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INFORME FINAL
DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
“Utilización de desechos agroindustriales en la remoción
de plaguicidas organoclorados”
CGPI No.20050337
PARTICIPANTES: M. en C. BLANCA ESTELA BARRAGAN HUERTA (ENCB-IPN)
DRA. REFUGIO RODRIGUEZ VAZQUEZ (CINVESTAV-MEXICO)
ING. CELESTINO ODÍN RODRÍGUEZ (ENCB-IPN)
México, DF., 22 de febrero de 2006
1
I. RESUMEN____________________________________________________ El café constituye uno de principales productos agrícolas generadores de divisas en varios
países en vías de desarrollo incluido México, quien ocupa el quinto lugar a nivel mundial res-
pecto a la producción de grano de café, con una producción promedio anual de 210 000 tone-
ladas (ASERCA, 2004). De la cantidad producida de grano verde de café, aproximadamente el
5% se retira del mercado por calidad inferior (DOF, 2001, 2002), siendo necesario realizar
trabajos de investigación para aprovechar los desechos de este recurso natural.
Por lo anterior, es importante realizar estudios acerca de la utilización de los desechos del gra-
no verde de café como sustrato en procesos de biodegradación de plaguicidas enfocándonos en
este estudio a plaguicidas organoclorados como el DDT y el endosulfan
Mediante técnicas de resiembra y enriquecimiento usando el plaguicida organoclorado penta-
cloronitrobenceno como única fuente de carbono e inhibidor de hongos, se aislaron e identifi-
caron cinco cepas bacterianas asociadas al grano verde de café con capacidad para degradar
plaguicidas organoclorados. Las cepas más activas se utilizaron para determinar la capacidad
de crecimiento y degradación en medio líquido, usando el grano verde de café como sustrato,
comparando su eficiencia dos fuentes de carbono tradicionales con son la glucosa y la pepto-
na.
Para determinar la capacidad de crecimiento de las diferentes cepas en los 3 medios propues-
tos y en presencia del plaguicida se estandarizó la metodología para la determinación de bio-
masa en peso seco. Para medir la degradación de plaguicidas se utilizó la técnica de cromato-
grafía de gases usando detector de captura de electrones. Para ello se estandarizó la técnica de
extracción y análisis a través de pruebas de recuperación en los diferentes medios y cepas. Se
trabajó con la técnica de extracción liquido-líquido.
.
2
II. INTRODUCCIÓN___________________________________________________
El uso de residuos agroindustriales en procesos de remoción de contaminantes es de gran inte-
rés, pues además de tener una contribución como material adsorbente, soporte para el creci-
miento y fuente de nutrientes, se utiliza un material de desecho de
bajocosto. Algunos residuos agroindustriales como la cascarilla del arroz (Adachi, 2001)
(Daifullah,2003), aserrín del árbol de mango (Ajmal,1998), aserrín de pino (Shukla, 2002),
café gastado y té (Minamisawa, 2004), entre otros han sido utilizados como adsorbentes en
procesos de remoción de metales y compuestos orgánicos, entre ellos plaguicidas de efluentes
industriales. La eliminación de plaguicidas se ha estudiado también utilizando paja de trigo
que sirve como fuente de carbono y soporte de los microorganismos (Aslan, 2004).
II.1. Café Las dos especies de café de mayor importancia mundial son Coffea arabica y Coffea canep-
hora conocidas comercialmente como Arábica y Robusta respectivamente. Por lo común el
café crudo se denomina de acuerdo a su origen, es decir por el país de procedencia. La califi-
cación del café crudo (categorización) se realiza atendiendo el tamaño, color, forma, consis-
tencia y corte de los granos. Los granos deficientes (semillas inmaduras, dañadas por las llu-
vias o resecos), se retiran puesto que alteran ostensiblemente el sabor en su conjunto.
El cultivo de café en México representa uno de los principales productos generadores de divi-
sas y es un importante generador de empleos en las zonas de alta marginación donde se ubica.
México ocupa el quinto lugar dentro de los países exportadores de café, con una producción
promedio de 210, 000 toneladas anuales en los últimos 5 años (ASERCA,2004).
Actualmente, el comercio mundial de café se ve afectado, entre otras causas, por la sobrepro-
ducción del aromático, lo que ha repercutido en la pérdida de valor del producto a niveles que
no permiten la recuperación de los costos del cultivo, por lo cual los principales países produc-
tores del aromático han acordado retirar del mercado el café de calidades inferiores.
Para tal efecto la Asociación de Países Productores de Café (APPC) emitió la Resolución
01/2001 que contiene la propuesta del Programa de Mejoramiento de la Calidad del Café,
3
misma que fue adoptada el 24 de mayo de 2001 por la Organización Internacional del Café
(OIC) en su resolución 399.
En junio de 2001 se concreta el Programa que considera la eliminación de 5% de la oferta ex-
portable, a partir de los cuales cinco países productores, incluidos México, Brasil y Colombia,
estructuraron los mecanismos de establecimiento del programa.
El 13 de diciembre de 2001 fue publicado en el Diario Oficial de la Federación el Decreto
que establece el Programa de Retiro de Café de Calidades Inferiores y el 22 de marzo del
2002 se emiten en el mismo Diario Oficial las Reglas de Operación del Programa de Retiro
de Café de Calidades Inferiores para el ciclo 2001-2002. Dentro de estas reglas se establece
que a través del Consejo Mexicano del Café, el café retirado, se pulverizará , acondicionará y
empleará para usos alternos no aptos para consumo humano, entre otros en la transformación
en combustible orgánico, composta, fertilizante, complemento de alimento para ganado ó des-
trucción definitiva.
Considerando la gran cantidad de café que se está desechando por esta razón adicionalmente a
la que se obtiene dentro del mismo proceso de selección en la producción de café , es necesa-
rio realizar trabajos de investigación con el fin de aprovechar este recurso natural.
II. 2. Componentes químicos del café.
La superficie del fruto al principio es verde, se colorea luego de rojo o violeta al madurar y
contiene en su pulpa dulce (mesocarpio) dos semillas que contactan por su cara lisa . Por 100
g de café seco (INCAP, 1978).se obtiene 29% pulpa seca (mesocarpio) de café, 12% cascari-
lla de pergamino (epicarpio), 4% mucílago y 55% granos de café verde ó grano oro (Fig 1)
a b
Figura 1. Fruto del grano de café maduro en el árbol (a) y grano verde de café (b)
4
La composición del café crudo depende de cual sea la clase de éste, su origen, obtención e
influencias climáticas. El cuadro 1 aporta información al respecto (Belitz and Grosh, 1997).
Cuadro 1. Composición del café crudo (cifras en % base seca)
Cantidad Componente Intervalo de variación
Extracto acuoso 29 - 36.2 Proteína bruta 8.7 - 12.2 Grasa 8.3 - 17.0 Azucares reductores (b) 0 - 0.5 Azucares reductores tras la inversión ( c ) 2 - 9 Sacarosa 6 - 7 Fibra bruta 10 - 11.7 Ácido cítrico 0.5 - 1.15 Ácido málico 0 - 0.5 Ácido oxálico < 0.2 Ácidos clorogénicos 4.5 –11.1 Cafeína 0.9 – 2.6 Trigonelina 0.24 - 1.2 Minerales 3 - 5.4
(b). Expresados como glucosa (c) Expresados como sacarosa
II.2.1. Carbohidratos.
Casi la mitad del grano verde de café está constituido por polisacáridos. De los polisacáridos
62.4% corresponde a celulosa y el 10.8% a lignina (Viegra, 2002).
Un estudio sobre Robusta y Arábiga (Bradbury,1990), mostró que el grano verde contiene
48% de polisacáridos, constituidos por manosa (22.4%), galactosa (12.4%), glucosa (8.7%) y
arabinosa (4%) con cantidades menores de ramnosa(0.3%) y xilosa (0.2%). Entre los polisa-
cáridos presentes se tiene celulosa , hemicelulosa y lignina.
Además de los polisacáridos, el grano verde de café contiene diversas clases de azucares de
bajo peso molecular (mono-, di- y trisacáridos). La sacarosa es el principal azúcar libre y está
presente en hasta el 8% en peso base seca.
II.2.2 Compuestos nitrogenados.
Contiene principalmente los alcaloides, aminoácidos y proteínas. La cafeína (I) es el alcaloide
mas conocido del café y se encuentra en un 1-2 % en base.
5
La trigonelina (II) es un componente del café que ha recibido mucha atención debido a su ac-
tividad antitumoral. Se encuentra presente en casi el 1% en base seca y es térmicamente ines-
table, produciendo otros compuestos nitrogenados como piridinas y pirroles durante el tostado.
NH+
O
O
-N
N
N
NO
O
(I) (II)
II.2.3 Ácidos carboxílicos.
Varios ácidos se encuentran presentes en el café que le proporcionan su sabor . El tipo y pro-
porción de los mismos cambia durante el tostado. Por ejemplo el ácido 2-Metilvalérico impar-
te sabor a cocoa o chocolate, mientras que el ácido pirúvico imparte un sabor a caramelo que-
mado. En café verde, los ácidos no volátiles como el cítrico, málico, oxálico y tartárico cons-
tituyen el 2 %. En café tostado cerca
de 30 ácidos alifáticos han sido identificado. Ellos incluyen 15 ácidos monocarboxílicos no
volátiles C1-C10, mientras que el resto son volátiles. En general durante el tostado disminuye
el contenido de ácidos.
El café verde contiene un 5-10% de ácidos clorogénicos (III), que poseen actividad antioxi-
dante.
(III)
6
II.2.4. Otros.
El café verde contiene pequeñas cantidades de tiamina (2ppm), niacina (14 ppm) y rifloflavi-
na (1ppm) y minerales como potasio, calcio fierro y magnesio .
Durante el tostado se producen en la zona térmica de los 200-250 °C transformaciones caracte-
rizadas exteriormente por un aumento de volumen (50-80%), modificaciones estructurales y
del color, disminución del peso y especialmente por la formación de un aroma típico que no
existe en el grano crudo.
II. 3 Plaguicidas
II.3.1 Definición de plaguicidas Plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias que se destina a controlar cualquier
plaga, incluidos los vectores que transmiten enfermedades humanas y de animales, las espe-
cies no deseadas que causen perjuicio o que interfieran con la producción agropecuaria y fo-
restal. Se incluyen en esta definición las sustancias defoliantes y las desecantes (CICLOPLA-
FEST, 1998).
II.3.2 Clasificación.
Los plaguicidas se pueden clasificar de varias maneras. A continuación se presentan las más
comunes (CICLOPLAFEST, 1998):
II.3.2.1 Organismos que controlan
De acuerdo al organismo que controlan los plaguicidas pueden ser: insecticida, acaricida, fun-
guicida, bactericida, antibiótico, herbicida, rodenticida o molusquicida.
II. 3.2.2 Modo de acción
El ingrediente activo puede ser:
7
a) De contacto: actúa principalmente al ser absorbido por los tejidos externos de la plaga.
b) De ingestión: debe ser ingerido por la plaga para su acción efectiva.
c) Sistémico: Al aplicarse en plantas o animales se absorbe y traslada por su sistema vascular
a puntos remotos del lugar en que se aplica y en las cuales actúa.
d) Fumigante: Se difunde en estado gaseoso o de vapor y penetra por todas las vías de absor-
ción.
e) Repelente: Impide que las plagas ataquen.
f) Defoliante: Causa la caída del follaje de las plantas.
II.3.2.4 Composición química
Los ingredientes activos pueden ser:
a) Compuestos inorgánicos: Estos son compuestos que carecen de carbono. En este catalogo
sólo se Consideran los derivados de cobre, azufre, zinc y aluminio.
b) Compuestos orgánicos: Son aquellos que contienen átomos de carbono en su estructura
química .La mayoría son de origen sintético, fabricados a partir de compuestos químicos
básicos; algunos son extraídos de plantas, por lo que se conocen como botánicos.
c) Plaguicidas biológicos: Se llama así a los virus, microorganismos o derivados de su meta-
bolismo, formulados como insumos, que pueden controlar a una plaga en particular.
II.3.2.5 Por su estructura química. También se clasifican de acuerdo al grupo funcional químico presente en su estructura: Alifá-
ticos halogenados, cíclico alifáticos clorinados, aromáticos halogenados, fenoxialcanoatos
clorinados, acilanilidinas (derivados de la anilina), derivados del ciclodieno, carbamatos, pire-
troides, derivados de las triazinas y organofosfonatos
Ejemplos de algunas estructuras se dan en el cuadro 2.
8
Cuadro 2. Estructuras químicas de algunos pesticidas.
II.3.2.6 Por su persistencia Se define como la capacidad de cualquier plaguicida para retener sus características físicas,
químicas y funcionales en el medio en el cual es transportado o distribuido, durante un periodo
limitado después de su emisión.
Los plaguicidas se clasifican de acuerdo con su periodo de persistencia en:
Ligeramente persistentes: menos de cuatro semanas Poco persistentes: de cuatro a veintiséis semanas Moderadamente persistentes: de veintisiete a cincuenta y dos semanas Altamente persistentes: más de un año y menos de veinte.
Cl C
H
C ClCl
Cl
Cl
Aromáticos halogenados
ClCl
ClCl
Cl
Cl
Ciclicalifáticos clorinados
Lindano
C2H5
N
C2H5
CH2OCH3
C-CH2Cl
ODerivados de la anilina
AlaclorDDT
O2N OP
S
OCH2CH3
OCH2CH3
Organofosfonato
Paration
OCH2COOH
Cl
Cl
Fenoxialcanoatos clorinados
2,4-D
Cl
Cl
O
O
O
Piretroides
Permetrina
O
ClCl Cl
Cl
ClCl
Ciclodieno
Dieldrin
NOCH3S-C-CH
NHCH3
O
Carbamato
Aldicarb
CH3-CH-CH-CH3
Br Br
Halogenados alifáticos
2,3-dibromobutano
9
Permanentes: mas de veinte años Los plaguicidas que persisten más tiempo en el ambiente, tienen mayor probabilidad de inter-
actuar con los diversos elementos que conforman los ecosistemas. Si su vida media y su per-
sistencia es mayor a la frecuencia con la que se aplican, los plaguicidas tienden a acumularse
tanto en los suelos como en la biota. En el cuadro 3 se dan algunos ejemplos de la persistencia
y bioacumulación de plaguicidas.
Cuadro 3. Ejemplo de la persistencia y bioacumulación de plaguicidas
Plaguicidas Persistencia en suelos Factor de ( SEMANAS) bioconcentración Organoclorados 4,444(pez) Aldrín 530 3,300 (pez) Dieldrín 312 1,000 (ostra) Endrín 624 70,000 (ostra) DDT 546 60 (ostra) Hexaclorobenceno HCB) 208 60 (ostra) X- Hexaclorociclohexano (x- HCH)
728
Organofosforados 0(camarón) Malatión 2
Paratión 8 9(n.e.) Forato 2 0(pez) Carbamatos Carbaryl 2 0(ostra) Carbofuran 8-16 0 Varios
0(ostra) Diclorvos 8 Captan 1 0 2.4.5-T 1-12 0 Cloruro de etilmercurio permanente 3,000(pez)
II.3. 2.7 De acuerdo a su toxicidad Según la Organización Mundial de la Salud se clasifican de acuerdo al cuadro 4.
Por ejemplo el Pentaclorofenol con un LD50= D80 pertenece a la clase Ib, el DDT con un
LD50 = 113, pertenece a la clase II, el Endosulfán con LD50 = 80 pertenece a la clase II. El
Quintozeno (Pentacloronitrobenceno) con un LD50 >10000 no está clasificado, sin embargo
su metabolito principal es el Pentaclorofenol
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Cuadro 4. Clasificación de los plaguicidas de acuerdo a su toxicidad
Clasificación de acuerdo a la OMS
Clase Toxicológica
Descripción
Ia Extremadamente peligroso
Ib Altamente peligroso
II Moderadamente peligroso
III Ligeramente peligroso
Tabla 5 No parece presentar toxicidad aguda con uso normal
Tabla 6 No clasificado : se cree obsoleto
LD50 en ratas (mg de químico/por kg de peso corporal)
Sólidos (oral)
Líquidos (oral)
Sólidos (dermal)
Líquidos (dermal)
‹ 5 ‹ 20 ‹ 10 ‹ 40
5-50 20-200 10-100 40-400
50-500 200-2,000 100-1,000 400-4,000
› 500 ›2,000 ›1000 › 4,000
› 2,000 › 3,000 --- ---
Tabla 7 Fumigantes no clasificados por la OMS
II.3. 3. Análisis de plaguicidas.
El análisis de plaguicidas es en general complejo debido a variedad en estructuras químicas
que presentan (organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, etc). Cada uno
puede ser analizado por un método analítico diferente dependiendo de su estructura química
particular.
Debido a que el efecto tóxico de los plaguicidas se manifiesta en concentraciones muy bajas,
el método utilizado para determinarlos debe ser muy sensible, como lo es la cromatografía.
La cromatografía de gases con Detector de Captura de Electrones (ECD), se recomienda para
evaluar plaguicidas organoclorados (Método EPA 8080). Para plaguicidas Organofosforados
es recomendable usar el Detector de Nitrógeno-Fósforo (NPD), para los carbamatos se reco-
mienda el uso de cromatografía de líquidos de alta resolución (Patnaik,1997).
En estos métodos, la identificación se realiza por comparación de los tiempos de retención del
problema contra un estándar, lo cual no es suficiente evidencia en la mayoría de los estudios
toxicológicos y de remediación. En estos casos la confirmación de la identidad por espectro-
metría de masas es recomendable.
11
La mayoría de los pesticidas pueden ser analizados por cromatografía de gases acoplada a ma-
sas, usando el metodo EPA 8270ª. En dicho método se describen las condiciones, los tiempos
de retención, los iones primarios y secundarios. En cuadro 5 se dan algunos ejemplos.
Cuadro 5. Iones primarios y secundarios de algunos ejemplos
Pesticida Ión primario Iones secundario Diclorvos 109 109, 185, 79,145 Pentaclorofenol 266 264,268 PCNB (quintozeno) 237 250,252,108,248, 215,254 Carbofuran 164 164,149, 131, 122 Aldrin 66 263,265,79,261 DDT 235 235,237,165,236,239 Clordano 373 375,377
Fuente: Metodo EPA 8270ª
Previo al análisis cromatográfico, se requiere un proceso de extracción y de limpieza de la
muestra. Para compuestos semivolátiles y no volátiles en suelo, como sería éste el caso, la
extracción de los analitos puede realizarse por el Método EPA 3540 basado en una extracción
Soxhlet.
Las técnicas de limpieza de los extractos se recomienda hacerla por cromatografía de adsor-
ción en florisil (Método EPA 3620), tanto para pesticidas organofosforados como organoclo-
rados.
II.3.4 Uso de plaguicidas en México
El volumen de la producción de plaguicidas formulados y técnicos no varió entre 1995 y 1998,
manteniéndose un consumo alrededor de las 50 mil toneladas para los primeros y en cerca de
20 mil toneladas para los segundos (INE,2000).
La producción de plaguicidas técnicos de acuerdo a su uso se muestra en la figura 2
12
Insecticidas34%
Otros8%
Fungicidas27%
Herbicidas31%
Figura 2. Producción de plaguicidas de acuerdo a su uso
De entre los insecticidas más utilizados se encuentran el Paratión metílico (37.47%), el Me-
tamidofos(10.62%) , el Endosulfán (6.14%) y el Clorpirifos (5.92%). Los herbicidas más utili-
zados son el 2,4-D (16%), el Paraquat (13.81%), y la Atrazina (12.80%). Los funguicidas más
utilizados son Mancozeb (43.08%) Clorotalonil (18.81%) y el Oxicloruro de cobre (9.62%).
En el cuadro 6 se listan los plaguicidas de mayor uso a nivel nacional reportados y resumen
sus posibles efectos al ambiente y a la salud humana.
Cuadro 6. Plaguicidas de mayor uso a nivel nacional Plaguicidas T* Persistencia Efectos ecológicos Efectos en salud humana si se mane-
jan inadecuadamente Paratión I Ligeramente Extremadamente peli-
groso para animales de sangre caliente (mamífe-ros y aves) y altamente tóxico para abejas
El paratión metílico es extremada-mente peligroso por inhalación, in-gestión y de rápida absorción por la piel. Produce efectos en la reproduc-ción, disminución del peso testicular. Teratogénico y potencialmente car-cinogénico
persistente
II Tóxico para abejas, pájaros y otras formas de vida silvestre
Altamente peligroso, irritante dérmi-co y del tracto respiratorio Metamidofos
IV Poco persisten-
te en suelo Altamente tóxico para peces y abejas
Irritante dérmico, de mucosas y del tracto respiratorio. Potencialmente teratogénico
Malation
13
III Poco persisten-te
No tóxico para peces y abejas
Irritante dérmico. Carcinogénico, teratogénico y mutagénico 2,4 D
IV Irritante ocular. El daño puede ser irreversible. Causa reacciones alérgi-cas. Carcinogénico en ratas
Clorotalonil Poco persisten-te
Tóxico para peces No aplicar donde los
mantos acuíferos sean poco profundos o los suelos sean muy per-meables. Evítese conta-minación de cuerpos de agua por arrastre pro-fundo
Irritante dérmico y ocular. Efectos de sensibilidad. Embriotóxico en anima-les a altas dosis y se ha relacionado con el aumento del riesgo de cáncer de ovario.
Atrazina IV Medianamente
persistente .
Irritante dérmico y de mucosas. Es-timulante del sistema nervioso cen-tral. Potencialmente teratogénico y carcinogénicoen humanos y animales
II Medianamente persistente
Tóxico para peces, aves y abejas Endosulfán
Si se ingiere produce fibrosis pulmo-
nar, irritante ocular, potencialmente teratogénico y carcinogénico en humanos
Paraquat II Poco persisten-te
Tóxico para peces y pájaros
Clorpirifos III Poco persisten-
te Tóxico para peces, crus-táceos,aves y abejas
Irritante dérmico Carbofuran: II Poco persisten-
te Tóxico para peces, abe-jas y vida silvestre Ex-tremadamente tóxico a aves
Neurotóxico. Se ha observado dege-neración testicular en perros bajo estudio de toxicidad crónica. Terato-génico y genotóxico.
Captan IV Poco persisten-te
Tóxico para peces Puede causar reacción alérgica en la piel. Teratogénico y carcinogénico en animales y potencialmente en humanos
* CT: Categoría toxicológica. Fuente: INE (2000)
II.3.5 Contaminación por plaguicidas en México.
Los plaguicidas contribuyen al incremento en los rendimientos de las cosechas y a limitar la
dispersión de ciertas enfermedades. Sin embargo los plaguicidas tienen efectos peligrosos,
pueden causar daño a la salud humana y al medio ambiente.
Con el incremento progresivo en la producción y aplicación de compuestos químicos en las
actividades agrícolas, se han generado en todo el mundo problemas de contaminación y aguas
superficiales y subterráneas ( Mansour, 2004).
El destino y comportamiento de los plaguicidas en el medio ambiente involucran varios fenó-
menos diferentes y frecuentemente simultáneos, tales como procesos de transformación quí-
mica y biológica, escorrentía, lixiviación , volatilización y erosión por el viento (Figura 3).
14
Como se puede deducir del inciso anterior, puede apreciarse que Existen pocos datos acerca de
la contaminación por plaguic
Figura 3. Contaminación por plaguicidas
A pesar de que aparentemente en nuestro país, los plaguicidas organoclorados como el Diel-
drín, Aldrín, DDT, BHC, entre otros, han dejado de producirse y usarse desde 1999, estudios
recientes demuestran la presencia de estos plaguicidas en muestras ambientales y humanas.
En el año 2002, Favari y colaboradores realizaron un estudio en la presa Ignacio Ramírez (Es-
tado de México), y reportaron la presencia en agua de los plaguicidas organoclorados Aldrin
(0.02470 mg/L, Dieldrin (0.2797mg/L) y Endrin (0.1770 mg/L), y de los plaguicidas Organo-
fosforados Metilparation (0.210 x10-3 -3 mg/L), Malation (0.13x10 mg/L). Tanto los insectici-
das organoclorados como organofosforados fueron bioconcentrados de 2-10 veces del agua a
las algas, 10 a 25 veces en zooplancton y de 8 a 140 veces en peces. El límite en aguas de
abastecimiento para uso público urbano y riego agrícola es de 0.001 mg/L (CNA, 2003).
15
Otro estudio realizado en el Estado de Morelos( López-Carrilo, 2001), indicó que el contenido
en leche materna en mujeres lactantes es del orden de 21.8 ng/mL de DDE y 2.93 ng/mL de
DDT respectivamente. El origen de estos plaguicidas pueden ser alimentos o agua contamina-
da.
Yánez y colaboradores (2002), determinaron los niveles de DDT y Dettametrina en suelos ,
sedimentos y sangre de la población en comunidades de Chiapas, Oaxaca, la Huasteca y San
Luis Potosí (control). La mayor contaminación por DDT se presenta en Chiapas con niveles de
DDT en suelo de 3316 a 8229 microgramos/Kg , de 1527 a 2562 microgramos/Kg en Oaxaca
y de 105 a 365 microgramas/Kg en San Luis Potosí. La cantidad máxima recomendada
(ODEQ, 2000) por el Departamento de Calidad Ambiental del Estado de Oregon con fines de
limpieza es de 2 mg/Kg.
Las concentraciones de DDT determinadas en sedimento de río estuvieron entre 20-35 micro-
gramos/Kg, de 551 a1899 microgramos/Kg en sedimento marino y de 194 a 4290 microgra-
mos/Kg en manglares. Todas las muestras rebasaron el valor de 4.48 microgramas/Kg reco-
mendado para sedimentos en la Guía canadiense (Environment Canada, 2001). Las concen-
traciones medias de DDT y DDE medidas en sangre fueron de 67.8 y 86.7 microgramos/L
para niños que viven en Chiapas y de 27.1 y 60.8 microgramos /L para adultos respectivamen-
te. Los fumigadores en Chiapas tiene los niveles más altos con 165.5 y 188.4 microgramos de
DDT y DDE respectivamente. Los niveles tan altos encontrados en niños son similares a los
que se presentan en Sudáfrica, donde el DDT está actualmente en uso para el control de la
malaria (Bouwman, 1991)
Un estudio más reciente (Barrientos, 2004), en tierras de cultivo del Estado de México, mues-
tran la presencia de : p,p’-DDT, p,p’-DDD, endosulfan I y II, alfa y beta HCH. El cultivo de
caña presenta la mayor concentración de p,p’-DDT tanto a los 20 cm como a los 40 cm
(0.1022 mg/Kg y 0.0900 mg/Kg), en segundo lugar el frijol a los 20 cm (0.0843 mg/Kg), en
tercero el maíz a los 40 cm (0.0784 mg/Kg) y por último el arroz tuvo una concentración
homogénea en los 40 cm (0.0623 mg/Kg).
No existe en México un inventario acerca de la contaminación de aguas o suelos por compues-
tos orgánicos peligrosos. En un reporte acerca de la contaminación de cuerpos de agua
16
(INE,2000), se muestra que las regiones Lerma-Balsas, Valle de México y Sureste son las más
contaminadas. Por ejemplo, la cuenca hidrológica del Valle de México contiene el 2.17% del
agua levemente contaminada, el 26% contaminada, el 23.91% fuertemente contaminada y el
47.83% fuertemente contaminada. Respecto a suelos sólo se ha considerado la contaminación
por hidrocarburos.
Los índices de Calidad (ICA) para cuencas hidrológicas considerados para determinar el grado
del agua no considera la presencia de compuestos químicos orgánicos (como los plaguicidas),
o inorgánicos, como los metales pesados, de manera que la clasificación de estos cuerpos de
agua y el grado de prioridad para su saneamiento pudieran cambiar de incluirse este otro tipo
de indicadores de riesgo ambiental.
Como parte del proyecto “Disminución de la contaminación de los suelos afectados por el uso
de pesticidas en la zona oriente del Estado de Tlaxcala” clave TLAX-2003-C02-12416 apro-
bado por el fondo Mixto CONACYT-TLAXCALA, se realizó un análisis cualitativo a mues-
tras de suelo colectadas en el estado de Tlaxcala encontrándose la presencia de DDT, Hepta-
cloro, endosulfan y sulfato de endosulfan.
Por lo anterior se ha considerado seleccionar al DDT como uno de los plaguicidas modelo
para realizar los estudios de biodegradación utilizando las bacterias asociadas al grano verde
de café de calidad inferior.
II. 3.6. Procesos de eliminación de plaguicidas.
El DDT pertenece a una clase de compuestos sintéticos de difícil degradación que se designan
como antropogénicos, xenobióticos, biorrefractarios ó biológicamente recalcitrantes.
Por muchos años se han utilizado grandes cantidades de ese tipo de compuestos con diversos
fines con los consecuentes daños a la salud y al ambiente. Sin embargo, es imposible eliminar
esas substancias del ambiente toda vez que su uso permite, como en el caso de los plaguicidas,
continuar manteniendo los niveles de producción agrícola que sustentan la vida de la pobla-
ción mundial.
17
Por lo tanto, la estrategia es limitar la descarga de esos contaminantes al ambiente tanto como
sea posible y de removerlos también tanto como sea posible. Para remover los pesticidas de
agua se han usado la ozonización (Okamura, 1992)9) o la hidrólisis alcalina (Drossman, H., et
al., 1988). El problema es el costo, además de que en algunos casos los productos generados
tienen mayor toxicidad que los reactantes.
La eliminación por adsorción ha sido utilizado como una alternativa, aunque el carbón usado
puede crear problemas de disposición final o si se quema puede conducir a problemas ambien-
tales adicionales (Alam et al., 2000).
A gran escala, los tratamiento biológicos son los proceso más económicos para la mineraliza-
ción tanto de compuestos orgánicos naturales como antropogénicos.
II.3.6.3 Biodegradación de compuestos orgánicos.
Eliminación Los modos metabólicos pueden ser, aeróbico o anaeróbico. Dadas sus caracterís-
ticas estructurales, los compuestos xenobióticos como los plaguicidas organoclorados, pueden
requerir condiciones de anaerobiosis (Knackmuss, 1996) para reducir la electrodeficiencia
molecular y facilitar así su posterior degradación .
Las estrategias para lograr mineralización de compuestos Xenobióticos incluyen la integración
de procesos anerobios y aerobios, la secuenciación de estos procesos, o bien la creación de
nichos microambientales con baja tensión de oxigeno (Knackmuss, 1997) (Middeldorp, 1997)
( Martins dos Santos,2001), (Barragán, 2004) .
II.3.6.3.1 Biodegradación de plaguicidas organoclorados
La literatura disponible sobre degradación microbiana de Xenobióticos muestra que los estu-
dios al respecto consideran dos aspectos : (1) las bases fundamentales de las actividades de
biodegradación y la evolución y transferencia de tales actividades entre los microorganismos,
y (2) la aplicación de técnicas de biorremediación para destoxificar ambientes severamente
contaminados.
Sin embargo el uso de los microorganismos para la biorremediación requiere de un entendi-
miento de los aspectos microbiológicos, fisiológicos y bioquímicos involucrados en la trans-
formación del contaminante. Se conocen muchos microorganismos del suelo capaces de de-
18
gradar plaguicidas. Para los plaguicidas organoclorados algunos microorganismos reportados
se muestran en el cuadro 8 (Singh et al., 1999 y referencias ahí citadas).
Cuadro 8. Microorganismos degradadores de plaguicidas organoclorados.
Plaguicida Microorganismo Plaguicida Microorganismo
Bacterias Bacterias DDT �-HCH
Aerobacter aerognenes Aerobacter aerogenes
Alcaligenes eutrophus A5 Bacillus cereus
Agrobacterium tumefaciens Bacillus megaterium
Arthrobacter sp Citrobacter freundii
Bacillus cereus Clostridium rectum
Bacillus coagulans E coli
Bacillus megaterium Peudomonas fluorescens
Bacillus subtilis Pseudomonas putida
Clostridium pasteurianum Pseudomonas paucimobilis
Clostridium michiganense Pseudomona sp
Enterobacter aerogenes
Erwinia amylovora Cianobacteria
Escherichia coli Anabaena sp
Hydrogenomonas sp Nostoc ellipssosum
Klebsiella pneumoniae
Kurthia zapfii Hongos
Microcccus sp
Nocardia sp Phanerochaete chrysospo-
rium
Serratia marsescens DT-1P
Streptomices annomoneus Trichoderma viride
Streptomyces aureofaciens Phanerochaete sordida
Cyathus bulleri Streptomyces viridochromogens
Xanthomonas sp.
Hongos Cianobacteria Endosulfan
Phanerochaete chrysosporium Anabaena sp
Trichoderma viride
19
La remoción de los sutituyentes halógeno es un paso clave en la degradación de plaguicidas
aromáticos halogenados. Esto puede ocurrir como un paso inicial de una ruta reductiva, hidro-
lítica u oxigenolítica, o después del rompimiento del anillo aromático en un estado final del
metabolismo ( Häggblom,1992).
La dehalogenación oxidativa donde el halogeno es perdido fortuitamente durante la oxidación
del anillo , ocurre sólo bajo condiciones aeróbicas. La dehalogenación hidrolítica (reemplazo
de un halógeno por un grupo hidroxilo), puede ocurrir tanto en aerobias y desnitrificantes. La
dehalogenación reductiva (reemplazo de halógeno por hidrógeno), ocurre sólo bajo condicio-
nes metanogénicas y sulfogénicas.
Adicionalmente, varias reacciones de biotransformación tales como la metilación y la polime-
rización pueden ocurrir y producir metabolitos más tóxicos o recalcitrantes.
Las principales reacciones químicas en la degradación microbiana de plaguicida organoclora-
dos incluyen la declorinación, la dehidroclorinación, la oxidación y la isomerización.
II. 3.6.3.2. Biodegradación de DDT
Se ha reportado (Nadeau et al., 1994) la capacidad para degradar DDT, t anto por hongos como
por bacterias. En condiciones aeróbicas Alcaligenes eutrophus A5, oxida al DDT a través de
una dioxigenasa, dando como producto final el acido 4-clorobenzoico. Un estudio más recien-
te (Bidlan and Manonmani, 2002), aislaron del suelo la bacteria Serratia marcescens DT-IP,
que degradaba completamente en condiciones aeróbicas al DDT en concentraciones no mayo-
res de 15 ppm. Después de sta concentración, se observaban efectos inhibitorios, perdiendo la
capacidad degradadora a 50 ppm del plaguicida. En este caso la degradación fue inhibida en la
presencia de fuentes de carbono auxiliares como citrato o hidrolizados de salvado de arroz. Sin
embargo, la presencia de extracto de levadura, peptona y glicerol favorecían la degradación. El
hongo de la pudrición blanca como Phanerochaete chrysosporium, es capaz de degradar va-
rios compuestos clorinados incluyendo DDT ( Kumar et al, 1996 y referencias ahí citadas).
Las reacciones de biodegradación para el DDT se muestran en la figura 8.
20
CCl3
OHClCl
HClCl
CN
CCl3
HClCl
CCl2
ClCl
CCl2
HClCl
CCl3
HClCl
OHH H
OH
CHCl
ClCl
CH2Cl
HClCl
CH2
ClCl
CH3
HClCl
CH2OH
HClCl
OH
HClCl
CH3
OH
HCl
O
ClCl
DDCN
DDE
DDMU
DDOH
DDMS
DDNU
DDNS
DBH DBPH
HClCl
OH
O
H
HCl
OH
HCl CHO
HClCl
COOHDDA
DDM
PCPA
p-clorofenilglicolaldehído
DDD
CCl3
HClCl
OH OH
CCl3
HCl
OCl
OH COOH
ClHOOC
B
C
Acido 4-clorobenzoico
D
A
OXIDACIÓN EN LODOS
KELTANO Dehidroclorinación
Declorinación reductiva
apertura del anillo
DDE: 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorofenil)etileno); DDD: 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorofenil) etileno; DBH: 4,4’-diclorobenzydrol; DBP: 4,4’-diclorobenzofenona; DDM: bis (4-clorofenil) metano; PCPA: ácido p-clorofenilacético
Figura 8 . Rutas de biodegradación del DDT por microorganismos. Las flechas gruesas indi-
can degradación aeróbica. Los compuestos A y B no han sido identificados; compuesto C, es
un producto de degradación color amarillo, determinado espectrofotométicamente (Singh,
1999).
21
III. JUSTIFICACIÓN___________________________________________________
Se ha demostrado que la adición de café en suelos contaminados por hidrocarburos del petró-
leo favorece la remoción del contaminante (Roldán, 2004). Si bien el proceso de degradación
se realiza por la microflora en su conjunto no se han realizado estudios que demuestren la par-
ticipación de las bacterias asociadas al café en la eliminación de contaminantes
Se han aislado e identificado en el Laboratorio de Xenobióticos del CINVESTAV, los siguien-
tes hongos asociados al café: Penicillium sp, Mucor sp , Aspergillus sp, Aspergillus Níger .
No se han realizado trabajos de aislamiento e identificación de las bacterias que pudieran aso-
ciarse al café, ni tampoco sobre su capacidad de degradar plaguicidas organoclorados.
Se dispone de varias toneladas de grano verde café de calidad inferior, considerado como un
desecho agrícola que puede ser utilizado en procesos de remoción de plaguicida (ProyectoTlax-
2003-C02-12416). Para ello se hace necesario realizar un estudio sobre el tipo de bacterias asocia-
das al grano verde y su capacidad de degradación de plaguicidas
En el presente trabajo se aprovechará el grano verde de café de calidad inferior para la remo-
ción de plaguicidas organoclorados en medio líquido, seleccionando al DDT como compuesto
modelo. Se determinará la contribución que tiene el grano de café de café desde el punto de
vista de aporte de microorganismos (bacterias) y nutrientes. Se determinará la capacidad que
el café tiene para soportar el crecimiento de bacterias degradadoras de plaguicidas organoclo-
rados y promover la degradación de estos contaminantes.
22
V. OBJETIVOS_______________________________________________________
Objetivo general
Utilizar los desechos de grano verde de café en la remoción de plaguicidas organoclorados
como el DDT y el endosulfán
Objetivos particulares
Aislamiento e identificación de las bacterias degradadoras de plaguicidas organo-
clorados.
Determinación del crecimiento de las bacterias asociadas al grano de café verde en
presencia de plaguicidas organoclorados y la capacidad degradadora.
Determinación de la capacidad de degradación de plaguicidas organoclorados por
bacterias asociadas al grano de café verde.
23
VI. PARTE EXPERIMENTAL__________________________________________
VI.1 Aislamiento de las bacterias asociadas al grano verde de café.
El café utilizado en este estudio proviene del rancho Rodríguez del Toro, situado en el estado
de Veracruz.
El aislamiento de las bacterias asociadas al café seleccionado se realizó utilizando el una mo-
dificación al método de Aitken et al ., (8), que consistió en la adición de café (2g) a matraces
conteniendo 40 mL de medio mineral a pH’s de 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5. adicionado con el funguici-
da Pentacloronitrobenceno (PCNB), también conocido como quintozeno a 200 ppm. Se selec-
cionó el PCNB porque es un plaguicida aromático organoclorado y se usó con la finalidad de
eliminar los hongos del medio.
Los cultivos fueron incubados a 30°C con agitación a 100 rpm por 7 días. A partir de este cul-
tivo, se transfirieron 2 mL y se transfirieron a medio mínimo freso. Un mililitro del cultivo
resultante de la cuarta transferencia se adicionó a 9 mL de solución salina 0.85% y se realizó
una dilución serial, inoculando 100 microlitros de la dilución 5 y 6 en cajas de Petri en agar
nutritivo para la cuenta y aislamiento de bacterias (30°C, 24 horas) y 100 microlitros de la
dilución 2 y 3 sobre medio conteniendo rosa de bengala y estreptomicina para verificar la au-
sencia de hongos (28 °C, 5 días).
Por otra parte, el aislamiento de las bacterias que se desarrollaron en placa se realizó con base
la morfología colonial. Las cepas aisladas se identificaron por medio de pruebas bioquímicas.
VI. 2. Determinación de la capacidad de crecimiento en placa con plaguicidas organoclorados
como única fuente de carbono.
Se adicionó por separado 1 mL DDT (50ppm) , endosulfan (50 ppm) y PCNB (200ppm) di-
sueltos en acetona a cajas petri conteniendo agar noble. Se dejó evaporar el disolvente y se
sembraron las cajas con una de las cepas aisladas.
Se incubaron a 30 °C por 24 horas y se observó la formación de colonias sobre el agar.
24
Cl
ClCl
Cl
Cl
NO2
PCNB DDT ENDOSULFAN
Las cepas que se desarrollaron sobre agar noble con plaguicida se seleccionaron para los estu-
dios de degradación en medio líquido .
VI. 3 . Elaboración de la curva de peso seco de biomasa.
Mediante esta curva se transforman los valores de absorbancia obtenidos de la muestra del
medio de cultivo a valores de concentración en gramos de masa celular seca por mililitro
(g/ml).
Para ello se obtuvo una suspensión concentrada del microorganismo a evaluar (Pedroza,
2004), realizando un cultivo de la cepa aislada sobre 200 mL de medio mineral enriquecido
con peptona (2 g/L), e incubando 24 horas con agitación de 100 rpm a 30°C.
Después de este tiempo el cultivo (con Absorbancia a 600 nm mayor a 1.0) las células se la-
varon en condiciones de esterilidad dos veces con solución isotónica (0.85% de NaCl) centri-
fugando a 6000 rpm por 20 minutos, para retirar el medio. Se resuspendió al volumen inicial
(solución de células concentrada) con agua destilada estéril.
Esta suspensión se dividió en dos partes., una de ellas para determinar peso seco y la otra para
hacer las mediciones de absorbancia a 600 nm.
VI.3.1. Determinación de peso seco de biomasa
Se marca y se secan durante 8 horas a 105ºC, 10 tubos de vidrio con capacidad de 25 ml. Se
pasan los tubos secos a un desecador y se dejan enfriar durante 3-4 horas. Se pesan los tubos
en balanza analítica, teniendo siempre la precaución de manipularlos con pinzas limpias, no
con la mano.
25
Se transfieren 10 ml por tubo de la solución de células concentrada a 10 tubos secos. Se llevan
todos los tubos al horno a 105ºC aproximadamente por 24 horas, hasta que el líquido se haya
evaporado y se tenga peso constante para asegurar que no hayan restos de humedad.
Se pasan los tubos al desecador y se dejan enfriar y se pesan en balanza analítica. Se determina
el promedio del peso de los 10 tubos que contienen las células. Expresar la concentración en
gramos de biomasa seca por litro de solución (g biomasa seca/L).
VI 3.2. Construcción de la curva
De la solución concentrada de células se realizan diluciones (por triplicado), tomando 2, 4, 6
y 8 mL y se afora a 10 mL con agua destilada. se lee absorbancia a 600 nm (las lecturas de
absorbancia deben quedar en el intervalo de 0.2 – 0.9).
Con el dato obtenido en el inciso anterior de g biomasa seca/L se calculan las concentraciones
finales para las respectivas diluciones. Se grafica absorbancia promedio en función de concen-
tración celular en g biomasa seca/L.
Se obtiene la ecuación: Abs 600nm = m*C + b ; donde m es la pendiente, C la concentración (g
biomasa seca/l) y b el punto de corte.
VI.3.3. Determinación de biomasa en el medio de cultivo .
Se toman 5 mL del medio de cultivo y se hacen dos lavados con centrifugación a 5000 rpm
por 20 min cada una. Se resuspenden en 5 ml de agua destilada. se agita y se lee absorbancia.
Se interpola el valoe obtenido en la curva de calibración y se obtiene el valor correspondiente
a g biomasa seca/L.
Si la absorbancia es mayor a 0.9, hacer dilución y tenerla en cuenta para los cálculos de con-
centración por la ecuación encontrada.
VI.4 Cinéticas de crecimiento y degradación del plaguicida seleccionado en medio líquido.
Se colocaron por duplicado en un matraz erlenmeyer de 125 mL, 50 mL de medio mineral
estéril pH 6.5 cuya composición (g/L) fue: NaH PO ( 2.4), K HPO (2), CaCl2 4 2 4 2 (0.01),
NH NO ( 0.1), MgSO .7H O (0.1) y suplementado con 3 diferentes sustratos: glucosa (10 4 3 4 2
26
g/L), peptona (2 g/L) y café estéril malla 10/20 (2 g/L). Los dos primeros se agregaron al me-
dio antes de esterilizar y el último antes de inocular.
Se agregaron 40 microlitros de plaguicida (DDT y endosulfan) disueltos en acetona: etanol
(1:1) para obtener una concentración final de 50 ppm. Finalmente se adicionaron 5 mL de cé-
lulas lavadas con solución salina de NaCl (0.85%) y resuspendidas en agua destilada que con-
tenían una concentración de biomasa de 0.3 g/L . Los matraces se incubaron a 30°C a 100 rpm
por 6 días. Se determinó biomasa cada 24 horas y plaguicida residual después de los 6 días de
incubación.
VI.5 Determinación de plaguicidas organoclorados.
La determinación de plaguicidas organoclorados se realizó por cromatografía de gases acopla-
da a masas, previa extracción con cloruro de metileno del medio de cultivo. Se hicieron 3 ex-
tracciones de 10 mL de disolvente cada una dejando reposar 15 minutos antes de separar la
fase orgánica. La fase orgánica se secó con Na SO2 4 y se evaporó. El residuo fue redisuelto en
5 mL de metanol, se filtraron por membrana de Nylon 0.22 �m y 2 microlitos de esta solución
se inyectaron al cromatógrafo.
El método cromatográfico empleado fue el siguiente:
Columna: ZB-5 (5% Fenilmetilsilicona), 30 m, 0.32 mm, 0.25 �m película
Temperatura columna: 140°(2min) después elevar a 5°C/min hasta 240°C (27 min).
Temperatura del inyector: 250 °C, Temperatura línea transferencia: 280°C.
Gas acarreador: Helio Flujo: 1.5 mL/min.
Los plaguicidas utilizados en este estudio fueron de grado técnico, con las siguientes caracte-
rísticas:
Concentración Solubilidad (mg/L) Plaguicida Composición* (%)
Endosulfán 96 Endosulfán I/Endosulfán II 0.32 (64.7:35.3)
DDT 98 DDE/o,p’-DDT/p,p’-DDT 0.001 8.7: 29.8:61.5
PCNB 97.6 --- 0.44
* Determinada por Cromatografía de gases-masas
27
VII. RESULTADOS_Y DISCUSIÒN________________________________________ VII. 1 Aislamiento de las bacterias asociadas al grano verde de café
Con base en la morfología colonial de las cepas crecidas en agar nutritivo, se aislaron cuatro
bacterias diferentes designadas AN-1, AN2, AN-3 y AN-4 (Figura 11). En este medio se
aprecian además unas colonias muy pequeñas de apariencia acuosa con muy poco crecimiento.
En agar con rosa de bengala se comprobó la ausencia de hongos pero se aprecian dos colonias
de lento crecimiento (Figura 12), designadas RB-1 y RB-2.
Las bacterias aisladas son bacilos Gram negativos. Las características morfológicas de las
colonias y la identificación microbiológica realizada por ensayos bioquímicos se indican en
el cuadro 11.
Figura 11. Cepas aisladas del café sembradas en agar nutritivo
28
Figura 12. Cepas aisladas del café sembradas en Agar Rosa de Bengala.
Cuadro 11. Morfología de las colonias aisladas del café .
Cepa Descripción Pseudomona ae-
ruginosa AN-1 Colonias de 5 mm de diámetro color amarillo claro.
Stenotrophomonas maltophilia
AN-2 Colonias de 5 mm de diámetro color crema, crecimiento com-pacto circular muy regular de apariencia cremosa
Pseudomona ae-ruginosa
AN-3 Colonía de 7 mm casi transparente (“acuosa”), crecimiento difuso, libera un pigmento verde que se difunde en el agar. Pocas bacterias de este tipo
Morganella AN-4 Colonia de 3 mm de color amarillo claro, circular. Crece hacia adentro del agar en la orilla de la colonia. morgani
Pseudomonas pu-tida
RB-1 Colonia de 2 mm, se tiñen de rojo con un halo blanco alrede-dor, circulares
Flavimonas RB-2 Colonia de 4 mm color crema oryzihabitans
Se ha reportado la capacidad de algunas bacterias del género Pseudomonas para degradar una
gran variedad de contaminantes entre ellos compuestos cloroaromáticos, alquilaromáticos,
nitroaromáticos e incluso bifenilos policlorados (BSD, 2004).
29
Se han aislado a partir de una planta de lodos activos (Buitrón and González, 1996) varias
cepas capaces de degradar fenol, 4-clorofenol , 2,4-diclorofenol y 2,4,6-triclorofenol, entre
ellas una cepa de Flavimonas oryzihabitans.
También se ha demostrado que Stenotrophomonas maltophilia es capaz de degradar hidrocar-
buros aromáticos policíclicos de alto peso molecular (Boonchan, 1998).
Puesto que el café será usado en los estudios de degradación como soporte para el crecimiento
de las bacterias aisladas, se realizó un análisis por microscopía electrónica de barrido (MEB)
de la superficie del grano de café antes y después de los 30 días de incubación con Pentacloro-
nitrobenceno. En la figura 13 se observa la degradación bacteriana de la superficie del grano
producida durante el periodo de incubación, lo cual nos sugiere que el café puede servir como
fuente de carbono , además de soporte para el crecimiento.
(a) (b)
Figura 13. Análisis por MEB de la superficie del café sin tratamiento (a), y a los 30 días de
incubación (b).
Respecto a la cuenta total bacteriana en función del pH (Cuadro 12), en agar nutritivo no se
observa una diferencia en el crecimiento arriba del pH 5.5, en contraste con el cultivo sobre
Rosa de Bengala donde se manifiesta un mayor número de colonias RB-1 en general, pero
mayor cantidad a pH de 5.5
30
Cuadro 12. Cuenta bacteriana de los cultivos de café (UFC/g de café) pH Rosa de Bengala Agar nutritivo Colonias blancas Colonias rojas
(RB-2) (RB-1) 5.0 8.4 x 1011 1.2x108 8x109
5.5 19.6 x 1011 2. x108 12.6 x109
6.0 18.8 x 1011 6 x108 4 x109
6.5 18.4 x 1011 7.6 x108 3 x109
VII. 2. Determinación de la capacidad de crecimiento en placa con plaguicidas organoclora-
dos como única fuente de carbono.
En el cuadro 13 se indica la capacidad de desarrollar colonias (+), de las diferentes cepas so-
bre agar noble con los plaguicidas indicados. La cepa AN3 no fue considerada en este ensayo
debido a que en el cultivo en agar nutritivo se liberaba un pigmento verde fluorescente, indica-
tivo de Pseudomonas aeruginosa. Como puede observarse la cepa AN-1 y RB2 tienen capaci-
dad de degradar todos los plaguicidas ensayados por lo que se seleccionaron para la siguiente
etapa.
Cuadro 13. Crecimiento sobre placa utilizando DDT, PCNB Y ENDOSULFAN
como fuente de carbono Plaguicidas organoclorados ensayados Cepa
PCNB DDT Endosulfán AN-1 + + + AN-2 + - + AN-3
VII.3 Cinéticas de crecimiento y degradación de plaguicidas en medio líquido. Selección de la
fuente de carbono.
Estos ensayos se realizaron utilizando la misma cantidad de biomasa en todos los casos, la
cual se determinó haciendo uso de la curva de calibración realizada para tal fin (figura 14).
- AN-4 + +
RB-1 - + - RB-2 + + +
31
(b)
y = 2.0473x + 0.0156R2 = 0.9973
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 0.1 0.2 0.3
Peso seco RB-2 (g/L)
Abs
600n
m
(a)
y = 1.7802x + 0.004R2 = 0.9986
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 0.1 0.2 0.3
Peso seco AN-1 (g/L)
Abs
600
nm
Figura 14. Relación grafica de turbidez vs. peso seco para AN-1(a) y RB-2 (b)
Las curvas de crecimiento obtenidas para cada bacteria en cada medio, con las diferentes
fuentes de carbono y para cada plaguicida se encuentran en las figuras
15 -18. la producción de biomasa para cada medio se muestra en la figura 19.
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 2 4 6Tiempo (días)
Abs
600
nm
P/DDT/AN1 G10/DDT/AN1Café2/DDT/AN1
Figura 15. Curva de crecimiento de la cepa AN-1 en presencia de DDT (50 ppm) 30°C, 100 rpm
32
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 2 4 6Tiempo (días)
Abs
600n
m
P/DDT/RB2 G10/DDT/RB2Café2/DDT/RB2
Figura 16. Curva de crecimiento de la cepa RB-2 en presencia de
DDT (50 ppm) 30°C, 100 rpm.
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 2 4 6
Tiempo (días)
Abs
600
nm
P/ENDO/AN1 G10/ENDO/AN1CAFE2/ENDO/AN1
Figura 17. Curva de crecimiento de la cepa AN-1 en presencia de endosulfan (50 ppm), 30°C, 100 rpm
33
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
0 2 4 6Tiempo (días)
Abs
600n
m
P/ENDO/RB2 G10/ENDO/RB2CAFE2/ENDO/RB2
Figura 18. Curva de crecimiento de la cepa RB-2 en presencia
de endosulfan (50 ppm), 30°C, 100 rpm.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
DD
T/A
N1
End
o/A
N1
DD
T/R
B2
End
o/R
B2
DD
T/A
N1
End
o/A
N1
DD
T/R
B2
End
o/R
B2
DD
T/A
N1
End
o/A
N1
DD
T/R
B2
End
o/R
B2
Plaguicida/Cepa
Bio
mas
a g/
L
Peptona 2g/L Glucosa 10g/L Café 2 g/L
Figura 19. Efecto del medio en la producción de biomasa en presencia
de DDT (50ppm) y de endosulfan (50 ppm) para la cepa AN-1 Y RB-2
34
De acuerdo a los resultados anteriores, el máximo crecimiento para la cepa AN-1 y RB-2 se
alcanza entre las 24 y 48 horas, teniendo una buena producción de biomasa aún en presencia
de 50 ppm de DDT y endosulfan.
La determinación del plaguicida residual se hará por cromatografía de gases. Curvas estándar
para cada uno de los plaguicidas en estudio han sido elaboradas (Figura 20).
Endo I (6.5- 324ppm)
y = 77571x + 433226R2 = 0.9989
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
0 100 200 300 400
Concentración (ppm)
area
PCNB(10-500ppm)
y = 45941x + 226716R2 = 0.9989
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
0 100 200 300 400 500
Concentración (ppm)
Are
a
p,p-DDT(3.07-307.7ppm)
y = 109613x - 448860R2 = 0.9995
-5000000
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
0 100 200 300 400
Concentración (ppm)
Áre
a
o,p'- DDT(1.48-148.8 ppm)
y = 95527x + 73900R2 = 0.9982
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 50 100 150 200
Concentración (ppm)
Are
a
Figura 20. Curvas estándar para la determinación de plaguicidas por GC-MS
35
El cuadro 14 y 15 muestran la degradación de DDT y endosulfán por las dos bacterias selec-cionadas. Cuadro 14. Valores de biomasa de F. oryzihabitans y degradación de DDT y endosulfán.
Cuadro 15 . Valores de biomasa de P. aeruginosa y degradación de DDT y endosulfán
Se puede observar que existen diferencias en cuanto al crecimiento y la degradación entre me-
dios y entre cepas, favoreciéndose mayormente la degradación de DDT por las 2 cepas ensa-
yadas, cuando se utiliza el grano de café como sustrato.
DDT Endosulfan
Carbon source Biomass Degradation Biomass Degradation
(gL-1) (%) (gL-1) (%)
Glucose(10gL-1) 0.489 ± 0.040 39.5± 1.5 0.660± 0.009 0± 2.0
-1Peptone (2gL ) 0.436± 0.036 26.7± 7.3 0.428± 0.074 16.3±3.2
Coffee (2gL-1) 0.296± 0.084 63.2 ± 1.6 0.407± 0.102 0 ± 1.8
DDT Endosulfan
Carbon source Biomass Degradation
(%)
Biomass Degradation
(gL-1) (gL-1) (%)
Glucose(10gL-1) 0.264 ± 0.046 32.5 ± 5.4 0.342 ± 0.023 30 ± 11
-1Peptone (2gL ) 0.337 ± 0.012 16.1 ± 0.1 0.345 ± 0.079 30 ± 12.2
Coffee (2gL-1) 0.334 ± 0.010 67.4 ± 0.2 0.531 ± 0.071 51.2 ± 10.6
36
VIII. CONCLUSIONES
Se han aislado 6 cepas de bacterias asociadas al grano de café en presencia del fungicida Pen-
tacloronitrobenceno (PCNB): Pseudomonas aeruginosa (AN-1y AN-3), Pseudomonas putida
(RB-1), Stenotrophomonas maltophilia (AN-2), Morganella morgani (AN-4)y Flavimonas ory-
zihabitans (RB-2).
Las cepas AN-1 y RB-2 crecen en placa de agar noble con PCNB, DDT y endosulfán como
única fuente de carbono .
El grano verde de café promueve el crecimiento de bacterias que tienen la capacidad de degra-
dar DDT y endosulfán, en medio líquido a una concentración de 2 g/L.
El mayor crecimiento en medio líquido se observa para la cepa RB-2 (Flavimonas oryzihabi-
tans) utilizando glucosa como fuente primaria de carbono, tanto en presencia DDT y de endo-
sulfán a 50 ppm.
.
37
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