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- Valores de Blanco aceptables: la determinación de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. El Blanco de Reactivos, ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones, no debe ser superior a 0,150 D.O. debiendo ser además, despreciable la contribución del agua en dicho Blanco. Para controlar esto último, se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0,5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2,5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. Caso contrario, reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0,02 uOhms).Por otra parte, si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0,150 D.O. es indicio de contaminación grosera de los reactivos, los cuales deberán desecharse. Efectuar este control periódicamente.- Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla opor agitación suave. No invertir para evitar contaminaciones.- Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro, para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.a. 10-15%, eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. Secar el material preferentemente a no más de 80°C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plásticos. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinación de hierro.
PERFORMANCEa) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 días diferentes, se obtuvo un coeficiente de variación del 4,2%, para un nivel de Fe sérico de 129 ug/dl.b) Recuperación: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alícuotas de un mismo suero, se recuperó entre 90 y 103%.c) Linealidad: la reacción es lineal hasta 500 ug/dl.
PRESENTACIONEquipo para 100 determinaciones (Cód. 1492001).
BIBLIOGRAFIA- Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973).- I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971).- Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971).- Rojkín, M. L.; Olguín de Mariani, M. C.; Drappo, G. A. Y Albarracín, A. - III Congreso Argentino de Bioquímica - Buenos Aires (1975).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
CONDICIONES DE REACCION- Longitud de onda: 560 nm en espectrofotómetro o 540-560 nm en fotocolorímetro con filtro verde.- Temperatura de reacción: temperatura ambiente- Tiempo de reacción: 10 minutos- Volumen de muestra: 500 ul- Volumen total de reacción: 2,5 ml
PROCEDIMIENTOEn tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco de Reactivos), S (Standard) y D (Desconocido) colocar:
B S DAgua bidestilada 500 ul - -Standard - 500 ul -Suero - - 500 ulBúfer/reductor 2 ml 2 ml 2 m
Mezclar. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de SueroBS) en espectrofotómetro a 560 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posición vertical,1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con agua.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINALLos tubos deben ser leídos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento.
CALCULO DE LOS RESULTADOSCorregir las lecturas de S y D, restándoles los Blancos correspondientes:S - B = S corregidaD - (B + BS) = D corregidaFe (ug/dl) = D corregida x f
Donde: f =100 ug/dl
S corregida
METODO DE CONTROL DE CALIDADStandatrol S-E 2 niveles.
VALORES DE REFERENCIAEn un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos, con edades oscilando entre los 18 y 51 años, se halló un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios:
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Varones: 114,6 ug/dlMujeres: 103,3 ug/dlSe recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE HEMOGLOBINA
Fundamento
Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. En este medio la HbA migra hacia el ánodo, mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeñas cantidades), queda en la HbA migrando juntas. La HbA2 tiene una velocidad menor que la A.
Materiales y reactivos
Soporte: Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,6). Las tiras deben conservarse en posición vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%. Las tiras secas pierden las dimensiones y las características del gel.La superficie de las tiras que es penetrable a las proteínas se reconoce porque es más opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro.
Solución buffer: Tris........................ 14,1 gGlicina .................. 22,6 gH2O destilada......... 1000 ml
Solución colorante: Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras)
Solución decolorante: Ácido acético 5%. Solución deshidratante: Metanol puro. Solución de transparentización: Metanol ......................... 85 ml
Ácido acético ................ 14 mlGlicerol ........................... 1 ml
Solución disolvente: Ácido acético 80%
Técnica
1) Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos.
2) Eliminar el exceso de líquido secando entre 2 papeles de filtro.
3) Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar rápidamente para evitar evaporaciones.
4) Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver más adelante).
5) Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts, durante 90 minutos.
6) Desconectar la corriente y retirar las tiras.
7) Colorear durante 5 minutos.
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8) Decolorar con 3-4 baños de decolorante, hasta ver el fondo blanco de la tira.
9) Determinación cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solución disolvente y agitar. Leer a 520 nm si se usó colorante Ponceau S.
10) Transparentización: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos, a continuación se las coloca en la solución transparentadora durante 1 minuto como mínimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos, hasta la transparencia completa. Así se conserva para leer en densitometría.
El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatías:
TIPO Polo negativo Polo positivo ACLARACIONESNormal
Anhidrasas HbA2 HbA Carbónicas
HbA 98%
HbA2 2%
Recién nacido
Anhidrasas HbF HbA Carbónicas
HbF 90%
HbA 10%
Drepanocitosishomocigota
Anhidrasas HbA2 Hb S Carbónicas
HbA2 2%
HbS 98%
Drepanocitosisheterocigota
Anhidrasas HbA2 Hb S HbA Carbónicas
HbA < 50%HbS > 50%HbA2 2%
Hemoglobinopatía C homocigota
Anhidrasas HbC carbónicas
HbC 98%
HbA2 2%
Hemoglobinopatía C heterocigota
Anhidrasas HbC HbA Carbónicas
HbC > 50%
HbA < 50%
-talasemia heterocigota
Anhidrasas HbA2 HbA Carbónicas
HbA2 entre 4-8%
-talasemia homocigota
Anhidrasas HbA2 HbF HbA Carbónicas
HbA2 normal% de HbF y HbA, variable según tipo de Th homocigota
Doble Heterocigota
HbS 50%
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S/C Anhidrasas HbC HbS Carbónicas
HbC 50%
PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO
Técnica
1) Obtener 5 ml de sangre por punción venosa, usando cualquier anticoagulante, aunque se recomienda la heparina.
2) Lavar tres veces con solución fisiológica, desechando los sobrenadantes.
3) Agregar un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0,8 ml de tolueno (rompe los glóbulos blancos), agitar vigorosamente durante 1 minuto.
4) Colocar en heladera (favorece la hemólisis), dejar 24 horas.
5) Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm, recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar.
6) Se determina la concentración de hemoglobina en el hemolizado obtenido, mediante el método de la cianmetahemoglobina, se lleva la concentración hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada.
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DETECCIÓN HISTOQUÍMICA DE HEMOGLOBINA FETAL: REACCIÓN DE KLEIHAUER-BETKE
Fundamento
La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la hemoglobina fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos.
Reactivos
Alcohol etílico al 80% Buffer de ácido cítrico, pH 3,4
Solución A ................. 84 mlSolución B.................. 16 ml
o Solución A: Ácido cítrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml
o Solución B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml
Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua.
Técnica
1) Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80%.
2) Lavado rápido con agua y secado.
3) Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical.
4) Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar.
Interpretación de resultados
Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.
El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.
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DIAGNOSTICO DE MONONUCLEOSIS INFECCIOSA
MonoslidePrueba de aglutinación en placa, con neutralización según
Davidsohn, para el diagnóstico de mononucleosis infecciosa
SIGNIFICACION CLINICALa mononucleosis infecciosa es una enfermedad benigna producida por el virus de Epstein-Barr (EBV) que se caracteriza en su aspecto clínico por la aparición de fiebre irregular durante una o dos semanas, dolor e hinchazón de los ganglios cervicales e irritación faríngea; con un cuadro hematológico bastante característico debido a la gran proliferación de células linfoides atípicas.Paul y Bunnell observaron que el suero de estos pacientes generalmente contiene un alto título de anticuerpos heterófilos, capaces de aglutinar glóbulos rojos de carnero o de caballo. Estos anticuerpos no son privativos de la mononucleosis, ya que en el suero de individuos sanos pueden existir aglutininas anti-carnero con títulos de 1/28 y hasta 1/56, observándose títulos de 1/112 o más en diversas infecciones y luego de estimulaciones antigénicas como transfusiones sanguíneas. Tales hechos indican que la evidencia de altos títulos de anticuerpos heterófilos sólo tiene valor presuntivo en el diagnóstico de esta enfermedad.Davidsohn introdujo la adsorción diferencial con extracto de riñón de cobayo (capaz de adsorber los anticuerpos heterófilos no-mononucleosis infecciosa o anticuerpos de Forssman), aumentando así la sensibilidad y especificidad de la prueba y permitiendo confirmar los resultados de la Paul-Bunnell, que por su rapidez y practicidad siguió empleándose como prueba de screening o selección.No obstante, existe cierto porcentaje de pacientes (aproximadamente el 10%) con mononucleosis infecciosa que poseen bajos títulos de anticuerpos heterófilos, razón por la cual los resultados de estas pruebas únicamente son considerados significativos, desde el punto de vista diagnóstico, cuando se relacionan con los datos hematológicos y las manifestaciones clínicas del paciente.
FUNDAMENTOS DEL METODOLos anticuerpos heterófilos asociados a la mononucleosis infecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eritrocitos de caballo, neutralizándose simultáneamente los anticuerpos no asociados a mononucleosis (anticuerpos Forssman) con extracto de riñón de cobayo. La aglutinación se visualiza macroscópicamente.
REACTIVOS PROVISTOSReactivo: suspensión de eritrocitos de caballo y extracto de riñón de cobayo.Control Positivo: dilución de suero positivo, inactivado. Equivalente a 2-3 (+).Control Negativo: dilución de suero negativo, inactivado.
REACTIVO NO PROVISTOSolución fisiológica.
INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo: vaciar la pipeta del gotero y agitar vigorosamente antes de usar, verificando que no queden eritrocitos adheridos al fondo del frasco.Control Positivo: listo para usar.Control Negativo: listo para usar.
PRECAUCIONESLos reactivos son para uso "in vitro".Los controles han sido examinados para HIV y HBV encontrándose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivo y Controles provistos: estables en refrigerador (2-10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
MUESTRASueroa) Recolección: obtener suero de la manera usual.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: se ha descripto un inhibidor termolábil de la reacción que produce resultados falsos negativos. Para eliminar esta interferencia es necesario inactivar el suero. Además, la hemólisis también interfiere. Inactivación: colocar el suero a 56°C durante 15 minutos, inmediatamente antes de usar.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarse en el momento puede conservarse en refrigerador (2-10°C) hasta 48 horas o en congelador durante 3 meses, a partir del momento de su recolección.
MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- Placa de vidrio2- No provisto
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- Palillo o varilla de vidrio- Cronómetro- Material volumétrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras- Lámpara o fuente de luz horizontal
PROCEDIMIENTOLlevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.I) PRUEBA CUALITATIVAColocar una gota (50 ul) de Muestra inactivada en uno de los círculos de la placa limpia y seca. Agregar una gota (50 ul) de reactivo homogeneizado. Mezclar con palillo de madera hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie del círculo. Inmediatamente, disparar un cronómetro y observar microscópicamente el resultado dentro de los dos minutos.Para una correcta visualización de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal (ej.: lámpara de microscopía).
II) PRUEBA CUANTITATIVALos sueros positivos, según la prueba anterior, pueden titularse efectuando diluciones seriadas:1) Colocar en una serie de tubos 200 ul de solución fisiológica.2) Agregar al primer tubo 200 ul de la Muestra inactivada y mezclar. Transferir 200 ul de esta dilución al segundo tubo y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc.3) Tomar una gota de cada dilución y ensayar según I).
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNegativo: suspensión homogénea.Positivo: aglutinación que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 (+).Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos heterófilos asociados a la mononucleosis infecciosa. Título: se expresa como la inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente.
METODO DE CONTROL DE CALIDADComo punto de referencia de las reacciones positivas y negativas de Monoslide, es conveniente procesar simultáneamente el Control Positivo y Control Negativo provistos, que se utilizan de la misma manera que la muestra.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
PERFORMANCESensibilidad: en la técnica original de Davidsohn se emplean eritrocitos frescos (nativos) que dan lugar a reacciones inespecíficas, por lo que la hemaglutinación sólo se considera como reacción positiva para mononucleosis infecciosa en diluciones mayores de 1/14. La sensibilidad de los eritrocitos estabilizados que provee Monoslide ha sido regulada para proporcionar igual reactividad con suero inactivado sin diluir.
PRESENTACIONEquipo para 100 determinaciones (Cód. 1593151).
BIBLIOGRAFIA- Wintrobe, M. M. - "Hematología Clínica" - Pág. 924 (Ed. 1969) - Intermédica.- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Slaby, R. - Am. J. Clin. Path. 49/1:3 (1968).- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Panczyszyn, O. - Am. J. Clin. Path. 49/1:12 (1968).- Sinay, H. S.; Schoen, I.; Miyahira, T. - Am. J. Clin. Path. 50/1:75 (1968).- Hoagland. R. J. - "Infectious mononucleosis" - Ed. 1967 - Grune-Stratton.- Marletta, J.; Cravero, J.; Fay, O.; Rey. J. - Paraná (1977).
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CÉLULAS LE Y AUTO-ANTICUERPOS
El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad de base autoinmune, en la que están afectados numerosos tejidos y órganos como articulaciones, piel, sistema nervioso, riñón, corazón, pulmón, sangre, hígado, bazo y ojos.
Fundamento
Las células LE son polimorfonucleares que han fagocitado material nuclear alterado proveniente de la destrucción del núcleo de otros leucocitos por el llamado factor LE (factor nuclear). Este factor (IgG anti-ADN) se fija a la superficie del núcleo y determina alteraciones de la cromatina. El material nuclear alterado recubierto de anticuerpos y complemento es fagocitado por los polimorfonucleares neutrófilos.
Técnica
1) Extraer 10 ml de sangre y dejarla coagular en un tubo de ensayo durante 2 horas a 37°C.
2) Centrifugar 10 minutos a 3500 rpm.
3) Eliminar el suero y depositar el coágulo sobre un tamiz de malla fina (gasa).
4) Aplastar el coágulo contra el tamiz, recogiendo el producto resultante en un tubo de ensayo.
5) Llenar mediante una pipeta de Pasteur un tubo de Wintrobe, con el material obtenido de la destrucción del coágulo.
6) Centrifugar durante 20 minutos a 5000 rpm.
7) Eliminar el sobrenadante y recoger con una pipeta Pasteur los leucocitos situados en la interfase suero/hematíes.
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8) Efectuar dos frotis con este material.
9) Teñir con el método de May Grunwald-Giemsa y observar mediante el objetivo de inmersión.
Interpretación de resultados
La prueba es positiva cuando se observan leucocitos en cuyo citoplasma se hallan núcleos fagocitados de otras células con aspecto desestructurado y parcial o totalmente hialinizados.
Esta prueba es específica, pero no tiene gran sensibilidad por cuanto es negativa en el 30% de los pacientes de lupus. La corticoterapia, que a menudo se aplica prontamente a estos enfermos, inhibe la formación de las células LE. Por lo tanto en la actualidad no tiene tanto valor diagnóstico y es necesario utilizar otras pruebas.
También se puede observar la formación de células LE en otras enfermedades autoinmunes y muchas veces difíciles de distinguir clínicamente del lupus, como en colagenopatías y artritis reumatoidea. Por ello en la actualidad la determinación clásica de las células LE ha sido desplazada por otras pruebas cada vez más sensibles y específicas, entre las que se destacan los anticuerpos antinucleares (AAN o factores antinucleares FAN). Estos autoanticuerpos tienen especificidad frente a los ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Pueden ser detectados por distintos métodos, como inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, inmunobloting., etc. El más usado es la IFI, que se basa en dos reacciones secuenciales. En el primer paso el suero del paciente se pone en contacto con el sustrato antigénico. Si los anticuerpos están presentes en el suero del paciente, se unen al antígeno formando un complejo Ag-Ac. Si el suero no contiene Acs dirigidos contra ese Ag en particular, no se formará el complejo Ag-Ac y todos los componentes del suero serán eliminados en la etapa de lavado. En el segundo paso se agrega una anti γ globulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína. Si el complejo Ag-Ac se formó en el primer paso la anti γ marcada se unirá al complejo dando una reacción positiva verde amarillenta que se observa al microscopio.
La IFI para ANA utiliza distintos sustratos pero el más específico son las improntas de la línea celular Hep-2. En ellas se estudia el título de positividad de la fluorescencia, como también el patrón microscópico de la misma. Los distintos patrones, homogéneo, moteado, nucleolar, citoplasmático, etc, se asocian a diferentes patologías autoinmunes.
Los anticuerpos anti ADN también se pueden detectar por IFI, usando improntas con el hemoflagelado Crithidia lucillae como fuente de ADN nativo. Este microorganismo contiene una mitocondria gigante modificada, el kinetoplasto, el cual contiene una red concentrada de ADN doble cadena, ubicado entre el núcleo y el cuerpo basal en la inserción del flagelo.
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ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS SERICAS EN ACETATO DE CELULOSA
El suero humano contiene numerosas proteínas que cumplen diferentes funciones. La electroforesis es una técnica simple para separarlas en fracciones (Fig. 1).
1Ac1Ag1AtLpAlbAT3LpC1q, C1r,C1s, C3, C4, C5C1Inh
Alfa1-antiquimotripsinaAlfa1-glicoproteína ácidaAlfa1-antitripsinaAlfalipoproteínaAlbúminaAntitrombina IIIBetalipoproteínaComponente del complemento C1q ... C5
Inhibidor de C1
CerCRPFBFibrHptHpxIgA, IgD,IgE, IgG,IgMPlPreA
CeruloplasminaProteína C reactivaFactor BFibrinógenoHaptoglobinaHemopexinaInmunoglobulinas A ... M
PlasminógenoPrealbúmina
Figura 1. Electroforesis de proteínas plasmáticas en acetato de celulosa: se observan cinco fracciones cada una compuesta por muchas proteínas individuales. Las más
importantes se muestran en la figura.
Se utiliza la electroforesis de zona en la cual se emplea un soporte inerte: acetato de celulosa o agarosa; las proteínas que son anfóteras adquieren una carga neta negativa en el buffer de pH 8,6 (barbital) que se usa en la corrida, por lo tanto migran hacia el ánodo. El buffer empleado no desnaturaliza ni precipita a las proteínas y su fuerza iónica está entre 0,05 y 1,5 mol/l. A medida que aumenta la fuerza iónica la migración se hace más lenta.
El soporte que utilizamos en el trabajo práctico separa las moléculas por su carga molecular neta y se obtiene un patrón de 5 bandas para un suero normal.
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La proporción de las distintas fracciones proteicas varía en algunas enfermedades y además se puede observar la aparición de bandas diferentes de las normales como en el mieloma.
Materiales y reactivos
Tiras de acetato de celulosa Conservación
Las tiras de acetato de celulosa se conservan en un recipiente tapado en metanol 40%. Es importante no permitir que las tiras se sequen porque pierden las dimensiones y características del gel
Reconocimiento de la superficie penetrable por las proteínasSólo una cara es penetrable por las proteínas y se reconoce fácilmente por que es más opaca, después de secarse entre dos hojas de papel de filtro. Las tiras tienen un ángulo achaflanado. La superficie penetrable puede reconocerse, por ejemplo, poniendo la tira con el ángulo achaflanado abajo y a la derecha.
Buffers N° 1 Veronal sódico 0,04M (dietilbarbiturato de sodio 8,24 g/litro)
pH=8,6. N° 2 Veronal sódico 5,15 g + EDTA sal tetrasódica 2,60 g/litro.
pH=8,6. Solución colorante: Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de ácido tricloroacético
5% (dosis para 20 tiras). Deshidratante: Metanol puro. Solución transparentizadora: 85 ml de metanol + 14 ml de ácido acético +
1 ml de glicerol Solución disolvente para cuantificar las fracciones proteicas: Ácido acético
80%.
Técnica
1) Sumergir las tiras en el tampón por lo menos 10 minutos (como máximo una noche).
2) Eliminar el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro.
3) Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La superficie penetrable tiene que estar dirigida hacia arriba; además las tiras deben quedar bien planas. Conviene hacerlo rápidamente para evitar la evaporación.
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4) Condiciones de siembre y migración: sobre puente de 8,5 cm para micro o semimicroelectoforesis. Voltaje fijo: 200 V en buffer n° 1 o n° 2.
Microelectroforesis Microaplicación de 0,5 l/5mm a 3 cm del borde catódico. Tiempo: 20 minutos (longitud de la migración 25 mm) (error admitido sobre
tiempo: -1+5 minutos)
Semimicroelectroforesis Semimicroaplicación de 1,5 l/9 mm a 2cm del borde catódico. Tiempo: 30 minutos (longitud de la migración 35 mm) error admitido sobre
tiempo: -1+8 min).
5) Coloración: 5 minutos.
6) Decoloración: con solución decolorante cambiar 3-4 veces hasta que el fondo de la tira esté blanco con agitación.
7) Determinación cuantitativa: Disolución.
Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo preparados en serie de 5. Agregar la solución disolvente y agitar (para las fracciones obtenidas de tiras 2,5 x 17 cm usar 3 ml de solución). Leer el colorímetro a 520 nm para el colorante Ponceau S.
Transparentización.Se sumergen las tiras decoloradas en metanol puro anhidro durante 30 segundos como mínimo, en cubeta seca, y a continuación en la solución transparentizadora durante 1 minuto como mínimo. Luego se colocan sobre una placa de vidrio, eliminando las burbujas de aire y se calienta preferentemente debajo de lámpara infrarroja o sobre un baño seco a 60°C durante unos minutos, a unos 5-10 cm de distancia, hasta transparencia completa. Conviene hacerlo rápidamente para evitar que las tiras transparentizadas se sequen al aire. Luego se invierte la placa de vidrio sobre papel de filtro, dejando enfriar durante 20 minutos como mínimo. Se puede separar la tira de acetato de celulosa de la placa de vidrio conservándola en sobre de plástico o entre papeles pudiéndose efectuar después la lectura en el densitómetro.
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Interpretación de resultados
Los perfiles que se obtienen en la densitometría son los siguientes:
Figura 2. Electroforesis de proteínas séricas: correlación clinicopatológica.
Valores de referencia
Proteínas Valores relativos (%)* Valores absolutos (g/dl)Albúmina12
52-652,5-5
7,0-13,08,0-14,012,0-22,0
3,2-5,60,1-0,40,4-1,20,5-1,10,5-1,6
* % del total de proteínas
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CITOQUÍMICA
Las técnicas citoquímicas tienen por objetivo detectar componentes celulares específicos (enzimas, lípidos, hidratos de carbono, depósitos de Fe, etc). En hematología, la citoquímica consituyó un complemento importante a la microscopía óptica convencional en el diagnóstico de neoplasias y otros desórdenes hematológicos. Sin embargo, hoy en día ha perdido relevancia por la difusión de la citometría de flujo.Las muestras utilizadas en hematología son extendidos de suspensiones celulares: sangre periférica, buffy coat (la banda rica en leucocitos provenientes de la centrifugación de sangre entera) y aspirados de médula ósea o ganglios linfáticos. En el TP se realizan dos tinciones que contribuyen en el diagnóstico de las leucemias agudas.
Consideraciones de bioseguridad
Metanol, formaldehído, ácido periódico y la solución de trabajo de Sudán Black son irritantes por inhalación o al contacto con piel, mucosas u ojos. La fucsina básica del Reactivo de Schiff es un carcinógeno reconocido.
A) REACCIÓN DE PAS (ácido periódico y Schiff)
Fundamento
El ácido peryódico oxida y rompe las uniones tipo glicol de la glucosa (o de sus derivados aminados). Esta oxidación genera funciones aldehído que quedan expuestas y pueden reaccionar con la base de Schiff, generando un compuesto coloreado.
Reactivos
Fijador: metanol Solución de ácido peryódico al 1%
Conservar a 4ºC hasta su uso. Reactivo de Schiff
Conservar a 4ºC y proteger de la luz hasta su uso.Es una solución de fucsina básica pretratada con Na2S2O5 (metabisulfito de sodio). Se incuba con carbón activado (para quitar el color) y se filtra antes de usar. Descartar si se torna rosa antes de usar.
Contracolorante: azul de metileno al 1%
Técnica
1) Fijar con metanol 10 min.
2) Lavar con H2O de la canilla.
3) Agregar ácido peryódico 30 min.
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4) Lavar con H2O de la canilla.
5) Cubrir toda la superficie con reactivo de Schiff 60 min.
6) Lavar bien con H2O de la canilla.
7) Cubrir con azul de metileno 5 min.
8) Lavar con H2O de la canilla y dejar secar.
Interpretación de resultados
Todas las células que contienen glúcidos insolubles (glucógeno, glicoproteínas, mucopolisacáridos, etc) son positivas. El patrón de positividad está diseminado en todo el citoplasma. Sin embargo, en los blastos linfoides la positividad se expresa en forma de gránulos gruesos perinucleares sobre un fondo negativo. Este patrón se observa también en una fracción de los eritroblastos presentes en la leucemia mieloide aguda tipo M6.
B) SUDAN BLACK B
Fundamento
El Sudán Black B es liposoluble y colorea intensamente fosfolípidos, lípidos neutros y esteroles.
Reactivos
Fijador: formol al 37 %. Solución de Sudan Black B al 0,3% en etanol. Buffer
Es una mezcla de fenol (16g en 30 ml de etanol) y Na2HPO4.12H2O (300mg en 100 ml de agua destilada).
Solución de trabajo: mezcla de buffer y solución de Sudán Black en proporción 2 : 3Conservar a 4ºC y proteger de la luz hasta su uso. Filtrar antes de usar.
Contracolorante: Giemsa 1:10.Preparar en el momento.
Técnica
1)Fijar los preparados con vapores de formol durante 10 min. (en ambiente cerrado, por ejemplo caja de Petri).
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2)Lavar bien con H2O de la canilla.
3)Cubrir con solución de trabajo 60 min.
4)Lavar con etanol 70% (2 lavados) durante 5 min.
5)Cubrir con Giemsa 1:10 10 min.
6)Lavar con H2O de la canilla y dejar secar.
Interpretación de resultados
En los blastos provenientes de leucemias mielocíticas y mielomonocíticas, el citoplasma aparece cubierto de gránulos color negro. Las células monocitoides se tiñen de forma menos intensa y las linfoides y eritorides son negativas. El patrón de positividad es idéntico al obtenido con la tinción de la mieloperoxidasa. Por lo tanto, permite diferenciar leucemias mieloides (positivas) de la
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DETERMINACIÓN DE FIBRINÓGENO
FibrinógenoReactivo para la determinación de fibrinógeno plasmático
SIGNIFICACION CLINICAEl fibrinógeno es una glicoproteína que se halla presente en el plasma y en los gránulos plaquetarios . Es el factor de la coagulación que se encuentra en mayor concentración plasmática (200-500 mg/dl).Cuando se produce un trauma o injuria vascular, la trombita formada escinde al fibrinógeno convirtiéndolo en monómeros de fibrina que polimerizan espontáneamente y luego son estabilizados dando lugar a la malla insoluble de fibrina. Niveles bajos de fibrinógeno pueden encontrarse en desórdenes hereditarios tales como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia, y también en otras circunstancias como enfermedad hepática, coagulación intravascular diseminada, síndromes fibrinolíticos, etc.Niveles elevados pueden encontrarse en diabetes, enfermedad inflamatoria, etc.Actualmente se ha reconocido que niveles altos de fibrinógeno aumentan el riesgo a padecer enfermedad cardiovascular.
FUNDAMENTOS DEL METODOEl ensayo se basa en el método de Clauss, designado como procedimiento de referencia por el NCCLS (Nacional Committee for Clinical Laboratory Standards). Cuando un exceso de trombina se adiciona a un plasma diluido, el tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno plasmático. El tiempo de coagulación obtenido se compara posteriormente con una preparación de fibrinógeno estandarizada.
REACTIVOS PROVISTOSTrombina: viales conteniendo trombina liofilizada. Una vez reconstituida equivale aproximadamente a 100 Unidades NIH de trombina/ml.Buffer Imidazol: solución de imidazol 0,05 M, pH 7,3.Plasma Referencia: vial conteniendo plasma liofilizado. Ver el valor de fibrinógeno asignado en el rótulo.
REACTIVO NO PROVISTOAgua bidestilada o desionizada.
INSTRUCCIONES PARA SU USOTrombina y Plasma Referencia: quitar el precinto metálico y abrir el vial retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material. Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el rótulo. Tapar, dejar reposar 30 minutos y luego mezclar suavemente (sin agitar) hasta obtener disolución completa antes de su uso. Fechar. Se recomienda mantener el reactivo Trombina en el frasco original luego de su reconstitución y durante su uso. Buffer Imidazol: listo para usar. Evitar su contaminación. Mantener en su frasco original bien cerrado.
PRECAUCIONESLos Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Este producto ha sido preparado a partir de plasmas humanos, los cuales han sido ensayados utilizando los métodos bajo licencia de la FDA. No se ha encontrado reactividad para HBsAg, HCV y HIV. Pero dado que ningún método de ensayo puede asegurar la ausencia absoluta de agentes infecciosos, los plasmas referencia, controles y muestras de pacientes deben manejarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Trombina reconstituida: estable 5 días refrigerada (2-10oC) o 30 días congelada (-20oC). Para descongelarla, hacerlo rápidamente a 37oC. No volver a congelar. Llevar a temperatura ambiente el reactivo antes de volver a usarlo. Evitar calentamientos prolongados.Plasma Referencia reconstituido: estable durante 8 horas refrigerado (2-10oC).
MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente, evitando estasis o espuma, y colocarla en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. La extracción se debe efectuar con jeringas plásticas.b) Aditivos: para obtener el plasma puede emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 3,8% o 3,2%. No debe emplearse EDTA o heparina.c) Sustancias interferentes conocidas:- Las muestras ictéricas, lipémicas o hemolizadas pueden dar resultados erróneos.- Niveles elevados de productos de degradación de fibrinógeno o fibrina pueden alargar los tiempos de coagulación especialmente cuando los niveles de fibrinógeno son menores a 150 mg/dl.- Niveles terapéuticos de heparina no interfieren con el ensayo, pero niveles elevados pueden conducir a resultados falsamente disminuidos.Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis en tubos plásticos para minimizar el efecto de activación por contacto que puede ocurrir con los tubos de vidrio.
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El plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuarse la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este último proceso debe realizarse con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37 oC) previo a la determinación.
MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- Hoja de papel doble logarítmico.2- No provisto- Tubos de hemólisis.- Tubos plásticos para preparar las soluciones.- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa para la observación del coágulo.PROCEDIMIENTOI- CURVA DE CALIBRACION1- Preparar diluciones del Plasma Referencia fibrinógeno 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, empleando 0,1 ml del Plasma Referencia reconstituido y 0,4; 0,9; 1,4; 1,9 y 2,9 ml de Buffer Imidazol respectivamente. El plasma diluido 1:10 representa el 100% del valor asignado en el envase.2- Precalentar 0,2 ml de cada dilución a 37oC durante 2 minutos.3- Disparar el cronómetro con el agregado de 0,1 ml de Trombina reconstituida (no precalentar el reactivo de Trombina) a las diluciones preincubadas y registrar el tiempo de formación del coágulo.4- Calcular el tiempo promedio de coagulación para cada dilución, por duplicado.5- Construir la curva de calibración de fibrinógeno representando los tiempos de coagulación en función de la concentración de fibrinógeno, sobre el papel log-log. Unir a través de una recta la mayoría de los puntos representados. La recta final debe contener por lo menos 3 puntos consecutivos.
Dilución Búfer Plasma Ref.Concentración
fibrinógeno*Factor dilución
1:51:101:151:201:30
0,80,91,41,92,9
0,20,10,10,10,1
----mg/dl----mg/dl----mg/dl----mg/dl----mg/dl
x 2 =x 1 =
x 0,67 =x 0,5 =
x 0,33 =* concentración de fibrinógeno indicada en el rótulo del Plasma Referencia
El valor de fibrinógeno de cada dilución de la curva se determina multiplicando la concentración de fibrinógeno en el Plasma Referencia por el factor de dilución. Por ejemplo, si en el Plasma Referencia se indica un nivel de fibrinógeno de 260 mg/dl, entonces las diluciones 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 y 1:30 tienen 520, 260, 173, 130 y 87 mg/dl respectivamente.
II- MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES1- Preparar diluciones 1:10 de los plasmas de pacientes o plasmas controles en Buffer Imidazol. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilución a 37oC durante 2 minutos.3- Rápidamente adicionar 0,1 ml de Trombina y registrar el tiempo de formación del coágulo.4- Repetir la determinación y promediar el resultado para cada muestra.
CALCULO DE LOS RESULTADOSConocido el tiempo de coagulación del paciente o del control, ingresar este valor a la curva standard e interpolar el valor de fibrinógeno en cada caso.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSSi el tiempo de coagulación para la muestra es demasiado corto (por ejemplo, menor a 7 segundos) diluir el plasma 1:20 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 2.Si el tiempo de coagulación para la muestra es demasiado largo (por ejemplo, mayor a 35 segundos) diluir el plasma 1:5 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 0,5.
METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal/patológico.
VALORES DE REFERENCIAEl intervalo de valores observados en pacientes normales oscila entre 200 - 400 mg/dl.En general se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia, dentro de su población de pacientes.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- Se deberá realizar una curva de calibración nueva con cada cambio de lote de reactivo o cualquier cambio de instrumento.- Fallas en la reconstitución de los reactivos pueden ser causa de resultados erróneos.- Recolección de muestra: las muestras y sus diluciones deberán colocarse en tubos de plástico o de vidrio siliconado. Es importante respetar la relación de anticoagulante y sangre como también la concentración de citrato utilizada.- Debe controlarse que el ensayo se realice a 37oC y que los tubos de trabajo estén absolutamente limpios.
PERFORMANCE
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Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes resultados:
Nivel D.S. C.V.
12,1 seg20,4 seg
+0,3 seg+0,6 seg
2,7%3,2%
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOSEl reactivo Fibrinógeno se puede usar en forma manual y con métodos de detección mecánicos y foto-ópticos. Para instrumentos semiautomáticos y automáticos se recomienda seguir las instrucciones del aparato.
PRESENTACIONEquipo para 100 determinaciones (Cód. 1705006) conteniendo:- Trombina: 10 x 1 ml- Plasma Referencia: 1 x 1 ml- Buffer Imidazol: 2 x 60 ml
BIBLIOGRAFIA- Clauss, A. - Acta Haematol. 17:237, 1957.- Koepke, J.A. - Am. J. Clin. Pathol. 63:984, 1975.- Collet, J.P. - Blood 82/8:2462, 1993.- Ernest, E. - Ann. Intern. Med. 118/12:956, 1993.- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
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