El pequeño tamaño, la transparencia que difi-culta su observación y el desconocimiento de algunas características metabólicas y antigéni-cas explican que el mundo microbiano estuvie-ra asentado hasta hace poco en la ignorancia humana. Sencillos, pero ingeniosos métodos, han permitido conocer lo que hoy sabemos de las bacterias. Revisaremos los más habituales.

2.1 Métodos de estudio2.1.1 el microscopioEl microscopio óptico permite ampliar el tamaño de las imágenes. Es decir, aumenta la capacidad de observar dos puntos muy pró-ximos, que a simple vista parecen un único punto, como puntos separados, lo que se de-nomina poder de resolución del microscopio. Los microscopios ópticos no resuelven más de 0,2 mm (micras o milésimas de milímetro), pero es suficiente para observar la mayoría de las bacterias, no así los virus. Normalmente

se utilizan los llamados microscopios com-puestos (fig. 2.1), que constan de un sistema de iluminación (lámpara y condensador), un grupo de lentes próximas al objeto que hay que estudiar (objetivo) y otro grupo de lentes próximas a los ojos del observador (ocular). El aumento total se calcula multiplicando los aumentos del objetivo por los del ocular, pudiendo llegar hasta 1.250 aumentos.

Los condensadores especiales de campo oscuro, que iluminan oblicuamente las mues-tras, permiten aumentar algo la resolución de los microscopios. Son útiles para observar bacterias muy finas, como el agente causante de la sífilis.

Los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones en vez de luz y permiten observar objetos mucho más pequeños (p. ej., 0,001 mm) que el microscopio óptico, como son los virus o estructuras bacterianas.

Los objetos que van a observarse al mi-croscopio se denominan preparaciones, que normalmente se elaboran depositando una gota de la muestra problema sobre el vidrio

oBJetiVos de APReNdiZAJe

• Los métodos de observación de las bacterias.

• Los fundamentos de las técnicas de cultivo.

• Las principales características morfológicas de las bacterias.

• La función de las diferentes estructuras.

• Los fundamentos de la identificación de las bacterias.

Ramón Cisterna Cáncer,Alfonso Ruiz Bravo López y

María del Carmen Ramos tejera

La célula bacteriana

(portaobjetos), se deja secar y se aplican co-lorantes especiales (tinciones).

Cuando la observación al microscopio se realiza directamente en preparaciones sin secar ni teñir, hablamos de examen en fresco. Las preparaciones en fresco se utilizan, por ejem-plo, en el examen de heces para la observación de parásitos (protozoos, huevos de gusanos) o para observar la movilidad de bacterias.

2.1.2 tincionesSon procedimientos usados para teñir, y así visualizar, diferentes microorganismos, entre ellos las bacterias, que normalmente no serían visibles al microscopio óptico por ser trans-

parentes. Las tinciones se efectúan general-mente sobre bacterias desecadas y calentadas para coagular sus proteínas (fijación).1. Tinción de Gram: es la más importante, es

una prueba rápida y sencilla, y la que más se emplea para observar las bacterias; uti-liza un colorante (violeta), un mordiente o fijador del colorante (yodo), un decolorante (alcohol) y otro colorante (normalmente rojo, como safranina) para teñir de diferente color las bacterias que se decoloraron en la primera fase de la tinción (fig. 2.2).

La tinción de Gram permite clasificar las bacterias en gramnegativas (se decolo-ran con el alcohol y vuelven a colorearse con el segundo colorante, por lo que se ven rojas) y grampositivas (no se decoloran con el alcohol y siguen de color violeta).

2. Tinción ácido-alcohol resistente o deZiehl: es útil para el estudio de las mico-bacterias, cuya compleja pared dificulta la tinción de Gram. Se tiñe la preparación calentándola con el colorante rojo fucsina, después se decolora con una mezcla de alcohol y ácido, y por último se tiñe otra vez con azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes, como el bacilo tubercu-loso o el de la lepra, se ven de color rojo (no se han decolorado con el ácido-alcohol) y las demás se ven azules o verdes.

FiguRA 2.2

Tinción de Gram.

FiguRA 2.1

Microscopio compuesto.

Existen otras muchas tinciones para observar estructuras especiales en las bacterias. Así, hay tinciones para cápsulas, esporas, flagelos, etc. Para la observación de protozoos parásitos en sangre suele utilizarse la tinción habitual de frotis sanguíneos (tinción de Giemsa).

2.2 Medios de CuLtiVoEl crecimiento bacteriano fuera de su hábitat natural (p. ej., cuando se realiza en el labora-torio) se denomina crecimiento en cultivo. Un cultivo es una población de microorganismos que crece en un medio artificial, y el soporte que permite el crecimiento de las bacterias fuera de su hábitat se llama medio de cultivo.

Los medios de cultivo permiten obtener poblaciones de bacterias in vitro, es decir, en el laboratorio, en contraste con el desarrollo de un microorganismo en un huésped viviente o in vivo.

Los medios de cultivo son mezclas com-plejas de sustancias químicas y/o productos naturales (proteínas, sangre, suero, etc.) capa-ces de soportar el crecimiento de las bacterias. Pueden ser líquidos o sólidos.

Los medios de cultivo sólidos son me-dios líquidos a los que se añade una sustancia (normalmente agar) para que solidifiquen y adquieran consistencia. Los medios de cultivo pueden prepararse mezclando cuidadosamente los diversos componentes, después disolviéndo-los (normalmente por calentamiento) y esterili-zando el medio ya completo (generalmente en autoclave). También pueden adquirirse en forma deshidratada (seca), listos para proceder a su in-mediata preparación con agua destilada y esteri-lización. Actualmente la mayoría de los medios de cultivo que se utilizan en los laboratorios de microbiología clínica se adquieren ya de forma preparada por diversos fabricantes industriales.

Los medios de cultivo sólidos suelen uti-lizarse en el laboratorio en unos recipientes especiales de plástico (antes eran de vidrio)

denominados placas de Petri, en forma de pequeños platos con tapa (fig. 2.3).

El hecho de depositar una muestra en un medio de cultivo para intentar que los microor-ganismos que pueda haber en ella crezcan en el medio se llama siembra.• Medios enriquecidos: contienen la ma-

yoría de factores necesarios para el cre-cimiento de casi todas las bacterias, in-cluso las exigentes. Estos medios suelen contener mezclas complejas de productos biológicos, como hidrolizados proteicos especiales de tejidos animales, extractos de tejido (p. ej., infusión de corazón, cerebro), sangre (p. ej., agar sangre), hemoglobina (agar chocolate), extracto de levadura, su-plementos de vitaminas y coenzimas, etc.

• Medios definidos: su composición seconoce exactamente por estar compuestos de mezclas de sustancias químicas puras.

• Medios selectivos: se les añaden deter-minadas sustancias (p. ej., antibióticos, metales colorantes) que favorecen el cre-cimiento de unas especies de bacterias e inhiben el crecimiento de otras.

• Medios de enriquecimiento: medios se-lectivos líquidos, especialmente preparados para el desarrollo selectivo de determinadas especies bacterianas que pueden estar en pequeña cantidad en algunas muestras; se

FiguRA 2.3

Placas de Petri con medio de cultivo sólido.

utilizan antes de su aislamiento en medios sólidos.

• Medios diferenciales: permiten estudiarpropiedades bioquímicas de las bacterias. Se utilizan para determinar caracteres bioquími-cos con los que se identifican las bacterias.

• Medios de transporte: no son realmentemedios de cultivo, dado que su propósito es la conservación de muestras para estudios microbiológicos. Estos medios intentan evi-tar la multiplicación de los microorganismos existentes en la muestra y, simultáneamente, impedir que pierdan su viabilidad (mueran) las bacterias más delicadas, como Neisseria gonorrhoeae (gonococo). Existen diversos tipos de medios de transporte, según el tipo de microorganismo que se quiera investigar. Los más conocidos son el de Stuart y el de Amies, destinados a la conservación de muestras para estudios bacteriológicos. Existen otros medios de transporte para otros propósitos, como la conservación de anaero-bios, la conservación de virus, etc.

2.3 BACteRiAs: MoRFoLogíA, AgRuPACioNes y estRuCtuRAsEn general, las bacterias son microorganismos unicelulares mucho más simples que las cé-lulas eucariotas (tabla 2.1). Su tamaño puede

variar entre 0,2 y 5 mm (milésimas de milíme-tro), aproximadamente (fig. 2.4).

La mayoría de las bacterias tienen una en-voltura rígida o pared bacteriana que determina su forma: esférica, cocos; cilíndrica (alargada), bacilos; cocobacilos (bacilos cortos redondea-dos); helicoidal, espiroquetas, etc. (fig. 2.5).

En ocasiones, sobre todo dependiendo de las condiciones de cultivo (edad del cultivo, tipo de medio sólido o líquido, presencia de antibióti-cos, etc.), una misma especie puede presentar morfología variable. A este fenómeno se le denomina pleomorfismo. Las bacterias a veces no se dividen totalmente, no se individualizan, y entonces dan lugar a agrupaciones de diferen-tes formas: cadenas (estreptococos), racimos (estafilococos), conjuntos de dos (diplococos)

Tabla 2.1 Diferencias entre células eucariotas y procariotas

Procariotas Eucariotas

Membrana nuclear

No Sí

Número de cromosomas

1 Múltiples

Tipo de cromosomas

Circular Lineal

División por mitosis

No Sí

Mitocondrias No SíRibosomas 70S 80S

FiguRA 2.4

Formas de bacterias.

FiguRA 2.5

Formas de bacterias.

(v. fig. 2.5) en ángulo o «en empalizada» (dif-teroides).

2.3.1 estructuras externas: paredLa pared bacteriana, además de dar la for-ma a la bacteria, la protege, por su rigidez, de los cambios osmóticos. Su conocimiento permite numerosas aplicaciones prácticas (tabla 2.2).

Químicamente, la parte rígida de la pared bacteriana es un compuesto llamado peptido-glucano, polímero en forma de red forma-da por largas cadenas lineales de moléculas (N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurá-mico) unidas por enlaces cruzados entre ellas (fig. 2.6). Esta especie de red envuelve toda la célula bacteriana y le da forma.

La tinción de Gram (llamada así en ho-nor a su descubridor) divide las bacterias en grampositivas y gramnegativas. Esta tinción (v. fig. 2.2) constituye uno de los elementos más importantes de la clasificación de las bacterias, pues el hecho de que una bacteria sea grampositiva o gramnegativa depende de la presencia de elementos importantes de la composición de la pared bacteriana. Existen también algunas bacterias que no se tiñen o se

tiñen irregularmente con el método de Gram, y por ello no son visibles en las preparaciones cuando se utiliza esta tinción (p. ej., las bac-terias del género Legionella), o son variables, respectivamente.

En las bacterias gramnegativas, la pared está formada por dos capas. La capa interna está compuesta por peptidoglucano. La capa exter-na contiene unas moléculas llamadas lipopoli-sacáridos. Estos lipopolisacáridos de las bac-terias gramnegativas son sustancias tóxicas: se denominan endotoxinas y son responsables de algunas de las consecuencias más graves de las infecciones (tabla 2.3).

En las bacterias grampositivas, la capa de peptidoglucano es mucho más gruesa y la pared sólo contiene una capa. El peptido-glucano existe en todas las células procario-tas y su bloqueo por medio de antibióticos es un arma excelente contra las infecciones bacterianas.

Existen algunas bacterias sin pared bacte-riana, bien porque carecen de ella (Mycoplas-ma) o bien porque se ha impedido su síntesis con antibióticos.

En las bacterias existen diversas estruc-turas externas que sobresalen de la célula (v. figs. 2.4 y 2.5, tabla 2.4).

Tabla 2.2 Funciones de la pared bacteriana

• Exoesqueleto»(formayresistenciaapresión)• Permeabilidad(porinas)• Patogenicidad

– Receptoresdeuniónalepitelio,etc.– Endotoxinas(lipopolisacárido[LPS]

endotóxico)• Diagnóstico

– DiferenteafinidadenGram– Especificidadantígeno(reacciones

serológicas)– Receptordefagos(fagotipia)

• Dianaterapéutica(accióndeantibióticos)

FiguRA 2.6

Peptidoglucano.

1. Flagelos: filamentos largos que hacenmoverse a la bacteria. Los flagelos sesitúan de forma característica en la paredbacteriana. En las bacterias con un soloflagelo, éste se sitúa en general en el ex-tremo de las bacterias alargadas (flagelopolar). Si existen múltiples flagelos, éstospueden estar situados como un penacho deflagelos polares o estar dispuestos alrededorde la bacteria.

2. Fimbrias o pili: filamentos cortos, rígidosy muy finos (no visibles al microscopioóptico), responsables de la adherencia delas bacterias a los tejidos (la adherencia bac-teriana es un requisito importante para quese produzca infección). Algunos pili estánrelacionados con el intercambio de materialgenético entre bacterias (conjugación).

3. Cápsula: capa de material amorfo usual-mente de naturaleza polisacárida que rodeala pared en muchas bacterias. Su presencia

es factor importante de virulencia, pues dificulta la fagocitosis.

2.3.2 estructuras internasLas bacterias se denominan procariotas, porque no contienen un núcleo definido, en contraste con las células eucariotas, que sí poseen núcleo (v. tabla 2.1). La diferencia fundamental entre bacterias y eucariotas es que el cromosoma o genoma bacteriano es una única molécula cir-cular de doble hélice de ADN, no separada del resto del citoplasma por una membrana nuclear (v. tabla 2.1 y fig. 2.4). Las bacterias a menudo contienen plásmidos: pequeñas molé-culas de ADN circular no pertenecientes al cro-mosoma.

En todas las bacterias, debajo de la pared se sitúa la membrana citoplasmática, de com-posición fosfolipídica y proteica. Tiene impor-tantes funciones: barrera de permeabilidad (re-gulación osmótica, metabólica y de excreción de enzimas, toxinas, etc.), sede de reacciones energéticas de fosforilación oxidativa, sus-trato para la síntesis de polímeros de la pared y diana de acción de algunos antibióticos y detergentes. Esta membrana delimita el cito-plasma celular, sistema coloidal que contiene el cromosoma (equivalente nuclear), los ribo-somas y las inclusiones, cuando existen.

Esporas: formas de resistencia producidas por bacterias de los géneros Bacillus (aerobios) y Clostridium (anaerobios), que les permiten sobrevivir en condiciones adversas. Las esporas

Tabla 2.3 Características de la pared bacteriana

Grampositivas Gramnegativas

Aspecto exterior Homogéneo RugosoEstructura Monodérmica

(unasolacapa)Bidérmica

(doscapas)Espesor Grueso(200-500Å) Fino(100-150Å)Componentes destacables Ácidosteicoicos LipopolisácaridoendotóxicoTinción de Gram Azul-violeta Rojo

Tabla 2.4 Estructuras bacterianas

Superficiales Internas

Constantes Pared MembranaCitoplasmaCromosomaRibosomas

Inconstantes Cápsula EsporasFlagelos InclusionesPili Plásmidos

son unas estructuras densas en las que se trans-forman las bacterias para resistir el calor o la desecación, y son muy resistentes a la acción de los desinfectantes. Cuando las condiciones vuel-ven a ser favorables, las esporas germinan y dan lugar de nuevo a bacterias en forma vegetativa.

2.4 FisioLogíA: NutRiCióN, CReCiMieNto y AisLAMieNto de LAs BACteRiAsLas bacterias se multiplican por división bina-ria. En condiciones óptimas, las bacterias de crecimiento rápido (p. ej., Escherichia coli) pueden llegar a dividirse cada 20 minutos.

Las bacterias, como todas las células, requie-ren nutrientes para multiplicarse; el crecimiento (y multiplicación) de las bacterias requiere:1. Materiales para la síntesis de sus elemen-

tos estructurales y para su metabolismo(proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, etc.).

2. Suministro de energía: en algunas bac-terias, esta energía puede obtenerse deforma sencilla, aprovechando la luz (fo-tosíntesis) u oxidando sales minerales;o de forma compleja, como es el casode los patógenos, por oxidación o por fermentación (oxidación sin oxígeno) de compuestos orgánicos más complejos.

En algunas bacterias, los materiales para la síntesis de sus biomoléculas pueden obtenerse a partir de elementos muy simples (p. ej., CO2, nitratos) y en otras se requieren moléculas preformadas mucho más complejas que han de obtenerse a partir de productos de degradación de macromoléculas complejas (p. ej., de proteí-nas). Este tipo de bacterias que para crecer en el laboratorio necesitan medios de composición compleja, en cuya fórmula se usan productos de origen biológico, se llaman bacterias exigentes (algunas bacterias exigentes pueden requerir para crecer la presencia en el medio de cultivo de sangre, vitaminas, lípidos especiales, etc.).

Análogamente a las técnicas y medios uti-lizados para cultivos de bacterias, existen téc-nicas y medios de cultivo aplicables a hongos, protozoos, gusanos y para células animales y vegetales (cultivos celulares).

2.5 CReCiMieNto BACteRiANo2.5.1 Condiciones ambientales y crecimiento bacteriano1. Agua: requerimiento absoluto para el cre-

cimiento de las bacterias. En general, almenos el 80% de la masa de las bacteriases agua, por lo que la disponibilidad deagua gobierna el tamaño de muchas po-blaciones bacterianas, como ocurre con lacantidad de bacterias que hay en la piel.

2. Oxígeno: las bacterias difieren en sus nece-sidades de oxígeno molecular para crecer.Las bacterias que son capaces de usar eloxígeno como aceptor final de electronesen su cadena respiratoria crecen en la at-mósfera habitual (aerobiosis) que contieneaproximadamente un 21% de oxígeno y sedenominan aerobias. Aquellas bacteriasque crecen sin la presencia de oxígeno(anaerobiosis) se denominan anaerobias.Son bacterias aerobias estrictas aquellasque no pueden crecer en anaerobiosis yanaerobias estrictas aquellas que no pue-den crecer en aerobiosis; bacterias facul-tativas son las que crecen en aerobiosis yanaerobiosis. Las bacterias incapaces deusar el oxígeno como aceptor final en surespiración pero que crecen en presencia deoxígeno se llaman aerotolerantes.

Determinadas bacterias, al crecer en pre-sencia de oxígeno, producen agua oxigena-da, que es muy tóxica, y por ello poseen una enzima denominada catalasa, que cataliza la descomposición del agua oxigenada. El tipo de respuesta de las distintas bacterias al oxígeno es muy importante (es decir, la

determinación de si son aerobias, anaerobias o facultativas) en el trabajo de laboratorio, yaque las muestras donde se quieren obtener cultivos bacterianos han de ser incubadas en la atmósfera adecuada para su crecimiento.

La necesidad de oxígeno de algunas bacterias influye, a veces, en su virulencia y en las enfermedades que producen. Así, determinadas bacterias causantes de la gangrena (secciones 12.4 y 30.3) no pue-den desarrollarse en tejidos normales bien vascularizados, que tengan un suministro de oxígeno adecuado.

3. Anhídrido carbónico: muchas bacteriaspatógenas, como los meningococos, re-quieren para su cultivo un contenido de un 5-10% de CO2 en la atmósfera. Esta atmósfera se logra fácilmente en un reci-piente con una vela encendida. Cerrando el recipiente, la vela se apaga al llegar a la proporción citada de CO2.

4. Temperatura: las bacterias también difierenen su temperatura óptima de crecimiento.a. Psicrófilas: óptimo por debajo de 20 °C.b. Mesófilas: entre 20 y 40 °C.c. Termófilas: entre 55 y 80 °C. La ma-

yoría de las bacterias patógenas sonmesófilas y crecen mejor a temperatu-ras de alrededor de 37 °C (temperaturadel cuerpo humano).

5. pH: como cabía esperar, el pH óptimopara el desarrollo de las bacterias queproducen enfermedad en el hombre es elpH fisiológico 7,2.

6. Productos metabólicos bacterianos:además de la producción de energía porlos diferentes mecanismos citados anterior-mente para las funciones fisiológicas, lasbacterias sintetizan componentes que sontransportados para formar las diferentes es-tructuras (cápsula, pared, flagelo, etc.) a granvelocidad. Una bacteria de E. coli «fabrica»una bacteria hija en 18-20 min. Además,las bacterias producen y anabolizan unagran cantidad de sustancias de gran interés

(diagnóstico, patogénico, industrial, ecológi-co), como es el caso de pigmentos, toxinas, vitaminas, antibióticos, bacteriocinas, etc.

2.5.2 Valoración del crecimiento bacteriano1. Cualitativo: cuando una célula bacteriana

se siembra en la superficie de un mediosólido, se multiplica in situ dando lugar a unacolonia que contiene millones de células quepueden observarse a simple vista. El tamañovaría desde puntiforme (como la punta de unalfiler) hasta 1 cm de diámetro según la espe-cie, el medio, el tiempo de incubación, etc.Asimismo, la forma, consistencia, color, etc.,son variables. Este tipo de cultivo es de graninterés para la obtención de cultivos puros,para el diagnóstico y para el antibiograma.

2. Cuantitativo: se estudia fundamentalmen-te en medio líquido y tiene gran interésen estudios de poblaciones, metabólicos,industriales, etc.

2.5.3 Fases del crecimiento bacterianoCuando una población bacteriana es trans-ferida a un nuevo medio de cultivo líquido, comienza a multiplicarse de acuerdo con la dinámica que se muestra en la figura 2.7.

En el crecimiento de una población bacte-riana pueden distinguirse 4 fases principales:

FiguRA 2.7

Fases del crecimiento bacteriano (medio líquido).

1. Fase lag: período de adaptación antes decomenzar a multiplicarse.

2. Fase exponencial: la multiplicación bac-teriana se acelera enormemente y en cadageneración se produce un número de bac-terias proporcional a las existentes.

3. Fase estacionaria: se alcanza cuando seconsumen los elementos nutritivos y elnúmero de bacterias se mantiene estable.

4. Fase de declive: las bacterias comienzan amorir.

2.5.4 Formación de biofilmsEn ciertas circunstancias, algunas bacterias y asociaciones de bacterias pueden crecer adhe-ridas a superficies y no como elementos indi-viduales. Este tipo de crecimiento bacteriano normalmente se efectúa en el interior de una acumulación de sustancias segregadas por las propias bacterias que forman unas estructuras llamadas glicocálix (en general de tipo poli-sacárido). Este tipo de estructuras bacterianas son muy importantes en el desarrollo de deter-minadas infecciones en algunos tejidos como las encías y los dientes (enfermedad perio-dontal [sección 34.2]) o las válvulas cardíacas (endocarditis), y desempeña también un papel fundamental en el establecimiento de infec-ciones que se desarrollan sobre material de prótesis (p. ej., prótesis cardíacas) o catéteres.

Cuando las bacterias crecen en estas con-diciones pueden escapar a la acción defensiva del sistema inmune y ser muy difíciles de tratar con antibióticos, pues la mayoría de los antibióticos no difunden fácilmente a través de la materia que forma el glicocálix que engloba a estas bacterias.

2.5.5 Aislamiento de microorganismos. Cultivos puros. Recuento de bacteriasEn la naturaleza y formando parte de la flora normal o patológica de diversos huéspedes, no

suelen encontrarse poblaciones bacterianas inte-gradas por una única especie. Al contrario, sue-len encontrarse mezclas de bacterias, a menudo muy complejas, con cientos de especies (como en el intestino grueso, vagina, sarro dentario).

Para estudiar una bacteria en el laboratorio e identificarla es necesario tener una pobla-ción bacteriana homogénea. Estas poblaciones bacterianas homogéneas que normalmente se obtienen como una población de bacterias descendiente de una sola bacteria (clon) se denominan cultivos puros. Las técnicas que permiten obtener cultivos puros a partir de mezclas de bacterias, separando las diversas especies existentes en la mezcla, reciben el nombre de técnicas de aislamiento.

Cuando se cultiva una muestra patológica para diagnosticar una infección, lo primero que se hace es sembrar la muestra en un medio de cultivo apropiado para que el microorga-nismo que buscamos crezca. A esto se llama recuperar el microorganismo.

Si como resultado de esta siembra obte-nemos colonias aisladas que nos permiten obtener cultivos puros, decimos que hemos aislado este microorganismo. La expresión técnicas de aislamiento referida a microor-ganismos tiene un significado completamente distinto que cuando se refiere a las técnicas de aislamiento de enfermos, y no debe confun-dirse con ellas.

La técnica de aislamiento más utilizada en los laboratorios de microbiología es la siembra por agotamiento de una porción de la muestra o del cultivo en la superficie de una placa dePetri, que contiene un medio de cultivo sóli-do. Esta siembra se realiza con un alambre especial (nicron o platino), que forma un bu-cle en la punta. Este dispositivo de siembra se denomina asa de platino o asa de siembra; las asas de siembra que suelen utilizarse hoy día son de plástico desechable.

Por este procedimiento, cada bacteria via-ble (viva) aislada en la superficie del medio sólido se desarrollará hasta formar un cúmulo

de bacterias, que se hace visible como una colonia aislada. Por ello, las bacterias viables existentes en una muestra se denominan uni-dades formadoras de colonias (UFC).

A menudo, al cultivar una muestra para identificar el agente causante de una infección encontramos que, si la muestra se ha conser-vado sin cuidado, durante la conservación se produce un crecimiento rápido de otras bac-terias de la muestra. Este crecimiento puede enmascarar el de la bacteria que queremos identificar, fenómeno que se denomina sobre-crecimiento.

Recuento de bacterias: si se quiere de-terminar el número de bacterias existentes en una muestra o en un cultivo, se recurre a técnicas de recuento de bacterias (recuentos bacterianos). Los recuentos bacterianos pue-den hacerse contando el número de bacterias en un volumen dado (después de efectuar una tinción) o determinando el número de bacterias vivas existentes. Para determinar el número de bacterias vivas se efectúa una siembra, de tal manera que cada bacteria dé lugar a una colonia diferente y luego se cuenta el número de colonias que se han desarrollado (recuento viable).

2.6 ideNtiFiCACióN de LAs BACteRiAsIdentificar una bacteria consiste en determi-nar la especie a la que pertenece y, en algu-nos casos, el serogrupo e incluso la cepa. La primera fase, y quizá la fundamental para la identificación de una bacteria, es la obtención de un cultivo puro utilizando las técnicas de aislamiento.

Una vez obtenido un cultivo puro, habi-tualmente se determina:1. Morfología y agregación (coco, bacilo,

cadenas, racimos, etc.), efectuando una tinción de Gram. Estos datos permiten encuadrar la bacteria en alguno de los

grandes grupos, como cocos grampositi-vos, bacilos gramnegativos, etc.

2. A partir de este punto, se valoran las carac-terísticas de crecimiento, lo que se efectúa sembrando la bacteria en diversos medios de cultivo y en distintas condiciones de incubación; por ejemplo:a. La falta de crecimiento en medios sin

suplementos nos indicará que es una bacteria exigente.

b. La falta de crecimiento en ausencia deoxígeno nos indicará que es aerobia estricta, etc.

c. El crecimiento en medios de cultivoque contienen sangre nos indicará si la bacteria hemoliza los hematíes, en cuyo caso diremos que es hemolítica; si la hemólisis es total, diremos que es betahemolítica, y si la hemólisis producida es parcial, diremos que la bacteria es alfahemolítica.

d. Otros.3. Se efectúan múltiples pruebas para de-

terminar caracteres fisiológicos, llamadaspruebas bioquímicas; por ejemplo:a. Podemos poner una porción de una

colonia en contacto con agua oxige-nada. El que se produzcan burbujas deoxígeno nos indicará la existencia de laenzima catalasa.

b. Podemos estudiar el tipo de vía meta-bólica (oxidativa o fermentativa) que labacteria utiliza para obtener su energía apartir de la glucosa. Para ello cultivamosla bacteria en aerobiosis y anaerobiosisen un medio de cultivo que contengaglucosa como único azúcar y observamosel cambio de pH con un indicador. Si labacteria obtiene su energía por la vía me-tabólica de oxidación de la glucosa, el pHcambia poco (diremos que la bacteria esoxidativa o no fermentadora), y si ob-tiene su energía por fermentación, el pHbaja mucho por los ácidos formados (di-remos que la bacteria es fermentadora).

c. Podemos cultivar la bacteria en unmedio que contenga lactosa y un in-dicador de pH; el cambio de color delindicador hacia pH ácido indicará quela bacteria ha utilizado la lactosa por lavía metabólica fermentativa y diremosque esta bacteria fermenta la lactosa.

d. Podemos comprobar la existencia dela ruta bioquímica oxidativa de loscitocromos en el metabolismo de labacteria mediante la detección dela enzima oxidasa, la que dividirálas bacterias en oxidasapositivas yoxidasanegativas.

e. Podemos observar si, cuando se hacecrecer la bacteria en un medio quecontiene nitratos, se producen nitritosy diremos que la bacteria reduce losnitratos.

f. Otras (características de colonias, pig-mentos, etc.).

Actualmente, la mayoría de los laboratorios de microbiología suelen usar los llamados sistemas de pruebas múltiples (dispositivos fabricados industrialmente) para la identifi-cación. Estos sistemas permiten el estudio si-multáneo de múltiples caracteres bioquímicos y la identificación de las bacterias a partir de los resultados obtenidos usando programas informáticos.

En ocasiones es posible recurrir a la iden-tificación de un microorganismo utilizando anticuerpos específicos (lo mejor es utilizar anticuerpos monoclonales [sección 9.4]) para detectar antígenos que son propios de determinadas bacterias: si el antígeno está presente, hemos identificado la bacteria. Esto se hace mediante reacciones antígeno-anticuerpo, principalmente aglutinación e inmunofluorescencia. También es posible la identificación comprobando la identidad de su genoma (ADN) mediante la búsqueda de trozos de ADN (secuencias génicas) que son específicas de determinadas bacterias; estas secuencias se buscan con otros trozos de ADN complementarios de ellas, que usamos como reactivos de prueba (sondas) utilizando técni-cas de genética molecular (sección 9.5).

A menudo, los métodos de detección espe-cífica de microorganismos, utilizando técnicas antígeno-anticuerpo o de genética molecular, permiten identificar específicamente un mi-croorganismo a partir de muestras, lo que posibilita (en ocasiones) el diagnóstico casi inmediato de la etiología de una infección.

Debe recordarse que la identificación ine-quívoca de una bacteria a partir de un cultivo, y mucho más directamente a partir de una muestra clínica, puede ser una tarea compleja y requerir la actuación de laboratorios muy especializados.

43

Factores que influyen en el crecimientoy supervivencia de los microorganismos

Virginia Leyva Castillo,Tamara K. Martino Zagovalov y Yamila Puig Peña

Los alimentos que consumimos casi nunca se encuentran estériles, sino quecontienen asociaciones microbianas cuya composición depende de qué organis-mo llegan a él y de cómo se multiplican, sobreviven e interaccionan en el alimen-to durante el transcurso del tiempo. Los microorganismos en los alimentosprocederán tanto de la microbiota de la materia prima como los que se introdu-cen durante las operaciones de recolección-sacrificio, tratamiento, almacena-miento y distribución. Los tipos y cantidad de microorganismos serán determinadospor las propiedades del alimento, por la atmósfera donde se almacena, por lascaracterísticas de los propios microorganismos y por los efectos del tratamiento.

En el proceso de elaboración de alimentos, cuando se cumple con las reglasde higiene o con las buenas prácticas de elaboración, en toda la cadena delproceso, esta microbiota no ejerce un efecto aparente y el alimento puede serconsumido sin consecuencias adversas. En caso contrario, los microorganismospueden manifestar su presencia en una de las formas siguientes:− Causando alteración de los alimentos.− Provocando enfermedades trasmitidas por los alimentos.− En algunos casos, de forma intencional en la elaboración de un alimento, se

transforman sus propiedades de una forma beneficiosa mediante su fer-mentación.

CRECIMIENTO MICROBIANOEl crecimiento microbiano es un proceso autocatalítico: no habrá crecimiento

sin la presencia de al menos una célula viable, y la tasa de crecimiento aumenta-rá de acuerdo con la cantidad de biomasa viable presente. La pauta de creci-miento es la misma para bacterias y hongos.

Las bacterias requieren determinadas condiciones para multiplicarse rápi-damente, esta multiplicación rápida es la que causa problemas relacionados conla seguridad del alimento. En condiciones ideales este crecimiento rápido puedellegar a un tiempo de generación menor que 20 min.

Si realizamos el experimento para determinar el número de microorganismosen relación con el tiempo y después representamos en una gráfica el logaritmo

de los microorganismos viables frente al tiempo, se obtiene la curva que se re-presenta en el capítulo 1, en la que se aprecia que el crecimiento exponencialsolo tiene lugar durante una parte del tiempo.

No es necesario hacer mucho énfasis en la importancia del crecimientoexponencial en el tratamiento de los alimentos, una sola bacteria con un tiempode generación de 20 min que crece en un alimento, puede producir una poblacióncelular superior a 107 microorganismos/g o mL en 8 h. Por lo tanto la misiónprincipal del microbiólogo de alimentos y de los especialistas en higiene de losalimentos es conocer qué es lo que influye en el crecimiento microbiano convistas a controlarlo.

Si se tiene en cuenta que normalmente la microbiota de un alimento nuncaestá compuesta por un solo tipo de microorganismo durante el crecimiento, reco-lección/sacrificio, tratamiento y almacenamiento, el alimento está sujeto a conta-minación de diversa procedencia. Algunos microorganismos serán capaces decrecer juntos en lo que se conoce como una asociación, cuya composición cam-biará en el transcurso del tiempo.

Los factores que influyen en el crecimiento microbiano en los alimentos ypor tanto las asociaciones que se desarrollan, también determinan la naturalezade la alteración y cualquier riesgo para la salud que se planteen. La fase logarítmicade crecimiento puede verse afectada si se acorta su longitud, controlando losfactores de crecimiento.

Hace más de 40 años Mossel e Ingram dividieron estos factores en 4 grupos:− Propiedades físico-químicas del propio alimento (factores intrínsecos).− Condiciones del ambiente del almacenamiento (factores extrínsecos).− Propiedades e interacciones de los microorganismos presentes (factores im-

plícitos).− Factores del tratamiento, este último incluido por Mossel e Ingram entre los

factores intrínsecos.

Factores que influyen en el desarrollo de las asociaciones microbianas enlos alimentos:− Factores intrínsecos:

• Nutrientes.• pH.• Potencial redox.• Actividad de agua.• Constituyentes antimicrobianos.• Estructuras biológicas.

− Factores ambientales o extrínsecos:• Humedad relativa.• Temperatura.• Atmósfera gaseosa.

FACTORES INTRÍNSECOS

Contenido de nutrientes. Del mismo modo que los seres humanos, losmicroorganismos son capaces de utilizar los alimentos como fuente de nutrientesy de energía. Los microorganismos en los alimentos, para multiplicarse y desa-rrollar su fisiologismo normal, necesitan los elementos siguientes:− Agua.− Fuente de energía.− Fuente de nitrógeno y vitaminas.− Factores de crecimiento afines, como sales minerales.

Los microorganismos que se encuentran en los alimentos pueden utilizarazúcares, alcoholes y aminoácidos propios de los alimentos como fuente de ener-gía. La incapacidad de un organismo para emplear un componente mayoritariode un material alimenticio limitará su crecimiento y lo situará en desventaja com-petitiva comparado con aquellos que no son capaces de utilizarlo. Algunos usancomo fuente de energía carbohidratos complejos, como son los almidones porposeer enzimas amilolíticas y la celulosa, por tener la posibilidad de degradarprimeramente estos compuestos a azúcares sencillos, esto favorecerá el creci-miento de un determinado organismo en los cereales y en otros productosfarináceos. La adición al yogurt de frutas que contiene sacarosa y otros azúca-res aumenta la gama de carbohidratos disponibles y permite el desarrollo de unamicrobiota variada de levaduras causantes de alteración. Las grasas tambiénson utilizadas por un reducido e insignificante número de microorganismos comofuentes de energía.

En general los microorganismos utilizan compuestos simples como losaminoácidos, antes de tener que atacar compuestos complejos, como las proteí-nas de elevado peso molecular, por tanto las principales fuentes de nitrógeno delos microorganismos heterótrofos son los aminoácidos. En condiciones ideales laconcentración de nutrientes indispensables puede, hasta cierto punto, determinarla velocidad de crecimiento microbiano.

pH. Tal y como se determina en un electrodo de vidrio, el pH es el logaritmonegativo de la concentración del ión hidrógeno de cualquier solución. En térmi-nos simple el pH de un alimento es la medida de su acidez o alcalinidad, teniendoen cuenta que la escala de pH comienza en cero y termina en 14; que unasolución de pH de 7 es considerada como neutra, que los pH menores que 7 sonconsiderados como ácidos y mayores como alcalinos.

La acidez o la alcalinidad de un medio tienen gran influencia en la estabili-dad de macromoléculas tales como las enzimas, lo que justifica que tanto elcrecimiento como el metabolismo de los microorganismos estén influidos por el pH.

En general, las bacterias crecen con mayor rapidez a pH comprendido en-tre 6,0 y 8,0 (tabla 4.1), las levaduras entre 4,5 y 6,0, así como los hongosfilamentosos entre 3,5 y 4,0; aunque hay bacterias capaces de crecer a pH bajoscomo consecuencia de su metabolismo productor de energía, por ejemplo, los

lactobacilos y las bacterias acéticas cuyo crecimiento óptimo generalmente tienelugar a un pH comprendido entre 5,0 y 6,0. Si a un alimento se le cambia el pH,ya sea por encima o por debajo del neutro, los microorganismos crecerán conmayor lentitud.

Tabla 4.1. Límites de pH según tipo de microorganismo

pHmínimo pHmáximo

Bacterias gramnegativasEscherichia coli 4,4 9Klebsiella pneumoniae 4,4 9Proteus vulgaris 4,4 9,2Pseudomonas aeruginosa 5,6 8Salmonella paratyphi 4,5 7,8Salmonella typhi 4,0-4,5 8,0-9,6Vibrio parahaemolyticus 4,8 11,0Bacterias grampositivasBacillus cereus 4,9 9,3Bacillus subtilis 4,5 8,5Bacillus stearothermophillus 5,2 9,2Clostridium botulinum 4,7 8,5Clostridium sporogenes 5,0 9,0Enterococcus spp. 4,8 10,6Staphylococcus aureus 4,0 9,8Streptococcus lacti 4,3-4,8 9,2

La mayoría de los alimentos son, cuando menos, ligeramente ácidos (tablas4.2 y 4.3), ya que los materiales cuyo pH es alcalino casi siempre tienen un saborbastante desagradable. La clara de huevo, cuyo pH aumenta hasta cerca de 9,2a medida que el dióxido de carbono es eliminado del huevo después de ser puestoeste, constituye una excepción común a lo expuesto. Un ejemplo que algunostomarían como prueba convincente de la no comestibilidad de los alimentos alcalinoses el tiburón fermentado, que se elabora en Groenlandia, y que tiene un pH de 10 a 12.

Aunque la mayoría de los alimentos son de naturaleza ácida, o sea quetienen el pH por debajo de 7, otros son más ácidos, tienen el pH por debajo de 4,6como por ejemplo el vinagre, algunas frutas, los alimentos en salmuera, el yogurt,la mayonesa, etc. Por debajo de 4,6 la mayoría de los microorganismos patógenosno crecen o lo hacen muy lentamente, por tanto, en general los alimentos ácidosno constituyen un problema para la salud, en estos pH suelen crecer microor-ganismos alteradores que pueden cambiar la textura y la apariencia del alimento.

La acidez de un producto puede tener importantes implicaciones tanto en suecología microbiana como en la rapidez y naturaleza de su alteración, por ejem-plo, los productos vegetales clasificados como hortalizas casi siempre tienen unpH ligeramente ácido y las bacterias productoras de putrefacción blanda, comoErwinia carotovora y Pseudomonas desempeñan un importante papel en sualteración. En las frutas, sin embargo, un pH más bajo impide el crecimientobacteriano y de aquí que su alteración sea dominada por levaduras y mohos.

Tabla 4.2. Valores de pH aproximados de algunas frutas y hortalizas frescasProducto pHHortalizasEspárragos (yemas y tallos) 5,7-6,1Judías (vedes y limas) 4,6-6,5Remolacha 4,2-4,4Zanahorias 4,9-5,2; 6,0Coliflor 5,6Berenjena 4,5Lechuga 6,0Aceitunas 3,6-3,8Cebollas rojas 5,3-5,8Perejil 5,7-6,0Patatas (tubérculos y boniatos) 5,3-5,6Calabaza 4,8-5,2Tomates entero 4,2-4,3Nabos 5,2-5,5FrutasManzanas 2,9-3,3Plátanos 4,5-4,7Higos 4,6Limas 1,8-2,0Melones 6,3-6,7Naranjas 3,6-4,3Ciruelas 2,8-4,6

Tabla 4.3. Valores de pH aproximados de los productos lácteos, de las carnes y de losproductos pesqueros

Producto pH

Productos lácteosMantequilla 6,1-6,4Suero de mantequilla 4,5Leche 6,3-6,5Nata 6,5Queso (suave americano Cheddar) 4,9-5,9

Pescados y mariscosPescado (casi todas las especiesinmediatamente después de la muerte) 6,6-6,8Almejas 6,5Cangrejos 7,0Ostras 4,8-6,3Atún 5,2-6,1Camarón 6,8-7,2Salmón 6,1-6,3Pescado blanco 5,5

CarnesVaca picada 5,1-6,2Jamón 5,9-6,2Ternera 6,0Pollo 6,2-6,4

La capacidad del pH bajo para limitar el crecimiento microbiano ha sidoaprovechado de forma deliberada, desde los tiempos más antiguos en la conser-vación de alimentos con los ácidos acéticos y láctico. Los pH bajos ayudan a laconservación de los alimentos de las formas siguientes:− Directamente, inhibiendo el crecimiento microbiano.− Indirectamente, disminuyendo la resistencia al calor de los microorganismos

en los alimentos que se someten a tratamiento térmico.

Potencial Redox (Eh). Una reacción de oxidación-reducción (O/R) o depotencial redox (Eh) se produce como consecuencia de una transferencia deelectrones entre átomos o entre moléculas. Desde hace muchos años se conoceque los microorganismos presentan diferentes grados de sensibilidad al potencialde oxidación-reducción del medio de cultivo.

En general, el potencial redox de un sustrato se puede definir como aquel enel que el sustrato pierde o gana electrones con mayor facilidad. Cuando un ele-mento o compuesto pierde electrones, se dice que el sustrato ha sido oxidado,mientras que un sustrato que gana electrones se ha reducido.

Oxidación

Cu Cu + e

Reducción

También se puede obtener oxidación por adición de oxígeno, como se indicaen la reacción siguiente:

Cu + O2 2CuO

Por tanto, una sustancia que fácilmente cede electrones es un buen agentereductor, mientras que otra que capte es un buen agente oxidante. Cuando pasanelectrones de un compuesto a otro se crea una diferencia de potencial entreambos, esta diferencia se mide frente a una referencia externa por medio de unelectrodo de metal inerte casi siempre de platino sumergido en un medio, y seexpresa en milivoltios (mV). Cuanto más oxidada esté una sustancia, más positi-vo será su potencial eléctrico y cuanto más reducida, más negativo su potencial.

En relación con los microorganismos, el potencial redox indica las relacio-nes de oxígeno entre ellos, y es utilizado para especificar el ambiente en que unmicroorganismo es capaz de generar energía y sintetizar nuevas células. Losmicroorganismos aerobios necesitan para crecer valores redox positivos, mien-tras que los anaerobios frecuentemente requieren valores negativos. Losmicroorganismos de acuerdo con su potencial de oxidación-reducción se dividenen los grupos siguientes: aerobios estrictos, anaerobios estrictos, anaerobios fa-cultativos y microaerófilos.

Aerobios estrictos. Los microorganismos aerobios estrictos en el hábitatde los alimentos usan el oxígeno como aceptor final de electrones en la respira-ción (Bacillus subtilis, B. megaterium, Acinetobacter, etc.), por consiguiente,tienen necesidad de oxígeno y de elevado Eh, por lo que predominarán en lasuperficie de los alimentos expuestos al aire o en aquellas zonas de los mismosen las que el aire pueda ser utilizado fácilmente; de manera que Pseudomonas,por ejemplo, Ps. fluorescens que crece a un Eh comprendido entre +100 y+500 mV. Otros bacilos gramnegativos oxidativos producen mucílagos y oloresdesagradables en la superficie de la carne, Bacillus subtilis posee un potencialredox de crecimiento comprendido entre -100 y +135 mV, produce viscosidad enla textura abierta del pan y las especies de Acetobacter que crecen en la super-ficie de las bebidas alcohólicas, oxidan el etanol a ácido acético para produciralteración o vinagre.

Anaerobios estrictos. Los microorganismos anaerobios obligados solotienden a crecer a potenciales redox bajos o negativos, no pueden utilizar eloxígeno como aceptor final de electrones; dentro de ellos los Clostridios tienengran importancia en microbiología de los alimentos. Tienen la posibilidad de cre-cer donde las condiciones sean anaerobias, por ejemplo, en la profundidad de lostejidos y en los estofados de carne, en los alimentos envasados y enlatados alvacío causando alteración. Entre los microorganismos anaerobios más importan-te para la salud pública se encuentra Clostridium botulinum.

Anaerobios facultativos. Los anaerobios facultativos como los que for-man las familias Vibrionaceae, Enterobacteriaceae y Corynebacteriaceae pue-den utilizar el oxígeno como aceptor final de electrones, pero en su ausenciatambién pueden utilizar una diversidad de aceptores de electrones (NO3

-, SO42-).

Estos organismos pueden crecer en la superficie y en el interior de los alimentos,algunos poseen actividad proteolítica o lipolítica. Con frecuencia sus productosde desechos son ácidos orgánicos.

Debido a su profusa distribución, su amplio rango de actividad enzimática ysu capacidad para descomponer los compuestos orgánicos, dichos microor-ganismos pueden competir en una amplia gama de ambientes y con frecuenciason responsables de la alteración de los alimentos de bajo Eh; a esto se debe quesean importantes microorganismos alteradores de los alimentos; aunque algunoscomo los lactobacilos se pueden utilizar para cambios beneficiosos en la elabora-ción de varios alimentos. Algunos microorganismos anaerobios facultativos comolas enterobacterias tienen gran relevancia para la salud pública.

Microaerófilos. Estos microorganismos necesitan una cantidad muy re-ducida de oxígeno para su crecimiento, lo cual se debe tener en cuenta a la horade cultivarlo en el laboratorio, uno de los microorganismos importantes desde elpunto de vista de enfermedad para el humano a través de los alimentos esCampylobacter spp.

Actividad de Agua. La vida tal y como nosotros la conocemos dependetotalmente de la presencia de agua en estado líquido, por tanto los microorganismosnecesitan de agua libre o disponible para su crecimiento. Los solutos como sal yazúcar, así como los mecanismos de deshidratación disminuyen el agua disponi-ble y reducen el rango de crecimiento microbiano.

La actividad acuosa de un alimento o solución (Aa) se define como el co-ciente entre la presión parcial del agua existente en la atmósfera en equilibrio conel sustrato (alimento) (P) y la presión parcial de la atmósfera en equilibrio con elagua pura a la misma temperatura: Aa = P/Po.

Este cociente es equivalente a la humedad relativa de equilibrio (HRE)expresada como fracción en lugar de porcentaje: Aa=P/Po=1/100 HRE

La humedad relativa de equilibrio tiene importantes repercusiones en elalmacenamiento de alimentos de baja Aa.

A medida que una solución se concentra la presión de vapor disminuye y laactividad acuosa va disminuyendo a partir de un valor máximo de 1 para el agua pura.

La mayoría de los microorganismos incluyendo las bacterias patógenas crecenmás rápidamente a niveles de Aa de 0,993 a 0,998 (tablas 4.4 y 4.5). A valoresinferiores de Aa, la velocidad de crecimiento o la masa celular final disminuye yla fase de latencia aumenta.

Tabla 4.4. Actividades de agua mínimas a las que puede haber crecimiento activo

Grupo de Aa Grupo de Aamicroorganismos mínima microorganismos mínima

Mayoría de bacterias 0,97 Mayoría de hongos 0,80gramnegativasMayoría de bacterias 0,90 Bacterias halófilas 0,75gramnegativasMayoría de levaduras 0,88 Hongos xerófilos 0,61

Tabla 4.5. Niveles mínimos de activad acuosa que permiten el crecimiento de losmicroorganismos que se citan a temperaturas próximas a la óptima

Microorganismos Aa

MohosAlternaria citri 0,84A. fumigatus 0,82P. islandicum 0,83A. flavus 0,78LevadurasS. cerevisiae 0,90Debaromyces hansenii 0,83S. rouxii 0,62

BacteriasC. botulinum tipo E 0,97C. botulinum tipo A 0,95B. cereus 0,95C. perfringens 0,95E, coli 0,95Salmonella spp. 0,95C. botulinum tipo B 0,94V. parahaemolyticus 0,94S. aureus 0,86Halobacterium halobium 0,75

Principales razones para la no disponibilidad del agua por los microor-ganismos:− Los solutos y los iones fijan agua de la disolución. El aumento de la concentra-

ción de las sustancias disueltas (azúcares o sales) equivale a una deshidratación.− Los coloides hidrófilos (geles) impiden la disponibilidad del agua.− El agua de cristalización o de hidratación no suele ser asequible a los

microorganismos, tampoco el agua cristalizada o formando hielo.− El potencial de agua puede contener un componente osmótico, relacionado

con el efecto de los solutos en solución.

A continuación se definen 3 grupos de microorganismos asociados a dife-rentes tipos de alimentos de acuerdo con su actividad acuosa o su presión osmótica:− Halotolerantes. Capaces de crecer en presencia de elevadas concentraciones de sal.− Osmotolerantes. Capaces de crecer en presencia de elevadas concentracio-

nes de compuestos orgánicos no ionizados como son los azúcares.− Xelotolerantes. Capaces de crecer en alimentos secos.

Estos términos no definen estrictamente grupos exclusivos demicroorganismos pero son útiles en el contexto de los estudios de determinadosalimentos.

Si bien es cierto que algunos microorganismos crecen mejor a Aa reducida,por ello pueden ser definidos como halófilos, xerófilos.y osmófilos.

Halófilos. Microorganismos que son capaces de crecer en presencia deelevadas concentraciones de sal y atañen principalmente a las bacterias, comolas halobacterias que incluyen géneros tales como Halobacterium y Halococcuspertenecientes a las Archebacterias. Son obligadamente halófilas, suelen en-contrarse en los lagos salados o en las charcas de agua salada y pueden causarla alteración proteolítica del pescado salado y desecado.

Xerófilos. Microorganismos que crecen más rápidamente bajos condicio-nes de relativa sequedad y están representados por mohos y levaduras.

Osmófilos. Microorganismos que crecen en hábitat con altas presionesosmóticas, este término se aplica habitualmente a las levaduras tolerantes alazúcar.

La tabla 4.6 muestra la escala de valores de la Aa correspondiente a dife-rentes alimentos.

El valor limitante de la actividad de agua para el crecimiento de cualquiermicroorganismo es aproximadamente de 0,6, de modo que por debajo de estevalor la alteración de los alimentos no es microbiológica.

FACTORES EXTRÍNSECOS

Humedad relativa. La humedad relativa y la actividad acuosa están rela-cionadas entre sí, de modo que la humedad relativa es esencialmente una medidade la actividad de agua en la fase gaseosa. Cuando se almacena un alimento que

tiene actividad acuosa baja en una atmósfera de humedad relativa elevada, elagua pasará desde la fase gaseosa al alimento. Es posible que transcurra muchotiempo para que la masa del alimento aumente su actividad de agua, pero puedehaber una condensación en las superficies que origine zonas localizadas de ele-vada actividad de agua, en estas zonas en que los propágulos han permanecidoviables, pero que no han sido capaces de crecer, pueden ahora germinar y crecer.

Estos casos se pueden dar en los silos de granos o en los tanques donde sealmacenan concentrados y jarabes.

Otro problema de las unidades de almacenamiento en gran escala, comoson los silos para grano, se presenta porque la humedad relativa del aire es muysensible a la temperatura. Si un lado del silo se calienta en exceso, debido a unaexposición al sol, en tal caso la humedad relativa disminuye en este lado y haydesplazamiento neto de moléculas de agua desde el lado más frío para volver aequilibrar la humedad relativa. Cuando el mismo lado del silo se enfría de nuevo,la humedad relativa aumenta y, aunque se desplazan de nuevo las moléculas deagua, el aumento temporal de la humedad relativa puede ser suficiente paracausar una condensación local en el grano, acompañada de aumento localizadode la Aa suficiente para permitir la germinación de las esporas fúngicas y lasubsiguiente alteración del grano.

Tabla 4.6. Grupos principales de alimentos en relación con su activad acuosa

Aa de 0,98 o superiores Jamón tipo SerranoCarnes y pescado frescos Leche condensada azucaradaFrutas, hortalizas y verduras frescas

Aa entre 0,85-0,60Leche y otras bebidas Alimentos de humedad intermediaHortalizas en salmueras enlatadas Frutas secasFrutas enlatadas en almíbares diluidas Harina

Aa entre 0,98-0,93 CerealesLeche evaporada Confituras y mermeladasConcentrado de tomate MelazasProductos cárnicos y de pescadoligeramente salados Pescado muy saladoCarnes curadas enlatadas Extractos de carneEmbutidos fermentados (no secos) Algunos quesos maduradosEmbutidos cocidos NuecesQuesos de maduración corta

Aa inferiores a 0,60Queso Gouda DulcesFrutas enlatadas en almíbar ChocolatePan MielCiruelas con elevado contenido en agua Macarrones, fideos

Aa entre 0,93-0,85 GalletasEmbutidos fermentados y madurados(tipo italianos y húngaro) Papas fritasQueso Cheddar curado Verduras secas, huevos deshidratados,

leche en polvo

El almacenamiento de frutas y hortalizas frescas requiere un control muycuidadoso de la humedad relativa. Si esta es excesivamente baja, en algunashortalizas disminuirá el contenido de agua y se mustiarán. Si es excesivamenteelevada, puede haber condensación y es posible que se inicie su alteraciónmicrobiana.

Temperatura. Los microorganismos crecen dentro de una amplia escalade temperaturas. A presión atmosférica puede haber crecimiento microbianodentro de un intervalo de temperatura comprendido aproximadamente desde -8hasta 100 ºC. La exigencia más importante es que el agua se encuentre en esta-do líquido y por tanto disponible para mantener el crecimiento. Ningún organismoha sido capaz de crecer en todas las temperaturas de este intervalo; las bacteriasnormalmente se limitan a crecer en una escala de temperaturas en torno alos 35 ºC, mientras que los mohos lo hacen con temperaturas algo inferiores a los 30 ºC.

Cada microorganismo exhibe unas temperaturas mínimas, máximas y ópti-mas de crecimiento. Estas temperaturas van a ser muy típicas de un determina-do microorganismo y van a estar influidas por el pH, la Aa y la disponibilidad denutrientes.

Tabla 4.7. Temperaturas cardinales correspondientes al crecimiento microbiano

Grupo Temperatura (°C)Mínima Óptima Máxima

Termófilos 40 - 45 55 - 75 60 - 90Mesófilos 5 - 15 30 - 40 40 - 47Psicrófilos (psicrófilos obligados) -5 - +5 12 - 15 15 - 20Psicrótrofos -5 - +5 25 - 30 30 - 35

Sobre la base de las temperaturas de crecimiento, los microorganismos puedenser clasificados en varios grupos fisiológicos (tabla 4.7).

En microbiología de los alimentos, los organismos mesófilos y psicrótrofosgeneralmente son de vital importancia. Los mesófilos con temperatura óptima entorno a 37 ºC con frecuencia son de origen humano o animal, e incluyen algunosde los más importantes patógenos trasmitidos por los alimentos como, Salmonella,Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens.

Por regla general a su temperatura óptima crecen más rápido que lospsicrótrofos y por ello, la alteración de los productos perecederos o almacenadosen el intervalo de temperaturas correspondientes al crecimiento de los mesófiloses más rápida que su alteración en condiciones de refrigeración.

Como hemos podido observar los psicrófilos y psicrótrofos son los 2 gruposde organismos que crecen a temperaturas bajas, los psicrófilos (amantes del frío)verdaderos o estrictos tienen temperaturas óptimas de 12-15 ºC y no crecen porencima de los 20 ºC; los psicrófilos están confinados principalmente en las regio-nes polares y en el medio marino. Los psicrótrofos o psicrófilos facultativos cre-cerán a las mismas temperaturas como psicrófilos estrictos pero sus temperaturasde crecimiento óptimo y máxima son más elevadas. Esta tolerancia de un inter-valo de temperaturas más amplio significa que los psicrótrofos se encuentran en

una gama de hábitat más variados y, consiguientemente, tienen mayor importan-cia en la alteración de los alimentos refrigerados.

Los termófilos por lo general tienen una importancia menor en microbiolo-gía de los alimentos, aunque existen termófilos esporógenos tales como determi-nados Bacillus y determinadas especies de Clostridium que causan problemas.

Constituyentes antimicrobianos (parámetro intrínseco). Algunos ali-mentos presentan estabilidad con respecto a determinados microorganismos, estoes debido a la presencia de algunas sustancias naturales en las que se ha demos-trado la existencia de actividad microbiana, por ejemplo, aceites esenciales.

Entre los aceites esenciales está el eugenol en el clavo, la alicina en el ajo,el aldehído cinámico, el isotiocianato de alilo en la mostaza, el eugenol y el timolen la salvia, así como el carvacrol (isotimol) y el timol en el orégano. La leche devaca contiene varias sustancias antimicrobianas que incluyen la lactoferrina, laconglutinina y el sistema lactoperoxidasa; se ha demostrado que la caseína, asícomo también algunos ácidos grasos libres que existen en la leche, tienen activi-dad antimicrobiana. Los huevos contienen lizozima, al igual que la leche, y estaenzima junto con la conalbúmina, dota a los huevos de un sistema antimicrobianomedianamente eficaz.

Estructuras biológicas (parámetro intrínseco). La envoltura naturalde algunos alimentos proporciona excelente protección frente a la entrada y dañosubsiguiente por microorganismos causantes de alteraciones. Entre los diferen-tes tipos de envolturas existen estructuras tales como la testa de las semillas, eltegumento externo de las frutas, las cáscaras de los frutos (como la nuez), la pielde los animales y la cáscara de los huevos.

1. FUNDAMENTOS DE LA CONSERVACIÓNDE ALIMENTOS

Como se ha indicado anteriormente la causa principal del deterioro de los alimentos es el desarrollo y proliferación de microorganismos, que general­mente no se encuentran en el interior de los tejidos de las plantas y de los ani­males sanos, pero siempre están presentes y dispuestos a invadirlos si hay una rotura de la piel, o si ha sido debilitada por enfermedad o muerte. Así mismo, hasta el momento de la cosecha o del sacrificio las reacciones enzimáticas, producidas por las enzimas naturales de los alimentos, son controladas y equi­libradas en la planta o en el animal que vive normalmente, pero a partir de ese momento dicho equilibrio se pierde.

Si los alimentos deben conservarse sólo durante un corto periodo de tiempo, se dispone de dos posibilidades:

• Mantener el alimento vivo el mayor tiempo posible. Un ejemplo deesta posibilidad es la conservación de las langostas vivas en los restau­rantes.

• Cuando no es posible mantener vivo el alimento, hay que cubrirlo yenfriarlo, con lo cual se retardan los factores de descomposición, perosólo durante un tiempo muy breve.

Para la conservación durante un periodo más largo que requieren la mayo­ría de nuestros alimentos, hacen falta otras precauciones, cuya finalidad es, generalmente, la inactivación o control de los microorganismos que, como ya se ha dicho, son la causa principal de la descomposición.

El alimento, o sustrato, determina los microorganismos que pueden desa­rrollarse, si se conocen las características del alimento se puede predecir la

flora microbiana que es posible que crezca en él. Para comprender los princi­pios básicos que rigen tanto la alteración como la conservación de los alimen­tos, es necesario recordar algunos principios fundamentales del crecimiento de los microorganismos y conocer los factores que favorecen o inhiben su multi­plicación.

Cuando los microorganismos se encuentran en un ambiente óptimo para su desarrollo, se multiplican con tiempos de duplicación muy breves que, en la mayor parte de los casos, son del orden de pocos minutos. Se comprende pues, que, en estos casos, el número de microorganismos puede alcanzar al cabo de pocas horas valores numéricos extremadamente elevados, incluso del orden de varios millares (tabla 1).

Tabla 1. Multiplicación de bacterias en leche (a temperatura ambiente)

Horas de almacenamiento Cuenta bacteriana por mi

0 137.00024 24.674.00048 639.885.00072 2.407.083.00096 5.346.667.000

La reproducción microbiana no se produce de forma indefinida, una vez se alcanza un limite determinado, como puede ser el agotamiento de los factores nutritivos disponibles, la mortalidad supera al número de células que se repro­ducen, por lo que se aprecia una reducción de las mismas.

La curva de crecimiento de un cultivo microbiano se puede subdividir en varias fases, como se puede apreciar en la gráfica 1:

• Fase lag: en esta fase el número de microorganismos permanece cons­tante, o incluso puede disminuir, como consecuencia de la adaptación delos microorganismos al medio. Corresponde al tramo AB de la curva.

• Fase estacionaria de crecimiento: una vez superada la fase anterior, deadaptación de los microorganismos al medio, comienzan su multiplica­ción lentamente, con tiempos de duplicación notablemente largos.Corresponde al tramo BC de la curva.

• Fase logarítmica: en este periodo los microorganismos se multiplicanactivamente y su número aumenta en progresión geométrica. Los tiem­pos de duplicación son muy breves. Corresponde al tramo CD de lacurva.

• Fase de crecimiento negativo: el número de microorganismos continúaaumentando pero con un ritmo mucho menor, los tiempos de duplicaciónson más largos, es el tramo DE de la curva.

• Fase estacionaria: en esta fase se establece un equilibrio entre la repro­ducción y la muerte de los microorganismos, por lo que su número per-

Gráfica 1.-Curva de crecimiento microbiano.

manece prácticamente constante. Corresponde esta fase al tramo EF de la curva.

• Fase ele muerte acelerada: el número de gérmenes que mueren supera alde los que se reproducen, en consecuencia disminuye el número demicroorganismos. Corresponde al tramo FG.

• Fase de muerte o fase de declive: durante la cual el número de célulasque mueren es mayor que el de las que se forman. Tramo GH de lacurva.

• Fase de supervivencia : durante el cual no existe división celular,las células que sobreviven lo hacen a expensas de nutrientes endó­genos.

A partir de la curva de crecimiento se puede calcular el tiempo de gene­ración de los microorganismos, es decir, el tiempo que transcurre entre la formación de una célula hija y su división para dar dos nuevas células. Para calcular los tiempos de duplicación de los diferentes microorganismos es suficiente con establecer el número de duplicaciones que se producen durante un intervalo de tiempo determinado, es lógico que los tiempos de duplicación que interesan fundamentalmente son los que tienen lugar durante la fase logarítmica. El número de generaciones se calcula con la ecuación siguiente:w

76 Procesos cle conservación de alimentos

log a - log b

donde:n = numero de generacioneslog a - logaritmo del número de microorganismos al final de la fase logaritmicalog b = logaritmo del número de microorganismos al inicio de la fase logaritmica

de aquí:log 2

log a - log b

donde t = tiempo.El tiempo de generación más corto se da en la fase de crecimiento logarít­

mico, y su duración dependerá de las condiciones existentes en el medio mien­tras se están multiplicando los microorganismos, es decir, del tipo de alimento, de su pH, de la temperatura, del potencial de oxido-reducción, de la humedad disponible, etc.

2. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL DESARROLLOMICROBIANO

A continuación se exponen los diferentes factores que condicionan, deforma favorable o desfavorable, a la causa biológica más importante de la degradación de los alimentos: los microorganismos.

Los principales factores de la composición de todo alimento que influyen en la actividad microbiana son: el pH, la humedad, el potencial de oxido- reducción y la presencia de sustancias inhibidoras, a los que hay que añadir la temperatura a la que se encuentre el alimento.

2.1. INCIDENCIA DEL PH

La acción del pH sobre el crecimiento de los microorganismos tiene lugar a tres niveles: el medio, puesto que la disponibilidad de ciertos nutrientes en el medio de cultivo sufre modificaciones en función del equilibrio iónico, la per­meabilidad de la membrana, que se ve afectada por las variaciones en la con­centración de iones H+ y OH- y la actividad metabòlica, las reacciones enzimá- ticas presentan un óptimo de actividad por encima o por debajo del cual su cinética sufre cambios, por lo tanto toda variación del pH citoplasmàtico implica una disminución de la actividad enzimàtica y, en consecuencia, del crecimiento del microorganismo.

Métodos industriales de conservación de alimentos 77

Cada microorganismo tiene por tanto un pH mínimo, un pH óptimo y un pH máximo de crecimiento. En la tabla 2 se indican los rangos de pH y los valores óptimos para el crecimiento de algunos microorganismos.

En general, las levaduras y los mohos toleran mejor la acidez que las bacterias. Dentro de las bacterias patógenas, los microorganismos de los géneros Vibrio y Clostridium son más sensibles a variaciones de pH que la mayor parte de las demás bacterias, mientras que Escherichia coli. Salmone­lla y Staphylococcus aureus son las más resistentes, este último aunque resiste un pH de 4,2 sufre una fuerte reducción de su crecimiento. El pH más bajo al que es capaz de crecer Clostridium botulinum es 4,8 para los tipos A y B y de 5,7 para el E. el más bajo para que pueda producirse toxina es tam­bién de 4,8.

Tabla 2. Límites de pH para el crecimiento de algunos microorganismos (Jay, 1986)

Mínimo Óptimo Máximo

Mohos 1.5-3,5 4,5-6,8 8.0-11.0Levaduras 1,5-3,5 5-6.5 8.0-8.5Bacterias 4.5 6,5-7,5 11.0Bacterias acéticas 4.0 5.4-6,3 9,2Bacterias lácticas 3.2 5.5-6.S 10.5L. plantarían 3,5 5,5-6,5 8,0Leu. cremoris 5.0 5.5-6.0 6.5S. lactis 4.1-4,8 6,4 9,2L. acidophilus 4.0-4.6 5.5-6.0 7,0Pseudomonas 5.6 6.6-7.0 8.0P. aeruginosa 4.4-4,5 6.6-7.0 8.0-9.0Enterobacterias 5.6 6.5-7.5 9.0S. typhi 4.0-4.5 6.5-12 8.0-9.6E. coli 4.3 6.0-8.0 9,0Staphylococcus 4,2 6.8-7,5 9,3Clostridium 4.6-5,0 9,0Cl. botulinum 4.8 8.2Cl. perfringens 5,5 6.0-7,6 8.5Cl. sporogenes 5.0-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0Bacillus 5.0-6.0 Ó.8-7.5 9.4-10,0

Los alimentos cuyo pH es bajo (valores inferiores a 4,5) no son alterados fácilmente por las bacterias, siendo más sensibles a la alteración por levaduras y mohos.

El pH de los alimentos depende no sólo de la cantidad de sustancias áci- das y básicas que contenga, sino también de la capacidad tampón del pro­ducto, que generalmente está asociada a la concentración de proteínas, por esta razón, en las frutas y hortalizas la adición de sustancias ácidas, de origen

78 Procesos de conservación de alimentos

fermentativo o no. produce variaciones importantes de pH. debido a su baja capacidad tampón.

En la tabla 3 se recoge el pH de los principales alimentos.El pH del músculo se encuentra próximo a la neutralidad, la paralización

de la circulación sanguínea y el consumo del oxígeno residual hacen que se produzca una fermentación láctica del glucógeno por enzimas endógenas, con lo cual se produce una bajada de pH, variable según las especies, los músculos y las cantidades de glucógeno presentes, que a su vez están en función del estado de reposo, del estrés y del estado de salud del animal.

Tabla 3. pH aproximado de algunos alimentos

Alimentos pH Alimentos PH

Came de vacuno 5,3-6,2 Zanahorias 5,2-6.0Carne de cerdo 5.J-6.4 Patatas 5,4-6,2Carne de pollo 5,8-6,4 Cebollas 5.3-5.8Pescado 6.5-6.8 Tomates 4,2-4,9Salmón 6.1-6,3 Guisantes 5,6-6.5Sardinas 5,7-6,6 Pimientos 4,7-5,2Camarones 6.8-7.0 Piña 3,2-4,0Atún 5.9-6.1 Espinacas 5,1-5,8Leche 6.3-6,5 Manzanas 2.9-3,3Mantequilla 6,1-6.4 Naranjas 3,6-4,3Queso parmesano 5,2-5.3 Judías verdes 4,9-5,5Queso Roquefort 4,7-4,8 Champiñones 6.0-6.5Pan 5.0-6.0 Melocotones 3,4-4.2Ostras 6,3-6,7 Uvas 3,4-4.5Pato 5.0-5.7 Limones 2,2-2.4

El pH del pescado, en general, es más alto que el de la carne, lo cual se debe, en parte, al agotamiento de reservas durante la captura. Existen diferen­cias importantes en el pH final según el tipo de pescado, la pescadilla por ejemplo tiene el pH más alto que el del rodaballo, este último tiene el pH más bajo que se conoce y evidentemente presenta un mayor poder de conservación. El pH de los crustáceos es, por lo general, más elevado que el de los pescados, de 6,8 a 7,4 en el centollo y de 7,1 a 8,2 en las gambas.

La clara de los huevos presenta un pH alcalino (7,6) pero puede llegar hasta 9 cuando los huevos se almacenan al aire, debido a las pérdidas de C 0 2, lo cual limita el crecimiento de microorganismos, la yema tiene un pH menor: de 6 a 6,3.

Las frutas en general, como se aprecia en la tabla 3, presentan un pH muy bajo en comparación con otros alimentos, razón por la cual sus alteraciones se deben a mohos principalmente. Las hortalizas presentan un pH algo más alto, lo que permite ya el desarrollo bacteriano.

Métodos industriales de conservación de alimentos 79

2.2. NECESIDADES DE AGUA

Los microorganismos necesitan agua para su crecimiento, que utilizan de dos formas, como solvente de nutrientes para permitir su transporte y disponi­bilidad en el citoplasma, y como agente químico que interviene en las reaccio­nes hidrolíticas que dan lugar a monómeros, necesarios para la síntesis micro­biana, y para las reacciones energéticas.

La “actividad de agua“ ( a j indica la disponibilidad de agua, de un medio determinado, para las reacciones químicas, bioquímicas y para las transferen­cias a través de membranas semipermeables. Su valor oscila entre 0 y 1. Se define como la relación entre la presión de vapor del agua en la disolución (p) y la presión de vapor del agua pura (p0) a la misma temperatura:

P

La humedad relativa (HR) del ambiente, en un medio cerrado, está relacio­nada con la aw de un producto: a v = HR/100.

Toda disminución de la aw afecta al crecimiento bacteriano, la mayor parte de las bacterias presentan un crecimiento óptimo alrededor de 0,990-0,995. En alimentos con aw baja (0,61-0,85) las alteraciones microbianas más frecuentes son producidas por mohos. En la tabla 4 se indican los valores mínimos nece­sarios de aw para el crecimiento de diversos microorganismos.

La disminución de la actividad de agua lleva consigo un fenómeno de plas- mólisis de la célula, Staphylococcus aureus por ejemplo, pierde un 50 % de su agua intracelular cuando la aw pasa de 0,995 a 0,950, esto disminuye o paraliza el crecimiento de los microorganismos como consecuencia de la inhibición de las actividades enzimáticas.

Existen algunos factores que influyen sobre las necesidades de aw de los microorganismos:

• El tipo de soluto utilizado para reducir la aw, para algunos microorganis­mos, sobre todo los mohos, la actividad aw mínima de crecimiento esprácticamente independiente del tipo de soluto utilizado. Otros microor­ganismos en cambio tienen valores de a,, limitantes del crecimientoo v»según el soluto utilizado. El cloruro potásico, por ejemplo, suele sermenos tóxico que el cloruro sódico y éste tiene, a su vez, menor poderinhibidor que el sulfato sódico.

• En general, cuanto más apropiado sea el medio de cultivo para el desa­rrollo de los microorganismos, tanto menor es el valor de la aw limitante.

• A temperaturas próximas a la temperatura óptima de crecimiento, lamayoría de los microorganismos tienen una tolerancia máxima a losvalores bajos de la aw.

• Cuando en el medio existe aire, la multiplicación de los microorganis­mos aerobios se produce a valores más bajos de au que cuando no existeaire, cuando se trata de microorganismos anaerobios ocurre, lógica­mente, lo contrallo.

• A valores de pH próximos a la neutralidad, la mayoría de los microorga­nismos son más tolerantes a au baja que cuando se encuentran en mediosácidos o básicos.

• La presencia de sustancias inhibidoras reduce el intervalo de valores deaw que permite la multiplicación de los microorganismos.

80 Procesos de conservación de alimentos

Tabla 4. Valores mínimos de aw para el crecimiento de algunos microorganismos(Bourgeois, 1996)

BACTERIAS >0.910 LEVADURAS >0,87Acinetobacter 0.990 5. cerevisiae 0.90-0.94C. botulinum E. 0.979 Rhodotorula 0.90C. perfringens 0.970 Levaduras osmofílicas 0,62P. fluorescens 0,970E. coli 0.957 MOHOS >0.70Salmonella sp. 0.950 Botrytis cinerea 0.93C. botulinum A, B 0.950 Fusarium 0.90B. subtilus 0.900 Mucor 0.80-0.90S. aureus 0,860 A. clavatus 0.85Bacterias halófilas 0.750 P. expansión 0.85

A. flavus 0.78Mohos xerófílos 0.70

En los alimentos una aw inferior a 0,7 se considera el límite inferior que presenta todas las garantías de estabilidad, sin embargo 0.91 es una cifra que sólo indica que por debajo de ella los microorganismos están fuertemente fre­nados; este es el límite propuesto por la directiva comunitaria de 1977 para la conservación de los alimentos a temperatura ambiente, este límite puede ele­varse incluso a 0,95 con la condición de que vaya acompañado por un pH igual o inferior a 5,2.

La mayoría de los productos frescos, como las frutas, hortalizas, carne, leche y pescados tienen una aw de 0.970 a 0.996. En la tabla 5 se indican los valores medios de los principales productos frescos.

Todos estos productos son por tanto favorables para el crecimiento bacte­riano, salvo las frutas en las que se desarrolla una flora fúngica, debido a los valores bajos de pH y a que la aw es algo más baja que en los demás productos frescos, por su contenido en azúcares solubles.

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Tabla 5. Valores aproximados de a.v de algunos alimentos (Bourgeois, 1996)

Alimento a„ Alimento a*Carne de vacuno Carne de cerdo PescadoProductos de charcuteríaLecheAlcachofasZanahoriasPepinosSetasPatatas

0.990-0.9800.990

0.994-0.9900.950-0.850

0.9950.987-0.9760.9S9-0.9S30.998-0.9920.995-0.989

0.985

TomatesManzanasCerezasUvasLimonesMelonesNaranjasMelocotonesConfiturasCereales

0,9910,9800.977

0.986-0.9630.984

0,991-0.9880.9880,985

0.800-0.7500.700

2.3. POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

El potencial de óxido-reducción, o poder oxidante y reductor, del propio alimento, influye en el tipo de microorganismo que se desarrollará en él y, pol­lo tanto, en las modificaciones que se producirán.

En función de sus exigencias en oxígeno y/o en su toxicidad, los microor­ganismos se clasifican en:

• aerobios estrictos {Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus) cuando necesi­tan oxígeno libre, es decir necesitan oxígeno como aceptor final de elec­trones, no tienen la posibilidad de utilizar una vía fermentativa.

• anaerobios estrictos {Clostridium. Bacteroides, Peptococcus, Prionibac- teriwn, etc.) cuando crecen mejor en ausencia de oxígeno libre, presen­tan obligatoriamente un metabolismo fermentativo.

• aerobios facultativos (Enterobacterias, Staphylococcus), que puedendesarrollarse en presencia o ausencia de oxígeno.

La disminución del contenido de oxígeno en la atmósfera tiene como con­secuencia la ralentización de la respiración. El efecto sobre la actividad respi­ratoria es particularmente marcado por debajo de 8 a 10% de oxígeno (gráfica 2), una hipoxia excesiva implica evidentemente un metabolismo fermentario. La disminución de la concentración de oxígeno aumenta por tanto la vida útil de los productos, siempre que se elija convenientemente.

2.4. SUSTANCIAS INHIBIDORAS

Son moléculas que poseen un poder bacteriostático y/o bactericida, algu­nas pueden ser específicamente inhibidoras de mohos. Existe una amplia gama de sustancias, que desarrollan una acción inhibidora, tanto por su composición química como por los mecanismos de actuación. Se encuentran en estado natu­ral en los tejidos animales y vegetales y se pueden producir también por fer-

82 Procesos de conservación de alimentos

Oxígeno (%)

Gráfica 2-Variación de la intensidad respiratoria de un órgano vegetal en función del contenido de oxígeno en la atmósfera (IRX: intensidad respiratoria en la atmósfera considerada

(x % de oxígeno); IRa¡K : intensidad respiratoria en el aire).

mentación. Pueden ser, además, añadidas por el hombre para la conservación de los alimentos.

2.5. TEMPERATURA

Es uno de los factores más importantes por su influencia en el crecimiento de los microorganismos, determina el estado físico del agua en un determinado medio y, por tanto, su mayor o menor disponibilidad para el crecimiento de los microorganismos, la temperatura actúa, además, sobre la velocidad de las reac­ciones químicas y bioquímicas.

Los microorganismos se clasifican en tres grandes grupos en función de la temperatura:

• psicrótrofos y psicrófilos: Los psicrófilos son gérmenes adaptados alfrío, se desarrollan a 0°C con un óptimo de crecimiento comprendidoentre 15 y 20°C. Los psicrótrofos son capaces de adaptarse y desarro­llarse a temperaturas próximas a 0°C, pero tienen un óptimo de creci­miento entre 25 y 35°C, lo que les aproxima a los mesofilos. Su metabo­lismo es lento y son poco competitivos con otros cuando aumenta latemperatura. Esta característica velocidad de crecimiento lenta hace que

Métodos industriales de conservación de alimentos 83

la invasión de los alimentos dure de una a tres semanas, con un tiempo de generación del orden de 24 horas a 0 °C. Los psierólrofos son los microorganismos dominantes en todos los alimentos refrigerados. Inclu­yen numerosas especies, cuyos principales géneros son: Pseudomonas, Erwinia, Corynebacterium, Lactobacillus, etc. La mayor parte de las levaduras y de los mohos son psierólrofos. Estos microorganismos rara­mente son patógenos.

• mesofilos: se multiplican a temperaturas entre +20 y +45°C, con unóptimo decrecimiento a 37°C. sus tasas de crecimiento son elevadas y laduración de su proliferación por tanto, es relativamente corta. Las princi­pales especies de bacterias se incluyen en este grupo. Se pueden encon­trar en alimentos almacenados a temperatura ambiente o en alimentosrefrigerados cuando se ha roto la cadena del frío.

• termófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas elevadas, entre45 y 65°C, con un óptimo a 55°C. Presentan una tasa de crecimientomuy elevada pero con una duración corta. Pueden encontrarse en elagua, aire y suelo. En este grupo se incluyen sobre todo los géneros deBacillus y Clostridium y los mohos Aspergillus , Cladosporium yThamnidium.

El descenso de la temperatura tiene como efecto esencial la reducción glo­bal de la actividad metabòlica de los órganos vegetales y animales. Este efecto del frío se traduce en una menor degradación de las reservas y en una menor producción de calor, por lo tanto aumentará la longevidad de los productos. En la gráfica 3 se muestra que la duración teórica de la conservación se incre­menta mucho con la disminución de la temperatura, se trata de una curva teó­rica pues sólo es válida para productos no sensibles al frío.

3. PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS EN LACONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

En la conservación de los alimentos, tiene una gran importancia el prolon­gar cuanto sea posible las dos primeras fases que se han descrito anteriormente del crecimiento microbiano: la fase lag y la fase estacionaria de crecimiento (gráfica 1). es decir los tramos AB y BC. Esto se puede conseguir de diferentes formas:

1. Aportando el menor número posible de microorganismos, es decir,reduciendo el grado de contaminación; cuanto menor es el número demicroorganismos, tanto más se prolonga la fase lag.

2. Evitando la incorporación de microorganismos en fase de crecimientoactivo (es decir procedentes de la fase de crecim iento logarítm ico).Estos microorganismos pueden estar creciendo en los equipos, recipien­tes, utensilios, etc. que entran en contacto con los alimentos.

84 Procesos de conservación de alimentos

3. Por medio de uno o más factores adversos del medio: nutrientes, hume­dad. temperatura y potencial óxido-reducción adversos, o existencia desustancias inhibidoras. Cuanto más adversas sean las condiciones delmedio, tanto más se retardará la iniciación de la multiplicación micro­biana.

4. Por medio de daño real a los microorganismos con distintos sistemasde tratamiento, como por ejemplo los tratamientos térmicos.

Tem peratura °C

Gráfica 3.-Variación de la duración de la conservación de un producto en función de latemperatura.

La descomposición microbiana de los alimentos se evitará si se destruyen, o se eliminan, todos los microorganismos que producen alteraciones y se evitaque se vuelvan a contaminar. Ahora bien, como se ha visto en el Capítulo anterior, los microorganismos son la principal causa del deterioro de los ali­mentos pero no la única, por lo tanto el hecho de detener la multiplicación de los microorganismos no necesariamente evita su descomposición. Algunos de los procedimientos utilizados para regular la actividad de los microorganis­mos son eficaces también tanto frente a la actividad enzimàtica existente en el alimento como frente a las reacciones químicas. Pero otros procedimientos como la desecación o el empleo de temperaturas bajas, permiten que continúe

Métodos industriales de conservación de alimentos 85

la descomposición natural del alimento si no se adoptan precauciones espe­ciales, la mayoría de las hortalizas, por ejemplo, se escaldan antes de la con­gelación con el fin de inaetivar las enzimas, lo mismo ocurre en el caso de la deshidratación.

Por lo tanto en los procedimientos de conservación de los alimentos se deberá:

• Prevenir o retrasar la actividad microbiana• Prevenir o retardar la descomposición de los alimentos: destruyendo o

inactivando sus enzimas, por ejemplo por medio del escaldado y previ­niendo o retardando las reacciones puramente químicas, por ejemplo,impidiendo la oxidación utilizando un antioxidante.

• Prevenir las lesiones debidas a insectos, roedores, causas mecánicas,etcétera.

Los procedimientos utilizados para la conservación de alimentos se diri­gen fundamentalmente al control de los microorganismos, por lo tanto se basan en la intervención sobre los factores que afectan a su actividad, y que se acaban de describir: pH. necesidad de agua, potencial de óxido-reduc­ción. sustancias inhibidoras y temperatura. Pero en todos los casos hay que tener en cuenta que cuando en el alimento existe un número inicial de microorganismos reducido, su conservación por cualquiera de los procedi­mientos que a continuación se indican, es más fácil que cuando su número inicial es elevado, de ahí la importancia que. en la conservación de los ali­mentos, presenta la reducción de la contaminación y la aplicación de buenas prácticas de fabricación: la implantación del sistema Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (A.P.P.C.C.), al que se hizo referencia en el Capítulo anterior, contribuye de forma importante al control de los microor­ganismos.

3.1. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA DISMINUCIÓN DEL pH

Algunos procedimientos de conservación de alimentos se basan en la inter­vención sobre el pH del medio. Anteriormente se ha tratado la sensibilidad de los diferentes microorganismos a pH bajos, a la acidez. En los métodos indus­triales de conservación esta reducción del pH se puede conseguir de dos for­mas: por adición de ácido al alimento (acidificación artificial) o por acidifica­ción natural (fermentación láctica, por ejemplo), unos microorganismos son mucho más sensibles que otros y el ácido producido por un tipo de microorga­nismo durante la fermentación inhibe la proliferación de otro tipo, este es uno de los principios en que se basa la fermentación bajo control como medio de conservación de los alimentos, ejemplos de este tipo de conservación son el yogur, los encurtidos, etc.

86 Procesos de conservación de alimentos

3.2. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA REDUCCIÓN DEL AGUA DISPONIBLE

Los microorganismos necesitan agua para su desarrollo, como se ha visto anteriormente, así pues si se elimina agua del alimento se detendrá su multipli­cación. Los alimentos con mayor humedad son más perecederos, tienen menos vida útil, por ejemplo un queso fresco se conserva menos tiempo que un queso curado, de menor humedad.

Varios métodos de conservación de alimentos que se aplican industrial­mente se basan en este principio, la reducción del agua disponible para los microorganismos. Según la cantidad de agua residual disponible y la forma de disminución de la disponibilidad de la misma tendremos diferentes métodos de conservación. La reducción del agua disponible se puede conseguir por medios físicos: deshidratación y concentración por evaporación, por ejemplo, leche en polvo y zumos concentrados, respectivamente, o por medios químicos, adi­ción de solutos, por ejemplo azúcar o sal, como se ha dicho, los microorganis­mos poseen agua en el interior de sus células, por lo tanto si se introducen en un almíbar o en una salmuera, el agua de sus células tiende a salir a través de su membrana, por un proceso de osmosis, tendiendo a igualar la concentración interior y exterior de la célula, causando así una deshidratación parcial de la misma, que obstaculiza su multiplicación. Se tiene así otros métodos industria­les de conservación: con adición de azúcar o con adición de sal, ejemplos de estos tipos de conservación son frutas en almíbar, mermeladas, leche conden- sada, etc. y salazones, respectivamente.

3.3. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA VARIACIÓN DEL POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUCCIÓN

Algunos microorganismos, como se ha dicho, necesitan aire, oxígeno, para su desarrollo, por lo tanto una forma de conservar los alimentos, preservándo­los del desarrollo de este tipo de microorganismos, será ponerlos íúera del con­tacto del aire, por ejemplo envasándolos en atmósferas pobres en oxígeno, lo cual se consigue por medios físicos y da lugar a otros métodos industriales de conservación: vacío, gases inertes y atmósferas controladas.

3.4. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS

La presencia de sustancias inhibidoras también afecta evidentemente al desa­rrollo de los microorganismos, por lo tanto también existen métodos de conserva­ción basados en este principio: utilización de conservantes o de antisépticos, como el alcohol. O el caso del ahumado, que se basa en el hecho de que el humo contiene sustancias químicas inhibidoras procedentes de la quema de la madera, que acompañado del calor desprendido contribuyen a la conservación de los ali­

Métodos industriales de conservación de alimentos 87

mentos. Este procedimiento se ha aplicado a carnes y pescados fundamental­mente. Hoy día en muchos casos se ahúma el alimento sólo para darle sabor, sin el calor de la combustión, con lo cual contribuye poco a la conservación.

3.5. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA UTILIZACIÓN DE CALOR O FRÍO

También se han descrito los rangos de temperatura óptimos para los dife­rentes tipos de microorganismos, así como las temperaturas necesarias para su destrucción o inactivación. Basándose en estos principios se han desarrollado a su vez métodos industriales de conservación de alimentos, unos por medio de la utilización de altas temperaturas y otros por el uso de temperaturas bajas. Los métodos industriales basados en la aplicación de calor son: pasteuriza­ción y esterilización, la diferencia principal entre ellos es la intensidad del tra­tamiento y lógicamente la vida útil del producto final. Los métodos basados en la aplicación de frío: son refrigeración y congelación, que también difieren en la intensidad del tratamiento y en la vida útil posterior.

3.6. PROCEDIM IENTOS BASADOS EN LA APLICACIÓN DE VARIOS PRINCIPIOS

Existe la posibilidad de utilizar métodos de conservación basados en más de uno de los principios citados, con lo cual se mejorarán las posibilidades de con­servación incrementando la vida útil, o bien se podrá reducir la intensidad del tratamiento, permitiendo mantener las cualidades organolépticas del producto.

Por ejemplo, la presencia de ácido en los alimentos acentúa el efecto del calor sobre los microorganismos, por esta razón en los alimentos de pH bajo, o que se hayan acidificado, o en los que se haya producido una fermentación lác­tica, normalmente se emplean tratamientos de pasteurización. A los productos concentrados por evaporación se aplica después también una pasteurización. O bien el caso de la leche condensada, conservada por la adición de azúcar se realiza también una concentración por evaporación.

La utilización de atmósferas controladas, lleva consigo el mantenimiento del producto en refrigeración. Los productos pasteurizados, a su vez, requieren también de una refrigeración.

4. MÉTODOS INDUSTRIALES DE CONSERVACIÓN DEALIMENTOS

En la tabla 6 se incluye la clasificación de los principales métodosindustriales de conservación de alimentos según su efecto sobre los micro­organismos.

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Tabla 6. Clasificación de los métodos de conservación de alimentos según su efecto sobrelos microorganismos

Acción sobre los microorganismos Forma de actuación Método de conservación

de alimentos

DESTRUCCIÓN Por acción del calor PasteurizaciónEsterilización

Por radiaciones ionizantes Irradiación

Por acción de antisépticos

Alcohol

ÁcidosConservadores químicos

Por acción mecánica Altas presiones

Por acción mixta: calor- mecánica

Cocción-extrusión

EFECTO BARRERA Por utilización de bajas temperaturas

RefrigeraciónCongelación

Por utilización de atmósferas pobres en 0-,

VacíoGases inertes Atmósferas controladas

Por reducción del contenido de agua

DeshidrataciónLiofilizaciónConcentración

Protección por incorporación y recubrimiento con inhibidores

SalazónInmersión en salmuera Recubrimientos con materias grasas (confits...) Recubrimientos con azúcar (frutas) escarchadas)Inmersión en ácidos (vinagre)Fermentación (auto- inhibición)

ELIMINACIÓN Por separación física Filtración esterilizante Ultrafiltración