INDICE GENERAL - senasa.go.cr · Asegure que la muestra fijada en formalina incluye: el puente, la médula oblongada y el cerebelo. 2.3. El fijador o preservador utilizado es formalina

DIRECCIÓN DE INOCUIDAD DE PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL

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INSTRUCTIVO PARA TOMA Y ENVIO DE MUESTRA PARA EEB Versión 03 Página 1 de 25

Elaborado por: Equipo Técnico DIPOA Revisado por: Unidad de Gestión de Calidad Aprobado por: Director DIPOA

©Documento normativo propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada

INDICE GENERAL

1. Tipo de muestra............................................................................................... 5

2. Recomendaciones............................................................................................. 7

3. Método 1. Extracción de la muestra a través del cráneo............................. 8

4. Método 2. Extracción de la muestra vía foramen mágnum......................... 14

5. Manejo y envió de muestra............................................................................. 19

6. Químicos utilizados en la desinfección.......................................................... 22

7. Determinación de la edad de los animales según su dentición.................... 23


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INDICE DE FIGURAS

1. Vista dorsal del encéfalo y clasificación de muestras................................... 6

2. Encéfalo completo (vista dorsal).................................................................... 6

3. Estructuras del tronco encefálico (vista dorsal)........................................... 7

4. Corte a nivel de la articulación atlanto-occipital.......................................... 10

5. Exposición del cráneo...................................................................................... 11

6. Corte del cráneo............................................................................................... 12

7. Exposición del cerebro..................................................................................... 13

8. Corte de las meninges...................................................................................... 14

9. Disección de la médula espinal....................................................................... 17

10. Extracción de la muestra vía foramen magnum........................................... 17

11. Introducción de la “cuchara”......................................................................... 18

12. Extracción de la muestra mediante la “cuchara”......................................... 18

13. Extracción completa de la muestra................................................................ 19

14. Manejo fresco del obex.................................................................................... 19

15. Muestra fijada en formalina........................................................................... 20

16. Determinación de la muestra.......................................................................... 21

17. Muestra 3 fijada en formalina........................................................................ 21

18. Cuchara para la extracción de muestra vía foramen magnum................... 22

19. Animal con todos los dientes falsos................................................................ 24

20. Animal con 2 dientes permanentes y el resto falsos...................................... 24



23. Animal con todos sus dientes permanentes................................................... 25

INDICE DE TABLAS

1. Determinación de la edad de los bovinos según su dentición....................... 23


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PROCEDIMIENTOS PARA LA TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS PARA EEB

El personal encargado de tomar la muestra deberá de conocer a plenitud los métodos de

toma y envió de muestra para EEB, además de conocer los riesgos existentes durante el

procedimiento de extracción. Será indispensable en todo momento contar con los materiales

y el equipo necesario para la toma de muestra y para garantizar la protección del personal.

Durante la inspección ante-morten o recibo del ganado en los corrales del establecimiento,

el Médico Veterinario Inspector y/o Oficial, debe observar cuáles de los animales recibidos

son caídos no ambulatorios. Aquellos animales caídos no ambulatorios, serán segregados

en el corral de aislamiento (cuando su condición así lo permita), y/o se mantendrán

separados del resto de animales recibidos para sacrificio, bajo condiciones que no afecten el

bienestar de este.

Una vez que los animales se encuentren dentro del establecimiento, el Médico Veterinario

Inspector y/o Oficial o el auxiliar de inspección, debe verificar la documentación con la que

ingresaron los animales al establecimiento (Guía de Sanitaria-Propiedad y Transporte de

Animales), así como boleta de recibo de ganado del establecimiento, los cuales están en la

obligación de notificar al equipo de inspección veterinaria, sobre la presencia de estos

animales.

El Médico Veterinario Inspector y/o Oficial es el responsable de la toma de muestra de los

animales caídos no ambulatorios. La zona más importante para el diagnóstico de EEB, es el

tronco encefálico y específicamente la médula oblongada a nivel del óbex, de modo que

esta zona debe estar intacta; por tal razón, en el sacrificio o eutanasia del animal, por

ningún motivo se debe dañar esta región. Las muestras deben ser colectadas

inmediatamente (no deberá transcurrir más de doce horas entre la muerte del animal y la

inmersión de la muestra en formalina) y depositadas con suavidad (a fin de no dañar sitios

importantes del órgano, ya que puede alterar seriamente los resultados del examen

histopatológico) en un contenedor de plástico de boca ancha, que contenga formalina neutra

al 10%, considerando una relación volumen muestra/volumen fijador = 1:10; es decir, el

tamaño de la muestra debe ser colocado en un contenedor (envase) que contenga por lo

menos 10 veces su volumen de fijador. Además, se debe garantizar que la muestra incluya:

el encéfalo, el puente, la médula oblongada y el cerebelo.

Al ser la formalina neutra al 10% un producto irritante para la piel y mucosas, el personal

debe tomar las precauciones necesarias para disminuir el riesgo de sufrir accidentes al

contacto con este producto. En caso de ocurrir un accidente, se debe lavar con abundante

agua la zona afectada, en caso de persistir la irritación, acudir a un centro médico para su

valoración.


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Los animales caídos no ambulatorios deben ser sacrificados de manera humanitaria,

logrando un adecuado aturdimiento (mecánico ya sea con perno o tornillo cautivo o

mediante arma de fuego) y posterior degollado que permita una inducción rápida a la

muerte del animal. De igual manera previa al sacrificio de los animales se debe tener claro

el lugar de sacrificio.

Una vez obtenida las muestras los animales, el cráneo y cualquier resto de tejido serán

depositados en la fosa sanitaria para su destrucción. La fosa deberá tener una profundidad

mínima de 2,5 mts, por 2 mts de ancho, y a lo menos 1 mt lineal por animal adulto de largo.

Los establecimientos determinaran la edad del animal, utilizando la dentición de los

incisivos, de acuerdo a las edades establecidas en la definición de material especifico de

riesgo.

Aquellos establecimientos que no lleven registros de las edades de los animales

sacrificados, estos se considerarán dentro de la franja de edad superior, de acuerdo con la

definición de material especifico de riesgo.

Por otro lado, los establecimientos deben mantener un registro de los animales sacrificados

mediante fotos que respalden la identificación del animal en la fosa, dentición y toma de

muestra.

El Médico Veterinario Inspector y/o Oficial debe completar el documento DIPOA-PG-

0013-RE1 (Constancia de Decomisos de Animales No Ambulatorios); el cual será

adjuntado a las fotos emitidas por el establecimiento; para ser entregadas una copia para el

dueño de los animales y la otra copia será guardada y registrada por el médico veterinario.

La muestra tomada deberá ser enviada al laboratorio LANASEBE y deberá ir acompañada

por el formulario de laboratorio Recepción de Muestras para Diagnostico-Código SEG-RE-

001.

Una vez que el Médico Veterinario Inspector y/o Oficial, posea los resultados de las

muestras enviadas, procederá a su archivo y lo mantendrá a disposición del SENASA y/o

del propietario de los animales. En caso tal, que los resultados sean positivos debe de

notificarse inmediatamente al coordinador del programa de vigilancia y prevención de

EEB.


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1. Tipo de muestra

1.1. Muestra 1 Sección del obex (forma rectangular del tronco del encéfalo

adyacente al obex) (figura 1). Esta se utiliza como muestra de tejido

fresco para el test rápido o método de inmunodiagnóstico.

Nota: En Costa Rica no está implementado el test rápido o método

de inmunodiagnóstico, por lo tanto la información sobre el manejo

de la muestra tipo 1 solo será contemplada en este instructivo de

manera didáctica.

1.2. Muestra 2 La segunda muestra corresponde al resto del encéfalo que queda

después de haber obtenido la primera más el cerebelo removido con

anterioridad (2a) o en caso de no realizar el test rápido de

inmunodiagnóstico se colocara el tejido encefálico completo (2b-sin

separar el cerebelo y el Obex) (figura 1 y 2).

1.3. Muestra 3 La tercera muestra se obtiene mediante el método de extracción vía

foramen mágnum (figura 3).


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Muestra 1. Obex

Muestra (2a) Muestra de todo el encéfalo (2b)

Figura 1. Vista dorsal del encéfalo y clasificación de muestras

Hemisferios cerebrales

Cerebelo Médula espinal

Obex Figura 2. Encéfalo completo (vista dorsal)


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Figura 3. Estructuras del tronco encefálico (vista dorsal)

2. Recomendaciones

2.1. Las muestras de encéfalo deberán ser colectadas inmediatamente después del

sacrificio del animal y fijadas cuanto antes a fin de minimizar los efectos de

autólisis.

2.2. Asegure que la muestra fijada en formalina incluye: el puente, la médula oblongada

y el cerebelo.

2.3. El fijador o preservador utilizado es formalina neutra al 10 %, este es un producto

irritante para la piel y mucosas, por lo cual se deberá de tomar todas las medidas de

precaución necesarias para evitar el contacto con los ojos. En caso de accidente se

debe lavar con abundante agua.


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2.4. La extracción del cerebro debe ser cuidadosa, a fin de no dañar sitios importantes

del órgano, ya que puede alterar seriamente los resultados del examen

histopatológico.

2.5. Por ningún motivo los tejidos fijados en formalina podrán ser congelados.

2.6. Todos los frascos utilizados para el envió de muestra deben estar adecuadamente

rotulados e identificados con tinta indeleble.

2.7. Todo material descartable utilizado durante el procedimiento de toma de muestra

debe ser incinerado al final del proceso.

2.8. Es conveniente enviar las muestras fijadas al laboratorio antes del 5º día post

extracción, ya que el fijador debe ser cambiado al 7º día, por lo tanto hay que hacer

envíos parciales o renovar la solución fijadora.

3. MÉTODO 1. EXTRACCION DE LA MUESTRA A TRAVEZ DEL CRANEO

3.1. Equipos y utensilios

3.1.1. Equipo básico del operario

3.1.1.1. Botas

3.1.1.2. Gabacha

3.1.1.3. Delantal

3.1.1.4. Guantes de latex desechables

3.1.1.5. Guantes metálicos de malla

3.1.1.6. Protector Bucal

3.1.1.7. Protector de Pelo

3.1.1.8. Anteojos protectores de policarbonato

3.1.2. Instrumental para extracción del encéfalo

3.1.2.1. Cuchillo curvo mango antideslizante


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3.1.2.2. Cuchillo recto mango antideslizante

3.1.2.3. Segueta para huesos

3.1.2.4. Cincel para huesos

3.1.2.5. Martillo peña

3.1.2.6. Tijeras (punta aguda/roma) de 14 cm

3.1.2.7. Tijeras (punta aguda/aguda) de 14 cm

3.1.2.8. Pinzas anatómicas de 25 cm

3.1.2.9. Pinzas diente de ratón de 25 cm

3.1.2.10. Chaira

3.1.2.11. Hoja de bisturí Nº 24

3.1.2.12. Mango de bisturí para hoja Nº 24.

3.1.3. Material para envío de muestras

3.1.3.1. Recipientes o frascos (plástico) de 4 a 6 litros, de boca ancha y tapa

hermética.

3.1.3.2. Formalina al 10 %.

3.1.3.3. Lápiz rotulador indeleble

3.1.3.4. Cinta de sellado de un ancho de 5 cm.

3.1.3.5. Hieleras

3.1.3.6. Gel refrigerante


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3.2. Procedimiento de toma de muestra

3.2.1. En todo momento debe utilizar guantes de látex y guantes de malla metálica

como protección.

3.2.2. Realice un corte a través de la articulación atlanto-occipital para separar la

cabeza del cuerpo del animal (figura 4).

Figura 4. Corte a nivel de la articulación atlanto-occipital

3.2.3. A nivel de la piel realice una incisión.

3.2.4. Para exponer el cráneo, órbitas y parte posterior de la nariz realice una

tracción caudal de la piel (figura 5).


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Figura 5a. Exposición del cráneo

Figura 5b. Exposición del cráneo

3.2.5. Para facilitar cortes posteriores remueva cualquier músculo y grasa del área

expuesta y mediante una sierra de carnicero realice un corte transversal a la

cabeza (huesos frontales), a nivel de la parte posterior de cada órbita y con

una profundidad de 1 a 2 cm (figura 6).

3.2.6. A cada lado del cráneo y desde el foramen mágnum efectúe dos cortes

mediante una sierra en un ángulo de aproximadamente 45 º respecto al eje

vertical (figura 6).


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Figura 6a Figura 6b

Figura 6c Figura 6d

Figura 6e. Figura 6f.


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3.2.7. Inserte un cuchillo firme o cincel de hueso en el corte transverso. Haga

palanca y extraiga hacia arriba la tapa del cráneo (figuras 7). Al traccionar se

debe tener precaución de evitar desgarros en los anexos o fijaciones

(meninges). Las meninges se cortan (mediante tijeras) cuando se remueve la

tapa del cráneo. Al retirar la fracción de los huesos seccionados, se visualiza

la duramadre (meninge externa que se caracteriza por ser una membrana

densa y resistente de tejido fibroso), esta deberá ser cortada

longitudinalmente en su línea media y apartada lateralmente para visualizar

tejido encefálico.

Figura 7. Exposición del cerebro

3.2.8. Corte las meninges entre los hemisferios cerebrales y sobre el cerebelo.

Remueva cuidadosamente (figura 8).


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Figura 8. Corte de las meninges

3.2.9. La cabeza debe ser invertida hacia el operador y apoyándola en los cóndilos

occipitales. Sostener la cabeza con la nariz y mandíbula hacia arriba para

permitir que la gravedad ayude a remover el cerebro de la cavidad craneana,

de manera que el encéfalo se desprenda por su propio peso. Cortar las

adherencias del cerebro comenzando por los bulbos olfatorios, nervios

ópticos, tallo hipofisiario y el resto de los pares craneanos. De este modo, se

irá liberando el cerebro. En su porción posterior se localizará el repliegue

meníngeo (tentorio) que es un pliegue transversal existente entre el cerebelo

y los hemisferios cerebrales, el cual se debe cortar y remover

cuidadosamente. Recuerde en todo momento desprender suavemente el

cerebro de la cavidad craneana, mientras se cortan las adherencias.

3.2.10. Deposite cuidadosamente el cerebro sobre una superficie limpia y seca.

Remueva el cerebelo efectuando un corte posterio-anterior a nivel de su base

para exponer el área a muestrear (obex-medula) (figura 1).

4. MÉTODO 2. EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA VÍA FORAMEN MÁGNUM

La zona del encéfalo más importante para el diagnóstico de encefalopatía

espongiforme transmisible (EET), es el tronco encefálico, y específicamente la médula

oblongada a nivel del obex, de modo que esta zona debe estar intacta (figura 3). Por tal

razón, en el sacrificio o eutanasia del animal por ningún motivo utilizar en el caso del

bovino el método de disparo en la nuca.


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El cerebro medio puede ser extraído segura y rápidamente vía foramen mágnum. El

uso de esta técnica requiere de menor cantidad de muestra, facilitando el proceso de

fijación y reduciendo el volumen de fijador. El método ha sido desarrollado por los

Servicios Veterinarios de Investigación de Inglaterra y Wales.

4.1. Instrumental para extracción del tronco encefálico

4.1.1. Equipo y utensilios

4.1.2. Equipo básico del operario

4.1.2.1. Botas

4.1.2.2. Gabacha

4.1.2.3. Delantal

4.1.2.4. Guantes de látex

4.1.2.5. Guantes metálicos de malla

4.1.2.6. Cubre bocas

4.1.2.7. Protector de pelo

4.1.2.8. Anteojos protectores de policarbonato

4.1.3. Instrumentos para extracción de encéfalo

4.1.3.1. “Cuchara” especialmente diseñada (figura 18), bordes laterales y

frontal rebajados, con filo en sus borde laterales y dentada en su parte

frontal. La parte dorsal de la “cuchara” presenta un sobre-relieve o

protuberancias para facilitar la adherencia del tejido y su extracción.

4.1.3.2. Tijeras rectas punta aguda/roma de 14 cm.

4.1.3.3. Bisturí con hoja N°24

4.1.3.4. Mango de bisturí para hoja N° 24

4.1.3.5. Pinza anatómica de 18 cm.


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4.1.4. Material para envío de muestras

4.1.4.1. Frascos de boca ancha capacidad 500 ml.

4.1.4.2. Formalina tamponado al 10%

4.1.4.3. Tubos cónicos con tapa rosca-capacidad 50 ml.

4.1.4.4. Hieleras

4.1.4.5. Gel refrigerante

4.1.4.6. Lápiz rotulador indeleble

4.1.4.7. Cinta de sellado de 5 cm. de ancho

4.1.4.8. Protocolo de toma y envío de muestras para el laboratorio

4.1.5. Procedimiento para extraer el tronco encefálico

4.1.5.1. Separar la cabeza a nivel de la unión atlanto-occipital, tan pronto

como sea posible tras la muerte del animal (figura 4).

4.1.5.2. Para facilidad del proceso el operario puede colocar la cabeza

dorsalmente hacia abajo en una mesa de necropsia u otra estructura

adecuada para realizar la extracción de la muestra.

4.1.5.3. Separar cuidadosamente la médula de la duramadre y nervios

espinales mediante disección. Para tal efecto se puede utilizar tijeras

y pinzas o realizarlo con un dedo suavemente. (figura 9).


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Figura 9. Disección de la médula espinal

4.1.5.4. Insertar la “cuchara” a través del foramen mágnum por el espacio

subdural hasta el nivel del puente, enseguida rotar la cuchara en 180

grados a la derecha e izquierda a objeto de completar un giro

completo para separar el tronco encefálico (figura 10 y 11).

Figura 10. Extracción de la muestra vía foramen magnum


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Figura 11. Introducción de la “cuchara”

4.1.5.5. Retirar cuidadosamente la “cuchara” al mismo tiempo efectuando

suave presión hacia arriba con el objeto de sacar completamente el

tronco encefálico (figura 12 y 13).

Figura 12. Extracción de la muestra mediante la “cuchara”


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Figura 13. Extracción completa de la muestra

5. MANEJO Y ENVIO DE MUESTRA

Los tejidos obtenidos mediante los dos métodos se manejaran de la siguiente manera,

según su naturaleza de muestra:

5.1. Muestra 1 Para el manejo de muestras de tejido fresco para el test rápido,

método de inmunodiagnóstico. Se deberá enviar una sección del obex

en forma rectangular (zona del tronco del encéfalo adyacente al obex)

incluyendo medula espinal; el cual deberá ser colocado

inmediatamente en un recipiente con tapa rosca de 50 ml. de

capacidad, y preservarse exclusivamente en frío. La muestra deberá

ser enviada en una hielera bajo refrigeración (figura 14).

Figura 14. Manejo fresco del obex


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5.2. Muestra 2 La segunda muestra corresponde al resto del encéfalo que queda

después de haber obtenido la primera más el cerebelo removido con

anterioridad o en caso de no realizar el test rápido de

inmunodiagnóstico se colocara el tejido encefálico completo (sin

haber separado el cerebelo y el Obex); el cual será colocado

inmediatamente y con suavidad en un contenedor de plástico de boca

ancha que contenga formalina neutra al 10%, considerando una

relación volumen muestra/ volumen fijador = 1:10. Es decir el

tamaño de la muestra debe ser colocado en un contenedor (envase)

que contenga por lo menos 10 veces su volumen de fijador (figura

15).

Figura 15. Muestra fijada en formalina

5.3. Muestra 3 Corresponde a la muestra tomada vía foramen magnum. Se procede a

separar el obex (técnica rápida de diagnostico) (figura 16) y fijación en

formalina del resto de tejido (figura 17). Cabe recalcar que en caso de

no realizar la técnica de diagnostico rápido, se podrá omitir la

separación del obex y toda la muestra deberá ser fijada en formalina.


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Muestra fijada en formalina Obex

Figura 16. Determinación de la muestra

Figura 17. Muestra 3 fijada en formalina

Es importante recalcar que no deberá transcurrir más de dos horas entre la muerte del

animal y la inmersión de la muestra en formalina.


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6. QUÍMICOS UTILIZADOS EN LA DESINFECCIÓN

6.1. Superficies

a) Hipoclorito de sodio dilución igual o mayor al 2%; aplicado por una hora

a 20º C.

b) Hidróxido de sodio 2 N; aplicar por una hora a 20º C.

6.2. Equipos

a) Hipoclorito de sodio dilución igual o mayor al 2%; durante toda la noche.

b) Hidróxido de sodio 2 N; aplicar por una hora a 20º C; durante toda la

noche.

6.2.1. Desinfectante de cortes accidental de piel.

6.2.2. Jabón desinfectante.

6.2.3. Toalla de papel desechable.

6.2.4. Paño esponja desechable.

6.2.5. En caso de heridas o cortes accidentales en la piel, se debe desinfectar con

Hidróxido de sodio 1N, aplicando una tórula en área afectada durante 5

minutos y posteriormente lavar con abundante agua.

Figura 18. Cuchara para la extracción de muestra vía foramen magnum


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7. DETERMINACIÓN DE LA EDAD DE LOS ANIMALES SEGÚN SU

DENTICIÓN

La determinación de la edad de los animales se realiza evaluando los dientes, de acuerdo a

la información suministrada en la tabla 1 y la figura 19.

Ejemplo Dientes

permanentes

Dientes

Falsos

Categoría Edad

(meses)

0 8 Joven menos de 22

2 6 Joven 22 a 27

4 4 Adulto-joven 27 a 37

6 2 Adulto 36 a 48

8 0 Adulto más de 48

Tabla 1. Determinación de la edad de los bovinos según su dentición


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En la figura 19 se muestra un animal con todos sus dientes falsos.

Figura 19a. Vista frontal Figura 19b. Vista dorsal

En la figura 20 se muestra un animal con 2 dientes permanentes y el resto falsos





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En la figura 23 se muestra un animal con todos sus dientes permanentes.


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