Informe Proyecto SIP20070141

Dra. Claudia Guadalupe Benítez Cardoza

Caracterización estructural de los intermediarios de la ruta de

desnaturalización de la enzima glucolítica triosa fosfato isomerasa de

Trypanosoma cruzi. Evaluación de la presencia de un intermediario de tipo

glóbulo fundido.

RESUMEN

Las enfermedades parasitarias son un problema muy importante en la salud

pública. El Trypasonoma cruzi, es un protozoario que provoca la Enfermedad de

Chagas teniendo una alta prevalecía en América Latina principalmente, esta

enfermedad actualmente es incurable y mortal Se ha descrito que las enzimas

glucolíticas son un blanco posible para dirigir un fármaco e inhibirlas

selectivamente sin comprometer la integridad del huésped; en particular, la

triosafosfato isomerasa (TIM) es un blanco muy atractivo. La TIM presenta un

plegamiento de barril TIM, un barril interno de 8 hebras-β interconectadas por

loops a 8 hélices-α, el plegamiento es altamente conservado así como el número

de aminoácidos, siendo 250 en promedio. En este informe se conjuntan los

resultados del desplegamiento por aumento en la temperatura de la TIM de

Trypansoma cruzi (TcTIM), El proceso se siguió por técnicas espectroscópicas

como Dicroísmo circular (DC) y Fluorescencia tanto intrinseca como de ANS, para

identificar la presencia de posibles intermediarios de tipo glóbulo fundido; para con

ello proponer un posible mecanismo de desplegamiento describiéndolo

energéticamente. En los experimentos del desplegamiento térmico de la TcTIM

seguido por dos técnicas espectroscópicas diferentes han demostrado que el

proceso se lleva, al menos, en tres fases y es irreversible y el proceso es

dependiente de la temperatura. En la primera fase, se observan cambios en la

estructura terciaria sin involucrar cambios en la estructura secundaria, es decir se

observa un intermediario que se puede describir como un glóbulo fundido; las dos

siguientes fases involucran cambios en la estructura terciaria acompañados por

cambios en la estructura secundaria, el proceso final implica también una

agregación de la proteína. La agregación de la muestra podría originar la

irreversibilidad del proceso. Con los valores promedio de ∆H≠ se construyó el

esquema del posible mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM, donde

se muestran las barreras energéticas calculadas para las tres fases encontradas

INTRODUCCION

Las proteínas, para ser funcionales, deben tener un plegamiento único. El

plegamiento correcto de proteínas depende de muchos factores como el pH,

concentración de iones, la presencia de algunas otras proteínas entre otros

factores externos así como, de manera principal, de la secuencia y naturaleza de

los aminoácidos que la conforman. Existen factores que favorecen tanto el

plegamiento como el desplegamiento de las proteínas. Algunos de los factores

que promueven el desplegamiento son: cambios de temperatura, del pH, de

presión y algunos agentes químicos como la urea o el cloruro de guanidinio. Al

variar la concentración de estos agentes químicos o al variar el valor de la

temperatura se induce el desplegamiento de una proteína y al seguir una

propiedad observable por métodos espectroscópicos o biofisicoquímicos se puede

conocer el mecanismo de desplegamiento. Las técnicas mías comunes para

seguir el desplegamiento de una proteína son seguir el cambio en la elipticidad por

Dicroísmo Circular en el UV lejano (DC), que cuantifica el contenido de estructura

secundaria regular de la proteína (α hélices y β plegadas) o cambios en la señal

de fluorescencia intrínseca. Esto da una medida del cambio en el entorno

hidrofóbico en los residuos aromáticos, principalmente de los triptofanos [1-4]. La

técnica del DC se basa en generar dos haces de luz circularmente polarizada, un

haz que gira a la derecha y otro a la izquierda, los cuales al interaccionar con los

planos formados por los enlaces peptídicos, son desviados generando un cambio

en la elipticidad. Cuando cambiamos el ambiente de la proteína, existirían cambios

en la estructura secundaria que se detectarían como cambios de la elipticidad.

También se puede seguir el desplegamiento de las proteínas siguiendo los

cambios en la señal de fluorescencia. Los aminoácidos aromáticos, que tienen

propiedades hidrofóbicas, presentan una fluorescencia intrínseca en la proteína

plegada, y al ser hidrofóbicos, se mantienen ocultos del disolvente acuoso.

Cuando existen cambios, debido al desplegamiento, los residuos aromáticos (F,

W, Y) se pueden exponer mas al disolvente cambiando su señal de fluorescencia,

en el caso de un medio acuoso, la longitud de onda de emisión se recorrerá a

valores mayores con respecto a los aminoácidos no expuestos. Los estudios de

estabilidad térmica de las proteínas tienen una gran relevancia para la generación

de información que nos permitan inferir el posible mecanismo de plegamiento de

una proteína y las variables de las cuales depende el proceso. El manejo de los

datos con herramientas fisicoquímicas generan información termodinámica y

cinética que permitirán proponer un mecanismo de desplegamiento desde el punto

de vista energético. Si las condiciones de reversibilidad del proceso de

desplegamiento son determinadas, el sistema podría tratarse como un sistema en

equilibrio obteniendo valores como: los cambios de energía libre de Gibbs

asociado al proceso (∆G). En el caso que no se encuentre reversibilidad en el

proceso los valores termodinámicos se denominarían aparentes. Además, para

procesos irreversibles si se obtienen datos experimentales de la cinética del

desplegamiento a diferentes temperaturas y se analizan utilizando la teoría del

estado de transición, es posible caracterizar energéticamente al estado de

transición (‡) y obtener valores del cambio de la entalpía de activación (∆H‡) que

caracterizan a la reacción. Mediante la recopilación de información, por el uso de

las técnicas antes descritas, es posible inferir los cambios estructurales que

suceden en el desplegamiento. Así mismo, se pueden identificar posibles

intermediarios en la ruta de desplegamiento. Uno de esos intermediarios es el

denominado glóbulo fundido; que aparece en los primeros estadios del

plegamiento proteico y que se caracteriza por poseer un grado elevado de

estructura secundaria pero que ha perdido la mayor parte de sus contactos

terciarios. Para determinar si un intermediario es de tipo glóbulo fundido

generalmente se utiliza el colorante ácido 8-anilino-naftaleno sulfónico (ANS). Este

colorante presenta una aumento en su emisión de fluorescencia en presencia de

ambientes hidrofóbicos. Dado que un intermediario de tipo glóbulo fundido expone

regiones hidrofobicas que estaban ocultas al solvente en el estado nativo y esas

regione sinteraccion con el ANS, aumentando este ultimo su emision de

fluorescencia. Con esto se puede proponer un mecanismo de plegamiento. Los

experimentos de desplegamiento térmico darán información de los factores que

dictan el plegamiento de una proteína para proponer la síntesis racional de

proteínas que tengan funciones determinadas o el desarrollo de fármacos que

permitan el cambio en la actividad de una proteína para combatir enfermedades.

En este proyecto se evaluó el mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM

por dos técnicas espectroscópicas, por Dicroísmo circular en el UV lejano, así

como por fluorescencia intrínseca de la proteína.

MÉTODOS Y MATERIALES

TcTIM

En este trabajo se utilizó la triosafosfato isomerasa recombinante de Trypanosoma

cruzi que se purificó siguiendo el protocolo descrito por Ostoa- Saloma y

colaboradores [5]. Una al´ıcuota de la rTcTIM fue donada por la IBI Liliana Vargas

y por el Dr. Arturo Rojo Domínguez del laboratorio de Biofisicoquímica de la UAM-

I. Todos los experimentos (a menos que se indique lo contrario) se realizaron en

soluci´on amortiguadora de fosfatos 50 mM a un pH de 7.4 a 25°C a una

concentraci´on final de prote´ına de 10 µg/mL. El agua utilizada en todos los

experimentos es agua bidestilada y desionizada. Todos los reactivos utilizados

son grado anal´ıtico y fueron adquiridos en Sigma y/o J.T. Baker

Fluorescencia intrínseca

Los experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro

PC1 de ISS (Champaign, IL). Este instrumento está equipado con un porta celdas

tipo Peltier para el control de la temperatura. A menos que se especifique lo

contrario, todos los experimentos fueron obtenidos en celdas de 1 cm de recorrido

óptico. La longitud de onda de excitación fue de 280nm. El espectro de emisión

fue obtenido en el intervalo de 300 nm a 400 nm. La longitud de onda registrada

para las cinéticas de desplegamiento térmico fue de 320 nm. La cinética de

desnaturalización de la TIM se estudió por medio de cambios en la señal de

fluorescencia a 320 nm a distintas temperaturas. Una celda de 1.0cm. de recorrido

óptico, que contenía solución amortiguadora de fosfatos, la que previamente se

llevó a equilibrio térmico con la temperatura del experimento, se le inyectó el

volumen suficiente de la solución concentrada de TcTIM para alcanzar la

concentración deseada (10µg/mL). En todos los casos se cuidó que el volumen

adicionado de proteína concentrada fuera menor al 1% del volumen final, esto

para no alterar la temperatura del experimento. Las muestras se homogeneizaron

con un agitador magnético a 550rpm para que el mezclado y equilibrio térmico se

alcanzaran de forma rápida y por completo. Inmediatamente después de añadida

la muestra, se inició la medición de los cambios en la emisión de fluorescencia.

Bajo estas condiciones el tiempo muerto de los experimentos fue menor a 10

segundos. Los datos cinéticos se ajustaron a una ecuación de decaimiento

exponencial.

Fluorescencia de ANS

Para la determinación de la fluoresncia de ANS se empleo una longitud de onda

de excitación fue de 380nm. El espectro de emisión fue obtenido en el intervalo de

400 nm a 600 nm. La longitud de onda registrada para las cinéticas de

desplegamiento térmico fue de 497 nm. La concentración de ANS fue 40µM.

Tratamiento de los datos

Con el antecedente de que el proceso no es reversible [4], se procede a realizar

cinéticas de desplegamiento para poder describir el proceso con datos cinéticos.

La cinética química explica el trayecto que toma un proceso químico, como

cambian las concentraciones de las especies químicas involucradas en dicho

proceso con respecto al tiempo. A estos procesos no se les asocia una constante

de equilibrio porque tal no existe, pero se les pueden asociar una constante de

velocidad de reacción que es dependiente de la temperatura y de la naturaleza de

las especies involucradas. Algo que se debe considerar es que los datos cinéticos

no pueden determinar sin ambigüedad el mecanismo por el cual un proceso

ocurre, pero si puede discriminar los procesos por los cuales no se efectúa cuando

los datos ajustados no concuerden con los experimentales. El plegamiento y

desplegamiento de una proteína se describe en términos de ecuaciones de primer

orden ya que son procesos intramoleculares. Sin embargo otros procesos donde

intervienen multímeros pueden ser descritos por otro tipo de ecuaciones cinéticas

de orden superior [6]. Asumiendo que la muestra es exclusivamente proteína

nativa y al someterla a un proceso de desnaturalización térmica por aumento de

temperatura, se inducirá el desplegamiento. Así entonces se genera una colección

de especies diferentes con propiedades que cambian con respecto al tiempo. La

reacción química que describe el proceso de desplegamiento es:

Donde N es la especie nativa y D es la especie desplegada, N‡ es el estado de

transición, k1, k−1 y k2 son las constantes de velocidad. La especie química N

absorbe energía, en el caso del desplegamiento térmico un aumento en la

temperatura, para llegar a un estado de alta energía, N‡, conocido como estado de

transición o complejo activado. Este complejo activado tiene dos opciones:

que libere la energía absorbida, disipándola al medio y regrese a la conformación

inicial que la energía absorbida genere cambios estructurales que le permitan

transformarse en el producto Las ecuaciones de Arrhenius y de Eyring describen

la dependencia de la velocidad de reacción con respecto a la temperatura (T). A

diferencia de la ecuación de Arrhenius, la ecuación de Eyring puede aplicarse a

sistemas gaseosos, condensados o reacciones en fases mezcladas. La ecuación

de Eyring se basa en la construcción teórica basada en el modelo del estado de

transición. Los cambios en la concentración del complejo activado N‡ en el tiempo

(t), de acuerdo con la siguiente se puede describir como:

Debido al equilibro que puede existir en la primera parte del proceso,

se cancelan, por lo que:

Por la mecánica estadística, a k2 se le define como:

Donde kB es la constante de Boltzmann [1.381 x 10−23J · K−1] y h es la constante

de Plank [6.626 x 10−34J · s]. A k2 se le conoce como la constante universal del

estado de transición y tiene un valor de 6 x 10−12s−1 a 25°C

Por otro lado [N‡] se deriva del estado quasi-estacionario entre N‡, N y D.

donde K‡ es la constante de equilibrio termodinámico

Sustituyendo las últimas dos ecuaciones

k de todo el proceso se define como:

Por otro lado, una definición termodinámica indica que:

De igual forma ∆G‡ se define como:

Donde el ∆G‡ es la energía libre de activación, ∆S‡ es la entropía de activación y

∆H‡ es la entalpía de activación del proceso. Combinando las últimas ecuaciones

se obtiene:

Sustituyendo y haciendo rearreglos de las ecuaciones se genera:

La ultima ecuación se conoce como la ecuación de Eyring, indica que al graficar el

ln k T contra 1/T se obtiene una línea recta con pendiente ∆H‡/R. De esta forma

se puede el valor de la entalpía de activación del proceso de desplegamiento

térmico. De esta forma, al obtener las cinéticas de desplegamiento térmico a

diferentes temperaturas, se tendría una colección de datos que puede ser ajustada

a una ecuación de decaimiento exponencial.

donde A es la amplitud de cada fase, y ki es la constante de velocidad asociada a

cada proceso, indica con que rapidez un reactivo se transforma en producto. Los

valores que se pueden obtener con los resultados obtenidos nos permitirán

describir un proceso químico desde el punto de vista energético. De este modo se

puede obtener un conjunto de valores de k a distintas temperaturas y con su

dependencia se puede conocer el valor del ∆H‡. Con esto se describe la

energética del estado de transición. En este caso el estado de

transición de la reacción de desplegamiento térmico de la TcTIM.

RESULTADOS

Cambios en el entorno hidrofóbico de los triptofanos determinados por

fluorescencia

Se realizaron experimentos cinéticos, determinando el cambio de la señal de

fluorescencia en el tiempo a distintas temperaturas (50°C, 54°C, 57°C, 60°C y

64°C). Los datos se presentan el la Fig. 1

Figura.1: Cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM seguidas por el cambio en la señal

de fluorescencia. Se presentan dos graficas, en el panel izquierdo se observa el

comportamiento del mecanismo de desplegamiento térmico a temperaturas menores a 60 °C

y en el panel derecho se muestra el comportamiento del mecanismo a temperaturas

mayores a 60 °C. Los experimentos se realizaron a una longitud de onda de excitación de

280 nm y el registró de la emisión de fluorescencia fue a una longitud de onda de emisión de

320 nm.

En la gráfica 1 se presentan los datos de cambios en la señal de fluorescencia a

diferentes temperaturas. Podemos observar que el proceso tiene dos

comportamientos diferentes. A temperatura baja (por debajo de los 60°C), se

pueden apreciar dos fases de decaimiento exponencial de la señal de

fluorescencia. Las curvas se ajustaron a una ecuación de decaimiento

exponencial doble (con dos factores exponenciales). A temperatura alta (por arriba

de los 60°C), se observa en la parte inicial un ligero incremento en la señal de

fluorescencia seguida por una disminución. En este caso fue necesario utilizar una

ecuación con tres factores exponenciales. El cambio de la forma de las curvas

cinéticas a distintas temperaturas podría indicar diferencias entre los mecanismo.

Los ajustes a dos o tres fases exponenciales permitieron obtener las constantes

de velocidad reportadas en el cuadro 1.

Cuadro 1: Cuadro de los valores de k para cada una de las fases del

desplegamiento térmico de la TcTIM siguiendo los cambios en la señal de

fluorescencia

Figura.2: Cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM seguidas por el cambio en la señal

de fluorescencia de ANS. Se presentan dos graficas, en el panel izquierdo se observa el

comportamiento del mecanismo de desplegamiento térmico a temperaturas menores a 60 °C

y en el panel derecho se muestra el comportamiento del mecanismo a temperaturas

mayores a 60 °C. Los experimentos se realizaron a una longitud de onda de excitación de

380 nm y el registró de la emisión de fluorescencia fue a una longitud de onda de emisión de

497 nm.

Con las constantes de velocidad del cuadro 1 se realizó el grafico de Eyring (Fig.

3). En este grafico se presentan los datos cinéticos obtenidos en un proyecto

anterior, se presentan os datos de Dicroísmos circular, fluorescencia intrínseca y

extrínseca

Figura 3: Grafico de Eyring mostrando la dependencia lineal de las k con respecto a la

Temperatura y el ajuste lineal utilizando la ecuación de Eyring. DC1 y DC2, datos obtenidos

mediante la técnica de Dicroísmo circular que refleja los cambios de estructura secundaria. FL3 y

FL4 representan los datos obtenidos para las etapas mas rápidas observadas por fluorescencia

intrínseca FL5 corresponde a los daros de fluorescencia extrínseca.

En el grafico de Eyring se observa que las constantes de velocidad (k1) de la

primera fase de los experimentos realizados a las temperaturas mas bajas,

seguidos por los cambios en la señal de fluorescencia de ANS, es decir la señal

que registra la aparición de un intermediario de tipo glóbulo fundido, siguen una

tendencia lineal. Esto permitió calcular la pendiente de la recta y a partir de ella un

valor de ∆H‡= 570 ± 80 kJ/mol. De manera similar, las constantes k2 y k3 siguen un

comportamiento también lineal. Al graficar los datos obtenidos por DC,

conjuntamente con los de fluorescencia se observa que la fase descrita por k2 de

fluorescencia coincide con la fase más rápida observada en DC. Esto indica que

se podría tratar del mismo proceso observado por las dos técnicas

espectroscópicas. De la pendiente de este conjuntos de puntos se obtiene un

∆H‡= 415 ± 30 kJ/mol. Finalmente las constantes k3, que corresponden a la fase

mas lenta observada en las cinéticas de temperatura más alta seguidas por la

técnica de fluorescencia, siguen de igual modo una tendencia lineal con el inverso

de la temperatura en el grafico de Eyring. De manera interesante, los puntos

coinciden con la reacción mas lenta, observada por DC (Fig.3). Esto podría indicar

que la estructura secundaria y terciaria de la proteína cambian de manera

concertada, es decir al mismo tiempo. Del ajuste lineal de estos puntos se obtuvo

un valor de ∆H‡= 270 ± 60 kJ/mol.

Mecanismo de desplegamiento térmico de la Tc-TIM

En los experimentos del desplegamiento térmico de la TcTIM seguido por dos

técnicas espectroscópicas diferentes han demostrado que el proceso ocurre al

menos, en tres fases y es irreversible. En la primera fase, se observan cambios en

la estructura terciaria sin involucrar cambios en la estructura secundaria, lo que

corresponde a la obtención de un intermediario en la ruta de plegamiento de tipo

glóbulo fundido; las dos siguientes fases involucran cambios en la estructura

terciaria acompañados por cambios en la estructura secundaria, el proceso final

implica también la agregación de la proteína. La agregación de la muestra podría

originar la irreversibilidad del proceso. A partir de los valores promedio de ∆H‡ se

construyó el esquema del posible mecanismo de desplegamiento térmico de la

TcTIM. En el se muestran las barreras energéticas calculadas para las tres fases

encontradas. Los valores promedio de los ∆H‡ se concentran en el cuadro 2.:

Cuadro 2. Promedio de los valores de ∆H‡ (kJ/mol) de los tres procesos del

desplegamiento térmico de la TcTIM

Cambios en estructura 3ª, asociados a la aparición de un intermediario de tipo

glóbulo fundido. Cambios en estructura 2a y 3a Cambios en estructura 2a y 3ª En

la Fig. 4 se presenta el gráfico de coordenada de reacción del mecanismo de

desplegamiento térmico de la TcTIM. El mecanismo aquí propuesto difiere con lo

reportado para el desplegamiento inducido por GuHCl de TcTIM [8]. Se reporta un

mecanismo completamente reversible con dos intermediarios estables diméricos

Estas diferencias podrían deberse a que el GuHCl y la temperatura tienen efectos

distintos en la conformación. El GuHCl solubiliza todas las partes constituyentes

de toda la proteína, tanto la cadena principal como sus cadenas laterales,

hidrofóbicas e hidrofílicas, exponiéndolas al disolvente acuoso. Por otro lado, el

incremento de la temperatura ocasiona un aumento en la energía cinética de las

moléculas, induciendo cambio en los modos vibracionales de la molécula,

originando rearreglos de puentes de hidrógeno tanto del disolvente acuoso con la

proteína como de la misma estructura interna de la proteína induciendo cambios

conformacionales.

Figura 4: Grafico de coordenada de reacción para el desplegamiento térmico de la TcTIM.

Esta gráfica muestra el mecanismo de desplegamiento térmico planteado según los datos

obtenidos por fluorescencia en este trabajo.

Además se ha observado que los estados desplegados obtenidos por GuHCl y por

incremento de la temperatura son diferentes. En el primer caso, concentraciones

altas de GuHCl originan un estado desplegado completamente extendido que

prácticamente no conserva estructura secundaria. Por el contrario, el aumento de

temperatura genera un estado desplegado final que podría presentar estructura

secundaria residual. Se ha observado que esta estructura secundaria resiudal, es

la misma observada en todas las proteínas desplegadas térmicamente [1], [9-10].

El mecanismo de desplegamiento de la TcTIM también se presenta distinto a lo

reportado para la yTIM donde se encontró un mecanismo reversible donde el

desplegamiento va acompañado de la disociación del dímero ; con

valores de ∆H‡= 480 kJ/mol. Estas diferencias podrían explicar la observación

empírica de que la TcTIM es más susceptible al almacenamiento que las TIM’s de

otras especies biológicas.

Todo lo anterior parece indicar que para la TIM de distintas fuentes, hasta el

momento, no es posible generalizar un mecanismo de plegamiento/

desplegamiento. Esto incluso se observa para la TcTIM en distintas condiciones

de medición del mecanismo de desplegamiento.

IMPACTO

En este informe se presentaron los resultados correspondientes a los objetivos de

la caracterización del mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM. De

este modo se obtuvieron las cinéticas del desplegamiento térmico de TcTIM

siguiendo los cambios de la señal de fluorescencia. Los datos se trataron con la

teoría del estado de transición y se obtuvieron los parámetros cinéticos

correspondientes. El desplegamiento térmico de la TcTIM seguido por dos

técnicas espectroscópicas generan las siguientes conclusiones:

1. El proceso de desplegamiento térmico de la TcTIM, es un proceso irreversible,

además se evidencia la presencia de agregados de la conformación desplegada.

2. El desplegamiento térmico involucra al menos 3 fases. a) Una fase muy rápida,

detectada únicamente por fluorescencia de ANS, de cambios de la estructura

terciaria. El estado que se alcanza en estas condiciones experimentales se puede

describir como un intermediario de tipo glóbulo fundido b) Dos fases posteriores

de cambios de la estructura secundaria, simultáneas cada una con cambios en la

estructura terciaria.

3. Las constantes de velocidad, k, muestran una dependencia lineal con respecto

a la Temperatura. Esto permitió calcular los valores de ∆H‡ de los 3 procesos.

4. Proponemos un posible mecanismo de desplegamiento térmico de la TcTIM,

ilustrado en la Fig. 4.

Esto contribuye de manera importante al conocimiento de la estabilidad de la

enzima, y esta información puede usarse como complemento a la información

sobre su in activación para el diseño racional de fármacos contra el parasito

Trypansoma cruzi

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