INGENIERÍA GENÉTICA

La oveja Dolly

1996

Premio Nobel de Química (2008), Shimomura, Martin Chalfie, Prasher

Aequorea victoria

Sistemas de restricción-modificación (M-R)

• análogo a un “sistema inmune”

• usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos

• ¿Cómo defenderse del DNA exógeno ?

• ¿Cómo proteger el DNA propio?

• Restricción: reconocimiento de DNA exógeno “extraño” y destrucción del mismo

• Modificación: El DNA propio es “marcado” químicamente (adición de grupos metilo)

Par endonucleasa + metilasa

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Sistemas de restricción TIPO I:

Complejos multi-proteicos que

contienen:

• Dos subunidades REasas (R),

cortan el ADN

•Dos subunidades

metiltransferasas MTasas (M)

que metilan al ADN.

•Cortan al DNA aleatoriamente

en sitios lejanos (1000 pb) del

sitio de reconocimiento

RE

MT

ATP y Mg 2+

-CH3

Los sistemas R-M tipo I son ampliamente distribuidos en procariotes, se han

descubierto aproximadamente 600 genes putativos.

TIPO II:

Complejos multi-proteicos que

contienen:

• Dos subunidades que forman

la REasa (R), corta el ADN

•Tienen las REasas y MTasas

por separado

•Una subunidad específica (S)

que reconoce la secuencia que

va a cortar. Corta en el sitio de

reconocimiento.

RE

MT

Sistema de modificación-restricción EcoRI (en E. coli)

Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento

Resultado del Corte

EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG

5'---G AATTC---3‘ 3'---CTTAA G---5'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens

5'GGATCC 3'CCTAGG

5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5'

DpnI Diplococcus pneumoniae

5'GATC 3'CTAG

5'---GA TC--3' 3'---CT AG---5’

HindIII Haemophilus influenzae

5'AAGCTT 3'TTCGAA

5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'

TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'

NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG

5'---GC GGCCGC--3' 3'---CGCCGG CG--5'

XbaI Xanthomonas badrii 5'TCTAGA 3'AGATCT

5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción TipoII

Secuencias palindrómicas de 4 a 8 pb

http://rebase.neb.com/rebase/

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria

co coli Especie de la bacteria

R RY13 Cepa de la bacteria

I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima en la bacteria

ANITA LAVA

LA TINA

TIPO III:

Complejos multi-proteicos que

contienen:

• subunidades REasas (R), cortan

el ADN

•subunidades MTasas (M) que

metilan al ADN.

•Cortan cerca del sitio de

reconocimiento.

•La modificación requiere SAM y la

restricción Mg2+ y ATP.

ATP, Mg 2+

RE

MT

-CH3

Sistemas de restricción

Tipo I Tipo II Tipo III

Complejos multisubunidad Actividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo

Enzimas endonucleasa Complejos multisubunidad Actividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo

Cortan al DNA aleatoriamente en sitios lejanos (1,000 pb) del sitio de reconocimiento

Cortan en la secuencia de reconocimiento

Cortan cerca (25 a 27 pb) del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos

Requieren ATP, para moverse desde el lugar de reconocimiento, hasta la de corte

Requieren ATP, para moverse desde el lugar de reconocimiento, hasta la de corte

Tipos de corte

APLICACIONES:

•ADN recombinante

•Estudio de deleciones

•Estudio de mutaciones

•Diagnostico de enfermedades genéticas

•Entre otros…

Menor tamaño

Mayor tamaño

Clonación de DNA

VECTORES DE CLONACIÓN

Vectores de clonación y/o expresión • En procariontes:

– Plásmidos bacterianos – Bacteriófagos – Cósmidos – BACs

• En eucariontes – levaduras

• YACs

Tamaño de inserto para las clonación en diferentes plásmidos

Tipo de Vector DNA Clonado (kb)

Plásmido 20

Fago λ 25

Cósmido 45

BAC (bacterial artificial chromosome)

300

YAC (yeast artificial chromosome) 1000

CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE CLONACIÓN

• Vector de clonación- molécula de DNA transportadora

1. Replicación independiente (ori*)

2. Sitios de corte únicos

3. Marcador de selección

4. Recuperación sencilla

Plásmidos

pBR322

5,5´-dibromo-4,4´-dicloro-índigo

(compuesto azul insoluble).

Lac Z

Bacteriófagos

El tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin afectar la capacidad del fago de infectar células y formar calvas. 25 kb

Bacteriófagos

25 kb

Cósmidos

Vectores híbridos, tiene

secuencias COS, un origen

de replicación y sitos de

restricción (45 kb)

Cósmidos

BAC (cromosoma bacteriano artificial)

•OriS: origen de replicación del factor F •parA, B, E: control de la replicación •CMr: gen de resistencia a cloranfenicol •Polilinker en su interior.

300 kb

YAC (cromosoma artificial de levadura)

•ARS1: secuencia de replicación autónoma •CEN4: centrómero del cromosoma , permite la segregación del plásmido durante la división celular •TELs: secuencias teloméricas. •HIS3, TRP1, URA3: marcadores de selección en levadura confieren prototrofía para histidina, triptófano y uracilo

1000 kb

PROYECTO

DEL

GENOMA

HUMANO

PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA

POLIMERASA)

Fue desarrollada en 1983 por Kary Mullis, el objetivo de esta

técnica es obtener un gran número de copias de un fragmento de

ADN.

Sus aplicaciones:

•Clonación de ADN para secuenciación

•Filogenia basada en ADN

•Análisis funcional de genes

•Diagnóstico de transtornos hereditarios

•Identificación de huellas génicas

•Entre otros…

•Se usan: DNA pol (pol Taq), cebadores, iones monovalentes, DNA

molde, buffer, los 4 desoxirribonucleósidos.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Reacción en cadena de la polimerasa PCR

Secuenciación Método Sanger

1.- Fraccionamiento de los

polinucleótidos a secuenciar.

2.- Secuenciación de los

fragmentos pequeños.

3.- Orden de los nucleótidos

A T C G G G G C C T T A T C G C

T A G C C C C G G

A

H H A

OH H

A

OH H

A

OH H

T

OH H

T

OH H

A

OH H

A

H H

G

OH H

G

OH H

Secuenciación Método Sanger

Secuenciación Método de Sanger

1 2 3 4

MUESTRAS SECUENCIAS DE DNA NUCLEOTIDO

ATCCACGTGACCGTATATGCCTGAGATCCCTTCGT 35

*TAG

TAGG* 1 5

---------TGCAC* 2 10

-------------------TGGCA* 3 15

-----------------------------TA* 4 17

---------------------------------TACGGAC* 5 24

-----------------------------------------------TC* 6 26

-------------------------------------------------TAGGGAAGCA 7 35

TAGGTG* 8 7

------------CA* 9 9

----------------CTGG* 10 13

------------------------CATATA* 11 19

------------------------------------CGGA* 12 23

--------------------------------------------CT* 13 25

------------------------------------------------CTAGGGAAG* 14 34

-------------------------------------------------------------------CA 15 35

TAG* 16 4

------GT* 17 6

----------GCACT* 18 11

--------------------G* 19 12

----------------------GCATATAC* 20 20

--------------------------------------G* 21 21

----------------------------------------GACTCTA* 22 28

------------------------------------------------------G* 23 29

--------------------------------------------------------G* 24 30

----------------------------------------------------------GAA* 25 33

-----------------------------------------------------------------GCA 26 35

TAGGTGC* 27 8

--------------ACTGGC* 28 14

--------------------------AT* 29 16

------------------------------AT* 30 18

----------------------------------ACGG* 31 22

------------------------------------------ACTCT* 32 27

----------------------------------------------------AGGG* 33 31

-------------------------------------------------------------A* 34 32

-------------------------------------------------------------- AGC* 35 35

Con ddT

Con ddC

Con ddG

Con ddA

SANGER ROCHE 454 ILLUMINA SOLID

LONGITUD PRECIO

6 Mb/día $ 500/Mb

750 Mb/día $ 20/Mb

5, 000 Mb/día $ 0.50/Mb

5000 Mb/día $ 0.50/Mb

FUNDAMENTO •Uso de didesoxiribonucleótidos no poseen el OH en el extremo 3´. •Síntesis in vitro de ADN usando cadena molde. •Primers •Polimerasa •desoxiribonucleótidos

Determinación de ADN mediante luminiscencia

Técnica similar a la Sanger. •Se usan terminadores reversibles. •Se usa fluorescencia.

Se basa en la ligación de octámeros marcados de la secuencia conocida de ADN y se detecta la señal fluorescente tras cada ligación.

APLICACIONES •Pequeñas muestras •Genomas pequeños

Genomas completos cortos Pequeños RNAs mRNAs Análisis de metilación

Genomas completos Pequeños RNAs mRNAs SNP

Genomas completos Pequeños RNAs mRNAs SNP

PROBLEMAS •Unión no específica del cebador al ADN •Fidelidad de la polimerasa y amplificación •Contaminación de las muestras

•Amplificación •Mezcla de las cuentas •Intensidad •Desfase

•Amplificación •Interferencia •Desfase

•Amplificación •Mezcla de cuentas •Desfase •Mala señal

Aislamiento mRNA

Construcción de bibliotecas

Biblioteca de cDNA

Bibliotecas de DNA

Las bibliotecas de ADN son

colecciones de vectores

recombinantes, que representan

secuencias de ADN extrañas o

insertadas.

Cromosomal (genómico) cDNA

cDNA ó DNA

DNA complementario = cDNA

Hibridación DNA-DNA (Southern blot)

Amplificación de

genes, deleciones

y mutaciones

puntuales

Southern blot

Escrutinio

NORTHERN O SOUTHERN

BLOT

t1 t2 t3 t4

Expresión de un gen

Microarreglos

APLICACIONES

Obtención de proteínas de interés médico y

económico

• antibióticos

• enzimas

• hormonas: insulina, hormona del

crecimiento, eritropoyetina…

• vacunas

• proteínas sanguíneas: factores de

coagulación…

Producción de anticuerpos

El gen para el Activador Tisular de Plasminógeno (TPA), es una proteína

para disolver los coágulos sanguíneos.

Mejora genética de vegetales y animales para obtener una

mayor producción y mejor calidad nutricional

Con el mejoramiento genético de los vegetales, se espera

conseguir:

Mayor adaptación a diversos ambientes.

Mejores características agronómicas (resistencia, desgrane,

etc.).

Resistencia a plagas, enfermedades o insecticidas.

Resistencia a la sequía, temperaturas bajas o altas, etc.

Para incrementar la calidad de los

productos se persigue:

Alto valor nutritivo (proteínas y vitaminas).

Mayor coloración, sabor y/o tamaño de los

frutos.

Resistencia al transporte y

almacenamiento.

Reducción de la cantidad de ciertas

sustancias indeseables en los productos,

etc.

Terapia génica a) Células germinales, es decir, espermatozoides u óvulos, lo que origina un cambio

permanente de todo el organismo y generaciones posteriores.

b) Somática celular y es análoga a un transplante de órganos.

Terapia génica para

el tratamiento de la

inmunodeficiencia

combinada grave

(SCID), una

enfermedad mortal

del sistema

inmunitario causada

por la falta de la

enzima adenosina

desaminasa (ADA).

DNA y Medicina Forense