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IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR DEL ACIDO
LISOFOSFATÍDICO EN POBLACIONES MONONUCLEARES
AISLADAS DE SANGRE PERIFERICA Y SU PAPEL EN LA
ESCLEROSIS MÚLTIPLE
Memoria de Tesis presentada por D. Jesús Manuel Romero Imbroda para optar al
grado de Doctor por la Universidad de Granada
Granada 2010
INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS CLÍNICAS
HOSPITAL REGIONAL UNIVERSITARIO CARLOS HAYA DE MÁLAGA
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE GRANADA
FUNDACIÓN IMABIS HOSPITAL REGIONAL UNIVERSITARIO
CARLOS HAYA DE MÁLAGA
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Jesús Manuel Romero Imbroda D.L.: GR 3475-2010ISBN: 978-84-693-5212-0
D. GUILLERMO ESTIVILL TORRÚS, Doctor en Biología, Investigador de la Fundación
IMABIS en el Hospital Carlos Haya y director del Grupo de Investigación en
Neuropsicofarmacología de Transmisores Lipídicos, de Málaga, como director,
CERTIFICA:
Que, D. JESÚS MANUEL ROMERO IMBRODA ha realizado bajo mi dirección
en la Fundación IMABIS de Málaga el presente trabajo de investigación titulado:
“Identificación del receptor del ácido lisofosfatídico en poblaciones mononucleares
aisladas de sangre periférica y su papel en la Esclerosis Múltiple”, y que ha sido objeto
de su Tesis Doctoral, considerando que reúne el rigor científico y las condiciones
necesarias para optar al grado de Doctor.
Y para que así conste, firmo el presente certificado en Málaga a 9 de junio de
2010.
Fdo. Guillermo Estivill Torrús
D. OSCAR FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ, Doctor en Medicina y Cirugía, Director del
Instituto de Neurociencias Clínicas y Jefe del Servicio de Neurología del Hospital
Carlos Haya, de Málaga, como director,
CERTIFICA:
Que, D. JESÚS MANUEL ROMERO IMBRODA ha realizado en el Instituto de
Neurociencias Clínicas del Hospital Carlos Haya de Málaga y bajo mi dirección el
presente trabajo de investigación titulado: “Identificación del receptor del ácido
lisofosfatídico en poblaciones mononucleares aisladas de sangre periférica y su papel
en la Esclerosis Múltiple”, y que ha sido objeto de su Tesis Doctoral, considerando que
reúne el rigor científico y las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor.
Y para que así conste, firmo el presente certificado en Málaga a 9 de junio de
2010.
Fdo. Óscar Fernández Fernández
D. ANTONIO CAMPOS MUÑOZ, Doctor en Medicina y Cirugía, Catedrático de
Histología de la Universidad de Granada, como director,
CERTIFICA:
Que, D. JESÚS MANUEL ROMERO IMBRODA ha realizado bajo mi dirección
el presente trabajo de investigación titulado: “Identificación del receptor del ácido
lisofosfatídico en poblaciones mononucleares aisladas de sangre periférica y su papel
en la Esclerosis Múltiple”, y que ha sido objeto de su Tesis Doctoral, considerando que
reúne el rigor científico y las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor.
Y para que así conste, firmo el presente certificado en Málaga a 9 de junio de
2010.
Fdo. Antonio Campos Muñoz.
Yo, JESÚS MANUEL ROMERO IMBRODA, declaro que soy autor del presente
trabajo de investigación original, a objeto de la realización de tesis doctoral,
titulado “Identificación del receptor del ácido lisofosfatídico en poblaciones
mononucleares aisladas de sangre periférica y su papel en la Esclerosis
Múltiple”, y que lo he realizado en la Fundación IMABIS y en el Instituto de
Neurociencias Clínicas del Hospital Carlos Haya de Málaga, bajo la dirección
del Dr. Guillermo Estivill Torrús, del Dr. Óscar Fernández Fernández y del Dr.
Antonio Campos Muñoz.
Y para que así conste, firmo el presente certificado en Málaga a 9 de junio de
2010.
Fdo. Jesús Manuel Romero Imbroda
Dedicada a mi abuela Inma: cuna de valores,
ejemplo de fortaleza, amor, humildad,
bondad y generosidad.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no existiría sin la motivación encontrada en cada uno de los
directores de la tesis: en el Dr. Antonio Campos que me cautivó con sus
lecciones magistrales y me ha acompañado desde los 18 años en la pasión por
el estudio de la Medicina y a aproximarme a los aspectos más humanos de
nuestro oficio y del arte; al Dr. Óscar Fernández, mi maestro, por encarnar la
unión entre la clínica y la investigación, por situar a la neurología española
como referente mundial y por arrojar luz y esperanza a miles de pacientes; y al
Dr. Guillermo Estivill, ejemplo de juventud y talento, que me enseñó los
aspectos de investigación del laboratorio y cómo podrían ser aplicados en la
clínica.
Este trabajo no existiría sin mis padres que además de darme la vida me han
apoyado con el amor más grande y profundo estando a mi lado siempre.
Este trabajo no existiría sin el esfuerzo de Beatriz García Díaz, dulce
compañera, la persona con mayor talento y capacidad de trabajo que he
conocido, cualidades solo superadas por su cariño infinito y su dulce sonrisa.
Quiero agradecer a Olga Pérez de la Fundación Imabis el asesoramiento y
análisis estadístico del trabajo.
Quiero dar gracias a Dios por mi familia, pilar fundamental de mi vida.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ______________________________________1
1.1 Epidemiología _______________________________________ 2
1.2 Clínica _____________________________________________ 7
1.3 Investigaciones paraclínicas __________________________ 13
1.3.1 Líquido Cefalorraquídeo _________________________ 13
1.3.2 Potenciales Evocados ___________________________14
1.3.3 Resonancia Magnética __________________________ 15
1.4 Diagnóstico ________________________________________ 18
1.5 Pronóstico _________________________________________ 24
1.6 Histopatología ______________________________________ 25
1.7 Patogenia __________________________________________ 30
1.7.1 La Esclerosis Múltiple como reacción inflamatoria
inmunomediada ____________________________________ 31
1.7.2 Sistema inmune adaptativo ______________________ 32
- La inmunidad celular
- La inmunidad humoral
1.7.3 Sistema inmune innato ___________________________ 40
- Mediadores moleculares del daño a los oligodendrocitos
- Mecanismos moleculares independientes de receptor: el
estrés oxidativo y excitotoxicidad
- Mecanismos moleculares independientes del receptor: las
proteasas y el sistema perforina/ granzima
- Mecanismos moleculares dependientes del receptor
1.7.4 Defectos primarios de los oligodendrocitos o de la
oligodendrogénesis ___________________________ 44
1.8 Ácido lisofosfatídico (LPA) __________________________ 49
1.8.1. Distribución y producción de LPA ________________ 51
1.8.2. Especies de LPA ______________________________ 55
1.8.3 Receptores de LPA ____________________________ 57
- Receptor LPA 1; gen Lpar1
- Receptor LPA 2; gen Lpar2
1.8.4 Ácido lisofosfatídico y mielinización ______________ 66
1.8.5 Ácido lisofosfatídico e inflamación _______________ 67
2. HIPÓTESIS DE TRABAJO ____________________________ 75
3. OBJETIVOS _______________________________________ 75
4. PACIENTES Y MÉTODOS ____________________________ 76
4.1 Pacientes ______________________________________ 76
4.2 Cuantificación de los receptores LPA 1 Y LPA2 _______ 76
- Obtención de muestras y criopreservación
- Extracción de ARN total
- Cuantificación
- Síntesis de ARN complementario: transcripción inversa
- Diseño de cebadores
- PCR a tiempo real
4.3 Análisis estadístico _____________________________ 82
5. RESULTADOS ____________________________________ 83
5.1 Características de los sujetos con EM _____________ 83
- Sexo
- Edad en el momento del estudio
- Edad al comienzo de la enfermedad
- EDSS al comienzo del estudio.
- EDSS en el momento de la finalización del estudio
- Número de brotes en el año previo al inicio del estudio
- Número de brotes en el último año previo a la finalización
del estudio
- Tratamiento inmunomodulador recibido
- Pérdida de sujetos
- Pacientes que precisaron cambio de tratamiento
5.2 Características de los controles ___________________ 86
5.3 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en
los sujetos con EM RR basal y en controles sanos ______ 87
5.4 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en
sujetos con EM, tras el tratamiento / seguimiento y en controles
sanos ____________________________________________ 89
5.5 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en
sujetos con EM previo al tratamiento y tras el tratamiento /
seguimiento ______________________________________ 91
5.6 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en
los sujetos con EM PS frente a controles sanos ________ 92
5.7 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en
los sujetos con EM PP frente a controles sanos ________ 94
6. DISCUSIÓN _______________________________________96
7. CONCLUSIONES _________________________________ 103
8. BIBLIOGRAFÍA __________________________________ 104
9. ABREVIATURAS _________________________________ 142
1
1. INTRODUCCIÓN
La esclerosis múltiple (EM) se describió, como enfermedad, con el nombre de
esclerosis en placas ya hace más de 130 años, habiendo tenido lugar desde
entonces avances formidables, en cuanto a prácticamente todos los aspectos
relacionados con la misma.
Aunque la definición de la esclerosis múltiple es clinicopatológica, llama
poderosamente la atención, el hecho de que la neuropatología siga siendo, la
ciencia que más contribuye a su conocimiento, incluso en la actualidad. Se han
descrito cuatro patrones neuropatológicos, cada uno de ellos correspondiente a
procesos patogénicos probablemente distintos, de forma que se están desgajando
de la enfermedad algunos subgrupos de pacientes, que seguramente padecen de
procesos nosológicos propiamente tales, como la neuromielitis óptica de Dévic, que
en su forma pura parece tratarse de una enfermedad, más que de un síndrome.
En la actualidad no se dispone de ningún marcador biológico de la enfermedad, ni
de la progresión de la misma, ni de la respuesta al tratamiento y aún hay algunos
aspectos de la patogenia que quedan por elucidar.
Aparte de esto, se está avanzando de forma notabilísima en el conocimiento de los
aspectos genéticos de la enfermedad y de la respuesta al tratamiento. Estos
conocimientos permitirán también subclasificar mejor a los pacientes de esclerosis
múltiple, con respecto al grupo patogénico al que pertenecen y definir que
tratamiento será más adecuado para cada paciente de forma individualizada.
Todo ello, permite mantener unas expectativas optimistas con respecto a la
esclerosis múltiple para los próximos años, en los que sin duda alguna, asistiremos a
avances hasta ahora impensables en el conocimiento y tratamiento de esta
enfermedad.
2
1.1 EPIDEMIOLOGÍA
Los estudios epidemiológicos han permitido saber: 1) que la EM es la enfermedad
neurológica crónica más frecuente en adultos jóvenes en Europa y Norteamérica;
2) que la existencia de un factor ambiental sería imprescindible para que aparezca
la enfermedad; este factor intervendría en la infancia, antes de los 15 años,
probablemente en forma de una infección inaparente o de carácter banal; y
finalmente, 3) que existe un factor genético de susceptibilidad a la enfermedad.
A partir de los conocimientos adquiridos mediante los estudios epidemiológicos, se
han generado dos hipótesis referentes a la, o las, causas de la EM, que no se
excluyen mutuamente, sino que se complementan (Hogancamp et al, 1997 y
Kahana 2000) de las que se enumeran las principales circunstancias que las
apoyan:
a) Hipótesis ambiental.
- La prevalencia varía alrededor del mundo.
- La incidencia ha cambiado en periodos cortos de tiempo, lo que se explicaría
mejor por una alteración ambiental que genética.
- Se han descrito focos y epidemias.
- La susceptibilidad a la EM puede modificarse por la emigración en edades
críticas, en particular en torno a la pubertad.
- La susceptibilidad en la descendencia de los emigrantes difiere de la de sus
progenitores.
b) Hipótesis genética.
- Ciertos grupos étnicos son resistentes.
- Existe una asociación con los antecedentes escandinavos.
- La recurrencia empírica entre hermanos aumenta por un factor de 10-50.
- La concordancia entre gemelos monocigotos es del 40 % frente al 4 % en
gemelos dicigotos.
- Existe asociación con ciertos genotipos HLA (genes de la región del antígeno de
3
leucocitario humano; HLA, de su denominación en inglés, human leukocyte
antigen), fundamentalmente DR15, en población de origen caucásico.
Los resultados de los estudios epidemiológicos, han permitido concluir que la EM
se manifestaría en sujetos genéticamente predispuestos sobre los que, por azar,
incidiría un factor ambiental desconocido, que pondría en marcha un proceso
inmunitario anormal. La raza es un importante factor predictivo de riesgo en la EM,
pero la genética por sí sola no explica la aparición de la EM. Además, la
predisposición genética es compleja, pues en ella están involucrados varios loci. No
obstante se han hallado recientemente formás génicas, mutaciones de la región
HLA, que confieren susceptibilidad, como los alelos HLA DR2, DRB1, DQA1 and
DQB1 (Fernández et al, 2004; Fernández et al, 2009; Vasconcelos et al, 2009).
Probablemente, el proceso inmune presente en la EM sea una consecuencia y no
la causa; ésta sería posiblemente única y de naturaleza infecciosa; el agente
causal puede ser raro o por el contrario, muy frecuente, pero ejercería diferentes
efectos biológicos en los individuos predispuestos.
La epidemiología por sí sola no es capaz de encontrar la causa de la EM,
precisando del concurso de las ciencias básicas (genética, microbiología, etc.) y
con el valor añadido de que, si nos permitieran encontrar y disponer de un
marcador biológico de la enfermedad, los resultados de los métodos
epidemiológicos mejorarían notablemente.
Epidemiología descriptiva
Los estudios de prevalencia han permitido apreciar una distribución irregular de la
EM en el mundo, al observarse la mayor frecuencia se da entre los 40 y 60 grados
de latitud norte, y apreciándose un fenómeno muy similar en el hemisferio sur.
Kurtzke definió, en los años 1970-80, zonas de riesgo alto (> 30 casos/100.000
habitantes), de riesgo medio (5-25 casos/100.000 habitantes) y de riesgo bajo (< 5
casos/100.000 habitantes). Posteriormente, al repetirse los estudios y realizarse
otros más detallados, se han podido apreciar aumentos muy llamativos de las tasas
4
de prevalencia, que han permitido clasificar estas zonas de riesgo en > 100, 50-100
y < 50 casos/100.000 habitantes.
En la España peninsular, se han completado al menos 23 estudios (Cataluña,
Cantabria, Vélez-Málaga, Aragón, Alicante, Salamanca, Zamora, Gijón, Navarra,
Vic, Segovia, Teruel, Calatayud, Móstoles, Valladolid, Alcoi, Vizcaya, Barcelona (C.
Ponent), Vigo y Santiago de Compostela), algunos de ellos en más de una ocasión
en el mismo lugar, que demuestran que estamos en una zona de riesgo medio-alto
(prevalencias de 42 a 79 casos/100.000 habitantes)(Matias-Guiu y Fernández,
2001; Fernández et al, 1994; Bufill et al, 1995; Sempere et al, 1995; Uria et al,
1997; Modrego et al, 1997; Benito-Leon et al, 1998; Pina et al, 1998; Tola et al,
1999; Mallada-Frechin et al, 2000; Areas, 2004). En la España insular se han
completado 5 estudios, dos de ellos ya antiguos en Las Palmas de Gran Canaria y
Lanzarote, con cifras bajas de prevalencia, similares a las de España continental
para su época y tres más recientes, que han encontrado también prevalencias
similares a las del continente en los estudios últimos, siendo estos, en las islas
Baleares, en Menorca, con 69 casos/100.000 habitantes (Casquero et al, 2001) y
en las Canarias, en La Palma y Las Palmas de Gran Canaria, con 42 y 78
casos/100.000 habitantes, respectivamente (Hernandez 2002; Aladro et al, 2005)
Epidemiología analítica (Weinshenker, 1995; Riise y Wolfson, 1997).
a) Estudios ecológicos. En la epidemiología analítica hay que tomar en
consideración la existencia de numerosos factores de confusión que pueden sesgar
los resultados. De entre los factores geoclimáticos, destaca la asociación entre la
EM y los climas fríos y, en probable relación con estos, la humedad y lluvia, así
como con las infecciones respiratorias. La asociación con el suelo de turba y las
coníferas probablemente se enmarca en el mismo tipo de relación.
En cuanto a los aspectos socioculturales, se ha hallado asociación con la ingestión
de grasa de origen animal, carne y productos de la granja. La asociación con la
industrialización es algo más débil; en particular se asociaría con zonas en las que
hubiera fábricas de papel y con disolventes orgánicos (Granieri, 2000).
5
b) Estudios de casos y controles. Este tipo de estudios investiga los factores de
riesgo comparados entre dos poblaciones, afectada y sana. Presenta numerosos
factores de sesgo que deben ser controlados. Se han hallado relaciones con el
antecedente escandinavo, la historia familiar positiva, el género femenino, los
genes clase II del complejo mayor de histocompatibilidad o CMH, la latitud norte, la
posesión de perros, vacunas, otros agentes ambientales como el tabaco y diversos
virus (Marrie, 2004).
Los datos de una causa viral de la EM son indirectos, pues no se ha logrado aislar
de forma reproducible ningún virus ni partícula viral en tejidos de enfermos de EM,
y se basan en datos epidemiológicos de estudios de casos y controles y datos
serológicos. Los virus que se han relacionado con la etiología de la EM son el virus
del moquillo canino, el del sarampión, el de la varicela zoster, el de la encefalitis por
garrapatas, el HTLV-I y el LM 7 (retrovirus) (Cook et al, 1995; Johnson, 1994;
Simon y Neubert 1996), entre otros. Los virus más recientemente involucrados en
la patogenia de la EM son el virus del Herpes 6 (VHH 6) (Gutierrez et al, 2004;
Clark, 2000; Rotola et al, 1999, 2000; Taus et al, 2000; Alvarez-Lafuente et al, 2002
y 2004) y el virus de Epstein –Barr (Marrie et al, 2000; Ascheiro et al, 2001; Haahr
et al, 2005; Levin et al, 2005) , aunque la participación de este último es
controvertida. Un nuevo retrovirus, el retrovirus asociado con la esclerosis múltiple
(MSRV),(Perron et al, 1997; Dolei et al, 2002; Sotgiu et al 2002) y diversas
partículas retrovirales (MSRV/HERV-W, RGH/HERV-H, HERV-W) han sido
identificadas por diferentes grupos de investigadores que proponen una interesante
hipótesis de reacción en cadena, donde la expresión retroviral, que al interactuar
con el material genético, tendría un papel de coactivador o de producción de
moléculas patogénicas (Perron et al, 1997 y 2000; Christensen et al, 2000).
Clamydophila pneumonie es un agente etiológico que está siendo muy estudiado
en la actualidad, al haber sido identificado en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de
un elevado porcentaje de pacientes con EM (64%) en comparación con los
controles (11 %); sin embargo, los resultados comunicados no han sido
confirmados por otros grupos de investigadores, probablemente por la falta de
estandarización de las técnicas microbiológicas, y deben ser tomados con
6
precaución por el momento (Sriram et al, 1999 y 2002; Derfuss et al, 2001; Hao et
al, 2002; Saiz et al, 2001; Munger et al, 2003 y 2004; Yucesam et al, 2001;
Kaufman et al, 2002).
c) Estudios de cohortes. Dada la relativa baja frecuencia de la EM, estos estudios
suelen ser retrospectivos, y se ciñen a una cohorte diagnosticada en una
comunidad y seguida a lo largo del tiempo. Así se ha podido comprobar que las
infecciones respiratorias preceden el 27 % de los brotes (Kriesel et al, 2004), que la
frecuencia de los brotes aumenta en el puerperio, que existe un descenso
marcado del número de lesiones nuevas medidas por la resonancia magnética
durante el embarazo (Confavreux et al, 1998) y que los traumatismos
craneoencefálicos no son un factor causal de la EM (Zorzon et al, 2003; Silva et al,
1993).
Resumiendo, cada vez parece más probada la existencia de un factor genético de
susceptibilidad, pero por otra parte, determinados factores ambientales
desconocidos explicarían mejor los cambios en la frecuencia de la enfermedad que
se han descrito en varios países, entre ellos en el nuestro, donde podemos decir
que estamos asistiendo no sólo a un aumento de la prevalencia, por la existencia
de un alto grado de sospecha de la enfermedad, mejores métodos diagnósticos y
mayor supervivencia de los pacientes gracias a mejor asistencia médica, sino que
parece existir una aumento de la frecuencia de la enfermedad, medida como
incidencia, en los países del entorno del sur de Europa.
La explicación del aumento de la incidencia de la EM podría estar relación con el
aumento del resto de enfermedades autoinmunes, según la “hipótesis de la
higiene”, según la cual, en los países desarrollados, las enfermedades
autoinmunes, y entre ellas la esclerosis múltiple, están aumentado de prevalencia
en sentido inverso al descenso de las infecciones durante la infancia. Durante las
tres últimas décadas, gracias a los antibióticos, vacunas, y a la mejora de la higiene
y de las condiciones socioeconómicas, se ha experimentado un descenso de las
infecciones infantiles que condicionaría las condiciones patogénicas necesarias
para el desarrollo de enfermedades autoimnunes (Bach, 2002; Sotgiu et al, 2003;
Ponsonby et al, 2005).
7
1.2 CLÍNICA
La característica clínica más llamativa de la EM es su gran variabilidad; los
síntomas y signos están determinados por la localización de las lesiones
desmielinizantes, que pueden ocurrir a todo lo largo del neuroeje.
Sin embargo, las lesiones muestran predilección por ciertas partes del sistema
nervioso central (SNC) (zonas periventriculares, nervio y quiasma óptico, tronco
encefálico, pedúnculos cerebelosos, médula), dando lugar a debilidad, parestesias,
alteración de la visión, diplopía, nistagmo, disartria, temblor intencional, ataxia,
alteración de la sensibilidad profunda, disfunción vesical, paraparesia, alteraciones
emocionales y deterioro cognitivo. Se configuran así complejos de síntomas y
signos más o menos característicos, que permiten su fácil reconocimiento y hacen
posible establecer el diagnóstico, que no debe considerarse como seguro hasta
que no se hayan descartado otras enfermedades y existan pruebas clínicas o
paraclínicas de diseminación en el espacio (más de una lesión en el neuroeje) y en
el tiempo (más de un episodio de disfunción neurológica)(Matthew, 1998).
Formas evolutivas .
El 90 % de los pacientes presenta un curso clínico caracterizado por la aparición de
episodios o brotes de disfunción neurológica más o menos reversibles, que se
repiten cada cierto tiempo y que, a medida que se repiten, van dejando secuelas
funcionales neurológicas (forma en brotes o recurrente-remitente, EM RR). Tras 10
años, un 50 % de los pacientes pasan del curso en brotes a un curso progresivo
(forma progresiva secundaria, EM PS). Un 10 % de los pacientes muestran un
curso progresivo desde el comienzo (forma progresiva primaria, EM PP) (Lublin y
Reingold, 1996). La edad de comienzo es la misma en las formas en brotes y las
formas progresivas secundarias, pero es significativamente mayor para las formas
progresivas primarias (45 años). La manifestación inicial más frecuente en la forma
progresiva primaria es una paraparesia espástica progresiva (80 %).
Un número reducido de pacientes puede presentar, tras un curso progresivo,
8
exacerbaciones ocasionales (forma progresiva-recurrente, EM PR) (Tullman et al,
2005).
Los síndromes clínicos desmielinizantes aislados (SCA o CIS, acrónimo inglés de
clinically isolated syndrome) del nervio óptico (neuritis óptica desmielinizante),
médula espinal (mielitis transversa) o del tronco del encéfalo, se incluyen
actualmente como parte del espectro clínico de la EM debido al elevado porcentaje
de pacientes con síndromes que desarrollarán una EM clínicamente definida (40-70
% para el caso de neuritis óptica). Las pruebas paraclínicas (resonancia magnética,
análisis del LCR) ayudan a determinar los riesgos de evolución a EM de estos
síndromes (O'Riordan et al, 1998; TIntore et al, 2000; Sailer et al, 1999).
Figura 1. Formas evolutivas de la esclerosis múltiple (Modificado de Lublin FD, Reingold SC. Defining
the clinical course of multiple sclerosis: results of an international survey. Neurology 1996; 46:906-
911.)
Edad de comienzo y sexo.
La enfermedad puede comenzar a cualquier edad, pero es rara antes de los 10
años y después de los 60 años. Suele presentarse entre los 25-30 años, y afecta
9
con mayor frecuencia a las mujeres (60 %) que a los varones (40 %), en una
proporción de 1,5 a 1.
Síntomas-signos de comienzo.
El síntoma de comienzo más frecuente, es la alteración de la sensibilidad (45 %),
consistente en la aparición de sensaciones de pinchazos u hormigueo (parestesias)
o acorchamiento de uno o más miembros, o del tronco, sugestivo de afectación del
haz espinotalámico, y sensación de banda constrictiva en el tronco o los miembros,
que indica afectación de los cordones posteriores. En la exploración se aprecian
diversas combinaciones de hipoestesia táctil, térmica y dolorosa, o disminución de
la sensibilidad profunda, posicional y vibratoria, así como signo de Romberg
frecuentemente positivo.
La alteración motora es también muy frecuente (40 %), y se caracteriza por la
pérdida de fuerza en uno o más miembros; el paciente arrastra uno o los dos pies
al caminar y presenta torpeza y debilidad en una o las dos manos, o bien fatiga
acusada tras pequeños esfuerzos. En la exploración se aprecian paresias o
parálisis francas (paraplejia, hemiplejia), hiperreflexia osteotendinosa, ausencia de
reflejos cutáneos abdominales y signo de Babinski, con frecuencia bilateral.
Los síntomas producidos por la disfunción del tronco encefálico, tales como
disartria, diplopía, disfagia o vértigo, son algo menos frecuentes (25 %). En la
exploración, es característica de la EM la presencia de nistagmo horizontal, vertical,
rotatorio o retráctil y de oftalmoplejia internuclear (al mirar a un lado el ojo que
aduce no pasa de la línea media y el ojo que abduce muestra sacudidas
nistagmoides) que, si se presenta en una persona joven y es bilateral, es un
hallazgo casi patognomónico de EM. Otras alteraciones menos frecuentes son la
oscilopsia (sensación de oscilación del entorno secundaria al nistagmo) y, en
ocasiones, la parálisis facial nuclear.
Las alteraciones visuales, por afectación del nervio o del quiasma óptico, son
también características, aunque algo más infrecuentes como síntoma de comienzo
(20 %); lo más frecuente es la presencia de un escotoma central con disminución
10
notable de la agudeza visual, pero pueden presentarse todo tipo de alteraciones
campimétricas. Durante el episodio agudo, el fondo de ojo puede ser normal
(neuritis retrobulbar) o bien presentar edema de papila (papilitis); se aprecia una
disminución del reflejo pupilar, o bien el signo de Marcus-Gunn (al iluminar el ojo
sano, se produce una contracción pupilar bilateral; si se estimula inmediatamente
después el ojo afecto, la pupila de este ojo se dilata); ambos indican un déficit
aferente. Es frecuente que al cabo de unas semanas se aprecie una palidez de
papila, con predominio en la región temporal o difusa (atrofia óptica).
El cerebelo se afecta inicialmente con menor frecuencia (10-20 %); la afectación
puede presentarse en forma de disartria cerebelosa (lenguaje escandido),
incoordinación motora de los miembros o inestabilidad en la marcha. En la
exploración se encuentran temblor intencional, dismetría, disdiadococinesia o
ataxia de los miembros o del tronco, con inestabilidad en el test de Romberg y en la
marcha.
La afectación de los esfínteres o la aparición de síntomas de deterioro mental son
muy infrecuentes como manifestaciones iniciales aisladas; cuando aparecen, crean
una gran incertidumbre diagnóstica, que persiste hasta que se presentan otros
síntomas (Weinshenker et al, 1989; Riise et al, 1992).
Síntomas-signos en el curso de la enfermedad.
En el curso de la enfermedad suele resultar afectada la mayor parte de los
sistemas funcionales neurológicos (piramidal, sensitivo, cerebeloso, tronco
encefálico, esfinteriano, visual, mental), siendo las alteraciones motoras (90 %),
sensitivas (77 %) y cerebelosas (75 %) las más frecuentes, seguidas en orden
decreciente por las alteraciones de tronco encefálico, esfinterianas, mentales y
visuales. Los casos evolucionados de EM muestran con mucha frecuencia una
combinación de síntomas y signos que indican la afectación de varios sistemas
neurológicos, lo que facilita enormemente el diagnóstico, en particular, cuando este
cuadro se presenta en personas jóvenes y más aún, si son mujeres (Fernández,
1990, Fernandez V. 2001; Riise et al, 1992).
11
Aparte de los síntomas y signos más frecuentes, que se deben a la alteración de
los distintos sistemas funcionales citados, existen alteraciones clínicas que se
presentan con cierta frecuencia en la EM: fatiga, atrofia muscular, dolor, signo de
Lhermitte, trastornos cognitivos, trastornos afectivos, epilepsia, síntomas
paroxísticos, movimientos anormales, neuritis óptica, alteraciones esfinterianas,
alteraciones sexuales.
Factores relacionados con el comienzo de la enfermedad o de los brotes.
Diversos factores han sido considerados como desencadenantes del comienzo de
la enfermedad o de la recurrencia de los brotes; entre ellos se encuentran los
siguientes: infecciones, embarazos, punción lumbar, vacunaciones, contraceptivos
orales, traumatismos, operaciones quirúrgicas, estrés emocional, cansancio y calor.
Estas relaciones son dudosas en la mayoría de los casos (GEED, 2003).
Frecuencia de los brotes.
La recurrencia de los brotes es variable, pero como media puede considerarse una
cifra de 0,9 brotes/ año en los pacientes en fase recurrente-remitente y de 0,30
brotes/ año si se considera a todos los pacientes, independientemente del tipo de
evolución. El intervalo entre los síntomas de comienzo y el siguiente brote es muy
variable; en el primer año recae un 30 %; el segundo año el 20 %; entre 5 y 9 años
siguientes el 20 %; y entre 10-30 años, el 10 %. La recurrencia precoz se asocia
con mal pronóstico.
Escalas de disfunción neurológica.
La exploración neurológica convencional constituye la primera aproximación del
neurólogo al paciente con EM. Mediante ella no sólo se establece el diagnóstico de
la enfermedad, sino que también se efectúa el seguimiento del curso la
12
enfermedad, aunque de forma poco estandarizada y escasamente comparable
entre los distintos evaluadores del paciente. Dada la inexistencia de un marcador
subrogado biológico o morfológico preciso, es evidente la necesidad de establecer
medidas objetivas de la evolución de los pacientes con EM, fundamentalmente con
el propósito de optimizar las posibilidades terapéuticas. Sin embargo, en una
enfermedad que, como la EM, fluctúa a lo largo del tiempo y tiene manifestaciones
clínicas muy diferentes, la búsqueda de instrumentos útiles en la determinación del
grado de deterioro neurológico y la discapacidad derivada de éste se ha revelado
como una tarea complicada. Se han propuesto diversas escalas clínicas de
valoración de la disfunción neurológica en EM. Cada escala tiene ventajas e
inconvenientes, puntos fuertes y deficiencias, pero por el momento ninguna cumple
todos los criterios ideales como medida final del grado de disfunción.
Kurztke desarrolló una escala de disfunción neurológica (EDSS, acrónimo del
inglés Expanded Disability Status Scale),(Kurztle 1983) que puntúa la disfunción de
0 (normal) a 10 (fallecido), con intervalos de 0,50 puntos. La puntuación se obtiene
de la valoración cuantitativa de las alteraciones presentes en lo que Kurztke
denominó sistemas funcionales, para lo que diseñó ocho subescalas destinadas a
cuantificar los hallazgos de la historia y la exploración neurológicas en los distintos
sistemas funcionales neurológicos (piramidal, cerebelo, tronco encefálico, sistema
sensitivo, esfínteres, visión, estado mental, espasticidad). La escala permite al
clínico seguir la enfermedad y detectar con más facilidad el momento en que pasa
a la forma progresiva. Constituye una herramienta de medición de particular interés
en el seguimiento de los enfermos en los ensayos clínicos. Permite, además,
calcular el índice de progresión, que es igual a la puntuación en la escala EDSS,
dividida por la duración de la enfermedad expresada en años. La media del índice
de progresión es 0,40-0,50 puntos por año. Este índice puede tener utilidad para
conocer la virulencia de la enfermedad en un paciente concreto. La EDSS presenta
el inconveniente de que debe de ser aplicada por un neurólogo específicamente
entrenado, para reducir lo más posible, la variabilidad intra e interobservador.
Además, la EDSS no refleja con certeza el grado de actividad de la enfermedad
debido a la importancia fundamental concedida en la escala a la motilidad, en
particular a la marcha, y a la naturaleza ordinal de la escala, que genera una
13
distribución bimodal de los pacientes evaluados, con picos de distribución de
frecuencias entorno a los grados 2 y 6. Con todo, es una escala ampliamente
utilizada, y ninguna otra escala ha demostrado ser más eficaz (Kurtzke, 1983;
Noseworthy 1994; Rudick et al, 1996; Hobart et al, 2000).
1.3 INVESTIGACIONES PARACLÍNICAS
1.3.1 Líquido cefalorraquídeo.
El estudio del líquido cefalorraquídeo (LCR) es útil para establecer el diagnóstico
de EM, apoya el proporcionar la categoría de definida o probable EM en los
criterios diagnósticos de Poser y, en algunos casos, es imprescindible como parte
del diagnóstico diferencial de EM.
El LCR de los pacientes con EM es de aspecto macroscópico normal, transparente,
incoloro y de presión normal. El número de células es normal (hasta 4 células / ml)
en el 60 % de los pacientes; la mayor parte son linfocitos T. Las proteínas totales y
la albúmina son normales o están ligeramente elevadas en el 40 % y el 20-30 % de
los casos, respectivamente. Un hallazgo característico es la elevación relativa, con
respecto a las demás proteínas, de las inmunoglobulinas (normal hasta el 11-12 %
de las proteínas totales), sobre todo de la IgG (normal hasta 4 mg/100 ml), lo que
implica síntesis intratecal. El índice IgG estima la concentración relativa de IgG en
el LCR y se considera normal por debajo de 0,66.
Índice IgG = [IgG LCR/albúmina LCR] / [IgG suero/albúmina suero]
Los hallazgos característicos del LCR en la EM son: elevación discreta de las
células y de las proteínas totales en el 40 % de los pacientes; elevación del
porcentaje de gammaglobulinas en el 70 %; elevación de la IgG en el 80 %; índice
IgG elevado y presencia de bandas oligoclonales (BO) en algo más del 90 %. Si se
14
realizan todas estas determinaciones se halla anormalidad en alguna de ellas en
casi el 100 % de los casos (Andersson et al, 1994).
La presencia de más de 50 células o de polimorfonucleares y de más de 100
mg/100 ml de proteínas totales, así como la ausencia de BO, deben hacernos
sospechar otras enfermedades.
El análisis del LCR puede ser útil no sólo en el diagnóstico de la EM: últimamente
se destaca la importancia que podría tener para la identificación, y posiblemente la
predicción, de la evolución de los pacientes, mediante detección de la síntesis
intratecal de inmunoglobulinas IgM cuya presencia ha sido asociada a un peor
pronóstico (Villar et al. 2002, 2003 y 2005), la caracterización de patrones celulares
o de citoquinas (Jongen et al, 1997; Cepok et al, 2001; Gronseth et al, 2000).
1.3.2 Potenciales evocados.
Los potenciales evocados (PE) relacionados con el estímulo se utilizan para la
valoración de la función en algunas vías nerviosas (visual, acústica,
somatosensitiva, motora). Proporcionan una medida fiable de la desmielinización.
El diagnóstico de la esclerosis múltiple (EM) se fundamenta en la objetivación de
lesiones diseminadas en el espacio y el tiempo. Por esta razón, los PE se utilizan
en el diagnostico de EM para definir la afectación de vías sensitivas o motoras en
presencia de síntomas vagos, y para detectar lesiones que no han producido
clínica alguna.
El análisis sistemático de la utilidad de los potenciales evocados en el diagnóstico
de EM establece como recomendaciones que los potenciales evocados visuales
(PEV) son probablemente útiles en el diagnóstico de EM, mientras que los
potenciales evocados somatosensitivos (PESS), sin distinción entre miembros
superiores e inferiores, solamente pueden recomendarse como posiblemente útiles;
en cuanto a los potenciales evocados acústicos de tronco (PEAT) no presentan
evidencias suficientes para ser recomendados como una herramienta útil en el
diagnóstico de EM. Todas las recomendaciones se basaban en estudios con clase
15
II de evidencia, es decir, en al menos un estudio prospectivo de un grupo no muy
amplio de sujetos con EM, o bien un estudio retrospectivo de un grupo amplio de
sujetos.
El uso de una batería de potenciales evocados que incluya todas las modalidades,
aumenta la sensibilidad del diagnóstico de EM (60-85 %), aunque no mejora la
especificidad (50-85 %). La especificidad de los potenciales evocados queda muy
limitada por su carácter de detección de anomalías fisiopatológicas que pueden
corresponder a diversas etiologías, y por tanto deben ser valorados siempre en su
contexto clínico (Gronseth y Ashman, 2000).
1.3.3. Resonancia magnética.
La resonancia magnética (RM) permite: 1) descartar otras enfermedades; 2)
demostrar lesiones desmielinizantes no sospechadas clínicamente; 3) determinar
en un solo estudio los criterios de diseminación espacial (presencia de más de una
lesión) y temporal (el estudio ponderado en T1 con gadolinio evidencia lesiones
agudas, y el ponderado en T2 evidencia preferentemente lesiones crónicas); 4)
monitorizar la actividad de la enfermedad en los ensayos clínicos; y 5) avanzar en
el conocimiento de la patogenia de la enfermedad, mostrando que la actividad
detectada por RM antecede a los síntomas clínicos y que la actividad captada por
RM es de 5-20 veces más frecuente que los brotes clínicos (Miller et al, 1993).
Se han desarrollado diversos criterios diagnósticos (Paty et al, 1988, Fazekas et al,
1988 y Barkhof et al, 1997) que contemplan la presencia de 3 a 9 lesiones, de 3 a
6 mm de diámetro y localización periventricular, yuxtacortical o en fosa posterior y,
que al menos una de las lesiones capte gadolinio. Cuantas más variables estén
presentes, mayor es la sensibilidad y la especificidad y, por tanto, la probabilidad
de que estemos ante un caso de EM.
16
La RM craneal convencional detecta lesiones en el 95%, y la RM cervical, en el
75% de los pacientes con EM. Se aprecia atrofia corticosubcortical en el 40-50 %
de los casos tras un período medio de 12 años.
De izquierda a derecha:
Figura 2. Resonancia magnética cerebral. Proyección axial. Secuencia Flair: Se aprecian múltiples
lesiones periventriculares y algunas subcorticales
Figura 3. Resonancia magnética cerebral. Proyección axial. Se aprecian varias lesiones que captan
gadolinio.
Figura 4. Resonancia magnética de la médula cervical. Proyecciones sagitales. Se aprecia una
lesión a la altura de C1 que capta gadolinio en secuencia T1.
La RM informa acerca de la histopatología: la captación de gadolinio, en la
secuencia ponderada en T1, representa apertura de la barrera hematoencefálica,
que en la EM precede a los fenómenos inflamatorios. La destrucción de la mielina y
los axones puede estudiarse por medio de la tasa de transferencia de
magnetización por RM (TMR); la gliosis, mediante la secuencia en T1 de espín-eco;
la técnica de RM de difusión mide la integridad tisular estudiando el edema,
desmielinización y la pérdida axonal; y la disfunción o destrucción axonal puede ser
evaluada mediante espectroscopia por RM (ERM), que permite detectar cambios
en el N-acetilaspartato (NAA), metabolito que es usado como marcador de la
actividad neuronal.
En los últimos años el empleo sistemático de la RM y su correlación con estudios
17
anatomopatológicos postmortem de pacientes con EM han permitido la descripción
de la evolución natural de la EM (Filipi et al, 2005; Schmierer et al, 2004; Brex et al,
2002). La EM resulta ser una patología muy dinámica, con lesiones independientes
que cambian a lo largo del tiempo. La ruptura de la barrera hematoencefálica es el
primer acontecimiento patogénico detectable mediante la captación de gadolinio en
T1, sobre todo en dosis triple (Filipi et al, 1996) tras el que aparecerá la lesión
aguda, detectada mediante la RM de densidad protónica y en T2. Generalmente,
estas lesiones aumentarán de tamaño a lo largo de aproximadamente un mes para
desparecer después gradualmente. Antes de la captación de gadolinio, aparecen
cambios en la tasa de TMR de la sustancia blanca de aspecto normal de la misma
localización, lo que sugiere episodios previos a la ruptura de la BHE y una actividad
latente no revelada por las técnicas RM convencionales.) Por otra parte, las
lesiones pueden hacerse crónicas, siendo detectadas como lesiones hiperintensas
en RM de densidad protónica y en T2, o en forma de “agujeros negros” en T1
(Truyen et al, 1996; Walderveen et al, 1998). Estos aspectos de la enfermedad
pueden ser monitorizados mediante la medición del volumen lesional total en RM.
La atrofia es un marcador indirecto, pero mucho más accesible para los clínicos, de
la pérdida axonal. Numerosos estudios confirman la progresiva atrofia
cerebral,(Simon et al, 1999; Losseff et al, 1996) del cuerpo calloso (Simon et al,
1987; Huber et al, 1987) y de la médula espinal,(Lossef et al, 1996; Filippi et al,
1997) desde estadios muy tempranos de la enfermedad. Una medida más precisa
de la atrofia cerebral es la fracción parenquimatosa cerebral (BPF, de la
denominación en inglés, brain parenchymal fraction) que consiste en calcular el
volumen parenquimatoso cerebral (BPV) y el volumen total cerebral dentro del
contorno de la superficie cerebral (BV), normalizándose después (BPF=BPV/BV).
La fracción parenquimatosa cerebral disminuye durante la evolución de la
enfermedad, lo que pone de manifiesto que los pacientes con EM forma RR tienen
un grado medible de atrofia cerebral total, que empeora de año en año, en la
mayoría de los casos sin manifestaciones clínicas concomitantes (Jagust y
Noseworthy, 2000).
18
Es de gran importancia encontrar indicadores de la destrucción axonal, que parece
ser la responsable de los déficit neurológicos irreversibles de la EM y cuya medida
objetiva sería un predictor mejor de la progresión de la discapacidad que las
medidas clínicas, como la escala EDSS. La atrofia cerebral, y sobre todo la fracción
parenquimatosa cerebral, sería un indicador útil del proceso patológico destructivo
subyacente en los pacientes con EM (Rudick et al, 1999).
1.4 DIAGNÓSTICO
El diagnóstico clínico de la EM se realiza tomando en consideración la existencia
de criterios clínicos de diseminación espacial (presencia de síntomas y signos que
indiquen la existencia de dos lesiones independientes en el SNC) y de dispersión
temporal (dos o más episodios de disfunción neurológica). En la actualidad, con la
clínica y con la ayuda de los métodos de investigación paraclínicos (LCR,
potenciales evocados, resonancia magnética), es posible descartar con bastante
seguridad otras enfermedades y llegar a un diagnóstico de certeza de la EM en la
mayoría de los casos; además, el diagnóstico se realiza cada vez de forma más
temprana, tras el comienzo de la enfermedad. Existe un pequeño porcentaje de
pacientes (1-2 %) que plantean un serio reto diagnóstico; en general, se trata de
pacientes con un curso clínico progresivo primario, afectación única o
preferentemente medular y normalidad en las exploraciones complementarias
(Palace, 2001; Lublin 2002; Guezzi et al, 2001).
Criterios diagnósticos
Ante las evidencias crecientes de la importancia del diagnóstico temprano de la EM
para iniciar cuanto antes el tratamiento, un comité de expertos presidido por
McDonald ha propuesto unos nuevos criterios diagnósticos, (McDonald et al, 2001)
basados sobre todo en la diseminación en el espacio y el tiempo, valorada
mediante RM. Estos criterios permiten adelantar el diagnóstico de EM de forma
significativa, y definir de forma más precisa las formas progresivas primarias, pero
se encuentran aún sometidos a discusión y en fase de validación, aunque se usan
19
ya en muchos centros en la práctica clínica diaria.(Poser y Brinar 2001; Tintore et al
2003).
Figura 5. Criterios diagnósticos de McDonald
En estos criterios es esencial obtener evidencia de diseminación en espacio y
tiempo para hacer un diagnóstico seguro, al igual que se requiere la exclusión de
una explicación mejor para las características clínicas. Se hace también hincapié
en que el diagnóstico de EM debe realizarse por neurólogos expertos en esta
enfermedad.
Los nuevos criterios recomiendan dejar de utilizar las denominaciones de “EM
clínicamente definida” y “EM probable” empleadas en los criterios de Poser. Los
resultados de las evaluaciones diagnósticas serán: “EM”, “no es EM”, o “posible
EM” (aquellos pacientes que parecen presentar cierto riesgo de padecer EM, pero
en los que la evaluación diagnóstica no ha sido concluyente).
20
Definiciones:
Brote: un brote (recurrencia, exacerbación, ataque) se refiere a un episodio de
disfunción neurológica del tipo que suele verse en la EM, definido por un informe
subjetivo, o por una observación objetiva, tiene que durar al menos 24 horas, con el
fin de excluir pseudobrotes, tales como los que se producen con los aumentos de
temperatura. Se precisa de hallazgos objetivos clínicos para hacer el diagnóstico
de EM. Los episodios paroxísticos no constituyen un brote, pero puede
considerarse que existe un brote si persisten durante al menos 24 horas.
Separación entre brotes: se considera que debe al menos haber 30 días entre el
comienzo de un brote y el comienzo del segundo brote, definición que es distinta a la
de Poser.
Anormalidad en las pruebas paraclínicas: Las datos paraclínicos (RM, LCR,
potenciales evocados) que se contemplan en los criterios de McDonald están bien
definidos.
Resonancia magnética: Las lesiones detectadas en RM pueden proveer evidencia
de diseminación en tiempo y espacio. Se requieren al menos evidencia de al menos
3 de los 4 siguientes criterios:
- Una lesión realzada con gadolinio o 9 lesiones hiperintensas en T2, en el caso
de no presentar ninguna lesión realzada con gadolinio.
- Una o más lesiones infratentoriales.
- Una o más lesiones yuxtacorticales.
- Tres o más lesiones periventriculares.
Hay que considerar siempre que una lesión medular puede sustituir a una lesión
cerebral.
Para objetivar la diseminación en el tiempo mediante RM, se realizan exploraciones
RM seriadas, a los 3 meses, y en ocasiones a los 6 meses, del brote inicial, según
el momento de la exploración RM inicial.
21
En una primera exploración con RM realizada al menos 3 meses después del inicio
del brote original, la evidencia de diseminación en el tiempo viene determinada por
la presencia de:
- Una lesión realzada con gadolinio, demostrada en una localización diferente
de la de la clínica del brote inicial, o bien, si no aparecen lesiones realzadas con
gadolinio a los 3 meses del brote, la presencia de:
- Una lesión realzada con gadolinio o nuevas lesiones en T2 en una nueva
exploración. El momento de la exploración con RM no es determinante, pero
preferentemente se realizará a los tres meses de la exploración anterior.
Cuando la primera RM se realiza antes de los 3 meses del brote original, la
evidencia de diseminación en el tiempo está definida por:
- Una lesión realzada con gadolinio, demostrada en una segunda RM realizada
a los 3 meses, o más, del brote.
Si no aparece ninguna lesión nueva en la segunda exploración RM, se realizará
una tercera RM, no antes de que hayan transcurrido 3 meses tras la primera
RM, en la que la presencia de una lesión realzada con gadolinio, o nuevas
lesiones en T2, proporciona pruebas de diseminación en el tiempo.
Líquido cefalorraquídeo: El LCR, para constituir una evidencia positiva para el
diagnóstico de EM, debe cumplir uno de los dos criterios siguientes:
- Bandas oligoclonales en el LCR que nos estén presentes en el suero, o bien,
- índice IgG elevado.
Potenciales evocados: en los criterios de McDonald solamente se toman en
consideración los potenciales evocados visuales, con un único criterio de evidencia:
22
- Un PEV positivo para EM tiene una morfología conservada con la latencia
prolongada. Aporta evidencia objetiva de una segunda lesión, siempre que la
que se expresa clínicamente no afecte a las vías visuales.
En el esquema diagnóstico en la tabla de la Figura 5 se indican los pasos a seguir
en el diagnóstico de la EM.
Interpretación de la tabla de criterios diagnósticos:
- Dos o más brotes, evidencia clínica objetiva de dos o más lesiones:
Dos o más brotes típicos de EM, documentados por evidencia objetiva de dos
lesiones separadas en el tiempo y en el espacio. Son suficientes para el diagnóstico
de EM en base clínica. No se requieren pruebas adicionales. Sin embargo, se
espera que se realicen una o más de las pruebas paraclínicas (RM, LCR, PE) y que
sean anormales. Si se realizan estas pruebas y resultan normales, se debe tener
mucha precaución antes de establecer el diagnóstico.
- Dos o más brotes, evidencia objetiva de una lesión:
Se precisa evidencia de una segunda lesión que demuestre diseminación en el
espacio. Esta evidencia puede facilitarla un estudio de RM que satisfaga los criterios
mencionados previamente. Una lesión en la médula espinal puede sustituir a una
lesión cerebral. De forma alternativa, la presencia de dos lesiones, una en el cerebro
y una en la médula espinal consistente con EM, asociadas a un LCR anormal (para
evitar lesiones vasculares no específicas como inflamatorias) puede usarse para
documentar diseminación en el espacio. Por último, si no se realiza RM, un nuevo
brote clínico en otro lugar puede cumplir los criterios de diseminación en el espacio.
- Un brote, evidencia clínica objetiva de dos o más lesiones:
En este caso, es preciso demostrar diseminación en el tiempo. Puede hacerse con
RM, con cuidado al momento de la realización de la misma. Debe existir al menos 3
meses entre el brote clínico y la RM subsiguiente. Sino se realiza RM, se precisa un
nuevo brote para cumplir el criterio de diseminación en el tiempo.
- Un brote, evidencia clínica objetiva de una lesión:
23
Se precisa demostrar diseminación en tiempo y espacio. Se trata de un síndrome
clínico aislado. Se precisa: 1) diseminación en el espacio, por medio de RM o al
menos, por dos lesiones en RM y un LCR positivo y 2) diseminación en el tiempo, al
igual que para el paciente con un brote y evidencia de dos lesiones. En este caso,
sino se realiza RM. Un segundo brote clínico que afecte a un sitio diferente al
primero, permite cumplir los criterios de diseminación en tiempo y espacio.
- Progresión neurológica insidiosa sugerente de EM:
En este caso, no existen brotes típicos y no es posible determinar con facilidad la
diseminación en el espacio. Para hacer un diagnóstico de EM se requiere un LCR
anormal con evidencia de inflamación, así como evidencias de diseminación en
espacio (RM o PE) y tiempo (RM o progresión continuada de la discapacidad
durante 1 año). Si se cumplen estos criterios el diagnóstico es “EM progresiva
primaria”.
Diagnóstico diferencial
Debe dudarse del diagnóstico: 1) si no existen alteraciones visuales ni
oculomotoras; 2) si hay ausencia completa de alteraciones sensitivas y
esfinterianas; 3) si existe un curso progresivo en pacientes jóvenes; 4) si todos los
hallazgos clínicos pueden explicarse por una lesión única; y 5) si el LCR es normal
o 6) en presencia de elevaciones anormalmente altas del número de células (en
particular, polimorfonucleares), o de las proteínas totales, y en ausencia de BO o
de lesiones en la RM de cráneo y columna cervical.
En el diagnóstico diferencial de la EM se incluyen numerosos procesos entre los
que destacan enfermedades genéticas: ataxias hereditarias, paraplejías
hereditarias, atrofia óptica de Leber, encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica
y accidentes cerebrovasculares (MELAS), enfermedades lisosomales (enfermedad
de Fabry, leucodistrofia de células globoides o enfermedad de Krabbe,
leucodistrofia metacromática), enfermedades peroxisómicas (adrenoleucodistrofia
ligada al cromosoma X, adrenomieloneuropatía) y enfermedad de Wilson;
enfermedades infecciosas virales: como sarampión (panencefalitis esclerosante
24
subaguda, SSPE), virus JC (leucoencefalopatía multifocal progresiva), retrovirus:
HIV (leucoencefalomielopatía asociada al virus HIV-1) y HTLV-I (mielopatía
asociada al virus HTLV-I / paraparesia espástica tropical), y bacterianas como
borreliosis, brucelosis y sífilis meningovascular; enfermedades inflamatorias no
infecciosas: encefalomielitis aguda diseminada postvacunal y postinfecciosa,
enfermedad de Behçet, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjögren primario,
sarcoidosis, síndrome antifosfolípido, hipersensibilidad a gluten; enfermedades
nutricionales: déficit de vitamina B12, vitamina E, ácido fólico; enfermedades
neoplásicas: linfoma primario del SNC, síndromes paraneoplásicos, tumores
primarios SNC (p. ej., meningioma); enfermedades vasculares: arteriopatía cerebral
autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL),
enfermedad de Eales, enfermedad cerebrovascular hipertensiva, émbolos
cerebrales múltiples, vasculopatía retrococlear de Susac, leucoencefalopatía
subcortical arteriosclerótica (enfermedad de Binswanger),cefalea vascular
(migraña), vasculitis; patología estructural: quiste aracnoideo, malformación de
Arnold-Chiari, espondilosis cervical, hernia discal intervertebral, malformación
vascular, siringomielia; enfermedades tóxicas: mielinolisis pontina central,
leucoencefalopatía posquimioterapia, efectos secundarios de radioterapia;
enfermedades psiquiátricas: trastorno de conversión; y una miscelánea que incluye:
síndrome de fatiga crónico, polineuropatía sensitiva migratoria, leucoencefalopatía
con sustancia blanca evanescente, neurorretinitis (edema de papila con mácula en
forma de estrella), degeneración sistémica esporádica e histiocitosis sistémica.
1.5 PRONÓSTICO
La expectativa de vida tras el diagnóstico de la enfermedad es de 25-35 años. Las
causas de muerte más frecuente son las infecciones, las enfermedades no
relacionadas y el suicidio (Ebers, 2001).
Formas malignas y benignas.
Existen casos de EM con evolución muy rápida, en particular la forma aguda
25
conocida como enfermedad de Marburg (1906) de curso fulminante, monofásico y
que ocasiona la muerte a las pocas semanas de su inicio. Las alteraciones en las
exploraciones paraclínicas y necrópsicas son en todo similares a las de otros casos
con evolución más benigna. El fallecimiento ocurre por afectación de las
estructuras del tronco encefálico. Otras formas, sin ser agudas, son de evolución
rápida y maligna; pueden considerarse como tales aquellas que originan el
fallecimiento del paciente tras unos cinco años de evolución.
Se denominan formas benignas aquellas que permiten desarrollar una vida normal
tras 10-15 años de evolución (puntuación no superior a 3 en la escala EDSS al
cabo de estos años); constituyen un 30% de los pacientes. Con el tiempo, estas
formas pueden llegar a ser eventualmente incapacitantes (Hawkins y McDonnell,
1999).
Factores pronósticos de la progresión
Son factores pronósticos clínicos favorables los siguientes: comienzo a edad
temprana, sexo femenino, síntomas de comienzo visuales y sensitivos, intervalo
prolongado entre el primer y segundo brote, pocos brotes durante los dos primeros
años y EDSS baja a los 2-5 años. Son, por el contrario, factores pronósticos
desfavorables los siguientes: comienzo por encima de 40 años, sexo masculino,
comienzo por síntomas motores y cerebelosos, recurrencia temprana tras el primer
brote, elevado número de brotes durante los primeros años y EDSS alta a los 2-5
años (Ramsaransing et al, 2001; Kantarci y Weinsheker, 2005).
1.6 HISTOPATOLOGÍA
La esclerosis múltiple se caracteriza por su anatomía patológica, consistente
en la aparición de lesiones focales en la sustancia blanca, denominadas
placas, en las que lo más llamativo es la pérdida de mielina (desmielinización)
con preservación relativa de los axones, pues siempre está presente un grado
variable de destrucción axonal (Lassmann y Vass, 1995; Ferguson et al, 1997;
26
Trapp et al, 1998; Prineas y McDonald 1997; Lassmann, 1998; Morris
1990).Estas lesiones suelen ser múltiples y están distribuidas por todo el
SNC; es característica su disposición perivenular, y se localizan más
frecuentemente en la sustancia blanca periventricular y subpial. Su tamaño es
variable, en general no mayor de 1’5 cm de diámetro, y tienden a coalescer,
dando como resultado placas de mayor tamaño. Pueden aparecer placas en
la sustancia gris, en general subpiales, pero son más difíciles de identificar;
las neuronas suelen estar respetadas.
Las placas de desmielinización son de dos tipos según la fase de la
enfermedad, y permiten distinguir una lesión aguda, en la que el fenómeno
anatomopatológico fundamental es la inflamación, y una lesión crónica, en la
que destacan la desmielinización, la degeneración axonal y la gliosis.
La lesión aguda presenta unos bordes mal definidos, con un importante
infiltrado inflamatorio, preferentemente de linfocitos T, linfocitos B, microglía
activada y macrófagos, en los que aparecen restos de mielina en distintas
fases de digestión. Se produce, además, pérdida de oligodendrocitos, con
degradación de las vainas de mielina, degeneración axonal en grado variable
y, posteriormente, proliferación de astrocitos. Un estudio reciente sobre las
lesiones agudas, describe sin embargo, que el cambio estructural más
temprano sería la apoptosis extensa de los oligodendrocitos en un tejido que
muestra activación temprana de la microglía, con complemento activado pero
con muy poco o ningún infiltrado linfocitario ni fagocitos con mielina en la zona
apoptótica, aunque pueden aparecer en otras zonas de la lesión. Después de
1 o 2 días, los oligodendrocitos desaparecerían, probablemente fagocitados
por la microglía presente en el tejido. La tercera fase sería la fragmentación y
vacualización de las vainas de mielina por los macrófagos, en presencia de
infiltrados de células T (Bennet y Prineas, 2004). Este estudio incluye 12
pacientes con EM que fallecieron durante o poco después de padecer un
brote de la enfermedad. La observación de que los oligodendrocitos
desaparecerían antes de que los macrófagos comenzasen la fagocitosis de la
mielina, así como que la infiltración por células T es tardía, es muy novedosa
y deberá corroborarse con estudios más extensos.
27
De izquierda a derecha:
Figura 6. Placas de desmielinización en cerebro. (Microfotografía cedida por el Dr. G. Izquierdo).
Figura 7. Lesión aguda. Infiltrado inflamatorio perivenoso en una lesión aguda (Microfotografía
cedida por el Dr. G. Izquierdo).
De izquierda a derecha:
Figura 8. Interrupción axonal en la EM. (Microfotografía cedida por el Dr. G. Izquierdo).
Figura 9. Borde de una lesión activa. La mielina que recubre los axones es de color blanquecino,
apreciándose interrupciones de la misma (espacio entre dos puntas de flecha). Se distinguen tres
axones parcialmente desmielinizados y afectos de degeneración axonal, caracterizada ésta por
ausencia de fosforilación. Se aprecia un axón interrumpido terminado en un ovoide (flecha) (Tomado
de Trapp BD, Peterson J, Ransohoff RM, Rudick R, Mork S, Bo L. Axonal transection in the lesions of
multiple sclerosis. N Engl J Med 1998; 338(5):278-85)
28
La lesión crónica es la lesión clásica de la anatomía patológica macroscópica, en
la que existe poca actividad inflamatoria, pero hay una importante pérdida de
vainas de mielina y de oligodendrocitos, mostrándose los axones desmielinizados,
en ocasiones degenerados, con formación de redes de prolongaciones
astrocitarias. Las localizaciones preferentes de estas lesiones son el nervio óptico,
las regiones periventriculares, el tronco encefálico y la médula espinal.
En algunos casos la diferenciación no es tan evidente, pues se trata de placas en
las que ocurre un fenómeno de remielinización parcial (placas sombreadas),
demostrándose por las tinciones de la mielina y microscopía electrónica la
existencia de oligodendrocitos o de sus prolongaciones y axones finamente
mielinizados.
Se han individualizado cuatro patrones anatomopatológicos de desmielinización,
según el grado de pérdida de mielina, la localización y extensión de las placas, el
patrón de destrucción de los oligodendrocitos, y la evidencia de remielinización y
de activación del complemento (Bruck y Stadelmann, 2005):
Los patrones I y II muestran desmielinización activa perivenular con infiltrados
inflamatorios de células T y macrófagos, con relativa preservación de los
oligodendrocitos y con remielinización concomitante. El patrón más frecuente es el
II, que se diferencia por la deposición de inmunoglobulinas, preferentemente IgG, y
de complemento activado en las lesiones. La lesión mediada por anticuerpos típica
del patrón II es el mecanismo más importante de producción de daño tisular en los
pacientes con neuromielitis óptica (enfermedad de Dévic) (Lucchinetti et al, 2002).
El patrón III también muestra áreas de desmielinización e infiltrados de células T y
macrófagos, pero no se encuentran centrados en las vénulas, y la muerte por
apoptosis de los oligodendrocitos en el borde activo de la lesión, es el hallazgo más
prominente, junto con la escasa o ausente remielinización. El mecanismo
patogénico subyacente en estas lesiones seria similar al daño tisular por hipoxia. El
patrón III se diferencia del IV por una pérdida más importante de la glicoproteína
asociada a la mielina, en comparación con las otras proteínas mielínicas. La forma
29
más grave de este tipo de lesión tisular resulta en la formación de las placas de
desmielinización concéntricas que se ven en los casos de esclerosis concéntrica de
Baló.
En el patrón IV, que se presenta en un subgrupo de pacientes con curso progresivo
primario, existe un infiltrado de linfocitos T y macrófagos, y desmielinización
asociada con muerte de oligodendrocitos en el borde activo de la placa, sin que
estas células muestren los signos típicos de la apoptosis. No se observan
fenómenos de remielinización. En el patrón IV todas las proteínas mielínicas están
afectadas por igual.
Las lesiones se pueden clasificar en dos grupos: aquellas que se asemejan a una
encefalomielitis autoinmunitaria (I-II), y las que presentan signos de distrofia
oligodendrocitaria (III-IV). El más frecuente es el patrón II, seguido por el III, I y IV.
Los patrones I-II se encuentran en pacientes de todos los subtipos clínicos, el III en
las formas agudas y el IV en la forma progresiva primaria.
Las lesiones de cada paciente presentan siempre el mismo patrón, por lo que
puede formularse la hipótesis de que cada tipo de patrón sería consecuencia de un
espectro equivalente de mecanismos patogénicos responsables de la inflamación
y la desmielinización de la enfermedad, en los que la mielina, los oligodendrocitos y
los progenitores de los oligodendrocitos están afectados de forma selectiva, en los
pacientes con EM. No obstante, este novedoso enfoque patogénico de la
enfermedad, debe ser comprobado en futuros estudios inmunopatológicos que
incluyan muestras de lesiones en diversas fases de la enfermedad, con grados de
actividad variable, ya que, hasta el momento, la descripción de esta clasificación
patogénica de la EM ha sido realizado en su mayor parte, con material biópsico de
formas agudas y de muy mala evolución, y en material necrópsico (análisis tardío
del material), lo que podría haber introducido sesgos en los resultados, o en su
interpretación (Ludwin, 2000; Lucchinetti et al, 2000).
30
Figura 10: Patrones anatomopatológicos (Modificado de Lassman H. Recent neuropathological
findings in MS-implications for diagnosis and therapy. J Neurol 2004; 251: IV2- IV5) CNTF: Factor
ciliar neurotrófico
1.7 PATOGENIA
El estudio de la patogenia de la esclerosis múltiple tiene un gran interés para la
búsqueda de la etiología de la enfermedad, aún desconocida a pasar de ser una
entidad clínica bien descrita desde hace más de un siglo, y para el consiguiente
desarrollo de tratamientos de la misma.
1.7.1 La esclerosis múltiple como reacción inflamatoria inmunomediada
La hipótesis patogénica más aceptada es que la esclerosis múltiple es fruto de la
conjunción de una determinada predisposición genética y un factor ambiental
desconocido, que, al aparecer en un mismo sujeto, originarían un amplio espectro
de alteraciones en la respuesta inmunitaria, que a su vez serían las causantes de la
inflamación presente en las lesiones de EM. La inflamación seria el mecanismo
más inmediato, pero no el único, de la desmielinización característica de la
enfermedad y de la pérdida axonal. Los datos sobre heterogeneidad
PPaattrróónn II PPaattrróónn IIII PPaattrróónn IIIIII PPaattrróónn IIVV MMeeddiiaaddoo ppoorr MMΦΦ MMeeddiiaaddoo ppoorr AACC OOlliiggooddeennddrrooppaattííaa ddiissttaall OOlliiggooddeennddrrooppaattííaa 11ªª yy aappooppttoossiiss LLeessiióónn ddee llaa mmiieelliinnaa LLeessiióónn ddee llooss oolliiggooddeennddrroocciittooss ((MMooddeelloo aauuttooiinnmmuunnee –– EEAAEE,, MMOOGG--EEAAEE)) ((MMooddeellooss vviirraalleess,, ttóóxxiiccooss,, iissqquuéémmiiccooss,, mmeettaabbóólliiccooss))
31
anatomopatológica de la lesión de EM, permiten sugerir la hipótesis de que cada
paciente con EM presentaría, de forma preferente, uno u otro mecanismo
patogénico de desmielinización, que sería el origen de las diferentes
presentaciones clínicas y de las diferencias en la respuesta al tratamiento de cada
paciente (Lassmann, 1998).
El papel central de los fenómenos de mediación autoinmunitaria en la esclerosis
múltiple está respaldado por datos inmunológicos procedentes del estudio de las
lesiones agudas de EM, en las que se detectan células T colaboradoras (con
expresión de CD4 ó CD4+) y en las que hay una expresión anómala de los
antígenos CMH clase II (macrófagos y astrocitos). Existe, además, activación de
las células B, demostrada por la presencia de inmunoglobulinas sintetizadas en el
sistema nervioso central, que dan lugar al hallazgo característico de las bandas
oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
Este modelo patogénico autoinmunitario es reproducible; así, existe una
encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), que se produce en animales de
laboratorio a los que se han inyectado homogeneizados de médula espinal o
proteínas de mielina purificada, y que se asocia con una desmielinización focal y un
infiltrado de células T, muy similares a los que se observan en la EM. En el cobaya,
este trastorno puede evolucionar hacia una enfermedad desmielinizante
recidivante. Los antígenos principales en la EAE son la proteína básica de mielina
(MBP, de su denominación en inglés, myelin basic protein) y la glucoproteína
mielínica oligodendrocítica (MOG, de su denominación en inglés, myelin
oligodendrocyte protein)(Wingerchuck et al, 2001; Hemmer et al, 2002).
Aunque hasta hace poco tiempo se ha tenido en consideración, casi
exclusivamente, la respuesta inmune celular, debido fundamentalmente a la
utilización de la EAE como modelo experimental, en la actualidad se sabe con toda
certeza, que la respuesta inmunomediada responsable de la esclerosis múltiple,
tendría dos componentes, al menos de igual importancia: los brazos celular y
humoral del sistema inmune adaptativo. Pero es preciso tener en cuenta que no
sólo participa el sistema inmune adaptativo, sino que también interviene el sistema
inmune innato en la cascada patogénica de la EM, constituyendo un importante
efector inmunitario responsable del resultado lesional final.
32
1.7.2 Sistema inmune adaptativo .
Inmunidad celular:
La predisposición hereditaria, combinada con el factor ambiental desconocido,
establece o mantiene células T autorreactivas que, tras un periodo de latencia de
10-20 años, serán activadas por un factor sistémico o local (infección viral,
puerperio, etc.) mediante un mecanismo de mimetismo molecular (epítopos
compartidos por la mielina y los posibles agentes infecciosos) o por una
estimulación a través de superantígenos virales o bacterianos.
Mimetismo molecular. Han sido demostrados epítopos compartidos por la mielina
(proteína básica de la mielina o MBP, y 2’-3’-nucleótido cíclico 3’-fosfodiesterasa o
CNPasa, por su denominación en inglés, 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-
phosphodiesterase) y los posibles agentes infecciosos (coronavirus 229E,
Mycobacterium leprae, HHV6, virus sincitial), que desencadenarían la respuesta
inmunológica; además, estudios recientes han demostrado que el modelo
conceptual de mimetismo molecular es flexible, pues el reconocimiento antigénico
es mucho menos específico de lo que se pensaba y no se basa únicamente en la
homología completa de secuencias peptídicas, que no es imprescindible para la
reactividad cruzada en los modelos experimentales de células T MBP-específicas
derivadas de pacientes con EM, pero sí es necesario el aumento concomitante de
la expresión de las moléculas del sistema HLA del complejo mayor de
histocompatibilidad e implicados en el reconocimiento inmunológico (genes de la
región del antígeno de leucocitario humano; HLA, de su denominación en inglés,
human leukocyte antigen), de coestimulación y de adhesión para que los
fenómenos de autoinmunidad tengan lugar (Liblau y Fontaine, 1998; Gran et al,
1999; Albert e Inman, 1999).
Superantígenos. Son proteínas bacterianas o virales capaces de unirse a la
molécula HLA de la célula presentadora de antígenos fuera de la hendidura de
unión antigénica, y activar células T policlonales específicas V-b reactivas contra
los antígenos mielínicos. Además, los superantígenos no necesitan ser degradados
33
antes de su unión con las moléculas HLA, ni tienen restricción HLA para ser
presentados, pero los distintos haplotipos de HLA-DR varían en su habilidad para
unirse y presentar algunos de los superantígenos. Los superantígenos más
estudiados e involucrados en la patogénesis de la EM y en la aparición de brotes
son las enterotoxinas estafilocócicas SEB y TSST-1(Johnson et al, 1996; Brocke et
al 1996).
Una vez reactivadas, estas células T autorreactivas pasan selectivamente la
barrera hematoencefálica (BHE) y, al ser expuestas de nuevo a su autoantígeno,
inician una reacción inflamatoria mediada por células colaboradoras Th-1 (del
ingles, T-helper 1). Se ha descrito el importante fenómeno de la amplificación
epitópica (Vanderlugt et al, 1996 y 1998; Goebels et al, 2000; Tuohy et al, 1998;
Kumar, 1998; Voskuhl, 1998) consistente en que inicialmente las células T
reconocen un epítopo de un antígeno, pero con el paso del tiempo, estas células
reconocen, además, otros epítopos del mismo antígeno, y por tanto se activan con
ellos, e incluso con otros antígenos.
El mecanismo por el cual los linfocitos T sistémicos penetran en el sistema nervioso
central no se conoce por completo, pero se sabe que se trata de un proceso
desarrollado en varias fases. Inicialmente, las citoquinas proinflamatorias,
interleuquina-1 (IL-1), factor de necrosis tumoral α/β (TNF-α/β, del inglés, tumor
necrosis factor) e interferón γ (IFNγ), inducen un aumento de la expresión de las
moléculas de adhesión endotelial, E-selectina, molécula de adhesión intracelular
(ICAM -1, del inglés, inter-cellular adhesion molecule 1) y molécula de adhesión
vascular (VCAM-1; del inglés, vascular adhesion molecule 1). Las selectinas
endoteliales establecen enlaces débiles con ligandos leucocitarios que hacen a los
leucocitos rodar sobre la pared vascular en la dirección de la corriente sanguínea.
El deslizamiento permite la activación y cambio conformacional de las integrinas
leucocitarias, antígeno asociado a la función linfocitaria (LFA-1, del inglés,
lymphocyte function-associated antigen 1) y antígeno muy tardío tipo 4 (VLA-4, del
inglés, Very Late Antigen-4). Así, las integrinas se unirán a sus respectivos ligandos
(ICAM-1 y VCAM-1) mediante enlaces estables. Entonces las células se deforman
34
y atraviesan el endotelio. La extravasación se produce bien a través del endotelio,
bien a través de las uniones celulares, y requiere la interacción de ICAM-1/LFA-1,
así como la de otras moléculas de adhesión, y la producción linfocitaria de
proteasas que degraden la matriz extracelular (metaloproteasas de la matriz o
MMP (del inglés, matrix metalloproteinases: gelatinasa A o MMP-2 y gelatinasa B o
MMP-9). En este momento juegan un papel importante las quimioquinas (citoquinas
quimioatrayentes que son responsables del reclutamiento selectivo de células
inflamatorias ), en especial las quimioquinas C-C que son las responsables de la
atracción de los macrófagos y los linfocitos T [proteína inflamatoria de macrófagos
α-1 o MIP-1α (del inglés, macrophage inflammatory protein 1 alpha) la β-1, proteína
quimiotáctica de monocitos-1 o MCP-1 (del inglés, monocyte chemotactic protein-
1), las proteínas reguladoras expresadas y secretadas en la activación del linfocito
T normal o RANTES (del inglés, regulated on activation, normal T cell expressed,
and secreted )y la linfotaxina].
Una vez en el SNC, el linfocito T activado encontrará a una célula presentadora de
antígeno (macrófago o microglía), que expresa en su superficie el antígeno
responsable de la EM en el contexto de una molécula HLA clase II y de las
moléculas coestimuladoras. El antígeno es el factor más desconocido; más aún, es
preciso tener en cuenta que puede existir más de un autoantígeno capaz de
desencadenar la respuesta autoinmunitaria y que el o los antígenos que inicien la
enfermedad pueden no ser los mismos que la perpetúen (amplificación epitópica).
Las proteínas mielínicas del sistema nervioso central implicadas en la
autorreactividad de las células T son la MBP, la MOG, la glucoproteína asociada a
la mielina o MAG (de su denominación en inglés, myelin associated glycoprotein),
la proteína proteolipídica o PLP (de su denominación en inglés, proteolipid protein),
la αB-cristalina, la transaldolasa , las fosfodiesterasas y otras proteínas no
mielínicas, como lasproteínas de choque térmico(Giovannoni y Hartung, 1996), los
antígenos astrocitarios (proteína S100), algunos antígenos endoteliales y factores
nucleares (Coyle, 1996).
Las moléculas coestimuladoras son tanto citoquinas como moléculas de
35
membrana. La interferencia sobre estos sistemas coestimuladores induce anergia,
dando idea de su relevante papel en la regulación de la respuesta inmune celular.
Estas moléculas son reguladas a su vez en diversos niveles mediante citoquinas
como la IL-4 e INFγ que aumentan su expresión, o como la IL-10 que la disminuye.
Los sistemas coestimuladores más implicados en la patogenia de la esclerosis
múltiple, son la vía de la familia de moléculas CD28/ CTLA4-CD80/CD86
(B7.1/B7.2) y el sistema CD40-CD40L En las lesiones agudas se ha encontrado
aumento en la expresión de CD80(B7.1), CD86(B7.2) y CD40L(Martinez-Cáceres,
1998).
Una vez constituido el complejo trimolecular (receptor de la célula T o RCT, el
antígeno y la molécula HLA clase II), las células T que son de fenotipo colaborador
CD4+ tipo 1 (Th1) producen citoquinas proinflamatorias (interferón γ, TNF-α, IL-1,
IL-2, IL-12) y quimioquinas, que inducen proliferación clonal de células T y que
atraen a los macrófagos y a la microglía, activándolos, con lo que se pone en
marcha la inflamación. Los linfocitos T colaboradores tipo 2 (Th-2) liberan
citoquinas antiinflamatorias (IL4, IL-6, IL10, TGF) que tienden a regular a la baja el
estado proinflamatorio del sistema inmune, pero que además inducen la
proliferación de células B y la consecuente elaboración de anticuerpos por parte de
éstas. El equilibrio entre las distintas citoquinas y de sus concentraciones
determina, en gran medida, el sentido de la reacción inmune de todo el proceso.
Además, los linfocitos T supresores citotóxicos (CD8+) y las células T que
expresan el receptor de los linfocitos asesinos naturales o células NKT (del inglés,
natural killer T cells), producen la disminución de la proliferación de los linfocitos T
colaboradores (respuesta antiergotípica), así como inhibición de su activación
(respuesta antiidiotípica), contribuyendo de este modo a la contrarregulación de la
inflamación (Martino y Hartung, 1999; Navikas et al, 1996).
La acción combinada de cuatro citoquinas proinflamatorias (IFNγ, TN-α, IL-2 e IL6)
determina la activación de la mayoría de los linfocitos T periféricos, al promover
una elevación sostenida del calcio intracelular por medio de dos caminos de señal
independientes. Este mecanismo de activación de las células T es independiente
del reconocimiento de los antígenos mielínicos por el TCR, y se cree que puede
36
CÉLULA T
CÉLULA presentadora de Ag- APC
RCT
Molécula Clase II
CD5CD2
ICAM-1CD28CTLA-4
CD4 CD40LCD27
LFA-1CD45
CD40ICAM-1CD70
CD45
LFA-3
LFA-1B7.2
B7.1
Ag
CD72
Fas
FasLFas
FasL TRAIL
TRAIL R2
TRAIL R2
TRAIL
contribuir al reclutamiento de linfocitos T periféricos hacia el SNC inflamado
(Martino et al, 1998).
Figura 11. Complejo trimolecular. Se aprecia la célula T con su receptor (RCT), el antígeno (Ag), la
molécula CMH de clase II en la pared de la célula presentadora de antígeno (APC) y las moléculas
coestimuladoras.
Inmunidad humoral:
Existen muchas evidencias en la EM que sugieren que los anticuerpos pueden
contribuir a la patogenia de la enfermedad. En primer lugar, la EM se caracteriza y
se diagnostica, por la existencia de síntesis intratecal de IgG, y se evidencian
grandes cantidades de ARNm IgG en las placas cerebrales de pacientes de EM, que
están ausentes en los normales. En segundo lugar, las células B son más
abundantes en las lesiones activas en las que ocurre desmielinización. En tercer
lugar, hay evidencias directas de la inducción de mecanismos efectores mediados
por anticuerpo en las lesiones de EM. La deposición de IgG en los bordes de las
lesiones en desmielinización activa se correlaciona con la presencia de fragmentos
y complejos de complemento activado.
37
La activación de las células B puede ocurrir por antígenos extraños o propios, ya sea
por un efecto colateral inducido por citoquinas durante el proceso inflamatorio o por
superantígenos. Las IgG del LCR de los pacientes con EM muestran BO, lo que
indica que sólo un número limitado de clones de células B contribuye a la IgG
elevada en el LCR. Además, el análisis en el LCR de pacientes de EM, de las
secuencias de la región variable de la IgG, ha mostrado una alta frecuencia de
células B de memoria expandidas clonalmente que expresan el tipo 4 de cadena
pesada en esta región (Qin et al, 1998) y lo mismo ocurre en las lesiones de EM
(Owens et al, 1998; Baranzini et al, 1999), lo que sugiere la selección por un
determinado antígeno.
Lo más probable es que en primer lugar intervengan las células T, iniciando el
proceso inflamatorio, y posteriormente las células B (que en condiciones normales
no pueden atravesar la barrera hematoencefálica - BHE) y otros elementos
presentes en la sangre, como anticuerpos y complemento, pasan a través de la BHE
al SNC y participan en la respuesta inmunológica.
Las células B y los anticuerpos pueden contribuir a la patogenia de la EM de varias
maneras. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos
para las células T autorreactivas. En apoyo de esta hipótesis está la observación de
que en la especificidad epitópica de los anticuerpos generados durante la EAE, los
epítopos encefalitogénicos de la célula T, y los epítopos inmunodominantes de las
células B y en humanos, con frecuencia se solapan (Wang y Fujinami, 1997;
Wucherpfennig et al, 1997). Por otra parte, las células B proveen coestimulación a
las células T autorreactivas. Además, las células B y la IgG ligada a los tejidos
pueden reclutar células T autorreactivas hacia el SNC (Lou et al, 2000).
Células T idiotipo-específicas pueden activar a la IgG del LCR, y además, estas
células T pueden sostener a las células T que producen tales idiotipos (Holmoy et al,
2003).
La contribución más importante a la patogenia de la EM, por parte de las células B,
parece ser la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra la mielina,
contra sus componentes, que contribuirían a la destrucción de la misma dentro de
38
las placas. Así, en los pacientes con EM se encuentran anticuerpos anti-MBP, anti-
MOG, anti-MAG, anti- 2’-3’-nucleótido cíclico 3’-fosfodiesterasa o CNPasa, anti-
proteína de superficie del precursor del oligodendrocito o AN-2 y otros.
En 1959 Bornstein et al demostraron que los factores humorales pueden jugar un
papel en la desmielinización inducida por inflamación, al comprobar in vitro la
existencia de actividad desmielinizante de un factor presente en el suero, que más
tarde fue identificado como una IgG específica para mielina.
Los estudios histopatológicos de tejido del SNC y del LCR reforzaron esta hipótesis
al detectar en las placas y en las áreas de desmielinización activas células B, células
plasmáticas, y anticuerpos específicos para mielina (Esiri, 1977; Mattson et al, 1980)
y complemento (Storch et al, 1998).
Los anticuerpos pueden causar desmielinización por medio de facilitación de la
fagocitosis tras opsonización de la mielina (Trotter et al, 1986; Van der Laan et al,
1996). Otro mecanismo de desmielinización mediado por anticuerpos tiene lugar a
través de la activación del complemento, dando lugar a la deposición del complejo
de ataque a la membrana y a la citolisis mediada por complemento (Mead et al,
2002). La discapacidad neurológica y la concentración del complemento en el LCR
se correlacionan en la EM. El potencial desmielinizante de los anticuerpos se ha
correlacionado en la EAE con la fijación de complemento y se ha demostrado que el
receptor soluble del complemento inhibe la gravedad de la EAE.
La especificidad o especificidades de los anticuerpos del LCR en la EM queda aún
por determinarse (Archelos et al, 2000; Cross et al, 2001). Es más, la mayoría de las
BO del LCR no están dirigidas contra los componentes mayores de la mielina (Troter
y Rust, 1989) sino contra agentes infecciosos (Sindic, 1994).
Asumiendo un papel patogénico para los autoanticuerpos en la EM, la búsqueda de
autoantígenos se ha enfocado en las proteínas mielínicas y otros componentes del
SNC. No se ha establecido una contribución patogénica de los anticuerpos
específicos contra MBP en la EAE, y es controvertida en la EM. Aunque algunos
estudios enfatizan la relevancia de los anticuerpos contra MBP (Warren y Catz,
39
1993; Reindl et al, 1999), otros no confirman estos datos. La realización de cribajes
no sesgados de librerías de antígenos con las IgG del LCR no ha identificado
epítopos de MBP (Cortese et al, 1996) . Estos resultados contradictorios pueden ser
debidos tanto a consideraciones técnicas como a las interacciones de baja afinidad
de estos anticuerpos (O'Connor et al, 2003). Se han detectado en el LCR de
pacientes de EM números elevados de células B que segregan anticuerpos anti-PLP
(Sun et al, 1991), siendo, además, aquellos pacientes que tienen respuesta
prominente anti-PLPdistintos a los que desarrollan anticuerpos anti MBP. Se han
descrito IgG contra componentes menores de la mielina. El MOG es el autoantígeno
candidato más interesante de células B en la EM.
Los anticuerpos anti-MOG son capaces de causar destrucción de la mielina en la
EAE (Schuesener et al, 1987; Linington et al, 1988), en contraste con los anticuerpos
anti-MBP o anti-PLP (Genain et al, 1995). Estos anticuerpos también se han hallado,
en las lesiones de EM humanas. La respuesta de células B a MOG está aumentada
en la EM (Sun et al, 1991). Los anticuerpos anti-MOG en los pacientes con un primer
episodio de afectación del SNC y lesiones en RM son predictores de brotes
subsecuentes y diagnóstico definitivo de EM (Berger et al, 2003); sin embargo,
debido a que,con frecuencia, también están presentes en los controles su papel
sigue siendo controvertido.
Por tanto, y a modo de resumen, habría que concluir que los anticuerpos
producirían la desmielinización mediante: a) la citotoxicidad mediada por células
dependientes de antígeno; b) la activación del complemento, que pondría en
marcha el complejo de ataque a la membrana; c) la opsonización de la mielina que
promueve la fagocitosis mediante los macrófagos; y d) la atracción de los
macrófagos y microglía, que liberarían sustancias mielotóxicas. Además, la unión
de los anticuerpos al nodo de Ranvier o a sus cercanías podría impedir la
conducción nerviosa; por último, también hay que considerar que los anticuerpos
podrían interferir con el proceso de remielinización interrumpiendo el reclutamiento
de los precursores de los oligodendrocitos (Kieseir et al, 1999; Brosnan y Raine,
1996; Hartung y Rieckmann, 1997; Lassmann, 1997; Rodriguez y Lucchinetti, 1999;
40
French-Constant, 1994; Hartung, 1995).
Algunos autores han sugerido que la inflamación mediada por mecanismos
humorales podría ejercer, a su vez, un efecto beneficioso en la EM, y que los
autoanticuerpos producidos por células B CD5+ podrían desempeñar alguna
función en la promoción de la remielinización, a través de mecanismos
inmunomoduladores todavía desconocidos, así como en la prevención del daño
axonal mediante la síntesis, por las células B activadas, del factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF) (Stadelmann et al, 2002).
Interesantemente, los anticuerpos pueden también jugar papeles beneficiosos de
otras dos maneras. Pueden inclinar la secreción celular del patrón de citoquinas
hacia una respuesta de perfil Th-2, que estimulará mas específicamente la
diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas y la producción de
anticuerpos (Saoudi et al, 1995) y, además, los anticuerpos contra componentes del
SNC (Ej: Nogo-A), pueden acelerar la reparación de la mielina. Se ha observado que
los anticuerpos IgM contra ciertos antígenos del SNC aumentan la remielinización en
diferentes modelos animales (Rodriguez y Lennon, 1990). Además, otra evidencia
del papel beneficioso de los anticuerpos surge del uso de mezclas de IgG en el
tratamiento de la EM, donde actúan por medio de diversos mecanismos, incluyendo
el bloqueo del receptor Fc para dicha fracción de las inmunoglobulinas, la
inactivación de las citoquinas, la inhibición del complemento, el bloqueo de CD4 y
del CMH, así como la modulación de la apoptosis (Achiron et al, 1998).
1.7.3 Sistema inmune innato
Hasta ahora hemos analizado los mecanismos de la respuesta celular y humoral
que intervienen en el proceso patogénico, pero finalmente, a estos mecanismos se
une la respuesta del sistema inmune innato, con una importante respuesta efectora
de carácter molecular, ya sea dependiente o independiente de receptor, que
acabará dañando a los oligodendrocitos.
41
Mediadores moleculares del daño a los oligodendrocitos
Además de los mecanismos celulares y humorales citados previamente, los
oligodendrocitos, como espectadores inocentes de la reacción inflamatoria, podrían
ser dañados por mecanismos efectores moleculares independientes de receptor y
dependientes de receptor del sistema inmune innato. Entre los mecanismos
moleculares independientes de receptor están el estrés oxidativo, la
excitotoxicidad, las proteasas y el sistema perforina/granzima.
Mecanismos moleculares independientes de receptor: el estrés oxidativo y
excitotoxicidad
Los macrófagos/microglía estimulados producen sustancias potencialmente tóxicas
como las proteína quinasas, los radicales libres, el óxido nítrico y el TNF-α que
podrían desempeñar algún papel en la desmielinización, actuando directamente
contra la mielina o contra los oligodendrocitos (peroxidación lipídica, inhibición de la
cadena respiratoria mitocondrial, daño axonal e inhibición de diversos enzimas
intracelulares), que tienen una capacidad de defensa antioxidante mermada, en
comparación con otras células del SNC como los astrocitos o la microglía. El óxido
nítrico y sus derivados pueden causar también bloqueo de la conducción axonal. La
peroxidación lipídica produce la liberación de componentes de la membrana
celular, como el ácido araquidónico, que se convertirá en leucotrienos y
prostaglandinas que perpetuarían el proceso inflamatorio y desmielinizante (Smith
et al, 1999).
Por otra parte, las células inmunitarias activadas producen grandes cantidades de
glutamato que activan mecanismos de excitotoxicidad, mediados por los receptores
AMPA/kainato del glutamato, lo que produce un metabolismo anormal del
glutamato, que está implicado en la muerte neuronal y de los oligodendrocitos (Pitt
et al, 2000; Werner et al, 2000 y 2001).
42
El estrés oxidativo y la excitotoxicidad, originan un aumento del Ca++ libre
intracelular e intramitocondrial, dando lugar a fracaso de la fosforilación oxidativa, la
apertura de poros proteináceos no selectivos en la membrana mitocondrial interna,
colapso bioenergético (con disminución de la síntesis de ATP), la rotura del balance
redox y sobreproducción mitocondrial de especies reactivas de oxígeno y de
nitrógeno (particularmente óxido nítrico); además, las mitocondrias liberan
moléculas proapoptóticas, contribuyendo al daño final.
Mecanismos moleculares independientes del receptor: las proteasas y el
sistema perforina/granzima
Otro mecanismo molecular independiente de receptor lo constituyen las células T
activadas, que producen: a) TNF-β o linfotoxina, que induce la apoptosis de los
oligodendrocitos; b) perforinas, que dan lugar a un aumento del calcio intracelular y
a la formación de poros en los oligodendrocitos y a su muerte; y c) calpaína, una
proteasa activada con el calcio que ha sido implicada en la degradación de la
mielina. La mayor parte de las células linfoides citotóxicas (al menos in vitro),
utilizan mecanismos no dependientes del receptor, presumiblemente el sistema
perforina/granzima. El sistema perforina /granzima es el mediador predominante de
la citotoxicidad inducida por las células T α/β, T γ/δ, y células NK (los linfocitos
asesinos naturales, NK, del inglés natural killer) (Pouly et al, 2000).
Mecanismos moleculares dependientes del receptor
Los mecanismos efectores moleculares de desmielinización también pueden ser
dependientes de receptor, mediados por receptores de muerte celular (miembros
de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral), el CD95/Fas y el
TNF-R1. Existen dos vías principales por las que los fenómenos de apoptosis
pueden tener un papel en la EM (Zipp, 2000). En primer lugar, la apoptosis de los
oligodendrocitos puede contribuir a los fenómenos de desmielinización y, en
segundo lugar, la activación de las células T va seguida normalmente de la “muerte
celular inducida por activación”, mecanismo fisiológico usado para limitar la
43
respuesta inmunitaria, de modo que fallos en este mecanismo apoptótico
contribuirían a la autoinmunidad. La apoptosis es el efecto final de una cadena de
acontecimientos intracelulares que pueden ser activados por diversos receptores
de la superficie celular, de los cuales los más importantes pertenecen a la familia
de los receptores de factor de necrosis tumoral (TNF). De entre ellos, el receptor
celular Fas (CD95) con su ligando Fas L(CD154), constituye el complejo esencial
para la apoptosis en las células T activadas.
Otros miembros importantes de la familia de receptores TNF, son el receptor 2 del
ligando inductor de apoptosis relacionado con el TNF (TRAIL-R2 DR5 killer o
TRICK) y los receptores de TNF, p55 y p75. Todos contienen una “secuencia letal”
en su cola citoplasmática que les une a las caspasas, un grupo de proteasas de
cisteína destructivas. La señal generada por la unión del receptor TNF a su ligando
activa la cascada de las caspasas, culminando en la fragmentación del ADN
nuclear y en la autodestrucción celular programada o apoptosis.
Las remisiones en la EM podrían ser provocadas por la eliminación de las células
inflamatorias del SNC a través de las vías de los receptores Fas, TRAIL R2 o TNF
p55/p75, o bien, por el contrario, los brotes de EM podrían ser el resultado de la
muerte de los oligodendrocitos a través de los receptores Fas (Segal et al, 2000,
Comi et al, 2000; Huang et al, 2000, Jordan et al, 2000).
La “muerte celular inducida por activación” de las células T puede fallar por dos
tipos de problemas genéticamente determinados, a saber: bien por alteraciones de
las células presentadoras de antígenos del SNC (iniciadas desde el espacio
extracelular, en superficie, con disminución de la expresión del Fas L, o incremento
de la capacidad coestimuladora, o alteraciones de las células T que presenten
hipoactividad de las vías de apoptosis mediada por el receptor Fas), o bien a nivel
intracelular propiamente dicho, por hiperactividad de la familia de proteínas
antiapoptóticas relacionadas con Bcl- 2, que actúan como punto regulador entre las
caspasas y la disfunción mitocondrial.
44
Células T Moléculas de Adhesión Metaloproteasas Quimioquinas Complejo trimolecular Antígeno RCT CMH clase II M. coestimuladoras Citoquinas Células B -Anticuerpos Complemento Macrófagos Mediadores inflamación Astrocitos
Th 1 Th 2
Ts
IFNγ IL1 IL2, IL12, TNFα/β
IL4 IL5
IL4 IL10
IL1 TNFα
IL1 TNFα/β
IFNγ
E-selectina
L-selectina VCAM-1/ VLA-4 VLA-4 LFA-1
ICAM-1/LFA-1
MMPs
Acantimielina
C. Plasmática
Linf. B
MΦ
Astrocito
TNFα /β , IL1, NO, NO2, O2, OH
Complemento, proteasas, eicosanoides
MΦ
CPA Th
T policlonal
IFNγ
NeuronaMielina
Endotelio
Th 3
TGFβ
Quimiocinas
Figura 12. Patogenia de la esclerosis múltiple.
1.7.4 Defectos primarios de los oligodendrocitos o de la oligodendrogénesis
La desmielinización puede ser también consecuencia de defectos primarios de los
oligodendrocitos o de la oligodendrogénesis. Se han propuesto varios mecanismos
para explicar la inestabilidad metabólica de los oligodendrocitos inducida por una
infección viral o por defectos en la regulación de los genes responsables de la
síntesis de la mielina, que originarían una oligodendropatía “dying-back” con
degeneración axonal, presente en el patrón III de las lesiones de EM, o una
distrofia del oligodendrocito, manifestada por una pérdida selectiva de la
glucoproteína asociada a la mielina (MAG). No obstante, las consecuencias de la
patogenia oligodendrocitaria sobre la patogenia de la desmielinización están aún
por definir claramente (Hemmer et al, 2002).
Independientemente de la existencia de una alteración primaria del oligodendrocito,
en las placas de EM se demuestra la muerte de los oligodendrocitos por
mecanismos de necrosis o de apoptosis, y continúa el debate sobre si es la vaina
de mielina o el oligodendrocito la diana inicial patogénica en la EM.
45
La remielinización
La remielinización de las placas agudas da lugar a la formación de placas
sombreadas con finas vainas de mielina; puede aparecer de forma precoz e incluso
al mismo tiempo que la desmielinización. Los oligodendrocitos maduros son unas
células con poca capacidad para proliferar, por lo que esta remielinización se
realizaría fundamentalmente a partir de las células progenitoras del oligodendrocito
(OA2), que aparecen en elevado número rodeando las lesiones de
desmielinización. Estas células precursoras requieren, para sobrevivir, los factores
de crecimiento adecuados.
En la EM, la remielinización es incompleta. Existen varias explicaciones posibles
para este fenómeno, basadas en que los episodios repetidos de desmielinización
producirían la depleción de OA2. No obstante, se ha comprobado recientemente
que la remielinización no se encuentra limitada por la ausencia de precursores de
los oligodendrocitos o por su capacidad potencial de generar oligodendrocitos. Es
posible también que la muerte de los OA2 se produzca por falta de los factores de
crecimiento específicos (factor de crecimiento derivado de plaquetas, PDGF, del
inglés, platelet-derived growth factor; factor de crecimiento de fibroblastos bFGF,
del inglés basic fibroblast growth factor; factor de crecimiento 1 tipo insulina IGF-1,
del inglés, insulin-like growth factor 1), por la existencia de una señal inhibitoria
especifica de la remielinización, o bien porque la presencia de axones alterados
podría inhibir por si misma la mielinización. También la hiperplasia astrocitaria,
presente en las lesiones de EM, podría inhibir la migración de OA2.
Ciertos factores de crecimiento endógenos (PDGF o el factor neurotrófico
ciliar,CNTF, del inglés, ciliary neurotrophic factor) no sólo promueven la
remielinización, sino que además pueden inhibir la lesión oligodendrocitíca
mediada por TNF-α; una serie de autoanticuerpos dirigidos contra antígenos del
SNC son capaces de promover la remielinización en los modelos experimentales
virales (Asakura y Rodriguez, 1998). Así pues, parece existir una interacción
dinámica entre los factores patogénicos y reparadores dentro de la lesión evolutiva
de EM. Incluso, un estudio experimental reciente con ratas Taipei que son
46
mutantes para la mielina y muestran una desmielinización progresiva, concluye que
la inflamación promueve la remielinización en las placas de desmielinización de EM
(Foote y Blakemoore, 2005), de modo que de nuevo la inflamación podría no tener
sólo la vertiente perjudicial que conocemos y este aspecto deberá ser estudiado
más en profundidad.
La gliosis
Desde las primeras descripciones anatomopatológicas de la esclerosis múltiple, se
reconoce que existe gliosis en las placas crónicas de EM. Sin embargo,
recientemente comienza a reconocerse que parece existir gliosis desde fases
tempranas de la enfermedad, reflejada en una actividad metabólica anormal en
todas las placas de EM, desde el principio de la enfermedad hasta fases más
avanzadas. Los niveles incrementados de creatinina y colina detectados mediante
espectroscopia sugieren que existe: a) gliosis activa e intentos de remielinización
en las lesiones detectadas con resonancia magnética T1; y b) recambio de
membranas con incremento de la celularidad (gliosis e inflamación) en la sustancia
blanca aparentemente normal (He et al, 2005).
Es posible que la gliosis sea uno de los aspectos más interesantes del futuro de la
investigación en la EM, ya que la misma, una vez que aparece sería uno de los
mecanismos que impiden la remielinización y contribuye así a la progresión de la
enfermedad.
El daño axonal
Los mecanismos patogénicos de la destrucción axonal no se conocen bien, se
sabe que la lesión puede aparecer en fases tempranas de la enfermedad, y que
estaría relacionada con la intensidad del proceso inflamatorio en las lesiones
activas de desmielinización (Kornek et al, 2000). Sin embargo, la lesión axonal
podría ser en parte independiente de la actividad desmielinizante, y podrían estar
involucrados en ella mecanismos patogénicos diferentes.
47
El daño axonal estructural puede ser secundario a los defectos funcionales (como
el bloqueo de la conducción axonal), inducidos por sustancias endógenas como las
excitotoxinas macrofágicas (a través de los receptores de glutamato y el óxido
nítrico presentes en las placas de EM), como efecto colateral o como parte de un
proceso activo destructivo dirigido contra el axón. Por otro lado, la degeneración
axonal podría formar parte de una respuesta fisiológica a la desmielinización
permanente, puesto que la mielinización facilita señales tróficas extrínsecas a los
axones (Ferguson et al, 1997; Trapp et al, 1998). A su vez, la actividad neuronal ha
demostrado ser crucial en la regulación de la reactividad inmunitaria en el SNC,
suprimiendo de forma activa la expresión de las moléculas HLA gliales y la
producción de citoquinas en los tejidos cerebrales; por ello, la alteración de la
función axonal podría producir una hiperactividad del sistema inmunitario en las
lesiones de EM donde existe degeneración axonal, que incrementaría los daños
producidos por la enfermedad (Wekerle, 1998, Neumann et al, 1998).
Un grupo de investigadores (Alcazar et al, 2000) han informado de la existencia de
factores solubles en el LCR de pacientes con formas agresivas de EM que inducen
rotura de los axones y apoptosis neuronal en cultivos celulares. Estos hallazgos no
estaban presentes en los casos más benignos de EM.
Los niveles de neurofilamentos ligeros (NFL) están elevados en el LCR de pacientes
de EM y estos niveles se correlacionan con la progresión de la EM y con marcadores
de RM de daño axonal (Silber et al, 2002) pudiendo actuar aquellos como un
marcador de daño axonal y de progresión de la enfermedad. Otro grupo de
investigadores ha demostrado que los niveles de NFL y de la proteína acída fibrilar
glial (GFAP, del inglés, glial fibrillary acidic protein) están elevados en el LCR de
pacientes con EM y que se correlacionan con la actividad de la enfermedad y,
particularmente, los de NFL con el grado de inflamación (Norgren et al, 2004;
Gonsette, 2001).
Un aspecto fundamental de la EM es el paso de la forma clínica más precoz y
clásica de presentación de la enfermedad, con períodos de afectación neurológica
recurrentes que alternan con remisiones (recurrente-remitente, RR), a una forma en
48
la que el deterioro neurológico es progresivo y con frecuencia acelerado. Durante la
evolución de la enfermedad, se producen cambios en las características
inmunitarias de los pacientes, que están relacionados con el cambio de fase clínica.
Como diferencia fundamental se observa que, durante la fase RR, la reacción
inflamatoria presente en las lesiones de EM es muy frecuente y está compuesta
mayoritariamente de células T CD4+ y, en menor, proporción, de células B y
macrófagos, y puede ser detectada mediante RM realzada con gadolinio, mientras
que la inflamación es infrecuente durante la fase progresiva de la enfermedad.
Durante este período, las células T CD4+ serán escasas, y se encontrarán células
B y macrófagos en la mayor parte de la lesión.
Así pues, la fase RR presenta una reacción inmunológica de tipo celular
predominante, mediada por células, citoquinas y productos oxidantes, y la
inflamación durante fase progresiva tiene mayor carácter humoral, y está mediada
por anticuerpos y citoquinas. Así mismo, encontramos que la lesión de la BHE es
transitoria y aguda durante la fase RR y que la lesión de la BHE, aunque escasa,
será permanente en la fase progresiva. Todos estos cambios pueden estar
relacionados con una modificación de los antígenos implicados en una y otra fase
de la EM, pues en la fase RR los antígenos implicados pertenecen a la mielina,
mientras que en la fase progresiva serían antígenos axonales más que mielínicos
los implicados en su patogenia.(Gonsette, 2001)
En la actualidad no disponemos de marcadores inmunológicos específicos para
identificar las características clínicas de la EM. Un estudio ha realizado medidas por
RT-PCR (del inglés, reverse transcription - RT- polymerase chain reaction - PCR) a
tiempo real de 25 moléculas inmunológicamente activas en células mononucleares
de sangre periférica ó PBMC (de su denominación en inglés, peripheral blood
mononuclear cells) de 198 pacientes de EM aplicando un análisis estadístico
multivariante y encontraron que la medición combinada de los niveles de IL-1β, TGF-
α, CCL20 y CCR3 era capaz de distinguir los enfermos de EM de los controles
sanos los niveles combinados de CXCR5, CCL5 y CCR3 identificaban a los
pacientes con EM PP, y los niveles combinados de TNF-α, IL-10, CXCL10 y CCR3
diferenciaban a los pacientes con EM RR. Estas detecciones podrían representar
49
una estrategia útil para la identificación de marcadores periféricos de formas clínicas
y fases de la enfermedad y probablemente de actividad de la misma (Furlan et al,
2005).
1.8 ÁCIDO LISOFOSFATÍDICO (LPA)
Los lisofosfolípidos (LPL, del inglés, lysophospholipids) son metabolitos que están
presentes en los seres vivos, pudiendo alguno de ellos desempeñar una doble
función. Por una parte forman parte de la síntesis de fosfolípidos de membrana y, a
la vez, pueden actuar como moléculas bioactivas capaces de llevar a cabo una
amplia variedad de procesos biológicos a través de receptores específicos
acoplados a proteínas G (GPCR, de su denominación en inglés, G protein-coupled
receptors). Los lisofosfolípidos mejor caracterizados que intervienen en procesos de
señalización son el ácido lisofosfatídico (LPA, del inglés, lysophosphatidic acid) y la
esfingosina 1-fosfato (S1P, del inglés, sphingosine 1-phosphate). Sin embargo,
aunque los papeles que desempeñaban en los diferentes procesos habían sido
estudiados durante décadas, no fue hasta el descubrimiento de nuevos receptores
de alta afinidad por ellos cuando se mejoró nuestra comprensión acerca de las vías
de señalización en las que se hayan implicados. La amplia expresión de receptores
LP, acoplados a una gran variedad de subtipos de proteína G, permite la regulación
de multitud de procesos celulares de relevancia fisiológica, destacando, entre ellos,
por su impacto en, la neurogénesis, esquizofrenia, dolor neuropático, desarrollo
vascular, implantación del óvulo, protección cardiovascular, fibrosis, cicatrización de
heridas, inmunidad y cáncer (revisado en Lin et al, 2010)..
El ácido lisofosfatídico (LPA) es un fosfolípido de señalización implicado en
numerosas acciones biológicas. Su estructura es la de un lípido simple que presenta
un grupo fosfato, una molécula de glicerol y una cadena de ácidos grasos saturados
e insaturados, denominándose genéricamente monoacil-sn-glicerol-3-fosfato
(Tokumura, 1995; Moolenaar, 1999; Tigyi y Parrill, 2003) (Fig. 13). Aunque su
estructura es simple, es capaz de actuar como mediador lipídico intracelular a través
de sus receptores, y está implicado en una multitud de respuestas llevadas a cabo
en una gran variedad de tipos celulares y que incluyen la proliferación celular,
50
inhibición de apoptosis, migración celular, diferenciación, liberación de citoquinas y
quimioquinas, agregación plaquetaria, contracción de la musculatura lisa, y
retracción de neuritas, entre otras (Chun et al, 2002; Ye et al., 2002; Anliker y Chun
2004; Moolenaar et al., 2004; Birgbauer y Chun, 2006; Chun 2005, 2007; Rivera y
Chun, 2008).
Fig. 13. Estructura química del lisofosfolipido de señalización LPA
El estudio del LPA se inició en 1990, al descubrir su capacidad para actuar como
factor de crecimiento en los fibroblastos iniciando una cascada de señalización a
través de receptores acoplados a proteínas G, aún no identificados en aquel tiempo.
Aparte de su papel mitogénico, el LPA es capaz de inducir una larga lista de
respuestas celulares entre las que también se encuentran efectos diferentes a los
proliferativos. Entre ellos podemos encontrar estimulación de la migración celular,
supervivencia, retracción de neuritas y cierre de uniones tipo gap. Esta extensa lista
de actividades del LPA se debe a la gran variedad de proteínas G a las que puede
acoplarse para iniciar su ruta de señalización (Moolenaar, 1999). Además, el LPA no
sólo inicia su señalización a través de las vías clásicas de mensajeros secundarios,
sino que también actúa a través de GTPasas de la familia de Ras y Rho para
controlar la proliferación celular, migración y morfogénesis respectivamente.
51
1.8.1 Distribución y producción de LPA
El LPA es una molécula que puede encontrarse en cantidades significativamente
detectables (nivel ~µM) en numerosos fluidos biológicos tales como suero (Tigyi y
Miledi, 1992; Baker et al., 2000; Sano et al., 2002; Aoki et al., 2002), saliva (Sugiura
et al, 2002), fluido seminal (Hama et al, 2002), fluido folicular (Tokumura et al, 1999)
y líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario (Nakane et al, 2001). De todos
ellos, el suero es la fuente de LPA mejor caracterizada (Tigyi y Miledi, 1992; Baker et
al, 2000; Aoki et al, 2002).
El primer mecanismo propuesto de producción de LPA fue la coagulación
sanguínea. Este mecanismo se sugirió tras observar que los niveles de LPA en
plasma fresco eran mucho menores a los encontrados en suero (Tigyi y Miledi, 1992;
Aoki et al, 2002). Estos datos señalaban que esa mayor concentración del LPA en
suero debía ser producida por las plaquetas. Tras ello, Mauco y colaboradores
demostraron dicha producción por parte de plaquetas humanas tras tratar estas
células con fosfolipasa C (PLC, del inglés, phospholipase C) de Clostridium welchii
(Mauco et al, 1978). La hipótesis propuesta a partir de estos resultados establecía
que el ácido fosfatídico (PA, del inglés, phosphatidic acid) se generaba rápidamente
en las células tratadas con PLC, y que tras ello, las fosfolipasas convertían este PA
a LPA por enzimas tales como la fosfolipasa A1 y fosfolipasa A2 (PLA1 y PLA2,
respectivamente, por su denominación en inglés, phospholipase A). Aparte de ello,
otros dos estudios mostraron que el LPA podía también ser producido por parte de
las plaquetas cuando estas eran activadas mediante trombina (Gerrard JM,
Robinson P, 1989; Eichholtz et al, 1993).
Sin embargo, la cantidad de LPA producido por la vía mediada por plaquetas
resultaba ser demasiado baja en relación a los niveles de LPA encontrado en suero
(nivel µM; Gaits et al, 1997). En esta línea, y para conocer cuánto LPA del suero era
generado por las plaquetas, Aoki y colaboradores usaron anticuerpos anti-plaquetas
52
en ratas con el fin de retirarlas de la sangre. El análisis del suero de estas ratas
reveló que la mitad del LPA sérico era producido de manera dependiente de
plaquetas, aunque sólo el 10% aproximadamente se liberaba por dichas plaquetas
activadas. Por otro lado, las plaquetas activadas eran capaces de producir y liberar
otras formas de lisofosfolípidos tales como lisofosfatidilcolina (LPC, del inglés,
lysophosphatidylcholine), lisofosfatidiletanolamina (LPE, del inglés,
lysophosphatidylethanolamine), y lisofosfatidilserina (LPS, del inglés,
lysophosphatidylserine). Teniendo en cuenta esto, el mismo grupo propuso que a
pesar de que las plaquetas activadas no liberaban grandes cantidades de LPA,
estas tomaban parte en la vía de producción dependiente de plaquetas al producir
otros tipos de lisofosfolípidos mediante las enzimas PLA1 y PLA2, que
subsecuentemente serían convertidos a LPA por enzimas plasmáticas, tales como la
lisofosfolipasa D (LysoPLD, del inglés, lysophospholipase D) (Aoki et al, 2002). En el
caso del suero humano, también se ha propuesto un mecanismo similar (Sano et al,
2002).
En concordancia con estos resultados, alrededor de la mitad del LPA sérico debe ser
producido por alguna otra vía independiente de plaquetas (Aoki et al, 2002), ya que
el LPA se genera en el plasma cuando este es incubado libre de células durante
varias horas. Estos últimos resultados indican claramente que el LPA puede ser
producido a través de otros lisofosfolípidos, particularmente la LPC, presente a altas
concentraciones en el plasma (Tokumura et al, 1986). Esta ruta podría explicar
entonces la parte del LPA sérico independiente de plaquetas.
En resumen, podemos concluir que, al menos, se conocen dos vías de producción
de LPA: mientras en suero y en plasma (también en adipocitos) el LPA es generado
principalmente a partir de lisofosfolípidos (LPL) , en plaquetas y en células
cancerígenas, el LPA es producido a partir de ácido fosfatídico.
En cada ruta, se requieren al menos dos actividades de fosfolipasas. En la primera
ruta, están implicadas las actividades de las PLA1/PLA2 y la lisofosfolipasa D
53
(lysoPLD). En ella inicialmente se producen los lisofosfolípidos a través de PLA1 y
PLA2, y más tarde, una enzima plasmática con actividad lisofosfolipasa D, la
autotaxina (ATX), produce LPA a partir de estos lisofosfolípidos. Por otro lado, en la
segunda ruta, el ácido fosfatídico es el primero generado a partir de fosfolípidos o
diacilglicerol mediante la acción de la fosfolipasa D (PLD, del inglés, phospholipase
D) o la diacilglicerol quinasa (DGK, del inglés, diacylglycerol kinase) para,
posteriormente, deacilarse a través de las enzimas PLA1 y PLA2 para producir
finalmente LPA (Fig. 14) (Aoki et al, 2002; 2008). Sin embargo, la cantidad de LPA
producido desde ácido fosfatídico parece ser mucho más baja, a causa de que éste
es un componente minoritario de los fosfolípidos celulares en muchos tipos de
células. No obstante, esta ruta puede resultar muy importante ya que se genera LPA
rápidamente como respuesta a varios estímulos, y ello puede jugar un papel
fundamental en distintos microambientes.
54
Fig 14. Rutas de producción de LPA. (A) Ruta PLA1/PLA2-lisoPLD; y (B) Ruta
PLD-PLA1/PLA2 (Aoki et al, 2008)
Es importante destacar que las concentraciones de LPA están, por tanto, altamente
reguladas, ya que no sólo puede inducirse su producción, como se ha mencionado,
55
sino que también ésta puede ser inhibida a través de inhibidores de PLA2 (Shen et
al, 1998; Eder et al, 2000). Varios estudios señalan que también los agonistas de
LPA, como el éster de forbol (Shen et al, 1998) la bombesina (Xie et al, 2002) o el
propio LPA (Eder et al, 2000), pueden inducir y estimular igualmente la producción
de LPA.
Al margen de lo anterior, el LPA es también un importante producto intermediario de
la ruta sintética del fosfolípidos y triacilgliceroles en muchos tipos celulares de varias
especies, incluyendo organismos superiores e inferiores, por lo que puede
encontrarse tanto fuera como dentro de la célula. Esta ruta biosintética tiene lugar
intracelularmente en el retículo endoplasmático o mitocondrias, allí, una
aciltransferasa produce LPA por acilación de glicerol-3-fosfato (Dircks y Sul, 1999).
Este LPA a su vez es convertido a PA por la LPA aciltransferasa y después, a otros
fosfolípidos y a triacilglicerol.
1.8.2 Especies de LPA
El LPA que es detectado en suero y producido por las plaquetas no consiste en una
única molécula sino que es una mezcla de varios ácidos grasos. Así, hay especies
del LPA con ácidos grasos saturados (16:0, 18:0) y otros con ácidos grasos
insaturados (16:1, 18:1, 18:2, 20:4), y todos ellos pueden encontrarse tanto en el
suero, como en el plasma y en las plaquetas activadas (Gerrard y Robinson, 1989;
Xiao et al, 2000; Baker et al, 2001) (Fig. 9). En estas últimas se pueden encontrar
varias especies moleculares de LPA con cadenas de ácidos grasos saturados
[estearoil (18:0), palmitoil (16:0)] o insaturadas [oleoil (18:1), linoleoil (18:2),
arachidonoil (20:4) (Gerrard y Robinson; 1989; Tigyi y Miledi 1992). Estos diferentes
ácidos grasos pueden unirse a las posiciones sn-1 o sn-2 del esqueleto de glicerol;
además, una pequeña proporción de glicerofosfolípidos naturales contienen un
enlace tipo alquil o alquenil- éter en la posición sn-1 en vez de la unión ester (1-
alquil-2-liso-sn-glicero-3-fosfato y 1-alquenil-2-liso-sn-glicero-3-fosfato) (Fischer et al,
1998; Sugiura et al, 1999). Por tanto, in vivo, pueden estar presentes varias especies
moleculares de LPA y lípidos similares o análogos a LPA.
56
Fig. 15. Diferentes especies de LPA (Bandoh et al, 2000)
De hecho, en cerebros de rata se han encontrado cantidades sustanciales de lípidos
bioactivos potentes como el ácido lisofosfatídico (en forma acil-LPA) (3,73 nmol/g
tejido) y el plasmalógeno alquil-LPA (0,44 nmol/g tejido), siendo las especies
moleculares predominantes las de acil-LPA 18:1, 18:0 y 16:0 (Sugiura et al, 1999).
Los mismo autores sugieren que ambos, tanto el acil como el alquil LPA, juegan
papeles fisiológicos importantes como moléculas de señalización intercelular así
como intermediarios metabólicos en el sistema nervioso, p.ej. para la síntesis del
ligando endógeno del receptor de cannabinoides 2-araquidonoilglicerol, debido a la
importante cantidad de LPA en el cerebro que contiene ácido araquidónico (Sugiura
et al, 1999).
57
Igualmente, es interesante señalar que estas especies de LPA presentan unas
actividades biológicas distintas (Yoshida et al, 2003; Hayashi et al, 2001; Tokumura
et al, 1994; Jalink et al, 1995) posiblemente porque activan de manera diferencial
cada uno de los, hasta la fecha conocidos, seis receptores de LPA (LPA1, LPA2,
LPA3, LPA4, LPA5 y LPA6) (Bandoh et al, 2000). La relación estructura-actividad de
estas moléculas de LPA y sus análogos depende de la célula y del tejido (Sugiura et
al, 1994; Gueguen et al, 1999; Jalink et al, 1995; van Corven et al, 1992; Perkins, et
al, 1994; Tokumura et al, 1978). No obstante, sin que deba tomarse como una
norma estricta, en general, las moléculas de LPA con ácidos insaturados, producidas
por la isoenzima PLA1, son biológicamente más potentes que las especies con un
ácido graso saturado, producidas por la isoenzima PLA2. Por ejemplo, los LPA con
un ácido graso insaturado inducen proliferación y desdiferenciación en las células
musculares lisas tanto in vivo como in vitro, mientras que formas de LPA con ácidos
grasos saturados no son capaces de llevar a cabo estas acciones (Yoshida et al,
2003; Hayashi et al, 2001). Estas observaciones claramente indican el significado
biológico de las especies de LPA in vivo.
1.8.3 Receptores de LPA
El primer receptor identificado de lisofosfolipidos fue el gen de la zona ventricular
1(vzg-1, del inglés, ventricular zone gene 1). Este gen se identificó en 1996 durante
el estudio de la neurogénesis en mamíferos, en el cual se clonó un receptor
huérfano que se había aislado por su expresión en la zona neurogénica de la
corteza cerebral embrionaria (Hecht et al, 1996; Chun et al, 1999; Chun 1999). Este
gen vzg-1 codificaba un receptor acoplado a proteína G que tenía alta afinidad por el
LPA. Basándose en su secuencia de nucleótidos, aparecieron en la base de datos
de secuencias de ADN otros receptores huérfanos o fragmentos de secuencia de
expresión los cuales interactuaban también con LPA o con lisofosfolipidos similares
tales como S1P.
Hasta la fecha se han identificado al menos seis receptores de LPA (LPA1-6)
(revisados en Bandoh et al, 2000; Fukushima et al, 2001; Anliker y Chun 2004; Ishii
et al. 2004; Aoki et al, 2008; Noguchi et al, 2009; Pasternack et al, 2008; Yanagida et
58
al, 2009; Choi et al, 2010) y otros dos receptores adicionales (GPR87 y P2Y10) han
mostrado cierta sensibilidad a LPA (Tabata et al, 2007; Murakami et al, 2008). Tres
de ellos, originalmente denominados EDG-2/VZG-1/rec1.3, EDG-4 (no-mutante) y
EDG-7 están íntimamente relacionados con la familia EDG de receptores de
proteína G (Sanna et al, 2004; Matloubian et al, 2004; Kupperman et al, 2000;
MacLennan et al, 2001). Estos receptores fueron más tarde renombrados siguiendo
la normativa de la IUPHAR (Ishii et al, 2002) recibiendo así los nombres LPA1, LPA2
y LPA3 respectivamente.
Más tarde, se clonó un cuarto receptor en humanos, el LPA4/GPR23/P2Y6. Este
receptor tiene sólo un 20-24 % de identidad de aminoácidos con LPA1, LPA2 y LPA3,
lo cual significa que existe una mayor distancia evolutiva entre LPA4 y los otros
receptores; de hecho, LPA4 se encuentra más relacionado con los receptores de la
familia P2Y GPRC (Candelore et al, 2002) que con la familia EDG. Uno de los
últimos receptores identificados, LPA5, también tiene una secuencia de aminoácidos
bastante diferente, la cual muestra sólo un 35 % aproximadamente de identidad con
LPA4. Por otro lado, el alineamiento de la secuencia de los receptores LPA5 /GPR92
de ratón y de humano mostró una equivalencia del 80 % apuntando que dicho
receptor está filogenéticamente muy bien conservado (Fig. 16).
En resumen, los receptores LPA5 y LPA4 están más relacionados filogenéticamente
entre sí, mientras que los tres primeros (LPA1, LPA2, y LPA3) están más cercanos
unos a otros (Lee et al, 2006). Muy recientemente, un último receptor de LPA
descubierto, el P2Y5 (Pasternak et al, 2008), ha sido denominado LPA6, y se
encuentra también asociado a LPA4-5.
59
Fig 16. Relación filogenética entre los receptores de LPA conocidos y propuestos.
Alternativamente, en algunos tipos celulares, los efectos de LPA fueron
independientes de los receptores GPRC. Esta observación se pudo explicar tras los
resultados que demostraron que el LPA también era capaz de actuar como agonista
transcelular del receptor nuclear gamma activado (PPARγ) (McIntyre et al, 2003).
Volviendo a los receptores GPRC de LPA, estos pueden estar acoplados a
miembros de tres familias de proteínas G: Gαi, Gαq, y Gα12. LPA1 y LPA2 son
conocidos por interactuar con estas tres familias de proteínas G. Mientras LPA3
interactúa con Gαi y Gαq, pero no con proteínas Gα12. Adicionalmente, LPA4 puede
ser una excepción ya que parece acoplarse con un cuarto tipo de familia de
proteínas G, las Gαs.
60
Fig. 17. Rutas de señalización activadas por los cinco receptores de LPA confirmados
(Choi et al, 2010)
En estos receptores, la unión del ligando a su receptor causa un cambio
conformacional de este, induciendo la correspondiente respuesta de la proteína G.
Esta cadena de eventos activa los procesos regulados por estas proteínas G:
I) Activación de Rho via Gα12,13.
II) Activación, via Gαq/11, de fosfolipasa C (PLC) con subsecuente
activación final de protein quinasa C (PKC, del inglés, protein kinase C)
y movilización de Ca2+.
III) Activación, via Gαi/o, mediada, bien por las GTPasas Ras, con cambio
en la actividad de proteína quinasas activadas por mitógeno (MAPK,
del inglés, mitogen-activated protein kinases) o bien, por activación de
fosfoinositol 3-quinasa (PI3K, del inglés, phosphoinositide 3-kinase) con
subsiguiente activación de la serina/teronina quinasa Akt, ambas con
consecuencias en la proliferación, supervivencia y apoptosis
IV) Inhibición/activación, via Gαs, de adenil ciclasa (AC) resultando en la
activación de la acumulación de AMPc y la movilización de Ca2+.
61
En la variedad de estos mecanismos subyacen los múltiples efectos de
lisofosfoslipidos y la diversidad en las respuestas celulares de ellos, (revisado en
Bandoh et al, 2000; Anliker y Chun, 2004; Choi et al, 2008).
Receptor LPA 1; gen Lpar1
Lpar1 fue el primer gen de un receptor de LPA identificado. Este receptor fue
encontrado durante los estudios de desarrollo de la corteza cerebral en ratones.
Estos experimentos se diseñaron para identificar nuevos genes de GPCR asociados
con la neurogénesis (Hecht et al, 1996; Chun et al, 1999; Chun 1999) y el desarrollo
embrionario, y aclarar su papel en la proliferación y diferenciación celular en otros
organismos (Crawford et al, 1993).
El protocolo usado para su aislamiento consistía en la amplificación de fragmentos
de genes GPCR por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de fragmentos de
ADNc de líneas celulares de neuroblastos corticales de ratón inmortalizadas (Chun y
Jaenisch, 1996). Seguidamente, los productos resultantes fueron usados para
identificar por hibridación in situ, genes que tuvieran una expresión enriquecida en la
corteza embrionaria, particularmente en las regiones neurogénicas. Este análisis
permitió clonar este nuevo receptor hasta entonces huérfano, vzg-1, denominado así
por su alta expresión en la zona ventricular de la corteza cerebral embrionaria (Hecht
et al, 1996; Chun et al, 1999; Chun 1999). Actualmente, este nombre ha sido
reemplazado por su nomenclatura funcional, LPA1.
Este gen, Lpar1, se halla localizado en el locus del cromosoma 9q31.3 humano y
en mamíferos ) codifica para una proteína de 41 kDa constituida por 364
aminoácidos, con siete dominios transmembrana, y que comparte homología con
dos receptores conocidos, el receptor de cannabinoides y el de melanocortina (30 %
y 32 % de identidad de aminoácidos, respectivamente). Sin embargo, la mayor
similitud la comparte con otro gen para un receptor huérfano clonado de células
endoteliales humanas edg-1 (37% de identidad de aminoácido) (Hla y Maciag,
1990).
62
Hasta la fecha, en humanos adultos se ha descrito altos niveles de expresión del
ARNm de Lpar1 en cerebro, corazón, colón, intestino delgado, placenta, próstata,
ovario, páncreas, testículos y bazo; y baja expresión en la musculatura esquelética y
el riñón, de manera similar a lo observado en ratones. Por el contrario, casi ningún
transcrito de LPA1 se ha detectado en pulmones ni timo, y está casi completamente
ausente en leucocitos de sangre periférica e hígado (An et al, 1998b).
Por otro lado, la expresión de LPA1 es bien conocida en el sistema nervioso de
ratón, mostrando una alta regulación espacio-temporal durante el desarrollo (Contos
et al, 2000; Fukushima et al, 2001). Mientras que en estadios embrionarios, durante
la neurogénesis cortical, LPA1 se expresa predominantemente en la zona ventricular
(Hecht et al, 1996; Estivill-Torrús et al, 2008), justo antes del nacimiento, los niveles
de expresión de LPA1 descienden en la corteza a la vez que finaliza la fase de
proliferación de los neuroblastos corticales (Hetch et al, 1996). Tras el nacimiento, la
expresión de LPA1 reaparece en el cerebro, asociada al desarrollo de los tractos
mielinizados y coincidiendo con los procesos de mielinización y mostrando su mayor
expresión entre los días postnatales 18 y 21 (Hetch et al, 1996; Weiner et al, 1998).
La ruta de señalización de LPA1 implica tres familias de proteínas G: Gαi, Gαq y
Gα12, y como la mayoría de los receptores de lisofosfolípidos, su cascada de efectos
incluye activación de fosfolipasa C (PLC), movilización de Ca2+, activación de protein
quinasa activada por mitógeno (MAPK) e inhibición de adenil ciclasa (AC). Sin
embargo, Rho también está implicado en la ruta observada para LPA1. En este caso,
la activación de PLC, MAPK y Rho a través de los receptores de LPA y S1P
desencadenan proliferación celular, supervivencia y cambios en la morfología de la
célula, tales como su redondeamiento (Lynch y Macdonald, 2002; Fukushima et al,
2002; Anliker y Chun, 2004). Por otro lado, la 3-fosfoinositol quinasa (PI3K) y su
sustrato Akt también son capaces de aumentar la supervivencia celular (Goetzl et al,
2002; Anliker y Chun, 2004).
Recientemente, el estudio del receptor LPA1 ha mostrado tener un papel importante
en el desarrollo del sistema nervioso (Chun et al, 2002; Anliker y Chun 2004;
Moolenaar et al, 2004; Chun 2005, 2007). Así, como ya se ha mencionado, durante
el desarrollo LPA1 se expresa en células progenitoras neurales sugiriendo una
63
función reguladora en la neurogénesis (Hecht et al, 1996; Estivill-Torrús et al, 2008).
La expresión de LPA1 in vivo no ha sido detectado únicamente en neuronas (Allard
et al, 1998; Tabuchi et al, 2000; Fujiwara et al, 2003; Pilpel y Segal 2006), sino
también en oligodendrocitos (Weiner et al, 1998; Handford et al, 2001), microglia
(Moller et al 2001; Tham et al, 2003) y astrocitos (Shano et al, 2008).
La administración exógena de LPA ha demostrado que las funciones mediadas por
LPA1 incluyen cambios morfológicos en los progenitores neurales (Dubin et al, 1999;
Kingsbury et al, 2003; Fukushima 2004; Fukushima y Morita 2006; Fukushima et al,
2000, 2007). Así mismo, cuando se administra a neuronas hipocampales se ha
demostrado que incrementa la fosforilación de las quinasas de adhesión focal
(Derkinderen et al, 1998), regula la muerte celular (Holtsberg et al, 1998a, b),
mimetiza efectos neurotróficos (Fujiwara et al, 2003) y media cambios sinápticos
asociados a la memoria espacial (Dash et al, 2004). A su vez, también se han
mostrado efectos en los ritmos in vivo debido a la perdida de LPA1 (Cunningham et
al, 2006) y una ganancia en la formación de sinapsis por sobreexpresión de este
receptor (Pilpel y Segal 2006). Además, también se ha observado la presencia de
moduladores de la actividad del ácido lisofosfatídico en hipocampo adulto (Brauer et
al, 2003). Actualmente, se han obtenido para su estudio ratones carentes de cada
uno de los receptores de LPA por disrupción génica (revisado en Choi et al, 2008).
Los estudios de pérdida de función de los receptores usando ratones nulos para
LPA1 o dobles nulos para LPA1/LPA2 sugieren defectos en el comportamiento
mediados a nivel central y alteraciones morfológicas cerebrales menores, aunque la
mutación inicialmente provocó una letalidad perinatal asociada de aproximadamente
el 50 % que puede estar relacionada con un componente del SNC, junto al
desarrollo defectuoso del sistema olfatorio (Contos et al, 2000, 2002; Harrison et al,
2003; Roberts et al, 2005). Recientemente, la propagación de la cepa original de
ratones LPA1-nulos (Contos et al, 2000), ha dado lugar, por parte de nuestro equipo
de investigación, a la obtención espontánea de una cepa estable de estos ratones,
denominada “variante Málaga”. Estos ratones muestran una viabilidad perinatal
mejorada, casi del 100 %, presentan la delección del exon 3 que codifica para el
dominio de unión al receptor, como la original, y, al contrario que las cepas
anteriores, muestra defectos visibles del sistema nervioso central, con una
64
neurogénesis cortical alterada y un aumento de la muerte celular durante el
desarrollo del cerebro que causa una reducción de la celularidad de las capas
corticales en adultos, indicando por primera vez la acción in vivo del LPA1 como
regulador de la neurogénesis cortical como ya se había planteado previamente y
sugiriendo la presencia in vivo de modificadores genéticos que actúan sobre la
expresión del receptor (Estivill-Torrús et al, 2008).
Otros análisis de nuestro equipo sobre dichos animales han demostrado que la
neurogénesis adulta está igualmente afectada. Así, los ratones LPA1-nulos de la
variante Málaga muestran una neurogénesis hipocampal postnatal reducida tanto
bajo condiciones basales como en condiciones de enriquecimiento ambiental
combinada con ejercicio (Matas-Rico et al, 2008). Estos resultados correlacionan
con un comportamiento anómalo mostrado por una incorrecta retención de memoria
espacial, un uso anormal de estrategias de búsqueda, una exploración alterada en
campo abierto y un incremento en las respuestas ansiosas en el laberinto elevado
(Santín et al, 2009). Recientemente también se han caracterizado los procesos
relacionados con la mielinización y que merecen un capítulo aparte, como se
describe más tarde.
Receptor LPA 2; gen Lpar2
Tras identificar el receptor LPA1, se buscaron otros receptores homólogos a él que
también respondieran a LPA. En base a ello, búsquedas con GenBank mostraron
una secuencia genómica humana nueva, previamente denominada edg-4, que
codificaba también para una GPCR con una similitud de aminoácidos con LPA1 del
60 %. Tras ello se aisló su gen homólogo en ratones (desde ADNc y ADN genómico)
y se caracterizó (Contos y Chun, 2000), dándolo a conocer como LPA2.
Este gen Lpar2 predice una secuencia de aminoácidos de 348 residuos y una masa
molecular calculada de 39 kDa. Su estructura consiste en tres exones con un intrón
insertado en el dominio transmenbrana VI, como se observó para Lpar1, indicando
que Lpar1 y Lpar2 fueron derivados de un gen ancestral común. Una de las
características más importantes del gen Lpar2 es la existencia de varias variantes
65
observada en células cancerígenas. Esta característica fue evidente en un gran
número de variaciones de nucleótidos en la región 3´ no traducida (principalmente
por una sustitución de un único nucleótido).
La expresión de LPA2 en ratones adultos es alta en testículos y riñones, baja en
cerebro, corazón, pulmón, bazo, timo y estómago, mientras que casi no se puede
detectar expresión en hígado, musculo e intestino delgado. A diferencia del cerebro
adulto, los cerebros embrionarios muestran altos niveles de LPA2 (Contos et al,
2000; Contos y Chun, 2000; Yang et al, 2002), pero cuando esta expresión se
analiza por western-blot, se pueden observar dos transcritos de diferente peso
molecular (2.8 kb and 7 kb) expresados tanto en estadios embrionario como
neonatales, sin embargo, ninguno de ellos puede ser detectado en adultos (Contos
et al, 2000). Estos resultados también fueron confirmados por estudios con
hibridación in situ, mostrando una expresión de Lpar2 en regiones neuronales
postmitóticas y en la zona ventricular de ratones embrionarios.
La expresión del gen Lpar2 en humanos se detectada fuertemente en testículos y
leucocitos, al igual que en el ratón. Además, cuando se analiza su expresión en
líneas de células linfoides humanas se detectan dos transcritos de distinto peso
molecular (1.8 kb y 8 kb). Por el contrario, los niveles de este receptor en próstata,
bazo, timo y páncreas son moderados. Mientras que en células cancerígenas, se ha
detectado en varios casos una expresión aberrante de Lpar2, lo que apunta a pensar
en su papel promotor de turmores (An et al, 1998a; Choi et al, 2010).
Al igual que LPA1, LPA2 puede acoplarse a proteínas Gαi, Gαq y Gα12 que median la
activación de PLC inducida por LPA, y estimulan el incremento de Ca2+ intracelular y
la producción de inositol fosfato. A su vez, la activación de LPA2 muestra también un
efecto sobre la MAP quinasa y Rho, y la fosforilación de Akt, resultando en procesos
de supervivencia y migración celular. Todo esto sugiere que la señalización de LPA2
puede ser un factor potencial para la metástasis del cáncer (Yang et al, 2002; Anliker
y Chun, 2004; Choi et al, 2010). En todos estos casos, la concentración efectiva
estimada para poder llevar a cabo esta gran variedad de respuestas es también, al
igual del caso de LPA1, en el rango nanomolar. Estas propiedades, demuestran que
LPA2 es un receptor multifuncional y funcionalmente similar a LPA1.
66
1.8.4 Ácido lisofosfatídico y mielinización
La esclerosis múltiple es una enfermedad que cursa con componente inflamatorio y
neurodegenerativo, con daño de la mielina. El LPA, como se ha mencionado, es un
lisofosfolípido endógeno bioactivo que media diferentes respuestas celulares) y que
actúa, además de lo mencionado en los apartados anteriores, sobre la glia
mielinizante y los mecanismo inflamatorios, procesos diana de la enfermedad,
principalmente a través de su receptor LPA1, siendo, por tanto, de enorme interés
para el estudio de la patología, conocer la relación exacta de sus funciones en este
sentido.
Los primeros estudios los llevaron a cabo Weiner et al (1998) demostrando una
correlación cercana al 100 % entre la expresión del receptor LPA1, y el inicio de la
expresión de la proteína proteolipídica (PLP), constituyente de la mielina y
expresada exclusivamente en oligodendrocitos maduros. En esta línea se mostró
que eran, precisamente, los oligodendrocitos maduros, mielinizantes, y no los
precursores, no mielinizantes, los que responden a la administración de LPA,
medida ésta en aumento de la concentración de calcio intracelular (Möller et al,
1999). Paralelamente diferentes estudios han demostrado la expresión receptor
LPA1, en cerebro adulto en los tractos mielínicos y en dichas células mielinizantes
(Weiner et al, 1998; Allard et al,1999; Handford et al, 2001). Cervera et al (2002)
también demostraron que el receptor LPA1, se expresaba los tractos mielínicos del
cerebro adulto, en el soma de los oligodendrocitos y en sus fibras mielinizantes
viendo, además, que éste colocalizaba con la expresión de la proteína básica para la
mielina en rata y en el cerebro humano. Los mismos autores observaron la
expresión del receptor era mayor en los oligodendrocitos que en las fibras
mielinizantes, en relación inversa a la de la proteína mielínica. La función del
receptor parece estar ligada a las últimas fases de maduracion oligodendrocítica y
podría estar implicada en la terminación o mantenimiento del proceso de
mielinización (Stankoff et al, 2002).
Sin embargo, todos estos estudios funcionales se realizaron mediante la regulación
farmacológica exógena de las poblaciones celulares afectadas, no siendo hasta
67
ahora, con la disponibilidad de un modelo viable carente del receptor LPA1, cuando
se pone de manifiesto específicamente su papel. Así, los estudios llevados a cabo
recientemente por nuestro grupo han puesto de manifiesto que el efecto del LPA a
través de este receptor es crucial para la correcta maduración de los
oligodendrocitos y la normal mielinización de las fibras nerviosas en el SNC,
participando, además, en el correcto transporte de proteínas constituyentes de la
mielina hacia su destino (García-Díaz, 2010; Estivill-Torrus et al, 2009). En estos
mismos estudios se demuestra que la alteración de dicho transporte en el
oligodendrocito y en ausencia del receptor LPA1, además de generar un patrón
menor y desorganizado de fibras mielínicas, termina por desembocar en la muerte
celular por estrés tras acumulación de las proteínas constituyentes en el retículo
endoplásmico del oligodendrocito, siendo por tanto necesaria la vía mediada por
LPA1 para el correcto proceso de diferenciación y mielinización.
Alternativamente, otros estudios recientes in vitro han mostrado que la
administración exógena de LPA induce en estas células un incremento en la
extensión de las estructuras membranosas y una estimulación de la expresión de
una de las principales proteínas de mielina, la MBP (Nogaroli et al, 2009). Este
efecto es producido en oligodendrocitos mielinizantes, no teniendo el mismo efecto
sobre aquellos con estadios previos de diferenciación.
1.8.5 Ácido lisofosfatídico e inflamación
La inflamación es una respuesta compleja del organismo que implica distintos tipos
de células, componentes del plasma y diversos productos celulares, los cuales tiene
como objetivo principal la reparación de un daño producido. Este daño puede tener
diferentes causas, tales como infección, trauma, isquemia, necrosis, hemorragia o
enfermedad.
La inflamación también implica una respuesta vascular dirigida a incrementar el flujo
sanguíneo al sitio donde se produce. Este incremento de la permeabilidad capilar se
debe a una retracción del endotelio que permite la salida de moléculas y mediadores
68
solubles, así como la migración de linfocitos al sitio de inflamación. Esta respuesta
puede existir en cualquier compartimento vascularizado del cuerpo, incluido el SNC.
La respuesta inflamatoria incluye la participación de diferentes tipos celulares, tales
como neutrófilos, macrófagos, mastocitos, linfocitos, plaquetas, células dendríticas,
células endoteliales y fibroblastos, entre otros. Durante los procesos inflamatorios, la
quimiotaxis es un proceso importante en el reclutamiento de células al sitio de
inflamación. Este reclutamiento de linfocitos implica la presencia de factores
quimiotácticos como las quimioquinas, la expresión de sus receptores en los
leucocitos, la expresión de moléculas de adhesión en leucocitos y endotelio
vascular, una estrecha relación entre leucocitos y endotelio, y finalmente su paso a
través del endotelio hasta llegar al sitio de inflamación (McGeer y McGeer, 2001).
Todo ello forma parte del proceso fisiológico de la inflamación que tiene por objetivo
la reparación del daño.
Sin embargo, algunas veces, si este proceso se extiende descontroladamente, la
inflamación puede agravar el daño en lugar de promover su reparación (Nathan,
2002). Si nos centramos en el SNC, la inflamación es frecuentemente la causa de
este daño en lugar de completar la función de reparación como ocurre en otras
partes del cuerpo. Así, la neuroinflamación es un proceso complejo que implica
células del sistema inmune y del SNC y que, a diferencia de otras partes del cuerpo,
favorece el daño en lugar de repararlo. En este contexto, la esclerosis múltiple es
una de las principales enfermedades en la que interviene la neuroinflamación. En
ella, se produce una ruptura de la barrera hematoencefálica, una importante
infiltración celular en la sustancia blanca y una consecuente desmielinización.
Los mediadores lipídicos en inflamación, son principalmente derivados de células del
sistema inmune como plaquetas, macrófagos, neutrófilos, monocitos, eosinófilos,
mastocitos y algunas otras células de los órganos diana. Su amplio espectro de
acciones incluye la vasoconstricción o vasodilatación, agregación plaquetaria,
reclutamiento y activación de leucocitos, modulación de la producción de citoquinas
por macrófagos y linfocitos, y estimulación de la producción de otros mediadores.
Entre ellos, uno de los mediadores lipídicos más importantes es el LPA (Gräler y
Goetzl, 2002).
69
Una de las primeras investigaciones acerca de los efectos del LPA en linfocitos fue
llevado a cabo por Xu y col. en 1995. En estos estudios, se observó que el LPA era
capaz de activar y mantener efectos proliferativos en las células T. Los autores
demostraron que las células de la línea celular Jurkat T (una línea celular de
linfocitos T inmortalizados) al ser tratados con LPA, o lípidos de naturaleza similar,
mostraban una respuesta de movilización de calcio intracelular. Además, el LPA
también era capaz de estimular la proliferación de las células Jurkat T, aumentando
la producción de interleuquina IL-2. Estos resultados fueron confirmados con
linfocitos T CD4+ derivados de sangre humana, donde la secreción de IL-2 se eleva
hasta dos veces tras su activación por mitógeno (Zheng et al, 2000).
Más tarde, el análisis de los receptores de LPA en líneas en cultivo de linfomas de
células T y linfoblastomas demostró que las células CD4+ aisladas de sangre fresca
expresaban constitutivamente una dominancia del receptor LPA2, con una muy baja
expresión de LPA1. Por el contrario, las células T CD8+ expresaban ambos
receptores, sin mostrar predominancia de ninguno de ellos. Esto producía una
respuesta diferente comparada con las células CD4+. Mientras que las células T
CD4+ mostraron una inhibición de la producción de IL-2 por LPA, las CD8+ no
presentaron este efecto (Goetzl et al, 2000).
Con el objetivo de comprender mejor los efectos de LPA en las células T, Zheng y
col. (2000) realizaron estudios de transfección, bien con LPA1, bien con LPA2, sobre
linfocitos T humanos CD4+ ycélulas Jurkat T estimuladasdemostrando que el LPA
actuaba directamente sobre la secreción de IL-2 sin implicar citoquinas, segundos
mensajeros u otros factores. Según estos estudios, la alteración más importante que
ocurría en las células T como resultado de la activación de mitógeno era un cambio
de expresión de los receptores, que pasaba de presentar como predominante LPA2
a mostrar una codominancia de LPA1 y LPA2. Así, este aumento de la relación de
expresión LPA1/LPA2 es capaz de cambiar el efecto de LPA permutando la
supresión de producción de IL-2 estimulada por activación celularpor un claro
aumento de la misma.
70
Este estudio mostró que las células Jurkat transfectadas, que presentaban
predominancia en LPA1 o LPA2, se comportaban de manera distinta tras la
estimulación con mitógeno o LPA. Por una parte el LPA o el anticuerpo anti-LPA2
suprimían la estimulación de la producción de IL-2 en las células Jurkat T con
expresión predominante de LPA2 o en las células T CD4+ inactivas. Por otra,las
células Jurkat T que expresaban el receptor LPA1 en ausencia de LPA2 generaron
marcadamente más IL-2 que aquellas células T CD4+ activadas por mitógeno en las
que ambos receptores LPA1 y LPA2 codominaban. Esto podía deberse, en parte, a la
falta de oposición de la señalización por LPA2.
Otro aspecto funcional de la alteración de la expresión de LPA1 y LPA2 en las
células T se examinó en ensayos de migración usando células Jurkat transfectadas
selectivamente con LPA1 y LPA2. En estos estudios, se observaron cambios
significativos en la síntesis de las metaloproteinasas de matriz que son requeridas
para la migración celular. La expresión de LPA2 en células T Jurkat resultó en una
regulación LPA-dependiente al alza de la migración sobre trans-Matrigel, que no se
observó en aquellas células que expresaban LPA1. Además de que, unicamentelas
células que expresaban LPA2 aumentaron la expresión, hasta cuatro veces, de
metaloproteinasas de matriz tras la estimulación con LPA (Zheng et al, 2001).
La razón por la cual puede ocurrir esta diferencia de efectos, podría ser el
acoplamiento por parte de cada receptor a distintas proteínas G, como consecuencia
los diferentes mecanismos de señalización que desencadenan. Estudios más
actuales sugieren que el receptor LPA2 se acopla de manera más efectiva a las
proteínas Gαq, activando, por lo tanto, directamente, a la fosfolipasa C (PLC), y a la
señalización por inositol fosfato que incrementan el calcio intracelular. A diferencia
de ello, LPA1 está más relacionado con Gαi, lo que induce un incremento del calcio
intracelular a través del aumento de la actividad de la PLC mediado por las
subunidades Gβ/γ,, tanto directamente como por aumento de niveles de activación de
Gαq a través de LPA1. Estos mecanismos de acoplamiento diferencial a distintas
proteínas G conllevan diferencias en el curso temporal de la respuesta y en la
71
contribución de la respuesta del proceso celular y ya han sido caracterizados en
detalle en otros sistemas (Zheng et al, 2000).
En resumen, los subtipos de linfocitos son capaces de responder a un estímulo
específico con LPA con un incremento o descenso en la proliferación dependiendo
del patrón de expresión de los receptores de LPA que presenten. Así las vías
mediadas por LPA1 y LPA2 tienen efectos opuestos en la capacidad migratoria de
células T así como en su proliferación. Por tanto, el LPA regula la capacidad de
migración y la movilidad de las células T humanas CD4+ a través del receptor LPA2.
Tras la activación por mitógeno, estas células aumentan la expresión de LPA1
resultando en un cambio de sus respuestas a LPA hacia proliferación.
En base a estos estudios, se sugiere que la alteración en la expresión de los
receptores LPA1 y LPA2, así como su relación, puede ser un indicador del estado de
activación que presentan estas células y por tanto de los procesos inflamatorios que
se están desarrollando. Estudios muy recientes llevados a cabo por nuestro grupo
han puesto de manifiesto que el ascenso de la expresión del receptor LPA1 y el
descenso de LPA2 en las células mononucleares de sangre periférica de ratones que
presentan encefalomielitis autoinmune experimental, modelo animal de esclerosis
múltiple, correlaciona con su curso clínico, siendo más acentuado durante los brotes
de la enfermedad (García-Díaz, 2010).
Por otro lado, el LPA también ha mostrado ser un factor de supervivencia para
macrófagos murinos en condiciones de ausencia de suero. Estos datos demuestran
que el LPA puede actuar como un potente factor de supervivencia de macrófagos y
que el LPA, unido a la albumina, es un factor sérico de supervivencia clave. Hasta
fechas recientes, todos los factores de supervivencia descritos habían sido proteínas
o lípidos basados en esteroides, por lo que el LPA representa una clase nueva de
estos factores. Así mismo, la supervivencia mediada por LPA es dependiente de la
activación de la cascada de señalización por PI3K donde uno de los mediadores
posteriores es la quinasa pp70s6k. Sin embargo, los experimentos encaminados a la
72
inhibición de pp70s6k han demostrado que sólo se bloquea parcialmente la
supervivencia mediada por LPA, por lo que tienen que estar implicados otros
mediadores de la vía activada por PI3K además de pp70s6k (Koh et al, 1998).
Otro de los efectos in vivo conocidos del LPA sobre la inflamación es el de promover
la cicatrización de la herida. Este efecto le hace ser un importante factor de
crecimiento en este ambiente. Cuando el LPA es aplicado tópicamente durante la
cicatrización de heridas en piel de rata, tiene lugar un aumento moderado de la
migración de macrófagos tipo histiocitos (Balazs et al, 2000). El LPA también
produce un aumento de la expresión de la selectina E en las células endoteliales de
la superficie celular, asi como de la molécula de adhesión vascular-1 (VCAM-1).
Esto, al menos en parte, puede contribuir al incremento observado en la unión de
monocitos, neutrofilos y células de leucemia humana (HL60) a este endotelio tras el
tratamiento con LPA (Rizza et al, 1999).
Además, se ha mostrado que el LPA, a través de la expresión de los receptores
LPA1 y LPA3, activa al factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) en las células
endoteliales, estando el mismo seguido de un incremento de los niveles de ARNm
codificantes para selectina E, molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1),
interleuquina IL-8 y la proteína quimoatrayente de monocitos -1 (MCP-1)
(Palmetshofer et al, 1999, Gustin et al, 2008). Por todo ello, puede considerarse al
LPA como una molécula de señalización inicial para el inicio de la infiltración de
macrófagos durante la cicatrización de las heridas.
A raíz de los resultados anteriores, se estudió la expresión de los receptores de LPA
en los macrófagos alveolares humanos mediante la reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR), demostrando niveles significativos
de expresión de los receptores LPA1 y LPA2 y, en menor medida, también del
receptor LPA3 (Hornuss et al, 2001).
73
La acción de factor de crecimiento de LPA no sólo ha sido demostrada sobre los
linfocitos T y los macrófagos, sino también sobre los linfocitos B (Rosskopf et al,
1998). La adición de LPA a linfoblastos B inmortalizados con el virus de Epstein-Barr
provoca la formación de PI3, el cual se acompaña de incremento de la concentración
de calcio intracelular, aumento de la formación de inositol fosfato, activación de
MAPK, síntesis de ADN, y formación de inmunoglobulinas, presumiblemente en
forma dependiente de la señalización mediada por receptor. Así mismo, se
demostraron niveles específicos de transcritos del receptor LPA1 en estas células.
Además, este receptor mostró respuestas tanto del tipo dependiente de la via
sensible a la toxina pertusis (con inhibición de la generación de AMPc) como del de
la vía no vulnerable a la toxina ( redondeamiento celular) (Xie et al, 2002) lo cual
apoya la hipótesis de que los receptores de LPA se acoplarían aqui a más de un tipo
de proteínas G.
Los exudados inflamatorios también presentan en altas cantidades una de las
enzimas generadoras de LPA, la PLA2, secretada, inducida por citoquinas
proinflamatorias, y que aumenta sus concentraciones en estados sépticos (Xu,
2002). Aunque los datos obtenidos de estudios in vitro son difíciles de comparar con
las situaciones in vivo, se sugiere que el LPA es liberado a los sitios de inflamación
local (en respuesta a daño celular, durante la reparación de heridas, o desde el
crecimiento de tumores) o en inflamaciones generalizadas (como los estados
sépticos o la esclerosis múltiple).
Recientemente, también se ha analizado la actividad biológica de LPA en otros tipos
celulares implicados en los procesos inflamatorios, tales como las células dendríticas
(Phanther et al 2002). Cuando estas células dendríticas están inmaduras, el LPA
activa en ellas los niveles de Ca2+ intracelular, la reorganización de los filamentos de
actina, y la migración quimotáctica, sin afectar a su capacidad de internalizar
proteínas o partículas. El incremento de Ca2+ intracelular en respuesta a LPA se
debe a la movilización de los almacenes de calcio vía activación de las proteínas
Gαi/o; mientras que los mecanismos que subyacen en la reorganización de la actina
74
podría ser presumiblemente regulados por la interacción de los fosfoinositoles con
las proteínas de unión a la actina, a través de la activación de las subunidades Gαi/o
y de las GTPasas de la familia Rho (Contos et al, 2000, Swarthout and Walling,
2000). Por el contrario, en células dendríticas maduras, inducidas a diferenciar con
lisofosfolípidos, no se observan estas respuestas dependientes de proteinas Gi/o ni
los procesos de señalización intracelulares inducidos por LPA, aunque sí son
capaces de responder a otros estímulos. Todo esto ha permitido sugerir que el LPA
podría también estar implicado, al igual que el factor activador de plaquetas, las
proteínas quimiotacticas de monocitos 1-4, la esfingosina-1-fosfato, y la adenosina,
en la acumulación de células dendríticas inmaduras en la periferia de los sitios de
lesión. En este caso, la pérdida de sensibilidad a LPA por la vía de la proteína Gαi/o
durante la maduración de las células dendríticas despejaría el camino para la
migración de estas células hacia los órganos linfoides secundarios (Sozzani et al,
2000). Sin embargo, en contra de lo que pasa con las células T, los niveles de
transcritos para los receptores LPA1, LPA2 y LPA3 no varían entre las células
inmaduras y las diferenciadas.
En conclusión, a falta aún de más estudios detallados en este sentido, está claro, sin
embargo, el importante papel que el LPA juega en los procesos inflamatorios, y
cómo éste se ve regulado por la expresión diferencial de sus distintos receptores. Es
por ello que el estudio en profundidad de los diferentes patrones de expresión de
estos receptores en las distintas células que forman parte del sistema inmune podría
arrojar alguna luz acerca de dichos procesos y de cómo se podrían controlar, siendo
por tanto de mucha importancia en enfermedades autoinmunes como la esclerosis
múltiple, que cursan con un importante componente neuroinflamatorio y donde se
hace más que necesario, a falta de nuevas terapias más efectivas, el estudio de
nuevas herramientas que ofrezcan alguna luz sobre el curso de la inflamación y su
posible regulación.
75
2. HIPÓTESIS DE TRABAJO
En base a lo expuesto anteriormente la hipótesis de partida para este trabajo es la
siguiente:
- La vía mediada por LPA, cuyos receptores se expresan en las poblaciones
celulares inmunológicas afectadas en el curso de la EM, mediaría parte de los
mecanismos implicados en el desarrollo de la patología.
- El grado de expresión de dichos receptores en estas poblaciones
celulares de pacientes con EM, comparándolos con sujetos sanos,
variaría durante el curso de la enfermedad y bajo la influencia de
tratamientos inmunomoduladores.
3. OBJETIVOS
Objetivo general: Obtener y caracterizar las poblaciones celulares de respuesta
inmune en pacientes con EM. Determinar la expresión de los receptores de LPA en
poblaciones mononucleares aisladas de sangre periférica.
Objetivos específicos: Analizar la expresión de los receptores de LPA1 y LPA2 en la
población de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con EM con
forma clínica recurrente-remitente en el momento del diagnóstico (sin haber recibido
ningún tratamiento inmunomodulador) para compararlos: a) con la expresión en
controles sanos; b) tras la evolución, entre 1,5 y 3 años y habiendo recibido
tratamiento inmunomodulador. Analizar la expresión de los receptores de LPA1 y
LPA2 en EM con forma clínica progresiva, ya sea primaria o secundaria.
76
4. PACIENTES Y MÉTODOS
4.1 PACIENTES
Se han estudiado un total de 56 pacientes con EM RR clínicamente definida por los
criterios de McDonald (2001), 20 pacientes con EM PS, 5 pacientes con EM PP y 27
controles sanos reclutados de voluntarios sanos con las mismas características
demográficas que los pacientes. Todos los pacientes han sido seguidos en la
Unidad de Neuroinmunología del Instituto de Neurociencias del Hospital Carlos
Haya de Málaga donde se realizan revisiones habituales cada 3 meses además de
visitas urgentes en el caso de brotes. Los datos y muestras han sido recogidos tras
obtener consentimiento informado de los pacientes y los controles sanos para
realizar el estudio y tras la aprobación del Comité Ético del centro.
Los únicos criterios de inclusión de los pacientes con EM RR escogidos para el
estudio fueron: a) no haber recibido tratamiento inmunomodulador previo al
momento de la extracción de la primera muestra de sangre; b) no haber sufrido un
brote en el mes previo al comienzo del estudio.
Una segunda muestra de sangre periférica en el grupo de pacientes con EM RR fue
extraída entre 1,5 y 3 años después de la primera considerándose el estudio
finalizado. El número de pacientes de esta cohorte en el seguimiento fue de 45.
4.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES LPA 1 Y LPA2
La expresión de los receptores de LPA analizados (LPA1 y LPA2) se llevó a cabo
mediante PCR (del inglés, polymerase chain reaction) a tiempo real a través de la
cuantificación relativa de los ARN mensajeros (ARNm) de estos receptores.
En todo momento, las soluciones y materiales utilizados permanecían totalmente
libres de ARNasas por la aplicación de protocolos específicos de manipulación y
limpieza de las muestras y el área de trabajo.
77
Obtención de muestras y criopreservación.
A cada paciente y control se le extrajeron 30 ml de sangre venosa periférica en
tubos heparinizados. La purificación de las células mononucleares de sangre
periférica ó PBMC (de su denominación en inglés, peripheral blood mononuclear
cells) se llevó a cabo por centrifugación mediante un gradiente de densidad con
Ficoll, usando una solución que contenía polisacarosa (Ficoll 400) y diatrizoato de
sodio, comercializada bajo el nombre de Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich Química
S.A.; Madrid; abreviadamente, Sigma-Aldrich). El proceso se realizó dejando caer
muy suavemente la sangre por las paredes del tubo donde previamente se puso el
Ficoll. A continuación se centrifugó a 400 xg. durante 25 min a 20ºC, se recogió el
halo de la interfase que constituyen las PBMC, lavándolo con solución salina
fisiológica para, de nuevo, volver a centrifugar a 400 xg durante 10 min. Una vez
decantado el sobrenadante, y asegurando la conservación del precipitado, donde se
encontraba la fracción de las PBMC, se volvió a lavar éste con suero fisiológico,
centrifugando esta vez durante10 min a 200 xg.
Seguidamente se criopreservaron las poblaciones mononucleares aisladas hasta el
momento de procesarlas. Las PBMC obtenidas fueron resuspendidas en medio de
cultivo convencional RPMI (Sigma-Aldrich) enriquecido con suero fetal bovino (PAA
Laboratories GmbH; Pasching, Austria) al 40%, alicuotadas en criotubos a los
cuales se le añadió posteriormente gota a gota un volumen igual del mismo medio
con dimetil sulfóxido, DMSO (Sigma-Aldrich) al 20%, el cual previene la formación
de cristales de hielo que disminuyen la viabilidad celular. Los criotubos se
congelaron progresivamente, manteniéndolos una hora a -20ºC, entre 12-24 h a -
80ºC y luego conservadas indefinidamente en tanques de nitrógeno líquido.
En el momento de realizar los estudios las células se descongelaron rápidamente
en un baño a 37ºC y se lavaron dos veces con suero salino centrifugando 10 min. a
400 xg para eliminar los restos de DMSO que puedan resultar tóxico para la célula.
Las muestras se sumergían posteriormente en 1 ml de Trizol® (Gibco BRL, Life
Technologies, Baltimore, Maryland) para extraer el ARN.
78
Extracción de ARN total.
Para el aislamiento del ARN total de las PBMC se usó el método del Trizol®
(Chomczynski, P y Socchi, N, 1987).
A las muestras en Trizol® se le añadieron 200 µl de cloroformo agitándose
vigorosamente y se centrifugaron a 13000 r.p.m. durante 15 min a 4ºC. Se recogió
el sobrenadante pasándolo a un tubo de centrifugación limpio y se añadió 500 µl de
isopropanol. Tras una gitación suave, se dejó precipitar durante 20 min. a -20ºC y,
posteriormente, se centrifugó a 13.000 r.p.m., 10 min a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante y se lavó el precipitado añadiendo 1 ml de etanol al 75% frío,
centrifugando nuevamente 5 min a 10.000 rpm a 4ºC. Se eliminó el etanol por
decantación y se dejó secar el precipitado. Por último se resuspendió éste en 15 µL
de agua tratada con pirocarbonato de dietilo, DEPC (del inglés, diethyl
pyrocarbonate) (Roche Diagnostics S.L., Barcelona; abreviadamente, Roche) para
inactivar las ARNasas del medio.
Cuantificación.
Una vez aislado el ARN se midió su absorbancia a 260 nm (A260) y 280 nm (A280)
en un espectrofotómetro (Biotech Photometer, UV 1101, WPA) para cuantificar y
comprobar la pureza del ARN extraído. Se hicieron diluciones 1/40 en agua libre de
ARNasas tratada con DEPC y se obtuvo el ratio A260 (ARN)/ A280 (proteínas) el
cual estaba entre 1.8 y 2 garantizando su buen estado de acuerdo a los protocolos
convencionales (Sambrook y Russell, 2001). En todos los casos, la absorbancia a
260 nm se ajustó a 0.1-1 para que la cuantificación fuera fiable.
Síntesis de ADN complementario: transcripción reversa.
Se obtuvo el ADN complementario (ADNc) a partir de 1 µg de ARN total de las
muestras a través de la enzima reversotranscriptasa MMLV (Sigma-Aldrich), usando
cebadores de secuencia aleatoria, lo que permite obtener ADNc de todos los ARN
mensajeros (ARNm) de la muestra.
Para ello, se mezcló 1 µL de una mezcla comercial de cebadores aleatorios
79
(Roche), 1 µg del ARN total de cada muestra y agua tratada con DEPC hasta
completar un volúmen final de 10 µl. Esta mezcla se calentó 10 min a 70ºC para
facilitar la alineación de los cebadores y desnaturalizar las posibles estructuras
secundarias de los ARNm. Posteriormente se añadió a cada muestra los reactivos
restantes: 2 µL de tampón 10X (Sigma-Aldrich), 1 µL dNTP 10mM (Roche) 0,5 µL de
inhibidor de ARNasa (Roche), 5,5 µL de agua tratada con DEPC y 1 µL de la enzima
MMLV (Sigma-Aldrich), incubandose durante 10 min a 25ºC, 1h a 44 ºC y por
último, 10 min a 92 ºC.
Una vez terminado se guardó el ADNc obtenido a -20 ºC, listo para realizar las PCR
cuantitativas.
Diseño de cebadores
El programa informático utilizado para el diseño de cebadores fue Primer3 versión
0.3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Las variables
establecidas fueron que el rango del producto de PCR se hallara entre 150-250
pares de bases (pb), el rango de temperatura de fusión de los cebadores estuviese
comprendido entre 57ºC y 63ºC, el porcentaje de nucleótidos guanina-citosina (G-C)
oscilara entre el 40 % y el 60 %, y que el tamaño de cebadores lo hiciera entre 18 y
23 nucleótidos.
Una vez diseñada y elegida la pareja de cebadores se realizó un análisis de
comparación de secuencias con la base de datos del genoma humano, mediante el
programa informático Nucleotide BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Ello
permitió discriminar aquellas parejas de cebadores que se pudieran unir a los ADNc
de otros genes evitándose su amplificación durante la PCR.
Todos los cebadores usados en el estudio fueron adquiridos a Sigma-Genosys
(Sigma-Aldrich)
PCR a tiempo real.
La cuantificación se llevó a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa
80
(PCR) que se ha perfeccionado para monitorizar el producto amplificado a medida
que se va sintetizando. Esta tecnología se basa en el uso de fluoróforos que
permiten detectar la fluorescencia emitida y monitorizar en tiempo real lo que está
ocurriendo en cada ciclo de amplificación.
La cuantificación se puede hacer, dependiendo del tipo de estudio que se esté
llevando a cabo, de forma absoluta (concentración del producto) o relativa
(porcentaje respecto a un patrón de referencia). En este estudio hemos utilizado la
segunda.
Para las PCRs cuantitativas a tiempo real se utilizó el analizador LightCycler
(Roche) y como sistema de marcaje fluorescente SYBR Green I (Roche LightCycler
FastStart DNA Master SYBR Green I; Roche). El SYBR Green I puede unirse a la
doble hélice de ADN y emite una fluorescencia proporcional a la concentración de
ADN (SYBR Green absorbe a una longitud de onda de 497 nm y emite a 520 nm).
Durante el proceso, puede ocurrir que se amplifiquen productos inespecíficos o que
se formen dímeros de cebadores. Con el fin de corroborar la especificidad de los
productos generados por la PCR es necesario realizar una curva de temperatura de
fusión o disociación del ADN (“melting curve”) (Fig. 18) incrementando gradualmente
la temperatura (0,5ºC/ciclo) desde una temperatura de 56ºC hasta 95ºC (98ºC en el
caso del receptor LPA2) realizando el termociclador una lectura de fluorescencia
cada 0,5ºC. Si no ha habido formación de dímeros de cebadores, ni productos
inespecíficos, aparecerá un solo pico, con la Tm o temperatura de fusión (del inglés,
temperature of melting) del producto específico de amplificación. A veces, los
cebadores pueden formar dímeros que generarían otro pico en la curva de
desnaturalización, siendo fácil diferenciarlo de nuestro producto de amplificación ya
que su Tm es muy inferior.
81
Figura 18. Curva de desnaturalización (melting curve)
Mediante esta técnica se midió la expresión de los dos principales receptores de
LPA: LPA1 y LPA2. Para poder determinar los niveles relativos de ARNm de cada
uno de los genes estudiados se compararon con la expresión de gen constitutivo de
representación similar en este tipo celular, que fue la enzima gliceraldehído-3-
fosfato-deshidrogenasa (GADPH, del inglés, glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase).
Para hacer la cuantificación se realizó una amplificación simultánea del mismo gen
en diluciones seriadas con concentraciones conocidas, esta curva patrón permite
extrapolar los datos obtenidos de nuestras muestras así como calcular la eficiencia
de la reacción, la cual se relaciona con la pendiente de la recta patrón (Fig. 19),
[Eficiencia = 10(-1/pendiente) – 1].
Figura 19. Recta patrón
Para la reacción de PCR se preparó en cada muestra una mezcla compuesta por
5,4 µl de agua destilada libre de ARNasa, 1,3 µl de MgCl2, 0,2 µl de cebadores
Dímeros cebadores
Productos específicos
82
sentido (o directo) y antisentido (o inverso), según el gen, 1 µl de la mezcla de
fluorocromo del kit y 2 µl de ADNc.
El programa de amplificación para las PCR fue similar para los tres genes
estudiados, si bien se diferenciaron en las temperaturas y tiempos de hibridación, la
cual era específica para cada pareja de cebadores:
� Desnaturalización: 15 min a 95ºC,
� Amplificación 40 cíclos: 30 s a 95ºC (salvo LPA2 98ºC), tiempo y temperatura
de hibridación, y 18s a 72ºC,
� Fusión (melting): de 65ºC a 95ºC ascendiendo de temperatura 0,1ºC/s
� Enfriamiento: 30 s a 40ºC
Los cebadores utilizados fueron:
LPA1 sentido: atttcacagccccagttcac; y antisentido: tagattgccaccatgaccaa,
Tiempo y temperatura de hibridación: 7s a 68ºC
LPA2 sentido: cccaaccaacaggactgact; y antisentido: gaagagccagattcctgcac,
Tiempo y temperatura de hibridación: 7s a 68ºC
GAPDH sentido: gccaaggtcatccatgacaact y antisentido: gaggggccatccacagtctt
Tiempo y temperatura de hibridación: 10 s a 68ºC
4.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 15.0 package (SPSS
Inc, Chicago, IL) de MS-Windows.
Para comparar los valores de la expresión de LPA1, LPA2, LPA1/LPA2 en controles
frente a pacientes con EM RR sin y con tratamiento, EM PS y EM PP, se aplicaron
test de contrastes de dos medias para muestras independientes, salvo en el grupo
EM RR basal y tras recibir tratamiento, que se aplicó un test para muestras
apareadas.
83
5. RESULTADOS
5.1 Características basales de los sujetos con EM
(se expresan las medidas de los parámetros en términos absolutos)
- Sexo:
a) EM RR:
Existe una predilección por el sexo femenino en los pacientes del estudio: 33 de 57
(57,8 %).
b) EM PS:
Existe una predilección por el sexo femenino en los pacientes del estudio: 17 de 20
(85 %).
c) EM PP:
Existe una predilección por el sexo femenino en los pacientes del estudio: 3 de 5 (60
%).
- Edad en el momento del estudio
a) EM RR:
La edad media de los pacientes en el momento de la extracción de la muestra en
situación basal previa al tratamiento era de 30,3 años (rango 18-55 años).
b) EM PS:
La edad media de los pacientes en el momento de la extracción de la muestra era
de 48,2 años (rango 32-62 años).
c) EM PP:
La edad media de los pacientes en el momento de la extracción de la muestra era
de 52,8 años (rango 50-71 años).
84
- Edad al comienzo de la enfermedad
a) EM RR:
La edad en el inicio de los síntomas de la enfermedad era de 26,5 (rango 10-45
años).
b) EM PS:
La edad de inicio de los síntomas de la enfermedad era de 33,1 años (rango 17-47
años).
c) EM PP:
La edad de inicio de los síntomas de la enfermedad era de 46,3 años (rango 37-55
años).
- EDSS al comienzo del estudio
a) EM RR:
La discapacidad media de los pacientes del estudio medida por la escala EDSS en
el momento de la extracción al inicio del estudio fue de 1,17 puntos (rango 0-3
puntos).
b) EM PS:
La discapacidad media de los pacientes del estudio medida por la escala EDSS en
el momento de la extracción al inicio del estudio fue de 3,85 puntos (rango 3-7
puntos).
c) EM PP:
La discapacidad media de los pacientes del estudio medida por la escala EDSS en
el momento de la extracción al inicio del estudio fue de 6,37 puntos (rango 5-7,5
puntos).
85
- EDSS al final tras tratamiento y seguimiento en los sujetos EM RR
La discapacidad media de los pacientes del estudio medida por la escala EDSS en
el momento de la extracción de la última muestra a los 3 años del inicio del estudio,
fue de 1,5 puntos (0-4 puntos).
- Número de brotes en el año previo al inicio del estudio en el grupo EM RR
La media del número de brotes en el año previo en los pacientes del estudio fue de1
brote (rango 0-4 brotes).
- Número de brotes en el último año previo a la finalización del estudio en el
grupo EM RR
La media del número de brotes en el año previo en los pacientes del estudio fue de
0,71 brotes (rango 0-3 brotes).
- Tratamiento inmunomodulador recibido
a) EM RR:
Todos los pacientes recibieron tratamiento inmunomodulador tras el inicio del
estudio: 17 lo hicieron con Interferon beta 1a, 26, con Interferon beta 1b, y 4
pacientes fueron tratados con acetato de glatirámero.
b) EM PS:
Todos los pacientes recibían tratamiento inmunomodulador al inicio del estudio: 11
recibieron Interferon beta 1a, 7, Interferon beta 1b, y dos pacientes recibieron
acetato de glatirámero.
86
c) EM PP:
3 de los 5 pacientes recibían tratamiento inmunomodulador en el momento del
estudio: dos fueron tratados con Interferon beta 1a y uno de ellos, con Interferon
beta 1b.
- Pérdida de sujetos en el grupo EM RR en el seguimiento:
Durante el estudio hubo 11 pérdidas de sujetos debido a 3 motivos:
- Cambio de domicilio (4 pérdidas)
- Decisión de continuar el seguimiento en su hospital de origen (4 pérdidas)
- Falta de adhesión al tratamiento (3 pérdidas)
- Pacientes que precisaron cambio de tratamiento.
De los pacientes del grupo EM RR que finalizaron el estudio hubo dos de ellos que
precisaron cambio de tratamiento. Un cambio fue de Interferon beta 1a a acetato de
glatirámero, y otro, de Interferon beta 1a a mitoxantrona. El criterio para el cambio
de tratamiento inmunomodulador recibido fue la falta de respuesta al mismo
considerada como: existencia de 2 brotes en el año previo, que precisaron
tratamiento con esteroides, o deterioro de 0,5 puntos en la escala EDSS, también en
el año previo.
5.2 Características de los controles.
De los 27 sujetos controles, 16 tienen género femenino (59,25 %). La edad media
del grupo es 29,8 años (rango 21-37 años).
87
RESUMEN DATOS DEMOGRÁFICOS DE LOS PACIENTES Y LOS CONTROLES
CONTROLES EM RR
BASAL
EM RR
SEGUIMIENTO
EM PS EM PP
Nº SUJETOS 30 56 45 20 5
MEDIA EDAD 29,8 30,3 32,9 48,2 52,8
MEDIA EDAD
COMIENZO EM
- 26,5 - 33,1 46,3
SEXO (% Fem) F/M (16/27)
59,25 %
F/M (33/57)
57,8%
F/M (27/45)
60%
F/M (17/20)
85%
F/M (3/5)
60%
EDSS BASAL - 1,17 1,5 3,85 6,37
Nº BROTES
AÑO PREVIO
- 1 0,71 - -
Figura 20. Datos demográficos de los sujetos de estudio. Se expresa la edad media en años, el
sexo como proporción de número de pacientes de sexo femenino (F) frente a masculino (M) así
como el porcentaje que son de sexo femenino, y la EDSS en puntos
5.3 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en los sujetos
con EM RR basal y en controles sanos
Para comparar las variables se aplicaron test de contrastes de dos medias para
muestras independientes. Tras comprobar la hipótesis de normalidad y
observándose que no se cumplía, se opto por aplicar la prueba no paramétrica de U
de Mann-Whitney obteniendo los resultados que se muestran en la Fig. 21:
88
SUJETOS n media desviación típica valor p
Control 27 0,061685 0,027898 LPA1
EM RR basal 56 0,142115 0,213518
0.029*
Control 27 2,010784 1,375019 LPA2
EM RR basal 56 1,879994 1,231843
0.8
Control 27 0,039071 0,025269 LPA1/LPA2
EM RR basal 56 0,280112 0,692702
0.346
Figura 21. Tabla de datos de la expresión de los receptores LPA1 y LPA2 normalizada respecto a la
del constitutivo control GAPDH, y ratio de expresión LPA1/LPA2 en las PBMC de los sujetos con EM
RR (previo al tratamiento) y en la correspondiente a controles sanos
Los datos obtenidos permitieron mostrar que existía una diferencia estadísticamente
significativa, a un nivel de confianza del 95 %, entre los dos grupos para la variable
expresión de LPA1 (Fig. 21).
En las PBMC de los individuos sanos se detectó una mayor expresión del receptor
LPA2 (media de expresión relativa de 2,010784, en términos absolutos) que de LPA1
(media de expresión relativa de 0,061685), de manera similar a lo que también
sucedía en la muestra procedentes de pacientes con EM RR y que mostraban una
mayor expresión de LPA2 (media de expresión relativa de 1,879994) que de LPA1
(media de expresión relativa de 0,142115).
En los pacientes con EM RR de nuestro estudio se observó un aumento relativo de
la expresión del receptor LPA1 en las PBMC, que permitió definir diferencias
estadísticamente significativas en la expresión del receptor LPA1 en dichos
pacientes frente a los sujetos control (Fig. 22).
Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión del receptor LPA2 (Fig.
23) entre los dos grupos, así como tampoco en el el ratio de expresión de
LPA1/LPA2, aunque en este último sí que se observó una clara tendencia a valores
mayores en presencia de la enfermedad.
89
Figura 22. Expresión relativa del receptor LPA1 en PBMC en controles y pacientes con EM RR basal, normalizada frente a GAPDH. Se indica el valor de p allí donde la diferencia fue significativa.
Figura 23. Expresión relativa del receptor LPA2 en PBMC en controles y pacientes con EM RR basal, normalizada frente a GAPDH.
Control
p= 0,029
EM RR basal Control EM RR basal
5.4 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en sujetos con
EM, tras el tratamiento/seguimiento, y en controles sanos.
Se procedió como en el caso anterior. Dado que tampoco se cumplía en este caso la
hipótesis de normalidad, aplicamos la prueba no paramétrica de U de Mann-Whitney
obteniendo los resultados que se muestran en la Fig. 24.
SUJETOS n media desviación típica valor p
Control 27 0,061685 0,027898 LPA1
EM RR tto 45 0,120735 0,221365 0.767
Control 27 2,010784 1,375019 LPA2
EM RR tto 45 1,534830 1,073262 0.154
Control 27 0,039071 0,025269 LPA1/LPA2
EM RR tto 45 0,273418 0,542592 0.32
Figura 24. Tabla de datos de la expresión relativa de los receptores LPA1 y LPA2, normalizada frente
a GAPDH. y ratio de la expresión deLPA1/LPA2 en PBMC de sujetos con EM RR tras
evolución/tratamiento (tto) y de controles sanos.
0,30
p = 0,029
90
Control EM RR tratamiento Control EM RR tratamiento
Figura 25. Expresión relativa del receptor LPA1 en PBMC en controles y pacientes con EM RR con tratamiento, normalizada frente a GAPDH.
Figura 26. Expresión relativa del receptor LPA2 en PBMC en controles y pacientes con EM RR con tratamiento, normalizada frente a GAPDH.
Aunque tras el tratamiento no se apreciaron diferencias significativas entre las
fracciones de PBMC de los grupos controles y los pacientes con EM RR, sí se pudo
observar la misma tendencia descrita en los pacientes en situación basal RR, es
decir, los niveles de expresión de LPA1 aumentaron, los niveles de LPA2
disminuyeron y por tanto el ratio de ambas expresiones aumentó, en tendencia, tras
el tratamiento. Más allá de no representar influencia alguna del tratamiento, esto
también podría sugerir, no obstante, que el tratamiento acerca los valores de
expresión de los receptores a la situación basal de referencia.
91
5.5 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en sujetos con
EM previo al tratamiento y tras el tratamiento/seguimiento.
Para comparar los valores de expresión de los receptores LPA1, LPA2 y el ratio
LPA1/LPA2 en dos grupos dependientes, se aplicó la prueba T de contrastes de dos
medias para muestras apareadas. Previamente se comprobó la condición de
normalidad a través del test de Shapiro-Wilk. Como no se aceptó la hipótesis de
normalidad se aplicó la correspondiente prueba no paramétrica de Wilcoxon dando
finalmente los valores que se expresan en la Fig.27.
SUJETOS n media desviación típica valor p
EM RR basal 45 0,128187 0,217143 LPA1
EM RR tto 45 0,112108 0,217226 0,516
EM RR basal 45 2,06205 1,21424 LPA2
EM RR tto 45 1,57748 1,06002 0.004*
EM RR basal 45 0,183405 0,534087 LPA1/LPA2
EM RR tto 45 0,239992 0,509659 0.31
Figura 27. Tabla de datos de la expresión relativa de los receptores LPA1 y LPA2, normalizada frente
a GAPDH y ratio de la expresión de LPA1/LPA2 en PBMC de sujetos con EM RR en situación basal y
tras tratamiento/evolución (tto).
Los datos mostraron que solo existían diferencias estadísticamente significativas a
un nivel de confianza del 95 % entre los dos grupos de pacientes para la variable
expresión de LPA2 (Fig. 27).
Comparando la expresión de ambos receptores en el grupo con EM RR tras recibir
tratamiento con la obtenida en situación basal solo se encontró diferencia
relativamente significativa en la expresión del receptor LPA2, que disminuía en las
PBMC del grupo que recibió el tratamiento (media relativa de 1,57748) frente a la
expresión observada en las PBMC de los pacientes con situación previa al
tratamiento (media relativa de 2,06205) (Fig. 28).
92
Figura 28. Expresión relativa del receptor LPA2 en PBMC de pacientes con EM RR (en situación basal y tras evolución y tratamiento), normalizada frente a GAPDH.
EM RR basal
5.6 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en los sujetos
con EM PS frente a controles sanos
Para comparar las variables se aplicaron test de contrastes de dos medias para
muestras independientes. Al aplicar la prueba de Shapiro-Wilk se obtuvo que ambos
grupos cumplían la condición de normalidad para la variable expresión de LPA1 por
lo aplicamos la prueba T. Sin embargo, las variables expresión de LPA2 y ratio de
expresión de LPA1/LPA2 no cumplían la condición de normalidad por lo que se
aplicaron pruebas no paramétricas obteniendo los resultados que se muestran en la
Fig 29.
p= 0,004
EM RR tratamiento
93
Figura 30. Expresión relativa del receptor LPA1 en PBMC de sujetos controles y con EM SP, normalizada frente a GAPDH.
Figura 31. Expresión relativa del receptor LPA2 en PBMC de sujetos controles y con EM SP, normalizada frente a GAPDH.
Control EM SP EM SP Control
p= 0,011
SUJETOS
n
media
desviación típica
valor p
Control 27 0,061685 0,027898 LPA1
EM PS 20 0,040808 0,025163
0.011*
Control 27 2,010784 1,375019 LPA2
EM PS 20 1,363159 0,834088
0.064
Control 27 0,039071 0,025269 LPA1/LPA2
EM PS 20 0,035715 0,024054
0.683
Figura 29. Tabla de datos de la expresión relativa de los receptores LPA1 y LPA2, normalizada frente
a GAPDH, y ratio de la expresión de LPA1/LPA2 en PBMC de sujetos con EM PS y de controles
sanos.
Los datos demostraron la existencia de diferencias estadísticamente significativas,
con un nivel de confianza del 95 %, entre los dos grupos de pacientes y respecto a
la expresión del receptor LPA1 que se apreciaba disminuida en las PBMC de los
pacientes con EM PS respecto a los controles (Fig. 30). Además, se detectó una
tendencia clara, aunque no significativa, a mostrar, igualmente, una menor expresión
del receptor LPA2 en las PBMC del grupo de pacientes con EM PS respecto a los
sujetos control (Fig. 31).
94
5.7 Expresión de los receptores LPA 1 y LPA 2 y ratio LPA 1/LPA2 en los sujetos
con EM PP frente a controles sanos
Para comparar las variables se aplicaron test de contrastes de dos medias para
muestras independientes. Al aplicar la prueba de Shapiro-Wilk se obtuvo que
ambos grupos cumplían la condición de normalidad para la variable expresión del
receptor LPA1 por lo aplicamos la prueba T; en cambio las variables expresión de
LPA2 y ratio de expresión de LPA1/LPA2 no cumplían la condición de normalidad por
lo se aplicaron pruebas no paramétricas obteniendo los resultados que se muestran
en la Fig 32.
SUJETOS
n
media
desviación típica
valor p
Control 27 0,061685 0,027898 LPA1
EM PP 5 0,029982 0,033805
0.031*
Control 27 2,010784 1,375019 LPA2
EM PP 5 2,007517 1,996336
0.92
Control 27 0,039071 0,025269 LPA1/LPA2
EM PP 5 0,096223 0,131118
0.579
Figura 32. Tabla de datos de la expresión relativa de los receptores LPA1 y LPA2, normalizada frente
a GAPDH, y ratio de la expresión LPA1/LPA2 en PBMC de sujetos con EM PP y de controles sanos.
Los resultados indicaron diferencias estadísticamente significativas con un nivel de
confianza del 95% entre los dos grupos para la expresión del receptor LPA1 en las
PBMC (Fig. 33), siendo menor la expresión del receptor en las muestras
procedentes de sujetos con EM PP respecto a los controles. No se encontraron, sin
95
Figura 33. Expresión relativa del receptor LPA1 en controles y EM PP, normalizada frente a GAPDH.
EM PP EM Control
embargo, diferencias signficativas respecto a los niveles de expresión del receptor
LPA2.
96
6. DISCUSIÓN
El aislamiento y la criopreservación de células mononucleares de sangre períférica
(PBMC) en pacientes con EM resulta un procedimiento adecuado y útil para realizar
estudios inmunológicos en la EM. En nuestro estudio, mediante PCR a tiempo real
pudimos determinar la expresión de los receptores de LPA en sujetos sanos y en
pacientes con EM en distintos escenarios: pacientes con EM RR previo y tras
tratamiento, con EM PS y con EM PP.
Como ya se expuso anteriormente, el LPA juega un papel muy importante en los
procesos inflamatorios, procesos que forman parte esencial de la patogenia de la
EM. Así mismo, los estudios previos con células T CD4+ humanas determinaron que
el patrón de expresión de los receptores LPA1 y LPA2 en este tipo celular se alteraba
en función a su activación (Zheng et al, 2000). Basándose en ello y debido a la alta
proporción de este tipo celular en las PBMC, de fácil obtención, se analizó en ellas la
expresión de ambos receptores.
Dichos estudios previos habían tratado el papel del LPA en los procesos
inflamatorios (Zheng et al, 2000) y mostraron que existía una expresión diferencial
de receptores para LPA en células CD4+ según estuviesen o no activadas por
mitógeno. En dicho estudio se observó que las células CD4+ inactivas presentaban
un predominio de la expresión del receptor LPA2 siendo la correspondiente al LPA1
casi inexistente; en cambio, cuando estas son activadas por mitógeno la expresión
del receptor LPA2 disminuye, aumentando la de LPA1. Este cambio cualitativo y
cuantitativo en los receptores para LPA tiene su reflejo en el efecto que produce en
las mismas su presencia en el medio. Mientras en células T inactivas, en las cuales
predomina el receptor LPA2, el LPA produce una disminución en la expresión de IL-
2; en las células CD4+ activadas la expresión de esta citoquina se ve fuertemente
aumentada en presencia de LPA.
97
Alternativamente, estudios muy recientes llevados a cabo por nuestro grupo han
puesto de manifiesto que el ascenso de la expresión del receptor LPA1 y el descenso
de LPA2 en las células mononucleares de sangre periférica de ratones que
presentan encefalomielitis autoinmune experimental, modelo animal de esclerosis
múltiple, correlaciona con su curso clínico, siendo este ratio más acentuado durante
los brotes de la enfermedad (García-Díaz, 2010). Los datos obtenidos en el presente
estudio a partir de pacientes de EM corroboran estos análisis previos realizados en
el modelo animal.
Según los resultados expuestos en este trabajo, los sujetos sanos expresan
predominantemente el receptor LPA2 en la fracción de PBMC, respecto a la
expresión, relativamente muy baja, que se detecta para el receptor LPA1, y de
manera acorde a lo publicado en las preparaciones de células T CD4+ humanas
(Zheng et al, 2000). Sin embargo, más allá de la situación basal de los sujetos
controles y con EM, en las PBMC procedentes de sujetos que padecen la
enfermedad en forma recurrente-remitente, existe un aumento de la expresión del
receptor LPA1 disminuyendo a su vez los niveles de LPA2, aunque se trate en sí
mismo de una tendencia en la relación que no muestra significación estadística.
Como resultado, el ratio LPA1/LPA2 presenta valores mucho mayores en los sujetos
con EM RR que en los sujetos sanos, aunque, como hemos mencionado, a pesar de
su marcada tendencia, estas diferencias no fueron significativas debida a su
variabilidad intrínseca por lo que, quizá el aumento del tamaño muestral, podría
determinar mejor su valor.
No obstante, donde sí que existe una diferencia estadísticamente significativa es en
la expresión de los receptores de LPA1 que muestran las células mononucleares
sanguíneas de los sujetos sanos respecto a la de las muestras de los pacientes con
EM RR que no han recibido tratamiento inmunomodulador, hallándose una mayor
expresión de LPA1 en la forma clínica de la enfermedad en brotes, donde
predominan los fenómenos inflamatorios, respecto a los controles. Los estudios
previos realizados en modelos animales con EAE, el modelo experimental de
98
esclerosis múltiple más comúnmente aceptado, han demostrado datos similares
respecto a la expresión del receptor, acentuando su papel en el curso de los brotes
más agresivos en términos inflamatorios (García-Díaz, 2010). Aún se desconoce
cual es la vía final de regulación del proceso que determina el aúmento de la
expresión del receptor pero ciertamente su expresión correlaciona con la de otros
compuestos reguladores también al alza bajo los procesos inflamatorios en la EM.
Tal es el caso de la glucogeno sintetasa quinasa GSK-3 (del inglés, glycogen
synthase kinase 3), que se ha demostrado como un regulador del balance entre la
producción de citoquinas pro- y anti- inflamatorias en el SNC (Beurel et al, 2010) y
cuya regulación por medio de fosforilación también es susceptible de modularse por
LPA a través de LPA1 o LPA2 y la subsiguiente via dependiente de PLC y de la
proteina quinasa C (PKC) (Fang et al, 2002).
La importancia de estos sistemas conjuntos de regulación es evidente.
Recientemente se ha demostrado que la administración de litio, inhibidor de GSK3,
es capaz de eliminar los síntomas clínicos de EAE y la producción de interleuquinas
inflamatorias (De Sarno et al, 2008). Igualmente, factores activos y fundamentales
en la inflamación durante el curso de la EM como NFkB, cuya via de señalización
está afectada diferencialmente en pacientes con EM RR y EM PP (Yan y Greer,
2008) o que se han demostrados como mediadores de la inflamación inducida con
antígenos de mielina en modelos de EAE (Sun et al, 2010) y que también pueden
ser regulados por medio de LPA y a través de señales mediadas por los receptores
específicos (Shahrestanifar et al, 1999; Chen et al, 2008). Es por ello que resulte de
enorme interés el estudio de patrones de expresión comunes a los diferentes
episodios de la enfermedad a objeto de establecer posibles dianas terapéuticas.
En relación al tratamiento los resultados muestran cierta controversia. Cuando los
pacientes en forma RR se vieron sometidos a tratamiento, que disminuían la
actividad de la enfermedad, disminuyendo el número de brotes anuales de 1 a 0,7, la
expresión de los receptores de LPA en las PBMC también se veía alterada. En este
caso, aunque la tendencia de las muestras de pacientes con EM RR y tratamiento
era la de mostrar mayores niveles de LPA1 y menores de LPA2 respecto a los
controles con RR, ni estos ni su ratio fueron significativamente distintos, mostrando
99
unos valores intermedios entre los pacientes basales con RR y los sanos. Esto
podría ser indicativo de que que el tratamiento podría modular los valores de
expresión de los receptores hacía la situación basal de referencia. De esta manera
la expresión del receptor LPA1 podría correlacionar con el grado de actividad de la
enfermedad, y la administración de inmunomoduladores que muestren cierta eficacia
en el tratamiento de esta enfermedad ayudaría a disminuir su expresión.
Por otro lado, respecto a la expresión de LPA2, a pesar de que en ninguno de los
dos grupos de pacientes con EM RR mostró diferencias significativas con respecto a
los controles, sí que se observaron éstas cuando se compararon las muestras de
PBMC de los grupos antes y después del tratamiento. Aunque el por qué ocurre
esto necesita ser estudiado con mayor profundidad, el hecho de que el LPA
produzca efectos antagónicos según active un receptor u otro (LPA1 o LPA2) puede
señalar que la modulación de un receptor puede causar efectos compensatorios en
la expresión del otro.
También la disminución de ambos receptores dentro del conjunto total de PBMC
podría quizás a apuntar que los distintos tratamientos inmunomoduladores ejerzan
algún efecto en el secuestro o disminución de las células CD4+ en el total de PBMC.
En este sentido se ha demostrado como el Fingolimod, un inmunosupresor oral para
el tratamiento de la EM que actúa como agonista de los receptores de S1P, otro
fosfolípido muy emparentado con el LPA, actúa promoviendo el secuestro de las
células T, impidiendo la migración de los linfocitos al SNC y mejorando así su acción
inmunosupresora (Daniel et al, 2007; Sawicka et al, 2005).
No obstante, la diferencia en el tratamiento recibido también podría incidir en la
respuesta observada por lo que son necesarios más estudios en este sentido.
La terapia con interferon beta (IFNβ), recibida por alguno de los pacientes incluidos
en este estudio, está configurada como uno de los tratamientos más estandarizados
para la EM. Las preparaciones recombinantes de IFNβ disponibles hoy dia han
mostrado una mejora de los brotes y de los síntomas observables por resonancia
100
magnética, en terminos de actividad. No asi, sin embargo, en lo que refiere a
términos de progresion, tales como la medida de discapacidad o de carga de lesión.
Además el tratamiento es efectivo en solo un porcentaje de pacientes debido a la
aparición, entre otras causas, de anticuerpos neutralizantes al cabo de un tiempo
prolongado de tratamiento.
Con la intención de evaluar la eficacia del tratamiento con cierta anticipación, se han
estudiado, recientemente, un número determinado de genes inducibles por
interferón, destacando, entre ellos, la proteína A de Myxovirus (MxA) (Sottini et al,
2009). En este sentido, la asociación entre la expresión de LPA1 y el tratamiento
inmunomodulador, observada en el presente estudio, podría representar una nueva
herramienta de evaluación para este tipo de terapias. Por otro lado, en la respuesta
a interferon desempeña un papel fundamental la respuesta diferencial de los
componentes del receptor de IFNβ, las subunidades IFNAR1, IFNAR2, asi como de
las tres isoformas de esta última, funcional, truncada no funcional y soluble (Oliver et
al, 2007; Sottini et al, 2009) por lo que sería interesante conocer, igualmente, si la
expresión de los receptores de LPA en las PBMC podrían correlacionarse a la
expresión de los distintos componentes del sistema de respuesta al IFNβ, más aun
cuando se ha demostrado en algunos estudios que la variación en la respuesta al
tratamiento con IFNβ es independiente de la presencia de anticuerpos
neutralizantes o de cambios en la expresión del receptor (Reder et al, 2008)
sugiriendo la presencia de otros elementos regualdores del sistema.
Por último, a pesar de que el ratio LPA1/LPA2 es el que mayores diferencias muestra
entre pacientes con EM RR e individuos sanos, no se pudo establecer diferencias
estadísticamente significativas. Esta falta de significancia es debida a la enorme
variabilidad que se encuentra en este valor entre los pacientes con EM RR, y que es
fruto de la gran variabilidad de los niveles de expresión de LPA1 y LPA2. De nuevo
esta gran variabilidad apunta a que se debe profundizar en el estudio de cómo estos
receptores se modulan a lo largo de la patogénesis de la enfermedad.
101
Según nuestros resultados el tratamiento inmunomodulador normaliza los niveles de
expresión del receptor de LPA1 en los pacientes con EM RR equiparándolo a los
controles sanos aunque producen una disminución significativa de la expresión de
LPA2.
Por el contrario, en pacientes con formas clínicas donde predomina la
neurodegeneración (EM PS y EM PP), siendo los procesos inflamatorios menos
importantes, la expresión del receptor LPA1 muestra una tendencia opuesta. En
estos pacientes se observa una menor expresión del receptor LPA1 con significación
estadística respecto a los individuos sanos. Sin embargo, debido a la menor
proporción de pacientes que cursan esta forma de la enfermedad, sobre todo en el
caso de la EM PP, y por tanto el menor tamaño de la muestra analizada, y el hecho
de que su mayoría se encuentran ya bajo el efecto de distintos tratamientos, no
podemos afirmar si la disminución de LPA1 es debido a la forma clínica de la
enfermedad en sí o al efecto de sus distintos tratamientos.
Asímismo, la tendencia hacia menores valores de expresión de LPA2 en las PBMC
de muestras con forma RR se sigue observando cuando estos pacientes
evolucionan a una forma progresiva secundaria, no mostrando en este caso
diferencias en los valores del ratio LPA1/LPA2 respecto a los individuos sanos.
Respecto a los pacientes con EM PP, ni la expresión de LPA2 ni el ratio LPA1/LPA2
se vieron alterados respecto a los controles. Todo ello corrobora la casi inexistencia
de los procesos inflamatorios en estas formas de la enfermedad si bien no pueden
tampoco considerarse como absolutamente independientes el proceso
neuroinflamatorio del neurodegenerativo.
En resumen, podríamos decir que la expresión del receptor LPA1 es mayor en la EM
RR donde predominan los procesos inflamatorios, se normaliza en estos pacientes
tras recibir tratamiento inmunomodulador y es menor en las formas clínicas donde
predomina la neurodegeneración, a pesar de que aún puedan existir focos de
inflamación.Además, basándonos en estos estudios, podríamos sugerir que la
102
alteración en la expresión de los receptores LPA1 y LPA2, así como su ratio, puede
ser un indicador del estado de activación que presentan estas células y por tanto de
los procesos inflamatorios que se están desarrollando.
Por tanto, según nuestros resultados, el LPA a través de la expresión de su receptor
LPA1 podría estar desempeñando un papel importante en la patogenia de la EM,
habida cuenta de la asociación que muestra su expresión, principalmente, en la
etapa neuroinflamatoria de la patología y su variabilidad en las distintas etapas de la
enfermedad nos sugiere que podría utilizarse para la búsqueda de nuevas dianas
terapéuticas reguladoras de la misma.
103
7. CONCLUSIONES
- El aislamiento y la criopreservación de células mononucleares de sangre
períférica en pacientes con EM resulta un procedimiento adecuado y útil para
realizar estudios inmunológicos en la Esclerosis Múltiple.
- La expresión del receptor LPA1 es significativamente mayor en la forma
clínica recurrente-remitente de la Esclerosis Múltiple en aquellos pacientes
que no han recibido tratamiento inmunomodulador donde los procesos
inflamatorios son predominantes. Es significativamente menor, en cambio, en
las formas de la enfermedad donde predomina la neurodegeneración
(esclerosis múltiple progresiva, ya sea primaria o secundaria)
- Los niveles del receptor LPA2 muestran una tendencia a disminuir sus valores
respecto a los individuos sanos tanto en las formas recurrentes remitentes
como secundarias progresivas, sin observarse en el curso primario
progresivo. Esto indica que sin ser significativas estas tendencias, este
receptor puede formar parte de la regulación de los procesos inflamatorios.
- A pesar de que el ratio LPA1/LPA2 no presenta diferencias significativas entre
pacientes con Esclerosis Múltiple recurrente-remitente e individuos sanos
debido a su alta variabilidad, sus valores elevados en dichos pacientes
podrían apoyar el diagnóstico de la enfermedad
- Los tratamientos de la forma recurrente-remitente con fármacos
inmunomoduladores tienen un efecto significativo en la expresión de los
receptores de LPA; disminuyendo tanto los valores de LPA1, que se asocian
con el progreso de la enfermedad, así como los niveles de LPA2.
104
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142
9. ABREVIATURAS
AC: adenilato ciclasa
ADN: ácido desoxirribonucleico.
APP: proteína precursora de amiloide
ARN: ácido ribonucleico.
ATX: autotaxina
BDNF: factor neutrófico derivado del cerebro
BHE: barrera hematoencefálica
CHM: complejo mayor de histocompatibilidad
DC: célula dendrítica.
DGK: diacilglicerolquinasa
EAE: encefalomielitis autoinmune experimental
EBV: virus de Epstein-Barr
EDSS: escala de estado de la discapacidad ampliada
ELISA: análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas
EM: esclerosis multiple.
HHV-6: virus herpes-6
HLA: antígeno leucocitario humano,
HSP: proteína de choque térmico
IFN: interferon
Ig: inmunoglobulina
IL: interleuquina
LCR: líquido cefalorraquídeo.
LP: lisofosfolípido
LPA: ácido lisofosfatídico.
LPC: lisofosfatidilcolina
LPE: lisofosfatidiletanolamina
LPS: lisofosfatidilserina
MAG: glicoproteína asociada a la mielina
MAPK: proteínaquinasa activada por mitógeno.
143
MMP: metaloproteasa de matriz
MOG: glicoproteína mielínica oligodendroglial
NAA: N-acetil-aspartato.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
PE: potenciales evocados
PKC: proteínquinasa C
PLA1: fosfolipasa 1
PLA2: fosfolipasa 3
PLC: fosfolipasa C
PLC: fosfolipasa C.
PLD: fosfolipasa D.
PLP: proteína proteolipídica
PLP: proteína proteolipídica
PMB: proteína mielínica básica
PP: progresiva primaria
PS: progresiva secundaria.
RM: resonancia magnética
RR: recurrente remitente
SNC: sistema nervioso central.
TNF: factor de necrosis tumoral.
144
