PÓSTERS

ÁREAS TEMÁTICAS

I. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL

II. BIOTECNOLOGÍA

III. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGAN ISMOS

V. BIOFÍSICA

VI. NEUROCIENCIAS

VII. PARASITOLOGÍA MOLECULAR

VIII. INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA INF LAMACIÓN

IX. GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA

X. BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ANIMAL

XI. RADICALES LIBRES

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL (1-8)

1) BÚSQUEDA DE SUSTRATOS DE LA DOS ÚNICAS FOSFATAS AS DE PROTEÍNAS EN TIROSINA DE Mycobacterium tuberculosis, PtpA y PtpB,

UTILIZANDO MUTANTES EN EL SITIO ACTIVO

M. Margenat 1, A.M. Labandera 1, M. Corbo 2, C. Rivas 2, L. Rodríguez 1, A.M. Ferreira 3 y A. Villarino 1

1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR);

2Comisión Honoraria para la Lucha Antituberculosa y Enfermedades Prevalentes, Departamento de Laboratorio, Centro de Referencia Nacional para

Micobacterias; 3Instituto de Química Biológica, Cátedra de Inmunología, Facultad de Ciencias (UDELAR)

Mycobacterium tuberculosis posee dos tirosín-fosfatasas, PtpA y PtpB, las cuales están implicadas en la virulencia de la bacteria y sus sustratos podían ser tanto proteínas de la bacteria como del macrófago infectado. El objetivo del presente estudio es utilizar la metodología de “substrate trapping” para el aislamiento de potenciales sustratos de PtpA y PtpB, basada en el uso de mutantes puntuales en residuos conservados del sitio activo. Se obtuvieron los mutantes PtpA-Cys11Ser, PtpA- Asp126Ala, PtpA-Arg17Ala y PtpB-Cys160Ser y PtpB-Asp82Ala por mutagénesis sitio dirigida, los que están siendo producidos en forma recombinante y purificadas por cromatografía de afinidad y gel filtración. En paralelo, se obtuvieron extractos de proteínas de macrófagos enriquecidos en fosfotirosin-proteínas a partir del cultivo de la línea premonocítica humana THP1 diferenciados a macrófagos mediante incubación con acetato de forbol miristato. Se prepararon tres extractos de proteínas de macrófagos: 1) activados con lipopolisacáridos, 2) activados con lipopolisacáridos e interferón gamma y 3) sin activar. Para la obtención de extractos de M. tuberculosis se realizó el cultivo en medio mínimo Sauton y en medio enriquecido (7H9). Utilizando como herramienta la Resonancia Plasmónica de Superficie (SPR), hemos definido las características de la interacción del mutante PtpA D126A y los extractos proteicos de macrófagos, encontrándonos actualmente en condiciones de realizar el escalado de dicho proceso. Para ello, utilizando la misma química usada en el ensayo de SPR, se inmovilizó la proteína mutante PtpA D126A a la resina N-hidroxisuccinimida-sefarosa, la cual se utilizará para el aislamiento de posibles sustratos de PtpA.

2) ESTUDIO IN SILICO E IN VIVO ACERCA DE LAS FUNCI ONES MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS EISOSOMALES.

Agustina Olivera-Couto 1,3, Martín Graña 2, Laura Harispe 1 y Pablo S.

Aguilar 1 1 Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de

Montevideo, Mataojo 2020, Montevideo 11400, Uruguay. 2 Unidad de Bioinformática, Institut Pasteur de Montevideo, Mataojo 2020,

Montevideo 11400, Uruguay. 3aolivera@pasteur.edu.uy.

Los eisosomas son grandes ensambles macromoleculares de reciente descubrimiento en varios hongos como ser la levadura del pan. Éstos se localizan por debajo de la membrana plasmática de la célula, siendo centrales para la definición de los dominios de membrana y limitando así el movimiento lateral de una serie de lípidos y proteínas. Varios enfoques de biología celular y genética nos han permitido mostrar que los eisosomas están conectados funcionalmente con eventos celulares centrales, tales como la endocitosis y la señalización intracelular. Además, datos bioquímicos señalan que por lo menos diez proteínas diferentes componen los eisosomas en forma estable. Dos proteínas parálogas, Pil1 y Lsp1, constituyen el núcleo del eisosoma, con 2.000-5.000 ejemplares de proteína/eisosoma, mientras que el resto de las proteínas varían desde decenas a cientos de copias/eisosoma. Datos cada vez más refinados de la naturaleza y la dinámica de estos componentes se acompañan con una falta de conocimiento respecto a sus funciones y mecanismos de acción a nivel molecular. Hasta el momento no se habían descripto, para ninguna de estas proteínas, dominios proteicos de función conocida. Para arrojar luz sobre esta cuestión, se realizó un análisis bioinformático de alta sensibilidad, diseñado para descubrir relaciones filogenéticas distantes y características estructurales de eisosomas. Para varias proteínas, hemos logrado encontrar un importante número de dominios estructurales, algunos de estos con potencial importancia en cuanto a las funciones celulares de los eisosomas. Sorprendentemente, encontramos en seis proteínas eisosomales la presencia de dominios potenciales de tipo BAR, incluidas entre estas los componentes principales Pil1 y Lsp1. Presentamos aquí un resumen de estos resultados bioinformáticos, así como las validaciones experimentales, tanto in vitro como in vivo, que nos han permitido corroborar la existencia de dichos dominios y caracterizarlos funcionalmente. En general, nuestros resultados ofrecen un marco para abordar las características mecanísticas moleculares de los eisosomas en relación a la organización de la membrana plasmática.

Agradecimientos: Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII, Uruguay) por la financiación.

3) HACIA LA CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DEL ANTÍGENO B DEL PARÁSITO Echinococcus granulosus

M. Folle 1, 2, V. Silva 3, A. Lima 2, C. Batthyány 2, B. Córsico 3 y A.M. Ferreira 1

1 Cátedra de Inmunología, Instituto de Higiene, Facultad de Química (UDELAR); 2 Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Instituto Pasteur de

Montevideo; 3 Laboratorio de Interacciones Lípido-Proteína, INIBIOLP, Facultad de Ciencias Médicas, La Plata, Argentina

El antígeno B (EgAgB) es una lipoproteína inmunogénica presente en el metacestodo de E.granulosus (quiste hidático). Su componente lipídico es heterogéneo, incluyendo una amplia variedad de lípidos neutros y fosfolípidos. Su componente proteico (8 kDa) está codificado por una familia de genes polimórficos específica de los cestodos que unen ligandos hidrofóbicos. Estos genes se agrupan en 5 subfamilias -EgAgB8/1 a EgAgB8/5- cuya distribución en el metacestodo y frecuencia en diferentes cepas del parásito se conoce pobremente. Como los cestodos no son capaces de sintetizar colesterol, fosfolípidos y ácidos grasos de novo, el EgAgB podría estar involucrado en la adquisición de lípidos del hospedero. Como un primer paso para abordar esta hipótesis buscamos identificar qué apolipoproteínas están presentes en diferentes tejidos/compartimientos del quiste, qué lípidos unen y si hay diferencias entre cepas distintas del parásito. Desarrollamos un nuevo método de purificación del EgAgB basado en fraccionamiento por intercambio iónico y ultracentrifugación en gradiente de KBr, y analizamos su composición por electroforesis bidimensional y espectrometría de masa. Hasta el momento observamos que el líquido hidático de quistes de la cepa G1 (bien adaptada al hospedero ovino) contiene el EgAgB8/1, EgAgB8/2 y en menor proporción EgAgB8/4. La mayoría de las isoformas EgAgB8/1 y EgAgB8/2 se enfocaron a pH∼9, coincidiendo con sus pI teóricos, pero una proporción de éstas mostró pI más ácidos, que se asocian a oligomerización. Resultados similares se observaron con el EgAgB obtenido de la cepa G7 (adaptada al cerdo). Las posibles modificaciones en las proteínas que explican esta observación están bajo estudio.

4) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA INHIBICIÓN DE LA FOSFATASA EN TIROSINA DE Mycobacterium tuberculosis

POR EL ÁCIDO NITRO-OLEICO.

M. Gil 1,*, M. Margenat 2,*, R. Durán 1, C. Batthyány 1 y A. Villarino 2. 1Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo

e IIBCE; 2Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UdelaR). *co-primer autor

La fosfatasa en tirosina de M. tuberculosis PtpB no posee homólogo eucariota y actuaría tanto dentro de la bacteria como en las células infectadas, existiendo evidencias que la supresión de su gen disminuye la supervivencia de la bacteria en los macrófagos. In vitro, PtpB defosforila proteínas (en Ser/Thr y Tyr) y fosfoinositoles. Su actividad reside en la capacidad de la Cys160 en realizar el ataque nucleofílico al sustrato, la cual presenta un bajo pka favorecido por la presencia de la His159 en el sitio activo. La regulación redox mediante una modificación reversible de la cisteína catalítica podría ser un mecanismo clave en la regulación de las fosfatasas eucariotas. Diferentes especies reactivas de oxígeno y nitrógeno modulan la actividad de estas fosfatasas y recientemente se demostró que lípidos oxidados son también potentes inhibidores. Los ácidos grasos insaturados nitrados en un doble enlace constituyen una familia de potentes electrófilos formados durante situaciones de estrés oxidativo y que median acciones anti-inflamatorias en las células a través de la modificación reversible de los residuos nucleofílicos Cys e His de diferentes blancos moleculares, incluyendo enzimas y los receptores PPAR�. En el presente trabajo estudiamos la inhibición de la PtpB por el ácido nitro-oleico (ácido 9- y 10-nitro-9-cis-octadecenoico; OA-NO2). Determinamos el IC50 de la inhibición e identificamos el sitio de la reacción que media la inhibición enzimática. Dada la ausencia de homólogos de estas fosfatasas en eucariotas, la potente inhibición descrita presenta una interesante perspectiva farmacológica para el diseño de inhibidores específicos de esta enzima.

5) ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS VENENOS DE Bothropoides pubescens y Rhinocerophis alternatus (Serpentes: Viperidae)

P. Berasain 1,2, S. Carreira 3,4, V. Morais 1

1Departamento de Biotecnología, Instituto de Higiene, Fac. de Medicina (UDELAR); 2Unidad de Biología Parasitaria, Dto. de Biología Celular y

Molecular, Fac. de Ciencias (UDELAR); 3Serpentario, Fac. de Ciencias-Fac. de Medicina, Instituto de Higiene (UDELAR); 4Laboratorio de Sistemática de

Vertebrados e Historia Natural, Instituto de Ecología y Ciencias Ambientales, Fac. de Ciencias (UDELAR)

En promedio existen 65 accidentes por mordedura de serpientes en Uruguay cada año. Todos son causados por dos serpientes incluidas en el género Bothrops sp, ahora reconocidas como Rhinocerophis alternatus (crucera) y Bothropoides pubescens (yara). El protocolo de tratamiento es idéntico para ambas especies, usando el mismo suero antiofídico polivalente. En este trabajo se comparan ambos venenos buscando diferencias de composición y/o actividad biológica. Aunque los dos venenos presentan un perfil de proteínas similar, se observa por densitometría diferencias en la concentraciones relativas de las bandas para ambos componentes. El componente principal de R. alternatus es una metaloproteinasa del tipo PIII que representa aproximadamente el 30% de la masa total de proteínas del veneno. Por otro lado, el componente principal del veneno de B. pubescens se corresponde a una fosfolipasa A2 y representa el 35 % del veneno. En lo que respecta a las actividades bioquímicas ambos venenos tienen actividad coagulante y fibrinogenolitica similar, sin embargo B. pubescens presenta actividad hemolítica indirecta mientras que en R. alternatus no se detecta. Es probable que la variación de las cantidades relativas de los venenos esté relacionada con los hábitos de alimentación. Mientras R. aternatus se alimenta exclusivamente de los mamíferos, B. pubescens tiene una amplia dieta que incluye anfibios, reptiles, aves y mamíferos.

6) AGREGACION DE LA alfa-SINUCLEINA: ROL DEL ESTRES NITROXIDATIVO EN LA PATOGENESIS DE LA ENFERMEDAD DE

PARKINSON C. Chavarría 1, L. Piacenza, G. Peluffo, W. Porcal 2, J.M. Souza 1

1 Facultad de Medicina, Cátedra de Bioquímica, Centro de Investigaciones

Biomédicas en Radicales Libres (UDELAR). 2 Facultad de Ciencias, Instituto de Química Biológica, Laboratorio de Química Orgánica (UDELAR).

La formación de agregados intracelulares de la proteína alfa-sinucleína (αS) en neuronas dopaminérgicas está estrechamente vinculada con la patogénesis de diversas enfermedades neurodegenerativas. A pesar de que el mecanismo molecular que subyace el proceso de agregación de αS permanece incierto, se cree que el estrés oxidativo y nitroxidativo constituyen un factor clave en la pérdida neuronal asociada a estas patologías. En este trabajo, analizamos la formación de agregados intracelulares de αS y evaluamos el efecto del estrés nitroxidativo sobre el proceso de agregación utilizando SIN-1 como agente nitrante. Trabajamos con una línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y establemente transfectada con una forma mutante A53T de αS. Mediante la tinción de las células fijadas con tioflavina S (ThS), sonda fluorescente que indica la presencia de placas amiloídes, y a través del uso de anticuerpos anti-αS, detectamos los agregados de αS en células. Además, la agregación de la proteína se cuantifica utilizando citometría de flujo y se comparan los niveles de agregación en presencia y en ausencia de un agente nitrante. Por otra parte, analizamos la toxicidad de las formas agregadas para comprender mejor el proceso de agregación y su rol en la patogénesis de las sinucleinopatías. Las preguntas que se intentan responder son: 1) si los agregados son tóxicos, 2) cuál es la relación entre estrés nitroxidativo y la agregación de la αS y 3) como se puede prevenir la toxicidad mediada por la αS.

7) MODULACIÓN REDOX DE LA PROTEÍNA QUINASA G DE Mycobacterium tuberculosis

M. Gil 1, R. Durán 1, A. Denicola 2 y C. Batthyány 1

1Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo e IIBCE; 2Laboratorio Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias (UdelaR)

La fosforilación reversible de proteínas constituye la base de un lenguaje universal utilizado para la transmisión de información en respuesta a estímulos. En el caso Mycobacterium tuberculosis la señalización recae principalmente sobre sistemas de fosforilación en serinas y treoninas típicamente eucariotas (STPK). Una de estas STPK, PknG, es una quinasa citosólica que intervendría en la supervivencia del bacilo dentro del macrófago. Además del dominio catalítico quinasa, PknG posee un motivo rubredoxina (Fe(Cys)4) con Cys esenciales que juegan un importante rol en la regulación redox de la actividad enzimática. En este trabajo nos propusimos ahondar en la regulación de la actividad quinasa de PknG por el dominio rubredoxina. En particular estudiamos el efecto de lípidos nitrados, especies electrofílicas producidas durante la activación del macrófago y que son capaces de modificar específicamente residuos de Cys e His, sobre la actividad de PknG. Nuestros resultados indican que el acido nitro-oleico es un potente inhibidor de la enzima, y contrariamente a lo ya reportado para estos nitroalquenos, esta inhibición es irreversible. Por espectrometría de masa demostramos que las Cys localizadas en el dominio rubredoxina son el blanco preferencial de estos inhibidores. La modificación covalente de estas cisteínas provoca la salida del hierro del dominio rubredoxina. En base a estos resultados postulamos que el mecanismo de acción de estos lípidos nitrados como inhibidores de esta quinasa implica una reactividad diferente a la previamente reportada. Estos datos plantean la interrogante sobre el potencial rol farmacológico de la modificación de cisteínas del dominio rubredoxina en PknG.

8) EFECTO DE LOS ÁCIDOS GRASOS EN LAS PROPIEDADES D EL TIOL DE LA ALBÚMINA Y SU DERIVADO SULFÉNICO

M.J. Torres 1, L. Turell 1,2, B. Álvarez 1

1 Laboratorios de Enzimología y 2 Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay

El único tiol libre de la albúmina sérica humana (HSA-SH) es el más abundante en plasma, pudiendo ser oxidado a un ácido sulfénico relativamente estable (HSA-SOH). Cada mol de HSA circulante transporta normalmente 1-2 moles de ácidos grasos (AG), aunque dicha relación puede alterarse bajo ciertos estímulos. Continuando nuestro trabajo con albúmina deslipidada, se estudió el efecto de la unión de ácidos grasos. La velocidad de reacción del tiol con el ácido 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) incrementó 2 y 6 veces en presencia de 2 y 5 moles de AG por mol de HSA, respectivamente. HSA deslipidada reaccionó con H2O2 a (1.45 ± 0.04) M-1 s-1, y con ONOOH a (7.5 ± 0.3) x 103 M-1 s-1, mientras que HSA-ácido esteárico (1:5) reaccionó el doble de rápido, a (3.3 ± 0.8) M-1 s-1 y (14.7 ± 0.6) x 103 M-1 s-1, respectivamente (37 °C, pH 7.4). La exposición a H2O2 (2 mM, 5 min, 37 °C) rindió 0.15 moles de HSA-SOH por mol de HSA deslipidada, ascendiendo a (0.29 ± 0.04) con ácido esteárico (1:5). A su vez, la presencia de ácido esteárico (1:5) aumentó la velocidad de reacción con tionitrobenzoato (TNB) de (115 ± 18) a (545 ± 42) M -

1 s-1 (25 ºC, pH 7.4), mientras su reactividad con diferentes tioles presentes en plasma aumentó ~3 veces. Los aumentos en reactividad, más significativos con moléculas grandes y cargadas (DTNB, TNB), que con pequeñas y neutras (H2O2, ONOOH), pueden explicarse por un cambio conformacional en la proteína, inducido por la unión de AG, que aumenta la exposición del tiol y disminuye su pKa.

BIOTECNOLOGÍA (9-26)

9) BÚSQUEDA DE ACTIVIDAD INHIBITORIA DE TRIPSINA EN EXTRACTOS DE PLANTAS AUTÓCTONAS

L. Macció 1, D. Vallés 1, A.M.B. Cantera 1,2

1Laboratorio de enzimas Hidrolíticas, IQB, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química

(UDELAR) Las plantas tienen una variedad de inhibidores de proteasas serínicas, objeto de numerosas investigaciones dado su posible papel como arsenal de defensa de los vegetales. (Díaz, 2006) En este grupo de inhibidores, se ha puesto énfasis en los inhibidores de tripsina, de los que se conocen hasta el momento cuatro fuentes naturales (Fei Fang, 2010). En este trabajo se realizó la búsqueda de la capacidad inhibitoria de tripsina en extractos de Baccharis trimera (carqueja) y Eugenia uniflora (pitanga). Se prepararon extractos acuosos a 25 y 100ºC y etanólicos a 25 y 40ºC de hojas de carqueja y frutos de pitanga con una relación 2:10 (w/v). La capacidad inhibitoria se controló incubando tripsina con cada uno de los extractos en estudio a distintos tiempos. La actividad remanente (%AR) se determinó utilizando azocaseína como sustrato. La capacidad inhibitoria de los extractos fue contrastada contra la producida por PMSF (inhibidor inespecífico para las serín proteasas) en las mismas condiciones de ensayo.Los extractos acuosos y etanólicos de carqueja en una relación de 12mgvegetal/mLtripsina, mostraron, a los 5 minutos de incubación un 40% de inhibición de la actividad tríptica, no observándose cambios a tiempos de incubación superiores (10, 20, 30 y 45 minutos).La incubación con extractos acuosos de pitanga en una relación 12mgvegetal/mLtripsina , no presentaron acción inhibitoria. Los extractos etanólicos, en cambio, mostraron un 80% de inhibición de la actividad de la tripsina a los 5 minutos de incubación. El IC50 correspondiente al extracto etanólico de pitanga fue de 8mgvegetal/mLtripsina.

10) CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DEL SISTEMA DE TRANSGALACTOSILACIÓN CATALIZADO POR LA BETA-

GALACTOSIDASA DE ASPERGILLUS ORYZAE

A. Castilla 1, C. Giacomini 1, G. Irazoqui 1. 1 Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química

En los últimos años se han reportado numerosas aplicaciones de alto impacto para los galactósidos, en particular en el área de la salud. Entre ellas se pueden destacar su uso en la producción de vacunas, en métodos de diagnóstico, en la generación de prodrogas, como agente antitumorales, como inhibidores de galectinas. Las glicosidasas son una excelente herramienta para la síntesis enzimática de galactósidos. Entre las características de estas enzimas se destaca su estéreoespecificidad que permite la generación de glicósidos anomericamente puros en un solo paso de reacción, lo que hace de ellas una interesante alternativa a la síntesis química. En particular la �-galactosidasa es capaz de catalizar procesos de transgalactosilación en el cual la galactosa es transferida desde una molécula donadora de grupo galactosilo a una molécula aceptora del mismo. Sin embargo para que el proceso sea exitoso las condiciones deben ser optimizadas para cada sistema en particular. En este trabajo se realizó una caracterización cinética del sistema de transglicosilación catalizado por la �-galactosidasa de Aspergillus oryzae, utilizando orto-nitrofenil-�-D-galactopiranósido (ONPG) como dador de grupo galactosilo y diferentes moléculas aceptoras: etilenglicol, glicerol y etanolamina. El comportamiento cinético del sistema se ajustó a un modelo de reacción con dos sustratos siguiendo un mecanismo de sustitución enzimática. Además se observó inhibición por sustrato, para los tres sustratos aceptores. Se determinaron las constantes cinéticas para el dador (ONPG) en presencia de diferentes concentraciones de cada uno de los aceptores y se están realizando los experimentos complementarios para determinar las constantes de inhibición de los mismos.

11) EXPRESIÓN DE PROQUIMOSINA B BOVINA RECOMBINANTE EN Escherichia coli BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR INDUCIBLE POR

ARABINOSA

F. Piriz 1, S. Castro-Sowinski 1,2, M. Marín1

1Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE

La quimosina es una proteasa aspártica sintetizada por las células chief de la mucosa gástrica del cuarto estómago de terneros lactantes. Hidroliza la kappa-caseína, resultando en la coagulación de la leche en presencia de calcio. Esta enzima es el componente esencial del “cuajo” para la elaboración de quesos, ocupando el 80% del mercado mundial. Su alta demanda impulsa a la industria a buscar fuentes alternativas. El objetivo de este trabajo fue expresar en un sistema heterólogo la secuencia de proquimosina B, por clonación direccional en el plásmido de expresión pBAD18, abajo control del promotor inducible por arabinosa. Las células de E.coli BL21 transformadas se indujeron por 5h con arabinosa y se lisaron por sonicación y por prensa de French. Se utilizó el extracto celular como fuente de proquimosina, y se activaron a pH2 y pH4 para la obtención de quimosina (forma activa de la enzima). Se purificó parcialmente por precipitación salina con (NH4)2SO4 al 80% de saturación, controlándose las fracciones por SDS-PAGE. Se observó una banda correspondiente al tamaño esperado de la quimosina comercial. La actividad enzimática (ensayo de coagulación de la leche) se determinó antes y después de la activación. En las muestras obtenidas por sonicación no se detectó actividad. En las fracciones obtenidas por prensa de French, activadas y precipitadas, se detectó una actividad específica de 15.4 h-1g-1 (pH2) y 6.9 hs-1g-1(pH4). Estos resultados nos alientan a seguir trabajando en la optimización de la recuperación de la quimosina soluble y activa en este sistema heterólogo. Agradecimientos: ANII

12) OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE LAS CUTIVO P ARA LA PRODUCCIÓN DE POLISACÁRIDO CAPSULAR DE S. pneumoniae

serotipo 1

J. Checa , E.Texeira, F. Ferreira, N. Suárez. Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Departamento de Desarrollo

Biotecnológico. Facultades de Medicina/Química. Instituto de Higiene, C.P 11600, Montevideo, Uruguay.

Streptococcus pneumoniae es agente causal de neumonía, meningitis, otitis media y otras enfermedades infecciosas. Las cepas patógenas de la bacteria producen una gruesa cápsula polisacarídica que constituye el principal factor de virulencia y determinante antigénico. Este polisacárido es efectivo como antígeno, generando inmunidad protectora y constituye la base de las preparaciones vacunales actualmente en uso. La producción y obtención de polisacáridos capsulares serotipo específicos bien definidos es esencial para diagnóstico, preparación de vacunas así como en investigación y desarrollo. Tradicionalmente se han empleado medios complejos o semisintéticos para el cultivo y crecimiento de S. pneumoniae, pero en el primer caso se requieren procesos complejos de purificación del antígeno. Teniendo en cuenta estos hechos y la conveniencia de utilización de medios definidos para la producción de antígenos es necesaria la optimización de condiciones de cultivo que permitan buenos rendimientos del proceso de producción y purificación. En el presente trabajo se reportan los resultados del cultivo de S.pneumoniae serotipo 1 y producción de antígeno capsular en condiciones definidas. En particular se reporta la producción de biomasa, carbohidratos totales y capsulares y pureza del producto. Los resultados indican que el método de producción propuesto es una forma eficiente de producción de éste antígeno en condiciones controladas.

13) CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA POBLACIÓN DEL PATÓGENO PYRICULARIA ORIZAE EN URUGUAY

Chao,L. 1 , Bonnecarrère,V. 1Ávila,S. 2

1 Unidad de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria INIA; 2 Estación Experimental Treinta y Tres, INIA.

El Tizón o Quemado del Arroz, provocado por el hongo patógeno Pyricularia orizae es considerado una de las principales enfermedades de este cereal en el mundo, a causa de su alta incidencia bajo condiciones favorables y las pérdidas en el rendimiento que provoca. P.orizae es un hongo que puede presentar una alta variabilidad genética, por lo que el estudio y caracterización genética de la población del patógeno en Uruguay y su evolución temporal es fundamental para el seguimiento de la enfermedad y la determinación de mecanismos de control. Para ello se utilizaron dos metodologías moleculares, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) que permite evaluar un gran número de bases en el genoma del patógeno; y Pot-2 repPCR la cual amplifica regiones mayores del ADN y detecta diferencias en el tamaño de los fragmentos amplificadas. El objetivo de este estudio es encontrar linajes o grupos genéticos que caractericen la diversidad genética del patógeno y encontrar una tendencia en la patogenicidad entre linajes de P.orizae y genotipos de arroz. Se analizaron aislamientos monospóricos de P.orizae obtenidos en cultivos o viveros trampa, desde el año 1993 hasta 2010. Mediante la técnica de AFLP se identificaron 3 grupos genéticos significativamente diferentes, mientras que con la técnica de Pot-2 repPCR se determinaron 4 grupos genéticos o linajes(A-D) con variaciones intra-linajes o haplotipos. Dos de los linajes son mayoritarios (B y C) y afectan principalmente a un cultivar cada uno de ellos. Debido a que esta técnica es más simple de implementar y muy robusta, se considera la más adecuada para la evaluación rutinaria de aislamientos del patógeno.

14) EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD DE LA ACETOLACTATO SINTASA (ALS) POR ACCION DEL ORTOSULFAMURON EN ARRO CES

CLEARFIELD ®

M .Diez Vignola 1, V. Bonnecarrère 1, N. Saldain 2. 1Unidad de Biotecnología,INIA Las Brujas ; 2Programa Arroz, INIA Treinta y

Tres La cadena arrocera es netamente exportadora en Uruguay, requiriendo de una producción competitiva y de alta calidad. En un 35% del área sembrada con arroz existe infestación con arroz rojo o arroz maleza (AM). El AM pertenece a la misma especie que el arroz cultivado (Oryza sativa L.) dificultando este hecho el control selectivamente con herbicidas. Una respuesta comercial al mismo es el Sistema de Producción de Arroz Clearfield®. Ésta tecnología combina el uso de imazapir + imazapic con variedades de arroz portadoras de una mutación puntual en la enzima ALS que le otorga resistencia. Esta enzima participa en la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada, por lo que su inhibición provoca detención del crecimiento y posteriormente la muerte de las especies susceptibles. Imazapir + imazapic, bispiribac, penoxulam, metsulfuron pirazosulfuron (inhibidores de la ALS) cuando son aplicados de manera frecuente seleccionan biotipos resistentes de las malezas que controlan. Las poblaciones de malezas han sido sometidas a una fuerte selección en contra de los individuos susceptibles a estos herbicidas en nuestros arrozales. En este trabajo se validó una metodología para ensayos de dosis-respuesta en tres materiales de arroz: INIA Olimar, CL146 y el híbrido INOV CL frente a orthosulfamuron .El análisis de datos se realizó con el programa estadístico R, ajustándose modelos no lineales específicos a las curvas de dosis-respuesta obtenidas. Esta herramienta será muy útil para detectar y monitorear la evolución de la resistencia en el AM y en el capín (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv) presentes en el cultivo.

15) EXPRESIÓN DE proNGF HUMANO SOLUBLE EN Escherichia coli

M. J. Lista 1, A.de León 1, L. Barbeito 1 1Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo

El factor de crecimiento nervioso (NGF, del inglés nerve growth factor) es miembro fundador y prototípico de las neurotrofinas, un grupo de factores tróficos relacionados originalmente con el desarrollo, mantenimiento y sobrevida del sistema nervioso central y periférico. El NGF es una proteína secretoria de carácter básico cuya forma biológicamente activa consta de un homodímero no covalente en solución. Traducido como una pre-pro-proteína de 240 aminoácidos, cada monómero presenta tres puentes di-sulfuro sumamente conservados donde dos enlaces di-sulfuro conforman una estructura en forma de anillo que es atravesada por un tercer enlace dando lugar al motivo conocido como nudo de cistinas. Dicha característica hace que la expresión de la proteína en sistemas procariotas lleve a la producción de la misma en forma insoluble. En este trabajo nos propusimos obtener proNGrh soluble en un sistema de expresión procariota, conjugando así ventajas como rapidez, simpleza y bajos costos de producción. Con ese propósito hemos escogido la cepa de expresión E. coli SHuffle, la cual se caracteriza por expresar en su citoplasma la enzima puente-disulfuro isomerasa DsbC cuya función es isomerizar los puentes disulfuro incorrectamente formados a su estado conformacional nativo. El uso de este sistema y la optimización de las condiciones de expresión nos ha permitido la obtención de proNGF en forma soluble y biológicamente activo.

16) PREPARACION Y CARACTERIZACION DE FRACCIONES DE SAPONINAS DE Quillaja brasiliensis CON REDUCIDA ACTIVIDAD

HEMOLITICA.

M. Mastrogiovanni , L. Quirici, S. Soulé, F. Ferreira Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Dep. de Química Orgánica-Instituto de Química Biológica, Facultades de Química y Ciencias, UDELAR.

La corteza de Quillaja saponaria Molina, árbol nativo de Chile, Bolivia y Ecuador se emplea para la producción de metabolitos secundarios conocidos como saponinas. Estos productos naturales son ampliamente utilizadas en la industria y en la preparación de productos biológicos, en particular como adyuvantes en la formulación de vacunas debido a su capacidad para incrementar una respuesta específica a antígenos co-administrados. Sin embargo, su utilización en vacunación se ve restringida debido a que se presentan en el vegetal como mezclas complejas, algunos de cuyos componentes pueden presentar efectos secundarios indeseables cuando son administrados por vía parental. La formación de micelas nanoestructuradas, llamadas ISCOMS, formuladas con estas saponinas, incrementa la actividad adyuvante y reduce los efectos secundarios. Trabajos anteriores han demostrado que fracciones de saponinas de otra especie del mismo género, autóctona del sur de Brasil y Uruguay, Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart., también son muy efectivas como adyuvantes y nuestro grupo ha logrado demostrar su capacidad de formar ISCOMS. El objetivo de nuestro trabajo es contribuir a la mejor caracterización estructural de estos productos, los cuales son prometedores como herramientas para el diseño de vacunas más efectivas. En el presente trabajo se presentan los resultados del fraccionamiento bioguiado, en la búsqueda de compuestos y fracciones con reducida actividad hemolítica de saponinas de Q. brasiliensis, así como la caracterización química preliminar de las fracciones con menor actividad hemolítica.

17) CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA HIDRÓLISIS DE PR OTEINAS DEL LACTOSUERO CON PROTEASAS CISTEÍNICAS DE UNA PLA NTA

AUTÓCTONA.

C. Villadóniga 1, A.M.B. Cantera 1,2 1Laboratorio de Enzimas Hidrolíticas, Instituto de Química Biológica, Facultad

de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química (UDELAR)

La influencia del pH y la temperatura en la estructura de las proteínas

mayoritarias del lactosuero, α-lactalbumina (α-La) y β-lactoglobulina (β-Lg), está bien caracterizada y existe evidencia de que estos parámetros afectan su susceptibilidad al ataque proteolítico. El efecto de las condiciones del ambiente sobre el sustrato durante la proteólisis debe ser considerado, especialmente cuando interesa liberar péptidos con características o funcionalidades específicas.

En este trabajo se estudió el efecto del pH en la cinética de degradación de las proteínas del lactosuero bovino con peptidasas cisteínicas de una planta autóctona. Se trabajó con un extracto de frutos maduros de Bromelia antiacantha Bertol. (EBA) previamente caracterizado. EBA presenta alta actividad proteolítica a pH 5.0-9.0 y actividad máxima a 65 °C. Los resultados electroforéticos y la cuantificación de aminos primarios mostraron que β-Lg se degrada más rápidamente que α-la a pH 9.2 y 50 °C, llegando a valores de grado de hidrólisis comparables (DH= 22 y 21 % respectivamente) a tiempo final (120 min). Se determinaron los parámetros cinéticos a diferentes valores de pH (4,2; 7,5 y 9,2). La afinidad de EBA para α-La es significativamente mayor a pH 4,2 (Km=0,061 mM) mientras que β-Lg no mostró una velocidad de degradación apreciable a este pH. El número de recambio para α-La es 2.5 veces mayor a pH 7,5 y 9,2 (Kcat= 7050 s-1) que a pH 4,2. β-Lg a pH 7,5 presenta un numero de recambio semejante al de α-La mientras que a pH 9,2 es 2,5 veces mayor (Kcat= 18000 s-1).

18) PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LACASA DE TRAMETES VILLOSA AISLADO DE EUCALYPTUS GLOBULUS

CULTIVADO EN URUGUAY

L. Gioia 1,2, C. Manta 1, P. Menéndez 2, K. Ovsejevi 1

1Cátedra de Bioquímica, DEPBIO; 2Lab. de Biocatálisis y Biotransformaciones, DQO. Facultad de Química (UDELAR)

Las lacasas (EC 1.10.3.2) son oxidasas que pertenecen a la familia de “proteínas azules de cobre”; utilizan oxígeno molecular como aceptor de electrones, produciendo agua sin requerir costosos cofactores. La mayoría de las lacasas son extracelulares producidas por hongos, especialmente por “basidiomicetes de la podredumbre blanca de la madera”, que se caracterizan por ser capaces de degradar la lignina de forma eficiente metabolizándola a CO2 y H2O. Entre las posibles aplicaciones de las lacasas se destaca el tratamiento de aguas residuales provenientes principalmente de las industrias textil y papelera las cuales generan contaminación ambiental entre otros por su contenido en polifenoles. La enzima actúa modificando la estructura química de estos compuestos, convirtiéndolos en otros generalmente más inocuos para el medio ambiente. Con la finalidad de optimizar dichas aplicaciones es necesario comparar el comportamiento de la enzima con distintos grados de pureza. En este trabajo se purificó una lacasa de Trametes villosa, cepa aislada de Eucalyptus globulus cultivado en Uruguay. Se desarrolló un eficiente protocolo de purificación involucrando las siguientes etapas: 1) Fraccionamiento salino, 2) Cromatografía hidrofóbica en Phenyl Sepharose con elución en columna, 3) Intercambio Iónico en batch con DEAE Sephadex y elución en columna por cambio de fuerza iónica. El grado de pureza alcanzada fue evaluado mediante Electroforesis PAGE-SDS, observándose una única banda proteica con actividad enzimática en el eluido del Intercambio Iónico. Se determinaron las condiciones de pH y temperatura óptima de catálisis y la estabilidad de la enzima purificada.

19) GENERACIÓN DE LEVADURAS CON PROPIEDADES INSECTI CIDAS

L. Harispe 1, H. Silva 2, M. Mailhos 1, E. Castiglioni 2, C. Carlini 3, P. Aguilar 1 1 Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay; 2 Estación Experimental Mario Cassinoni, UDELAR, Uruguay ; 3 Centro de Biotecnología, UFR GS, Brasil.

Las semillas de la leguminosa Canavalia ensiformis producen una forma de la enzima ureasa – llamada canatoxina - que posee actividad insecticida. Esta actividad afecta a los insectos que poseen sistemas digestivos basados en proteasas tipo catepsinas, incluyendo algunos de relevancia médica y agrícola tales como Nezara viridula, Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus y Triatoma infestans. La entomotoxicidad de la canatoxina se basa en la presencia de un péptido interno de 10-15 kDa, denominado Jaburetox, que puede ser producido in vitro mediante hidrólisis de la ureasa con catepsinas obtenidas de insectos susceptibles. Este péptido, obtenido de forma recombinante en E. coli, ha demostrado potente actividad insecticida cuando es introducido en la dieta de varios insectos. Asimismo, se ha demostrado que la administración oral o mediante inyección intraperitoneal de altas dosis de Jaburetox-2Ec (10 mg/kg) a ratones y ratas, no produce la muerte ni síntomas de toxicidad aguda. Hemos demostrado que S. cerevisiae es un modelo biológico compatible con la expresión de este péptido. Una versión de Jaburetox marcada en su extremo C-terminal con V5-6XHis (Jbx-2Ec) fue clonada en distintos tipos de vectores de expresión y se determinaron los niveles de proteína obtenidos. En base a estos resultados, nos proponemos utilizar este organismo como modelo para el desarrollo de cepas de levaduras que, a través de la producción de este péptido insecticida, presenten capacidad entomotóxica sobre tres insectos blanco que afectan la producción regional de soja (Piezodorus guildinii), maíz (Spodoptera frugiperda) y algodón (Dysdercus peruvianus).

20) PUESTO A PUNTO DE LA TÉCNICA DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE Brucella abortus RB51 y S19.

M. Cattáneo 1,2, J. Bermúdez 1,2, F. Campos. 3

1 Área de Bacteriología, Departamento de Microbiología,

Facultad de Veterinaria (UdelaR), Uruguay; 2 Laboratorios de Investigación y Desarrollo. CCA. Laboratorios Santa Elena. Uruguay; 3Facultad de Veterinaria

de Porto Alegre (UFRGS), Brasil. La brucelosis bovina es una enfermedad infecto contagiosa de los bovinos causada por Brucella abortus (B. abortus). Esta enfermedad es una zoonosis, esta presente en nuestro país y es objeto de campaña oficial del Ministerio de Ganadería. El género Brucella consiste en seis especies designadas en base a su patogenecidad y tipo de húesped de preferencia: B. melitensis (cabras y ovejas), B. abortus (vacas y bison), B. suis (cerdos), B. ovis (ovejas), B. canis (perros) y B. neotomae (rata). Se han aislado cepas de Brucella en una gran variedad de mamíferos marinos y se han propuesto dos nuevas especies: B. ceti (cetaceos) y B. pinnipedialis (pinnípedos). Algunas de estas especies incluyen varios biovares. Para diferenciar entre especies y biovares se llevan a cabo 25 pruebas fenotípicas. Estas son muy costosas, se requiere de personal capacitado y llevan tiempo. Para superar estos inconvenientes se ha desarrollado la técnica de PCR multiplex para la tipificación de todas las especies de Brucella, incluidas las cepas vacunales de B. abortus RB51 y S19. El objetivo de este trabajo fue poner a punto la técnica de PCR multiplex para la identificación de las cepas vacunales de B. abortus RB51 y S19. Se estudiaron cepas pertenecientes a los ceparios del Departamento de Microbiología y al Laboratorios Santa Elena. Se logro poner a punto la técnica de PCR multiplex pudiendo diferenciar entre las cepas de B. abortus RB51 y S19 estudiadas. Esta técnica es altamente específica, rápida y sencilla de realizar. Se continuará trabajando para identificar por esta técnica las cepas de Brucella ovis, canis y suis.

21) MONITOREO INTRACELULAR DE CAMBIOS REDOX EN TRIPANOSOMAS Y CÉLULAS HUÉSPEDES CON PROTEÍNAS

FLUORESCENTES REDOX-SENSIBLES

M. Curto 1, B. Manta 1, M. Laverriere 2, S. Astrada 3, M. Bollati 3, M. Comini 1

1 Laboratorio de Biología Redox de Tripanosomas, Institut Pasteur de Montevideo; 2 Universidad Nacional de San Martín, Buenos Aires;, 3Unidad de

Biología Celular, Institut Pasteur de Montevideo

Las células están expuestas a especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, originadas como subproductos metabólicos o en el medio ambiente. Una producción descontrolada y/o neutralización insuficiente de estos compuestos es capaz de alterar el equilibrio redox celular causando daño en las macromoléculas. Las células están equipadas con distintos sistemas que controlan la homeostasis redox tiol-disulfuro a nivel intracelular. Por ejemplo, el sistema tiorredoxina proporciona control cinético de la reducción de tioles protéicos, mientras que el sistema del glutatión actúa como el principal amortiguador redox. Los tripanosomátidos han desarrollado sistemas análogos que dependen de una oxidorreductasa denominada triparredoxina y del tripanotión (bis-glutationilespermidina), el principal tiol de bajo peso molecular en estos parásitos. Recientemente se han generado variantes de la proteína fluorescente verde (roGFP2 y rxYFP) que permiten el análisis espacial y temporal de alteraciones en el estado redox sin destruir la integridad celular. Los biosensores poseen dos cisteínas en su superficie que transducen el estado tiol-disulfuro del pool de glutatión en cambios cuantitativos en las propiedades del cromóforo (intensidad de emisión a diferentes λ de excitación). Nuestro objetivo es validar el empleo de estas herramientas para estudiar los fenómenos redox durante los procesos de diferenciación celular, interacción huésped-parásito y respuesta a estrés. En estos estudios se utilizaron líneas celulares de T. cruzi y de células de mamíferos, que expresan roGFP2 o rxYFP, las cuales fueron sometidas a distintos estímulos. Los cambios redox fueron analizados mediante microscopía confocal y análisis de citometría de flujo. Se mostrarán los resultados de estos estudios preliminares.

22) NUEVAS LÍNEAS REPORTERAS PARA EVALUAR LA ACTIVI DAD BIOLÓGICA DE LOS INTERFERONES HUMANOS DE TIPO I

M. Bürgi 1, C. Prieto 1, M. Etcheverrigaray 1, R. Kratje 1, M. Oggero-Eberhardt

1 , M. Bollati-Fogolín 2 1Laboratorio de Cultivos Celulares - UNL, Santa Fe. Argentina; 2UBC-IPMONT.

Montevideo. Uruguay Dado el importante rol que cumplen los interferones (IFNs) en el sistema inmune, sus potencias deben ser correctamente identificadas para ser empleados como agentes biofarmacéuticos. Una metodología de uso corriente es un ensayo antiviral pero presenta ciertas desventajas. Para evitar esto, se desarrollaron 4 líneas celulares de diferente origen tisular (A549, Hela, Wish y HEp-2) reporteras de la actividad de los IFNs humanos de tipo I (IFN-α e IFN-β), utilizando el gen de la proteína de fluorescencia verde (eGFP) bajo el control del promotor Mx-2 inducible por IFN. El mencionado promotor respondió específica y cuantitativamente frente a la adición de dichas citoquinas demostrando una buena correlación entre la expresión de eGFP y las moléculas ensayadas. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en los límites de detección al comparar las respuestas de las distintas líneas celulares frente a los subtipos de IFN-α. Contrariamente, se verificaron variaciones en tales límites al comparar la actividad de los subtipos de IFN-β en las líneas HEp-2. Por lo tanto, mediante la utilización de las líneas celulares apropiadas se podrá llevar a cabo la estandarización de diferentes ensayos reporteros para medir la potencia de los IFNs de tipo I de origen humano. En síntesis, las principales ventajas de estos sistemas con respecto a los ya existentes son: rapidez, sensibilidad, especificidad y seguridad, siendo útiles además, para evaluar el modo en que los IFNs desarrollan su actividad en los diferentes tejidos humanos o para el monitoreo de compuestos que interfieran en las vías de señalización.

23) CARACTERIZACION DE LA CAPACIDAD INVASIVA Y REPL ICATIVA DE CEPAS ATENUADAS DE SALMONELLA TYPHIMURIUM EN UN

MODELO DE CANCER DE MAMA

M. Masner 1, R. Gonzalez 1, N. Mazza1, M. Moreno 1, P. Berasain 1, J.A. Chabalgoity 1, M.G. Kramer 1

1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina (UDELAR)

Ante la necesidad de nuevas alternativas para combatir los tumores mamarios, las bacterias del genero Salmonella presentan características ventajosas como agentes terapéuticos. Ciertas cepas son capaces de localizarse y replicar naturalmente dentro de tumores (y sus metastasis), pudiendo ejercer un efecto antitumoral moderado, que combinado con otro tipo de terapias podría resultar en un tratamiento efectivo para el control de estas neoplasias. En este trabajo se emplearon dos cepas atenuadas de S. Typhimurium y se evaluó su capacidad in vitro para invadir y replicar en células tumorales de cáncer mamario. Además se estableció un modelo metastásico de cáncer mamario murino donde se estudio el efecto de la administración de Salmonellas en la evolución de los ratones portadores de tumores y su biodistribución tras distintas vías de inoculación. Resultados preliminares indican que una de las cepas estudiadas posee una alta capacidad para invadir y replicar in vitro en distintas líneas tumorales de cáncer mamario. Estas bacterias inoculadas en ratones también logran localizarse y replicar selectivamente en los ambientes tumorales. Aunque el efecto intrínseco de estas Salmonellas en la sobrevida de los ratones portadores de tumores es moderado, sus propiedades las perfilan como una alternativa a explorar en el tratamiento contra el cáncer de mama.

24) UTILIZACIÓN DE UN BIOSENSOR FLUORESCENTE REDOX SENSIBLE EN UNA LÍNEA CELULAR DE IMPORTANCIA BIOTECNOLÓGICA

K. Perelmuter *1, I. Tiscornia* 1, V. Porro 1, M. Comini 2, M. Bollati-Fogolín 1

1Unidad de Biología Celular; 2Laboratorio de Biología Redox de Tripanosomas, Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay.

*Ambos autores contribuyeron igualmente al trabajo Funciones celulares tal como la replicación del ADN y la traducción de proteínas son influenciadas por cambios en la homeostasis redox intracelular. El monitoreo de dichos cambios redox en tiempo real y de manera no invasiva permitiría diseñar estrategias de intervención específicas tendientes a optimizar procesos de producción celular. Recientemente se han generado variantes de la proteína fluorescente verde (roGFP2 y rxYFP) que permiten llevar a cabo este tipo de análisis. En el presente trabajo empleamos la rxYFP para monitorear la homeostasis redox in situ en una línea celular de importancia biotecnológica. En primer lugar se generó una línea celular CHO.K1 productora de GM-CSF que expresa de manera constitutiva la rxYFP. Los clones celulares fueron seleccionados por enriquecimiento y posterior clonado mediante un separador celular (MoFlo). Se comparó el crecimiento y metabolismo celular de dos clones de referencia respecto de la línea celular original. Se determinó que tanto la densidad celular, el consumo de glucosa, como la producción de lactato y de GM-CSF no se vieron modificados por la introducción del sensor. El análisis funcional del biosensor se realizó por citometría de flujo. Se detectaron cambios en la intensidad de fluorescencia estímulo-dependientes (peróxido de hidrógeno, agente reductor y compuesto pro-oxidante). Por otro lado, se observó una disminución de la misma a partir del día 5 en cultivos tipo batch, coincidente con el agotamiento de glucosa y la acumulación de lactato. Experimentos en curso se orientan hacia la evaluación cuali- y cuantitativa de estímulos fisiológicos.

25) VECTORES LENTIVIRALES: HERRAMIENTAS EFECTIVAS P ARA LA TRANSDUCCIÓN CELULAR

M.L. Negro 1,2, S.G. Ahmed 3, R.J. Yáñez-Muñoz 3, P.J. Díaz-Amarilla 4, L.

Barbeito 1, H. Peluffo 1,2 1Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo.

2Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de la República.

3School of Biological Sciences, Royal Holloway, University of London, UK. 4Laboratorio de Neurobiología Celular y Molecular, Instituto de Investigaciones

Biológicas Clemente Estable. Los vectores retrovirales derivados de lentivirus han evolucionado en los últimos años, siendo muy populares en su uso como mecanismos moleculares especializados para la introducción de transgenes tanto en células replicativas como postmitóticas. Los lentivectores derivados de HIV1 son capaces de mediar la expresión in vivo a largo plazo en diversos órganos y tejidos. Cuando son pseudotipados con la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV-G) son capaces de transducir un amplio rango de células incluyendo neuronas adultas y células gliales del sistema nervioso central. Estos vectores poseen la capacidad de introducir secuencias de gran tamaño, de entre 10 y 12 kb, siendo su expresión estable debido a la inserción preferencial en sitios activos del genoma. Debido a la mutagénesis insertional que puede producirse, se han desarrollado vectores lentivirales no integrativos. Aquí analizamos diferentes protocolos de producción de vectores lentivirales de tercera generación con el objetivo de aumentar el título obtenido. Analizamos el efecto de la cafeína y de complementos lipídicos sobre el título obtenido. Además, analizamos la eficiencia de estos vectores (ya sea integrativos como no integrativos) para transducir diferentes tipos celulares del sistema nervioso tales como motoneuronas y glias, así como su capacidad para generar líneas que expresen establemente un transgén. En conclusión, hemos logrado producir vectores lentivirales de tercera generación así como evaluar su eficiencia de transducción en células en cultivo. Finalmente, logramos generar a partir de una línea de células derivadas de astrocitos (Aba) una nueva línea de células Aba que expresa establemente GFP.

26) REGULACIÓN DE LA RUTA DE SÍNTESIS DE VALINA EN Synechocystis sp. PCC 6803 PARA PRODUCCIÓN DE BIOBUTANOL DE

TERCERA GENERACIÓN. A. Peri 1, V. Amarelle, I. Loaces, C. Rodriguez, F. Noya.

1Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbianas, IIBCE. adperi@gmail.com

La producción de biocombustibles ha tomado relevancia en los últimos años, basado en la necesidad de buscar alternativas a los combustibles derivados de petróleo. Dentro de los alcoholes propuestos como sustitutos, se encuentra el butanol, que presenta la ventaja de alcanzar un 95% de rendimiento que el mismo volumen de gasolina. Las cianobacterias son microorganismos atractivos para producción de biocombustibles porque mezclan la facilidad de manipulación genética de los organismos procariotas con la actividad fotosintética de las plantas. De todas las especies, Synechocystis sp. PCC 6803 es la más caracterizada, y más elegida en estudios de genética y metabolismo en cianobacterias. El objetivo de este trabajo se basa en la transformación de Synechocystis sp. PCC 6803, para producción de isobutanol, utilizando la vía de síntesis del aminoácido Valina. El 2-cetovalerato es el precursor final de valina, en un paso catalizado por la enzima IlvE. Este cetoácido también puede ser convertido a butanal por una descarboxilasa específica de cetoácidos, KivD, esta enzima es común encontrarla en el genoma de Lactococcus lactis, organismo del cual se aisló. La estrategia propuesta es la mutación del gen IlvE y posterior transformación de Synechocystis sp. PCC 6803 con kivD, para de esta forma redirigir una vía metabólica propia del microorganismo en una nueva vía de producción de aldehído. El aldehído producido puede ser convertido en butanol, por medio de deshidrogenasas presentes en levaduras, obteniéndose de esta forma una energía renovable de bajo costo, a partir de un microorganismo con mínimas exigencias nutricionales.

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MICROORGANISMOS (27-48)

27) USO DE Pseudomonas fluorescens ααααC119 PARA MEJORAR LA IMPLANTACIÓN DE LA ALFALFA

L. Braga 1, M.L. Yanes 1, N. Altier 2 y A. Arias 1

1 Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable. Montevideo, Uruguay; 2 Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria. Las Brujas,

Uruguay.

Las enfermedades de implantación son un factor limitante en el mantenimiento de alfalfares productivos. El biocontrol mediante Pseudomonas fluorescentes puede estimular el crecimiento de las plantas y/o disminuir el daño provocado por patógenos favoreciendo la implantación del cultivo. La cepa nativa P. fluorescens αC119, aislada de rizósfera de alfalfa, produce metabolitos antifúngicos, protege la alfalfa contra el damping-off causado por Pythium debaryanum y promueve su crecimiento en condiciones controladas. Nuestros objetivos son evaluar el efecto biocontrolador y promotor del crecimiento de la cepa αC119 sobre la alfalfa en condiciones de campo y el impacto de su inoculación sobre la comunidad bacteriana de la rizósfera de alfalfa. Se realizó un ensayo de campo en el cual las semillas de alfalfa fueron co-inoculadas con la cepa de P. fluorescens y rizobio comercial. Se evaluó implantación a los 15, 60 y 100 días, y biomasa aérea a los 150 días post-siembra. Se determinará la capacidad colonizadora de la raíz por la cepa αC119, mediante recuentos en placa a partir de rizósfera de alfalfa colectada a los 15, 60 y 100 días post siembra. El impacto sobre la comunidad bacteriana de la raíz de alfalfa se determinará mediante DGGE (Denaturing Gradient Gel electrophoresis) del ADNr 16S amplificado por PCR a partir del ADN total extraído de la rizósfera de plantas inoculadas con los dos tratamientos mencionados. Estos resultados contribuirán al desarrollo de un producto biotecnológico basado en una cepa nativa la cual aportará una herramienta más para el desarrollo de sistemas agrícolas sustentables.

28) CONSTRUCCIÓN DE UNA MUTANTE CARENTE DE BACTERIOFERRITINA EN Sinorhizobium meliloti 1021.

D. Costa 1, V. Amarelle 1 y E. Fabiano 1

1 Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana. IIBCE-MEC. Av.Italia 3318 Montevideo. dcostaduarte@hotmail.com

Este trabajo tiene como objetivo estudiar el rol de la bacterioferritina (Bfr) en S. meliloti 1021. El hierro es un elemento esencial en múltiples reacciones bioquímicas incluyendo la fijación biológica del nitrógeno. Si bien, debe estar presente en el interior celular, cuando éste se acumula en su forma libre produce efectos tóxicos relacionados a la generación de especies reactivas del oxígeno. Se ha propuesto que las ferritinas cumplen el papel de secuestrar hierro intracelular y evitar el estrés oxidativo causado por un exceso de hierro, aunque también podrían actuar como fuentes de hierro intracelular, cuando la disponibilidad del metal es limitante. La Bfr es una proteína de almacenamiento de hierro compuesta por 24 subunidades iguales o diferentes que forman una cáscara esférica en cuyo interior se almacena hierro. Para lograr el objetivo propuesto se realizó la construcción de mutantes carentes en bacterioferritina, mediante una deleción in frame y mediante la inserción del cassette reportero lacZGmR. Además se construyó una doble mutante que carece además de IRR, el regulador central de la homeostasis del hierro en S. meliloti 1021. La verificación de las mutaciones obtenidas se realizará mediante Southern blot con una sonda que hibrida en una región del gen bfr. Para conocer el fenotipo de las mutantes se realizarán ensayos de expresión y curvas de crecimiento bajo diferentes condiciones de cultivo (limitante y suficiente en hierro), además de estudios in planta en los que se evaluará el rol de la Bfr en la simbiosis con la planta hospedera alfalfa.

29) CARACTERIZACION DE INTEGRONES EN AISLAMIENTOS D E Delfia sp. RESISTENTES A METALES PESADOS Y ANTIBIOTICOS

F. Sueiro 1, 2, C. Martínez-Rosales 1, 2, M. Morel 2, M. Ubalde 2, C. Marquez 3, S.

Castro-Sowinski 1, 2

1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2Unidad de Micr obiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable; 3Cátedra

de Microbiología, Facultad de Química (UdelaR). Los integrones son sistemas de capturar de casettes de genes exógenos por recombinación sitio específica. Se caracterizan por codificar para una integrasa (intI), un sitio de recombinación especifico (attI) y un promotor asociado que dirige la expresión de los cassettes. En general contienen genes que codifican para la resistencia a antibióticos y metales pesados (MP), y están implicados en los procesos de transferencia horizontal de genes. El objetivo de esta investigación fue caracterizar en tres aislamientos de Delftia sp. (JD2, 3C y 6C): i) la resistencia a cromo [Cr(VI)] y plomo [Pb(II)]; ii) la resistencia a antibióticos y; iii) la presencia de integrones (tipo I, II y III). Los tres aislamientos fueron resistentes a ambos metales, determinado en curvas de crecimiento en medio líquido conteniendo altas concentraciones de estos MP. Además, fueron resistentes a antibióticos relacionados con la inhibición de la síntesis de proteínas, pared celular y, síntesis de ADN y ARN (determinado por MIC). Se comprobó la presencia de integrones tipo I por PCR utilizando cebadores específicos, secuenciación de los fragmentos de amplificación y análisis de secuencias en las bases de datos de la NCBI. Se utilizó también cebadores dirigidos a las secuencias attI para el análisis de los cassetes de genes integrados. Se encontró un bandeo similar para 3C y 6C (ambos aislados de un suelo contaminado con Pb) y diferente para JD2 (aislado de un suelo contaminado con Cr). Actualmente estamos caracterizando los fragmentos de amplificación de cassettes de 3C. Los autores agradecen a PEDECIBA.

30) CARACTERIZACION GENETICA DEL VIRUS DE LA ENFERM EDAD DE GUMBORO: ESTUDIOS COMPARATIVOS DEL GEN VP1

F. Ferrara 1, R. Pérez1, G. Tomás 1, D. Hernández 1 y M. Hernández 1

1 Sección Genética Evolutiva, Departamento Biología Animal, Facultad de Ciencias (UDELAR)

El Virus de Gumboro (IBDV) es el causante de una enfermedad que afecta aves de corta edad produciendo importantes pérdidas económicas en la industria avícola mundial. IBDV se replica en la bursa de Fabricius, donde destruye linfocitos B inmaduros. Genera daño masivo e inmunodepresión, causando infecciones secundarias por agentes oportunistas y una pobre respuesta a vacunas. IBDV pertenece a la familia Birnaviridae, que se caracteriza por estar compuesta por virus con genoma de ARN doble hebra bisegmentado. El segmento mayor A codifica para una poliproteina que por autoproteolisis genera las proteínas estructurales VP2 y VP3, la proteasa viral VP4 y la proteína no estructural VP5. El segmento más pequeño B, codifica para la proteína viral VP1, responsable de la replicación del genoma, síntesis de ARNm e involucrada en la patogénesis. La región hipervariable de VP2, es la más utilizada para clasificar IBDV en cepas clásicas, variantes e hipervirulentas. Sin embargo, luego de la identificación de virus con reordenamientos genómicos y el descubrimiento de que ambos segmentos están involucrados en la patogénesis, es necesario el estudio de ambos segmentos para proveer pistas sobre el origen, diversidad y epidemiologia de IBDV. En este trabajo se logró la amplificación del gen vp1 en cepas de campo clásicas e hipervirulentas. Con las secuencias obtenidas se desarrolló un análisis comparativo con el fin de encontrar marcadores genéticos e información que nos permita un mejor entendimiento de la incidencia del gen vp1 en la biología de IBDV.

31) ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE PARÁLOGO DEL GEN TRANSPORTADOR DE UREA (UreA) DE Aspergillus nidulans

L. Carrau , M. Sanguinetti, A. Ramón

Sección Bioquímica, Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

UreA ha sido identificada y caracterizada como un transportador de urea de Aspergillus nidulans. A partir de la secuencia del ésta y haciendo una búsqueda en el genoma de A. nidulans, se encontraron tres parálogos de este gen, llamados ANID_02598.1, ANID_07373.1 y ANID_07557.1 que no transportan urea. Es posible que los mismos codifiquen para transportadores de especificidad desconocida. El objetivo de este trabajo es determinar si estos parálogos se expresan o no bajo determinadas condiciones cuidadosamente seleccionadas. Estas fueron: condiciones de no represión, ausencia de nitrógeno y fase isotrópica de crecimiento. El estudio de expresión se realizó mediante RT-PCR (transcripción reversa–PCR) con primers específicos diseñados para amplificar los distintos parálogos. De estos ensayos se obtuvieron resultados preliminares que mostraron que ninguno de los tres genes se expresa, al menos bajo las condiciones mencionadas. Con la finalidad de profundizar en nuestro estudio, decidimos como siguiente estrategia realizar una deleción del gen de uno de los tres parálogos, el ANID_02598.1. Para esto se realizó una construcción génica mediante la técnica de fusion-PCR, que contiene los extremos 5’ y 3’ del gen ANID_02598.1 y entre estos el gen pabaA como marcador auxotrófico. Esta construcción será introducida en una cepa wt pabaA1, seleccionándose aquellas cepas capaces de crecer en un medio carente de ácido p-aminobenzoico (paba). Para los transformantes para los que se compruebe la deleción del gen, se realizarán ensayos de crecimiento en placa utilizando como fuente de nitrógeno distintos compuestos nitrogenados, procurando así determinar los posibles sustratos de ANID_02598.1.

32) CARACTERIZACIÓN DE LA GLUTARREDOXINA MONOTIÓLIC A 1 DE Trypanosoma cruzi.

A. L. Fleitas 1, B. Manta 1, A. Medeiros 1, G. Ferrer Sueta 2, N. Dirdjaja 3, M. A.

Comini 1. 1. Laboratorio de Biología redox de tripanosomas, Institut Pasteur de

Montevideo, Uruguay; 2. Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay; 3. Centro de Bioquímica, Universidad de Heidelberg, Alemania.

El tratamiento de la tripanosomiasis americana es limitado dada la inexistencia de vacunas y a que la quimioterapia actual resulta tóxica e ineficaz. El estudio de rutas metabólicas relevantes para la infectividad y patogénesis puede contribuir a mejorar esta situación. En este sentido, hemos demostrado que la glutaredoxina monotiólica 1 de T.brucei (1-C-Grx1) es una proteína mitocondrial capaz de coordinar centros ferro-sulfurados (ISC) utilizando la cisteína de su sitio activo putativo y tioles de bajo peso molecular (RSH). Esta proteína probablemente desempeña un rol conservado en el ensamblaje de ISCs o en la entrega de estos cofactores a sus aceptores, siendo importante en el metabolismo del hierro e, indirectamente, en la homeostasis redox. Su función es fundamental para la diferenciación del parásito y la supervivencia en el huésped mamífero presentando asimismo divergencias estructurales y bioquímicas que la posicionan como posible blanco terapéutico. El objetivo de nuestro trabajo es estudiar la proteína homóloga de T.cruzi, procurando revelar su papel fisiológico. La secuencia codificante de la 1-C-Grx1 fue aislada de ADN genómico de T.cruzi cepa Tulahen. La forma recombinante de la proteína sobreexpresada en E.coli fue purificada y caracterizada bioquímicamente mediante cromatografía de exclusión molecular, dispersión dinámica de luz y técnicas espectroscópicas. Al igual que Tb 1-C-Grx1, Tc 1-C-Grx1 es una proteína dimérica que une ISCs sin cambiar su estructura cuaternaria. La eliminación de una extensión N-terminal sólo conservada entre 1-C-Grx1 de tripanosomátidos convirtió la apo-proteína en una especie monomérica. Los resultados serán discutidos considerando lo sabido sobre estas glutarredoxias al momento.

33) OPTIMIZACIÓN DE RT-PCR PARA LA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL VIRUS DE INFLUENZA CIRCULANTE EN URUG UAY

DURANTE LA TEMPORADA INVERNAL 2011

M. Sóñora 1, V. Comas 1, N. Goñi 1, G Moratorio 1, M. Cappetta 2, R. Uriarte 2, S. Boschi 2, J. Cristina 1, P. Moreno 1

1Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Laboratorio de Biología Molecular,

Asociación Española Primera de Socorros Mutuos.

La sorpresiva aparición de una variante del virus influenza A/H1N1 en abril del 2009 condujo a declarar la inminente llegada de la primer pandemia del siglo XXI y con esto la urgencia por resolver dicho problema. Este trabajo busca mediante el análisis filogenético de las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) establecer relaciones genéticas y antigénicas entre estirpes virales circulantes en nuestro país durante la temporada invernal 2011. Para ello se realizarán análisis comparativos contra las estirpes circulantes en la región para esta misma temporada, así como con las estirpes incluidas en la vacuna recomendada por la OMS. Con este fin se planteó la necesidad de desarrollar y optimizar una RT-PCR que permita la amplificación de los genes NA y HA de los virus de Influenza A (VIA) H1N1, H3N2 y del virus de Influenza B. Mediante esta metodología podremos secuenciar las estirpes de VIA circulantes en Uruguay en dicha temporada. Una vez optimizada esta técnica se realizará el estudio de exudados nasales de pacientes uruguayos con síntomas clínicos de influenza, provenientes de la Asociación Española Primera de Socorros Mutuos (AESPM). A través del análisis filogenético de las secuencias obtenidas, y las reportadas en el banco de datos, se determinarán las relaciones filogenéticas de interés. La vigilancia mundial de la Influenza es esencial para brindar información sobre cepas circulantes, ya que su rápida identificación durante la temporada invernal provee valiosa información a las autoridades de salud pública y posibilita una vacunación apropiada y tratamiento profiláctico para grupos de alto riesgo.

34) PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN PÉPTIDO AN TIFÚNGICO PRODUCIDO POR LA CEPA Pseudomonas fluorescens CFBP2392

N. Riera, 1, N. Bajsa 1,2, A. Arias 1

1Laboratorio de Ecología Microbiana, IIBCE; 2Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR)

El control biológico es una práctica agrícola que se basa en introducir microorganismos vivos para controlar patógenos que afectan el crecimiento vegetal. La cepa Pseudomonas fluorescens CFBP2392 tiene actividad como agente de biocontrol suprimiendo la enfermedad “root rot” inducida por Rhizoctonia solani en tomate. Estudios anteriores muestran que esta bacteria no produce ninguno de los antibióticos más caracterizados dentro del género Pseudomonas. El objetivo de este trabajo es purificar y caracterizar un nuevo metabolito con actividad antifúngica producido por esta cepa. Se eligió un organismo blanco para comprobar la actividad antagonista del metabolito mediante ensayos de antagonismo in vitro de Pseudomonas fluorescens contra diferentes microorganismos. La mayor actividad inhibitoria se observó contra un aislamiento de Rhizoctonia solani AG3. Se seleccionó un medio de cultivo apropiado para maximizar la síntesis del compuesto, comparando la actividad inhibitoria en varios medios sintéticos. Se comprobó una mayor actividad en un medio mínimo para Pseudomonas con casaminoácidos y triptófano. Se evaluó un protocolo para la purificación del compuesto. Mediante extracción con acetato de etilo y cromatografía en capa fina (TLC) se identificó una fracción con actividad antifúngica. Actualmente se está ajustando su separación por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para lograr una pureza adecuada para su análisis espectroscópico. Hoy en día se hace particularmente importante la identificación y el registro de nuevos antibióticos tanto para la industria agrícola como clínica. Estos compuestos apuntan a una mejora en el sector ambiental ya que pueden ser utilizados como una alternativa al uso de fungicidas químicos.

35) PRIMER ANÁLISIS Y CARACTERIZACIÓN DEL GENOMA CO MPLETO DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA OBTENIDO A PARTIR D E UN

LINFOSARCOMA

S. Fischer 1, 2, S. Bianchi 1, 3, G. Rama1, L. Tome 1, 4, 5, G. Obal 1, 5, F. Carrión 1, J. Cristina 1, O. Pritsch 1, 5, G. Moratorio 1, 2

1 Unidad de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay; 2 Laboratorio de Virología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la

República, Uruguay; 3 Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay; 4 Sección Virología, Facultad de

Ciencias, Universidad de la República, Uruguay; 5 Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay.

El Virus de la Leucosis Bovina (VLB), pertenece a la familia Retroviridae y al género Deltaretrovirus. Dicho virus es responsable de la enfermedad conocida como Leucosis Bovina Enzootica (LBE). Ésta se manifiesta en tres formas clínicas posibles: a) Asintomática; b) Linfocitosis Persistente (LP), con elevados niveles de células B no malignas y c) Linfosarcoma. Su estudio es de gran relevancia para los sectores agropecuarios y agroindustriales del Uruguay ya que compromete mercados importantes de exportación. Además, la inexistencia de programas de control de la enfermedad ha dado lugar a una elevada prevalencia de VLB en la actualidad. El análisis y estudio del genoma viral de VLB es de fundamental importancia para entender la patogenia de la enfermedad causada por este agente etiológico. Actualmente existe escasa información disponible sobre genomas completos de VLB, y de estos, ninguno ha sido reportado a partir de la manifestación clínica linfosarcoma. Para contribuir al conocimiento de la Leucosis Bovina, el presente trabajo tiene como objetivo principal la optimización y puesta a punto de las técnicas moleculares, que permitan la amplificación y clonación del genoma completo del virus obtenido a partir de un linfosarcoma. Posteriormente, se realizó el secuenciamiento completo y diversos análisis bioinformáticos, como alineamientos de las secuencias aminoacídicas de las proteínas virales, estudios de análisis de estructuras secundarias a lo largo del genoma viral y de regiones no codificantes del mismo. Con el presente trabajo, intentamos también acercarnos a responder cuánto puede influir la genética viral en la manifestación clínica tumoral de la enfermedad.

36) DESARROLLO DE UNA ESTRATEGIA PARA EL ANALISIS D E GENOMAS COMPLETOS DEL VIRUS INFLUENZA A/H1N1 PANDE MICO

CIRCULANTE EN URUGUAY EN EL AÑO 2009

V.Comas 1, M.Soñora 1, P.Moreno 1, 3, G.Moratorio 1, 2, J.Cristina 1, N.Goñi 1 1Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares (CIN), Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Unidad de Biofísica de Proteínas,

Instituto Pasteur de Montevideo; 3Unidad de Proteínas Recombinantes, Instituto Pasteur de Montevideo.

El virus de la influenza A (VIA) pertenece a la familia Orthomyxoviridae y contiene un genoma de ARN constituido por ocho segmentos. Dentro de los VIA existen diferentes subtipos que se clasifican de acuerdo a las glicoproteínas de superficie: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). Cambios frecuentes en estas proteínas constituyen la base de las epidemias y pandemias. En marzo 2009 surgió un nuevo VIA pandémico H1N1 de origen porcino. Su genoma es producto de una combinación de segmentos provenientes de cerdos y aves de Norteamérica, de humanos y de cerdos de Eurasia. Los objetivos de este trabajo son desarrollar un método para obtener genomas completos de estas cepas y determinar el grado de variabilidad de las mismas. Actualmente hemos optimizado los genes HA, NA, matriz (M) y no estructural (NS) de tres muestras de VIA subtipo H1N1 pandémicas que circularon en 2009 en Uruguay. Para realizar este objetivo se amplificó la carga viral de estas muestras mediante el pasaje por cultivos celulares y posteriormente se realizó la extracción de RNA y la RT-PCR para estos 4 genes utilizando cebadores previamente diseñados. Con las secuencias obtenidas se identificará el modelo evolutivo que mejor describa nuestros datos y construirá árboles filogenéticos. El conocimiento del genoma completo de VIA nos proporcionará información de los procesos epidemiológicos, de qué manera ocurren, migran, co-circulan y se reordenan cepas circulantes permitiendo la formulación de mejores vacunas para nuestro país y la región, siendo las cepas H1N1 pandémicas posibles futuras cepas vacunales.

37) PREDICCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE EXCRECIÓN EN RESPUESTA A LA TOXICIDAD POR AMONIO EN S. cerevisiae

M. San Román 1, M. Ponce de León 1, H. Cancela 2 y L. Acerenza 1

1 Laboratorio de Biología de Sistemas, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, msanroman@fcien.edu.uy, mponce@fcien.edu.uy,

aceren@fcien.edu.uy; 2 Instituto de Computación, Facultad de Ingeniería, Universidad de la República,

cancela@fing.edu.uy

Una herramienta fundamental de la Biología de Sistemas para el estudio del funcionamiento celular son las redes metabólicas reconstruidas a escala genómica. Estas redes contienen la lista de todas las reacciones que pueden tener lugar en un organismo particular, en diferentes condiciones. La red metabólica se puede emplear, por ejemplo, para calcular como responde la tasa de crecimiento y el patrón de productos de excreción a la variación en la composición del medio. Distintas estrategias de modelización, como el Análisis de Balance de Flujo (FBA) o la Minimización de los Ajustes Metabólicos (MOMA), son empleados con este fin. FBA consiste en maximizar la tasa de crecimiento, sujeto a un conjunto de restricciones que aseguran una distribución de flujos estacionarios y acotados. MOMA, en lugar de maximizar crecimiento, minimiza la distancia a un punto de referencia, sujeto al mismo conjunto de restricciones que FBA. El amonio ha sido reportado como inhibidor del crecimiento celular. Aquí, empleamos FBA y MOMA para calcular como responde la red de S. cerevisiae a cantidades crecientes de amonio en el medio. Ambos procedimientos predicen correctamente que, en el rango tóxico, la tasa de crecimiento decrece con el aumento de la concentración de amonio. El nitrógeno sobrante se elimina excretando compuestos nitrogenados, principalmente aminoácidos. FBA predice la excreción de uno y MOMA de 15 aminoácidos. De los 14 aminoácidos cuya excreción se ha medido experimentalmente, 10 coinciden con los predichos por MOMA. La excreción de aminoácidos parecería ser el principal mecanismo de detoxificación usado por la levadura.

38) Expresión diferencial de macromoléculas a baja temperatura en la bacteria antártica Pseudomonas sp. AU10

C. Martínez Rosales 1,2, N. Fullana 1, M. Señorale 1, M. Morel 2, M. Dardanelli 3,

y S. -Sowinski 1,2. 1 Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR, Igual 4225, Montevideo-

Uruguay; 2 Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE, Av. Italia 3318, Montevideo-Uruguay; 3 Departamento de Biología Molecular, Universidad

Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto, Argentina s.castro.sow@gmail.com

Las bajas temperaturas imponen un desafío al desarrollo de la vida, ya que afectan varios procesos fisiológicos celulares, llegando a disminuir el metabolismo general, e incluso a provocar daños en la célula debidos a la formación de hielo intracelular. La vida en ese tipo de ambientes requiere que los microorganismos diferentes estrategias fisiológicas, que involucran la producción de ciertas macromoléculas dependiendo de la temperatura ambiental. Estas macromoléculas cumplen roles importantes cuando las bacterias crecen a bajas temperaturas, y nos acercan a comprender los mecanismos de adaptación bacteriana al frío. El objetivo de este trabajo fue estudiar la producción de macromoléculas a dos temperaturas, y así contribuir al conocimiento general de los mecanismos involucrados en la adaptación al frío en bacterias. Describimos la identificación de proteínas intracelulares que se expresan diferencialmente a bajas temperaturas, y la caracterización de lípidos y exopolisacáridos (EPS) producidos a 4ºC y 30ºC, en la bacteria antártica Pseudomonas sp. AU10. La composición de lípidos y EPS se analizó mediante CG-EM. La expresión de proteínas se estudió mediante electroforesis 2D de dos fracciones celulares (membrana externa/periplasma, y membrana interna/citoplasma), y se identificaron las proteínas expresadas diferencialmente a 4ºC mediante MALDI/ToF. Se detectaron diferencias en EPS y lípidos, sugiriendo que estas macromoléculas participan de alguna manera en la adaptación al frío, probablemente como crioprotectores. Además, varias proteínas relacionadas a los procesos de transcripción, traducción, metabolismo, y transporte de solutos se expresaron diferencialmente a 4ºC. Agradecemos el apoyo financiero de ANII, PEDECIBA, y el apoyo logístico del IAU.

39) DETECCION DE METALO-β-LACTAMASAS EN TRES CENTROS ASISTENCIALES DE MONTEVIDEO

Bado I 1- Gutierrez C 2, Rodriguez M 3, Batista M 1,3, García V 1, Cordeiro N 1,

Robino L 1, Valeta I 3, Palacio R 2,Seija V 4,Vignoli R 1. 1Instituto de Higiene, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Hospital de

Clínicas, Facultad de Medicina (UDELAR); 3C.U.D.A.M; 4Hospital Pasteur; Antecedentes: Uno de los principales mecanismos de resistencia a los β-lactámicos, antibióticos muy utilizados a nivel clínico, es la producción de β-lactamasas, enzimas capaces de hidrolizarlos. Estas pueden clasificarse en: A, B, C y D, siendo las de clase B las únicas que contienen en su centro activo 2Zn+2 (metalo-β-lactamasas). Su importancia, radica en su acción sobre los carbapenems, antibióticos de amplio espectro, utilizados sobre microorganismos altamente resistentes. Objetivos: Detectar la presencia de metalo-β-lactamasas en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa provenientes de tres centros hospitalarios. Metodología: a 113 aislamientos clínicos de P. aeruginosa, se les realizó test de screening para metalo-β-lactamasas, mediante disco difusión, con discos de EDTA, imipenem y meropenem. A los microorganismos positivos, se les hizo PCR para la detección de metalo-β-lactamasas, confirmando los resultados mediante secuenciación. Resultados: cuatro aislamientos provenientes de los tres centros fueron positivos para el test de sinergia, tres de ellos correspondieron a blaVIM-2, y eran positivos para integrones de clase 1; mientras que el cuarto caso continúa siendo estudiado. Conclusión: Este es el primer reporte de blaVIM-

2 en distintos centros hospitalarios, sin embargo, se trataría de aislamientos esporádicos. Todavía no se ha podido determinar que tipo de enzima posee el cuarto caso, claramente poseedor de una metalo-β-enzima por el test de sinergia. Las carbapenemasas se encuentran ampliamente distribuidas a nivel mundial, llegando algunas a ser endémicas en el ambiente hospitalario, dificultando su control una vez instaladas. Es fundamental llevar a cabo sistemas de vigilancia para evitar su diseminación.

40) PRESENCIA DE INTEGRONES EN BACTERIAS AISLADAS DE SUELOS DE LA PENÍNSULA FILDES, ISLA REY JORGE (ANTÁ RTIDA

MARÍTIMA)

V. Antelo 1, A.M. Guérout 2, S.Batista 1, D. Mazel2

1 Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE; 2 Unidad de Plasticidad del Genoma Bacteriano, Departamento de Genomas y Genética, Instituto Pasteur

de París.

La transferencia horizontal de genes es reconocida como un mecanismo de distribución generalizada de resistencia a antibióticos en bacterias. Los microorganismos aislados de ambientes ”extremos” han sido poco estudiados en lo que refiere a la presencia de genes de resistencia y su incorporación en elementos denominados integrones. El objetivo del trabajo es el estudio de integrones y elementos genéticos asociados, en una colección de bacterias resistentes a distintos antibióticos obtenidas a partir de muestras colectadas en la Isla Rey Jorge. Las muestras fueron tomadas en distintos sitios de la Península Fildes, durante las campañas antárticas estivales del 2008 y 2010. Las muestras suspendidas en buffer fueron utilizadas para inocular frascos con medio LB, que se incubaron a 5°C y 22°C con agitaci ón. Se obtuvo una colección de 200 aislamientos presuntamente puros y se determinó el perfil de resistencia antibiótica para cada uno de ellos. Al usar como templado el ADN

genómico de los aislamientos resistentes a trimetoprim (Tmr) se logró amplificar por PCR un producto del tamaño esperado usando cebadores para

el gen intI1 (integrasa1). A partir de seis aislamientos (Tmr) se purificó un plásmido y se analizó la secuencia de parte del gen intI1 y dfrA14 (dihidrofolato-reductasa). El análisis de secuencia del gen 16S ADNr indicó que

estos aislamiento (Tmr) pertenecen al género Enterobacter (99%). Seis de los aislamientos poseen plásmidos conteniendo genes intI1 y dfrA14 altamente conservados, siendo su organización genética similar a la del plásmido pKOX105 de Klebsiella oxytoca.

Financiamiento: IAU, ANII, PEDECIBA, AMSUD-Pasteur

41) DETECCIÓN DE CTX-M EN NIÑOS QUE SE ASISTEN EN EL CENTRO HOSPITALARIO PEREIRA ROSSELL

V.García 1, I.Bado 1, I.Mota 1,2, L.Robino 1, N.Cordeiro 1, A.Varela 2,

G.Algorta 1,2, R.Vignoli 1 1Depto. de Bacteriología y Virología, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Centro

Hospitalario Pereira Rossell (CHPR)

Introducción La resistencia antimicrobiana en enterobacterias es un fenómeno creciente a nivel hospitalario, siendo oxiiminocefalosporinas, aminoglucósidos, y fluoroquinolonas los antibióticos más utilizados. Los principales mecanismos transferibles de resistencia involucrados son: la producción de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE); la enzima Aac(6’)Ib; las proteínas Qnr y la enzima Aac(6’)Ib-cr, respectivamente. Objetivos Conocer la proporción de CTX-M y su asociación con mecanismos transferibles de resistencia a quinolonas (PMQR) en enterobacterias aisladas en el Laboratorio del Hospital Pediátrico Centro Hospitalario Pereira Rossell (HP-CHPR). Materiales y Métodos Se incluyeron todos los aislamientos de enterobacterias obtenidos en el HP-CHPR entre el 1/1-30/12 de 2010. El tamizaje para la detección de BLEE fue realizado según CLSI. A las cepas con sospecha de BLEE se les realizó PCR para: detección de blaCTX-M, aac(6´)Ib, su variante cr y qnrA, B, S, con posterior secuenciación. Resultados Se obtuvieron 30 cepas de enterobacterias portadoras de BLEE. Se detectó CTX-M en 16/30 aislamientos: K.pneumoniae (8), E.cloacae (4), E.coli (3), S.marcescens (1). Las más frecuentes fueron: CTX-M-15 (5), CTX-M-2 (5), CTX-M-9 (5), seguido por CTX-M-8 (1). En 4 casos se encontró qnrA asociado a blaCTX-M-9 y en 3 casos qnrB1 y aac(6´)Ib-cr asociados a blaCTX-M-15. No se vió asociación de blaCTX-M-2 a PMQR. Conclusiones Se detectaron distintos tipos de CTX-M en enterobacterias aisladas en el HP-CHPR. El arribo de BLEEs, distintas a CTX-M-2, se asoció a la llegada de nuevos PMQR. En este sentido, el uso de oxiiminocefalosporinas puede llevar a una co-selección de genes qnr y aac(6’)Ib-cr.

42) DIVERSIFICACIÓN, TASAS EVOLUTIVAS Y DINÁMICA PO BLACIONAL DEL GENOTIPO III DEL VIRUS DENGUE 3 EN VENEZUELA.

A. Fajardo 1, A. Ramírez 2, R. Recarey 1, Z. Moros 2, G. Caraballo 2, G.

Moratorio 1, F. Liprandi 2, y J. Cristina 1. 1Laboratorio de Biología de Virus. Centro de Microbiología y Biología Celular. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela; 2Laboratorio de Virología Molecular. Centro de Investigaciones Nucleares. Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay. El virus Dengue (DENV) pertenece al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae. Comprende 4 serotipos relacionados antigénicamente, Dengue 1 a Dengue 4 (DENV-1 a DENV-4), que se dividen en diferentes genotipos, y son transmitidos al humano principalmente por el mosquito Aedes aegypti. En la actualidad existe una dramática emergencia del genotipo III de DENV-3 en las Américas. Sin embargo, nuestro conocimiento de las fuerzas evolutivas que subyacen a la evolución de este genotipo es aún incompleto. El objetivo del presente estudio fue investigar el grado de variabilidad genética, las tasas y patrones evolutivos de este genotipo en Venezuela. Para ello, procedimos al análisis de un gran número de secuencias (n = 116) del gen de la Envoltura viral (E) de variantes Venezolanas del genotipo III de DENV-3, aisladas entre 2001 y 2008. Los análisis filogenéticos revelaron una evolución in situ de este genotipo desde su introducción a América Latina, observándose 3 grupos genéticos distintos (A a C). Asimismo, se observó la co-circulación de cepas de diferentes clados genéticos en Venezuela. Esto revela al menos 3 eventos de introducción de cepas del genotipo III de DENV-3 en este país. Por otra parte, los análisis bayesianos de coalescencia revelaron una tasa evolutiva de 9,1 x 10-4 sustituciones/sitio/año (s/s/a) para las cepas del clado A, compuesto exclusivamente por cepas de Venezuela. Esta tasa es comparativamente más alta que las reportadas para otros serotipos, lo que se relaciona con la elevada capacidad patogénica de este genotipo particular.

43) ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS: ESTUDIO DE LA S ÍNTESIS DE POLIHIDROXIBUTIRATO POR HERBASPIRILLUM SEROPEDICAE

A.I. Catalán 1, K. Malán 1, G. Martínez 2, V. Saravia 2, M. Rodriguez 3, F.

Ferreira 3, S. Batista 1 1Unidad Microbiología Molecular, IIBCE; 2Depto. Bioingeniería, Facultad de

Ingeniería (UDELAR); 3Lab.Carbohidratos y Glicoconjugados, Depto. de Química Orgánica, Facultad de Química (UDELAR)

El poli-3-hidroxibutirato (PHB) es un poliéster de la familia de los polihidroxialcanoatos (PHAs). Algunos microorganismos acumulan PHB como reserva de carbono. Parte del interés en los PHAs radica en sus propiedades termoplásticas, biodegradabilidad y biocompatibilidad [1]. Los PHAs son más costosos que los plásticos convencionales y se investigan distintas estrategias para abaratarlos. La fuente carbonada es el factor que más contribuye en el costo, por lo que se ha estudiado el uso de sustratos carbonados económicos y el incremento del rendimiento de transformación del sustrato carbonado en polímero. La especie Herbaspirillum seropedicae pertenece a la subclase β de Proteobacterias. Son organismos Gram-, aerobios y diazótrofos. La cepa Z69 de esta especie acumula PHB al ser cultivada en presencia de varios carbohidratos [2]. Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que la eficiencia de transformación de glucosa en polímero es bastante menor que la teórica. El análisis de flujos metabólicos (AFM) permite identificar los flujos que se expresan en una red metabólica y definir cambios para aumentar la producción del metabolito de interés [3]. El objetivo del trabajo es obtener un mapa metabólico de la cepa Z69 en condiciones de producción de PHB mediante el AFM. Se definió un modelo metabólico que incluye las vías de Entner-Doudoroff, pentosas fosfato, glioxilato y ciclo de Krebs, en base al genoma de la cepa SmR1 y datos bioquímicos obtenidos en nuestro laboratorio. Este modelo metabólico es ajustado de acuerdo a los datos experimentales obtenidos con la cepa Z69 crecida en presencia de glucosa. Bibliografía [1] L. L. Madison, G. W. Huisman, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999, 63, 21-53. [2] A. I. Catalán, F. Ferreira, P. R. Gill, S. Batista, Enzyme Microb.Tech. 2007,

40, 1352-1357. [3] G. Stephanopoulos, Metabolic eng. 1999, 1, 1-11. Financiamiento: ANII-FSE-1-2009-46, PEDECIBA-Biología, CYTED-2009 P309RT0120 (PRIBOP)

44) ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DE LOS COMPLEJOS DE C OBRE, CASIOPEINAS® CON ADN Y SU ACTIVIDAD ANTI - Trypanosoma cruzi.

L. Becco 1, M. E. Bravo-Gómez 2, L. Ruiz Azuara 2, D. Gambino 3, B. Garat 1

[1] Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, UDELAR, Iguá 4225, 11400 Montevideo, Uruguay; [2] Facultad de Química, Departamento de Química Inorgánica y Nuclear, Universidad Nacional Autónoma de México,

México DF 04510, México; [3] Cátedra de Química Inorgánica, Facultad de Química, UDELAR, Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo, Uruguay.

Una serie de complejos de Cu(II) denominados en forma genérica CASIOPEINAS®, ha sorteado con éxito los estudios preclínicos, mostrando una actividad antineoplásica contundente sobre diferentes tipos de tumores (carcinoma de colon (HCT-15), glioma C6, adenocarcinoma mamario), baja toxicidad y genotoxicidad. Entre los múltiples mecanismos de acción posibles, se destaca la interacción con el ADN y la inducción de apoptosis. Actualmente, algunos de estos compuestos están ingresando a fase clínica como potenciales fármacos anticancerígenos. Con el fin de contribuir a dilucidar el mecanismo de acción de estos complejos se profundizó en el estudio de su interacción con ADN. Se encontró que las 7 Casiopeinas estudiadas, en mayor o menor grado degradan el ADN doble hebra. Algunos miembros parecen presentar una afinidad preferencial por secuencias ricas en IC. Asimismo la presencia de agentes reductores, como el ácido ascórbico, potencian el efecto degradativo mientras que agentes quelantes y scavenger de radicales lo disminuyen. Se vio además que la Distamicina A estaría potenciando la degradación. Por otra parte, muchos compuestos anticancerígenos presentan actividad contra el Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, por actuar a nivel del ADN. Por esto se testaron los efectos de las 3 Casiopeinas más activas sobre el crecimiento de T. cruzi (epimastigota) en cultivo, obteniéndose valores de IC50 comparables a los del fármaco antichagásico de referencia Nifurtimox. Agradecimientos: LB agradece a la ANII Uruguay por financiar la beca BE_INI_2010_1979. Los autores agradecen al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología en el Desarrollo (CYTED) red temática 209RT0380.

45) IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y GENES INVOLUCRADO S EN LA ACTIVIDAD DE LA SECUENCIA (dTdG)n EN Trypanosoma cruzi.

L. Guggeri 1, P. Smircich 1, L. Pastro 1, M.A. Duhagon 1, B. Garat 1

1 Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Las numerosas diferencias en los mecanismos de la regulación génica de los tripanosomátidos en relación a los eucariotas superiores, hacen que sean modelos excepcionales para estos estudios. En particular, las secuencias reguladoras que actúan en cis en los ácidos nucleicos están pobremente conservadas.

A partir de evidencia bioinformática y experimental postulamos que los repetidos de dinucleótidos (TG)n funcionan como elementos reguladores de la expresión génica en T. cruzi (Duhagon y col., 2003, 2011).

Este trabajo busca profundizar en el rol de los repetidos (TG)n en la regulación de la expresión génica en T. cruzi mediante dos estrategias Primero, una estrategia experimental para identificar los factores en trans que interaccionan con dicha secuencia. Para esto se realizó una purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando un oligonucleótido (dTdG)20 biotinilado. Cuatro de las siete proteínas identificadas presentan antecedentes en la literatura de unión a ácidos nucleicos (CYCA, MSR, PGFS, IMPDH, OXCT, Tc38, NDPK1). Aquí se presenta el progreso en el estudio de la nucleósido difosfato quinasa 1 (TcNDPK1), incluyendo ensayos in vitro utilizando la proteína recombinante para confirmar la unión específica con las secuencias (TG)n. Segundo, un enfoque bioinformático, se identificaron los genes que presentan repetidos (TG)n en el genoma de T. cruzi con el fin de determinar relaciones funcionales o estructurales entre ellos. Nuestros resultados indican que las proteínas pertenecientes a familias multigénicas se encuentran enriquecidas en repetidos (TG)n (i.e 85% de las MASP, 44% de las RHS).

M.A. Duhagon, P. Smircich, D. Forteza, H. Naya, N. Williams, B. Garat (2011) Gene. 2011 Nov 1;487(1):29-37. Publicación electrónica 2011 Jul 28.

M. A. Duhagon, B. Dallagiovanna, M. Ciganda, W. Ruychean, N. Williams, G. Garat, (2003) Biochemical and Biophysical Research Communications, volume 309 1, pages 183.

46) ANÁLISIS DE MUTACIONES DEL GEN FMR1 (CAUSANTE D EL SÍNDROME DE X-FRÁGIL) EN LA POBLACIÓN URUGUAYA

L. Pastro ; N. Pi-Denis; A. Tapié; V. Raggio; N. Curbelo; M. Boidi; L. Roche.

Departamento de Genética, Facultad de Medicina, (UdelaR). El SXF es la causa más frecuente de retardo mental hereditario, con una incidencia de 1:4000 varones y 1:6000 mujeres. El gen FMR1 contiene una secuencia repetida CGG altamente polimórfica en el 5´UTR. Las variantes descritas se pueden clasificar por su tamaño, los individuos normales poseen entre 5-45 repetidos, una “zona gris” entre 46-50 repetidos, mientras que los individuos portadores de una premutación poseen entre 51-200 repetidos, teniendo riesgo de expansión en la descendencia. Los individuos afectados poseen de más de 200 trinucleótidos. La expansión de los repetidos produce la metilación del promotor causando la inactivación del gen. En el marco de un proyecto clínico-molecular en niños con retardo mental, determinaremos el número de repetidos CGG de FRM1. Incluiremos pacientes con retardo mental que cumplan los criterios de Giangreco (J.Pediatr 1996) y pacientes con antecedentes de retardo mental ligado al X. Planteamos la puesta a punto de la técnica publicada por Tassone (J.Mol.Diagn 2008) para la determinación del número de repetidos por PCR. Ésta permite discriminar rápidamente varones normales, mujeres normales heterocigotas y algunas premutaciones. Para los casos indeterminados realizamos un segundo PCR con un cebador para los repetidos. Los productos se resuelven en geles de agarosa-I o de alta resolución 2% no desnaturalizantes. En paralelo, estamos implementando la utilización de cebadores marcados para determinar las expansiones mediante electroforesis capilar y/o agarosa. En los casos dudosos, complementaremos el estudio mediante southern blot y secuenciación. En este proyecto esperamos aportar nuevos datos de la prevalencia de la enfermedad en nuestro país.

47) DETECCIÓN DE LOS GENES DE LAS TOXINAS ALFA, BET A Y

ÉPSILON EN CEPAS DE Clostridium perfringens POR LA TÉCNICA DE PCR

M. Cattáneo 1,2, J. Bermúdez 1,2.

1 Área de Bacteriología, Departamento de Microbiología,

Facultad de Veterinaria (UdelaR), Uruguay; 2 Laboratorios de Investigación y Desarrollo. CCA. Laboratorios Santa Elena. Uruguay.

Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria anaeróbia causante de enterotoxemias y gangrenas gaseosas en los animales domésticos. C. perfringens se clasifica en 5 tipos: A, B, C y D; y mediante la producción de cuatro toxinas mayores: alfa, beta, épsilon e iota. Se han identificado dos toxinas nuevas que intervienen en la patogénesis de estas enfermedades, beta 2 y enterotoxina. El diagnóstico de estas enfermedades es complejo debido a la dificultad para el aislamiento del agente etiológico y para la tipificación de las toxinas. La identificación de toxinas clostridiales puede realizarce por ELISA, cultivo celular y seroneutralización en animales de laboratorio utilizando antisueros específicos, los cuales son adquiridos en centros de referencia internacionales. El objetivo de este trabajo fue poner a punto la técnica de PCR para identificar los genes que codifican para las toxinas alfa, beta y épsilon de C. perfringens. Para este trabajo su utilizaron cepas de referencia pertenecientes a nuestro Departamento. Se logró estandarizar la técnica de PCR para la identificación de los genes que codifican para las toxinas alfa, beta y épsilon. Esto nos permite tener una técnica específica y rápida para la identificación de toxinas clostridiales los que nos permitirá sustituir las técnicas serológicas utilizadas hasta ahora. Se continuará trabajando para identificar los genes de las toxinas iota, enterotoxina y beta 2, y padronización de la técnica de PCR multiplex para esta especie de Clostridium.

48) DETECCIÓN DE MUTACIONES DE RESISTENCIA AL PALIV IZUMAB EN AISLADOS DE VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL

N. Farina 1,2, S. Frabasile 1,3 y J. Arbiza 1,3.

1 Sección Virología, Facultad de Ciencias UdeLaR; 2 Becario de Agencia Nacional de Investigación e Innovación; 3 Investigador perteneciente al Sistema

Nacional de Investigadores Las infecciones respiratorias del tracto respiratorio bajo representan un problema significativo de salud mundial. El virus respiratorio sincitial (VRS) es el principal agente de infecciones respiratorias en lactantes y niños pequeños. Debido a la ausencia de una vacuna para contra VRS el tratamiento de estas infecciones se basa en el suministro de Palivizumab. El Palivizumab (PZ) es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra la proteína F de VRS. Existen escasos trabajos de vigilancia en la aparición de virus resistentes a PZ. Dada la importante tasa mutacional de este virus es esperable la generación de resistencia. El objetivo de este trabajo fue estudiar el gen de la proteína F de cepas de VRS correspondientes a años previos al uso de PZ y compararlas con muestras clínicas extraídas de niños tratados con PZ como profilaxis en busca de posibles mutaciones responsables de la resistencia a PZ.

Una cepa pre-PZ correspondiente al año 1996, reveló una mutación en la posición 814 del gen de la proteína F, está mutación fue reportada como mutación de resistencia al PZ y se aisló a partir de una muestra clínica. En cuanto a las demás posiciones del gen en las cuales se reportaron mutaciones de resistencia, no se encontraron cambios en las cepas estudiadas.

Las cepas post-PZ mostraron ser negativas para VRS asimismo una de estas muestras mostró ser positiva para Adenovirus (AdV).

49) IDENTIFICACIÓN DEL GEN CODIFICANTE DE UNA PROTE ASA EXTRACELULAR ACTIVA EN FRIO PRODUCIDA POR UN AISLAM IENTO

ANTÁRTICO DE Pseudomonas sp.

N. Fullana 1, C. Martínez-Rosales 1, 2, M. Señorale 1, S. Castro-Sowinski 1, 2

1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR. 2Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE.

s.castro.sow@gmail.com

Las enzimas provenientes de microorganismos sicrófilos han generado gran interés por su potencial aplicación industrial. La Antártida, continente que experimenta condiciones ambientales extremas, es un buen escenario para el hallazgo de microorganismos capaces de ser explotados biotecnológicamente. Como primer paso hacia el desarrollo de una nueva proteasa comercial activa a bajas temperaturas nos hemos propuesto: i) identificar el gen que codifica una proteasa extracelular producida por el aislamiento antártico de Pseudomonas sp. AU10 (Martínez-Rosales y Castro-Sowinski, 2011); ii) expresarlo en un sistema heterólogo apropiado para su uso en la industria láctea y del detergente y; iii) analizar sus potenciales aplicaciones biotecnológicas. Se trabajó con el sobrenadante de cultivo de AU10 (con leche descremada como inductor de la producción de proteasas) crecido a 4ºC. Se detectó la presencia de una sola banda de actividad proteolítica en geles de poliacrilamida nativos copolimerizados con gelatina. Se encontró por SDS-PAGE una banda dominante de aproximadamente 50 kDa, que por MS- MALDI/ToF se identificó como una proteasa alcalina de Pseudomonas. Los péptidos identificados se utilizaron para diseñar cebadores degenerados con el fin de amplificar por PCR regiones parciales del gen. Los fragmentos amplificados fueron clonados en el vector InsTA/clone (Fermentas) para su secuenciación. Próximamente se diseñarán cebadores específicos para amplificar por PCR inverso la totalidad del gen. Los fragmentos amplificados serán secuenciados y analizados con la finalidad de reconstruir la totalidad del gen que codifica la proteasa. Los autores agradecen a Pedeciba. Martínez-Rosales y Castro-Sowinski. Polar Research 2011, 30, 7123, DOI: 10.3402/polar.v30i0.7123

BIOFÍSICA (50-54)

50) LA EXPOSICIÓN AGUDA A HG EN MIOCITOS VENTRICULA RES AISLADOS, ALTERA SU EXCITABILIDAD Y SU CONTRACTILID AD.

J. Rompani 1, C.Costa 1, G.Brum 2 y G.Ferreira 1*

* autor correspondiente. 1 Laboratorio de Canales Ionicos. Departamento de Biofisica. Facultad de Medicina. UdelaR. Montevideo; 2 Laboratorio de Biofisica

del Musculo. Departamento de Biofisica. Facultad de Medicina.

La intoxicación por Mercurio (Hg), es relativamente frecuente, aumentando en el tiempo, por ausencia de degradación. Si bien los niveles de toxicidad mínimos son discutidos, se coincide en que es extremadamente tóxico. En comunicaciones anteriores hemos descrito los efectos de la exposición aguda al Hg en registros de tensión y electrogramas de superficie de corazones aislados de cobayo (Rompani et al., 2010). Teniendo esta descripción en el órgano, decidimos observar los efectos en células aisladas para entender mejor los mecanismos desde el punto de vista celular. En cuanto a los registros de potencial de acción, la exposición aguda a Hg origino una disminución de la meseta del potencial de acción, con prolongación del mismo. La amplitud también disminuyo. Las curvas dosis-respuesta de estos efectos (n=3), indican IC50 similar a los efectos descritos en corazones aislados. Consistentemente con estos efectos en potencial de acción, también se alteraron casi todas las corrientes ionicas, con distinto IC50. Las mas sensibles fueron las de Calcio y Potasio. Miocitos cargados con pigmentos sensibles a Calcio, mostraron disminución de su epifluorescencia ante estimulos externos. Paralelamente, se observo que ondas de Calcio intracelular disminuyeron su velocidad de propagación de manera sustancial en presencia de Hg. Estos hallazgos indican multiples mecanismos de acción a nivel celular, que finalmente convergen en alteraciones de excitabilidad celular y de Calcio intracelular por exposición aguda a Hg. Ambas alteraciones pueden potenciarse entre si, manteniendo la inestabilidad de la función cardiaca a nivel celular, traduciendose en las alteraciones macroscópicas descritas.

Agradecemos financiación de CSIC-UdelaR y apoyo académico ANII

51) ARSENICO PRODUCE VARIADOS EFECTOS CARDIOVASCULA RES EN CORAZON Y MIOCITOS AISLADOS DE CORAZÓN VENTRICUL AR DE

COBAYO.

C. Costa, J. Rompani, A. Schmidt y G. Ferreira * * autor correspondiente. Laboratorio de Canales Ionicos. Departamento de

Biofisica. Facultad de Medicina. UdelaR. Montevideo.

Los metaloides son elementos químicos intermedios entre los metales y los halógenos. El As (z=33, A=75), tiene variedades de ionización +3 y +5. Es usado por su capacidad como semiconductor en electrónica y por sus efectos metabolico-celulares, como pesticida y quimioterapico. Es también un elemento frecuente de encontrar contaminando naturalmente suelos de agua dulce. Puede provocar intoxicaciones agudas o crónicas, penetrando por cualquier vía, en formas orgánicas y/o inorgánicas. Se estudiaron los efectos de distintas exposiciones agudas al As a nivel de corazón y células aisladas de cobayo como As2O3 o AsCl3. Ambas variedades provocan un efecto inotrópico negativo rápidamente reversible, con IC50 mayor en comparación con los metales pesados Pb/Hg (aprox. 100 a 200 uM comparado con 10 a 30 uM). El efecto inotrópico negativo afecta la cinetica de la contracción, enlenteciéndola en ambas fases (contracción y relajación). Este efecto es mas pronunciado con AsCl3 que As2O3, aunque se ve en ambos. El As también altera electrogramas de superficie. La frecuencia cardiaca aumenta y disminuye ante una dosis dada, observandose mas fenómenos arrítmicos respecto a situaciones control. En células aisladas no provoca cambios sustanciales en las corrientes de Calcio L, pero si en otras corrientes. Los resultados indican que As a altas concentraciones, puede matar por acciones directas a nivel cardiovascular. Estos valores son mayores que los encontrados en las intoxicaciones endémicas por As. Sin embargo, son una luz de alarma sobre blancos del As a menudo subvalorados en las poblaciones de riesgo, como por ej. el aparato cardiovascular.

Agradecemos financiación de CSIC-UdelaR, apoyo académico de ANII

52) ROL DEL SURFACTANTE PULMONAR EN LA LESIÓN PULMO NAR AGUDA: DESDE LA FISIOPATOLOGÍA A ASPECTOS BIOFÍSICO S DE SU

FUNCIÓN.

L. Malacrida 1, O. Cañadas 2, E. Lopez-Rodriguez 2, J. Perez-Gil 2, H. Botti 3, C. Casals 2, A. Briva 1, A. Denicola 4.

1Area de Investigación Respiratoria, Departamento de Fisiopatología, Hospital de Clínicas, UdelaR-Uruguay; 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid-España; 3Unidad de

Cristalografía del Instituto Pasteur de Montevideo-Uruguay; 4Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UdelaR-Uruguay

El surfactante pulmonar (SP) es un complejo sistema lipoproteico, sintetizado y secretado por los neumonocitos II del pulmón al espacio alveolar. Su función principal radica en permitir una transferencia de moléculas tensoactivas (fosfolípidos y proteínas) a la interfase aire/líquido y la disminución de las tensiones intra-alveolares a cero durante la espiración, evitando el colapso alveolar. Existe evidencia relacionada a la disfunción del SP como mecanismo de desarrollo y agravamiento de la Lesión Pulmonar Aguda (LPA). Particularmente, el Sevoflurano (anestésico inhalatorio) se ha vinculado al agravamiento de la LPA a través de una inhibición de la función del SP. En un abordaje in vivo fue posible identificar alteraciones de la mecánica pulmonar (deterioro del componente viscoelástico) e histología (colapso alveolar) por Sevoflurano. No se identificaron alteraciones en la función epitelial (reabsorción de fluido alveolar), composición fosfolipídica ni proteínas totales del lavado broncoalveolar. Al mismo tiempo, se identificó pérdida de las capacidades tensoactivas durante la compresión dinámica y Q-estática en un Surfactómetro de Burbuja Captiva y alteración de los parámetros termodinámicos (∆H, Tm, T1/2) por Calorimetría Diferencial de Barrido. Se identificaron además cambios en la viscosidad (Anisotropía) y solvatación (Polarizabilidad Generalizada) de membranas reconstituídas de SP por Fluorescencia. De esta manera nuestros hallazgos identifican a las interacciones lípido-lípido y lípido-proteína como el principal mecanismo de disfunción del SP por anestésicos inhalatorios en la LPA.

53) GERMANIO, METALOIDE USADO EN COMPONENTES ELECTRÓNICOS, PRODUCE FALLAS CARDIACAS ANTE EXPOSIC IONES

AGUDAS EN EL RANGO MICROMOLAR.

T. Casagrande 1, S. Stumpf 1, C.Costa 1, A. Schmidt, A. Trott y G.Ferreira* *autor correspondiente. 1Igual contribución al trabajo. Universidade de Santa Catarina, Sao Miguel do Leste. Laboratorio de Canales Ionicos. Departamento

de Biofisica. Facultad de Medicina. UdelaR. Montevideo.

El Germanio (Ge, Z=32), elemento no abundante, se encuentra ampliamente distribuido en la corteza terrestre. Puede encontrarse en forma di-tetravalente. La forma divalente posee un importante potencial redox y forma parte de compuestos órganicos. Germanio inorgánico parece ser más tóxicos que Germanio orgánico. Su toxicidad en mamíferos, indica que tiene menor toxicidad que el Arsénico en su forma de óxido. Se prevé que su uso continúe en aumento y es un elemento a tener en cuenta en la contaminación por depósitos de chatarra electrónica. Se han reportado varios casos de intoxicación por Ge inorganico en las que se observa síndrome de disfuncion organica múltiple y muerte por shock hiperdinamico, no habiéndose estudiado en detalle hasta el momento la disfuncion cardiovascular (Obara et al., 1991; Shamir et al., 1997; Luck et al., 1999). Debido a ello, caracterizamos el efecto del Ge ante exposiciones agudas al mismo en corazones aislados de cobayo. Todos los efectos fueron parcialmente reversibles al lavado, exhibiendo dependencia con la dosis. El GeCl2 tuvo un efecto inotrópico negativo, con IC50 aprox. 200 a 300 uM. Mayores dosis aumentan contracciones cardiacas alternantes. Paralelamente, se observa alteración de la cinetica de contracción. Estos efectos se acompañaron de alteraciones de electrogramas de superficie. En configuraciones de Potencial de Accion monofásico, sus efectos mayores ocurren en fase 0 y fase 3. Estos hallazgos indican que el Ge puede producir alteraciones a nivel cardiovascular. Son un llamado de alerta acerca del manejo de los residuos y chatarra electrónica.

Agradecemos financiación de CSIC-UdelaR y apoyo académico ProInBio-REMH, ANII

54) EL SEVOFLURANO ES CAPAZ DE PREVENIR Y REVERTIR LOS EFECTOS CARDIACOS DE LA EXPOSICIÓN AGUDA A PLOMO A NIVEL

CARDIACO.

S. Stumpf &1, T. Casagrande &1, C.Costa 1@, A. Schmidt @, A. Trott &, H. Piriz % y G.Ferreira@*

* autor correspondiente. 1 Igual contribución al trabajo. % Direccion ProInBio (Ex-Director Fisiopatologia). Universidade de Santa Catarina, Sao Miguel do

Leste. @ Laboratorio de Canales Ionicos. Departamento de Biofisica. Facultad de Medicina. UdelaR. Montevideo.

Recientemente, hemos caracterizado las repercusiones que provoca la exposición aguda a Plomo (Pb2+), en corazón y células aisladas de miocardio ventricular de cobayo (Rompani et al., 2007, 2008, 2009, 2010). Entre estas destacan su efecto inotrópico negativo y pro-arritmogenicidad. Intentos por revertir estos efectos con isoproterenol, han sido parcialmente exitosos (Rompani, 2010), indicando que parte de las alteraciones a nivel cardiaco por Pb, tienen que ver con blancos directos o indirectos de la via ProteinQuinasa A. El sevoflurano (C4H3F7O ), es un anestésico general halogenado, de amplio uso. Los anestésicos volátiles y halogenados son conocidos por su acción cardioprotectora (respuesta condicionada por anestésicos). Esta se manifiesta por efecto inotrópico negativo antiarrimogenico. Los mecanismos de acción hipotéticos son multipes, involucrando cambios en canales y transportadores, calcio intracelular, especies reactivas de oxigeno, proteínas contráctiles/regulatorias y componentes lipidicos de membranas celulares (Landoni et al., 2009). Por ello, observamos la respuesta a la exposición aguda al Plomo, en corazones pretratados o postratados con el equivalente de 2 %o Concentracion Alveolar Minima, de sevoflurano (dosis habituales). Las curvas dosis-respuesta al Pb y sus efectos cardiovasculares, indican que el sevoflurano es un agente preventivo y terapéutico eficaz, para tratar las alteraciones cardiacas observadas por exposición aguda a Plomo. Esto sugiere que el sevoflurano es un agente que por sus mecanismos de acción, interfiere con los mecanismos de daño celular producidos por Pb, de forma diferente al isoproterenol, revirtiendo totalmente las alteraciones cardiacas por exposición aguda a Pb extracelular.

Agradecemos financiación de CSIC-UdelaR, PDT 7643, apoyo académico ProInBio-REMH, ANII, Bioxel-Cristalia

NEUROCIENCIAS (55-69)

55) SEMAFORINA 3F/NEUROPILINA-2 EN LA DEGENERACIÓN DE LOS NERVIOS SIMPÁTICOS UTERINOS EN RESPUESTA AL ESTRÓGE NO

A. Richeri 1, C. Chalar 2, C. Texidor 1, G. Martínez 1, M.M. Brauer 1

1 Laboratorio de Biología Celular, IIBCE (MEC) 2 Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UdelaR)

Los nervios simpáticos del útero sufren un proceso de neurodegeneración regulada en respuesta a la exposición crónica al estrógeno. Esta plasticidad es iniciada por cambios en el tejido uterino e involucra alteraciones en la síntesis de señales repulsivas para los nervios simpáticos. Recientemente, el estudio del transcriptoma del útero de ratas prepúberes tratadas con estrógeno permitió detectar una inducción significativa (5X) de semaforina 3F (Sema3F), la cual es repulsiva para los nervios simpáticos tras interaccionar con el receptor neuropilina-2 presente en la superficie de los terminales adrenérgicos. Con el fin de continuar explorando el impacto de la elevación en los niveles de Sema3F observada en el útero estrogenizado, en este estudio determinamos la localización tisular y celular de los transcriptos de Sema3F mediante hibridización in situ y utilizando inmunohistoquímica, analizamos si los nervios uterinos expresan neuropilina-2. Estos estudios mostraron que: (a) el estrógeno provoca una inducción tejido-específica de Sema3F, la cual se localiza en el tejido conjuntivo que rodea los haces musculares miometriales y los grandes vasos sanguíneos; (b) los transcriptos de Sema3F se expresan con gran intensidad en los fibroblastos residentes y en los leucocitos eosinófilos que invaden el útero en respuesta al estrógeno; y (c) una población de nervios, presumiblemente simpáticos, se vuelven inmunoreactivos para neuropilina-2 durante el proceso de degeneración iniciado por el estrógeno. Estos resultados, aunque de naturaleza correlativa, apoyan un modelo en el cual Sema3F en conjunción con otras señales inhibitorias convierten al miometrio uterino en un terreno inhóspito para los nervios simpáticos. Financiación: PEDECIBA

56) UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE NEUROPATÍAS PERIFÉ RICAS HEREDITARIAS EN CULTIVOS ORGANOTIPICOS DE Trembler-J.

Romeo C. 1, Bresque M. 1, Rosso G. 1, Canclini L. 1, Cal K. 1, Pizzarossa C. 1,

Damian J.P. 4, Sotelo J.R. 1, Kun A. 1,2

1 Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos del IIBCE 2; Sección Bioquímica de Facultad de Ciencias; 3 Departamento de Biología Celular y

Molecular Área Bioquímica de Facultad de Veterinaria.

Antecedentes generales: Las neuropatías periféricas hereditarias constituyen un grupo de trastornos que difieren a nivel clínico y genético, e incluyen una amplia serie de síndromes, afectando típicamente células de Schwann (SC) y axones mielinizados del Sistema Nervioso Periférico (PNS). Dentro de ellas, la más frecuente es CMT1A, mielinopatia desmielinizante causada por una duplicación de pmp22. El modelo murino Trembler J constituye una herramienta versátil para abordar la neuropatía desde diferentes enfoques a través de estudios in vivo e in vitro.

Antecedentes específicos: El cultivo de Ganglios de la Raíz Dorsal (DRG’s) in vitro reproduce el desarrollo celular con un alto nivel de organización cito-histológica estructural y funcional, permitiendo el estudio de procesos complejos observados in vivo en el PNS. En este modelo, células de diferentes linajes pueden intentar reproducir in vitro las relaciones tridimensionales naturales. En particular, los cultivos de DRG’s embrionarios murinos, han sido utilizados como modelo de cocultivo de neuronas y SC del PNS, en el estudio de la mielinización.

Nuestro trabajo: Hemos estudiado la expresión de pmp22 en cocultivos de DRG´s y SC, en dominios celulares y nucleares, en condiciones normales y patológicas. Además se han caracterizado con diferentes marcadores (PMP22, MAG, NF, Actina y Vimentina).

Resultados-Conclusiones: Hemos observado diferencias en la expresión y distribución de algunos marcadores en el fenotipo patológico y normal. La determinación de estas características contribuye a profundizar el conocimiento del proceso de mielinización en ambas condiciones, lo cual es fundamental para estudiar posibles terapias que permitan revertir los efectos de la neuropatía.

57) OPTIMIZACIÓN DEL DIAGNOSTICO MOLECULAR DE CMT-X MEDIANTE EL GEN GJB1 PARA SU IMPLEMENTACIÓN EN EL P AÍS

A. Hanusz 1, U. Koziol 2, F. Dominguéz 2, A. Costabile 2, G. Caurla 2, L. Canclini 1, G. Rosso 1, E. Castillo 2 & A. Kun 1, 2

1 Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 2 Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR)

La enfermedad Charcot-Marie-Tooth (CMT) es la neuropatía hereditaria más común del SNP. Existen dos grandes grupos de CMT según el tipo celular afectado: gliales (CMT1) y axonales (CMT2). Esta enfermedad se caracteriza por provocar pérdida sensorial, debilidad progresiva de músculos distales y atrofia muscular, produciendo pie cavo. CMT-X (dentro de CMT1) es la segunda forma más común de esta neuropatía. Es causada por mutaciones en el gen de la Conexina 32 (CX-32) (GJB1, gap junction beta 1). CX-32 es expresada por las células de Schwann, pertenece a una familia homologa de proteínas integrales de membrana que se ensamblan para formar canales (conocidos como gap junction). En Uruguay no se cuenta con diagnostico genético-molecular para la identificación de las distintas variantes de CMT. El objetivo de este trabajo fue conformar un diagnostico integral de CMT-X mediante el análisis del gen GJB1 en el ADN de células sanguíneas proveniente de pacientes con diagnóstico clínico de CMT, junto al estudio molecular in situ en cortes histológicos de nervio sural de los mismos pacientes. Una vez realizada la secuenciación del ADN tanto de los pacientes como de controles sanos se analizaron las mismas mediante alineamientos múltiples. Tres de los ocho pacientes estudiados son positivos para CMT-X. Con los controles sanos corroboramos que el diagnostico en sí fue efectivo ya que estos dieron negativo para la enfermedad. Con la inmuno-microscopía confocal se visualizó el comportamiento de CX-32 y se concluyó que existe un patrón de distribución asociada a la enfermedad.

58) IMPORTANCIA DE LOS MACRÓFAGOS EN LA REINERVAC IÓN DEL ENDOMETRIO ECTÓPICO EN UN MODELO DE ENDOMETRIOSIS

EXPERIMENTAL

C. Texidor , P. Silveira, G. Martínez, M.M. Brauer Laboratorio de Biología Celular, IIBCE (MEC)

La endometriosis es una enfermedad ginecológica estrógeno-dependiente caracterizada por la presencia de tejido endometrial fuera del útero. Los crecimientos endometrióticos espontáneos y experimentales presentan una rica inervación simpática y sensorial, la cual contribuiría al dolor pélvico crónico causado por esta patología. Se ha postulado que los macrófagos y otras células inmunes presentes en el peritoneo contribuirían al establecimiento de los endometriomas y promoverían su exacerbada reinervación. Estas células sintetizan citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento, incluyendo NGF. En estudios previos demostramos que los explantos endometriales eran reinervados fuera del peritoneo y aún en un ambiente inmunológicamente privilegiado como la cámara anterior del ojo (CAO). En el presente estudio evaluamos: (a) si en la CAO, los transplantes endometriales eran invadidos por macrófagos; (b) si existía una correlación entre la presencia de estas células y la densidad de inervación; y (c) si los macrófagos se presentaban en el endometrio normal. Utilizando inmunohistoquímica observamos que luego de tres semanas en el ojo, muchos de los transplantes endometriales presentaban abundantes macrófagos, aunque no se detectó una correlación positiva entre la densidad inervación y la de macrófagos. En el endometrio normal de ratas adultas, se observó la presencia de macrófagos exclusivamente en la capa funcional, la cual representa la zona del endometrio más pobremente inervada por los nervios simpáticos y sensoriales. Estos resultados apoyan la idea de que la reinervación del endometrio en localizaciones ectópicas no depende del ambiente peritoneal y no presenta necesariamente una correlación positiva con la presencia de macrófagos. Financiación: PEDECIBA

59) EL DAÑO ASTROCITARIO NEONATAL DISPARA LA NEURODEGENERACIÓN ESTRIATAL PROGRESIVA EN UN MODELO DE

ACIDEMIA GLUTÁRICA I

S. Olivera 1, M.N. Sarlabós, 1 E. Isasi 1, J. Rosillo 2, A. Fernández 2, G. Casanova 3, V. Cóppola 1, P. Díaz-Amarilla 1, L. Barbeito 4

1Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 2 IIBCE-Neuroanatomía Comparada Unidad Asociada a Facultad de Ciencias-UdelaR; 3Unidad de Microscopía

Electrónica, Facultad de Ciencias-UdelaR; 4Institut Pasteur Montevideo

Un daño metabólico agudo sobre los astrocitos durante el período neonatal podría alterar el desarrollo y desencadenar una patología del sistema nervioso. La acidemia glutárica I (GAI) es una enfermedad neurometabólica infantil caracterizada por la degeneración de neuronas estriatales y la acumulación en concentraciones milimolares de ácido glutárico (GA). GA no produce muerte neuronal pero induce disfunción mitocondrial, estrés oxidativo y aumento de proliferación en astrocitos. Nuestro grupo estudió si la disfunción astrocitaria inducida por GA produce neurodegeneración estriatal. Se administró GA intraventricular a ratas recién nacidas para reproducir una crisis encefalopática típica de GAI y se evaluó sobrevida neuronal desde los 5 a los 45 días postinyección (DPI). A 5 DPI, GA produjo una proliferación aumentada de astrocitos S100β+ seguida de una astrocitosis GFAP+, sin muerte neuronal significativa. A 21 y 45 DPI, se observó immunoreactividad para nitrotirosina, disminución de NeuN y del diámetro de los haces axonales que perforan el estriado, mostrando una neurodegeneración estriatal retardada que sigue la disfunción astrocitaria. La viabilidad de neuronas estriatales en cultivo no fue afectada por GA pero el medio condicionado de astrocitos tratados con GA indujo la muerte del 40% de las neuronas. El antioxidante FeTCPP (hierro(III)-tetrakis(p-carboxifenil)porfirina) previno la proliferación astrocitaria y la degeneración estriatal posterior in vivo e in vitro. En resumen, un daño metabólico transitorio con GA indujo cambios fenotípicos de larga duración en astrocitos volviéndolos neurotóxicos. La prevención farmacológica de dicho daño con antioxidantes previno la degeneración estriatal y podría colaborar retardando la progresión de GAI en pacientes.

60) CAMBIOS EN LA DIETA MODIFICAN PERFILES DE EXPRE SIÓN DE PMP22 Y LOCOMOCIÓN EN RATONES CON TRASTORNOS

NEURODEGENERATIVOS.

Bresque M 1, Romeo C 1, Rosso G 1, Canclini L 1, Pizzarosa C 1, Prieto JP 2, Rodriguez H 4, Sotelo JR 1, Verdes JM 5 & Kun A 1.

1Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleícos, 2 Laboratorio de Biología Celular y 3 Bioterio, IIBCE, Montevideo, Uruguay, 4 Departamento de Biología

Molecular y Celular, Área Biofisica, Facultad de Veterinaria.

Antecedentes generales: Las neuropatías hereditarias conocidas como CMT son procesos neurodegenerativo del Sistema Nervioso Periferico. La más frecuente es CMT-1A, causada por mutaciones o una duplicación del gen pmp22 codificante de la proteína mielínica PMP22. Esta participa en la mielinización temprana y normalmente es propensa a agregar. Al saturarse la función proteosómica en la patología, PMP22 forma agregosomas, que serán degradados vía autofágica-lisosomal. Se propone que interrupciones en el tráfico intracelular de PMP22 junto la formación de agregados poseen un rol substancial en el desarrollo del síndrome CMT-1A. Antecedentes específicos: La restricción en la dieta, en este contexto, provee una aproximación no farmacológica que pretende potenciar las vías autofagica-lisosomal, incrementando la degradación de los agregados, y contribuyendo a resistir el trastorno neurodegenerativo mediante la atenuación del déficit morfológico y locomotor. Nuestro trabajo: Utilizando un modelo murino validado de CMT1A, hemos sometido a ratones Trembler J a tratamientos de restricción en la dieta durante 5 meses, con el objetivo de evaluar las posibles mejoras locomotoras y estructurales. Los efectos dietarios fueron evaluados analizando variaciones en las capacidades locomotoras utilizando tests comportamentales, los que permitieron observar mejoras en aquellos individuos portadores de la patología. Los patrones de expresión de pmp22 mostraron modificaciones detectables en los ratones tratados. Los resultados podrían indicar un efecto de los regímenes sobre el comportamiento anormal patológico, lo cual nos acerca a un posible tratamiento de fácil aplicación humana.

61) LA LISINA Y EL ÁCIDO GLUTÁRICO AFECTAN A LOS AS TROCITOS DEL MODELO MURINO KNOCK OUT PARA LA ACIDEMIA GLUTÁR ICA

TIPO I

E. Isasi1, V. Cóppola1, M. Perata1, E. Trías1, P. Díaz-Amarilla1, G. Leipnitz2, C.A. Ribeiro2, S.I. Goodman3, M. Wajner2, L. Barbeito4, S. Olivera1.

1Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciencias Basicas da Saude, Universidade Federal de Rio Grande

do sul, Brasil; 3Pediatric Departament, University of Colorado Denver School of Medicine; 4Institut Pasteur de Montevideo

La acidemia glutárica I (GAI) es una enfermedad neurodegenerativa del catabolismo de lisina y triptofano. Se produce por disfunción de la proteína mitocondrial glutarilCoA deshidrogenasa (GCDH) y acumulación de ácidos orgánicos (ácido glutárico, GA) no neurotóxicos per se. El ratón knock out (KO) para GCDH no sufre daño neurológico pero presenta alteraciones en la sustancia blanca sugiriendo que las células gliales podrían ser blanco de los metabolitos de GAl y desempeñar un papel en su patogénesis. Para validar esta hipótesis, se evaluaron los efectos de concentraciones fisiopatológicas (5-10 mM) de lisina y GA en parámetros funcionales y morfológicos de cultivos primarios de astrocitos de ratones KO y salvajes hermanos. En ambos cultivos, lisina y GA causaron disfunción mitocondrial evidenciada por disminución de JC1 y de actividad MTT. Los niveles celulares de glutatión disminuyeron 25% y la señal de carboxi-H2DFFDA aumentó 35%, sugiriendo un aumento significativo del estrés oxidativo. La proliferación astrocitaria aumentó un 30%. No hubo cambios en la expresión del transportador de glutamato GLT1 ni de glutamina-sintasa. Respecto de oligodendrocitos, se obtuvo 80% menos de progenitores en los cultivos de glía mixta del ratón KO comparado con los astrocitos salvajes. En resumen, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo aumentado y la proliferación astrocitaria exacerbada observada en los cultivos del ratón KO GCDH podría contribuir activamente a la muerte neuronal y las alteraciones de la sustancia blanca reportadas en GAI.

62) EXISTEN FOSFORILACIONES MUTUAMENTE EXCLUYENTES EN MARCKS?

A. Toledo , C. Arruti

Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República.

La actividad de la proteína MARCKS es fundamental para el desarrollo del sistema nervioso en vertebrados. Ésta es capaz de modular el citoesqueleto de actina durante eventos como el cierre del tubo neural y la laminación de la corteza cerebral o la retina. Su actividad es modulada por interacción con CaCAM y por fosforilación por diversas quinasas. Entre estas últimas, la fosforilación por PKC (proteína kinasa C) ha sido extensivamente estudiada y desvinculada del proceso de desarrollo nervioso. Previamente describimos la ocurrencia de una fosforilación en MARCKS, a cargo de Cdk5, que es específica de neuroblastos en diferenciación y neuronas jóvenes, mientras que está ausente del resto de los tipos celulares en donde se encuentra MARCKS. Desconocemos, sin embargo, el papel que juega esta particular fosforilación. Estudiamos la interacción entre esta fosforilación en la S25 de MARCKS con las fosforilaciones de PKC en el dominio efector (DE). La estimulación de la actividad de PKC en neuronas de embriones de pollo, provoca un enorme incremento de la fosforilación de MARCKS. Llamativamente encontramos que la fosforilacion en S25 no tiene lugar en el mismo pool de moléculas de MARCKS que la fosforilacion en el DE ya que se observan en parches celulares que no colocalizan. Por otro lado verificamos por electroforesis que dichas fosforilaciones no tienen lugar simultáneamente en la misma molécula de MARCKS. Esta exclusión puede estar vinculada a un mecanismo de regulación de rango amplio que tiene lugar entre dominios diferentes y alejados de esta proteína constitutivamente desplegada.

63) RELACION ENTRE DISFUNCION REDOX MITOCONDRIAL Y ALTERACIONES DE LA UNION NEUROMUSCULAR EN ESCLEROSI S

LATERAL AMIOTROFICA

Adrián Aicardo &, Carmen Bolatto #, Patrícia Cassina #, Luis Barbeito £, §

Michael Murphy ‡, Rafael Radi & and Adriana Cassina &. &Centro de investigaciones Biomédicas, Dpto de Bioquímica, Facultad de

Medicina; #Dept. Histología Facultad de Medicina, Universidad de la Republica, Uruguay; £Institut Pasteur, Montevideo, Uruguay; ‡MRC Dunn Human Nutrition

Unit, Hills Road, Cambridge, UK

La relación entre disfunción mitocondrial, sobreproducción de especies reactivas del oxígeno (ERO), y muerte neuronal está bastamente documentada en la literatura. Por tanto, muchas aproximaciones terapéuticas basadas en antioxidantes han sido propuestas para prevenir este fenómeno. Utilizando un modelo murino de esclerosis lateral amiotrófica (SODG93A), realizamos estudios inmunohistoquímicos de la unión neuromuscular (NMJ), demostrando modificaciones estructurales a nivel de músculo esquelético en estadíos tempranos de la enfermedad. Además, encontramos una reducción en la presencia de mitocondrias a nivel de los botones sinápticos, comparado con animales no transgénicos. La distribución mitocondrial celular está en parte regulada por proteínas que participan en la dinámica mitocondrial (Opa1 y Fis1). Por ende, estudiamos la presencia de estas proteínas en mitocondrias aisladas de músculo esquelético, encontrando que los niveles de Opa1 y Fis1 fueron menores en los animales SODG93A. Considerando que, por resultados anteriores sabemos que la disfunción mitocondrial puede estar relacionada a nuestros hallazgos, tratamos animales SODG93A con un antioxidante dirigido a la mitocondria (MitoQ). El tratamiento con MitoQ recupera la morfología de la NMJ, incrementa la presencia de mitocondrias en la terminal, y los niveles de Opa1 y Fis1 en mitocondrias de músculo esquelético. En conclusión, nuestros datos sugieren que en estadios temprano de la enfermedad, la disfunción mitocondrial lleva a modificaciones en la NMJ, y que esto está relacionado con estrés oxidativo, ya que el tratamiento con un antioxidante dirigido a la mitocondrial logra revertir estas alteraciones.

64) INFLUENCIA DE LOS ASTROCITOS EN LAS CELULAS PRODUCTORAS DE MIELINA

E. Isasi 1, M.N.Sarlabós 1, M. Perata 1, L. Barbeito 2, S. Olivera-Bravo 1

1Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 2 Instituto Pasteur de Montevideo La Acidemia Glutárica I (GAI) es una enfermedad neurometabólica hereditaria caracterizada por deficiencia de la enzima glutaril-CoA deshidrogenasa y acumulación de ácidos orgánicos como el glutárico (GA). GA-I presenta neurodegeneración estriatal y cortical, alteraciones en la sustancia blanca y en la barrera hematoencefálica; trastornos distónicos y disquinéticos irreversibles. En pacientes y modelos murinos de GA-I, se reporta mielinización retardada, enfermedad periventricular de la sustancia blanca y mielinopatía espongiforme. Como hasta el momento se desconoce si la afectación de la mielina se produce por efectos directos de GA o mediante una disfunción astrocitaria como se ha reportado en otras enfermedades del neurodesarrollo, se realizaron cultivos primarios de astrocitos, de células precursoras de oligodendrocitos (CPO) o de glía mixta de corteza de ratas SD de 1 día. Los cultivos fueron tratados con GA o con medios condicionados de astrocitos controles (MCC) o tratados con GA (MCA) y se evaluó número, proliferación, diferenciación y estado redox de CPO y de oligodendrocitos diferenciados in vitro. Los resultados preliminares indicarían que 24hs de tratamiento con GA no altera el número ni la morfología de oligodendrocitos diferenciados que expresan CNPasa y MAG. Por otro lado, la dilución 1:5 del MCA disminuyó un 20% el número de oligodendrocitos inmaduros respecto de los controles con MCC y redujo el número de sus prolongaciones. Por lo tanto, la disfunción astrocitaria podría participar en las alteraciones de la mielina. Se planifica, además, realizar ensayos de migración de CPO y de mielinización in vitro en presencia de GA o MCA.

65) MIELINIZACIÓN Y DEMIELINIZACION DE FIBRAS NERVI OSAS TREMBLER-J POR MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA (MFA) Y

CONFOCAL

G. Rosso 1, C. Negreira 2, J. R. Sotelo 1, A. Kun 1. 1- Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE); 2- Laboratorio de Ultrasonido, Instituto de

Física – Facultas de Ciencias (UDELAR).

Aproximación general :

Charcot-Marie-Tooth 1A (CMT1A) es la neuropatía humana demielinizante mas frecuente, asociada a la duplicación de pmp-22, un gen que codifíca la proteína transmembrana PMP-22 expresada en la mielina de las células de Schwann mielinizantes (cSm). Mutaciones en pmp-22 también han sido identificadas en familias humanas CMT1A. Los ratones Trembler-J (Tr-J), son un modelo animal de CMT1A (poseen una mutación puntual en pmp-22 que impide la inseción de PMP-22 en la mielina).

Enfoque específico

En fibras mielnizadas, la presencia de lamina basal (LB) y el correcto ensamblaje de la matriz extracelular (MEC) son cruciales para la maduración y ensamblaje de la mielina, la correcta propagación del impulso nervioso y la organización del citoesqueleto. Un aspecto poco explorado en CMT1A es la gradual remodelación de la MEC y la LB durante el proceso de desmielinización. Estudios bioquímicos demuestran una disminución de componentes de la MEC (Colageno IV: molécula formadora de red en membranas basales) y la LB (Fibrinectina) en nervio ciático de ratones Tr-J.

Nuestro trabajo

Mostramos aquí un análisis de la mielinización y demielinización del nervio ciático de ratones +/+ y Tr-J/+ por microscopía de fuerza atómica (MFA) y conofocal para caracterizar cambios estructurales, extracelulares e intracelulares, en esta neuropatía.

Los resultados obtenidos mostraron diferencias en la organización de la MEC y LB, en la distribución de PMP-22 y en las propiedades nanomecánicas de las fibras, entre ambos genotípos. Así, la MFA podría ser considerada como una nueva herramienta diagnóstica para estudiar aspectos fisiológicos relevantes en neuropatías periféricas.

66) ASTROGLIOSIS Y DESMIELINIZACIÓN ASOCIADAS A LA MUERTE NEURONAL EN CEREBELO E HIPOCAMPO DE BOVINOS INTOXIC ADOS

CON Solanum bonariense.

J. M. Verdes 1,2, M. Márquez 3, A. Moraña 2, M. Pumarola 3

1Departamento de Biología Molecular y Celular y 2Departamento de Patología, Facultad de Veterinaria (UDELAR); 3Departamento de Medicina y Cirugía

Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), ESPAÑA.

Se evaluó la reacción astrocitaria, perdida neuronal y desmielinización en cerebelo de bovinos intoxicados con Solanum bonariense. A partir de muestras fijadas en formol al 10% e incluidas en parafina de 2 bovinos intoxicados y con síntomas cerebelosos y otro bovino normal utilizado como control, se procedió a desarrollar las siguientes técnicas: Tinción de Kluver-Barrera y Bielschowscky para evaluar desmielinización en sustancia blanca cerebelosa. Inmunohistoquímica con anticuerpo contra neurofilamentos (NF-200KDa) para evaluar perdida de neuronas en cortes de cerebelo e hipocampo y para estudiar la reacción astroglial en las mismas regiones se utilizó un anticuerpo contra GFAP (proteína ácida fibrilar glial), asociado con polímero marcado con peroxidasa y diaminobenzidina como cromógeno. En los bovinos intoxicados, la sustancia blanca presentó una menor tinción para Kluver-Barrera y Bielchowscky, confirmando la degeneración axonal. Estos resultados concuerdan con la disminución de positividad a NF-200KDa observada en las células de Purkinje y neuronas de hipocampo de los animales intoxicados. La marcación contra GFAP mostró respuesta astrocitaria, que fue más extensa y pronunciada en el animal con más síntomas, mostrando también en el hipocampo, una mayor marcación alrededor de los vasos sanguíneos. De acuerdo con resultados previos, confirmamos la pérdida progresiva de células de Purkinje y la progresiva desmielinización, así como una marcada respuesta astroglial y una disminución de la marcación contra NF-200KDa en neuronas de cerebelo e hipocampo, sugiriéndose que, además de afectar al cerebelo, en esta neurodegeneración causada por la ingestión de Solanum bonariense podría verse afectado el hipocampo de los bovinos.

67) ESTUDIO DE LOS MECANIMOS MOLECULARES DE PLASTIC IDAD NEURONAL EN LA CORTEZA VISUAL: APROXIMACIONES DESDE LA

PROTEOMICA

L. Ruiz 1, N. Bornia 1, G. Vierci 1, F.M. Rossi 1,2

1Lab. de Neurociencias, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, (UdelaR); 2Lab. de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo

La capacidad de los circuitos neuronales de modificar y reorganizar sus conexiones en respuesta a la experiencia - plasticidad neuronal - constituye la base de procesos vitales como el aprendizaje y la memoria. Esta capacidad es muy alta durante fases precoces de la vida postnatal (periodos críticos de plasticidad), pero disminuye progresivamente con el pasar del tiempo, siendo muy limitada en fases adultas. Un ejemplo son los dramáticos efectos de la eliminación de la experiencia visual en un ojo durante el periodo crítico sobre la funcionalidad y organización anatómica de la corteza visual, que se vuelven permanentes si no son tratados cuando el sistema es todavía plástico. Recientemente han sido identificadas algunas estrategias que permiten modular los niveles de plasticidad en el sistema visual, pero los mecanismos moleculares subyacentes son todavía ampliamente desconocidos. Nuestro proyecto consiste en caracterizar, a través de la proteómica, diferencias en el patrón de expresión de proteínas en la corteza visual de ratones C57B6 en función del nivel de plasticidad. Utilizamos tres condiciones experimentales: pico de plasticidad (periodo crítico), plasticidad disminuida o ausente (adultos), y plasticidad reinstaurada por tratamiento con fluoxetina (modelo elegido por su relevancia clínica y por su amplio uso como anti-depresivo). Utilizamos separadamente extractos proteicos totales y extractos enriquecidos en histonas, por su fundamental importancia en la regulación de la expresión de programas génicos. Esperamos que los resultados obtenidos puedan brindar información útil en la identificación de nuevas estrategias para el tratamiento de patologías en las cuales el proceso de plasticidad es afectado.

68) ASTROCITOS ABERRANTES QUE PROMUEVEN EL DAÑO DE MOTONEURONAS EN UN MODELO DE ESCLEROSIS LATERAL

AMIOTRÓFICA FAMILIAR

P. Díaz-Amarilla 1, S. Olivera-Bravo 1, E. Trias 1, A. Cragnolini 2, L. Martínez-Palma 3, P. Cassina 3, J. Beckman 4, y L. Barbeito 2

1Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 2Laboratorio de Neurodegeneraciones, IPMON; 3Facultad de Medicina, UdelaR; 4Department of Biochemistry and Biophysics, Environmental Health Sciences Center and Linus

Pauling Institute.

La muerte de motoneuronas y la astrocitosis reactiva son características patológicas de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), una enfermedad neurodegenerativa progresiva, que puede ser provocada por mutaciones en la Superóxido Dismutasa 1 (SOD1). Los astrocitos disfuncionales contribuyen a la patogénesis de la ELA. Sin embargo, aún queda por dilucidar si la progresión de la enfermedad se encuentra asociada a la aparición de un fenotipo astrocitario neurotóxico específico. En este trabajo reportamos el aislamiento de células con un fenotipo astrocitario aberrante (AbA) de médula espinal adulta de ratas SOD1G93A sintomáticas en estadío terminal. Las AbAs son altamente proliferativas en cultivo, presentan marcadores astrocitarios (GFAP, S100�, glutamina sintasa y conexina (Cx) 43), pero carecen del transportador de glutamato GLT1) y son negativas para la glicoproteina marcadora de progenitores gliales NG2. Las AbAs secretan factores solubles que inducen la muerte de motoneuronas con una potencia 10 veces mayor a la de los factores secretados por los cultivos primarios de astrocitos transgénicos neonatales. Hemos identificado astrocitos con fenotipo AbA, S100� y Cx43 positivos y NG2 negativos, rodeando a las motoneuronas en la médula espinal de animales transgénicos en fase terminal. El número de estas células en la médula espinal aumenta considerablemente luego del comienzo de los síntomas y acompaña la progresión de la enfermedad. Estos resultados permiten sugerir que las células Aba son una población astrocitaria aun no reportada que presentan una alta tasa proliferativa y capacidad neurotóxica cuya aparición se encuentra asociada a la fase sintomática terminal de la ELA.

69) LAS CÉLULAS DE SCHWANN COMO FUENTE LOCAL DE ARN AXONAL EN NERVIOS CIÁTICOS EN REGENERACIÓN.

Canclini, L 1; Romeo, C 1; Rosso, G. 1; Calliari, A. 1,2; Sotelo Silveira, J.R. 3,4; Kun, A. 1,5Mercer, J. 6; Sotelo, J.R. 1

1- Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE. 2- Laboratorio de Biofísica, Facultad de Veterinaria. 3- Departamento de Neurobiología

Molecular, IIBCE.4- Departamento de Biología Celular, Facultad de Ciencias. 5- Unidad Asociada a Bioquímica, Facultad de Ciencias. 6- McLaughlin Research

Institute, GF, USA.

Los ARNm son transportados hacia dominios celulares específicos donde serán traducidos, debido a que las proteínas que codifican deben cumplir su función allí. Este concepto se ha adaptado al territorio axonal en neuronas. A pesar de que el dogma tradicional establecía que los axones están desprovistos de maquinaria traduccional se ha demostrado que motores moleculares, como Miosina Va o kinesina, transportan ARNm hacia sitios blanco axonales donde los mismos son traducidos de forma local. Los ARNm viajan dentro de la célula en forma de ribonucleopartículas, donde proteínas (conocidas como linkers) vinculan los ARNm a los motores moleculares, y en las cuales la traducción de los mismos está reprimida. En cuanto a la transferencia de ARNm y proteínas desde la célula de Schwann (CS) al axón, se ha demostrado por inmunocitoquìmica la presencia de ribosomas en estructuras vesiculares, protruyendo desde la CS hacia el axoplasma. Este podría ser un camino mediante el cual los ribosomas y ARNm pueden ser transferidos al axón. Nuestro objetivo es proveer evidencias que apoyen la hipótesis de que la CS es una fuente local y complementaria de ARN con destino axonal en respuesta a la lesión nerviosa. Para ello, nervios ciáticos (mamíferos) en regeneración y descentralizados fueron incubados en medio conteniendo bromouridina, para marcar los ARN neosintetizados y estudiar así la transferencia de ARN desde la glia al axón. Así mismo presentaremos resultados obtenidos demostrando que esta transferencia depende de la integridad del citoesqueleto de actina e involucra la actividad de su motor asociado Miosina Va.

PARASITOLOGÍA MOLECULAR (70-81)

70) IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y ESTRUCTURAS CON A FINIDAD A HEPARINA EN Fasciola hepatica.

F. Fossa 1, C. Carmona 1, P. Berasain 1

1Unidad de Biología Parasitaria, Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias-Instituto de Higiene (UDELAR)

El presente trabajo se enfoca en la búsqueda y caracterización en Fasciola hepatica de moléculas con afinidad a heparina, aspirando a la identificación de posibles vías metabólicas y/o mecanismos de interacción con el hospedero vitales para la supervivencia del parásito en el huésped. Por microscopia de fluorescencia directa, usando heparina conjugada a fluoresceína, se visualizó en el gusano adulto reactividad muy intensa sobre células del parénquima, en las espinas del tegumento y moderada sobre algunas glándulas vitelinas. Para aislar las moléculas responsables de esta interacción, se preparó un extracto somático a partir de parásitos adultos y se sometió a una cromatografía de afinidad por heparina-sefarosa. Los resultados demostraron la existencia de numerosas proteínas con diversa afinidad por la heparina; destacándose cuantitativamente las fracciones eluidas a 0.2M de NaCl. Las mismas fueron analizadas por espectrometría de masas identificándose las enzimas, glutatión S-transferasa clase sigma, glutamato deshidrogenasa y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa. El análisis de actividad proteolítica en las fracciones, usando sustratos fluorogénicos para las enzimas de la cascada digestiva del parásito, catepsinas tipo L, leucinaminopeptidasa y legumaína, demostraron que las mismas no interaccionan con la heparina ya que la mayor actividad se detectó en la fracción de proteínas no retenidas; recuperándose solamente trazas de actividad en algunos eluídos. Por lo tanto hemos demostramos en este helminto la existencia de proteínas y estructuras reactivas a la heparina algunas de las cuales pertenecen al metabolismo energético o antioxidante del parásito.

71) DESARROLLO DE HERRAMIENTAS MOLECULARES E INMUNOLÓGICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y DIAGNÓSTICO DEL

PARÁSITO TOXOCARA CANIS

S. Estrade 1, M.J. Lista 1, V. Villalba 1, M. Marin 1, E. Castillo 1 1 Sección Bioquímica Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

La Toxocariasis es una enfermedad causada por la infección con larvas del nematodo Toxocara. Esta geohelmintiasis, es contraída a partir del hábito de pica y geófagia presente en niños en interacción con perros parasitados, un hábitat usualmente más contaminado, menos hábitos higiénicos y menor acceso a servicios de salud. Si bien es una enfermedad muy frecuente en dicho contexto, no existen en nuestro país métodos de diagnóstico inequívocos del parásito. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de herramientas que permitan la detección de Toxocara canis, a través de aproximaciones moleculares e inmunológicas. Buscamos mejorar las metodologías inmunológicas existentes aumentando la especificidad de los ensayos. En particular clonamos en vectores de expresión dos proteínas específicas de T.canis lo cual permitirá mejorar los ensayos de ELISA existentes, disminuyendo la reacción cruzada con otros parásitos. Los ensayos de expresión de las proteínas están en proceso. Asimismo, mediante técnicas de PCR buscamos detectar el parásito en muestras de suelo y sangre. Hasta el momento se diseñaron cebadores específicos y comprobamos la funcionalidad de estos. Comenzamos los primeros estudios en muestras de suelo, obteniendo muestras de ADN que serán identificadas mediante secuenciación. Este proyecto se enmarca en el llamado de la UdelaR a proyectos de Inclusión Social. Además de contribuir al diagnóstico y tratamiento de esta parasitosis, la realización de este proyecto permitirá determinar su real incidencia y constituirá un insumo importante para establecer políticas de salud pública para control, prevención.

72) EVALUACIÓN DE LA UTILIDAD DEL PROMOTOR DE TROP OMIOSINA 1 DE M. CORTI PARA LA EXPRESIÓN DE TRANSGENES EN CE STODOS

S. Estrade , U. Koziol, I.Tiscornia, M. Bollati, E. Castillo

1 , Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR) 2- Unidad de Biología Celular, Instituto Pasteur.

En nuestro laboratorio buscamos profundizar en varios aspectos de la biología de los cestodos, en particular en el aislamiento y caracterización in vitro de células proliferantes de Mesocestoides corti como primer paso hacia cultivos de líneas celulares de este organismo. Para ahondar estos estudios debemos desarrollar herramientas para la manipulación génica. Previamente fueron clonados y caracterizados dos genes parálogos codificantes para Tropomiosinas (genes TPM1 y TPM2), generando cada uno de ellos isoformas de alto y bajo peso molecular (HMW y LMW).También se clono la región del promotor basal de la forma LMW del gen TPM1 esta podría ser usada para dirigir la transcripción de transgenes en este organismo desde un promotor homólogo. Nos planteamos caracterizar este promotor y determinar su potencial uso para la expresión de transgenes en M. Corti. Hasta el momento se consiguió clonar la región promotora de interés en un vector con la luciferasa como gen reportero, y también se han alcanzado resultados alentadores en transfecciones de un cultivo celular heterólogo con este vector. Asimismo, se logró mapear el inicio aproximado de la transcripción del gen de TPM1 LMW, y se está llevando a cabo un estudio para analizar el patrón de expresión de la TPM1 LMW en M. corti.

73) EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS TIPO CRISP DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS PARA SU UTILIZACIÓN COMO ANTÍGENO.

S. Echeverría 1, A. Costábile 1, E. Castillo 1

1Seccion bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDLAR)

Echinococcus granulosus provoca perdidas económicas en la ganadería, debido a que sus hospederos intermediarios son principalmente ovejas y vacas. Actualmente existe un tratamiento basado en administración de drogas al hospedero definitivo, pero no es eficaz sobre todo por la aparición de parásitos resistentes a la droga. Por esta razón se plantea la generación de una vacuna. Indagando en posibles antígenos para el desarrollo de una vacuna antihelmíntica, elegimos estudiar proteínas tipo CRISP de E. granulosus. Éstas forman parte de la superfamilia SCP/TAPS de proteínas. Se caracterizan por la presencia de un dominio SCP y varios residuos de cisteína conservados. Na-ASP2 es una proteína perteneciente a esta superfamilia que se está utilizando en ensayos para desarrollar una vacuna contra nematodos. Estas proteínas al expresarse en sistemas procariotas se obtienen en forma insoluble, por lo que decidimos expresar estas proteínas recombinantes en Pichia pastoris. En este trabajo elegimos como candidatas a dos proteínas. Destacándose una de ellas por encontrase en una biblioteca de protoescólices pepsinados de E. granulosus, lo cual indicaría una posible función en el proceso de invasión de la larva. Diseñamos primers a partir de las secuencias de Echinococcus multilocularis los que fueron utilizados para realizar experimentos de PCR usando como molde ADNc de E. granulosus. Los fragmentos obtenidos fueron clonados en vectores procariotas y secuenciados. Luego de confirmada la obtención de los ADNc correspondientes fueron clonados en el vector de levadura. Actualmente estamos realizando la puesta a punto de la expresión de dichas proteínas en P. pastoris.

74) CARACTERIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA MAF1 EN TRYPANOSOMA CRUZI

A. Trochine 1, M. L. Chiribao 1, P. Faral 1, C. Robello 1, E. Serra 2.

1 Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur Montevideo; 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), Rosario, Argentina.

Trypanosoma cruzi es un protozoo unicelular parásito, que cursa su ciclo de vida en entornos con diferentes condiciones nutricionales. En cada uno de ellos se expresan diferentes grupos de genes, cuya regulación global estaría ligada al estado de la cromatina y a eventos de regulación post-transcripcional. En este contexto nos propusimos estudiar las proteínas que estarían involucradas en la transcripción de la ARNPIII en T. cruzi. Entre ellas, se caracterizó una proteína del parásito (TcMaf1) que conserva un 20% de identidad con Maf1 humana. En levaduras y humanos Maf1 actúa como inhibidor de la transcripción mediada por la ARN polimerasa III (ARNPIII). Esta enzima está encargada de la síntesis de pequeños ARNs, incluidos todos los ARNts, el ARNr5S y otros ARNs pequeños indispensables para la síntesis proteica, y se encuentra regulada en relación con el crecimiento celular. TcMaf1 se encontraría en muy bajas cantidades en los diferentes estadios del ciclo de vida del parásito. La sobreexpresión de una fusión GFP-TcMaf1 muestra que la proteína se encuentra localizada en el citoplasma, mayormente excluída del núcleo y otras organelas, en todos los estadios del ciclo de vida. En epimastigotas su localización no varía en relación con el ciclo celular, sin embargo, ante condiciones de estress nutricional la proteína migra al núcleo, y se ubica en el entorno del nucleolo. Aún queda por probar la relación funcional de esta proteína con la ARPIII, y si es que tendría una función en la transcripción al igual que sus homólogos de otros eucariotas.

75) ESTUDIO DE REGIONES CONSERVADAS EN EL EXTREMO D E LOS CROMOSOMAS DE TOXOPLASMA GONDII

M. C. Dalmasso 1, F. Agüero 2, S. O. Angel 1

1Laboratorio de Parasitología Molecular, IIB-INTECH sede Chascomús;

2Laboratorio de Genómica y bioinformática, IIB-INTECH sede San Martín. Toxoplasma gondii (Apicomplexa) es el agente causal de la toxoplasmosis, la cual afecta a más de un tercio de la población mundial. En las regiones subteloméricas de Plasmodium falciparum, otro Apicomplexa, se observó una región no codificante que contiene las secuencias denominadas TARE (Telomere Asociated Repetitive Element) involucradas en la segregación de cromosomas y la agrupación de telómeros en la periferia nuclear. El objetivo de nuestro trabajo es determinar la presencia de arreglos particulares en los extremos de los cromosomas de T. gondii. Para ello, comparamos todos los cromosomas entre sí utilizando ACT (http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT) y observamos una región conservada de aproximadamente 25 a 30 Kbp que denominamos ChCER (Chromosome Concerved End Region). Estas se encuentran en 10 de los 14 cromosomas de T. gondii y presentan más de un 65% de identidad entre ellas. Al comparar los ChCER entre sí utilizando Dotter (http://sonnhammer.sbc.su.se/Dotter.html) pudimos determinar un patrón conservado en todas las regiones, compuesto por: una secuencia repetitiva (REP1), un fragmento A (~ 10 Kbp), otra secuencia repetitiva (REP2) seguida de otro fragmento B (~ 10 Kbp). Un análisis detallado de cada ChCER en ToxoDB - Genome Browser (http://toxodb.org/cgi-bin/gbrowse/toxodb/) sugiere que estas regiones contienen principalmente secuencias silenciadas a excepción de la presencia de un gen hipotético al final del Fragmento B. Estos ChCER se encuentran en sintenía entre las 3 cepas analizadas (>98% de identidad) y solo existen en Toxoplasma. Estos resultados demuestran la presencia de un patrón específico en los extremos de los cromosomas de T. gondii.

76) DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE FABPS DE MESOCESTOID ES VOGAE

G. Alvite 1, A. Kun 2, y A. Esteves 1

1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Unidad Asociada a Facultad de Ciencias, IIBCE.

Mesocestoides vogae, no es una amenaza para la salud pública como

ocurre con Echinococcus granulosus. Sin embargo, es un organismo modelo para el estudio de la biología de los cestodos presentando similitudes con tenias de interés sanitario y es de fácil mantenimiento en el laboratorio. Hemos aislado dos genes que codifican para proteínas de unión de ácidos grasos de M. vogae (MvFABPa y MvFABPb). Si bien la función de las FABPs es un tema no resuelto, éstas proteínas serían moléculas clave en la biología de los cestodos ya que son incapaces de sintetizar de novo la mayoría de sus lípidos. Las FABPs participarían en el transporte de lípidos, regulación de la expresión génica, diferenciación celular y regulación del metabolismo lipídico.

Planteamos como objetivo determinar la localización intracelular de las MvFABPs, buscando entender sus funciones específicas. Generamos sueros policlonales contra MvFABPa y contra MvFABPb. Luego de purificados, realizamos inmunohistoquímicas buscando colocalización con marcadores subcelulares específicos y con un análogo de ácido graso.

La microscopía confocal confirmó la presencia de MvFABPa y MvFABPb a nivel nuclear y perinuclear. Observamos colocalización parcial de ambas MvFABPs con mitocondrias, siendo mayor para MvFABPa. También encontramos en Golgi y/o retículo endoplásmico a MvFABPa pero no a MvFABPb, sugiriendo una función específica de MvFABPa en la síntesis de membranas y lípidos. Además, verificamos que M. vogae capta el ácido graso utilizado y éste colocaliza con ambas MvFABPs. Estos resultados confirman resultados previos obtenidos con otras estrategias y nos permiten delinear funciones comunes y específicas para ambas proteínas.

77) UN ÚNICO RESIDUO DEL SITIO ACTIVO DE LA CATEPSI NA L3 DE FASCIOLA HEPATICA ES DETERMINANTE DE SU INUSUAL

ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO

I. Corvo 1, L. Pastro 1, C.R. Caffrey 2, A. O'Donoghue 3, N. Pi-Denis 1, J.H. McKerrow 2, C.S. Craik 3, L. Roche 1 & J.F. Tort 1.

1Dpto. de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Sandler Center for Basic Research in Parasitic Diseases, Universidad de California, San Francisco

(UCSF); 3Department of Pharmaceutical Chemistry (UCSF).

Las cisteína proteasas catepsinas L de Fasciola hepatica constituyen una familia multigénica, dónde CL1 se expresa predominantemente en adultos, mientras CL3 es propia del estadio juvenil invasivo. La especificidad de sustrato de CL3 es inusual para una proteasa de esta familia, dada su marcada preferencia por el clivaje de péptidos con prolina en la posición P2 y su capacidad de hidrolizar colágeno nativo, mientras que CL1 prefiere residuos hidrofóbicos en P2 y no posee actividad colagenolítica. Mediante modelado molecular observamos que la selectividad de sustrato de CL3 podría deberse a las restricciones estéricas impuestas por residuos presentes tanto en el subsitio S2, como en el S3. Para evaluar esta hipótesis, se modificaron mediante mutagénesis dirigida 2 residuos del sitio activo de CL1 y CL3 de manera de sustituir el residuo presente en una enzima por el de la otra. Para estudiar cambios en especificidad se utilizó una biblioteca de péptidos sintéticos con todas las combinaciones posibles de aminoácidos en cada uno de los sitios P1-P4 del sustrato. Encontramos que a diferencia de las demás proteasas de la familia, el bolsillo S3 de CL3 es específico, acomodando preferentemente glicina. CL3 perdió la preferencia por prolina en P2 al sustituir Trp69 por Leu (presente en CL1), mientras que el cambio recíproco en CL1 no alteró sus preferencias en P2, aunque si incrementó el clivaje de glicina en P3. Demostramos que la preferencia de CL3 por péptidos con prolina en P2 se correlaciona directamente con su capacidad de digerir colágeno nativo.

78) EXPRESION DE PROTEINAS DE SUPERFICIE EN TRYPANOSOMA CRUZI

M. L. Chiribao 1,2, A. Parodi Tálice 3, G. Libisch 2, F. Alvarez 4, E. Osinaga 5,

C. Robello 1,2

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay 2 Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur de Montevideo 3 Sección genética Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay

4 Sección Biomatemática, Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay 5 Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina, Montevideo,

Uruguay

El protozoario flagelado Trypanosoma cruzi es el agente causante de la enfermedad de Chagas y presenta un ciclo de vida muy complejo. Durante su ciclo de vida, el parásito se enfrenta a ambientes muy distintos, pasando desde el intestino del insecto vector, al citoplasma de la célula hospedadora y finalmente a la sangre del hospedero mamífero. Por otro lado, existen procesos de diferenciación que involucran distintas morfologías celulares, así como el pasaje de estadíos replicativos a no replicativos e infectivos a no infectivos. Para poder completar el ciclo de forma exitosa, el parásito debe contar con una maquinaria de expresión génica versátil, altamente regulada y coordinada que le permita una rápida adaptación. Existen evidencias que muestran que la regulación en este organismo se realiza principalmente a nivel post-transcripcional. Cerca del 50 % del genoma de T. cruzi codifica para proteínas de superficie dentro de las que se encuentran mucinas, masp, trans-sialidasas y glicoproteínas. Estas cumplen roles esenciales durante el ciclo vital, como la protección frente a la proteólisis, adhesión con la célula hospedera, protección frente al sistema inmune e invasión. En nuestro grupo caracterizamos la enzima que cataliza el primer paso en la síntesis de las mucinas, la cual presenta un patrón de expresión coordinado con la trans-sialidasa, además de una asociación estructural en el genoma del parásito. Recientemente realizamos el transcriptoma de los 3 estadíos principales del parásito por secuenciado masivo, observando resultados muy interesantes en cuanto a los niveles de expresión de las proteínas de superficie.

79) CARACTERIZACIÓN DE LA RESPUESTA DE Trypanosoma cruzi AL PEROXIDO DE HIDRÓGENO: ROL DE LAS PEROXIRREDOXINAS.

1,2 Gardner M. , 1,3 Piñeyro MD, 1,3Robello C, 1,2 Parodi-Talice A.

1 Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur de Montevideo, Uruguay; 2

Sección Genética, Facultad de Ciencias (UDELAR); 3 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR).

Durante su ciclo de vida, Trypanosoma cruzi invade diferentes tipos celulares, desencadenando una serie de respuestas inmunes que incluyen la activación del complemento, neutrófilos y macrófagos. Estos producen especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que contribuyen a la generación de un estrés oxidativo a través de la formación de radicales libres. El establecimiento de una infección exitosa depende de la habilidad del parásito a sobrevivir un ambiente tan hostil. Los tripanosomátidos han desarrollado un sistema de enzimas antioxidantes dependientes de tripanotión que eliminan el peróxido de hidrógeno y otros hidroperóxidos. Las peroxirredoxinas triparredoxinas peroxidasas (Prx) son parte de este sistema de defensa antioxidante. T. cruzi tiene una Prx citosólica y una mitocondrial; son proteínas de 2-Cys típicas, y su actividad depende de sus residuos de cisteína. En nuestro grupo hemos realizado la caracterización proteómica de la Prx citosólica de T. cruzi, trabajando in vitro con la proteína wild type y proteínas que llevan una mutación en la cisteína de su sitio activo, bajo diferentes condiciones de estrés oxidativo. También hicimos análisis proteómicos, incluyendo geles bidimensionales y geles diagonales para evaluar cambios en la expresión y/o modificaciones post-traduccionales de proteínas en respuesta al H2O2. Actualmente estamos en el proceso de construir parásitos que sobre-expresan las Prx wild type y las mutantes de pérdida de función (citosólica y mitocondrial), y con esto esperamos estudiar la respuesta de estos parásitos al estrés oxidativo, los cambios sufridos por las Prxs en el proceso y su posible rol en vías de señalización utilizando H2O2 como segundo mensajero.

80) IDENTIFICACIÓN Y EXPRESIÓN HETEROLOGA EN E. coli DE UNA ASPARAGINIL ENDOPEPTIDASA (LEGUMAÍNA) DEL ESTADÍO J UVENIL

DE Fasciola hepatica.

T. Basika 1,3, G. Maggioli 1, I. Corvo 3, M. Cancela 2, J. Tort 3, C. Carmona 1.

1Unidad de Biología Parasitaria, Instituto de Higiene, UdelaR, Montevideo, Uruguay; +5982 4801597; tbasika@higiene.edu.uy; 2 Laboratorio de Genomica Estructural y Funcional, CenBiot, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,

Porto Alegre, Brasil; 3 Departamento de Genética, Facultad de Medicina, UdelaR.

Fasciola hepatica, es un trematodo parásito que produce pérdidas millonarias en la productividad de rumiantes a nivel mundial. Las enzimas proteolíticas constituyen los principales componentes de los productos de excreción-secreción de este parásito, donde cumplen roles esenciales en la digestión de proteínas, inmuno-modulación e invasión de los tejidos del huésped. Las asparaginil endopeptidasas (comúnmente conocidas como legumaínas) son cisteína proteasas (clan CD, familia C13) que hidrolizan péptidos y proteínas en el extremo carboxilo de un residuo de asparagina. Se expresan en la gastrodermis de helmintos parásitos, tales como Schistosoma mansoni, donde poseen un rol relevante en la activación de otras enzimas, en las cascadas proteolíticas. A partir del análisis de EST (expressed sequence tags) de juveniles recién desenquistados (JRD) de Fasciola hepatica identificamos una nueva legumaína, diferente a las expresadas en adultos. El ADNc completo (1221pb) codifica una secuencia proteica de 407 aminoácidos, con una masa molecular estimada de 46,7kDa, y fue sintetizado por Genscript Corporation (Piscataway, NJ), clonado en el vector de expresión pGS21a (Genscript) y expresado en células de E.coli BL21 (DE3). La proteína recombinante fue producida como una proteína de fusión a la Glutation-S-Transferasa y purificada a partir de los cuerpos de inclusión, obteniéndose una proteína inactiva. Esta proteína fue utilizada para producir un anticuerpo específico en conejos, con el objetivo de realizar estudios de inmunolocalización en los diferentes estadios de F. hepatica. Buscando la expresión de proteasa activa hemos iniciado el clonado de este gen en la levadura Hansenula polymorpha.

81) AISLAMIENTO DE CÉLULAS PROLIFERATIVAS DE MESOCESTOIDES CORTI POR CITOMETRÍA DE FLUJO Y DE UN POSIBLE M ARCADOR

DE ESTAS TIPO PL10.

M.F. Dominguez 1, U. Koziol 1,2, G. Caurla 1, V.Porro 3,A. Kun 5 M. Bollati 3J.Tort 4, E. Castillo 1.

1 Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias ( UdelaR);2Institute of Hygiene and Microbiology, University of Würzburg,;3 Unidad de

Biología Celular, Instituto Pasteur;4 Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UdelaR),5 Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE.

Estudios sobre poblaciones de células proliferativas en platelmintos de vida libre, han demostrado que no existe proliferación entre las células somáticas diferenciadas, siendo células madre indiferenciadas las responsables de la renovación celular. En platelmintos parásitos existen evidencias de un mecanismo similar, y en particular para Mesocestoides. corti , hemos caracterizado estas células proliferativas en estudios previos. Nuestro trabajo actual busca el aislamiento y caracterización in vitro de estas células proliferantes como primer paso hacia cultivos de líneas celulares de este organismo. En este trabajo hemos analizado la población correspondiente a estas células mediante estudio del ciclo celular por citometría de flujo. Actualmente, estamos realizando experimentos para realizar la separación celular de esta población, los que nos permitirá su caracterización morfológica y estudios de expresión de algunos marcadores moleculares previamente aislados. También nos propusimos el aislamiento y caracterización del gen pL10. El mismo perteneciente a la familia de DEAD helicasas y es expresado de forma conservada en las células de la línea germinal, por lo que es considerado marcador molecular de estas células. Hemos aislado un fragmento del gen tipo pL 10 y actualmente estamos realizando experimentos de RACE para completar su secuencia. A su vez, los estudios de expresión espacial por hibridación in situ están en proceso.

INMUNOLOGÍA Y BASES BIOQUÍMICAS DE LA INFLAMACIÓN (82-84)

82) ANÁLISIS DE LOS COMPONENTES DE LA CAPA LAMINAR DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS ACTIVOS SOBRE CÉLULAS

DENDRÍTICAS

Á. Pittini 1, C. Casaravilla 1, J.E. Allen 2, A. Ferreira 1, Á. Diaz1 1 Cátedra de inmunología, Departamento de Biociencias de la Facultad de

Química e Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias, UdelaR; 2 Institutes of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh,

Reino Unido.

La capa laminar (CL) es la cubierta externa, rica en mucinas, de la larva del parásito Echinococus granulosus. Se propone que la CL es en parte responsable del perfil no inflamatorio de respuesta inmune observado en esta infección. Nuestros estudios previos muestran que una preparación particulada de la fracción mucínica de la CL (pLL) induce fenotipos potencialmente tolerógenicos en células dendríticas. Los motivos moleculares que actúan como agonistas sobre las células son susceptibles a proteólisis inespecífica, y no a oxidación de azúcares por periodato. A fin de obtener más información sobre dichos agonistas, en este trabajo se sometió a pLL a tratamientos adicionales. Se ensayó la capacidad de materiales tratados y control de modular la producción de IL-12/23p40 e IL-10 por parte de células dendríticas derivadas de medula ósea de ratón estimuladas con LPS. Se descartó en tanto agonistas a las proteínas del hospedero (fundamentalmente inmunoglobulinas) remanentes en la preparación. También se obtuvo un resultado inicial negativo en relación a la participación de posibles grupos sulfato sobre tirosina que se postula decorarían algunas apomucinas de la CL. En cambio se observó que la reducción/alquilación de enlaces disulfuro, sin alterar la forma física del material, anula totalmente la actividad de potenciación de IL-10 y parcialmente la de inhibición de IL-12/23p40. Dados los resultados respecto a las proteínas del hospedero y la aparente ausencia de proteínas estructurales no-mucinas en la CL, se puede especular con la participación de segmentos no glicosilados de las apomucinas que porten enlaces disulfuro.

83) EL DISELENURO DE DIFENILO PROTEGE CONTRA EL DAÑ O MEDIADO POR PEROXINITRITO EN CÉLULAS ENDOTELIALES P OR

INDUCCIÓN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN NRF-2

B. Fiuza 1, 2; P. Calcerrada 1; G. Peluffo 1; JBT. Rocha 3; R. Radi 1; AF.deBem 2.

1Departamento de Bioquímica and Center for Free Radical and Biomedical

Research, Facultad de Medicina (UDELAR), Uruguay; 2Departamento de Bioquímica,Centro de Ciências Biológicas (UFSC), Brasil;

3Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas (UFSM),Brasil.

Durante las etapas iniciales de la aterogénesis ocurre un incremento en la producción de superóxido (O2

•-) y óxido nítrico (•NO) en los vasos sanguíneos, dando lugar a la formación de peroxinitrito (ONOO-), un poderoso agente oxidante y nitrante, mediador de modificaciónes de la LDL y del daño vascular, reconocidos como eventos importantes durante el proceso aterogénico. Este estudio fue desarollado para evaluar la protección del diselenuro de difenilo (PhSe)2, un nuevo compuesto orgánico de selenio, frente al daño mediado por peroxitrito en células endoteliales. Así mismo buscamos elucidar el mecanismo de acción del compuesto. La exposición de células endoteliales de aorta bovina (BAEC) a peroxinitrito en bolo conduce a un estrés nitroxidativo caracterizado por un consumo del glutatión intracelular y un aumento en la nitración de tirosinas protéicas. Si bien la pre incubación de BAEC con (PhSe)2 0,5 y 1 µM por 24 horas aumenta los niveles basales de GSH, no es suficiente para evitar el consumo de GSH dependiente de ONOO- a pesar de la protección observada en la nitración de tirosinas proteícas tras la preincubación con (PhSe)2. Con el fin de elucidar el mecanismo protector del compuesto, se evaluo la accíon del (PhSe)2 sobre la translocación nuclear del factor de transcripción Nrf-2 el cual controla la activación de genes de enzimas antioxidantes. Efectivamente, el (PhSe)2 promovio la translocación temprana de Nrf-2 al núcleo con mayor eficacia que el ebselen, compuesto antioxidante de selenio prototípico. En suma (PhSe)2 protege parcialmente del estrés nitroxidativo a BAEC en parte por la activación temprana de genes controlados por Nrf-2.

84) HALLAZGO DE ANTICUERPOS EN OVEJAS DIRIGIDOS CON TRA ANTÍGENOS EMBRIONARIOS DE LA GARRAPATA Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, UN ECTOPARÁSITO ESPECÍFICO DEL GANADO BOVINO.

A. Barrios 1*, F. Fossa 1*, D. Gambetta 1*, U. Benavidez 2, P. Berasain 1,3.

1 Unidad de Biología Parasitaria, Dto. de Biología Celular y Molecular, Fac. de Ciencias (UDELAR); 2 Ärea Inmunología, Dto. de Ciencias Microbiológicas, Fac.

de Veterinaria (UDELAR); 3 Departamento de Biotecnología, Instituto de Higiene, Fac. de Medicina (UDELAR)

La infestación del ganado bovino por la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus ocasiona en Uruguay grandes pérdidas estimadas para el año 2006 en 45 millones de dólares; distribuidas en acciones del Estado (4,5%), cueros dañados (6,3%), tratamientos garrapaticidas (44,6%), pérdida de peso del animal, abortos (31,1%) y tratamientos. Esta garrapata es específica del bovino y no parasita las ovejas. En este trabajo demostramos mediante western-blot que un total de 20 sueros de ovejas Corriedale reconocen el mismo perfil de proteínas entre 20 y 120 kDa presentes en el extracto total de huevos de R. microplus. Cuando el antígeno es pretratado con solución de peryodato de sodio, tratamiento que destruye epítopes glucídicos por oxidación, la reactividad de los sueros disminuye notoriamente con las proteínas de 30 a 40 kDa, se mantiene en otros componentes y aparece reactividad sobre uno nuevo de 100 kDa. Esto indicaría que los anticuerpos de la oveja reconocen tanto epítopes proteicos, como glucídicos. La presencia de anticuerpos específicos en las ovejas contra antígenos de huevo de R. microplus, un parásito no habitual en ovinos, y la hipótesis de que éstos anticuerpos puedan interferir con el desarrollo embrionario de la garrapata bovina, nos brinda una herramienta interesante en la búsqueda de nuevos antígenos como candidatos para el desarrollo de futuras vacunas contra R. microplus.

* trabajan por igual

GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA (85-99)

85) ANÁLISIS DEL SESGO EN EL USO DE CODONES SINÓNIM OS EN REGIONES TRANSMEMBRANA EN PROCARIOTAS

A. Iriarte 1, 2, 3, E. Jara 1, H. Romero 1, H. Musto 1.

1Laboratorio de Organización y Evolución del Genoma, 2Laboratorio de Evolución; Facultad de Ciencias, 3Área Genética; Facultad de Veterinaria;

UDELAR.

Los codones sinónimos son tripletes que especifican a un mismo aminoácido. Se sabe que no son equivalentes y que la elección de cada codón sinónimo está influenciada por diferentes fuerzas: deriva génica, selección natural y sesgo mutacional. Se ha demostrado que el cambio de un codón sinónimo por otro puede afectar la cinética del plegamiento generando proteínas no funcionales. Nos propusimos estudiar el uso de codones sinónimos en proteínas de membrana y en los límites de dominios de estas, en procariotas.

Las secuencias de los genomas fueron obtenidas via “ftp” del servidor NCBI GenBank. Mediante el programa TMHMM se identificaron las proteínas de membrana. El estadístico chi cuadrado (χ2) se utilizó para determinar los codones más frecuentes en las regiones transmembranas respecto a la no-transmembranas y a los límites de dominios.

Se observó que ciertos codones terminados en guanina tienden a aumentar sistemáticamente en las regiones transmembranas, presentando una correlación positiva y significativa entre ellos. En las regiones no-transmembranas pudimos observar un aumento de los codones terminados con adenina, citocina y uracilo. No se observo un uso diferencial de codones entre los límites de dominios.

Los sesgos detectados en las regiones transmembranas no parecen asociarse a los codones óptimos. Podemos concluir que las regiones hidrofóbicas tienen un enriquecimiento de ciertos codones sinónimos, patrón conservado en organismos muy diversos no relacionados filogenéticamente. Si bien podría estar involucrada en el fenómeno la velocidad de traducción no parece ser la causa de la tendencia detectada. El sentido de esta observación está en estudio.

86) EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ONCOGÉNICA DE 3 NUEVOS MICRO-ARNs IDENTIFICADOS EN LINFOCITOS B LEUCÉMICOS .

F. Bangueses 1, B. Bonilla 1, MR. García 1, A. Cayota 1, MC. Gûida 1

1 Laboratorio de genómica funcional, Instituto Pasteur de Montevideo. Uno de los mayores descubrimientos en biología molecular de las últimas décadas fue el de los pequeños ARNs, incluyendo a los microARNs (miARNs). La expresión de los miARNs esta marcadamente desregulada en distintos tipos de cáncer y dada su función como reguladores de la expresión génica pueden actuar como oncogenes o supresores tumorales. La leucemia linfoide crónica (LLC) constituye el tipo de leucemia más frecuente y a diferencia de otros tipos de leucemias, en cuya etiología participan determinadas mutaciones o translocaciones cromosómicas, las bases patogénicas de la LLC siguen siendo desconocidas.

Estudios recientes de nuestro laboratorio revelaron la existencia de 4 nuevos miARNs en pacientes con LLC (1200, 1201, 1202 y 1203). Mediante análisis bioinformático se han identificado los blancos más relevantes de cada uno, siendo la cromohelicasa de unión al ADN 5 (CHD5) uno de ellos. CHD5 ha sido descrita como un supresor tumoral en cáncer humano. Por este motivo el principal interés de nuestro grupo es analizar la capacidad oncogénica de los nuevos miARNs y la relación con uno de sus blancos putativos: CHD5. Se evaluó el potencial oncogénico de los miARN por análisis de viabilidad celular y apoptosis al sobre expresar y bloquear los niveles endógenos de los mismos. Resultados preliminares muestran un significativo aumento de la viabilidad al sobre expresar el miARN 1202, y un incremento de la apoptosis al bloquear el miARN 1201, sugiriendo su posible potencial oncogénico.

87) ESTUDIO DE LA INFLUENCIA TRADUCCIONAL DEL SUPRE SOR DE TUMORES PROGRAMMED CELL DEATH 4 (PDCD4) MEDIANTE

SECUENCIACIÓN MASIVA DE HUELLAS POLISOMALES.

J. Sotelo Silveira 1,4 , G. Eastman 1, A. Dipaolo 1, N. Volfovski 2 , C. Stewart 2, D. Munroe 2, N. Colburn 3.

1Instituto de Investigaciones Clemente Estable (MEC); 2SAIC, 3Laboratory of Cancer Prevention, National Cancer Institute-NIH, USA; 4Facultad de Ciencias,

(UdelaR). Programmed Cell Death 4 (PDCD4) es un supresor de tumores que regula la expresión génica a nivel transcripcional y traduccional. Se ha propuesto, aunque no se conocen los blancos de acción, que PDCD4 interaccionaría interfiriendo la acción de la helicasa del complejo de iniciación de la traducción influyendo la capacidad del mismo para resolver estructuras secundarias del ARNm a ser traducido. En este trabajo nos propusimos, mediante la aplicación de secuenciación masiva de regiones protegidas por los ribosomas en polisomas activos (Ingolia et al Science 2009) estudiar a alta resolución la influencia de la PDCD4 en la traducción eucariótica en modelos celulares de cáncer. La estrategia fue el secuenciado masivo (SOLiD) de huellas polisomales en condiciones de supresión del factor PDCD4 mediante siRNA. Luego de la cuantificación del mapeo de huellas sobre ARNm indican que sería posible un amplio espectro de regulación traduccional por parte de PDCD4. Esto posibilita, por primera vez, generar un perfil traduccional para más de 500 ARNm localizados en la maquinaria traduccional activa en ausencia de este factor. A su vez se verifican en líneas generales características traduccionales generales observadas previamente en levaduras y células de mamíferos, así como patrones de huellas en regiones no traducidas que indicarían posicionamiento ribosomal fuera del las regiones codificantes clásicas. La posibilidad de generar mapas traduccionales a alta resolución, así como generar perfiles traduccionales en diferentes situaciones de estudio también podrían tener claras aplicaciones en identificación del amplio espectro regulatorio de la traducción tanto en proyectos básicos o aplicados.

88) DETECCIÓN DE CEPAS DIVERGENTES DE PARVOVIRUS CA NINO EN URUGUAY

Stephanie Zoller , Pablo Bianchi, Lourdes Francia, Leticia Maya, Kat ia Sosa, Martín Hernández, Valeria Picun, Yanina Panze ra y Ruben Pérez. Sección Genética Evolutiva. Departamento de Biología Animal. Instituto de

Biología. Facultad de Ciencias. UdelaR.

El Parvovirus canino de tipo 2 (CPV-2) es virus autónomo de ADN simple hebra de muy pequeño tamaño (5.2 kb). CPV-2 es uno de los agentes infecciosos más importantes de los canes, donde produce generalmente graves cuadros de gastroenteritis hemorrágica en cachorros. CPV-2 emergió alrededor de 1978 como en nuevo patógeno que rápidamente se esparció por todo el mundo. Se presume que proviene del virus de la Panlukopenia felina (FPV) o de un virus cercano que infecta carnívoros. Existen actualmente tres variantes antigénicas que circulan en las poblaciones caninas: CPV-2a, CPV-2b y CPV-2c. La distinción entre las variantes se basa en la presencia de los residuos aminoacídicos Asn (2a), Asp (2b) y Glu (2c) en la posición 426 de la proteína mayoritaria de la cápside, VP2. Nuestro grupo de investigación, estudió las frecuencias de las variantes CPV-2 presentes en la población canina del Uruguay, durante los últimos cinco años (2007-2011). Nuestros resultados indican que la única variante observada durante el período comprendido entre 2007-2009 fue CPV-2c. En el 2010 la aparición de una nueva variante de CPV-2 fue detectada mediante Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción (RFLP), presentando un patrón de restricción de tipo CPV-2a/2b. Ésta alcanzó una frecuencia relativamente alta (32 %) durante el 2010, que siguió aumentando en el 2011, llegando a un 77% de las variantes circulantes en nuestro país. La secuenciación de las mismas permitió determinar que eran variantes del tipo 2a.

89) LA REGIÓN 8q24, LIGADA AL CÁNCER DE PRÓSTATA Y COLON, INTERACCIONA CON REGIONES INTRA E INTER CROMOSÓMICA S DIVERSAS: ANÁLISIS GENÉTICO DE LA CONFORMACIÓN DE L A

CROMATINA.

V. Romero 1, J. Farias 1, C. Stewart 2, D. Munroe 2 y J. Sotelo Silveira 1,3. 1Instituto de Investigaciones Clemente Estable; 2 SAIC-National Cancer

Institute-NIH, USA; 3 Facultad de Ciencias, UdelaR.

El desierto génico 8q24 ubicado en el brazo largo del cromosoma 8 humano, ha sido vinculado recientemente a patologías como el cáncer de próstata y colon. Al estudiar funcionalmente esta zona hemos descubierto que existían potenciadores o “enhancers” de la transcripción del oncogen MYC, localizado 350kb rio abajo de esta region (Sotelo Silveira et al PNAS 2010). Las interacciones físicas entre estas dos regiones fueron demostradas mediante Captura de la Conformación de la Cromatina o 3C. A partir de estos estudios nos preguntamos si esta región interacciona con otras regiones del genoma humano, que eventualmente regulasen la expresión génica de MYC u otros genes potencialmente importantes en el cáncer. Esto fue investigado mediante una estrategia derivada de 3C, llamada circular chromosome conformation capture (4C), que permite la generación de bibliotecas moleculares de contactos cromosómicos. Estas, luego de generadas, pueden ser analizadas mediante secuenciado masivo, en este caso Ion Torrent. Los mapeos de interacciones realizados, muestran un primer estudio donde se reflejan interacciones intra e inter cromosómicas, localizadas en intrones y regiones próximas (5´) a genes con vinculación a cáncer, entre otros. Esto indicaría por primera vez que esta región, asociada al cáncer de próstata y colon, podría tener una estructura compleja, quizás integrando la actividad transcripcional de varios genes relacionados, como ha sido sugerido en el concepto de las “fabricas de transcripción”.

90) MODULACION POR NITRACION DE LA REACTIVIDAD Y LA CAPACIDAD DE INTERACCION DE ACIDOS GRASOS INSATURAD OS

V. Veroli 1, S. Portillo 1, A. Trostchansky 2, H. Rubbo 2, E. L. Coitiño 1

1Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Facultad de Ciencias, UdelaR; 2Centro de Radicales Libres e Investigación Biomédica, Departamento

de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR.

Los derivados nitrados de los ácidos grasos insaturados (NO2-FA) son especies electrofílicas naturalmente presentes en el organismo [1]. Su estudio ha ido cobrando interés creciente con el tiempo, entre otros motivos debido a la posibilidad de emplearlos como agentes anti-inflamatorios [2]. Los mecanismos por los cuales ejercen este tipo de acción in vivo son objeto de estudio corriente, e involucran tanto la formación de complejos no covalentes con otros actores moleculares de distinta complejidad como el desarrollo de reacciones químicas reversibles para formar aductos covalentes [3]. Estudios recientes señalan que la potencia terapéutica de distintos NO2-FA depende fundamentalmente de la posición del grupo nitro, y en mucha menor escala de su longitud o del número de insaturaciones presentes en la estructura [4].

Aquí presentamos los resultados de un estudio sistemático realizado sobre los ácidos oleico, linoleico y araquidónico con métodos de modelado cuántico DFT (B3LYP/6-31G*) para determinar cuantitativamente de que manera la nitración (y la posición en que la misma se da) modula propiedades moleculares claves tales como la estabilidad, reactividad intrínseca global, reactividad como electrófilo y las características que determinan el comportamiento frente al reconocimiento molecular (forma molecular, volumen, potencial electrostático molecular superficial, etc.) tanto en octanol como en solución acuosa, representados a través de un modelo de continuo (IEF-PCM). Teniendo en cuenta que las interacciones de los ácidos grasos nitrados con proteínas de diversa función fisiológica/patofisiológica tienen lugar bajo la forma carboxilato, el estudio las incluye también a lo largo de toda la serie. [1] Trostchansky, A.; Rubbo, H. Nitrated fatty acids: Mechanisms of formation, chemical characterization,and biological properties Free Rad. Biol. & Med. 2008, 44: p.1887–1896.

[2] Cui, T.; Schopfer, F.J., et al., Nitrated Fatty Acids: Endogenous Anti-inflammatory

Signaling Mediators J. Biol. Chem. 2006, 281(47): p.35686-35698.

[3] Baker, L.M.S.; Baker, P.R.S., et al., Nitro-Fatty Acid Reaction With Glutathione And Cysteine. J. Biol. Chem. 2007, 282(42): p.31085-31093.

[4] Gorczynski, M.J; Smitherman, P.K., et al., Activation of PPARγ by Nitroalkene Fatty Acids: Importance of Nitration Position and Degree of Unsaturation. J. Med. Chem., 2009 52: p.4631-4639.

91) ESTUDIO DE EXPRESIÓN GÉNICA Y GENES VSG EN Trypanosoma vivax UTILIZANDO SECUENCIACIÓN MASIVA.

G. Greif 1; M. Ponce de Leon 2; G. Lamolle 2; M. Rodriguez 2; D. Piñeyro 3; L.

Tabares 4; A. Reyna 4; C. Robello 1,3; F. Alvarez 2

1 Unidad de Biología Molecular, Institut Pasteur Montevideo; 2 Sección Biomátemática, Facultad de Ciencias, UdelaR. 3 Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR; 4 Centro de Estudios

Biomédicos y Veterinarios, Universidad Simón Rodríguez, Venezuela. Los mecanismos de regulación de la expresión génica de los tripanosomátidos aún no están claros y un mejor entendimiento de los mismos nos ayudará a comprender un número importante de procesos como diferenciación, virulencia y variación antigénica. Por otra parte la secuenciación a gran escala ha mostrado ser una herramienta altamente poderosa para el estudio de transcriptomas y genomas. Es en este contexto que planteamos el estudio de la expresión génica de tripanosomátidos a través de la secuenciación masiva de sus transcriptomas en distintas fases del ciclo de vida. Como modelo inicial se plantea T. vivax debido a su interés evolutivo –descendiente directo del ancestro de los tripanosomas africanos- y por ser una zoonosis emergente en la región. En los objetivos de este trabajo nos propusimos obtener el transcriptoma de Trypanosoma vivax utilizando secuenciación masiva (454 e Illumina). Cuantificación de transcriptos y comparación de tecnologías. Búsqueda de mecanismos de regulación génica –por ejemplo, evidencias de degradación diferencial, transcripción de regiones no codificantes de proteínas, etc-. Un último punto de este trabajo, es el estudio de genes codificantes de proteínas VSG. De los resultados obtenidos destacamos: generación de una base de datos con las secuencias obtenidas. Cuantificación de transcriptos y evaluación de la homogeneidad entre ambas tecnologías. Se obtuvo información sobre trans-splicing diferencial para más de 2500 genes. Por otra parte, en cuánto a las proteínas VSG, sorprendentemente se observó altamente expresada una variante caracterizada previamente y aislada en Africa, la cual esperamos caracterizar a nivel molecular y bioquímico.

92) ELEMENTOS IDENTIFIER (ID): SECUENCIAS REGULADOR AS EN CIS?

A. Goldman 1, E. González-López 1, A. Capoano 1 y A. Geisinger 1,2.

1 Departamento de Biología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; 2Sección Bioquímica, Facultad de

Ciencias (UDELAR), Montevideo, Uruguay

Los elementos ID son secuencias medianamente repetidas (SINEs), dispersas en los genomas de roedores. Se originaron por eventos de retroposición no-autónoma del gen BC1, transcripto por la ARN polimerasa III y altamente expresado en cerebro. Se asocia dicho transcripto con funciones regulatorias a nivel postrancripcional en dendritas. Como consecuencia de eventos de retrotransposición a lo largo de la evolución, se insertaron elementos ID dentro de unidades transcripcionales de la ARN polimerasa II (codificantes para ARNm). Durante mucho tiempo se consideró que estas secuencias se localizaban en unidades transcripcionales de genes de cerebro, donde ejercían una función regulatoria tejido-específica en cis. En este trabajo se utilizaron técnicas de Northern-blot y análisis in-silico para determinar la distribución de los elementos ID dentro de unidades transcripcionales dependientes de ARN pol II, tanto tejido-específicas como para genes de uso doméstico (housekeeping). Se encontraron elementos ID distribuidos de manera similar tanto en unidades transcripcionales de genes housekeeping como de genes del tipo tejido-específico. Incluso, la presencia de estos repetidos resultó notoriamente mayor en genes housekeeping, descartando la idea de una función tejido-específica y regulatoria en cis de estos elementos. Por otra parte, la frecuencia de inserción de los elementos ID entre las diferentes regiones dentro de las unidades transcripcionales sugiere una distribución predominantemente al azar, con excepción de aquellas regiones de cuya integridad dependa la adecuada funcionalidad del producto proteico.En suma, nuestros resultados contribuyen a descartar una teoría vigente durante mucho tiempo en relación con la regulación de genes tejido-específicos en el cerebro.

93) IDENTIFICACION DE BLANCOS DE hsa-miR-183 EN CÁN CER DE PROSTATA MEDIANTE INTEGRACION DE ALGORITMOS DE PRED ICCION

Y META-ANALISIS

C. Ottati 1,2, M. Méndez3, N. Maedo3, L. Méndez 3, J.R. Sotelo-Silveira 4,5, M. A. Duhagon 1,2.

1Departamento de Genética. Facultad de Medicina. UdelaR; 2Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias. UdelaR; 3Departamento de Anatomía Patológica. Hospital Policial; 4 Depto. Biología Celular y Molecular.

Facultad de Ciencias. UdelaR; 5 Depto. de Genética. IIBCE.

Los microRNAs (miRs) son moléculas pequeñas de ARN no codificante que regulan la expresión génica, y se encuentran desregulados en procesos patológicos como el cáncer, presentando funciones oncogénicas o supresoras de tumores. En cáncer de próstata (PCa) se han identificado grupos de miRs desregulados, entre ellos hsa-miR-183 .

Estudios preliminares de niveles de expresión de hsa-miR-183 muestran un incremento en muestras tumorales de PCa. Sin embargo, hasta el momento se desconoce su función y no se han reportado blancos directos de hsa-miR-183 en PCa.

Para avanzar en la comprensión de estos aspectos se realizaron predicciones de genes blancos mediante algoritmos computacionales (miRbase, Miranda, PicTar, Targetscan, Tarbase) y se investigó si estos genes se correlacionan con PCa utilizando Oncomine. Esto permite interrogar la expresión de genes teóricos en los estudios clínicos más extensos de expresión génica hasta ahora publicados en PCa.

Identificamos 363 genes con sitios blancos para hsa-miR-183. La sub-expresión de los mismos se correlaciona significativamente (p≤0,0001, disparidad 2) con varios aspectos clínicos del PCa (estatus clínico y genético, evolución clínica, metástasis, grado y estadio).

162 de ellos se ven significativamente subexpresados a nivel de ARNm en PCa relativo al tejido prostático normal, apoyando nuestros resultados previos. Estos resultados apoyan la hipótesis de una función oncogénica de hsa-miR-183 en PCa.

Para aproximarnos a la función de hsa-miR-183, se muestran estudios de Gene Ontology, vías de señalización y metabólicas y estudios de modulación traduccional utilizando datos de expresión proteica obtenida por inmunohistoquímica (como los depositados en The Human Protein Atlas).

94) ANÁLISIS DE REORDENAMIENTOS CROMOSÓMICOS EN HEM ATO-ONCOLOGÍA Y REGIONES DE HIPEREXPRESIÓN GÉNICA

F. F. Santiñaque 1*, L. Lafon-Hughes 1*, M.V. Di Tomaso 1, B. López-Carro 1,

P. Liddle 1, R. Bonomi 2, G.A. Folle 1

1Departamento de Genética, IIBCE; 2Citogenética Hematológica, AEPSM Se realizó un meta-análisis para estudiar la posible correlación entre la localización de sitios de fractura cromosómica (SFC) de translocaciones hemato-oncológicas y las regiones hiperacetiladas (H4+a) y de elevada expresión génica (RIDGEs) del genoma humano. Se analizaron las translocaciones de las siguientes entidades nosológicas: síndromes mieloproliferativos crónicos, síndromes mielodisplásicos, leucemias agudas no linfocíticas y linfocíticas a células B y T, linfomas no hodgkinianos, síndromes linfoproliferativos crónicos y leucemias relacionadas al tratamiento. La información de los SFC a nivel de sub-banda se obtuvo de las siguientes bases de datos: http://atlasgeneticsoncology.org/Anomalies/Anomliste.html y http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway. Los SFC se mapearon sobre un idiograma de 860 bandas y sub-bandas (ISCN). Dicho análisis reveló que la distribución de los SFC (n = 998) no es al azar (test de χ2, p<0.001) observándose una localización preferencial de los SFC en sub-bandas hiperacetiladas y RIDGEs. Sólo 150 de 860 sub-bandas participaron en las translocaciones analizadas. Un pequeño conjunto de sub-bandas mostraron una elevada tendencia a translocarse con numerosas (10 a 60) regiones diferentes del cariotipo humano. Los resultados obtenidos podrían explicarse por la conformación abierta de la cromatina en regiones de alta expresión génica, permitiendo mayor facilidad para la producción de intercambios cromosómicos en caso de generarse fracturas tanto espontáneas como inducidas por clastógenos. El reciente descubrimiento de la existencia de usinas transcripcionales (“hubs”) en el núcleo interfásico, en las cuales se congregan asas de diferentes regiones del genoma para su co-expresión, podría explicar la alta frecuencia de translocación que exhiben ciertas regiones cromosómicas. Financiado por la Comisión Honoraria de Lucha Contra el Cáncer (CHLCC) * Ambos autores aportaron igualmente en esta investigación.

95) ESTRUCTURA Y RECONOCIMIENTO MOLECULAR PARA UNA NUEVA VARIANTE (L163R) DE LA PROTEINA von HIPPEL-LINDAU ( pVHL)

C. Mathó 1, A. Merlino 2, G. Sansó 1, P. Pennisi 1, E. L. Coitiño 2

1Centro de Investigaciones Endocrinológicas (CEDIE), Hospital de Niños "Dr. Ricardo Gutiérrez", Buenos Aires, Argentina; 2Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica, Facultad de Ciencias, UdelaR,

Uruguay La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un sindrome hereditario causado por mutaciones del gen VHL. Predispone al desarrollo de una variedad de tumores benignos y malignos. La proteína codificada por VHL (pVHL) integra un complejo multiproteico con Elonguinas B y C, Cullina2 y Ring Box protein 1, cuya función es poliubiquitinar a HIF1α, determinando su degradación. Objetivo : Analizar in silico las características estructurales que definen la naturaleza de las interacciones moleculares de la pVHL en el complejo multiproteico, modelando la nueva variante génica (L163R) para predecir si se afecta la función de pVHL. Metodología : Se emplearon herramientas bioinformáticas y de modelado computacional para predecir y comparar la estructura y propiedades superficiales de la variante L163R y pVHL nativa en el contexto del complejo multiproteico (PDB ID 1LQB) rodeado por agua explícita y contraiones, evaluando su energía de formación a nivel clásico con los campos de fuerza AMBER (proteínas) y TIP3P (agua). Resultados : La estabilidad del complejo formado resultó menor para la variante L163R que para la proteína nativa. Esto sugiere que la mutación podría disminuir la estabilidad o incluso impedir la formación del complejo, atribuyendo un posible rol de esta variante en la fisiopatología de la enfermedad. Conclusiones : El modelado computacional fue utilizado como herramienta eficiente para predecir cambios estructurales producidos por la variante L163R en la pVHL, permitiendo orientar los experimentos in vitro a realizar para su caracterización funcional.

96) DIVERSIDAD GENÉTICA DE POBLACIONES DE FILOXERA DE LA VID (DAKTULOPHAIRA VITIFOLIAE, HEMIPTERA: PHYLLOXERIDAE)

L. Bao 1, I. Scatoni 1, C. Gaggero 2, L. Gutierrez 3, A. Walker 4, J. Monza 5.

1Departamento de Protección Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2Departamento de Biología Molecular, IIBCE; 3Departamento de Biometría,

Estadística y Computación, Facultad de Agronomía (UDELAR), 4Viticulture and Enology Department, Universidad de California Davis, 5Departamento de

Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR). Daktulosphaira vitifoliae es un insecto que se alimenta preferentemente de hojas de vides americanas y raíces de vides europeas. Recientemente se observaron casos de infestación en hojas de vides europeas en altas densidades, en Uruguay, Italia, Brasil y Perú, modalidad de ataque no esperable. Por esta razón, se caracterizó la estructura genética de poblaciones de hojas de Uruguay, y se analizaron junto con poblaciones de Brasil, Perú y Europa. Se compararon poblaciones de Uruguay procedentes de hoja y raíz de la misma planta. Se detectaron polimorfismos en los ADNs analizando 4 loci de microsatélites con los cebadores DVIT1, DVIT2, DVSSR3, DVSSR4. Las poblaciones de Uruguay presentaron un rango de 3 a 7 alelos por locus, con una media de 4.25. El análisis de varianza molecular presentó 88% de la varianza entre individuos dentro de cada población (FST = 0,122, P<0,001) y 12% entre poblaciones. Este valor de FST sugiere que el flujo génico es limitado. El test de chi cuadrado para la heterocigosidad observada y esperada detectó un desvío significativo del equilibrio Hardy Weinberg (P<0,05), que indica que las poblaciones no presentan apareamiento al azar. Esto sugiere que la partenogénesis es el modo reproductivo predominante. Las distancias genéticas de Nei entre poblaciones extranjeras y uruguayas permitieron establecer cierto grado de diferenciación entre las mismas. Las distancias genéticas de Nei entre poblaciones de hoja y raíz mostraron diferencias entre cinco de los ocho pares de muestras procesadas. La diversidad encontrada representa un significativo potencial de adaptación frente a condiciones ambientales variables.

97) ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE LOS REPETIDOS DI NUCLE ÓTIDOS CA EN Trypanosoma cruzi

L. Pastro ; M. A. Duhagon; L. Guggeri; P. Smircich y B. Garat

Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias, (UdelaR) Trypanosoma cruzi es el protozoario parásito causante de la enfermedad de Chagas. La ausencia de promotores canónicos para la ARNpol-II y la transcripción policistrónica junto con una regulación principalmente postranscripcional de la expresión génica son algunas de las peculiaridades de los trypanosomátidos. Nuestro grupo ha sugerido que las secuencias repetidas de dinucleótidos podrían regular la expresión génica. Para comprender la funcionalidad de los repetidos CA transfectamos epimastigotas de T. cruzi con vectores que expresan genes reporteros (CAT) donde los repetidos fueron clonados en las regiones UTRs correspondientes. Analizamos los niveles de ARNm cat por PCR cuantitativo y encontramos que, la inserción del repetido en el 3’UTR, produce un aumento significativo del nivel de ARNm reportero en estado estacionario. Análisis en presencia de Actinomicina D sugieren que este cambio sería el resultado de un aumento en la vida media del mensajero y varía dependiendo de la posición del repetido. Por otro lado, identificamos in-silico los genes de T. cruzi CL Brener Esmeraldo-like que poseen repetidos de más de 8 nucleótidos en las regiones no traducidas. Encontramos 1081 genes que codifican para proteínas de funciones variadas. Sin embargo, una gran proporción de estas proteínas pertenecen a familias multigénicas involucradas en la infección. Nos planteamos también, la identificación de los elementos que actúan en trans mediante cromatografía de afinidad y análisis por MALDI-TOF-TOF. Los resultados indican que la proteína PEPCK interacciona con los repetidos. Actualmente estamos analizando su rol en la regulación de la expresión génica.

98) CARACTERÍSTICAS COMPOSICIONALES DE LOS GENOMAS DE TREMATODOS

P. Smircich 1,2, N. Dell´Oca, M. Cancela, N. Young 3, F. Alvarez-Valín, R.

Gasser 3, J. Tort 1

1 Cátedra de Genetica. Facultad de Medicina, UdelaR. 2 Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias, UdelaR.

3 Parasite Genetics and Genomics. University of Melbourne, Australia. Los trematodos incluyen varias especies de gusanos parásitos que causan zoonosis y patologías humanas de alta prevalencia. Los estudios genómicos se encuentran poco desarrollados, habiéndose completado únicamente el genoma de Schistosoma mansoni y Schistosoma japonicum. Ambos son altamente repetitivos (50%) y ricos en bases AT (66%), considerándose como modelo de platelmintos. Mediante la comparación global con datos parciales de transcriptomas de otros trematodos observamos que éstos no presentan un marcado sesgo composicional (GC 45%), y que tanto el uso de codones como de aminoácidos difiere significativamente entre los Schistosomas y las demás especies. La reciente disponibilidad de transcriptomas completos de otros trematodos nos permite ahondar en la caracterización de estas particularidades. El análisis gen a gen del contenido de aminoácidos y codones en seis especies de trematodos confirma que los Schistosomas presentan patrones radicalmente diferentes. Para continuar la caracterización observamos los patrones de sustitución de aminoácidos y codones en los posibles genes ortólogos. Se cuantificaron los cambios observados en posiciones ortológas en regiones de alineamientos de alta calidad. Los resultados muestran que S. mansoni tiende a sustituir aminoácidos codificados por codones ricos en GC por aminoácidos de características fisicoquímicas similares codificados por codones ricos en AT. Llamativamente estos cambios implican tanto sustituciones simples a nivel de ADN entre codones no sinónimos así como también sustituciones en 2 o incluso las 3 bases del codón. Estas particularidades pueden vincularse a procesos selectivos exclusivos de los Schistosomas, sugiriendo además que estos organismos no representan cabalmente la diversidad de los trematodos.

99) ANÁLISIS DE LAS RESPUESTAS GÉNICAS FRENTE AL DÉ FICIT HÍDRICO EN UN MUTANTE DEFICIENTE EN GLUTAMINA SINTE TASA

PLASTÍDICA

P. Díaz1, M. Betti 2, O. Borsani 1, A. Márquez 2 y J. Monza 1 1 Laboratorio de Bioquímica. Departamento de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Montevideo-Uruguay; 2 Departamento de Bioquímica Vegetal y

Biología Molecular. Facultad de Química. Sevilla-España.

La glutamina sintetasa (GS) participa en la asimilación de amonio derivado de la reducción de nitrógeno o de la fotrrespiración. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol de la GSp en respuestas de la expresión de genes en condición de déficit hídrico en la leguminosa modelo Lotus japonicus. El análisis del transcriptoma mostró que el mutante carente de GSp en condición de déficit hídrico induce-reprime tres veces más genes que el salvaje. Mientras 7915 secuencias de genes fueron inducidos-reprimidos por déficit hídrico en el mutante, 2608 lo fueron en el salvaje. Del total de genes inducidos-reprimidos, 2070 fueron comunes en los dos genotipos, y el grado de inducción-represión fue siempre mayor en el mutante que en el salvaje. Entre los genes que se indujeron se encuentran los relacionados a proteínas transportadoras de aminoácidos y transaminasas, y entre los que se reprimieron los que codifican para proteínas estructurales de los fotosistemas y de la defensa antioxidante enzimática. La deficiencia de GSp se acompañó también de la sobreexpresión de algunos genes del metabolismo de prolina y GABA, aunque la concentración de estos osmolitos fue menor en el mutante. Varios genes están fuertemente regulados por déficit hídrico en el mutante, lo que muestra que la proteína GSp es crucial para la maquinaria de respuesta al déficit hídrico en plantas.

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BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ANIMAL (100-113) 100) ESTUDIO DE LA LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS P ROTEÍNAS

BBS2 Y BBS7

B. Torrado 1, C. Gascue 1, F. Irigoín 1,2, J. Badano 1 1 Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur de Montevideo; 2

Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, UDELAR

El síndrome de Bardet-Biedl es una ciliopatía altamente pleiotrópica que ha sido caracterizada a nivel genético, con 16 genes causales identificados a la fecha. Datos obtenidos en nuestro laboratorio mostraron que algunas proteínas BBS poseen roles extra-ciliares afectando la expresión génica. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar la localización subcelular de las proteínas BBS7 y BBS2 con énfasis en la capacidad de las mismas de entrar al núcleo. En cultivos no sincronizados observamos diferentes localizaciones (citoplasmática, centrosómica y nuclear). Pensamos que la localización subcelular podía cambiar a lo largo del ciclo celular para lo cual pusimos a punto un protocolo de sincronización de células en fase G0 y S y estudiamos la localización de BBS7 y BBS2 por inmunofluorescencia y fraccionamiento subcelular seguido de Western Blot. Observamos cambios en la localización de BBS7, que cambia de una distribución homogénea en G0 a una localización perinuclear en fase S. Por el contrario, BBS2 se localiza en el núcleo tanto en G0 como en fase S. Además, generamos una línea célular establemente transfectada con BBS7 fusionada a GFP donde observamos una correlación entre la presencia de cilias y la localización nuclear de BBS7. Por lo tanto, la localización nuclear de BBS7 podría relacionarse con la ciliación, mientras que aún no comprendemos los estímulos que llevan a BBS2 al núcleo. Los próximos estudios estarán abocados a elucidar los mecanismos que regulan la localización de estas proteínas, a fin de entender el rol de las mismas en la fisiología celular.

101) NUEVAS GLUTARREDOXINAS Y TIORREDOXINAS EN LA R ED REDOX DEPENDIENTE DE TIOLES EN PLATELMINTOS PARÁSIT OS

H. Bisio 1, M. Bonilla 1, G. Salinas 1

1 Cátedra de Inmunología, Facultad de Química-Facultad de Ciencias, Instituto de Higiene, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Las Tiorredoxinas (Trxs) y las Glutarredoxinas (Grxs) son oxido-reductasas capaces de reducir tanto disulfuros proteicos como disulfuros mixtos glutatión-proteína, y poseen un centro redox típico CxxC/S. Las Grxs monotiólicas del tipo CGFS participan en el ensamblaje y transferencia de centros hierro-azufre. En el presente trabajo identificamos en el genoma de Echinococcus granulosus varios genes que codifican para Trxs y Grxs no caracterizadas previamente, y que corresponden a dos Trxs citosólicas, cTrx2 y cTrx3, y una Grx mitocondrial, mGrx1. Es de destacar que cTrx2 posee 3 Cys adicionales a las del sitio activo, y que mGrx1 posee un sitio activo CGFS. Asimismo, identificamos transcriptos de largo completo de mGrx1, cTrx2 y cTrx3 en el transcriptoma de E. granulosus. Por otra parte obtuvimos evidencias indirectas que sugieren que el dominio Grx de mGrx1 podría expresarse también fusionado a la Ser/Thr proteína quinasa del tipo A. Las secuencias que codifican para estas enzimas fueron amplificadas a partir de ADN genómico o de cDNA de E. granulosus, clonadas en pET 28a y expresadas en E. coli. mGrx1 se obtiene parcialmente soluble, cTrx2 totalmente soluble y cTrx3 insoluble. cTrx2 fue purificada y se constató actividad oxido-reductasa por el ensayo de reducción de insulina.La purificación de las enzimas permitirá la caracterización bioquímica de las mismas y determinar si mGrx1 une centros hierro-sulfurados. Se procurará evidencia directa de si el dominio Grx de mGrx1 también se expresa fusionado a la Ser/Thr proteína quinasa de tipo A.

102) PROPIEDADES DE UNIÓN DE LAS FABPS DE MESOCESTOIDES

VOGAE

C. Silvarrey , G. Banchero, A. Esteves. Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, UdelaR

Las FABPs son proteínas citosólicas conservadas a lo largo de la escala zoológica y de función poco conocida, si bien se ha demostrado su capacidad de unión a ligandos hidrofóbicos. Estas proteínas son moléculas claves en la biología de los cestodes ya que estos organismos son incapaces de sintetizar de novo la mayoría de sus propios lípidos. Nuestro grupo ha aislado dos genes de los platelmintos parásitos Echinococcus granulosus (Egfapb1 y Egfabp2) y Mesocestoides vogae (Mvfabpa y Mvfabpb), que codifican para proteínas de esta familia y con alta similitud entre ellas. E. granulosus es el parásito causante de la Hidatidosis, mientras que M. vogae, si bien de poca importancia sanitaria, es un modelo alternativo muy útil para estudios funcionales. Con el objetivo de profundizar en los posibles roles de las MvFABPs, así como para explicar porqué dos proteínas similares se expresan en el mismo organismo, iniciamos estudios de unión a ligandos. Las proteínas recombinantes purificadas, se titularon con el ligando fluorescente Bodipy FL C16. Una vez determinadas las condiciones de saturación se compitieron con distintos ligandos hidrofóbicos: ácidos grasos, ácido retinoico, bezafibrato, sales biliares y colesterol. Nuestros resultados indican que ambas proteínas tienen afinidades diferentes por los ligandos ensayados.

103) ROL DE FABP1b Y FABP2 EN LA ABSORCIÓN LIPIDICA

EN DANIO RERIO.

M. Flores 1, L. Canclini 2 A. Esteves 1. 1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2Dpto de Proteínas y

Ácidos nucleicos, (IIBCE) La proteínas transportadoras de ácidos grasos,FABPs, son proteínas citosólicas altamente conservadas que unen ligandos hidrofóbicos. Está ampliamente aceptado que participan en el transporte de ácidos grasos, siendo poco conocido el destino intracelular de los ligandos transportados. Las grasas obtenidas a través de la dieta son el mayor aporte de lípidos presentes en el lumen del intestino. Su hidrólisis por los jugos pancréaticos libera grandes cantidades de ácidos grasos de cadena larga que son absorbidos por los enterocitos. La deficiencia en la absorción lipídica es la base de severas patologías; a pesar de ello el papel de los lípidos en la etiología de estas patologías es poco conocido. Se ha demostrado que las FABPs intestinales estarían involucradas en el proceso de captura y distribución intracelular de los ácidos grasos absorbidos. El objetivo de este trabajo fue el estudio del patrón de expresión de las FABPs intestinales, FABP1b y FABP2 en el enterocito de Danio rerio en respuesta a la dieta. Para ello hemos dosificado ambas proteínas y detectado su expresión por inmunohistoquímca, en peces en inhanición y luego de 3 horas de la ingesta. Nuestros resultados indican una clara respuesta a la dieta de ambas proteínas, siendo mayor la expresión luego de la ingesta. En cuanto a la distriubución celular no hemos podido detectar diferencias que permitan inferir funciones específicas.

104) EFECTO DEL HSA-MIR-301B EN CÁNCER DE PRÓSTATA: PROLIFERACIÓN CELULAR Y ACTIVIDAD DE SUS POSIBLES G ENES

BLANCOS.

R. Fort 1,2, J. R. Sotelo-Silveira 3,4, W. Farrar 5, M. A. Duhagón 1,2

1Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR); 3Departamento

de Genética (IIBCE); 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR); 5Cancer Stem Cell Section, National

Cancer Institute at Frederick, NIH.

Nuestro grupo trabaja en la identificación de genes que intervienen en la diferenciación de las células madre de cáncer (CSCs) de próstata (PCa), una población tumoral que incrementa la agresividad de la enfermedad. Utilizando el modelo de diferenciación de CSCs a partir de “prostatoesferas”, se observó que la expresión del hsa-miR-301b disminuye cuando se induce la diferenciación. Se demostró que la expresión del hsa-miR-301b inhibe la diferenciación de las CSCs, incrementa la invasividad y correlaciona con la agresividad de la línea celular. En este trabajo presentamos el estudio del efecto del hsa-miR-301b sobre la proliferación celular. Generamos líneas de PCa (DU145 y LNCaP) que sobreexpresan este microARN y determinamos sus curvas de crecimiento (microscópicamente) y la distribución del ciclo celular (citométricamente). Observamos que el hsa-miR-301b inhibe la proliferación incrementando el número de células retenidas en G1. Asimismo, reduce la actividad metabólica en ensayos de MTT. Mediante análisis bioinformáticos predijimos 308 genes blancos de acción del hsa-miR-301b. Estudios de agrupación en vías de señalización nos sugieren que el hsa-miR-301b participaría en la vía de TGFbeta. El estudio de la actividad del hsa-miR-301b en microarreglos de ARN de PCa (utilizando Oncomine) muestra correlación con dos estudios de recurrencia en un año (p<1.91x10-5 y 2.91x10-13, razón de posibilidades de 2.7 y 3 respectivamente). Finalmente se analiza la expresión a nivel de proteína -Human Protein Atlas- para un grupo de blancos seleccionados en base a su expresión en el set clínico y a la literatura. Las listas de genes obtenidas se presentan y discuten.

105) DISTRIBUCIÓN DE LOS RECEPTORES DE LA HORMONA

LUTEINIZANTE (RLH) EN EL EPITELIO DEL CERVIX OVINO DURANTE EL CICLO ESTRAL.

M. R. Gonzalez , M. Rodríguez Piñón.

Área Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay. michygcamp@hotmail.com

Se estudió la distribución inmunohistoquímica del RLH en los epitelios de las regiones craneal y caudal del cérvix ovino durante el ciclo estral. Ovejas Corriedale adultas fueron sacrificadas a los días 1 (n=6), 6 (n=6) o 13 (n=6) del estro (día=0). Se utilizó un anticuerpo policlonal (hRLH, H-50, Santa Cruz Biotechnology, Inc.CA-USA; dilución 1:75). Imágenes de 10 campos (40X) de la zona apical y basal de los pliegues de la mucosa cervical fueron procesadas para obtener solo los epitelios luminales apical (ALE) y basal (BLE) (Photoshop 10.0), en los que midió el porcentaje de área ocupada por la tonalidad positiva intensa (%intensa) y moderada (%moderada) en función del área total del epitelio (Image Pro Express). Los resultados (media±es) se analizaron por ANOVA (MIXED Proc., SAS), incluyendo los efectos fijos de día del ciclo estral, región cervical, epitelio e interacciones. No se consideró el %intensa por ser menor a 2%. En %moderada hubo un efecto significativo del día del ciclo estral (p<0.002), del epitelio (p<0.0001) y una interacción entre región cervical y epitelio (p>0.001). El %moderada fue menor al día 1 (24.7±3.2) que a los días 6 (35.9±3.7) y 13 (31.7±3.3) y mayor en ALE (40.4±2.8) que en BLE (20.8±1.6). Los ALE y BLE de craneal y caudal fueron diferentes (47.0±3.8, 18.9±2.2 y 31.5±2.9, 23.5±2.0, respectivamente). Los resultados sugieren que la sensibilidad del cérvix ovino a la LH es mayor en la fase luteal respecto a la folicular y en el epitelio luminal apical respecto al basal. Financiación: CIDEC-FacVet; CSIC-UdelaR.

106) ANÁLISIS DEL EFECTO DE LA SUSTITUCIÓN DE CODON ES SINÓNIMOS EN EL PERFIL DE SOLUBILIDAD DE Cu/Zn SUPE RÓXIDO

DISMUTASA

V. Varela 1, M. J. Lista 1, L. Pizzo 1, M. Marín1

1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que lleva a la muerte de las motoneuronas provocando parálisis y posteriormente la muerte del individuo. En aproximadamente el 20% de los casos de ELA familiar se identificaron mutaciones en el gen sod1. Tanto en casos esporádicos como en casos familiares, la Cu/Zn SOD forma agregados intracelulares en el sistema nervioso, principalmente en la médula espinal. Los mecanismos moleculares involucrados en la formación de estos agregados no han sido completamente establecidos. El objetivo de este trabajo es establecer si variaciones de la cinética local de traducción de la Cu/Zn SOD humana expresada in vivo pueden alterar su solubilidad. Se generaron dos variantes sinónimas de la hSOD1 y se expresaron en E. coli BL21 star a 30 y 37°C. Las proteínas fueron fraccionadas mediante centrifugación a 18000g y las fracciones soluble e insoluble fueron analizadas mediante SDS-PAGE y Western blot. Los resultados muestran que las dos variantes de la hSOD1 son solubles igual al wt, cuando se expresan a 30°C, mi entras que los resultados de las expresiones a 37°C están en proceso. Estos r esultados no permiten descartar que las mutaciones hayan ocasionado un cambio en el plegamiento ni en la cinética de traducción. Es necesario estudiar la actividad enzimática, la estructura y las pausas en la cinética de traducción de cada mutante respecto a la hSOD1 wt. Este trabajo se realizó en el marco de una beca de iniciación por la ANII.

107) ROL DE LA ONDA FUGAZ DE CALCIO: REGULACIÓN DE LA

MUERTE PROGRAMADA DURANTE LA CICATRIZACIÓN DE ENDOT ELIO DE CÓRNEA

C. Justet 1, J.A. Hernández 2, S. Chifflet 1.

1Dpto. de Bioquímica, Facultad de Medicina; 2S. Biofísica, Facultad de Ciencias En nuestro laboratorio hemos encontrado que durante la cicatrización de endotelio de córnea bovino (BCE) en cultivo, se produce una onda fugaz de incremento de la concentración de calcio citosólico ([Ca2+]c) (OFCa) dependiente de receptores purinérgicos. La inhibición reversible de la OFCa no provoca cambios significativos sobre la velocidad de cicatrización. Recientemente se ha encontrado que, durante la cicatrización de la piel y la regeneración hepática, se produce muerte celular por apoptosis que induce la proliferación de queratinocitos y hepatocitos respectivamente. En este trabajo estudiamos si existe muerte programada durante la cicatrización en células de BCE y la posible participación de la OFCa en este proceso. Nuestros resultados indican que algunas de las células que migran para sellar la herida mueren durante la cicatrización. Este proceso es detectable con Hoechst 10-12 horas después de realizada la herida y no depende del ancho de la misma. Las células que mueren son positivas para anexina e ioduro de propidio, indicando necrosis o apoptosis tardía. Además, presentan activación de caspasa-3. La inhibición reversible de la OFCa con ciclopiazónico-EGTA provoca una duplicación del número de cuerpos apoptóticos o necróticos por micrómetro de largo de herida (nCAN/µm). El nCAN/µm vuelve a sus valores normales después de la inducción de un incremento de [Ca2+]c con 100µM de ATP. En su conjunto, estos resultados sugieren que durante la cicatrización en BCE se produce muerte programada dependiente de caspasa-3 y que la OFCa tiene un rol modulador de este proceso.

108) CARACTERIZACIÓN DE LA REGULACIÓN DE LA EXPRESI ÓN Y LOCALIZACIÓN SUB-CELULAR DE CCDC28B

R.Novas 1, M.Cárdenas, F.Irigoín 1,2, C.Gascue 1, J. Badano 1

1Laboratorio de Genética Molecular y Humana, Institut Pasteur de Montevideo; 2Departamento de Histología, Facultad de Medicina,UDELAR

El síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una enfermedad oligogénica en la cual mutaciones en distintos genes interactúan para modular penetrancia y expresividad. Mutaciones en CCDC28B se correlacionan con una presentación más severa de la enfermedad. Datos de nuestro laboratorio indican que CCDC28B cumple un rol importante en la modulación de la vía de mTOR. Para entender el rol de esta proteína en el contexto de mTOR y/o fuera del mismo nos enfocamos en completar la identificación del complejo donde participa CCDC28B así como entender como se regula su expresión y localización. En primer lugar, hemos trabajado para entender como cambia la expresión de CCDC28B en distintas condiciones de división celular, en particular en relación a condiciones caracterizadas por la presencia o ausencia de cilias. Nuestros datos preliminares indican que los niveles de CCDC28B aumentan cuando las células alcanzan confluencia por lo que estamos trabajando para caracterizar en mayor detalle este proceso. Otro aspecto fundamental es la identificación y caracterización funcional del complejo donde CCDC28B participa. Mediante ensayos de levaduras hemos mostrado que CCDC28B interactúa con un número de proteínas asociadas a microtúbulos por lo que estamos determinando como estas interacciones afectan la funcionalidad de CCDC28B, haciendo énfasis en la localización sub-celular de esta proteína. Creemos que estos estudios nos permitirán entender más profundamente el rol de CCDC28B en la vía mTOR así como otras posibles funciones que pueda tener complementando otros trabajos que se están llevando a cabo en el laboratorio.

109) LA SENSIBILIDAD A LA IRRADIACIÓN UV-C DE LAS C ÉLULAS AA8 NO ES POTENCIADA POR UN POSTRATAMIENTO CON INHIBIDO RES DE

PARP

L. Lafon-Hughes Departamento de Genética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente

Estable (IIBCE)

El núcleo de las células eucariotas contiene proteínas, ADN, ARN y un cuarto tipo de biopolímero denominado poli(ADP-ribosa) o PAR. PAR es sintetizada por poli-(ADP-ribosil)-polymerasas o PARPs en una reacción denominada poli-(ADP-ribosil)ación o PARlación y es degradada por poli-ADP-glicohidrolasas. Las células poseen un pool de PAR constitutivo y un pool sintetizado en respuesta a estímulos mitogénicos o estrés genotóxico. La PARlación de proteínas asociadas a la cromatina se correlaciona con hiperacetilación de histonas, hipometilación del ADN y decompactación de la cromatina, facilitando el acceso al ADN de las maquinarias de transcripción y reparación. Por otra parte, requiere clivaje de NAD+, por lo cual su exacerbación puede consumir las reservas energéticas induciendo muerte celular. Si el pool de PAR sintetizado en respuesta al estrés genotóxico cumple realmente un rol para facilitar la reparación del ADN, debería observarse una potenciación de la genotoxicidad por un postratamiento con inhibidores de PARP (nicotinamida, 3-aminobenzamida, DPQ y minociclina) en células sometidas a daño genético. Hemos testado esta hipótesis en células AA8 (fibroblastos de hámster) añadiendo los inhibidores de PARP inmediatamente luego de la irradiación con UV-C. No se observó la potenciación esperada en ensayos de viabilidad (MTT) y eficiencia clonogénica. Estos resultados contrastan con los obtenidos por otros grupos de investigación mediante inhibición o depleción de PARP previa a la irradiación UV-C. .

110) ESTUDIO COMPARATIVO DE LA EXPRESIÓN DE LA BOMB A DE CALCIO DE SERCA2a Y DE LA SIRTUINA SIRT1 EN CORAZON ES DE

RATONES DIABÉTICOS.

A.I. Zambrana 1, N. Oddone 1, V. Bervejillo 1, M. Da Cuña 3, V. Acosta 3, A. Benech 2, J.P. Damian 1, 3, J.C. Benech 1

1Lab. Señalización Celular-Nanobiología, IIBCE; 2Dpto. de Fisiología, Fac. Veterinaria; 3Dpto. Bioquímica, Fac. Veterinaria.

La diabetes mellitus es una enfermedad crónica que afecta millones de personas en el mundo. El síndrome de la Cardiomiopatía Diabética (CD) incluye cardiomegalia, disfunción del ventrículo izquierdo, remodelamiento eléctrico ventricular, etc. Uno de los mayores cambios patológicos observados es una anomalía en la homeostasis de Ca2+ intracelular, atribuida a la alteración de proteínas involucradas en la liberación y captación del Ca2+. Evidencias recientes sugieren una relación directa entre expresión y actividad SIRT1, y la expresión de SERCA2a en la diabetes tipo-1. Para poder estudiar esta patología, hemos realizado los siguientes ensayos: 1) hemos obtenido ratones diabéticos (valores de glicemia > 250 mg/dl) por inyección intra-peritoneal de streptozotocina (150 mg/kg). La streptozotocina produce necrosis selectiva de células beta del páncreas, resultando en animales diabéticos tipo-1; 2) utilizando anticuerpos específicos, identificamos SIRT1 y los transportadores de Ca2+ SERCA2a, NCX1 y PMCA1 en homogenizados de corazón de ratones control; 3) en homogenizados de corazón de ratones diabéticos de 45 días, la expresión de SERCA2a fue menor que en homogenizados de corazón de ratones control de 45 días, la expresión de SIRT1 no se vio modificada; 4) hemos logrado medir actividad SIRT1 en muestras congeladas de corazón de ratones control y mediremos la actividad SIRT1 en muestras congeladas de corazón de ratones diabéticos. Esperamos constatar una menor actividad SIRT1 en corazón de ratones diabéticos. Por otro lado, esperamos detectar una recuperación tanto de la expresión de SERCA2a y de actividad SIRT1, en ratones diabéticos de 45 días, tratados con Resveratrol (activador de SIRT1).

111) IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CCDC14, UNA

PROTEÍNA CON POSIBLE FUNCIÓN EN LA ESPERMATOGÉNESIS DE LOS MAMÍFEROS.

E. González López 1, G. Lassabe 1, A. Geisinger 1, 2

1 Departamento de Biología Molecular, IIBCE; 2 Sección Bioquímica/Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

CCDC14 (Coiled-coil domain containing 14) es un gen de expresión

específica del testículo y diferencial de profase meiótica, identificado en nuestro laboratorio empleando rata (Rattus norvegicus) como modelo. Codifica una proteína predicha cuyo rasgo más notable sería la presencia de un dominio coiled-coil. Nuestro interés en CCDC14 se basa en que proteínas esqueléticas específicas de línea germinal masculina como los componentes de los complejos sinaptonémicos y proteínas de la lámina nuclear (de las cuales existen variantes específicas de testículo), presentan dominios coiled-coil.

En este trabajo se presentan los resultados obtenidos hasta ahora en la caracterización del ARNm y la proteína CCDC14. Hemos identificado la secuencia codificante completa. Estudios de RT-PCR semicuantitativos demostraron que el transcripto es específico de células meióticas. Asimismo, hemos clonado la región codificante del gen en un vector de expresión, expresado y purificado la proteína como producto de fusión con GST, e inyectado conejos para producir un suero policlonal contra esa proteína. Ensayos preliminares de Western-blot detectaron una banda del tamaño esperado para la proteína en lisados proteicos de testículo de ratas de 21 días (que se encuentran iniciando la primera onda espermática y cuyos testículos están enriquecidos en meiocitos en profase I), y no en lisados proteicos de otros tejidos, como hígado y cerebro, confirmando que se trata de una proteína específica de profase meiótica. Actualmente nos encontramos realizando ensayos de inmunohistoquímica para estudiar su localización celular de modo de aportar conocimiento tendiente a elucidar el rol de esta proteína en relación con la espermatogénesis.

112) EFECTO DE LA HIPERPOLARIZACIÓN PROLONGADA DEL

POTENCIAL DE MEMBRANA PLASMÁTICA SOBRE EL ENDOTELIO VASCULAR

L. Fajardo , S. Chifflet

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR) La terapia antiangiogénica es una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer. Un modelo utilizado para el estudio de la migración celular en la angiogénesis es el estudio de la velocidad de cicatrización de heridas en endotelio vascular. Se ha demostrado que para que se produzcan los eventos del proceso angiogénico es necesario el debilitamiento de las uniones celulares de endotelio vascular. Nuestro laboratorio encontró que la hiperpolarización del potencial de membrana plasmática modifica el citoesqueleto y estabiliza las uniones celulares en células endoteliales de córnea de bovino en cultivo. El objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de la hiperpolarización del potencial de membrana plasmática (HPMP) sobre la estabilidad de las uniones celulares, la proliferación y la velocidad de cicatrización en endotelio de aorta de bovino en cultivo (BAEC). En este estudio se provocó una HPMP en monocapas confluentes de BAEC mediante la incorporación del ionóforo valinomicina o sustituyendo el cloruro de sodio del medio extracelular por cloruro de colina. Luego de 24 horas de HPMP se evaluó la estabilidad de las uniones mediante el estudio de su resistencia a la incubación en medios sin calcio. La velocidad de cicatrización se estudió mediante análisis de imagen, y la proliferación celular mediante la incorporación de BrdU. Se encontró que la HPMP determina mayor estabilidad de las uniones intercelulares, inhibición de la migración celular e inhibición de la proliferación. La inhibición de la angiogénesis por HPMP podría entonces constituir una estrategia para la terapia antiangiogénica.

113) IDENTIFICACIÓN Y ANÁLISIS DEL EFECTO DE MUTACI ONES EN TP53 ASOCIADAS A LA PATOLOGÍA TUMORAL

I. López 1, L. P. de Oliveira 2, P. Tucci 1, F. Álvarez-Valín 3, R. Coudry 2, M.

Marín1. 1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República,

Montevideo, Uruguay; 2Centro Internacional de Pesquisa e Ensino (CIPE), Hospital A. C. Camargo, São Paulo, Brasil; 3Sección Biomatemática, Facultad

de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. La proteína supresora de tumores P53 es un factor de transcripción que regula vías centrales que controlan el ciclo celular. El gen TP53 se encuentra mutado en más del 50% de los cánceres. El 90% de las mutaciones son puntuales y afectan principalmente el dominio de unión al ADN. Asimismo, el 5% son mutaciones sinónimas, que no cambian la secuencia aminoacídica. Este valor es 20 a 100 veces superior al esperado para mutaciones que no afectan la función de la proteína. El objetivo general del proyecto es comprender el elevado número de mutaciones sinónimas de TP53 en cáncer. Para ello, 1) Se analizó la secuencia codificante completa de TP53 en 101 muestras de cáncer colorectal, agrupadas según sobreexpresen o no la proteína de acuerdo a su detección mediante inmunohistoquímica. En el 54,5% de las muestras se identificó alguna de las 40 mutaciones diferentes detectadas. El número y el patrón de mutaciones entre los dos grupos de muestras resultaron distintos. 2) Se analizó la actividad transcripcional de P53 sobre promotores humanos en levaduras. En este sistema, dos cambios sinónimos estudiados se comportaron como el gen salvaje, mientras que una mezcla de mutantes sinónimos en codones para ciertas Prolinas presentó diferencias con respecto a la proteína salvaje. 3) En células humanas transfectadas, mediante inmunoprecipitación con anticuerpos conformacionales se comparó la reacción de P53 wt y algunos mutantes sinónimos. Los resultados preliminares no arrojaron diferencias claras de precipitación. Sin embargo, el conjunto de los resultados obtenidos reafirman el interés en caracterizar estas mutaciones.

RADICALES LIBRES (114-122)

114) FACTORES PRONÓSTICO NO CONVENCIONALES EN INSUFICIENCIA CARDIACA.

G. Specker 1, A. Denicola 1, D. Murillo 1,2

1Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UdelaR, 2Unidad Multidisciplinaria de Insuficiencia Cardiaca, Dpto. Medico de Medicina,

Hospital de Clínicas, UdelaR.

La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome clínico caracterizado por signos y síntomas de sobrecarga de volumen en los vasos sanguíneos y el intersticio que incluye dificultad respiratoria y edema en los miembros inferiores, así como manifestaciones de inadecuada perfusión de tejidos como fatiga. Existe evidencia que indica que la disfunción ventricular aumenta como resultado del aumento de la producción de especies reactivas de oxigeno y de nitrógeno. Las ROS y RNS son producidas en el corazón por varios mecanismos, que incluyen generación por la fosforilación oxidativa como producto secundario, por la xantina oxidasa, por la NAD(P)H oxidasa y por NOS desacoplada. Estas especies están implicadas en los procesos de patogénesis cardiaca como hipertrofia, contracción reducida, apoptosis de miocitos, remodelación del miocardio, entre otros. El desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes en el miocardio defectuoso resultó en la formulación de la hipótesis oxidativa de la IC, que postula que la IC está caracterizada por un estrés oxidativo sistémico que resulta en una función miocardica disminuida. Nuestro trabajo se basa en esta hipótesis, y tiene como objetivo determinar si existe una relación entre los parámetros clínicos usados para evaluar la IC, como fracción de eyección del ventrículo izquierdo y la clase funcional y los biomarcadores de estrés oxidativo y estrés nitrosativo analizados. Un aumento en la producción sistémica de radicales libres en pacientes con una prognosis pobre fue indicada por varios de los biomarcadores analizados, esto puede permitirnos discriminar grupos de pacientes con un riesgo aumentado de sufrir un evento cardiaco adverso.

115) EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE

NITROALQUENOS DE SÍNTESIS.

C. Carabio 1, H. Cerecetto 3, M. González 3, L. Celano 1.2, L. Thomson 1.2. 1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias; 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres (CEINBIO), Facultad de Medicina; 3Grupo de Química Medicinal, Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias-

Facultad de Química.Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. claudiocarabio@hotmail.com

Las especies reactivas del oxígeno y nitrógeno producidas en procesos metabólicos normales, son inactivadas por defensas antioxidantes del organismo. Un desbalance en esta relación permite que estas especies interaccionen con diversas moléculas blanco, produciendo daño celular asociado a diversas patologías como artritis reumatoidea, aterosclerosis y enfermedades neurodegenerativas. Además en el organismo existen en condiciones normales y patológicas nitrolípidos con propiedades antioxidantes comprobadas. A partir de 14 nitroalquenos sintetizados en el Laboratorio de Química Orgánica (Facultad de Ciencias), nos propusimos estudiar sus propiedades antioxidantes. Se estudió la capacidad in vitro de atrapar radicales peroxilo (•OOR), peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2

•-) y anión peroxinitrito (ONOO-). Los compuestos (1Z)-N,N-dimetil-4-(2-nitroprop-1-enil) bencenamina (809), su derivado 2-nitrovinil (902), (E)-5-(2-nitrovinil)benzo[d][1,3]dioxol (802) y (E)-1-cloro-4-(2-nitrovinil)benceno (0905), fueron buenos atrapadores de •OOR, ONOO-, H2O2. Ninguno fue capaz de reaccionar con O2

•-. Los compuestos más eficientes se ensayaron en macrófagos J774 A.1 activados. La enzima óxido nítrico sintasa se indujo con INF� y LPS y el óxido nítrico se determinó por fluorescencia de diaminofluoresceína. El complejo NADPH oxidasa se indujo con PMA y la producción de O2

•- se determinó por reducción de citocromo c3+. El ONOO- producido a partir de •NO y O2

•- se siguió por oxidación de dihidrorodamina 123. El compuesto 902 (2.5 µM) inhibió la oxidación de DAF en más de un 50% (p<0.01), sin embargo para lograr una inhibición similar de la oxidación de DHR se necesitó 5 µM, posiblemente por competencia con O2

•- por el •NO. El 902 parece ser buen candidato para posteriores estudios farmacológicos en co-cultivo de macrófagos/condorcitos y en modelo de artritis inducida por colágeno (CIA).

116) HOMEOSTASIS DE SULFHIDRILOS INTRAERITROCITARIO S DURANTE EL ALMACENAMIENTO DE GLÓBULOS ROJOS PARA

TRANSFUSIÓN

Amen, F. 1; Touriño, C. 3; Rodríguez, I. 3; Denicola, A. 1,2; Thomson, L. 1,2 Facultad de Ciencias1, y Center for Free Radical and Biomedical Research2, y

Facultad de Medicina3, Universidad de la República.

Durante el almacenamiento, los glóbulos rojos (GR) sufren una serie de alteraciones estructurales y funcionales, conocidas como lesiones de almacenamiento. Las mismas incluyen cambios en la morfología, exposición de fosfatidil serina, vesiculación, y eventualmente lisis celular. Con el fin de examinar la condición redox de los GR en el almacenamiento bajo las condiciones del banco de sangre, se evaluó el estado de oxidación de la hemoglobina intracelular, encontrándose un aumento progresivo en la forma meta dentro del glóbulo. Por su parte, la concentración de sulfhidrilos de bajo peso molecular disminuyó a partir del día 21 de almacenamiento llegando a menos del 50% del valor inicial (2.4 ± 0.13 mM). Conjuntamente con la oxidación de los tioles de bajo peso molecular, empleando electroforesis diagonal y western blot, se encontraron cambios importantes en los estados de oxidación y oligomerización de la peroxiredoxina 2 (Prx2), una peroxiredoxina de 2 cisteínas típica, y la enzima antioxidante más abundante en los GR. A pesar de los cambios encontrados en el estado redox intracelular no se encontraron variaciones en la capacidad de estas células para consumir peróxido de hidrógeno agregado al medio extracelular.

117) CAMBIOS REDOX EN SIRT 1 HUMANA RECOMBINANTE

Leonardo Santos , Ana Denicola Laboratorio de Fisicoquímica Biológica. Instituto de Química Biológica. Facultad

de Ciencias. CEINBIO. Universidad de la República. Uruguay.

Las sirtuinas son enzimas que catalizan la desacetilación NAD-dependiente de lisinas proteicas. Hay siete isoformas humanas, SIRT1-7. La SIRT1, localizada en núcleo y citosol ha sido asociada con varias patologías cardiovasculares, neurodegenerativas y desórdenes metabólicos (síndrome metabólico). El aumento en la actividad de SIRT1, ya sea por sobreexpresión o activación farmacológica con resveratrol, ha mostrado sorprendentes efectos beneficiosos en modelos murinos de enfermedades asociadas a la obesidad, lo que apunta a SIRT1 como un potencial blanco terapéutico. Evidencia más reciente sugiere que SIRT1 puede ser sensible no sólo a NAD/NADH sino también otros moduladores redox como GSH/GSSG o H2O2, lo que sugiere una regulación redox de esta enzima, con importantes consecuencias metabólicas. En este trabajo estudiamos la susceptibilidad de la SIRT1 humana recombinante al estrés oxidativo, analizando cambios estructurales y funcionales. Se purificó la enzima en tres pasos cromatográficos (>99%). La enzima de 80 kDa migra en SDS-PAGE con un peso aparente de 116 kDa y eluye de SEC como un dímero. La enzima reducida con exceso de DTT muestra cinco residuos de cisteína titulados con ditiopiridina, otros 4 Cys coordinan tetrahédricamente Zn2+, más 5 disulfuros (no reducibles por DTT) para contabilizar las 19 C. El tratamiento con concentraciones crecientes de peróxido (H2O2 y peroxinitrito) disminuye la relación SH/mol proteína con pérdida de actividad (ensayada con método fluorescente discontinuo). Cambios estructurales se evidencian sólo luego de tratamiento con gran exceso de peróxido. En el caso de peroxinitrito, se observa nitración de tirosinas sólo con alto exceso del oxidante.

118) PARÁMETROS DE ACTIVACIÓN DE UNA PEROXIRREDOXIN A DE Mycobacterium tuberculosis

Aníbal M. Reyes 1,2, Ari Zeida 3, Martín Hugo 1,2, Darío Estrin 3, Rafael Radi 1,2 y

Madia Trujillo 1,2. 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina; 2Center for Free Radical and Biomedical Research, Universidad de la República, Uruguay; 3Facultad de

Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Las peroxirredoxinas son peroxidasas dependientes de tioles que reducen peróxidos con mayor velocidad que otros compuestos que contienen tioles, mediante un mecanismo catalítico que comienza a ser dilucidado. Nuestro grupo ha reportado que la alquil hidroperóxido reductasa E (AhpE), la peroxirredoxina de 1-cisteína de Mycobacterium tuberculosis, reduce hidroperóxidos lipídicos y peroxinitrito más rápido que peróxido de hidrogeno (H2O2). En este trabajo, estudiamos los parámetros de activación de la oxidación por diferentes sustratos de la cisteína peroxidática (CP) de AhpE y los comparamos con los parámetros obtenidos de la oxidación de la cisteína libre. La energía de activación (Ea) de oxidación de la CP de AhpE por peroxinitrito fue menor a la reportada para la cisteína libre. La Ea de la oxidación de la CP

de AhpE por H2O2 también fue mas baja comparada con la oxidación de la cisteína libre (20.7 vs 70.96 kJ/mol). Como esperábamos de las diferentes constantes de velocidad reportadas, la diferencia entre las Ea de la oxidación del tiol no catalizada y la catalizada por la AhpE fue mayor cuando utilizamos H2O2 como oxidante que con peroxinitrito. La entalpia y entropía de activación para la oxidación de la CP de la AhpE con H2O2 fueron menores en comparación a la oxidación de la cisteína libre. Estos datos están de acuerdo con la estabilización del estado de transición entre el sustrato y residuos específicos de la enzima a partir de la formación de múltiples puentes de hidrogeno, hipótesis propuesta recientemente para explicar la catálisis de las peroxirredoxinas.

119) DESARROLLO DE UN MODELO DE ATEROSCLEROSIS EN R ATÓN PARA EL ESTUDIO DE DROGAS CON POTENCIAL ANTIATEROGÉ NICO

Lamas M 1, Gómez L 2, Trostchansky A 3, Rodríguez J 2, Fernández G 4,

Crispo M 4, López V 2, Rubbo H 3, Ferreira A 1. 1Cátedra de Inmunología y 2Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias-Facultad de Química, UdelaR; 3Depto Bioquímica, LOBBM, Facultad

de Medicina, UdelaR; 4Unidad de Animales Transgénicos y de Experimentación, Instituto Pasteur de Montevideo.

Se puso a punto un modelo de aterosclerosis usando ratones deficientes en el receptor de la LDL con el fin de ensayar drogas con potencial antiaterogénico. Estos animales desarrollan aterosclerosis espontáneamente pero el proceso se acelera cuando ingieren una dieta rica en grasas y colesterol (dieta hipercolesterolémica, HC). Se compararon dos dietas HC, comercial (HCcom) y preparada enriqueciendo con colesterol una dieta básica comercial (HCp), que se administraron durante 4 y 7 semanas. Al final del experimento se evaluó el desarrollo de placa de ateroma en la válvula aórtica por histología tiñendo específicamente los lípidos con oil red. Además, al inicio y final del experimento se determinaron los niveles de colesterol (COL) y triglicéridos (TG) en sangre. Se comprobó que los ratones desarrollan un mayor nivel de placa, COL y TG utilizando la dieta HCp y 7 semanas de tratamiento. En estas condiciones se evaluó la capacidad de prevenir el desarrollo de placa por el ácido nitroaraquidónico (AANO2), molécula que posee in vitro propiedades antiinflamatorias y vasorelajantes. Para esto se inyectaron ratones semanalmente por vía subcutánea con el vehículo (PEG:EtOH) o el compuesto (AANO2 1µmol/dosis/kg ). El análisis de los niveles de COL y TG muestra que los aumentos inducidos por la dieta HCp fueron significativamente menores en el grupo tratado con AANO2 vs el control. Los resultados preliminares del desarrollo de placa obtenidos con 5 ratones de cada grupo no indican diferencias significativas entre dichos tratamientos; se espera el análisis de la totalidad de los ratones para alcanzar una conclusión.

120) EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ALBÚMINA SÉRICA HU MANA

RECOMBINANTE EN PICHIA PASTORIS

R. Lombide 1, I. López 2, M. Marín2, B. Alvarez 1, L. Turell 1,3 1Laboratorio de Enzimología; 2Sección Bioquímica; 3 Laboratorio de

Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

En los últimos años se ha propuesto que la albúmina sérica humana (HSA), tiene un rol antioxidante. El principal responsable de esta propiedad es el único tiol libre entre 17 disulfuros, correspondiente a la cisteína 34. Este residuo, así como sus derivados oxidados, están siendo caracterizados por nuestro grupo. Como parte de esta línea de trabajo planteamos generar mutantes en residuos clave del entorno del tiol. Con este objetivo nos propusimos expresar y purificar HSA recombinante en la levadura Pichia pastoris. La secuencia codificante de la HSA salvaje fue clonada en el vector de expresión pPICZA. Mediante electroporación se transformó la cepa GS115 de la levadura y se seleccionaron 5 clones para los ensayos de expresión. La inducción de la expresión se llevó a cabo durante 96 h agregando metanol (0.5%) y tomando alícuotas del sobrenadante cada 24 h. Los niveles de expresión de los distintos clones se evaluaron por SDS-PAGE, obteniéndose en todos los casos una banda del tamaño esperado para la HSA (66 kDa). Por mapeo tríptico y espectrometría de masa se confirmó que se trataba de HSA. Para la purificación se ensayó una precipitación con sulfato de amonio en dos etapas, a 40% y 60% de saturación respectivamente, no lográndose una buena purificación. A continuación, considerando el bajo punto isoeléctrico de la HSA, se realizó una cromatografía de intercambio aniónico pero la misma tampoco fue exitosa. Actualmente estamos ensayando su purificación mediante cromatografía de afinidad en una columna Hitrap Blue donde la HSA se une al colorante Cibacron Blue.

121) EFECTOS DE LA NITRACIÓN EN LA FUNCIONALIDAD DE LA PRX2 DE GLÓBULO ROJO HUMANO

L. Randall 1,2, B. Manta 3, M. Hugo 2,4, M. Gil 5, C. Batthyány 5, M. Trujillo 2,4, A

Denicola 1,2

1Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República; 2Centro de Investigaciones Biomédicas y Radicales Libres, Universidad de la República; 3Departamento de Bioquímica, Facultad de

Medicina, Universidad de la República; 4Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo

El eritrocito es una célula particularmente sometida a estrés oxidativo debido a una exposición constante a especies oxidantes generadas en la luz del vaso. Para protegerse del daño oxidativo, cuenta con una batería de enzimas antioxidantes entre las que destaca la peroxirredoxina 2 (Prx2), tercer proteína más abundante en el citosol del eritrocito. La Prx2 es un homodecámero formado por la asociación no covalente de 5 dímeros. Es una peroxirredoxina típica (2-Cys Prx) cuyo ciclo catalítico involucra la reacción del peróxido con la cisteína peroxidática de una subunidad para dar ácido cisteínsulfénico, el cual reacciona con la cisteína resolutiva de la otra subunidad del dímero para formar un disulfuro intermolecular, posteriormente reducido por el sistema tiorredoxina dependiente de NADPH. En presencia de altos niveles del peróxido sustrato, la Prx2 puede sufrir inactivación por sobreoxidación de la cisteína peroxidática a ácido cisteínsulfónico. De los posibles agentes oxidantes a los que está expuesto el glóbulo, es de particular importancia el peroxinitrito (ONOO-

/ONOOH). La Prx2 es una eficiente peroxinitrito reductasa pero puede resultar sobreoxidada y nitrada como consecuencia de esta reacción. En este trabajo se explora la relación entre sobreoxidación, nitración y actividad peroxidasa de la Prx2 in vitro. Los resultados sugieren que la nitración de la enzima afecta su estructura decamérica así como su susceptibilidad a la sobreoxidación. La identificación por espectrometría de masa de los residuos modificados contribuirá a entender los cambios estructurales que sufre la enzima y asociarlos con cambios en su funcionalidad en el contexto del eritrocito.

122) USO DE BORONATOS COMO SONDAS PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PEROXINITRITO EN CÉLULAS ENDOTELI ALES

VASCULARES

P. Calcerrada1,2, G. Peluffo1,2, L. Piacenza1,2, B. Kalyanaraman3, R. Radi1,2 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina y 2Centro de

Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Universidad de la República; 3Department of Biophysics & Free Radical Research Center, Medical College of

Wisconsin, Milwaukee, USA.

La formación de peroxinitrito (ONOO-) a nivel endotelial constituye uno de los principales mecanismos responsables de la disfunción endotelial observada en múltiples patologías como diabetes, tabaquismo e hipertensión arterial. La capacidad de detectar y cuantificar los niveles celulares de ONOO- es fundamental para comprender su rol en el desarrollo de tales patologías. Esta tarea constituye un desafío debido a la naturaleza elusiva del ONOO-, a las múltiples reacciones que puede sufrir y a la falta de sondas o footprints específicos. Recientemente se demostró que ONOO- reacciona rápido (k ~ 1 x 106 M-1s-1) con compuestos arilborónicos, con especificidad en relación a otros peroxidos como H2O2 (k ~ 1 M-1s-1) y HOCl (k ~ 1 x 103 M-1s-1), para rendir nitrito y el derivado fenólico del compuesto original. En el presente trabajo se utilizaron dos nuevas sondas basadas en ácidos borónicos para evaluar la formación de ONOO- en células endoteliales aorticas bovinas (BAEC). Utilizando el ácido cumarin-borónico (CBA) fuimos capaces de detectar semicuantitativamente un incremento en la formación de peroxinitrito en BAECs expuestas a DMNQ/NOC-18 y a extracto de humo de tabaco (CSE). Alternativamente y con fines cuantitativos, se utilizó la sonda fenilalanina-4-ácido borónico (FBA), la cual es convertida estequiométricamente en tirosina por ONOO-. Así, la cuantificación de tirosina por LC/MS-MS en BAECs precargadas con FBA fue considerada como medida de la producción de peroxinitrito luego de la exposición a DMNQ/NOC-18 y CSE. Nuestros resultados indican que estas nuevas sondas redox son capaces de detectar directamente peroxinitrito con sensibilidad y especificidad.