Células T genéticamente modificadas en la terapia del cáncer: oportunidades y retos Michaela Sharpe y Natalie mount

Resumen Los tumores usan muchas estrategias para evadir la respuesta inmune del hospedador, incluyendo la regulación negativa o una inmunogenicidad débil de los antígenos blancos y la creación de un ambiente inmunitario supresor de tumores. Las células T juegan un papel fundamental en la inmunicidad mediada por células. Recientemente, ciertas estrategias para modificar genéticamente células T ya sea por la alteración de la especificidad del receptor de células T (TCR) o introduciendo

reconocimiento similar a anticuerpos en receptores de antígenos quiméricos (CARs), han proporcionado avances substanciales. El potencial de estas investigaciones se ha demostrado, en particular, por exitoso uso de células T modificadas para tratar células B hematológicamente malignas en pruebas clínicas. Este avance clínico se refleja en el creciente numero de alanzas estratégicas en esta área que ha atraído un alto numero de inversiones e involucra grandes organismos farmacéuticos. Aunque nuestro entendimiento de los factores que influencian la seguridad y eficacia de estas terapias ha aumentado, aun quedan obstáculos antes de llevar la inmunoterapia con células t modificadas genéticamente a pacientes con diferentes tipos de tumores. Estos obstáculos van desde la selección del antígeno blanco hasta lidiar con los problemas de regulación y seguridad para seguir las rutas comerciales. Sin embargo, la alentadora información clínica, el progreso en el entendimiento de la inmunología tumoral y las mejoras en la manufactura de los productos celulares están ayudando al avance clínico de estas inmunoterapias celulares. Palabras clave: Inmunoterapias, modificación génica, TCR,CAR, células T, oncología, eficacia, seguridad, regulación, manufactura, pruebas clínicas.

Introducción El sistema inmune se divide en dos: el innato y el adaptativo (fig. 1). Mediante la vigilancia inmunitaria, cualquier molécula que sea identificada como extraña será eliminada. Los blancos incluyen no solo células virales infectas , sino también células transformadas (tumores) que pueden adquirir inmunogenicidad mediante la expresión de neoantígenos que pueden ser reconocidos como extraños. Sin embargo, las células cancerígenas han desarrollado estrategias para escapar y suprimir el sistema inmune (Pizon.Charry et al.; 2005; Blankenstein et al., 2012), que resultan en un fallo para iniciar y mantener adecuada actividad antitumoral, y consecuentemente facilita la supervivencia del tumor y su

progresion. Las estrategias incluyen tumores antigenicos que son debilmente inmunogenicos. Alternativamente, el tumor puede regular negativamente o modular la expresión de antígenos, así evadiendo su detección por células inmunes. Adicionalmente, los tumores pueden suprimir la respuesta inmune a través de la síntesis de va rios supresores inmunológicos que tienen roles en mantener la auto-tolerancia, o que inhiben la función de células inmunes efectoras. La supresión inmune por los tumores afecta todas

las ramas del sistema inmune y puede resultar en el escape de tumores del sistema inmune. Al avanzar nuestro entendimiento del sistema inmune, números crecientes de terapias innovadoras están siendo desarrolladas que utilizan células del sistema inmune optimizan su respuesta a enfermedades a través de modificación genética. Esto es particularmente cierto en el campo de la medicina para el cáncer. Al aprovechar o incrementar la función de células inmunes específicas, existe la posibilidad de aumentar la respuesta inmune para lograr una regresión duradera del cáncer. En los últimos 20 años, terapias con células inmunes contra el cáncer, basadas en la manipulación e infusión de células inmunes autólogas (del mismo individuo) o allogénicas (de otro individuo) al paciente, han sido ampliamente probadas en ensayos clínicos. Esto incluye terapias con células NK, dendríticas y células T modificadas. Dado el potencial de creciente importancia como tratamiento contra ciertas formas de cáncer y se éxito clínico, centramos esta revisión en el desarrollo de estrategias de tratamiento que utilizan inmunoterapias con células T genéticamente modificadas. Los avances en nuestro conocimiento de la inmunología del cáncer, las mejoras en la producción de productos para inmunoterapias y la habilidad de seleccionar pacientes cuyos tumores expresan antígenos específicos están mejorando los desenlaces clínicos de inmunoterapias con células T genéticamente modificadas. Sin embargo, todavía quedan desafíos en este campo emergente relacionados a eficiencia, seguridad, y producción de estas terapias, así como su regulación. Células T y el rol del receptor de células T Las células T (también llamadas linfocitos T) se encuentran ampliamente distribuidas entre tejidos y el ambiente del

tumor. Juegan un rol centran en la inmunidad mediada por células y pueden mediar respuestas de memoria efectoras e inmunes de larga vida especificas a antígenos. Las células T se diferencian de otros linfocitos por la presencia de TCRs en su superficie celular. El TCR es un complejo transmembrana de múltiples subunidades que media la activación específica a antígenos de células T. Está compuesto de 2 cadenas polipeptídicas diferentes, cadenas α y β del TCR. Ambas cadenas tienen una región N-terminal variable y una región constante. Las cadenas están unidas por un enlace disulfuro, con cada receptor proveyendo un solo sitio de unión a antígenos. El TCR confiere especificidad antigénica a la célula T, al reconocer un ligando antigénico compuesto por una cadena corta de una secuencia de amino-ácidos de una proteína presentada en la célula blanco por un complejo MHC (Box 1, Fig. 2B). Moleculas accesorias de adhesión expresadas por células T, tales como CD4 para MHC clase II y CD8 para MHC clase I, también están involucradas. El TCR interactua con su ligando al tomar contacto con tanto la molecula de MHC como el péptido antigénico. Se piensa que la transducción de señal esta asociada al complejo invariante CD3, que esta compuesto de cuatro proteínas diferentes CD3 que forman dos heterodimeros (CD3δε y CD3γε) y un homodimero (CD3ζζ) (Fig. 2A). Luego del contacto con sus péptidos cognados (cognate es la palabra en ingles) presentados por moléculas de MHC clase I, las células T citotóxicas CD8+ naive proliferan vigorosamente y adquieren propiedades fenotípicas y funcionales permitiéndoles actuar como células T efectoras (Box 1); esto elimina células expresando el antígeno a través de Ligandos inductores de apoptosis o liberación de granulos líticos.

Fig. 1. Células del sistema in mune ad aptativo e innato. El sistema in mune innato proporciona una respuesta in mediata a objetivos extraños, con respuestas

normalmente en cu estión de minutos a horas. Se compone d e una serie de factores solubles y proteínas, así como un conjunto diverso de células, incluyendo granulocitos, macrófagos, células d endrític as y células asesinas n aturales. La

segunda rama d el sistema inmun e es el sistema inmune ad aptativo o adquirido, que proporcion a respuestas inmunes espec íficas d e larga duración. El sistema

inmune ad aptativo e inn ato están v inculados; por ejemplo, las células d endríticas son importantes act ivadores d e c élulas sistema inmun e adaptativo. El sistema inmune adaptativo consiste de ant icuerpos, c élulas B y las células T CD4 + y CD8 +,

y estos p ermiten una respuesta altamente específic a contra un objet ivo particular. Las células T n atural killer y las células T gamma d elta son linfocitos citotóxicos que

se superponen tanto en la inmunid ad innata y ad aptat iva. Las c élulas de ambos brazos del sistema inmun e se encu entran en desarrol lo como posibles inmunoterapias celulares.

Ademas, las células T de memoria de larga vida (Box 1)

que pueden autorenovarse son generadas, permitiendo rápida expansión en presencia de objetivos antigénicos y proveyendo de una respuesta sostenida y durable ante una re exposición. La función de las células T como orquestantes y efectores de la respuesta

inmune adaptativa es di rigida por la especificidad del TCR.

Tolerancia central y periférica Aunque los antigenos tumorales tienen el potencial de

ser inmunogenicos , ya que los tumores se originan de las células propias de un individuo y solo proteínas mutadas o proteínas con procesamientos

traduccionales al terados serán reconocidas como extrañas por el sis tema inmune. Los antigenos que son sobre regulados o sobre expresados (llamados auto

antigenos) no necesariamente inducirán una respuesta inmune funcional contra el tumor. Las células T expresando TCRs que son altamente reactivos contra estos antigenos tendrán que ser negativamente seleccionadas dentro del timo en un proceso

denominado tolerancia central (Box 1), resultando en que solo células T con TCRs de baja afinidad para los autoantigenos se mantengan. El ambiente tumoral también juega un rol vi tal en la respuesta inmune. Para que una celula T sea activada, señales coestimulatorias originadas típicamente por células presentadoras de antigenos (como células

dendríticas, Box 1) son requeridas . Sin embargo, las células tumorales podrían estimular insuficientemente a las células presentadoras de antigenos , resultado en

expresión inadecuada de moléculas peptídicas de MHC clase I y II , moléculas coestimulatorias y producción de

ci tosinas. Las células presentadoras de antigenos por tanto no pueden relacionarse completamente con la celula T. Esto lleva a activación, proliferación y

expansión no optima de células T, resultando en anergia (tolerancia peri férica, Box 1). Ademas , evidencia creciente sugiere que otro tipo célul r, las células T reguladoras , tienen un rol principal en la supresión de la actividad de células T específicas de

tumor y son una barrera importante a respuestas inmunes contra tumores que llevan a establecer un estado de inmunosupresión. El resultado final es un

crecimiento en la supervivencia tumoral ; el objetivo de las terapias basadas en células inmunes es devolverle el

poder al sistema inmune.

Células T genéticamente modificadas en inmunoterapia de cáncer El concepto de transferencia de células T a pacientes (transferencia de células T adoptivas) para tratar

enfermedades ha sido establecida durante muchos años a través de la manipulación ex vivo, expansión y reinfusión de células T que tienen como objetivo vi rus

específicos, por ejemplo para tratar infecciones virales por ci tomegalovirus o vi rus Epstein Barr, seguida por el

trasplante de células madre hematopoyéticas. Como se describe arriba, exis ten raras poblaciones de células T antígeno específicas de tumor y pueden ser aisladas en

el lugar del tumor, son conocidas como tumores infiltradores de linfoci tos (TILs ). Los TILs pueden ser aislados a parti r de tejido tumoral removido, cul tivado,

activado y expandido ex vivo, y, en reinfusión, han mostrado una eficacia prometedora en la clínica , particularmente en el tratamiento de melanomas, apoyando al potencial terapéutico de células T específicas de tumor.

Una opción al ternativa que está empezando a generar una data cl ínica convincente está basada en la premisa de que la especificidad antigénica de las células T pueden ser manipuladas por modificaciones genéticas y restringidas a marcar exi tosamente antígenos expresados por tumores . En particular, las células T pueden ser estructuradas para expresar TCR modificado

(llamado terapias de TCR) o receptores de antígenos quiméricos derivados de fusión proteica (CARs) que han mejorado su especificidad antigénica (Fig. 3). Es tos

avances podrían sobrepasar los límites asociados a la tolerancia central y peri férica y formar células T más

eficientes al marca r tumores como objetivos, sin necesi tar la activación de células T de novo en el paciente.

Terapias de TCR modificado genéticamente Las terapias de TCR modificado genéticamente están basadas en la alteración de la especificidad de células T a través de la expresión de cadenas α y β específicas de TCR que median el proceso de reconocimiento de

antígeno (Fig. 2). Las cadenas α y β del TCR específicas de tumor son identificadas , aisladas y clonadas en vectores de transducción y la transducción de células T

crea células T específicas de antígenos tumorales.

Para generar un TRC especifico para tumor eficiente, se

necesi ta identi ficar una apropiada secuencia blanco. Esta debe aislarse de una célula T tumoral reactiva especial, o en su defecto, se pueden usar alternativas tecnologicas para generar antigenos antigenos anti tumorales al tamente activos . Un enfoque es inmunizar a ratones transgénicos que expresan el sistema de antígeno leucocitario humano (HLA, ca ja 1) con

proteinas tumorales humanas para generar celulas T que expresen TCRs contra antígenos humanos . Un método al ternativo es la transferencia de genes TCR

alogénicos , en el cual las células T especificas para tumores son separadas de pacientes que pasan por

remisión. Las secuencias reactivas de TCR son transferidas a celulas T de otro paciente que comparte la enfermedad pero no presenta respuesta . Finalmente,

usando tecnologia in vi tro se al tera la secuencia del TCR, aumentando su actividad anti tumoral mediante el

aumento de la fuerza de interacción (avidez) de un TCR específico para tumor que reacciona débilmente al antígeno blanco.

Chimeric antigen receptors (CARs) Los CARs combinan un reconocimiento semejante al que hacen los anticuerpos, como la función activadora de células T [es decir, los CARs presentan esas dos características]. Son compuestos de una región de unión al antígeno, derivada comúnmente de un anticuerpo, un dominio transmembrana para anclar el CaR a la célula T, y uno o más dominios de señalamiento intracelular que inducen funciones efectoras , funciones de persis tencia y tráfico en células T transducidas . Las secuencias usadas para defini r el motiv del señalamiento antigénico para un CAR derivan típicamente de un anticuerpo monoclonal , pero l igandos y otros receptores también pueden ser usados.

La especificidad de los Car es determinada frecuentemente por un fragmento variable monocatenario (scFv – el dominio señalado), el cual

es tá formado por la autoasociación de las regiones variables clonadas de las cadenas pesada y ligera de un

anticuerpo monoclonal . El scFv está unido vía región espaciadora flexible a un dominio de señalamiento intracelular, siendo este último típicamente el dominio

transmembrana y endodominio del correceptor CD33ζ. Las señales coestimulatorias , tales como aquellas mediadas por CD28, OX40 (un receptor de factor de necorsis tumoral) y CD40L, permiten una activación de células T más eficiente y de mayor duración, pero

usualmente los tumores no expresan los ligandos apropiados para tales moléculas coestimulatorias . Por esta razón, a pesar de que los CARs que sólo contienen CD3ζ (CARs de primera generación) han sido capaces de inducir respues tas anti tumorales, en la mayoría de los casos la ausencia de una coestimulación ha llevado a una falta de respuesta inmune (anergia) y a la falla de la

expansión de células T in vivo. CARs de segunda generación, los cuales incluyen dominios de señalamiento intracelular para señales coestimulatorias

tales como CD28 y CD137, han mostrado poder reproducir efectos mejorados de regresión tumoral . Los CARs que llevan consigo más de un tipo de moléculas

coestimulatorias se encuentran actualmente en desarrollo, como es discutido más abajo.

Las células T que expresan CARs (CAR T cells) reconocen una variedad de tipos de antígeno no únicamente proteicos , sino también carbohidratos y es tructuras

glucol ípidas típicamente expresadas en la superficie celular de un tumor. A diferencia del reconocimiento de

TCR, el antígeno no necesi ta ser procesado y presentado por un MHC y por lo tanto el mismo acercamiento basado en CAR puede ser usado en todos

los pacientes que expresen el mismo antígeno tumoral, independientemente del tipo de HLA.

Glosario Alogénico: derivado de otro individuo y por lo tanto genéticamente diferente al hospedero. Anergia: estado sin respuesta inmune. Es inducido cuando el receptor de antígeno de las células T es estimulado, deteniendo efectivamente la respuesta de las células T hasta una segunda señal de las células presentadoras de antígenos. Células presentadoras de antígenos (APCs): grupo heterogéneo de células que median la respuesta inmune celular al procesar y presentar antígenos para ser reconocidos por las células T. Antigenicidad: capacidad de una molécula o un antígeno para inducir una respuesta inmune, es decir, ser reconocido por e interactuar con un anticuerpo especifico inmunológicamente o por receptores de células T. Autólogo: derivado del mismo individuo y por lo tanto genéticamente idéntico al hospedero. Blastos: células más jóvenes e inmaduras de la línea mieloide. Tolerancia central: mecanismo de tolerancia que opera en el timo antes de la maduración y circulación de células T. Células dendríticas (DC): una célula especializada en la presentación de antígenos. Células T efectoras CD8+: matan las células objetivo que expresan el péptido antigénico afín. Enfermedad de injerto contra huésped (GvHD): respuesta inmune agresiva causada las células T derivadas de donadores celulares reconocen tejido del receptor. Antígeno leucocitario humano (HLA): molécula altamente polimórfica requerida para la presentación de antígenos codificado por el complejo mayor de histocompatibilidad humano. Leucoféresis: separación selectiva y extracción de glóbulos blancos (leucocitos) de la sangre. Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC): proteínas que controlan la respuesta inmune, codificado por un locus que abarca una familia de genes altamente polimórficos. Célula de memoria: una célula del sistema inmune que, cuando es expuesta a un antígeno, se replica a si misma en los linfonodos para buscar el mismo antigeno, resultando en una respuesta más eficiente y rápida en exposiciones repetidas (respuesta memoria). Célula asesina naturales (NKC): un tipo de célula T

citotóxica que puede distinguirse de una célula CD8+ por su falta de TCR. Son parte del sistema inmune innato. Tolerancia periférica: no todos los autoantígenos, los cuales deben ser tolerados por las células T, son expresados en el timo. La tolerancia periferica es la tolerancia frente a autoantigenos perifericos que se desarrolla después que las células T maduran y pasan a la periferia. Células T regulatorias: una población de células T que pueden suprimir funcionalmente la actividad de otras células inmunes. Senecencia: pérdida de la capacidad de una célula de crecer y dividirse. Transduccion Viral: la transferencia de material genético a una célula mediante un vector viral.