MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BloTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Establecimjento de protocolos de solubilización con detergente ypurificación por cromatografía de afinidad de la enzima 3-hidroxj-3-

metilglutaril-CoA reductasa de raíces transformadas de CafAa[ariíAusroseus (L.) G. Don.

Luis Carlos Gutiérrez Pacheco

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.

POSGRAD0 EN CIENCIAS Y BloTECNOLOGI'A DE PLANTAS

Establecímiento de protocolos de solubilización con detergente ypuríficacíón por cromatograf ía de afinidad de la enzima 3-hidroxi-3-

metilglutaril-CoA reductasa de rai'ces transformadas de Oaíharaníhusnoseus (L.) G. Don.

TESIS QUE PRESENTA

Q.F.B LUIS CAF`LOS GUTIÉFIREZ PACHECO

PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS Y BI0TECNOLOGÍA DE PLANTAS

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTI'FICA DE YUCATÁN, A.C.

MÉRIDA, YUCATÁN MÉXICO

2000

"Cada vez que cometo un error me

parece descubrir una verdad que noconocía".

Mauricio Maeterlinck

A mi.s Padres Miguel y Dulce, porque suspalabras de aliento y cariño siempre fueronfuente de ánimo.

áaLtees,Eo,::mMpa.r,'tzfa,c:LCY:nyeíyT:as::np:¡amor del que sólo tú eres capaz.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se llevó a cabo haciendo uso del equipo e instalacionesde la Unidad de Biología Experimental del Centro de lnvestigaciónCienti'Íica de Yucatán, bajo la dirección del Dr. Víctor M. LoyolaVargas a quien agradezco toda la paciencia e interés mostrados en miformación académica durante mi estancia como estudiante deposgrado en esta lnstitución.

EI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi'a otoígó una beca-crédito(89533) para Luis Carlos Gutiérrez Pacheco. El autor agradece esteapoyo recibido.

A mis revisores de tesis, Dres. Enrique Sauri, Teresa Hernández,Lourdes Miranda, Armando Escamilla y Nancy Santana, por susatinadas observaciones y sugerencias que permitieron darle formadefinitiva a este trabajo.

A mis compañeros de laboratorio, F¡osy, Armando, Miguel, Blondy,Marce, Tere y F]afa, por sus valiosos comentarios y porque sin ellos lavida en el laboratorio no sería igual.

A todos y cada uno de los integrantes de la Unidad de BiologíaExperimental, Profesores, Técnicos y Estudiantes, porque cada unosiempre tuvo el suficiente tiempo y las palabras pai.a compartir suexperiencia conmigo.

Al personal de esta lnstitución, que siempre fue oportuno cuandorequerí de su ayuda técnica o logística a lo largo de este trabajo hastasu culminación, y en especial al Lic. Francisco LÓpez y a la fotógrafaAlejandra Gómez.

A toda mi familia por su fe en mí.

ABREVIATURAS

AACTABAAct. Esp.Act. Tot.ADNcADPAJAMPcAMVARNmATPBrij.W-1C. roseusCaMV 35SCG-EMCoACTCCuS04DMAPPDITDXFF]DXFSECEDTAEREFADFMNFPPSGIO-OHasaGA3GPPHcl 6NHMGHMG-CoAHMGLHMGF]HMGSHS-CoAIPPKclkDaKNac4H40e .4H20LPBDmci

Acetoacetil-coenzima A tiolasaAcido AbscísicoActividad específicaActividad totalAcido desoxirribonucléico complementarioDifosfato de AdenosinaAcido JasmónicoAdenosín monofosfato cíclicoAcido mevalónicoAcido ribonucléico mensajeroTrifosfato de AdenosinaPolioxietilén éterCatharan{hus roseusVirus del mosaico de la coliflor fracción 35SCromatografía de gases-Espectrometri'a de masasCoenzima ACobre-tartrato-carbonatoSulfato de cobreDimetilalil pirofosfatoDitiotreitol -

1 -desoxi-D-xi l u losa-5-fosfato red uctoiso merasa1 -desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasaEnzyme Comission (Comisión lnternacional de Enzimas)Sal disódica del ácido tetra-acético etilén diaminoElemento de respuesta a los esteroidesFlavín adenín dinucleótidoFlavi'n mononucleótidoFarnesil pirofosfato sintasaGeraniol-10-hidroxilasaAcido GiberéJico-3Geranil pirofosfatoAcido clorhídrico 6 Normal3-hidroxi-metilgutárico3-hidroxi-metilgutáril coenzima A3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A ligasa3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A sintasaSulfhidrato de la Coenzima Alsopentenil pirofosfatoCloruro de potasioKilodaltonesTartráto de sodio y potasioLipoproteínas de baja densidadMilicurie

MeJaMgc12MGHMKMPKNa2Co3Nac'NADt

R-Ál#+pHNaoH(NH4)2S04PAE-PUEREPKpkatPMSFPPPaQProt. Tot.PuEF'Ep„F]MNSAMSDSSSTDC'4c5'UTR

Acido Metil JasmónicoDicloruro de Ma.gnesio3-metilglutaconil-coenzima A hidratasaMevalonato cinasaMevalonato 5-fosfato ci nasaCarbonato de sodioCloruro de SodioNicotín adenín dinucleótidoNicotinamida adenina dinucleótido tosfato (forma reducida)Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (forma oxidada)Hidróxido de sodioSulfato de amonioProtei'na de activación de las PUEF]E mediante escisiónProtein-cinasaPicokatalesFenilmetil sulfonil fluoruroFosfato de piridoxalQuinona pirroquinolínicaP rote ína totalProteínas de unión a los EREPeso/volumenF`esonancia magnética nuclearS-adenosil-L-metioninaDodecil sulfato de sodioEstrictosidina si ntasaDescarboxilasa de triptofanoCarbono 14F`egión no coditicante

lNDICE DE CUADROS

Cuadrol Distribución de algunos de los grupos importantes demetabolitos secundarios en la naturaleza.

Cuadro 2 F}ecursos empleados para aumentar la producción demetabolitos secundarios en cultivos de células y tejidosvegetales.

Cuadro 3 Metabolitos secLindarios producidos en abundancia porcultivos de células en suspensión.

Cuadro 4 Ventajas de los cultivos de raíces transformadas frente acultivos de células en suspensión en términos de obtenciónde metabolitos secundarios.

Cuadro 5 Algunos efectos fisiológicos y usos medicinales de losalcaloides indólicos de 0. noseus.

Cuadro 6 Algurias estrategias usadas para aumentar los alcaloidesindólicos en células de C. roseus cultivadas /.n v/tro.

Cuadi'o 7 Enzimas relacionadas con la biosíntesi§ de los alcaloidesmonoterpenindólicos que han sido caracterizadas en C.roseus.

Cuadro s Características de las HMG-CoA reductasas purificadas ahomogeneidad a partir de diferentes fuentes.

Cuadro 9 F]egulación de la HMGF} mediante productos de la vi'a delmevalonato.

Cuadrolo Genes de HMGR detectados en diferentes especiesvegetales.

Cuadro 11 Compuestos isoprénicos provenientes de la vía clásica ode la nueva vía de si'ntesi§ del lpp en plantas superiores.

Cuadro 12 Preparación del gel discontinuo de poliacrilamida.Cuadro 13 El detergente Brij W-1 a diíerentes concentraciones y su

precipitación durante su almacenamiento a 4Q C.Cuadrol4 Proceso de purificación de la HMGF} a partir de una

columna de sefarosa azul.Cuadrol5 Elución en lote de la HMGR a partir de una resina de

afinidad del tipo de HMG.CoA-hexil-sefarosa.Cuadro 16 Flesumen de los datos de purificación correspondientes a

la resina de afinidad HMG.CoA-hexil-sefarosa.

lNDICE DE FIGURAS

Flgura l Dibujo anatómico de c. roseus.

Figura 2 Las dos vías que dan origen a la estrictosidina.

Figura3 Estructuras hidrocarbonadas que torman parte de losalcaloides de 0. noseus.

Figura 4 F]uta biosintética de algunos alcaloides indólicos binariosa pariir de los precursores monoterpenindólicos.

Figura 5 Principio de la reglade la biogénesis de los isoprenoides.

Figura6 ProdLictos de la ruta biosintética del mevalonato encélulas animales y vegetales.

Figura7 Enantiómeros correspondientes al ácido mevalónico deconfiguración S y f?.

Figura s Enzimas involucradas en la degradación del 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA.

F¡gura9 Esquemas represemativos de la reacción que lleva acabo la HMGF}.

Figura l0 Características comunes de la topología de la HMGR deanimales y plantas.

Figura ll Estructuras e imágenes tridimensionales de los dímeros,monómeros y sitios activos de la HMGF` de P. meva/on/..v H. sapiens.

Flgura l2 Modelo que explica la regulación de las isoenzimas deHMGF} en levadura.

Flgura l3 Proceso proteolítico de la maduración de las puEF`E.

Flgura l4 Propuesta de chappell de los canales metabólicos paraexplicar la biosíntesis de los isoprenos.

F¡gural5 Propuesta de Lichtenthaler eí a/. de lacompartamentalización de la biosíntesis de los isQprenos.

Figural6 Modelo vigente que explica cómo está configurada lacompartamentalización y la biosíntesis de losisoprenoides en las plantas.

Figura l7 Comparación de la ruta del mevalonato con la nueva víade biosíntesis de lpp.

Figura l8 Diagramade flujodel trabajo experimental.

Figura l9 Diagrama deflujo del diseño experimental.

Figura 20 Curva e§tándar de albúmina sérica bovina, elaboradamediante el método de Peterson.

Figura 21 Validación del método para medirla actividad enzimáticade la HMGR de raíces transformadas de 0. roseus.

Flgura22 Determinación de la estabilidad de la actMdad de laHMGF} a diterente§ temperaturas.

Flgura23 Efecto del almacenam.iento a 49 C sobre la act.ividad

Figura 24

Figura 25

Figura 26

Figura 27

Figura 28

Figura 29

Figura 30

Figura 31

Fjgura 32

Figura 33Figura 34

Figura 35

enzimática de la HMGFi.Solubili.zación de la HMGF] con el fjn de estabilizarla porperi'odos más largos.Variación de la actividad de la HMGF} a lo largo delproceso de extracción/solubilizaci`Ón.Recuperación de la acti.vi.dad de HMGF` en elsobrenadante después de centrifugar a 145,000 x g.F}ecuperación de la actividad de HMGR en elsobrenadante después de aplicar diferentes ti.empos desonicación durante el proceso de solubilizacjón.Recuperación de la actividad de HMGFl en elsobrenadante después de solubilizar con unhomogeneizador de teflón a diferentes tiempos.Efecto de la lemperatura de i.ncubación sobre larecuperación de la proteínas (A) y de la activi.dad deHMGFi en el sobrenadante (8).Recuperación de la acti.vi.dad mi.crosomal inicial y de la

protei'na total en el sobrenadante posterior a lacentrifugación a 190,000 x g.Proceso de elución de la HMGF` a través de una columnade Sefarosa azulFotografías de la electroforesis desnaturalizantedesarrollada en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.Curva de calibración de la concentración de HMG-CoA.Unión de la HMGR a la resina de afinidad.

Modelo para los probables canales metabólicos de losproductos de la o las HMGR presentes en las raícestransformadas de C. /oseus.

CONTENIDO

Breve descripción del metabolismo secundario.Obtención de metabolitos secundarios a partir del cultivo /.n v/.frode células y tejidos vegetales.1.2.1 Reseña histórica del cultivo de tejidos vegetales.1.2.2 Estrategias para aumentar la producción de metabolitossecundarios en cultivos de tejidos vegetales.1.2.3 Uso del cuftwo`de raices transformadas como estrategia

para producir metabolitos secundarios económicamentevaliosos.

Los alcaloides monoterpenindólicos de Caíhamnfhus mseus (L)G. Don.13.1 Descripción, distribución y usos de la planta.1.3.2 Los alcaloides monoterpenindólicos.1.3.3 Estudios realizados en Caíhafflníht/s roseus.Origen y función de los isoprenoides en el metabolismo de losseres vivos.La enzimologia de la biosíntesis de los isoprenoides.1.5.1 Reseña histórica de la investigación sobre la bios¡ntesis

del ácido mevalónico.1.5.2 La via del mevalonato.

1.5.2.1 Del acetil CoA al mevalonato.1.5.2.2 Del mevalonato al isopentenil pirofosfato.1.5.2.3 La acción de preniltransferasas y terpenciclasas.1.5.2.4 Modificaciones secundarias y transformaciones.

Breve descripción de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoAreductasa.1.6.1 La reacc.ión enz.imática.1.6.2 Topologia de la HMGR en células procariotes, plantas y

animales.1.6.2.1 La HMGR de procariotes.1.6.2.2 La HMGR de protozoarios y metazoarios.1.6.2.3 La HMGR de las plantas.

1.6.3 Purificac.ión de la HMGR.La regulación de la HMGR.1.7.1 La regulación de la HMGR de levadura.

1.7.1.1 Regulación por retroalimentación de la HMGR delevadura.

1.7.1.2 La regulac.ión cruzada ejercida por el oxigeno sobrela HMGR de levadura.

Abstl'actResumenlntroducciónCapitulo 11 Antecedentes

1.3

1.6

1.7

2023

232525262627

2728

2931

3133333535

35

36

18

1.9

1.10

1,11

112

1.13

1 7.2 La regulación de la HMGR en mamíferos.1.7.2.1 Regulación de la transcripción de la HMGR de células

de mamíferos.1.7.3 La regulación de la HMGR en las plantas.

17 3.1 Compartamentalización de la HMGR en las plantasLa nueva vía b¡osintétjca de lpp1.8.1 El hallazgo de la nueva vía.1.8 2 La nueva vía también está presente en algas verdes y

hongos.1.8.3 Las plantas superiores también están dotadas de la nueva

vía de biosíntesis del lpp1.8,4 Ruta biosintética del lpp a través de la nueva vía de

TF/piruvato.SíntesisJustificación.Obretivos y metas.Estrategia experimental.Referencias bibliográficas.

Capítulo 22 lvlateriales y métodos.

2.1 Material bjológico.2.2 Preparación del extracto microsomal.2 3 Metodología del ensayo enzimátjco.2.4 Determinación de proteínas.2.5 Protocolo para la purificación de la HMGR.

2.5.1 Solubjlización de la enzjma.2.5.2 Procedimiento cromatográfico.

2.6 Electroforesis en gel de poliacrilamida2.7 Revelado con plata para proteínas con geles.2.8 Protocolo de acoplamíento del HMG-CoA a la resina de amidad

mediante la carbodiimida2 9 Estabilidad de la actividad enzimática de la HMGR a 4°. C y a

-80° C durante su almacenamiento por 30 días2.10 Referencias bibliográficas.

Capitulo 33 Resultados y discusión.

3.1 Cuantifícación de las proteínas solubles totales.3.2 Validación del método para la cuantificación de actMdad

enzimátíca de la HMGR.Estudios del efecto de la temperatura sobre la estabilidad de laactividad de la HMGR.Variación de la actividad a lo largo del proceso deextracción/solubilización.Estandarización de los parámetros para la solubilización de laenzima HMGR.

49

71

71

71

71

727373747475

76

7779

81

81

81

81

82

86

88

3.63.738

3.9

3,J1 0

3 5.1 Uso del sonicador.3 5 2 Uso de un homogenizador de teflón mecanizado3.5 3 Uso de diferentes temperaturas de incübación3.5 4 Resuspensión y recentr.ifugac.ión de la pastilla de

190 000 x 9.

Concentración del detergente durante el proceso cromatográficoElución de la HMGR de una columna de sefarosa azulElectroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio

(PAGE-SDS)Elaborac.ión y prueba de una resina de afinidad del tipo HMG-CoA-hexil-sefarosa.Referencias bibliográficas.

Capitu'0 44 Conclusiones y perspectivas.

4.1 Conclus.iones.4.2 Perspectivas.4.3 Referenc.ias bibl`iográficas.

889091

929494

96

98101

Resumen

La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGF]) (EC 1.1.1.34) cataliza lasíntesis del ácido mevalónico, a partir del cual, después de una serie de pasosenzimáticos, se forma el isopentenil pirofosfato (lpp), unidad principal de construcciónque da lugar a toda la serie de compuestos isoprénicos que intervienen en múltiplesprocesos bioquímicos de las plantas. En células de mamíferos, la HMGF] es la enzimaclave en la regulación de la biosíntesis del colesterol. Comparado con lo que ya sesabe de la enzima en células de mamíferos, en plantas, Ia información disponible esmuy escasa. Se ha sugerido que la HMGF` es la enzima clave en la biosi'ntesis dehormonas, Íitoalexinas y metabolitos secundarios como los alcaloides monoterpén-indólicos. En Oaíha/anmus roseus se sintetiza un monoteípeno, la secologanjna, elcual al condensarse con la triptamina produce la estrictosidina, alcaloide a partir delcual se sintetizan la serie completa de estos compuestos en las Apocinaceas. Dadoque la HMGR no es monogénica en las plantas, existe la posibilidad de que seencuentre más de una isoenzima. El objetivo de este proyecto fue poner a prueba estahipótesis. Para ello iniciamos la purificación de la HMGF` membranal de raícestransformadas de C. roseus. Como pasos previos, se estandarizaron paíámetros útilespara el proceso de purificación, tales como el tiempo y la concentración de proteínasnecesarios para la reacción enzimática y cuyos valores óptimos fueron 10 minutos y 9/L de volumen de extracto vegetal (32.4 /g de protei'na); la estabilidad enzimática de laHMGFi a 4°C, que tue de 36 horas. Dado el carácter membranal de la HMGF], seensayaron varios métodos de solubilización y los mejores resultados se obtuvieron conla congelación del extracto enzimático y su posterior incubación con 6°/o de detergenteno iónico Brij Wl durante 30 minutos a 35°C, y la aplicación de una doblecentrifugación a 190,000xg. Para el proceso cromatográfico, se utilizó una columna deazul de sefarosa, de la que se eluyó la HMGR con un cambio instantáneo de

::::i2:,rcaoc'ósn.,:3,Kzca'¿:o;u:oRerumn'áióapc:,rJ:ácaadr5e:3evc:,:::'3eHT393kpa:n#-?':f.r,aci3resultado obtenido de la electroforesis en un gel desnaturalizante sugiere que la HMGRde C. /oseus podría estar compuesta de 4 subunidades de 50 kDa. Posteriormente sepreparó una columna de afinidad de HMG-CoA sefarosa.

Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron la dificultad para purificar laHMGF}; sin embargo, se estandarizaron los protocolos de la extracción, solubilización yestabilización de la enzima.

Abstract

The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGFt) enzyme (EC 1.1.1.34)catalyses the mevalonic acid synthesis, which, after a series of enzymatic steps, yieldsisopentenyl pyrophosphate (lpp), the main building block which render all variety ofisoprene compounds related with several biochemical processes in plants. Mammal,HMGR is the key enzyme in the control of biosynthesis of cholesterol. Knowledge aboutthe plant enzyme is scarce if compared to mammal's cells, Plant HMGF` has beensuggested as the key enzyme Ín biosynthesis of phytohormones, phytoalexins andsecondary metabolites like monoterpen-indol alkaloids. Caíharaníht/s roseus plantsynthesizes a monoterpen, secologanine, through condensation reaction betweentryptamine, produces estrictosidine, a monoterpen-indol alkaloid the first one of thecomplete series of these compounds on Apocynaceae. Since plant HMGR is notmonogenic, then it could be possible to find out more than one isoenzyme, to provethis, it is necessary to purify HMGR. The objective of this study was to stablish thesolubilization and purifícation protocols to purify the HMGF} of C. roseus transformedroots. We standardized the following parameters: time and extract volume (proteinconcentration) in the enzyme reaction. The best values obtained were 10 minutes ofreaction time and 9 yL of extract volume (32 /g protein). The enzyme activitymaintaíned stable 36 h. at 4°C. Since HMGF} its a membrane protein severalsolubilization methods were assayed, and the best results weíe to freeze the extractand then incubate it with 6% w/v of Brij Wl detergent during 30 minutes to 35°C. Afterthis centrifugate twice at 190,000xg. For chromatographic process, it was used a bluesefarose column, then HMGFl was eluted with instantaneous concentration change ofKcl, and had an specific activity of 7.67 pkat mg.-t prot. SDS-PAGE result§ suggest a 4subunits of 50 kDa each one confomation. Also, elaboration and proof of an HMG-CoA-hexil-sefarose type affinity column took places. HMGF] was purífied partially with the aidof a detergent solubilization and only one affinity column, a second affinity column couldresult in a faster and precise purification protocol, particularly with this enzyme.

Nevertheless the results obtained in this study, the HMGFi shows as a difficult enzymeto purify.

Introducción

La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa, (HMGFl) (EC 1.1.1.34), que catalizala si'ntesis del ácído mevalónico a pahh del 3-metilglutam CoA (HMG-CoA), tiene unafunción imprescindible y fundamental en la producción de la vasta familia de moléculasderivadas de su producto.

Las moléculas producidas a través de la vía metabólica del mevalonato reciben elnombre genérico de terpenos. Sin embargo, Ia denominación común para esleconjunto tan heterogéneo de conipuestos, se basa en su origen bi.osintético, dado que

se forman a partir de una unidad estructural común de cinco carbonos llamada'Sopreno.

Los isoprenoides forman parte de la exten§a colección de compueslos llamadosmetabo" secundarios; estas moléculas,son ubicuas en todos los organismos que seencuentran en la naturaleza y en un principio. predominó la idea de que careci'an deuna funcíón específica en el metabolismo general de los seíes vivos. Sin embargo, alcorrer de los años, el avance de las metodología§ bioqui'micas y el florecimiento de labiología molecular permitieron develar algunas funciones de estas fascinantesestructuras. Ahora se sabe que los isoprenoide§ forman parle de moléculas, máscomplejas, implicadas en procesos estructurales, fisiológicos y metabólicos.Posteriormente, como consecuencia de estudios etnológicos, etnobotánicos yfarmacológicos se determinaron otras cualidades de lo§ metabolitos secundarios quelos hicieron económicamente atractivos para las industrias agroquímica, alimentaria yfarmacéutica.

Emre los metabolitos secundarios, con isoprenoides como parte de su estructura, seencuentra un abundante grupo llamado alcaloides, que poseen propjedades comomedicamemos, saborizantes y venenos.

Desde hace poco más de 20 años, se han realízaclo esfuerzos encaminados a oblenermayor cantidad de metabolitos secundaíios; se han logrado algunos avances,destacando principalmente la producción de metabolilos en sistemas microbianos yvegetales. Gracias al surgimionto de poderosas herramientas, tales como la biologi'amolecular y las diversas estrategias para cultivar tejidos y células, en el futuro sepodrán so§layar muchos de los problemas que actualmente enfrenta la obtención deestos compuestos.

Más de 1,200 publicacíones científicas se han acumulado desde 1950 a la fecha,i.elacionadas con el estudio de la planta medícinal productora de alcaloidesmonoterpenjndólicos, C. tioseus (Moreno et a/., 1995). De entre estos alcaloidesdestacan, por sus cualidades antineoplásícas, la vinblastina y la víncrislina. Estosalcaloides se sintetizan a partm de la secologanína, que a §u vez, se origína de lacondensación de la secologanina (componente isoprenoide) y la triptamina(proveniente del triptofano). La secologanina se origina en la vi'a del mevalonato, por loque la HMGR podri'a ser una enzima limitante en su biosi'ntesis y por lo tanto, regular la

producción de los alcaloides monoterpenindólicos; la existencia de isoenzimas de laHMGFl, su regulación, así como su localización intracelular, ha sido tema de estudiodurante años en diferentes seres v.ivos.

En estudios realizados con plantas, se observó, como resultado de la inducción

:|¥s:Csíf,á:Fseo::es.g:fe(rÑ::::,;oáTuz,,sms:sm,d:d39r!goF,:fai?urguág;'óÉstdoesdLfa:,raezn::Sllevaron a formulaí una serie de hipótesis para explicar el hallazgo. Una de ellas,establece la existencia de canales metabólicos dedicados a la producción deisoprenoides específicos, de acuerdo al estadio fi§iológico de la célula (Chappell,1995). Otra de las hipótesis promueve la existencia de una ruta biosintética deisoprenoides di{erente a la del mevalonato y cuyo inicio está determinado por lacondensación entre el gliceraldehído-3-foslato y el ácido pirúvico (Lichtenthaler er a/.,1997a).

En el presente trabajo, se hace una revisión del conocimiento generado sobre lascaracterísticas y la relación que guarda la enzima HMGF} con la producción deisoprenoides, tale§ como los alcaloides monoterpenindólicos. Además §e discuten lasimplicaciones que tiene la nueva vía metabólica de isoprenoides con la HMGF}. Porúltimo, se presentan los resultados obtenidos de la purificación parcial de la HMGF} enrai'ces transformadas de 0. roseus.

Capl'tulo 1

11 Antececientes

1.1 BREVE DESCRIPCIÓN DEL METABOLISMO SECUNDARIO

Al conjunto de reacciones metabólicas que realizan la si'ntesis y degradación de losácidos nucléicos y las protei'nas (incluso sus precursores), de carbohidratos y ácidoscarboxi.Iicos (como los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxi'Iicos y los ácidosgrasos) se le llama metabolismo primario. Estas reacciones son análogas entre losseres vivos.

Además de las reacciones mencionadas, existen otras que en lo general reciben elnombre de metabolismo secundario, y que producen compuestos qui'micos muypeculiafes. Entre.las particularidades de estas sustancias se tiene que:

• Cada compuesto tiene una djstribución taxonómicamente limitada.

• Dependen del estadio de desarrollo del organismo que los produce.

• Proceden del metabolismo pnmario y poseen múltiples, y en muchos casos,complejas, estructuras qui'micas.

• Carecen de importancia para la célula que los sintetiza, pero son de gran relevancia

para el organismo entero.

En 1891, el fisiólogo vegetal alemán Kossel utilizó por primera vez la denominación"secundario" para jdentificar a estos constituyente§. Posteriormente, en 1921, Czapek

la usÓ para indicar el carácter secundaíio de los alcaloides con respecto a los procesoscelulares. Sin embargo, no fue sino hasta 1950 que Paech y Bonner emplearon eltérmino secundario en un sentido más amplio (Luckner,1990).

El metabolismo secundari.o es iina característica de la especialización celular y supresenci.a durante cieítos estadios del desarrollo en los organismos que los producen,obedece en parte, a la expresión diferencial de los genes involucrados.

Al principio de la investigación sobre los productos naturales, se adoptó la idea de quela síntesis de los metabolitos secundarios sólo era posíble en las plantas; pero eldesarrollo de la bioquímica llevó a la detección de esos compuestos, tanto en cultivosbacterianos, como en animales (Cuadro 1).

Cuadro 1. Distribución de algunos de los grupos` impoman`es do metabolitos secundarios on lanaturaleza (adaptado do Luckner, 1990). Donde X= presencia.

Prescncla

Grupos de metabolitos secundarios Mlcroorg®nlsmos Plantas Anlmale8

Derivados del acetil CoA X X X

lsoprenoides X X X

Derivados del homoisopentenil difostato X X X

Dorivados de vías comunes do aminoácidos X X X

Onginados a partir del L-triptofano X X X

Derivados do la L-{enilalanina y la L.tirosina X X X

Derivados de pinmidina X X

Antibióticos X

1.2 LA PBTENC]ÓN DE METABOLITOS SECUNDAF]los A PARTIR DEL CULTIVO¡ `w wrJ]o DE cÉLULAs v TEjlDos vEGETALEs

Como ya se mencionó anteriormonte, los metabolitos secundarios consisten en ungrupo heterogéneo de sustancias, que son empleadas, principalmente, para propósitosfarmacéuticos y como colorantes, esencias, in§ecticidas y saborizantes. La granmayoría de estas sustancias se producen en cantidades muy pequeñas, las cuales sonsuficientes para las necesidades de los organismos productores, pero no para un usoindustrial. En consecuencia, se han desarrollado múltiples estrategias para eliminaresta limitante. En un principio se utilizó la extracc-ión a partir de sus fuentes naturales.Sin embargo, esto pone en peligío a las especies en cuestión, ya que se requiere degrandes extensiones de cultivo para su explotación comeícial. Por otro lado, el uso deplantas cultivadas en el campo implica que están expuestas a factores adversos.También se ha empleado la si'ntesis qui'mica para prodiicir una amplia variedad demetabolitos secundarios; sin embargo. en muchos casos, su síntesis es muy dif ícil ocasi imposible de realizar de manera rentable, hasta ahora, dada la complejidad de susestructuras químicas. Una alternativa a esta problemática la constituye el cultivo /.n v/.Ínode células y tejido§ vegetales.

i.2.i Fleseña histórica del cultivo de teiidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales se originó a principios de este siglo, cuando en 1902 elfisiólogo vegetal alemán G. Haberlandt expuso su hipótesis sobre la totipotencialidadcelular. En ella manifestó que un cúmulo de células podría convertirse en brotes,estructuras embrionarias y raíces. Sin embargo, él no pudo demostrar su hipótesis.Durante la década de los 30s, se establecieron los primeros cultivos /`r} v/`Íro gíacias alos adelantos alcanzados en la fisiología vegetal; en esa época se indujeron callos apartir del cambium de saLice y de zanahoria.

En el año de 1956 se otorgó la primera patente para la producción de metabolitossecundarios mediante el uso de cultivo de células vegetales, el beneficiario de lapatente fue la empresa farmacéutica estadounidense Pfizer. Durante la década de los60s se dieron avances importantes en la producción de metabolitos secundarios pormedio de cultivo de tejidos. Durante el peri.odo comprendido entre 1975 y 1985 sellevaron a cabo esfuerzos para optimizar, tanto el crecimiento de los cultivos, como laformación de productos. En 1983 se logró producir, por primera vez, a escala industrial,un metaboljto secundario a partir de cultivos de células en suspensión. El procesoempleado fue de dos etapas en biorreactores de 750 L. El producto obtenido fue lashikonina, un colorante con propiedades adicionales de antiinflamatorio yantibacteriano a partir de células en cultjvo de Li.mospermum eo¢h/o/i.zhon (Sasson,1992; Dicosmo y Misawa,1995; Dórnenburg y Knorr,1995; Lowe eía/.,1996).

i.2.2 Estrategias para aumentar la producción de metabolitos secundariosen cultivos de tejidos vegetales

El propósito principal del estudio de la biosíntesis de los metabolitos secundarios hasido generar el conocimiento necesario que permita la explotación comercial de esoscompuestos, mediante sistemas de cultivo de células y tejidos vegetale§. Enconsecuencia, una gran parte de la investigación realizada sobre el tema ha estadodirigida a aumentar la productividad de los cultivos (Cuadro 2).

Cuadro 2. Recursos empleados para aumentar la producción de los metabolitos secundarios encult.ivosdocélulasytejido§vegetales(adaptadodoSasson,1992;DicosmoyMisawa,1995;DÓnenburavKnorr1995)

rMeioramionto de líneas de cultivoBúsquedaseieccLónAntimetabolitos

Modificaciones al medio de cultivoFi`ohormonas

NutrLentesPrecursoresAgitación

Condiciones del cultNo

Luz

pHTamaño del inóculo

TemDeraturalnductores

Técnicas especialízadas

lnmovilización (en gel o superficie)lnductoíes (biótico§ o abióticos)

PermeabilizaciónProducción de nuevos genotipos (lusión de protoplastos o

ingenieri'a genética)Mutágenos

Sistemas de 2 fasesSistemas de 2 etapas

Cultivo de Órganos (rai'ces, brotes, etc.)lnoeniería metabólica

1:?._3._y_5_o:IPI. c.!.Itivo de raípes transformadas como estrategia paraproducir metabolitos secundarios económicamente ,val iososAunque existen ejemplos sobresalientes de cultivos de células vegetales con altosrendimientos de metabolitos secundarios (Cuadro 3), la capacidad del sistema no hapodido aprovecharse al máximo, ya que en muchos casos se encuentran presentesalgunas limitantes, tales como: crecimiento lento; patrón de metabolitos secundariosdiferente al de la plania completa; inestabilidad en la producción de los metabolitossecundarios, Io que deriva en culti.vos improductivos; di.ferenciación celular y/oorganogénesis necesarias para la síntesis de los metabolitos secundarios.

Cuadro 3. MetabolicélulasensuspensVerpoorleeía/.,199tos secundarios producidos en abundancia por cultivos de¡Ón(adaptadodeLoyola-VargasyMiranda-Ham,1990;3,.DicosmovMisawa,1995)

Compueslo Especje vegetal F`endimlento

Antraquinonas Morinda citrifolia 18% del PS \ 2.5 g L-1

Acido rosmarimco Coleus blumeii 15% del PS \ 5.5 g L- '

Berbertna Coptis japonica 10% del PS \ 7 g L-'

Shikonina Lithosperrnun erythrorhizon 20% del PS \ 4.0 g L- 1

Vincamina Vinca minor 3.3 9 L- 1

Para algunas especies vegetales, la utiljzación de raíces transformadas, comoalternativa a las limitantes que tienen los cultivos celulares de esas mismas especies,ha probado ser mejor en términos de la si'ntesís de metabolitos secundarios (Cuadro4).

En este cuadro, únicamente se dan algunos de los ejemplos más sobresalientes, pueshasta el momento se han generado cultivos de rai'ces transformadas en más de 78especies vegetales, tanto para estudios básicos como aplicados (Canto-Canché yLoyola-Vargas,1999).

Cuadro 4. Ventajas de los cultivos de rai.ces transfomiadas frente a cultivos de células en susp©nsión en`érminosdoobtencióndemetabolitossecimdarios.DondeFiT=raícestransformadas;CC=cultivos

11 . PS-Deso seco. PF=Deso frescoce u ares. -EspeclevegetalCompuesto Rendlmiento y edad del cultivoRT'CC2 Cita

C. roseus Ajmalicina

4.0 mg 9_' PS5semana§ 2.0 mg 9 ' PS10años Bhadra 6Í a/., 19932Berlineía/.,1987

Cinchona Quinina

22.5„9 9'' PF 0.11 „g 9 ' PF Hamill eí a/.,1987 2F]obinseía/.,1986

Iedgeriana45 dl'as 33 días

Datura Escopolamina

0.43 mg g" PS 0.00073 mg g 'Monforte-Gonzáloz el a/. , 12992'

stramcmium4 años PS 3 años

Savary y Dougall, 1990

Lupinus spp. lsoflavonoides 8.3 mg g.' 8.5 mg g-' Berlin oÍ a/., iggo' y2

Panax ginseng Saponinas 0.95 % PS 0.65 % PS YoshikawayFuruya,i987'y2

Las raíces transformadas, además de eliminar las limitantes de los cultivos celularesanteriormente mencionados, también poseen otras ventajas tales como:

• Abundante generación de biomasa.

• La producción de metabolitos es muy estable, aún después de un gran número detransferencias.

• En algunos ca§os, las rai'ces excretan al medio los metabolitos sintetizados.

• No necesitan de reguladores del crecimiento en el medio de cultivo.

(Flores eía/.,1999; Sasson,1992; Canto-Canché y Loyola-Vargas,1999).

1.3 LOS ALCALOIDES MONOTERPENINDÓLICOS DE C. f}OSEUS (L.) G. DON

1.3.1 Descripción, distribución y usos de la planta

El nombre genéri.co de la planta proviene de las raíces griegas: i(Q0cpoo, ka!fiaros,puro y cwOoo, anlhos, flor (literalmente pura flor). La denominación hace referencia a laelegancia y belleza de las flore§ (Stearn, 1975).

La clasifi.cación taxonómica de la planta es como sigue:

• Djvísión.. Magnoliophyta

• Clase: Magnoliopsida

• Orden: Gentianales

• Famjlia: Apocynaffie

• Subfamlia: Plumerioi.deae

• Tribu: Plumerieae

• Subtrjbu: Catharanthi.nae

• Género.. Catharanthus

• Especje: roseus

La planta es un arbusto perenne de rápi.do crecimiento, el cual alcanza una altura de30 a 120 cm, su taHo es menudo y enhiesto, Ieñoso en su base y con sendas ramaserguidas de 30 a 60 cm de largo. El tallo, las hojas, los pedicelos, el cáliz, el tubo de lacorola, así como los folículos, por lo general son pubescentes y rara vez, glabros.Presenta hojas ovales simples, enteras y sin estípulas, de 3.5 a 9 cm de largo por 1 a3.5 crn de ancho, con nervadura central color blanco; brotan por pares opuestos, sobretallos cenceños; son siempre verdes, coriáceas, mucronatas y obtusas. Las flores sonaxiales y hermafroditas, poseen un tubo de 2.5 cm de longitud que remata en un planoformado por 5 pétalos de aproxi.madamente 4 cm de diámetro. Las flores son de colorrosa, malva o blanco y con el centro de color carmín. Los folículos tienen de 1.5 a 3.5cm de largo; semillas negras de 2 por 1 mm. Su número cromosómico es 2n=16(Stearn,1975).

Su nombre ha variado a través del tiempo (V/.naa /o//./.s oblongo-ovatis; V/.nca rosea;lochnera riosea; Ammoca//í.s tioseus); no obstante, Ia denominación utilizada es laestablecjda por el naturalista inglés George Don en 1835 (Stearn,1975; Svoboda yBlake,1975).

La planta es endémica del sureste de Madagascar y fue introducida a Europa,probablemente a mediados del siglo XvllI; debjdo a su rápida adaptabilidad, ladistribución actual de 0. roseus es pantropical. En México se encuentra en los estadosde Baja Californi.a Sur, Jali'sco, Oaxaca, Puebla, Veracruz y Yucatán, enw otros;

7

habita en clima cálido desde el nivel del mar hasta los 30 m.s.n.m.; asociada a bosquólropical peronnifolio. Comprendo una variada nomenclatura común: maravilla, ninla,perivinca, teresm vicaria, xmicaria, por mencionar algunos; en la mayoría de los

E:íieesroacng;:itiolo,sgáe:Ci::":lonNoamc?or:a,d,:di.gme:fs:gig?E,.periwinkle„tearn"5:

En un principio, la planta so usó como agente hipoglucemiante; sin embargo, losestudios farmacológico§ han determinado que carece de osa actividad. También existeinlormación concerniente al uso que se le dió durante el siglo pasado en Bra§il a lasinfusiones de las hojas para interrumpir hemorragias y para el tratamiento delescorbuto: como enjuague bucal para aliviar el dolor de muelas y en la cura y limpiezade heridas crónicas (Svoboda y Blal(e, 1975).

En México también hay descripciones del empleo que esta planta tiene, por eiemplo,en Quintana Roo se le usa para cuíar la viruela y el salpullido, además se utiliza paraalgunas irregularidades de la menstruación; para desparasitar, en el caso dealmorranas y heridas o bien, para dolores de cabeza o como antiinflamatorio, mientrasque en Yucatán las infusiones florales se emplean para la oftalmia catarral y baños conlas hojas machacadas para afecciones vaginales (Mendieta y del Amo,1984; lnstitutoNacional lndigenista,1994).

En la actualidad la planta tiene gran valor comercial como fuente de agentesantineoplásicos, dado que algunos de los alcaloides que sintetiza han demostradocabalmente su eficacia contra padecimientos de este tipo.

6

1,3.2 Los alcaloides monoterpenindólicos

Entre la inmensa variedad de metabolitos secundarios, producidos por las plantas conflores, se tiene a los alcaloides, y de éstos el grupo más abundante lo constituyen losalcaloides derivados del metabolismo del triptofano. De los cuatro grupos en los queestán divididos, el de los monoterpenindólicos es el más cuantioso y el número deestructuras conocidas que lo conforman, probablemente sobrepase los 3,000(Verpoorte eía/.,1998).

Básicamente son tres las familias vegetales que contienen este tipo de alcaloides:Apocynaceae, Loganiaceae y F]ubiaceae.

La caracteri'stica más relevante de los alcaloides monoterpenindólicos, acaso consistaen su origen biosintético común, puesto que provienen de un solo precursor: laestrictosidina, la cual es un glucósido procedente de la condensación entre unamolécula de triptamina (formada a partir del triptofano) y un aldehído monoterpénicodenominado secologanina, molécula derivada probablemente del ácido mevalónico, vi'ael dimetilalil y el isopentenil pirofosfatos, el geraniol y el iridodial (Figura 2).

En experimentos realizados /.n v/tro, la reacción de condensación descritaanteriormente conduce a la formación de dos glucósidos epímeros (el vincósido y laestrictosidina). Sin embargo, en la planta la reacción origina exclusivamente laformación de estrictosidina y la lleva a cabo la enzima estrictosidina sintasa (EC4.3.3.2) (Bruneton,1993).

10

BIOSÍM'ESIS DE LA TF]lpTAMINA

T#o+OH

Eritrosa 4-Fostato

Shlkir"to

Corémlto

Antra"lato

EiJFosfoe")lpiruwto

É#:ecr:?s,ato-coo. Triptamm

BIOSÍNTESIS DE LA SECOLOGAMNA

Gerarl'-PP

10-hjdroxi-gerarial

Iridodial

Ácido logário

Ácido secologá"co

c.,;`::.:,:CH3

Estrk)tcx5idim

Flgura 2. La§ dos vías que dan origen a la estrictosídi.na, las flechas de líneas punteadas indican variospaso§ enzimáticos.

11

Los pr.incipales modelos de alcaloides monoterpenindólicos pueden cla§ificarse endiferentes categorías, fundamentadas en §u biogénesis (Parry,1975; Luckneí,1990;Bruneton,1993):

• Grupo l.-Corinante-Estricnos.

• Grupo ll.-Aspidosperma.

• Grupo lll.-lboga.

Para una mejor comprensión, en la figura 3 se muestran las estructurascorrespondientes a esta clasificación.EIIHCoriante-Estr.icnos Aspidosperma lboga

Figura 3. Estructuras hidrocarbonadas que toman parte de los alcaloides de 0. rosGus.

Además del sistema anterior, se han propuesto otros, tal es el caso del de Kisakürek yHess (1980), en cuyo sistema los alcaloides monolerpenindólicos se clasifican en stipos:

• Corinanootipoc

• UncosanootipoD

• Valesiacomatano o tipo v

• Estricnano otipo s

• Aspidosperma otipo A

• EburnanootipoE

• Plumeranootipop

• lboganootipoJ

Además de los grupos mencionados anteriormente, 0. mseus sintetiza alcaloidesindólicos binarios. Estos compuestos incluyen en su molécula dos parte§: dos indoles,o dos dihidroindoles, o un indol y un dihidroindol; estos grupos están unidos unos conotros por medio de enlaces C-C ó C-N. La vinbla§tina y la vincristina son dos ejemplosfundamentales de ese tipo de alcaloides (Figura 4).

12

3. 4 ANHIDFiovmGLASTINA

CATARAmNA

Flgura 4. F¡uta bio§intética de algunos alcaloides indóíícos binarios a partm de los precursoresmonoterpenlndóljcos.

La generaljdad de los alcaloides indólicos producidos por C. roseus poseen activi.dadfarmacológica, según pruebas realizadas en ratones (Svoboda y Blake,1975); sinembargo, sólo unos cuantos son los que han sido empleados como principios activospara la elaboración de medicamentos (Cuadro 5).

13

cDuacdro,5.c?:gausneoys,eá%toÉru,Ls:%Ón:,:8S3Yusosmed,c,na,esde,osa,ca,o,des,nc,ó,,cosdec,os-( e OnlyAl1lde

ActMdad farmacológ icaAdosiselevadasrevier[eloselectos de la Apllcación torapéutlcaCa0Ajmalicina

No se aplica por sÍ sola; forma parte de lasmedicinasdepatenteindicadasparael

adrenalina y regula la actMdad de loscentrosvasomotores,parlicularmenteenlatra`amiento de la mpertensión, accidemescerebrova§culares, traumatismos craneales,rama cerebralasí como sus secuelas neurológicas.

Vincamina Aumenta el llujo sanguíneo del cerebro. lndicada en los problemas psicológicos y deconductaderivadosdelasonilidadcerebral.Elsulfatodevinbiastinaestáindicadoparael

Vinblastina Se unen a la tubulina, impídiendo así latratamiento de la en{ermedad de Hódgkin,formacíón de los microtúbulos, que a su vezcáncer `estícular avanzado, ep¡telioma departicipan en la formación del huso mitótico;Loer,::an§s:guÁemná:,si:t.e;r:Tppaec:asTáo,:'i,g,?l: mama y ovario, sarcoma de Karposi,coriocarcinomas,a§icomoparaalgunos

síntesis de ácidos nucleicos y proteínas, asi casos de histiocitosis.

mismo son neurotóxicos ,

Vincristina_,'\1' ),,` El sulfato de vincrLstina se utiliza en`<Jlcombinacíón con otros medicamentos parael tratamiento de padecimientos tales comola enfermedad de Hódgkin en la cual seaplica iunto con la procarbazina y lapíednisona;ademásseaplicaencascx5de

cáncer de mama y Útero.

1.3.3 Estudios realizados en C. roseus

De entre los alcaloides indólicos producidos por 0. roseus, cuatro han sido los que han

:,:,i!:dn,a::ícmoa;gr.Fá?t:c;aa%ó,ná;,oe::d:g,eT;:§baq,:'sml:t:Í:gé.urt:cdousc,á:suapdorro,a5'É,aenstta:han mot.ivado'una gran cantidad de e§tudios a fin de aumentar su producción yrendimiento en los difere.ntes cultivos in vitro.

Por m᧠de veinte años, Ias estrategias enumerádas en el cuadro 2 se han aplicadocon el mismo fin a 0. roseus. Ninguna, por sÍ sola, ha logrado dar resultados respectoa la vincristina y a la vinblastina (Cuadro 6). Por ejemplo, los resultados obtenidosrespecto al estudio del etecto de la fuente de nitrógeno en el medio de cultM3 soncontradictorios, dado que la concentración de los alcaloides indólicos pueden tantoaumentar como disminuir en su coniunto, o favorecer la acumulación de alguno deello§ en particular; Ia misma tendencia fue observada en el crecimiento del cultivo y enla acumulación de las antocianinas. En vista de que es impredecible el efecto de lavariac'ión de la fuente de n.itrógeno sobre la síntesi§ de los alcaloides indólicos, no esrecomendable entonces hacer uso de esta estrategia para mejorar su producción. Lo

14

mismo sucede con la variación de la fuente de fósforo; sin embargo, existe una clararelación inversa entre el contenido de fósforo en el medio de cultivo y la cantidad dealcaloides sisntetizados por las células (Vázquez-Flota et a/.,1994), en tanto que laalteración de la concentración de la sacarosa tiene efectos definidos sobre la si'ntesisdelosalcaloidesindólicos,puesestosaumentanalaumentaraquellaapesardequeelcrecjmiento pueda afectarse negativamente, acaso como consecuencia del tipo deteji.do o de la línea celular empleados (Dicosmo y Towers, 1984; Loyola-Vargas yMranda-Ham,1995; Moreno eía/.,1995,. Bahdra y Shanks,1997).

En lo que se refiere a la obtención de metabolitos secundarios en biorreactores, losresultados aún son contradictorios. Se han realizado pruebas con procesos de cultivode una y dos etapas, y ha si.do esta última la que ha dado los mei.ores rendimientos(hasta m veces más) en la producción de alcaloides. También se ha empleado latécnica de inmovilización con resultados poco satisfactori.os; si.n embargo, al combinaresta técni.ca, con la de dos etapas (inducción-producción), la producción puedeaumentar de 3 a 5 veces y presentarse la liberación de alcaloides al medio de cultivo.No obstante, §i se comparan estos resultados con los obtenidos en cultivos de célulasen suspensión, el rendimjento fue 4 veces menor (Moíeno eí a/,, 1995).

El escalamiento de la producción de alcaloides, desde matraces hasta biorreactor, esel paso más difi'cW en un proceso productivo. Para el caso de los cultivos celulares ensuspensión de 0. /oseus, se observó que di.sminuyó la capaci.dad de inducción en lasi'ntesis de ajmalicina y serpentina cuanclo se escaló el proceso de rnatraz abiorreactor. Parte del problema es la composición gaseosa dentro del biorreactor. Otroproblema consiste en el lipo de biorreaclor utilizado, pues existen determinantesinsoslayables, tales como la fuerza de cizallamiento y el tipo de cultjvo /.n vi.Wo. Pararesolver este problema se desarrolló un impulsor de doble cinta en espiral. Estebiorreactor se empleó en cultivos de 0. rosew a alta densidad, con resultados exitosos(Moreno eí a/., 1995).

Con todo lo que se ha logrado para producir una amplia variedad de alcaloidesindólicos, a través de los diferentes sistemas de cultivo /.n vi.Íro de 0. roseus descritosanteriorniente, hasta ahora no se ha consegui.do producir los alcaloides bisindólicosvinblastina y vi.ncristina. La compañi'a canadiense AIleJix sintetizó ambos alcaloidesmediante una reacción química en la cual el ión férrico catalizó la dimerización de lacatarantina y la vindolina a anhidrovinblastina y vinblastina con rendimientos de 52.8°/oy 12.3%, respectvamente. Dado el potenci'al del proceso para alcanzar la explotacióncomercial, el grupo Allelix transfirió su tecnologi'a al grupo Mitsui Peirochemicalslndustries del Japón. Este grupo obtuvo rendi.mientos de 230 mg/L/semana decatarantina a partir de cullivos celulares de alta densidad. Posteriormem3 el uso delmétodo qui'mico de acoplamientiD del grupo AIlelix, les permitió mejorar el Íendimientoen la obtención de vinblastina hasta en un 50% en presencia de Fec13, oxalato, malatoy borhidruro de sodio (Dicosmo y Misawa,1995).

15

::%dr;£.et:g::,i,#*:a;:gha:Paraaumentglosalcaloldesmdóh®sserpntinayamaicinaemóiuiü11lde

Estrategl&Modelo empleedo ycompuestoapllcado

Re§ultadoe sobre el e ca oestudladoCiú

Testlgo Me|or tratemlentoCondlclone8

SEF`PENTINA

Luz

Cultivo do callosLuzt)lanca o.3 g kg-' P§

3.2gkg PSValoralcanzadodespuósdo25díasdetratamientoLoyola-Vaígas oÍ a/.. 1992

F]aíc®s transfomadas 1 .7 mg g-` PSi.ZloTgg":,:anzado Shanks eí a/..1998

Luz blanca despuós de 65.5díasdetratamiento

AJMALIC lNA

lnductores(fúngico§)

Cólulas en

1.9 ug 100 mL-1

10 ug 100 mLLacantidadaplicadadehomogenadofue

Nef eía/.,1991Luosmpeo::¡f:do,úng,code Pythium voxans do 0.87 ug .9extractomL

(de Bary)F]aícestranstomadas

o.,3 mg L'

0.,7 mg L'Lacantidad aplicada

Vázquez.Flota oÍ a/., 1994Homogenado lúngicodeAspergillus de homogenado tue:fuuc¡Xa:enji.io.6mg

Fleguladoresde'

Células en

o.26mg g-' PS

3.:,:rmgg.;:§nzadoCarpin eí a/.,1997suspensión después do 7 di`as

-2,4 D de tratamiento con 5+Zeatina LmovL de zeatina

F]a`ces peludas o.5mg g-' PS3.:loTgg-`:,:anzadodespuésde2días

F`ijhwani y Shanks, 1998+Ácido jasmónico de tratamiento con25ma/matrazdeAJ

Cólulas ensuspensión

o.45mg g-' PS

1 .2-1.7 mg g" PSV1salcanzados

Gantet eí a/„ 1998crecimientoaOredespués do 7 días

+Metil jasmonato do tratamiento con-2.4 DF`ai'ces peludas 25-400 ÜM de MeJa

1 mg g.' PS3.a5ioTgg.':isanzadodespuésdo3días

Ciau-Uitz oÍ a/., 1994+Metil jasmonato do tratamiento con10uMdeMeJa

Pr#ursores

Plántulas (raíces)N-(metoxicarboniletil)-N-[2-(1H.indol-3il)-etiii-B-metiiaianinato(MIA\

o.3mg g" PS3.a5,:rmgg-;:§nzadodespuósde35di'asdetratamiontocon1mMMIA

Bonzom oÍ a/„ 1997

16

Por consiguiente, con el fin de alcanzar niveles de importancia económica en laproducción de alcaloides indólicos de C. noseus, qué permitan su explotacióncomercial, deberán seguirse combinando los diferentes métodos y tecnologías.Además, deberán tomarse en cuenta los procesos bioquímicos que a sponíe suarealizan las células y tejidos, los cuales se discutirán a continuación.

A la fecha se han aíslado y caracterizado varias de las enzimas involucradas en labiosíntesis de los alcaloides indólicos. Algunos genes han podido ser clonados (Cuadro7). Este conocimiento ha permitido realizar estudios más detallados sobre losmecanismos de regulación de la biosi'ntesis de los alcaloides, lo que posteriormentepermitirá conducir al mejoramiento de su producción, a tíavés de la manipulacióngenética de la planta o de los cultivos /.n vítro.

Actualmente se ha puesto en práctica una estrategia para el perfeccionamiento de laproducción de los alcaloides indólicos en C. noseus: la ingeniería metabólica.

Este planteamiento puede emplearse en cualquier ruta biosintética de metabolitossecundarios en plantas completas, lo mismo que en cultivos in vitro; de manera quetiene un efecto mucho más amplio.

Verpoorte eí a/. (1998) consideraron las siguientes propuestas para aumentar laproducción de los metaboli.tos secundarios con la ayuda de la ingeniería metabólica:

• Aumento del flujo de precursores en la ruta biosintética del producto deseado.

• Multiplicación del número de células productoras.

• Disminución del catabolismo del producto deseado.

En células de 0. roseus ya se ha utilizado la estrategia, para ello se introdujo unasecuencia en antisentjdo del gen de la descarboxilasa del triptofano (TDC), y comoresultado se interrumpió la biosíntesis de los alcaloides (Verpoorte eí a/., 1998). En otroestLidio se introdujo el mismo gen, pero unido al promotor CaMV 35S, y si bien seprodujo un claro aumento en los niveles de triptamina no cambiaron los niveles deproducción de los alcaloides Índólicos (Shanks eí a/., 1998).

Los datos descritos en el párrafo anterior sugieren que el paso limítante en labiosíntesis de los alcaloides indólicos es la vi'a terpénica y no la vía que produce latriptamina, Cuando se sobreexpresa el gen de la estrictosidjna sintasa (SSS/ encultivos de células en suspensión de C. roseus, aumentan los niveles de alcaloides(Verpoorte eí a/., 1998; Shanks eí a/., 1998).

Lo§ sitios de bifurcación en la vía de síntesis que conducen a los diferentes tipos dealcaloides indólicos en 0. roseL/s no están aún claramente definidos. La vía mejorcaracterizada es la de la biosi'ntesis de la vindolina a partir de la tabersonina. Hastaahora se conocen 5 de las 6 enzimas cle la vi'a. Asimismo, se sabe que el tlujo detabersonina sufre desvíos hacia la formación de lochnericina y hórhammericina. Lainhibición en eso§ desvíos podri'a aumentar la síntesis de vindolina y posiblemente, lade los alcaloides bisindólicos (Shanks eí a/., 1998).

17

Cuadro 7. Enzimas relacionadas con la biosíntesis de los alcaloides monoterpenindólicos, que han sido caracterizadas en C. roseus (tomado de Morenoeía/1995.±Teuseía/1998.VanTegeleneía/.1999;Dato§nopublicados).

Enzlma Sialas Cofactore8 18olorma8 Km L"llzaciónClto§ol oH1 Pui.ificaclónparciavtlomo-geneidadaparenteHdd ADNc'kDa\Glutamino sinteta§a GS Mg+c 2 46/48 .mu m

0.63/0.55 mM hidroxilamLna Cloroplasios

Antranilato cintasa AS Mg-c 1? 143 0.37mM L-glutamina67/Mcorismato 7.5-8_3 omogenei aaparenteH-dd

lsocorismato cintasa 'CS Mg-- 2 64 558/319 uM corismato Cloroplas`o omogenei aaoarente -+

Geraniol 10-mdroxila§a G10H Heme 1 56 5.5 vM gera11/Mner ol Membranasprovacuolares Homogeneidadaparemedd

NADPH-citocromo P-450 NADPHFADFMN 1 79 Memb provacuolaresRet.end Homogenei aaparente

Acido logánico: SAM metiitransferasa LAMT SAM 0 06 mM SAM12.5mMácidologánico Parc'al 'dd

Triptofano descarboxilasa TDC PPPQQ 1 56 75 vM triptofano C'tosolCltoso'VacuolaC'tosolda'a 8.5 Homogenei aai)arente1 +

l riciodoiai ciclasa lc NADPH 2? 44 767 ParclaHomogeneidadaoarenleHomogeneidadaparentePrlal+

Esinctosidina sinta§a SS 7, 38 o. -. m ripamina

Estrictosidina SG 3 650 >20 „M83uMgeissoschizina 6-8.5

f)-glucosidasa930240 asocia amembrana

Geissoschizina NADP. ac

CatenamLna NADPH ll,,Im_ iiiiiiii ParclalParcla'P`1

Tetrahidroalstonina sintasa NADPH 1 81 62 /M lminium ca enamlna

PeroxLdasa Heme >5 1 5/37 VacuolaMembranatilacoidal aíclaParclalPl

SAM metox¡ 2,16 dihidro-16-mdrotabersonina-N-metil-translerasa NMT SAM 60

Desacetoxivindolina-4- OHT 2- 3 44.7 45 /M 2-oxogliitarato C,'Oplasma 7-8 a,Cla `dd

hidroxilasa oxogÉ:t+aratoascorbato 45 4M oxigen003/Mdasace(o0 (02)xMndoline

Aceiil CoA:deacetilvincloíinadd 17-o-acetiltransferasa DAT Acelll-CoA _5 54 6.5 4M acetil -COA C,toplasma 8-9 Homogenei aaparente

Verpoorteeíat(1998)proponenqueparaaumentarelflujodecarbonoalolargodelaruta biosintética es necesarjo aplicar la ingenjería metabolica sobre genes que esténinvolucrados en los pasos limi.tantes. Para ello habría de conocerse de antemano elesquema completo de regulación e i.dentificar el interruptor que controle la vía entera;en este sentido los estudios realizados en C. noseüs acerca de la regulación de laexpresión de los genes tdc y ss muestran que el segundo podría ser Lin primer blancopara este tjpo de estudjos.

Sin embargo, no hay que oMdar otros elementos de la regulación, tales como lacomparlamentalizacjón o la existencia de canales metabólicos. Es% temas sediscutiránmásadelanteyconmayordelalle,enelaparladocorrespondiente.

19

1.4 0RIGEN Y FUNCIÓN DE LOS ISOPREN0lDES EN EL METAB0LISMO DE LOSSERES VIVOS

Las moléculas produc.idas a través de la vía metabólica del mevalonato reciben elnornbre genérico de terpenos; el nombre deriva de la expresión inglesa "turpentine o"(cuya traducción al castellano es aceite de trementina), sustancia de la que se a.islaronlas pr.imeras moléculas terpénicas; Ia trementina es una resina líquida generada por elárbol de nombre terebinto (Terebi.níhus spp.) y o" especies de terebintáceas. Sinembargo, la denominación común para este coniunto heterogéneo de compuestos, sebasa en su origen biosintét.ico, que tiene su punto de partida en el isopreno y en laregla de la biogénesis del 'isopreno, propuesta por Ruzicka en 1953, que establece quelos isoprenoides se formarán a través del enlace repetitivo de un.idades de isopreno (2-met.il-1, 3-butadieno), involucrando elongaciones electrofílicas, ciclizaciones yrearreglos moleculare§., todo ello s.in importar la naturaleza exacta de los precursoresbiológ.icos (F.igura 5).

GGPP

Figura 5. Principio de \a regla de la biogéne% de los (soprenotdes (tomado do MCGarvey yCrc)teau,1995)

Con la expl.icación anterior debe entenderse ahora el porqué seri'a preferibb el térm.misoprenoide al de terpenoide, puesto que aquél refleia el or.igen biosintético de latamilia de compuestos terpénicos e incluye a todos los compuestos derivados de una omás unidades de isopreno.

20

Los isoprenoides constituyen Lina numerosa familia de compuestos, ya que, hasta lafecha, se han identificado más de 29,000 moléculas (Mccaskill y Croteau,1998). Susestructuras van desde sencillas cadenas lineales hidrocarbonadas, hasta las máscomplejas estructuras cíclicas conocidas; debido a su naturaleza qui'mica losisoprenoides poseen, en general, propiedades lipídicas (Kush, 1994). Además, sonesenciales en diversas funciones celulares pues inteivienen como componentesestructurales de las membranas, hormonas y transportadores de electrones, enanimales, plantas, insectos y hongos (Goldstein y Brown,1990; Kush,1994; MCGarveyy Croteau,1995; Parks y Casey,1995; Mccaskill y Croteau,1998); si bien es en lasplantas donde tienen el mayor número y variedad (Figura 6).

lncluso, existen isoprenoídes producidos por las plantas que en la forma de aceitesesenciales, ceras y resinas proporcionan precursores a la industria química para crearproductos terminados con utilidad comercial, tales como esencias, dísolventes,pegamentos, revestimientos, sabori.zantes y vitaminas.

A diferencia de lo que sucede en animales e insectos, en las plantas la vía metabólicadel mevalonato, además de proveer de esqueletos de isopreno a jmportantesmetabolitos primarios, aporta tambión estructuras para la síntesis de una ampliavariedad de metaboljtos secundarios, que constituyen una fuente importante decompuestos con alto valor comercial, práctico y terapéutico. Estos compuestos sonsintetizados en la forma de polímeros isoprenoides, como el hule y el chjcle, lo mismoque en la forma de compuestos más complejos como las fitoalexinas (elementos dedefensa de las plantas, de gran interés biotecnológico), los piretroides (utilizados comoinsecticidas) y los alcaloides, por ejemplo la camptotecina, la artemisina, la vinblastinay el paclitaxel (taxol), debido a sus actividades farmacológicas antineoplásicas.

El qu/'d del asunto se relaciona con la dificultad de comprender la regulación de tanimportante vía metabólica; en la mayor parte de las revisiones publicadas sobre eltema se menciona esa necesidad. Si se lograran revelar los misterios de la Íegiilaciónde la biosíntesis de los isoprenoides, se abrirían posibilidades enormes, tanto en loci.entífico como en lo tecnológico.

21

La vía del mevalonato

AcetilcoA+AcetoacetllcoA =

l§opentenll adenina(ARN')

Dollco'

Grupo homo AUbiqulnomPra¢eínas

farneslladas

Rogulac]ón delcolesteroi sobre

la enzlma

Hormonasesteroldk}sVltanúna D

:M;joAA

Mevalonato

WMevalonato-PP

- l.-.#pp

La nueva vía de biosíntesis del lppTrlosa Foslao + Plruvato

Wl>1desoxlxllulosa€-foslato

Tipode isoprenolde E|emplo

Grupos prenilo Citocinlnase='a-5=rE=

< 0 Fame§ll-l]P e >

EscualenorJi1##'!:=ss -co,estero,

'Geranilgeranil-PP

®L

®rS=11

Monotorpenos MenolAlcaloides

Sesqulterpeno§ Capsldiol

Esteroles Estigmasterol

Protaínas

Funclón

F`egulador docrecimk!nto

AromasLnteracclónplanta-insecto

lnuracclónplantapatógeno

Estiuctura denembianas

CreclmientoProteínas prenlladas Simiiares a " cBlular

DRerpenos AckkúberélLco cFbregc#:°Eode'

Po'lprenoles DollcotesUblqulnona

Cloroflla

Glucosllaclón

Transporte eiec.Foúsi.ntesls

Flgura 6. Productos do la ruta biosinté`ica del mevalonato en células animales y vegetales. Las (Iechas dobles indican varios paso§ enzimá`icos:Ias tlechas gruesas indican la ruta principal; las llechas punteadas indican pasos enzimáticos en animale§; las llechas continuas para las plantas(Adaptado de Chappell,1995; Goldstein y Brown,1990).

1.5 LA ENZIMOLOGl'A DE BIOsl'NTESIS DE LOS ISOPFIEN0lDES

1:5=,1,.,E::^e^ña histórica de la investigaclón sobre la biosíntesis del ácldomevalónico

La vía del mevalonato en los animales comenzó a llamar la atención, luego ciue en ladécada de los cincuentas se relaci.onase con la biosíntesis del colesterol, en tanto qiieen las plantas las investigaciones eran en ese entonces menos nurnerosas. Acontinuación, se hace un recuento de los sucesos más notables.

Hacia el año de 1954 se aisló de la linaza, el ácido 3-hidroxi-3-metilglutárico (HMG) einmediatamente fue propuesto como un probable precursor de los jsoprenoides. Ellogro subsiguiente vino cuando se interpíetó la formación de un derivado del HMG (mjdentifi.cado en ese entonces) a parlir de acetato, ATP exógeno y HS-CoA en un cultivode células de lino en suspensión, como una reacción de condensación ocurrida entre elacetil-CoA y el acetoacetato. Dos años más tarde, un grupo de investigadores de laempresa farmacéuti.ca Merck consiguieron aislar el ácido mevalónico (AMV), a pariir deSaocnatiomyces cerev/.s/.ae y posteriormente, se demostró que el colesterol podríasinteti.zarse a pam del AMV, medi.ante experimentos en hepatocitos de rata cuyosresultados fueron precisamente la i.ncorporación del AMV a la molécula de colesterol(Bach eía/.,1990; Vagelos,1991).

Entre 1957 y 1959 hubieron adelantos i.mportantes pues en tanto que varios grupos deinvestigadores comprobaron que la síntesis del HMG, en hepatoci.tos de rata y encélulas de levadura, requiere de dos reacciones de condensación: la primera entre dosmoléculas de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA y la segunda, entre el compuesioanterior y otra molécula de acetil-CoA con la consecuente liberación de HS-CoA; otrogrupo investigadores del lnstjtuto Max Planck, demostró que la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGF}) (EC 1.1.1.34) consti(uye el paso limitante principalde la síntesis del colesterol. Además quedó demostrado que la actividad de la HMGFi,en mami'feros, es susceptible de regularse a través de la dieta. También se preci.sócual enanti.Ómero de AMV es biosintéticamente activo, pues al poner (fi, @-AMV comoúnica fuente de cabono en el medio de crecimiento de Mycooacíen.um spp. se hallóque el (S)-AMV permaneci.Ó en el medio y por consi.gujente, el (q)-AMV resiiltó ser elacti.vo (Figura 7). Así mismo el hecho de que moléculas de AMV, marcadas conisótopos radiactivos, se incorporasen a diversos i.soprenoides de ori'gen vegetalpemitió comprobar y generalizar, en principio, Ia idea de que el AMV sirve comoprecursor universal de los isoprenos (Bach eí a/., 1990; Vagelos, 1991 ).

23

COOH1

3SLÁcido mevalónico 3 f}Ácido mevalónico

:g.y:!T7.e::a::e::L:.Tfe,,:;e,n:r:;:igarn:3s%,:,:e:ao:r,ááá::dn:ig;a::n,ó::nooég,edd:,ii`;,:gur:u::cÍ::.::y::::arí:c:;:#:adq:::,ii::i#nt::;aF::e::i,onLoas:á:®mh::e;nad:Cuaeno::asrebnotldooq:,'L,g:roorreLsopsonnduoma:,::r=unb:a3ya-,nd,Canl-ad"

Al principio de la década de los sesentas quedó plenamente confirmada, tanlo enlevadura como en hepatocitos de rata, la intervención de la enzima HMGF` en laconversión del HMG-CoA a AMV con ayuda del poder reductor del NADPH (Bach efa'.,1990)

Para 1973 los resultados de dos grupos independientes de investigadores, revelaronquelaactividaddolaHMGRdisminuíaenpresenciadeoxiesteroides(Vagelos,1991).En el año de 1976, un grupo de investigadores japoneses logró aislar con éxm) uncompuesto al que llamaron compactina, el cual posee un efecto inhibitorio especi'ficosobre la HMGF`, que a su vez promueve la inteírupción de la síntesis /.n v/vo delcolesterol (Vagelos, 1991). A principios de 1979, se aisló la lovastatina del hongoAspergi" 1erreus, lo cual constiluyó el segundo hallazgo de un inhibidor de laactividad enzimática de la HMGF`, y que posteriormente fue patentado, por la compañíafarmacéutica Merck, como principio activo de un medicamento para el tratamiento dehipercolesterolemiasgraves(factorderiesgoenenfermedadescardiovasculares)yqueestá presente en el mercado desde 1982 (Vagelos,1991).

En la actualidad se busca potenciar los efectos terapéuticos de los medicamentos através de las propiedades quirales de sus principios activos, los adelantos surgidos deesta estrategia han permitido mejorar las estatinas (nombre genérico de los inhibidoresde la HMGR) utilizada§ para el tratamiento de hipercolesterolemias graves (Stinson,1998). Desde hace algún tiempo se descubrió la capacidad de las estatinas (a a"concentraciones) para evitar la prenilación de las proteínas involucradas en laproliferación de las céliilas tumorales, así como su efecto posterior, consistente en lainterrupción de dicha proliferación. Este hech.o podría usarse como una herramienta enel tralamiento de cierlos tipos de cáncer (Goldstein y Brown,1990; lvessa e[ a/.,1997;Guijarro eí a/.,1998).

Así pues, el descubrimiento de que la HMGR de mami'feros es el paso limitante en labiosíntesis del colesterol y el hallazgo de inhibidores de su actividad enzimática, trajocomo consecuencia la generación de un gran caudal de investigaciones acerca de suspropiedades y regulación. Por consiguiente, la mayor pam3 de la información de labioqui'micadelosisoprenoidesenlasplantassetomóenunprincipiodelainformaciónobtenida a través de experimentos realizados principalmente en células animales ylevaduras, si bien §us productos isoprenoides no son lan complejos y numerosos como

24

;s§#:,;ossc¡a:::nc#j;T,9:9e5Sguej::h:e::ía:nb;;%S::e:esáu:dTe:::;á%:p::::asd:nq,::p::ntcaé¡u:ausn::

1.5.2 La vía del mevalontio

1.5.2.1 Del acetil-CoA al mevalonato

Encélulasanjmalesyenlevadurasparticipandosenzimasenlasi'ntesisdelHMG-CoAapamdelacetil-CoA,éstassomlaacetoacetil-CoAliolasa(AACT)(EC2.3J.9)yla3-

:íg::::-3ÓTr:t:Ig':tearr,:-:foe:zniFaEfesq,::,?bsr:o,geM£Sr,eá::ó:,d:.i2,Ánc,fné:,agu.e,,eenn,a,á:hacia la forrnaci.ón del acetíl-CoA, más que hacia la si'n.esis del acetoacetil-CoA y laHS-CoA. La razón de esto resi.de en el mecanismo de la reaccíón, pues incluye unacondensación tipo Clajsen, puesto que una de las dos moléculas de acetil-CoA actúacomo carbanión que luego se adiciona nucleofílicamente a la otra molécula de acewCoA, y aunque la eliminación del protón en el a metilo del acetilo, para converlirlo encarbanión, es energéticamente dosfavorable, Ia reacción general de si'nte§is del HMG-CoAlograllevarseacabo,demaneratermodi.námicamentefavorable,graciasaquela

&a8:Ó(nB:cehc:'n::,n:s3'g;nMa:dGó:;aéyq;ecrr:::,::,,igH9T,?E,|ieMaGC-ocP:aAapLaeg:e,.ria:íz,a,:sdestinos diferentes una vez que ha si.do sintetizado:

• lnteractuar con la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A ligasa (HMGL) (EC4.1.3.4), cuya reacción contribuye a la formación de cuerpos cetónícos en lasmitocondrias de las células animales. Si bien ya se ha detectado su presenciaen la§ plantas (Bach eí a/.,1990; Van der Heijden y Verpoorte,1995), aún no seconoce con certeza su papel dentro de la fisiología vegetal y permanece comoun área no explorada.

• F}ecm la acci.Ón de la 3-metilglutaconil-CoA hidratasa (MGH) (EC 4.2.1.18), lacual cataliza la hidroxjlación reversibhg del 3-metilglutaconil-CoA para convenirloa HMG-CoA, reacción involucrada en el catabolismo de la leucina. La MGH fuepurificada de hepatocitos de oveja y semipurificada de C. nosem (Van derHeijden eía/.,1994).

• La 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMGR) (EC 1.1.1.34) puedemetabolizarlo a AMV ó rrievalonato con la ayuda del poder reductor de dosmoléculas de NADPH (Figura 8).

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3S-hidroxl-3-meti©lutaiil-CoA

woNÑÁ A„oAwoÑAcetoacetato + Aceti\.CoA

3fi.Ácido mevalónico

oH H°°C«o3-Motilg¡ulaconil.CoA

:#áaa§8i,EHni,g::LnMvá,-ué:aAdi:s::taGdHe,gá::ae:,,,ÓgTufae:o3n3:!,:ÁOT,-d3r-aTaest;g',uÁ#tca?:d:"v3:,dg,"HGe-,#y Verpoorie,1994).

1.5.2.2 Del mevalonato al isopentenil pirofosfato (IPP)

Posterior a su síntesis, el mevalonato e§ fosforilado y descarboxilado secuencialmentehasta generaí IPP, todo ello con la intervención de las enzimas mevalonato cinasa

t#á!f£:oC3á7s:á?g¿'xTaesvaa'íÉ6t°4:t-t?:j3}?CÉrisap(yu%"cEocn2éz|s2ó)my::or:Ya¿#t:ai,-,pirotosfato (DMAPP), componen la piedra angular a pam de la cual se construyen la

:sr::eTaasyaor,,,Écd:i::2;::rse,:o:dnez:Lzareqquu:e::geM#+?SMel2:u;á'raat:,edvear'aa'S:g:e::acc.ión de foslorilasa que da lugar al isopreno (Chappell,1995 y MCGarvey y Croteau1995) (Figura 6).

1.5.2.3 La acción de preniltransferasas y terpenciclasas.

La reacción enzimática Fealizada por la geranil p.irofosfato sintasa consiste encondensación del DMAPP con una molécula de lpp (cabeza a cola) para produch..., _.__£__..._ ^:ht--- nlla rataii7a

g::,.:,|páreof::;?tom,ofépc:)aLdueeg,opfc,aiaáapáar::rsá`3,:;':::::os"s,:::osf?,sfqa::::;aÉ'FaL:

conciensac;iorl Ut;l L7lv.nr l ,V„ U,,U ..,V._,_._ __

siguiente enzima, la geranilgeranil pirofosfato, lleva a cabo su reacción de una manera

!¡ii,;,íf::ors:!e:7a?,:íidso:áDTÉo;:q:u:e,::ns::T:di;:::a::s:::i:ss:i::MnielE:::¡:ec,SS;,;on::;fd:;ossg:eialilo, lo que permite una escisión más fácH al momemD de ionizarse, este evonto dalugar a un carbocatión estable (Gray, 1987, Chappell, 1995, MCGarvey y Croteau,1995).

La adición electrof ílica al dobft3 enlace del lpp da lugar a un carbcmtión intermediario,queluegodelaeliminacióntipoÍransdeunprotón(otipoc/.senelcasodelaspre"transferasasinvolucradasenlabiosi'ntesisdelhiile)generanuevosgriiposprenilomás

26

largos. La naturaleza electrofílica de estas adjciones no suelen ser bioquímicamentecomunes, en relacm a las más generalizadas conden§aciones nucloofi'licas; noobstante, las primeras parecen ser un mecanismo de reacción común enw la§enzimas de la biosínte§is de los isoprenoides (ChappeH 1995, MCGarvey y Croteau,1995).

Lamayori'adelosisoprenoidessondeestructuraci'clica,porlotantoexí§tenenzimas

g::,:eac:bpeons:::od::r:a?:ct::,:,,:assespqeuc.i,yaí:ts:rpeean,íj:,:sc::|':a:i,:,na:sa:n,Fas|eop.r:up,:,g:ytienenaltaespecificidadporsusustrato(Chappew1995;MCGarveyyCroteau,1995).

En cuanto a las reacciones, las monoterpenciclasas realizan la ionización eisomerización del GPP a linalw pjroíosfato, cuya posterior ionización permito que eldobbenlaceterminalcompletelaciclización,Ioquedalugaralcatióna-terpinil.CabemencionarqueelGPP,lomismoqueelljnalilpírofosfatoyelci-terpinHseránobjetodelas modjficaciones mencionadas mientras permanecon en el sftb activo de la enzima.Todas las estructuras monoterpénicas básicas se forman a pam del G-terpinn con elconcurso de adiciones electrofílicas y previas a la terminación de la reaccíónenzímática (Chappell,1995; MCGarvey y Croteau,1995).

En el caso de las sesquiterpgnciclasas, Ia ciclización la llevan a cabo de una manerasimilar a las monoterpencicla§as, aunque sin la isomerización. Por su parle, Iasdjterpenciclasasdanlugaralaciclizacióncuandoeldobleenlacehasídopreviamenteprotonado, en tanto que las triterpenciclasas provocan la ciclización por medio de laprotonacióndeunepóxido(Chappell,1995;MCGarveyyCroteau,1995).

1.5.2.4 Modificaciones secundari.as y transformaciones.

Las estructuras isoprénicas bá§icas, tanto lineales como cíclicas, serán objeto detransformacjones subsecuentes, que consísten en hidroxilaciones, metilaciones,Ísomorizaciones, desmetilaciones, oxidaciones, hjdrataciones y reduccíonos. Comodato adicional se tiene que muchas de las hidroxilacionos y epoxjdacione§ sonrealizadas por citocromos P-450 oxigenasas (Chappew 1995; MCGarvey y Croteau,1995; Canto-Canché, 2000).

" BREVE DESCRIPCIÓN DE LA ENZIMA 3-HIDROxl-3-METILGLUTAFllLCOAF]EDUCTASA

::,d:rezáTcata::h:dur:x:-ai:Tzeá",g:uftoarrt-acc,óAnáeed:c:::fon,aE:(Áú,ú,).34;atT,Md:RH,MeGS_cuonA:laimporlanciadeestaroacciónradicaenqueaparlirdelmevalonatoseformaellpp,el cual es el bloque básico de construcción de la enorme variedad de compuestosisoprénicos.

27

i.6.1 La reacción énzimática

La HMGR curnple su función de la siguiente manera: el HMG-CoA entra primero en elsitio catalítico de la enz ma, en seguida se une iina molécula de NADPH, que con supoder reductor da lugar a un tiohemiacetal, el mevaldato, y que permanece unido alsitio catalítico de la enzima, mientras que del sit® para la coenzima sale una molécubdeNADP+parapermitirlaentradaaunasegundamoléculadeNADPHlacustreduciráal mevaldato para formar el mevalonato, que entonces abandor`a el sitio catalítico, ys.imultáneamente tiene lugar la salida de una segunda molécula de NADP+, además deuna molécula de HS-CoA (F`ussell,1985; Bach eí at,1986; Bach,1987) (Figura 9).

AH:ff3sc¥[Ho:ñcHH9o]üHo:ñcHH32oHHMG-CoA MEVALDATO

MEVALONATO

`\(

ó/

~,, LX

Mevinolina Lovastatina Fluvastatim

Flgura 9. Esciuemas represen`ativos de la reacción que llova a cabo la HMGFl, (A) esquema con las

::tpr:¡:::sd:i:m::::mdaeEoss,eLeb:,:=,oas,3aen:cz,,pma:,ñ;r:,na,3er::3c:óslátBr'e:ie:::fa!::,,Z::'na'srue§P::S,á::a,á:

g:,#hiL:3.q.::::genc;,l:::u?rea7aasHeMndá,rf:C:,eóvn,nco:[::Z3gau:o:t##oBdéco'r,.E:t:u,cut::icso?:na',gaunl:sqg:los otros do§ son sintetizados químicamente, Ios ci'rculos de líneas punteadas indican el sü con el queefectúan la inhibición (Las estriicturas de los inhibidores se tomaron de Gray,1987; Tumei GÍ at 1995,.Yamamoto eí a/.,1995/.

Si bien el esquema anterior es correcto, la HMGR puede, así m.ismo, catalizar lass.iguientes reacciones (tomado de Frimpong y Rodwell,1994):

• La acilación oxidativa del mevaldehído a HMG-CoA [2].

• La reducción del mevaldehído a mevalonato [3].

• La oxidación del mevaldil-CoA a HMG-CoA [4].

• Y la desac.ilación reductiva del mevald.il-CoA a mevalonato [5].

28

[1] (S)HMG-CoA + 2 NADPH + 2 H+ ---- 3 (Fl)-Mevalonato + CoASH + 2 NADP+

[2] Mevaldehi'do + NADP+ + CoASH ---- ? HMG-CoA + NADPH + H+

[3] Mevaldehi'do + NADPH + H+ -------- ? Mevalonato + NADP+

[4] Mevaldil-CoA + NADP+ -------- > HMG-CoA + NADPH + H+

[5] Mevaldil-CoA + NADPH + H+ ---- + Mevalonato + CoASH + NADP+

Frimpong y F}odwell (1994) realizaron un estudio detaHado de la reacción catalizada

por la HMGR en células de hámster, utilizando una HMGF] silvestre y dos mutantessobreexpresadas en Esc^er/.ch/a c`o//. y con sus resultados propusieron un mecanismode reacci.Ón más fino que el que se conoci'a, y en el que tienen un papel fundamentaltres residuos de aminoácidos correspondientes al sitio catalíti.co:

• Asp766 que par|icjpa en la reacción inversa de [4] y en la reacción [3].

. Giu588 e His865 que funcionan de manera coordinada durante la desacilación delmevaldil-CoA, es decir en la reacción [5].

De manera que de acuerdo a lo que proponen Frimpong y RodweH (1994), la reaccióngeneral de la HMGF] quedaría de la siguiente manera:

HMG-CoA ---- ?[Mevaldil-CoA ---?Mevaldehi.do] ---- ?Mevalonato

Puesto que el sitio catali'tico de la HMGR está muy conservado (como se verá un pocomás adelante), es ciertamente probable que la estequi.ometría de la reacción seaprácticamente la misma entre microorganismos, animales y plantas (Flussell, 1985;Frimpong y F`odwell,1994; Friesen eí a/.,1996).

La mayoría de las HMG-CoA reductasas tienen una funci.Ón biosi.ntéti.ca, para lo cualemplean el poder reductor del NADPH; sin embargo, Ia HMGF} de PseudomonasmevabM (EC 1.1.1.88) tiene la capaci.dad bi.odegradante, pues utiliza al NAD+ paracatalizar la acilación oxidativa del mevalonato a HMG-CoA, a diferencia de las demásHMG-CoA reductasas. La peculiaridad de esta HMGR bacteriana está basada en lapresencia de un residuo de aspartato en el sitio 146 del dominio de li.gami.ento demcleótidos, en lugar del residuo de alanina (Friesen ef a/.,1996).

1.6.2 Topologi'a de la HMGR en células de procariotes, plantas y animales

La estructura de la HMGF} de procariotes, plantas y animales se puede di.vi.di.r en tresregiones: el dominjo catalítico, ubicado en el extremo carboxilo terminal y sumamenteconservado eme protozoari.os, metazoarios y procari.otes (Figura 11A); el domini.otransmembranal, ubicado hacia el extremo amino termi.nal y que presenta una elevadadiversidad entre todos los organismos e incluso hay los que carecen de él; y por último,una rggión que enlaza a los dominios anteriores e igualmente diferente entre losorganismos conocidos, además de que comparten otras característica§ de imporiancia(Figura 10) (Chin ef a/,1984; Liscum ef a/.,1985; Monfar eí a/.,1990; Roitelman eí a/.,`ngagn2=^=,n±U+`9,et..a*=.`u9P4__r!5±So_T_stgL,^igg_4.,~Bá_c.h:i69É.,--ó=m5á=';`E.*¿:au{:F&8¿'.,Denbow eí a/.,1996,. Hampton ef a/.,1996; Peña-Díaz eí a/„ 1997).

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3AANIMALES

lnserciónco-traduccionalPresencia de péptido señalTamaño promedio de 90-100 kDa(900aminoácidos).Estructura para metazooarios yprotozooarios

Luz del aparato de Golgi

!:;:#:d:,a:fii!,cm=e(L:::Í,;oTs!:::Ia::Óng',ucos"ac,on

L:Enx.tre.;eor:tr:]+,no y carbox, term¡na,es de, m¡smolado, clasifica como protei'na transmembranal delgrupol''

PLANTASl nserción co-traduccional.Ausencia de péptido señal y de tránsito.Tamaño promedio de 63 kDa (600 aminoácidos).Estructura para :Solanum tuberosumALN%!%£g%;n%::aucn#ntum

Raphanus sativusCatiiaranthus roseusHevea brasilensisPisum sativum

Figura10:CaracterísticascomunesentrelastopologíasdelasHMGRdeanimalesyplantas(Ch.inefat1984;Liscumeía/.,1985;Monfarefa/.,1990;Roitelmanefa/.,1992;Enjutoe(a/.,1994;Nelsoneíat1994;CamposyBoronat,1995;Bach1995;Denbowefat1996; Hampton ef a/.,1996; Peñ-Díaz ef a/.,1997).

La estructura de la región catali'ti.ca, tanto de la HMGR bacteriana (Pseuc/omonasmeva/on/./) como de la humana (Homo sap/.ens), s;e compone de 3 dominios a saber(Figura 11C), un dominio N, un dominio mayor y un dominio menor. El dominio N es elmás pequeño de los tres y consiste en cK-hélices y que en le caso de la HMGF} dehumano este domi.nio forma parte de la región de enlace entre las regiones catalítica ymembranal El domi.nio mayor tiene una forma característica y propia de las HMGF`,

pues consta de 24 residuos de aminoácidos en forma de ct-hélice y está localizada enel centro de la estructura del dominio y que a su vez se encuentra rodeada por otrastres estructuras o subdominios. El dominio menor contiene al sitio de unión para eldinucleótido (NADPH en la de humano y NADH en la bacteriana); sin embargo, suconfiguración no corresponde con la forma comúnmente observada en el sitio de uniónde enzimas dependientes de NAD(P), dado que la HMGF} presenta cuatro láminas 8antiparalelas en medio de dos a-hélices a manera de un emparedado (Lawrence era/.,1995; lstvan eí a/., 2000).

No obstante, el dominio catali'tico de la HMGF} está conservado a tal grado que porejemplo: la HMGR de humano pudo funcionar correctamente a pesar de expresarse enlevadura; o el caso de la inhibición de la HMGF` de una especie de Archaebacteria porla lovastatina, inhibidor competitivo de HMGR de mamíferos y de uso en formulacionesmédicas (Hampton eí a/.,1996).

1.6.2.1 La HMGF¡ de procariotes

La mayoría de las HMGFi de bacterias carece del dominio de anclaje a la membrana otransmembranal; por ello su tamaño es el menor de entre las HMG-CoA reductasasconocidas, con un promedio de 400 aminoácidos (Peña-Díaz ef a/., 1997). Laestructura cristalina de la HMGR de Pseudomonas meva/on/./. ya ha sido elucidada(Figura 11C) Se trata de una protei'na soluble (dado que carece del dominio de anclajea la membrana, normalmente situado hacia el extremo amino-terminal), compuesta dedos subunidades de 45 kDa de 428 aminoácidos cada uno y cuyo dominio catalítico esfuncionalmente análogo al de la HMGFi de los mamíferos, aún cuando la homologíaentre ellas resultó baja (20%), puesto que conservan residuos de aminoácidos clavespara el reconocimiento y catálisis del sustrato (Figura 118). En el estudio realizado, laenzima mostró un arreglo de homodi'mero; sin embargo, ,los autores no descartan laposibilidad de que la enzima tenga una conformación hexaméri.ca /.n vt.vo, en vista delas características cristalográficas observadas (Lawrence eí a/., 1995).

1.6.2.2 La HMGR de protozoarios y metazoarios

La HMGF] de Saccharom}tces cerev/.s/ae posee siete segmentos transmembranales(Hampton eí a/., 1996; Polakowski eí a/.,1998), mientras que la generalidad de losmetazoarios tiene ocho,. la enzima es cotraduccionalmente insertada en la membranadel retículo endoplásmico, gracias a una partícula de reconocimiento de señal (SF`Ppor sus siglas en inglés).

La HMGF] de mamíferos contiene un sitio catalítico (Figura 118) de 453 residuos deaminoácidos (unos 53 kDa), con alto grado de homología entre las especies y el cuales capaz de mantenerse activo, aun cuando se le haya separado del dominio

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Figura 11. A) lmagen estereoscópica de los monómeros sobrepuestos en los carbonos w de HMGR humana(en azul) y Pseudomonas meva/o" (en ro]o) 8) Estructuras del sitio activo de la HMGR humana (izquierda) yde P meva/on// (derecha). Los residuos del monomero tÁ están en amarillo y en azul los del monómero r}, laHMG-CoA está en viole(a y en verde el NAD(P) (tomado de lstvan eí a/ , 2000) C) A la izquierda, es(ructuratriclimensonal en forma de T del di'mero de la HMGR de P meva/ontt. Los colores roio y azul diferencian a losmonómeros Los símbolos blancos señalan la posición de los sitios catali'ticos de cada monómero. Lasregiones en verde oscuro representan a las secuencias conservadas entre las diversas HMGR, aquí situadasen las orillas de las oquedades correspondientes a los sitios activos (tomado de Lawrence eí a/„ 1995) A laderecha, estructura tridimensonal clel dímero de la HMGFi de humano, de la que solamente uno de losmonómeros está coloreado y en la que se encuentran señalados los componentes (tomado de lstvan eí a/ ,2000)

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transmembranal mediante proteólisis. En cuanto al dominio transmembranal, éste estáconservado entre las diferentes especies animales, aunque no comparte semejanzascon plamas, levaduras y esquistosomas. (Brown y Simoni, 1984; F}oitelman eí a/.,1992; Cappel y Gilbert,1993).

Basados en los resultados obtenidos por ultracemrifugación anaítica, lstvan eí a/.,(2000) concluyeron que la HMGF} humana consiste en un homotetrámero y consideranque la región de enlace le permitiría colocarse de forma paralela a la membrana delreti'culo endoplásmico de manera que las cuatro regiones membranales monoméricasqueden cercanas emre sÍ.

La primera HMGF} soluble en eucariotes fue detectada en 7loipanosoma cruz/./.. Alanaljzar el ADNc no se encontraron las secuencias que codifican el dominiotransmembranal en el extremo amino terminal; además, se identiticó una secuenciametionina-arginina-leucina propia del extremo carboxilo terminal de protei'nas deprotozoarios que experimentan imponación desde los glioxisomas (Peña-Di'az eí a/.,1997).

1.6.2.3 La HMGR de las plantas

La comparación entíe las diversas secuencias de HMGF} de plantas revelan queexisten dos regiones con alta homologi'a, éstas son: el dominio catalítico (>90%),ubicado hacia el extremo carboxilo termínal y formado por cerca de 400 aminoácidos yel dominio transmembranal consistente en 120 aminoácidos hidrofóbicos divididos endos secuencias y situado hacia el extremo amino termi.nal (Nelson eí a/., 1994;Weissemborn eí a/., 1995; Denbow eí a/., 1996). En tanto que el resto del extremoamino terminal de las plantas, es decir,180 residuos de aminoácidos, es muy diversoentre las especies vegetales, lo mismo que la región de enlace entre el dominiocatalítico y el transmembranal (Bach,1995; Campos y Boronat,1995; Denbow eí a/.,1996).

1:6.3 Purificación de la HMGF\

La purificación a homogeneidad de una enzima, emendido como la presencia de laenzima activa de interés en el extracto de trabajo y que no se encuentren cantidadesdetectables de contaminantes, es requi'sito indispensable para poder comprender laspropiedades fisicoqui'micas y los mecanismos moleculares involucrados en suregulación.

Debido al carácter membranal de la HMGF], su purificación ha sido en extremo dificil(panicularmente en las plantas) dado que al extraer a una enzima membranal existeuna gran probabilidad de que se inactive por exponerla a un medio ambiente adverso,de manera que al extraerla de la membrana es imperativo proporctonarle lascondiciones necesaíias para mantener su funcionamiento (Cuadro 8). En este sentidose han utjlizado diferentes metodologías para su solubilización sin afectar la actividadcatalítica, entre las más utilizadas se encuentran el congelamiento-descongelamiento,el uso de detergentes, las incubaciones dentro del rango de los 30 a los 379C, el uso

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de homogenizadore¿ del tipo Potter-Elveihem, la aplicac.ión de tripsina y por supuesto,las combinaciones de uno o más de los métodos enlistados (Tormanen eí a/.,1976;Beg y Brewer,1981 ; Bach eí a/.,1986 y 1990; Kondo y Oba,1986; Dale eí a/.,1995).

5,ne.:p|,aanct,?na:.:r:Ñi:?2Sdoe4,?u:,í,iraa::ó:,e:Tosánscea,ohra,,necmuE':c:g:apr6oá:Si,meenntt:nl:que la cromatogíafi'a empleada se ha centrado en la utilización de columnas deafinidad en los pasos f.inales, como la sefarosa azul o la HMG-CoA-hexil-sefarosa, loque ha permitido obtener niveles elevados de purificación (Tornamen e{ a/.,1976; Begy Brewer,1981 ; Beach eí a/.,1986 y 1990; Wititsuwannakul eí a/.,1990; Dale eí a/.,1995).

Cuadro 8. Características de ladiferentesfuentes.ND=datonoHx=hexámero.(.Tormaneneía/.1986,1990;¢Wititsuwannakuleías HMG-CoA reductasas purificadas a homdisponible;Hm=Homo;M=monómero;D=,1976;.BegyBrewer,1981;OKondoyOb/.,1990;#LawrenceoÍa/.,1995.,+Daleeíaogeneidad a par[ir dedímero;Te=te`rámero;a,1986;.:.Bacheía/.,/.,1995;tFrieseneía/.,

1996).

Fuente Peso molecular KmW) KmW) Ac vidad Subunldades pH

FA (kDa) NADPH+H+ HMG-CoA especi'tlca (pkatmq-Drot) óp,lmo

PseudomonasmevaloniFF+45M 210 (NAD+) ND ND HmHx

9(NAD+)

Flaphanussativus+ 45M 27.00 1.50 824.13 HmTe 7.00

Solanumtuberosumo 55M 25.00 6.40 1.32xi o5 HmD ND

Heveabrasiliensis* 59M N.D. 13.00 1 .76xi o3 HmTe 7.00

DominiocatalíticodeArabidopsisthaliana+

50M 71.00 8_30 2.83Xios ND 7.50

H Ígado derata., 52M 38.00 0.86 8.67xi o4 HmHx 6.3-7.3

Hígado deDollol 18M 263.00 1.05 2.8xio4 Oligómero 6.8-7.0

La fuente de la cual se han realizado más puriticaciones a homogenidad ha sido elhígado de rata (Beg y Brewer, 1981), así mismo se ha purificado parcialmente enPariihen/.um argeníaíum (Fieddy y Das,1986), Nepeía caíar/.a (Arébalo y Mitchell,1984),y Zea mays (Bach eí a/„ 1990). La mayor parte de las purificaciones se han llevado acabo a paítir de microsomas.

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1.7 LA REGULACIÓN DE LA HMGR

Puesto que la HMGF` tiene una función muy ¡mportante .en el metaboli§mo celular delos seres vivos, la regulación a la que está sometida es tanto estricta como precisa y seefectúa a todos los niveles: transcripcional, traduccional, modificación covalente,degradación enzimática, así como compartamentalización (Bach, 1987; Goldstein yBrown,1990; Chappell,1995).

1 .7.1 . La regulación de la HNIGFi de levadura

Sacc`ha/omyces cerev/.s/.ae cuenta con dos isoenzimas de la HMGFl insertadas en lamembrana del reti'culo endoplásmico, la Hmgl p y la Hmg2p, las cuales son producidaspor los genes hmg7 y hmg2, que a su vez se encuentran localizados en cíomosomasdiferentes (Parks y Casey, 1995; Hampton eí a/„ 1996; Gardner eí a/., 1998;Polakowski eí a/., 1998). Los dominios catali'ticos de ambas isoenzimas son muysemejantes entre si`, pues tienen 93°/o de homología, mientras que el segmentohidrofóbico ubicado hacia el extremo amino-terminal sólo mantiene un 50% dehomología (Hampton eí a/., 1996; Gardner ef a/.,1998). De las dos isoenzimas, laHmglp contribuye con el 83% de la actividad enzimática total; a pesar de ello ambasisoenzimas participan en la biosíntesis de los esteroides de manera similar en cuanto alflujo de carbono, siempre que haya suficientes grupos hemo disponibles (Parks yCasey, 1995). En un experimento realizado con cepas carentes de la Hmg2p, sedeterminó que el ácido palmitoleico actuó como un regulador positivo de la síntesis delos esteroides, en tanto que el ergosterol (compuesto de la levadura equivalente enfunciones e importancia al colesterol de los mamíferos) lo hizo como inhibjdor. Alestudiarse cepas carentes de la Hmglp se halló que el ácido oléico fue el que actuócomo regulador principal de la síntesis de los esteroides, mientras que el ergosterol lohizo en menor grado (Parks y Casey, 1995). Los resultados anteriores y aunados a lasdiscrepancias en los resultados de experimentos donde se aplicaron esteroidesexógenos, permiten sugerir que la si.ntesis de los esteroides en la levadura estáfisiológicamente compartame ntalizada.

1.7.1.1. F}egulación por retroalimentación de la HMGF} de levadura.

Ambas isoenzimas muestran este tipo de regulación, Ios fármacos o perturbacionesgenéticas que disminuyen el flujo de la vía del mevalonato, dan como resultado unaumento en los niveles basales de la HMGF`.

La regulación por retroalimentación de la Hmglp parece tener lugar únicamente através de la traducción del AF"m, y son los productos iniciales de la vía delmevalonato (y previos a la producción del escualeno), Ias señales que regulan la tasade traducción del mensajero de la Hmglp, tal y como se da en las células demamíferos (Parks y Casey, 1995; Hampton eí a/., 1996).

El estudio de la regulación por retroalimentación de la síntesis de la Hmg2p todavíaestá en su fase inicial; sin embargo, se presume que la producción de esa enzima estáregulada por moléculas sintetizadas al tinal de la vi'a del mevalonaio, ya sea antes o alnivel del escualeno.

La degradación de la Hmg2p cambia si se afecta el flujo de los precursores de la vi'adel mevalonato, de manera que a mayor flujo de los precursores, más acelerada es la

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degradación de la Hmg2p y a menor fluio, más lento es el proceso. Las señales queregulan este mecanismo se derivan de los primeros productos de la vía del mevalonatoy anteriores al escualeno. A diferencia de la Hmg2p, cuya degradación se lleva a caboen el retículo endoplásmico, la Hmglp es sumamente estable (Parks y Casey,1995;Hampton eí a/., 1996).

F`especto a la degradación de la Hmg2p, Gardner eí a/., (1998) iniciaron el estudio delas regiones amino-terminales de las isoenzimas para distinguir a los determinantesinvolucrados utilizando el intercambio de segmentos del dominio transmembranal entrelas isoenzimas. Sus resultados demostraron que los primeros 26 amjnoácidos deldominio transmembranal de la Hmgl p son suficientes para conferirle estabilidad a laHmg2p, propiedad que no se debe a una incorrecta orientación o posición de laenzima; sino a que no puede ser reconocida por la maquinaria degradativa delproteosoma. En un principio se manejó la idea de que se había suprimido un sitio deubiquitinación dentro del segmento de los 26 aminoácidos; pero la presencia de otraslisinas en ese mismo segmento y la nula degradación de la Hmgl p con el segmento delos primeros 26 aminoácidos de la Hmg2p, hicieron descartar dicha posibilidad. Lasconclusiones del trabajo expresan que de los determinantes encontrados, ninguno fuecapaz de inducir la degradación controlada cle la Hmgl p y que hay evidencias acercade la existencia de otras secuencias de determinantes en la Hmg2p, necesarias parasu degradación y su correcta Íegulación.

1.7.1.2. La regulación cruzada ejercida por el oxi'geno sobre la HMGF` de levadura

El principio de este tipo de regulación en la levadura es que las dos isoenzimas estánreguladas en ambos sentidos por el mismo estímulo.

El grupo hemo necesita del oxígeno para su síntesis, luego éste es un parámetro útilpara medir la disponibilidad de oxígeno. Con esta estrategia fue posible crear unmodelo de regulación por oxígeno de la HMGFi de levadura (Figura 12). Cuando laconcentración de oxi'geno es elevada, la Hmglp está en mayoí proporción que laHmg2p y viceversa cuando la concentración del oxígeno es baja; por consiguiente elgrupo hemo regula la transcíipción de hmgJ y hmg2 a través de mecanismosseparados, y cuando la célula está en estado de aerobiosis, la Hmglp es la isoenzimapredominante, en tanto que en estado de anaerobiosis es la Hmg2p. Este punto,aunado a la degradación regulada induce a cuestionar la presencia de dos enzimas conlas mismas caraterísticas catali'ticas y de localización en la célula; más este hecho sevuelve comprensible al conectarse la regulación por retroalimentación y la cruzada,como se verá a continuación.

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rdOx,'geno -

Hmglp

+ Degradación# lnhibición-

Estado aeróbico

Estimulación

Sin efecto

H±p

Productos iniciales

productos,Lea

Hm92p

Estado anaeróbico

Flgura 12. Modelo quo oxplica la rogulación de kis isoenzimas do HMGR en levadura (Hampton eí a/..1996)

El oxi'geno es Íundamental en la parte tinal de la vía del mevalonato, pero carece deimportancia para los pasos iniciales. El oxígeno es necesario para la epoxidación delescualeno, Io que peímite su posterior ciclización a lanosterol, que es un paso previo ala formación del ergosterol (o del colesterol en el caso de las células de mami'feros),por lo que la disponibilidad del oxígeno es un factor determinante del tlujo de moléculasprecursoras a lo largo de la vía del mevalonato, de manera que cuando hay muchooxígeno disponible suceden dos cosas:

• Hay poca cantidad de productos iniciales a causa de [a ef iciente conversión de losesteíoide§ a productos finales por las reacciones que dependen de la presenciadel oxígeno.

• 'La pFoducción del AF`Nm del gen Amg7 se estimula directamonte.

Cuando la disponibilidad del oxi'geno es baja. la eficiencia de la convei.sión de losproductos iniciales a esteroides disminuye y por lo tanto, aumenta el número demoléculas capaces de inhibir la traducción de los AF" monsajeros de Hmgl p. Ademássobreviene una disminución en la estimulación de la transcripción del gen de nmg7, asípues el efecto neto de ambos mecanLsmos de regulación es que tanto más oxígenohaya disponible, cuanto mayor será la concentración de Hmgl p y viceversa (Hamptoneía/.,1996).

Para el caso de la Hmg2p siicede algo similar. La síntesis de la enzima es regulada poÍretroalimentación a través de los productos finales de la vía del mevalonato querequieren del oxígeno para su formación. Entonces cuando hay oxígeno enabundancia, la eficiencia de la producción de las moléculas posteíiores al escualeno esalta y como consecuencia aumenta la inhibición por retroalimentación de la si'ntesis dela Hmg2p, ocurre además la represión de la transcripción del gen nmg2, de esta

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manera ambos mecanismos actúan hacia el mismo sentido. Cuando el oxi'geno estápoco disponible, los producto§ finales de la vía no pueden formarse y el resultadoconsiste en la disminución de la inhibición por retroalimentación y en la estimulación dela transcripción del gen hmg2. Conforme a lo expuesto anteriormente, queda claro qiiela Hmg2p so§tiene una relación inversamente proporcíonal con el oxígeno (Hampton eía/_ 1996).

Puesto que la Hmg2p aparece cuando se acumulan los productos iniciales de la vi'a, aconsecuencia de una baja disponibilidad de oxígeno para la célula, y que desaparececuando se recuperan los niveles de oxi'geno, podría decirse que la Hmg2p se trata deuna enzima de situaciones de estrés.

Gardner y Hampton (1999b) hallaron que la Hmg2p tiene dos lisinas localizadas ensitios difei.entes y distantes respecto a la secuencia lineal y participan en laubiquitinación y degradación de la enzima. Ambos residuos dependen de su situacíónestructural dentro de la proteu'na para funcionar correctamente. Adem᧠Cronin eí a/.,(2000) identificaron un gen involucrado en la degradación regulada dela Hmgzp. El

tpr;°ndsupc::a8:}e8edne 8a2?' es Una ATpasa de tipo P y que son conocidas como

1.7.2. La regulación de la HMGFl de mamíferosLas células de mami'feros se enfrentan a un complicado problema para regular lasíntesis del mevalonato, puesto qiie el colesterol, producto final de esta vía metabólica,pÍoviene de fuentes tamo internas como externas. Este balance debe ser preciso paramantener, por un lado, la síntesis del mevalonato y por el otro, impedir la acumulaciónde los esteroides.

El balance se alcanza a través de la regulación por retroalimentación de dos enzimasconsecutivas en la síntesis del mevalonato, la HMGS y la HMGR, asimismo por laregulación de los receptores para las lipoprotei`nas de baja densidad (LPBD o LDL, porsus siglas en inglés). En au§encia de las LPBD, los niveles de la HMGS y de la HMGRestán elevados y por consiguiente, también lo está la síntesis del colesterol, así comolos productos no esteroidales; pero cuando las LPBD están presentes las actividadesde ambas enzimas caen hasta en un 90°/o respecto a la actividad inicial y entonces lascélulas sólo producen las cantidades necesarias de mevalonato para la síntesis de lospíoductos no esteroidales. Si se llegase al extremo de dar un exceso de mevalonatoexógeno en conjunto con LPBD, entonces la actividad restante de HMGF} cesaría y porlo tanto, la síntesis del mevalonato se detendri'a. Cuando los niveles de los esteroidesaumentan o cuando se detiene el crecimiento celular, entonces sobreviene la represióndel gen del receptor para las LPBD, previniendo a§í la acumulación del colesterol(Goldstein y Brown,1990).Además de regular la si'ntesis del mevalonato, las células animales también regulan ladisponibilidad del mismo. Las enzimas de la síntesis de productos no esteíoidalestienen, de manera general, mayor afinidad por los sustratos de la vi'a del mevalonato,que aquéllas encargadas de la síntesis de los productos esteroidales, de manera quecuando el mevalonato es escaso, es canalizado hacia la formación de los píimeíos(Goldstein y Brown,1990).

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1.7.2.1. Regulación de la transcripción de la HMGF} de células de mami'feros.

La regulación transcripcional de la HMGF} por el colesterol ha sido estudiada demanera abundante en una línea celular tumoral de ovario de hámster chino, capaz decrecer en presencia de compactina. Esta línea celular, denominada UT-1, expresaniveles elevados de HMGR debido, en parte, a la amplificación del gen. La adición decolesterol-LPBD disminuye significativamente los niveles de AF]Nm de la HMGF} lo cualindica una regulación transcripcional (Goldstein y Brown,1990; López ef a/.,1997). Lasecuencia responsable de esta regulación está ubicada en la región 5' del gen quecodifica para la HMGF`. Esta secuencia, CCGCACCAT, recibe el nombre de elementode respuesta a los esteroides 1 (EFIE-1 o SF}E-1 por sus siglas en inglés), y se localizaentre -159 y -150 bases del promotor de la HMGF] (LÓpez eí a/„ 1997).

Posteriormente se determinó que la secuencia EFiE-1 es el sitio de contacto de lasproteínas de unión a los elementos de respuesta a los esteíoides 1 y 2 (PUERE I Y 2 óSREBP), estas proteínas forman parte de una subfamilia de protei'nas de unión al ADNcon la conformaeión bHLHzip (basic helix-loop-helix-leucine zipper), puesto que sudominio amino terminal es en realidad un factor de transcripción con este tipoconformación. Asimismo, se definió que la PUERE 1 actúa en la transcripción a nivelbasal y la PUERE 2 cuando se requiere estimular la transcripción (LÓpez eí a/.,1997;Nohtum eí a/„ 1998; Brown y Goldstein,1997).

En células que han sido privadas de colesterol, el proceso para estimular latranscripción de la HMGF}, así como de otras enzima§ involucradas en la bio§i'ntesis delcolesterol, sigue 2 pasos proteolíticos, y comienza cuando se forma un complejo PAE-PUEF]E (Proteína de Activación de las PUERE mediante Escisión o SCAP por sussiglas en inglés), posteriormente una serina proteasa membranal del tipo de lasubtilisina se une al complejo PAE-PUERE, específicamente al sitio 1 de la PUERE,consistente en un enlace leu-ser en el lazo del lado luminal de la proteína, y efectúa laproteólisis correspondiente, la cual provoca la escisión de la PUEF}E en dos mitades,que permanecen unidas a la membrana (Vallet ef a/.,1996; Brown y Goldstein,1997;Nohtuítft eí a/„ 1998; Brown y Goldstein, 1999).

El siguiente paso proteoli'tico inicia con la intervención de una segunda protea§a quelibera al dominio amino terminal de la PUEFIE de la membrana, la enzima responsablede esta acción es la llamada proteasa- del sitio 2 y fue recientemente clonada ycaracterizada como una nueva metaloproteasa membranal politópica (Vallet eí a/.,1996; Brown y Goldstein, 1997; Nohturfft eí a/., 1998).

Una vez liberado de la membrana, el dom.inio amino terminal de la PUEF`E se dirige eintroduce al núcleo, en donde activa la transcripción de varios genes involucrados en lasíntesis del colesterol (nmgs, nmgr, ñpps, escL/a/eno s/.níasa, entre otras) (Figura 13)(Vallet eí a/„ 1996; Brown y Goldstein,1997; Nohturfft eí a/„ 1998).

Todo el proceso anterior es regulado por el colesterol mediante retroalimentación, puesuna vez que ha alcanzado los niveles requeíidos por la célula, inhibe su síntesisimpidiendo la escisión de las PUERE en el sitio 1, mediante su interacción con eldominio membranal de las PAE. Por otra parte, lo§ esteroides regulan de maneraindirecta la capacidad del complejo PAE-PUERE para activar a la proteasa del sitio 1(Vallet eí a/.,1996; Brown y Goldstein,1997; Nohtuffit ef a/.,1998; Brown y Goldstein,1999).

39

La proteólisis en el sitio 1 está regulada por los esteroides

La proteólisis en el sitio 2 no está regulada por los esteroides

±-f\ _ -

Liberación de la PUERE madura

PUERE madura

T'

Figura 13. Proceso proteolítico de maduración de las PUERE (Adaptado de Brown y Goldstein,

1997,1999)

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Un hecho interesante, descubierto por Nohturift eí a/., (1998) es que las reg.ionestransmembranales de la HMGF} y de la PAE son muy semejantes y dado que losesteroides regulan directamente a la HMGFl a través de sitios específicos en sudom.inio transmembranal, no sería de extrañar que ambas proteínas tengan unmecanismo común de regulación.

La región membranal de la HMGF` de ma"'feros contiene un. sitio de 167 residuos deaminoácidos, denominado .`dominio sensible a los esteroides", el cual compartecaracterísticas de identidad con las regiones membranales de otras protei'nas que sonreguladas por el colesterol (Brown y Goldstein, 1999). Este dominio §ensible a losesteroides es el responsable del aumento en la degradación de la HMGR comorespuesta a elevadas concentraciones de los oxiesteroles (Kumagai eí a/„ 1995;MCGee eí a/., 1996).

De acuerdo con los resultados obtenidos por Moriyama eí a/., (1998), la degradación dela HMGR parece ser que se inicia cuando una cisteína proteasa membranal actúa en elinterior de la región membranal de la enzima.

Además de la concentración de los esteroides, el estado de la oligomerización de laHMGF` también influye en su degradación. Asi' lo demostró Cheng eí a/., (1999) los queencontraron que sus construcciories quiméricas (proteína heteróloga+regiónmembranal de la HMGF]) en estado monomérico, fueron degradadas más rápido queaquellas a las que indujeron a la oligomerización.

Los resultados anterioíes en conjunto con los datos cristalográficos de lstvan eí a/.,(2000) permiten sugerir la .importancia de las regiones catalíticas (solubles) enpromover la oligomerización de las regiones membranales monoméricas y que suposterior disociación facilita el acceso a las proteasas, lo que resulta en la inactivaciónde la enzima.

señalan que en células de mami'feros existen diversosmecanismos de regulación que por retróalimentación comrolan la transcripción del geny su actividad catalítica es modulada, tanto por modificaciones covalentes como porinteracciones no covalentes. Beg y Brewer (1981) y Chappell (1995) mencionan que laHMGR de mamíferos es inactivada por una fosforilación reversible en el residuo deS872 (HMGF` humana), que no parece estar Íelacionada al mecanismo de control porretroalimentación y lo está más bien con la actividad de una cinasa dependiente de

MCGarvey y Croteau (1995)

AMPc.

Un hecho interesante es que los insectos carecen de la enzima escualeno sintasa, estoimplicaría que la HMGR de estos animales no puede ser regulada por los esteroidescomo es el caso de los mamíferos (Tittiger eí a/.,1999).

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Con respecto a las modificacíones post-traduccionales, en un estudio reciente sedemostró que los compuestos no esteroides derivados del mevalonato y sintetizadosentre el escualeno y el lanosterol disminuyen la si.ntesis de HMGF}, en células dehámster tratadas con lovastatina (un inhibidor de la HMGF}), TMD (un inhi.bidor de laescualeno ciclasa) y mevalonato (Peffley y Gayen, 1997). Además en diversos es(udiosse han encontrado evidencias que señalan al farnesol como el componente noesteroidal encargado de la regulación de la degradación de la HMGR, tanto enmami'feros como en levaduras (Correll eí a/.,1994; Meigs eí a/.,1996; López eí a/.,1997; Meigs y Simoni,1997; Gardner y Hampton,1999a)

Actualmente se tienen evidencias de que los inhibidores de la HMGR provocan laapari.ción de mecanismos regulatorios presentes de manera implícita, a este respectoLÓpez eí a/., (1997) concluyen en su estudio que los inhjbidores son capaces dedevelar mecanismos de regulación transcripcional, controlados por el colesterol de ladi.eta, y mecanismos de degradación de la enzima controlados por farnesol.

En las células de mamíferos, la HMGR es una enzi.ma que está fuertemente regulada adiferentes niveles y codifjcada por un solo gen. En el cuadro 9 se resumen losconocimientos actuales sobre la regulación de la HMGR de mamíferos.

Cuadro 9. Flegulación de la HMGF¡ mediante productos de la vía del mevalonato(tomado de Goldstein v Brown,1990)

Agente regiilador derivado del mevalonato

Nivel de regulación Esteroide No esteroide Sitío propuesto para elefectodelareaulación

Transcripcíonal + Secuencia EFiE 1 en elDromotor.

Post transcrípcional

Traducción de+ Complejo 5' de la región no

ARNmDegradación de la codjficante (5' UTFl).

+ +

Las siet© regionestransmembranales

proteínalnactivación de la ubicadas en el dominioaminotermínal.

Residuos de serina ytreonJnaubicadoseneldominjocatalíticocarboxilo

enzíma terminal y fosforilados porunacinasadependientedeAMPc.

La HMGF] de mamíferos parece estar compartamentalizada, pues en el parénquimahepático además de estar presente en el retículo endoplásmico, también lo está en losperoxisomas (Engfelt eí a/„ 1997). Por su pane, Keller eí a/.,(1985) fueron los primerosen demostrar que la HMGF` está presente en los peroxisomas, mediante el uso demicroscopia electrónica para detectar a los anticuerpos monoclonales utilizados contrala HMGR y con el empleo del fraccionamiento subcelülar mediante gradientes depercoll. La función de la HMGF` peroxi§omal dentro del metabolismo del colesterol e

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isoprenoides aún no se ha definido, como tampoco su estructura. Las HMGF` de amboscompanimientos deben estar reguladas de manera tanto diferencial como coordinada ypor lo tanto, desempeñar funciones distintas (Engfelt eí a/., 1997).

1.7.3 La regulación de la HMGFl en las plantasEn el reino vegetal, la HMGF` está codificada por pequeñas familias multigénicas, quevarían en número, desde 2 en el caso cle Arabí.c/ops/s Íha/Í.ana hasta 12 en So/anumtuoerosum (Mccaskill y Croteau, 1998) (Cuadro 1 o); además se han hallado evidenciasde que el uso de diterentes promotores permite el empleo de sitios alternativos decomienzo de la transcripción dentro de un mismo gen, con la posterior expresión dediferentes formas de HMGF} con regiones amino terminales de longitud variada(Mccaskill y Croteau,1998). En relación a lo anterior, en Lycopers/.con escu/en!um seencontró que el promotor del gen hmgr2 posee un elemento regulador positivo en elinterior de la región 5'UTR, y uno más que consiste en un rizo localizado corrientearriba del codón iniciaclor ATG (Daraselia eí a/.,1996). Asimismo se han encontradomatcos de lectura abierta diferentes al principal en las regiones 5' en el gen "G7 deGossypum h/.rsufum (Loguercio eí a/., 1999). Dichos marcos actuarían reduciendo laefectividad de la traducción del mensajero al proveer de un codón AUG falso, afectandoasi' la síntesis del polipéptido principal. No obstante, que la existencia de varios marcosde lectura abierta está comprobada en Sírep{omyces spp. (Takagi et a/., 2000), supresencia en las plantas constituiría un nuevo mecanismo de regulación transcripcional.Estas diversas isoformas de la HMGR poseen distintos patrones de expresión,refei.ente al tipo de tejido y a su estadio de desarrollo, y responden de maneradiferencial a los estímulos del medio ambiente (Enjuto eí a/.,1994; Chappell,1995;Weissenbom ef a/„ 1995; Jain eí a/., 2000). Por ejemplo Cho.i e! a/., (1992) encontraron

que hay una inducción de la acumulación de esteroides cuando §e somete a dañomecánico a tejidos de So/anum Íuoerosum y en el que está involucrado el gen hmgJ,en tanto que detectaron la acumulación de fitoalexinas sesquiterpénicas cuando sesometió al tejido a un tratamiento con inductores fúngicos, en donde hallaroninvolucrados a los genes nmg2 y hmg3. Posteriormente en Araoi.dops/'s Ína/i.ana, quecontiene solamente 2 genes que codifican a la HMGFi, denominados nmgJ y hmg2, seencontró que la expresión de nmg2 se da únicamente en tejidos meristemáticos yflorales (Enjuto ef a/., 1995), en tanto que el gen hmgJ posee dos sitios diferentes parael inicio de la transcripción, Io que resulta en la síntesis de una forma corta (HMGF}1S)y una larga (HMGRIL) de la HMGF` (Mccaskill y Croteau,1998). La HMGFlls esexpresada a niveles relativamente altos en toda la planta y responde a la luz; aunque,depende del tejido que se e§tudie; sus elevados niveles en la planta la implicarían en lasi.ntesis constitutiva cle los isoprenoides necesarios para el crecimiento celular (porejemplo, formación de esteroides indispensables en la biogénesis de membranas). Encontraste, la HMGRIL sólo se expresa a muy bajos niveles en plántiilas, raíces einflorescencias (Leamed y Connolly,1997).

En i. escu/eníum, el tamaño del fruto, durante su fase de desarrollo (fase 1), fuesensible al tratamiento con mevinolina, debido a que en ese momento hay una granactiv.idad de b.iogénesis de membranas; la aplicación de mevalonato exógeno revirtiólos efectos de la mevinolina. No obstante la aplicación de mevinolina en las etapasposteriores del desarrollo del truto no tuvo repercusiones, esto aunado a que losperfiles de las actividades y los niveles del AFINm permitieron sugerir que las

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isoenzimas de HMGFi en L. escu/eníum están reguladas durante el desarrollo (Narita yGruissem,1989). En este sentido el gen HMG7 podri.a tener la función principal deproveer de la suficiente cantidad de AMV, requerida durante las etapas de divisióncelular y de crecimiento (Jelesko ef a/., 1999).

El mismo evento se ha observado en tubérculos de So/anum Íuberosum, en donde losmiembros de la familia de la HMGF] se expresan de acuerdo a la etapa del desarrolloen que se encuentre el tejido, mediante la producción de isoformas específicas para lasíntesis de productos finales diferentes en tejidos particulares (Korth eí a/., 1997).Asimismo, Burnett ef a/., (1993) encontraron que los genes de HMGR en Campíoíhecaacum/.oaía presentan regulación, tanto diferencial como por desarrollo.

Una observación interesante que podría tener importantes implicaciones para laregulación de isoformas especi'ficas de la HMGF}, la constituye la existencia de un sitiode N-glucosilación en el segmento transmembranal expuesto hacia el lumen delretículo endoplásmico. Este sitio está presente en todas las isoformas conocidas deHMGF} que están involucradas en la producción de compuestos inducidos para ladefensa contra ataques de patógenos o cle otros compuestos secundarios, en tantoéste no existe en aquellas asociadas con tejidos de rápido crecimiento o la síntesisconstitutiva de los esteroides (Denbow eí a/., 1996).

Cuadro 10. Genes de HMGF¡ detectados en dilerentes especjes vegetales

Planta Genes Posibles tunciones F]eferencias

Arabidopsis 2 Constitutivo, meristemos e Enjuto eí a/.,1994; 1995thaliana intlorescencias

Camptolheca 3 Síntesis de esteroles, desarrollo Maldonado-Mendoza eí a/., 1997acumina{a f oral

Catharanthusroseus 1 Síntesis de isopreno Maldonado-Mendoza eí a/„ 1992

Hevea brasiliensis 3 8 osíntesis de hule, constitutivo Chve eí a/., 1991 ; 1992Lycopersri3um 3 Ó más 8 iogénes is de membrana, Daraselia eí a/.,1996; Denbow GÍesculentum maduración de truto a/" 1996

Nicotiana tabacum 2 Ó más Defensa Weissenborq ef a/., 1995Orvza sativa 2 8 osíntesis de fitoalexi na§ Nek;ofi eí a/.,1994

Parieniumaraentatum varios Biosíntesis de hule Ji eí a/., 1993

Pisum sativum 5 No determ inados Weissenboía eí a/. 1995FlaDhanus sativus 2 ó más P ántulas etioladas v meilslemos Vóllack eí a/., 1994

Solanum 12 S ntesis de esteroides Choí eí a/„ 1992;tuberosum Choi v Bostock, 1994

Triticum aestivum 4 ó más Constitutivo, tejido meristemático Aoyagí et a/.,1993

La regulación coordinada de las diversas enzimas que participan en la biosíntesis delcolesterol en las células de mami'feros también existe indudablemente en las plantas,un ejemplo ilustrativo es el estudio realizado por Choi eí a/., (1994a) acerca de lasrespuestas diferenciales de los genes hmg7 y hmg2 de So/anum Íubenosum durante suindiicción. El tratamiento con pequeñas cantidades de metil jasmonato, provocó unafuerte inducción de la transcripción del gene nmg7 con el correspondiente aumento en

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Iaacumulacióndeesteroidesyalcaloidesglucosilados;sinemba@elmetwjasmonatono tuvo ningún etecto sobre la transcripción del gen hmg2 ni sobre la formación defitoalexinas. En estudios similares realizados en cultivos en suspensión de Ni.coíi.anafabacum, tamb.ién se demostró la presencia del mecanisrno de regulación coordinadade un conjunto de enzimas, pues durante la respuesta al ataque por Pnyfopnmoraparas/t/.ca se detectó la inducción transitoria de la HMGR (EC 1.1.1.34), la IPPisomerasa (EC 5.3.3.2), Ia pren.iltransterasa (farnesilp.irofosfato sintasa; EC 2.5J .1) yde terpenoide sintasas específicas, así como la represión de las enzimas de labiosíntesis de esteroides (Vógeli y Chappell, 1988).

Existen otros factores que también regulan a la HMGR de las plantas, como elfitocromo (de manera post-traduccional) (Budde y Chollet, 1988), herbicidas,fitohormonas, mecanismos de retroalimentación y tactores proteícos endógenos (Bach,1987). Ad.icionalmente, existe evidencia de que la HMGR de plantas podría estarregulada por fosforilación reversible, al parecer mediante una cascada de dos ciclos.De hecho ya se han encontrado algiinas c.inasas que actúan sobre la HMGR (BaH efa/.,1994; Huber eí a/.,1994; Dale et a/„ 1995; Barl(er et a/.,1996; Douglas et at1997).

Halw y Hardie (1998) .ind.icaron que, Ias proteín-cinasas tipo SNF1 (las SNFl sonc.inasas de§cubiertas en la levadura S. cerev/.s/.eae y con funciones §.imilares a lasAMPK de los mami'feros) halladas en las plantas scm potenciales reguladoresgenerales del metabolismo del carbono dado que, son capaces de tosforilaí /.n v#m aimportantes enzimas metaból.icas tales como, Ia HMGR, la nitrato reductasa (EC1.6.6.2); y la sacarosa fosfato §intasa (EC 2.4.1.14).

A este respecto en estudios realizados en extrac" de hoja de Sp/.nacea o/eracea, sedemostró la capacidad de 4 proteín-cinasas del tipo SNFl para desactivar, med.iantefosforilación, a la nitrato reductasa, la sacarosa fosfato sintasa y la HMGRl deArab/.dops/.sma//.anaLafosforilacióndelaHMGR1,fueenlaserina577(Douglasefa/.,1997; Sugden eí at 1999), apoyando así la propuesta hecha por Dale e{ a/, (1995) enel sentido de que ese residuo es el punto de regulación por fosior.ilacióm Este hallazgotraerá como consecuencia replanteamientos acerca de cómo se dan las interrelacionesentre la asimilación de nitrato y el metabolismo de la sacarosa y de los isoprenos.

1.7.3.1 Compartamentalización de la HMGR en las ptantas

El tema de la localización de la enz.ima fue, durante algún tiempo, tema de controversiaen lo concerniente a la biosíntesis de isoprenos en plantas, dados los resultadosobtenidos en algunos estudios. Por ejemplo, Heintze eí a/., (1990) demostraron que loscloroplastos de tejidos iuveniles de Hondeum w/ga/e son capaces de sintetizar lpp. entanto que aquellos pertenecientes a hojas maduras, dependen de la importación dellpp c.itosól.ico. Por otro lado, en tricomas glandulares aislados de Mentha p/.peri'fa, Iaformación de lpp en el citosol es bloqueada al n.ivel de la HMGF}, en el momento que laacumulación de aceites esenciales es más rápida y el resultado e§ que no se atectadicha acumulación, los autores del estudio concluyeron que la biosíntesis demonoterpenos y sesqu.iterpenos recae exclusivamente en el IPP derivado de plá§tidos(Mccaskill y Croteau, 1995).

En cé" de mamífe" Ia HMGR es una glucoproteína localizada en la membranadel reti'culo endoplásmicb, en tanto que en las plantas la presencia de la HMGR se

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asoció, en un principio con membranas plastídicas, mítocondriales, además de la delretículo endoplásmlco (Bach, 1987). Sin embargo, todas las secuencias de HMGR deplantas se caracterizan por la ausencia de un péptido li'der que indique la translocacióndesde el citoplasma hacia los organelos, además de que la mayor parte de lasisoformas de HMGF} que han sido caracterizadas ampli.amente, presentan un factorcomún dado por la posesión de dos regiones transmembranales con un segmento deunión entre ellas y de manera altamente conservada, lo que implica una tuerteevidencia a favor de la inserción de la enzima en la membrana del retículoendoplásmico, sobi.e todo teniendo en cuenta la diversidad de condiciones fisiológicasa partir de las cuales se aislaron los ARNm para preparar los ADNc, la variedad de lospatrc)nes de expresión de los genes, y de la especialización funcional de las HMGR dealgunas e§pecies.

Posteriormente, en experimentos de transcripción y traducción de la enzima /.n v/.Íno,con isogenes muy divergentes entre sÍ, en Arabí.dops/.s lha//.ana se demostró que lainserción de los productos se dió co-traduccionalmente en microsomas derivados deretículo endoplás"`co, similar a lo que ocurre en las células de mamíferos (Enjuto eía/., 1994). De igual maneía, Denbow eí a/., (1996) no observaron inserción post-traduccional de una isoforma de la HMGR de jitomate en cloroplastos completos.Asimismo, Godoy (1997) obtuvo resultados que sugieren la existencia de una enzimaHMGF} involucrada en metabolones pero no en la formación de lpp dentro delcloroplasto.

Anteriormente, se suponía que la biosíntesis de los compuestos isoprénicos serepartía entre tres compartimientos subcelulares semiautónomos: el citosovretículoendoplásmico para la biosíntesis de sesquiterpenos y triterpenos; los plástidos para labiosíntesis de monoterpenos, diterpenos y tetraterpenos (así como para las poícionesprenil de la clorofila, plastoquinonas y tocoferoles); y la mitocondria (y/o el aparato deGolgi) para la biosi'ntesis de ubiquinona (MCGarvey y Croteau,1995); no obstante, estavisión resultaba simplista y no ayudaba a explicar algunos aspectos desconcertantesde la biosíntesis de los isoprenoídes en las plantas, de aquí que surgieran nuevosmodelos encaminados a esclarecer la compartamentalización de la biosíntesis de losisoprenojdes en las plantas.

Chappell (1995) propuso el concepto de canales metabólicos dedicados a lapíoduccción de tipos especi`ficos de isoprenoides y regulados independientementeunos de otros (Figura 14).

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Figura14.PropuestadeChappell(1995)deloscanalesmetabólicosparaexplicarlabiosíntesisde los isoprenos.

Posteriomerite se manejó otro modelo en el se incluyó a la recientemente descubierta víade Rohmer o TF/piruvato (Figura 15) y en la que se delimitan los sitios de acción de la víaclásica del mevalonato y la nueva de TF/piruvato.

CitoDlasma

3 Acetil-CoA

+HMG-CoA

Mevinolina

Mevalonato

+DMAPP ® lpp

FEP (Sj 5) + Sesquiterpenosi\Politerpenos

EsterolesTriterpenos

Figura 15: Propuesta de Lichtentahler eí a/„ (1997) de la compartamentalización de labiosíntesis de los isoprenos

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Finalmente el modelo actual (Figura 16) toma en cuenta los hallazgos realizados endiversos estudios, por ejemplo en Maín'can'a recuí/.Ía la distribución de la marca de [`3C] enlos sesquiterpenos fue heterogénea; es decir, las dos primeras unidades de isoprenoincorporadas al precursos FPP provenían de la nueva vía TF/piruvato, mientras que elúltlmo lpp incorporado se origlnó a partir de las dos vi'as: la del mevalonato y la nueva (Adamy Zapp, 1998) o del caso del esqueleto carbonado del alcaloide indólico secologanina enCaíhaffiníht/s roseus, el cual presentó marca de ["C] proveniente tanto de la vía delmevalonato como de la nueva vi.a TF/piruvato (Comn eí a/. , 1998).

Entonces el modelo vigente tiene en consideración que, al menos /.n v/.vo, existe unintercambio de unidades de lpp entre los diferentes compartimientos celulares y que desdeluego. existen diferenci.as en el grado de intercambio sujetos al tipo de tejido y tal vez alestadio de desarrollo.

Figura 16. Modelo vigente que explica cómo está configurada la compartamentalización y labiosíntesis de los isoprenoides en las plantas. Las flechas gruesas indican vari.os pasosenzimáticos (Adaptado de Mccaskill y croteau, 1998 y Lichtenthaler, 1999).

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1.8 LA NUEVA VÍA BIOSINTÉTICA DE IPP

Hasta hace muy poco tiempo se teni'a por válida y generalizada la idea de que loscompuestos isoprénicos sintetizados en todos los seres vivos del planeta der.ivan delIPP formado por la vía del mevalonato. Sin embargo, durante los últimos añosempezaron a aparecer una serie de resultados que no eran compatibles con la idea deuna sola ruta de síntesis para lo§ isoprenoides. Por otro lado, desde finale§ de ladécada pasada y principios de la actual, aparecieron algunos estudios que fueron losprimeros eslabones de una cadena de investigaciones cuyos resultados revelaron, demanera ind.iscutible, la existencia de una niieva vía biosintética de IPP en bacterias yplantas (Schwender et a/.,1996; Lichtenthaler et a/.,1997). Esta nueva vi.a, por surelevancia, ha provocado una tran§formación profunda en la concepción de labiosíntesis de los isoprenos en diversos organismos (algas, bacterias, hongos yplantas).

1.8.1 El hallazgo de la nueva vía

Los primeros indicios de la existencia de esta vía tuvieron lugar en 1988 cuando seestudiaba en procariotes la biosi'ntesis de los hopanoides (triterpenos pentacíclicos,sucedáneos esteroidales presentes en las membranas bacterianas). El estudio anteriorjunto a diferentes estudios posteriores demostraron la incorporación de moléculas deacetato, glucosa, piruvato y eritrosa, marcadas con [13C], a las unidades isoprénicasde los hopanoides, así como a las cadenas laterales de las ubiquinonas y a lostilacoides (Bach, 1995; L.ichtenthaler et a/.,1997). De esta manera quedó al descubiertouna vía biosintética de lpp independiente de la clásica (mevalonato) y que aquélla estápresente en diversas especies bacterianas, tales como: A//.cyc/obac/.Wu§ ac/.doca/dar/.us,yÉ-s;i;ÑCÑi.i -;á,i'-_Ñit-ñ:yiábá-cterium fujisawaense, Methy,ob.acte_rium ?!g_a_n_oP±i!uL#'--E:iá.áb.:é.Jd:oñ¿.ha:--áóíd-oihiia,F3oqoóseud?Tonps_Lpeiu5tr!?L.Z^!rr::^°^P^°nu3ShTh°.b!!¡as,'S;ñ%-h-o-c;:;;;¿iii„üaóñ;ioppi'ius.!n_f!u.ezee,.y_¥Eep_a_ctepu^Ttu.P€nrsyi?S!S:Ha£'¡C.:b.aocgeR:

py/or/., Bac/.//us suof/.//.s (Bach, 1995; Lichtenthaler ef a/., 1997: Lois eí a/.,1998:Takahash.i ef a/„ 1998); aunque en una cepa de Sírepfomyces aen.ouv/./er, se encontróque ambas vías de si'ntesis de IPP funcionan de manera simultánea (Lichtenthaler eía/.,1997).

1.8.2 Ls nueva vía también está presente en abas verdes y hongosDesde hace años, existen informes referentes a estudios en los que el AMV marcadocon [14C] ó con [13C] no es incorporado a productos finales tales como B-caroteno,esteroides y luteína; de estos resultados se llegó a la conclu§ión de que las células delas algas verdes eran impermeables al AMV aplicado exógenamente. En 1996Schwender ef a/., descubrieron que los isoprenos formados en los plástidos deScenedesmus oÓ//.qLíus no provienen del IPP formado por la vía del mevalonato; el

patrón de incorporación de la marca ([1-13C] glucosa; [6-13C| glucosa; [4, 513C2]

glucosa; [U-13C6] glucosa y [1-13C] acetato) a la cadena lateral de fitol de lasclorofilas, carotenoides y de los esteroides citosólicos condrilasterol y ergost-7-enol fueidéntico a la nueva vía encontíada en diversas eubacterias. Con la ayuda de espectrosde RMN se determ.inó que iino de los precursores era una triosa fosfato. Otra evidenciamencionada por Schwender ef a/. (1996) que apoya la biosíntesis del lpp en algas a

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parlir de la nueva.vi'a fue el hecho de que la mevinolina (inhibidor especi'fico de laHMGF} en animales, plantas y hongos) no atectó ni el crecimiento ni la multiplicación deScenedesmus oÓ//.quus, así como tampoco afectó los niveles de los pigmentosfotosintéticos (clorofilas y carotenoides).

Además de Scenedesmus ob//.qws, también se han hallado los mismos patrones deincoíporación de la marca en otras especies de algas verdes, como son: Cn/ore//ap¥rf_no!dosa, C. ellipsoidea, C. fusca y Chlamydomo;as reinhardtii (J+ich+eri{haJer et al.,1997; Schwender eí a/.,1997).

En cuanto a los hongos, también se descubrió la presencia de esta nueva vi'a enG/.Obere//a Íu/./.kuro/., en el que la adición de precursores marcados (acetato, mevalonatoy leucina) a los .productos finales como el ergosterol, neurosporaxantina y fitoeno fuedifeient® en cada uno, indicando con ello que la biosi'ntesis de los esteroides,gibéíelinas y caíotenoides está físicamente sepaíada entre los diversoscompartimentos subcelubTe§ y cada cual con su poza de §ustratos, lo que para el casode los carotenoides denotaría a la nueva vía (Domenech eí a/., 1996).

1.8.3 Las plantas superlores tamb¡én están dotadas de la nueva vía de blosíntesisdoi 'ppLos cloroplastos de las algas verdes son muy sjmilares a los de las plantas superioíes,por lo que respecta a la composición de los pigmentos, el rendimiento fotosintético,asimjsmo pai.a la bioquímica, la tisiología y §u filogenia, de manera que actualmentepredomina la idea de que las plantas superiores son parientes cercanas de las algasverdes por compaítir estas características, aclemás de tener ancestíos comunes(Schwender eí a/„ 1996; Lichtenthaler eí a/., 1997), por lo que lo descubierto en lasalgas verdes acerca de la biosíntesis del lpp, podri'a también ocurrir en las plantassuperiores (Cuadro 11 ).

Los resultados mostrados en este cuadro se obtuvieron a través de los patrones de•a,

giFr:eps3;ancáfennte:se!:a,R[ñ:C3ond:xc`::c:!nede,|;esperstt:f,:Ss::rd:a,:toepr:onso,:supe:stcr::este compuesto se utilizó 2H como marca y se interpretó con la ayuda de CG-EMademás de espectroscopi'a de T]MN de 1 H.

Del cuadi.o 11 pueden hacerse dos importantes deducciones, la prímera es que loslípidos prenilados producidos en los plástidos provienen de la nueva vía y losesteroides citosólicos de la vi'a del AMV; la segunda es que ambas vías parecen estarinvolucradas en la formación de los elementos isoprénicos durante la biosíntesis dealgunos compuestos (como el caso de la secologanina en Camaraníhus /oseus o elchamazuleno en Matricaria recutita).

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Cuadro 11: Compuestos i§oprénicos provenientes de la vía clásica o de la nueva vía de si`ntesisdel lpp en plan`as superiores. TF=Triosa (osfato F` f rencia

E§pec,e lsoprenoide Ruta b!osintetica de'PP ee /

Ginkgo biloba Ginkólido A (diterpeno) TF/piruvatoLichten`haler eí a„(1997c)

Morus albaChalcomoraci na (ChalconaDrenilada) TF/piruvato Bach, (1995)

Marrubium vulgare Marrubiin (diterpeno) TF/piruvatoLichtenthaler oÍ a/.,(1997ct

Taxus chinensisTaxol [esqueleto carbonado del

TF/piruvatoEinsenreich eí a/.,

sistema anular taxano|(diterDeno) (1996)

Daucus caromFitolCampesterol TF/piruvato

Lichten`haler eí a/.,1997b/

AMV

Hordeum vulgareFltolSitosterol TF/piruvato

Lichtenthaler eí a.,1997b

AMV

Lemna gibbaÍ)-sitoesterol. plastoqu inona 9 TF/piruvato

Lich`enthaler Gt a/.,(1997a)Zeidlereía/.,(1997)

Sitoesteroi AMV

Chelidonium maiusPcjpulusnigra lsoprenolsopreno'sopreno TF/piruvato

TF/piruvato Zeidler eí a/., 1997

TF/piruvato Zeidler eí a/„ 1997Salix viminalisCatharanlhusS

Secologanina (i ridiodeglucosilado) TF/piruvato y/o AMV Contin eí a/., (1998)roseuMalricaria recutita

Bisabololoxido A yChamazulene(sesaui`erDenos) TF/piruvato y/o AMV Adam y Zapp, (1998)

Mentha piperitaThymusvulgarisNicotianatabacLim MonoterpenosMonoterpenosCadenalateral prenilada de TF/piruvato Adam y Zapp, (1998)

TF/piruvato Adam y Zapp, (1998)

TF/pirwa`oAMV Disch eí a/..(1998)

(Células BY-2) plastoquinonaEsteroide§

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1.8.4 Ruta biosintética del IPP a través de la nueva vía de TF/piruvato.La primera reacción que tiene lugar en la nueva vía y que lleva a cabo la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfalo sintasa (DXFS) (Lange eí a/.,1998; Lois ef a/.,1998), consi.ste en lacondensación de la hjdroxietiltiamina (derivada del piruvato) y el grupo aldehído delcarbono 1 del D-gliceraldehído-3-fosfato, lo que da como resultado la formación de D-desoxixilulosa-5-fosfato (Zeidler eí a/., 1997; Lich{enthaler eí a/., 1997b y c).Posteriormente, la D-desoxixilulosa-5-fosfato sufre un rearreglo molecular el cual daorígen a un intermediario: La 2-C-metileritrosa-4-fosfato, que a su vez es objeto de unareducción que produce 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato, todo lo anterior lo realiza una 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXFF]) (Takahashi eí a/.,1998). El restode las reacciones que llevan a la síntesis del lpp aún no se conocen (Figura 17).

En relación a lo anterior Kuzuyama eí a/., (2000 a y b) consiguieron caracterizar tanto ala DXFS como a la DXFR. El gen de la DXFS se clonó a partir de una cepa deSírepíomyces spp. y se encontró que el gen codifica una protei'na de 631 aminoácidosy con un peso molecular probable de 68 kDa. El producto del gen se purificó a partir desu sobreexpresión en Esche/Í.ch/.a co//. y presentó un peso molecular cercano alpredi.cho (70 kDa), en tanto que por electroforésis en geles de poliacrilamida bajocondjciones disocjantes el peso molecular fue de 130 kDa, lo cual sugiere que setratade un dímero. Cuando se compararon las DXFS purifjcadas de Sírepíomyces spp y deE. co/Í., se observó que tuvieronlas msmas características enzimáticas.

Mientras que el gen que codi.fica la Dxm de E, co//. se sobreexpresó y posteriormentese caracterizó, los resultados obtenidos indican que la glutamina 231 es fundamentaldurante la conversión de la D-desoxixilulosa-5-fosfato a 2-C-metil-D-erilritol-4-fosfato y

que un tres histidinas (153, 209, y 257) participan en la unión de la D-desoxixilulosa-5-fosfato a la enzima.

Otro par de puntos importantes a considerar sobre esta nueva vía es que: 1 ) parece serque la Dxm es el paso limitante en la nueva vía (Takahashi eí a/.,1998) y 2) que estanueva vía no existe en células animales, dado que la búsqueda de homologías en losbancos de secuencias para la dxís, dió como resultado que hubo una gran similitud consecuencias de microorganismos pertenecientes al grupo de las eubacterias, asi' como

?f!T.._a!g_unas..p_lar:\as (.Oryza` sativa, F]icinus corñmunis, Pinnus taeda, Árabidópsí-slfia//.ana j/ Meníha p/.períta/, peío no para animales; sin embargo, tampoco seencontraron analogías con micoplasmas ni con Saccnaromyces cerev/.s/.ae (Loi.s eí a/.,1998); en tanto que dxr regi.stró homologi'a con elementos del grupo de las eubacteriasy a pesar de que no se han encontrado simllitudes con secuencias de plantas, no sedescarta la idea de que muy pronto se encuentre al gen en las plantas, tan pronto comoesté disponible un genoma totalmente secuenciado (Takahashi. eí a/., 1998).

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A":ficoA

```

ACA.:®oñ„oA

HOOC"CoA

`-`.`.-.`. `..,``

G luco sa

AACT/HMGS

HÑGL=Cusrpos cetómcos

M%H = Catabolismo de ¡eucina

DXF REDUCTO ISOM ERASA

`"

Glic®raldohído.3,losfato

+ñsr=oHHidToxietil.tiamina difosfato

[T::*cH20H®]

LH+Pl'ldoxal- -TiammacH20H®

OH

1-De3oxJxiluloga-5-fosfato

::#,o4Pp - [H#o]2.c.metii-0-ormlol-4-P L - 1

2-C-met\leritrosa-4-P

Flgura 17. Comparación de la ruta del mevalonato con la nueva vía de biosintesis cle IPP. Las dobles

t,A=:;:aá:dáceaÁdvaaú,oys2:;,ig:3:,Tá,t:c:;á,,:ig,á#aaskaphuanst::gra:,,,nldd33,a,asenz,ma-volucrada§

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1.9 SINTESIS

Las secuenci.as metabólicas ini.ciales que parten de las unidades básicas, {ales como elacetato (hasta llegar a los policétido§ e isoprenoides), shiki.mato (hasia llegar aalcaloides) y glucosa (hasta llegar a carbohidratos complejos), son comunes tanto enlas plantas como en los microorganismos. Los eventos secundarios sucesivos como laci.cli.zación, hidroxilación y rearreglos de las unidades oligomerizadas son, en granmedjda, muy diferentes en cada organismo.

Dado que las plantas producen una gran cantidad de sustancias con propiedades útilesal hombre, se idearon estrategias para obtenerlos, y entre éstas, tenemos al cullivo detejidos vegetales.

A la planta Cafharanfht/s roseus se le han realizado una gran cantidad de estudios conel objeto de conocer mejor el mecani§mo biosintético de los alcaloides indólicos conactividad terapéutica o para aumentar su producción.

Este tipo de alcaloides contiene un componente isoprenoide que se derlva de una rutabiosínteti'ca conocida como la vía del mevalonato. La caracterización de las enzimasque intervi.enen en la formación de e§e componente isoprenoide ha sido lenta y difícil,pero dada la insoslayable importancia de la HMGF} en la regulación de la biosi'ntesis delcolesterol en células de mami'feros, era de esperar que tuviera una función igual deimportante en la biosíntesis de los isoprenoides de las plantas.

El dominio catalítico de la HMGF` está altamente conservado a través de los seresvivos, en tanto que su dominio tran§membranal lo e§tá menos,. sín embargo, seencuentra conseívado entre las especies de un mismo reino.

Mientras que en las células de mamíferos la HMGR es una enzima codificada por unsolo gen, en las plantas esta mísma enzima se presenta como múlti.ples isoenzi.masque son codificadas por una pequeña familia de genes. Miembros específicos de esafamilia de genes son expresados diferencialmente durante el desarrollo o en Íespuestaa factores ambientales y distintas isoformas de la enzima pueden ser críticas en ladirección de los intermediarios de la vía hacia compuestos isoprénicos específicos,. noobstante, en todos los seres vivos la enzima está fuertemente regulada a cuamniveles: la transcripción, la traducción del ARNm, la degradaci.Ón de la enzima y lamodifi.cación covalente por fosforilación.

Además en las plantas existe la compartamentalización de los productos isoprénicosprovenientes tanto de la vía clásica del mevalonato, en donde interviene la HMGFl, y lanueva vía TF/piruvato, lo cual podría explicarse por la necesidad de coordinar y regularla si'ntesis de una gran cantidad de isoprenoi.des provenientes de un sustrato común, ellpp, y que explicaría la falta de efectividad de los recursos empleados para obtener loscompuestos isoprenojdes de interés.

El qu/.d del asunto se relaciona con la dificultad de comprender la regulación de tanimportante vía metabólica; en la mayor pane de las revisiones realizadas sobre el temase menciona e§a necesidad. Si se lograran revelar los mi.sterios de la regulación de labiosíntesis de los isoprenoi.des, podri'an aplicarse las ,herramientas modernas, talescomo la biología molecular y la ingeniería metabóljca, así como las novedosasestrategias para cultivar tejidos y células, y con las cuales se podri'an soslayar, en elfuturo, muchos de los problemas que actualmente enfrenta la obtención de los

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compuestosisoprenoidesdeinterés;demaneraqueseabriri'anposibilidadesenormes,tanto en lo cienti'tico como en lo tecnológico.

?::3:í:nTnáussd,:sveeJnst,ec:ioeii,:E:np#::,??:,íteer:::;;t,:;:g,::ndt:d:á:`:á:ea,tceá`,::dse3indólicos(parlicularmentelavincristinayalavinblastina);peroninguna,porsÍsola,hadado resultado.

1.10 JUSTIFICAclóN

En Camaíaníhus roseus se sintetiza un terpeno, la secologanina, el cual al

::f.:c:::,adr,;:,ca::a,L:d:r,gtap:Llf,dep,rocLea,,::tes,ndt:,i::,á,'ase:,:'ct:i#,feát:oáepra:g:,co:d:Smonoterpenindólicos en las Apociriaceas. Se piensa que la secologanina, al igual quecualquier om terpeno, deriva su esqueleto carbonado a pam del mevalonato; esteúltimocompuestotambiénsirveparalabiosíntesi§detodoslosdemásisoprenos,de`alforma que el conocimiento de cómo se sintetizan y de los^ mecanismos que Íegulan laactividad de las enzimas que los producen se ha convertido en un objetivo deprimordialimportanciaparaentenderelprocesocompletodesíntesisdelosalcaloidesindólicos monoterpénicos.

1.110BJETIVOS Y METAS*Purificar a la HMGR membranal, de rai'ce§ transtomadas de C. roseus.

1.12 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

La reacción que cataliza la HMGR produce la formación del mevalonato del cual seforma lpp, que a su vez es la unidad constructom de la inmensa variedad decompuestos terpénicos. Con la idea anterior cabría pensar entonces que cualquier

i,;#¡;!nep:ous:ie,r:onri,;:áif:::s:i:ac!:a,;:,LTáac:áón:adge:#eFr,mgegd:,::,oás:i;o:gcui:asnc:h::s,di:'i,:si'ntesis de estructuras esteroidales finales más complejas, mientras que Wiessenbornefat(1995),mencionanelhechodequelaHMGRdesernpeñaunaimportantefunciónen la regulación de la síntesis de se§quiterpenos: sin embargo existon o" muyprobabbs pitntos de regulación, adenús de la HMGR a lo largo de la vi'a de losterpenos, pues otras enzimas tales como la geraniol-10-hidroxilasa (GIO-OHasa), Iaeslrictosidina sintasa (SS), y/o una monoterpenciclasa, podri'an intervenir como puntosde regulación en la vía.

EnelcasopanicukHdeesteproyecto,interesalabiosíntesisdealcaloidesrnonoterpenrindólicos, dado que éstos poseen una poú monoterpénica (secologanina), poÍ loqueesdeinterésconocerlospuntosderegulacióndeestavía.

¿Cuáleslarazónparallevaracabolapurificacióndeestaenzima?.Comosesabe,laHMGR de las planlas es codificada por una familia de genes y por lo tanto enCaíhamnlhusÍoseusdebehabertambiónmásdeunaHMGR,luegoentonces,¿cuálesla encargada de regular el flujo hacia los precursores de terpenos (secologanina) queintervienen en la síntesis de alcaloides monoterpen-indólicos?.

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Para saberlo, es necesario purificar y caracterizar la o las i.soenzimas de HMGFl enraíces transformadas de Caf4a/an% noseus, como paso previo para determinarcuales se encuentran involucradas en la biosi'ntesi.s de lo§ alcaloides mencionados.

Para el proceso cromatográfico de la purificación se utilizarán columnas de afinidad de2 tipos: la sefarosa azul, que contiene al colorante Cibacron Blue F3G-A, desarrolladopor la compañia sueca Pharmacia Fine Chemicals en los años sesenta (Scopes,1994).Este colorante tiene la particularidad de guardar semejanzas con la estructura del anilloplanar y con los grupos cargados negativamente del nicotín adeni.n dinucleotido (NAD),lo cual le permite uni.rse a aquellas enzimas reductasas que contienen un sitio de uniónpara dinucleótidos ("dinucleotide fold") y que utilizan NADPH ó NADH como cofactores(Tormanen eí a/.,1976; Lowe,1979; Scopes,1994). En el caso particular de la HMGR,ese sitio es primordial para la unión del NADPH, que desempeña el papel de coenzimadurante la reacción catalítica. Además, se eligió otra columna del lipo HMG-CoA-hexil-agarosa, 'a cual contiene unido al sustrato de la enzima. El uso de este tipo decromatografía permitirá una purificación más "limpia.', precisa y con altos Íendimi'entosde recuperación de la enzima, dado que esta técnica explota la especificidad biológicaúni.ca, inherente en una interacción macromolécula-ligando.

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Extracción:

HomogeneizadoFiltradoCentrifugación a 1,000 x gLa pastilla se desecha y se mide el volumen y la actMdad deHMGF} en el sobrenadanteCentrifugación a 100,000 x g del sobrenadante anteriorAntes de desechar el sobrenadante se le mide el volumen y laactMdadLa pastilla se resuspende y se le mide el volumen y la actividad

Solubilización:

Agregar detergente no iónico Brii Wl a la pastillaresuspendida anteriormente

rn::brav,oáu3m5?:X:8t,#au:odseHMGRMedir volumen y actividad de HMGF`Añadir 5 ml de glicerolCentritugar a 190,000 x gMedir volumen y actividad del sobrenadante y almacenarloF`esuspender la pastilla, solubilizar de nuevo y centrifugaruna vez más a 190,000 x gMezclar los sobrenadantes de las dos centrifugacionesanteriores

Procedi m iento cromatog ráfi co :

Aplicar los sobrenadantes anteriores a una columna de sefarosa azulEluir y recolectar las fracciones con actividadPreparar una columna de afinidad del tipo HMG-CoA-hexil-§efarosa y aplicarle el extractoenzimático, elum y medm la actividad de HMGF} a las tracoione§ para comprobar que la resinafunciona adecuadamente

Flgura 18.Diagrama de fluio del tíabaio experimental

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1.13 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Adam 1(. P., J. Zapp. (1998) Biosynthesis of the isoprene um§ of chamomilesesqu.i`erpenes. Phytocíiemistry.48.. 95ó-ó¿9.

Arébalo R. E., E. D. Mitchell. (1984) Cellular distribution of 3-hydroxy-3-methylglutarwcoenzyme A reductase and movalonate kinase in leaves of Wepela caíar/.a.Phytochemistry23..13-18.

Aoyagi 1(., A. Beyou, K. Moon, L. Fang, T. Ulrich. (1993) lsolation andcharacterization of cDNAs encoding wheat 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA reduciase. Plant Physiol.102: 6Z€3-626.

Bach T.J. (1995) Some new aspects of isoprenoid biosyn(hesis in plants -a revíew.Lipids 30.. 191 -202.

Bach T.J., A. Motelí T. Weber. (1990) Some properlies of enzymes involved i.n thebiosynthesjs and metabolism of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A inp#H:sÑ?nn.iBTPEheQ#Tgt^%^of^:!e\T€_vía,_éiÉ-i¿ió_iáitñfi*'í:m-e-:á#='FTo^we'rnsG.H.N. and H.A. Stafford, eds.) Plenum Pross, New York. pp.1-82

Bach T.J. (1987) Synthesis and metabolism of mevalonic acid in plants. P/anf P^ys/.o/.Biochem. 25.. 163-178.

Bach T.J., D. H. Rogers, H. Rudiiey. (1986) Detergent-solubilization, purification, andcharacterization of membrane-bound 3-hydíoxy-3-melhylglutaryl-coenzyme Areductase from radish seedlings. Eu/. J. B/.ocnem.154: 103-111.

Bach T.J. (1981) Ph D. Ihes/.s Karlsrusher Beitr.Planzenphysiol.10: 1-219.

BaH K. L., S. Dale, J. Weekes, D. G. Hardie. (1994) Biochemical characterization oftwo forms of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase kinase from cauliflower(Brassica oieracian. Eúr. J. Bioáhórñ:-2i g.:ii¿:i&ó.

Barker J. H. A., S. P. Slooombe, 1(. L. Ball, D. G. Hardle, P. Shewry, N. G. Halford.(1996) Evidence that bark» 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzime A reductasekinaseisamemberofthesucrosenontermenling-1-relatedproteinki.nasefamily.Plant Physiol. 112.. 1141 -1149.

Beg Z. H., H. 8. Brewer Jr. (1981) F]egulation of líver 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase. Curr. rop. Oe//. f}eg. 20: 139-184.

Berlin J., C. Mollenscho" F. Dlcosmo. (1987) Comparison of various strategiesdesígned to optimize indole alkaloid accumulation of a ceH su§pension cijlture ofCatharanthusroseus.z.Naturfo;sáh:riri¿."i-+-ói-.'íiv&i.

Berlln J., C. Mollen§choü N. Greldzw S. Érdogan,1. Kuzuklna. (1990) Affectingsecondaiy product formation in su§pension and hairy root cullures- A

3c£apn%T:soann;eRn;^'P£hg_'^e:_s_.ir.._p,,a_n:._pg|,Iú,_á.r.-aióifiiic;,:-;`áio`,&;-áuu;;::;SÉ|a;tSo/.Gnco aw B/.oíechno/ogy /.n Agr/.cuM Vol. 9 ( Nijkamp H. J. J., L. H. W. Vander Plas and J. Van Aarlrijk, eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. pp.763-768.

58

Bhadra R. y J. V. Shanks. (1997) Transient studies of nutrient uptake grow`h andindole alkaloid accumulation in heterotrophic cultures of hairy Íoots ot'óá:áñara-;iñ;u-s-roseus.Biotechno,.Bioeng.55..52J-534.

Bhadra R., S. Vanl, J. V. Shank§. (1993) Production of indole alkaloids by selectedhairy root lines of Catharanthus roseus. B/.olechno/. B/.oeng. 41 : 581 -592.

Bonarius H. P., C. D. de Gooijer, J. Tromper, G. Schmld. (1995) Determination of lherespiration quotient in mammalian ceu culture in bicarbonate buffered media.Biótechnol. Bioeng. 45.. 524-535.

Bonzom M. P., C. Andary, A. Guerffier, J. L. Roussel, A. Gargadennec. (1997)Effect of a tertiary amine on alkaloid accumulation in Oaíhaíanthus roseus.Phytochemistry 46.. 235-239 .

Brown D. A., R. D. Simoni. (1984) Biogenesis of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzirneA reductase, an integral glycoprotein of the endoplasmic reticulum. Proc. Wal/.Acad. ScÍ.. USA. 81 : t674-1678.

Brown M.S., J. L. Goldsteln. (1986) A receptor-mediated pathway for cholesterolhomeostasis. Sc/.ence 232: 34-47.

Brown, M.S., J. L. Goldstein. (1999) A proteolytic pathway that controls the chole§terolcontent of membranes, cells, and blood. Proc. ~aí/. Acad. Sc/.. 96: 11041-11048.

Bruneton J. (1993) Monoterpenoid .indole alkaloids, en: Phamacognosy,"plhlyto-c'he};át-Ñ' 'f tóí¿ih.E,- -_F,a.n_t_s.- __Teoc.hen.,oqEuP aT,d Documen\ati,or,-

Lavoisier/lntercept, Hampsh.ire, England. pp. 816-854.

Budde R.J.A., R. Chollet. (1988) Regulation of enzyme actMty in plants by reversiblephosphorylation. Phys/.o/. P/aní. 72: 435-439.

Burnett R.J., 1. E. Maldonado-Mendoza, T.D. MCKnight, C.L. Nes§leh (1993)Expression ot a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene fmCampfoíheca acum/.nafa is differentially regulated by wounding and methyljasmonate. P/aní. Phys/.o/.103: 41 -48.

Caelles C., A. Ferrer, Ll. Balcells, F. G. Hegardt, A. Boronat (1989) lsolation andstíuclural characterization of a cDNA encoding Arao/.dops/.s tha//.ana 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase. P/aní Mo/. B/.oJ. 13: 627-638.

Campos N., A. Boionat. (1995) Targeting and topology in the mernbrane ot plant 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase.P/anfCe//7:2163-2174.

Canel C., M. J. Lopes-Cardo§o, S. Whitmer, L. Van der Flts, G. Pascuali, Fl. van derHeijden, J. H. C. Hoge, R. Verpoorte. (1998) Effects of over-expression ofstrictosidine and tryptophan decarboxyla§e on alkaloid production by ceM culturesof Cafharaníhus noseus. P/anía 205(3): 414-419.

Canto-Canché 8. (2000) Estudio de las enzimas geraniol lo-hidroxilasa y P450 enrai'ces transformadas de Oaíharanlnus roseus. Tesis de Doc`orado, CICY.

Canto-Canché 8., Loyola-Vargas V.M. (1999) Chemicais from roots, hairy roots, andtheir application. Chemicals via Higher Plant Bioengineerring. Chapter 18(Shahidi el a/. eds.) Kluwer Academic/Plenum Publishers, N. Y. pp. 235-275.

59

CappelR.E.,IJ.F..Gllber[.(1993)Oxidativeinaclivatíonof3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase and subunit cross-linking involve different dilhiovdisulfidecen`ers. J. Biol. Chem. 268: 342-348.

Carpin S., L. Ovelhazi, M. Filali, J. C. Chénleux, M. Rideau, S. Hamdi. (1997) Therelationship between the accumulatíon oí a 28kD polypeptide and that of indolealkaloid§ in Oalharanfhüs nosew cew suspension cultures. J. P/aní f'hys/.o/.150:452457.

Ciau-Ulü fl., lvl.L. Miranda-Ham, J. Coello-Coello, 8. Chi, L.M. Pacheoo, V.M.Loyola-Vargas. (1994) lndole alkaloid production by transformed and non-transformed root cultures of Oalharanlnus noseus. /n V/.Íno Ce//. Dev. B/.o/. 30: 84-88.

Clarke C. F., P. A. Edwards, S. F. Lan, R. D. Tanaka, A. M. Fogelman. (1983)

Een::'.aftg?, oAfc:-dryg:%-gATe8,gy:gá:tá.*gsoA reductase mF,NA ,eve,s ,n rat ,,veíContin A., R. Vam der Heijden, A.W.M. Lefeber, R. Veerporle. (1998) The iridoid

glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvatePa`hwa'y in a Catharanthus roseus ce|| cu|\úré. `ñÉás -Lsiñá,s:LgT'4T`3G_`4V,yg.

Crea§ey W.A. (1975) Biochemistry of djmeric Caínazanlhus alkaloids. en: TheOaíhar"w a/ka/Óft* (Taylor W.l. and N.R. Farnsworth, eds.) Marcel Dekker,lnc. New York. pp. 209-236.

CI`appeH J. (1995) Biochemislry and molecular biology of the isoprenoid biosyntheticPa+hway |n p|ante. Annu. hev. p|ant Physioi. -p|-a-n`t Ñoi|'.'-Biá|:Zg:'3#_gá;.

Cheng, H., L. Xu 1+. Kumagai, R. D. Simoni. (1999) Oligomerization state influencesthe degradation rate of 3-Hydroxy-3-melhylglutaryl-CoA Fleductase. J. B/.o/.Onem. 274: 17171-17178.

Chln D.J., G. Gll, D. W. Russell, L. LI§cum, K. L. Luskey, S. K. Basu, H. Okayama,P. Berg, J. L. Goldstein, S. 8. Michael. (1984) Nucleotide sequence of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, a glycoprotein of endoplasmicreticulum. Waíure 308; 613-617.

Choi, D., R. M. Bostock. (1994) lnvolvoment of de novo píotein synthesis, proteinkinase, extracellular Ca2+, and lipoxygenase in arachidonic acid induction of 3-

:%d:om#:t.,Tne::y;go,tuattaoT5o,caoneunmpf%„o€umreLd,:C;a::„g;:,eo¡TáTdT2:S7o.¡r2e4n4o¡dChol, D., R., M. Bostock, S. Avdiushko, DJI Hlldebrand. (1994a) Lipid-derived

si.gnals that discriminate wound- and pathogen- responsive jsoprenoid pathwaysin plants: methyl ja§monate and the fungal elicitor arachidonic acid inducedifforent 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase genes andantimicrobial isoprenoids in So/anm fuóerosm L. Pnoc. Waí/. Acad. Sci.. USA.91 : 2329-2333.

Choi, D., 8. L. Ward, R. M. Bostock. (1992) Differential induction and §uppression of

E#toopj;#aro,#:3-,Tne,:h#iutt:T!sc::cnigrmaeraAchr,ád.:::a::,d:e!Fasn;náe,iEon,s3e3i:1344.

60

Chye M. L., C. T. Tan, N. H. Chua. (1992) Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hewea bras/.//.ens/.s: nmg7 and hmg3 aredifferentially expressed. P/anf Mo/. B/.o/. 19: 473-484.

Chye M. L., A. Kush, C. T. Tan, N. H. Chua. (1991) Characterization of cDNA andgenomic clones encoding 3-hydroxy-3-melhylglutaryl-coenzyme A reductaselrom Hevea brasiliensis. Plant Mol. Biol.16.. 567-5".

Cronin, S. R., A. Khoury, D. K. Ferry, R. Y. Hampton. (2000) F]egulation of HMG-CoAreductase degradation requires the P-Type ATpase Codlp/Spflp. J. Ce// B/.o/.148: 915-924.

Dale S., M. Arró, 8. Becerra, N. G. Morrice, A. Boronat, D. G. Hardle, A. Ferrer.(1995) Bacterial expression of the catalitic domain of 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA reductase (isoform HMGF]1 ) from Arab/.dops/.s Íha//.ana, and its activation byphosphorylation at Ser577 by Brassí.ca o/eracea 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoAreductase kinase. Eur. J. B/.ochem. 233: 506-513.

Daraselia N. D.,-S. Tarchevskaya, S. J. 0. Narlta. (1996) The promoter of tomato 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene 2 has unusual regulatoryelements that direct high-level expression. P/aní Phys/.o/. 112: 727-733.

Deconti R.C. y W.A. Crea§ey. (1975) Clinical aspects fo the dimeric Caíharanlhusalkaloids, en: The Oaínaraníhus a/ka/o/.ds (Taylor W.l. and N.F`. Famsworth,eds.) Marcel Dekker, lnc. New York. pp. 2237-278.

Denbow C.J., S. Lang, C. L, Cramer. (1996) The N-terminal domain of tomato 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases. J. B/.o/. Chem. 271 : 9710-9715.

Dicosmo F., M. Mlsawa. (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives formetabolite production, B/.oíeohno/. Adv. 13: 425-453.

DICosmo F., G.H.N. Towers. (1984) Stress and secondary metabolism in culturedplEm\ cells, en.. Flecent Advances in Phytochemistry, Phytochemical adaptationsÍo síress. (Timmerman B.N., Steelink C„ Loewus F.A. eds.) Plenum Píess, NewYork. pp. 97-175.

Disch A., A. Hemmeílin, T.J. Bach, M. Rohmer. (1998) Mevalonate-derivedisopentenyl diphosphate is the biosyntthetic precur§or of ubiquinone prenyl sidechain in tobacco BY-2 cells. B/.ocnem. J. 331 : 615-621.

Domenech C. E., W. Giordano, J. Avalos, E. Cerdá-Olmedo. (1996) Separatecompartments for the production of sterols, caíotenoids and gibberellins inGibberella Íuiikuroi. Eur. J. Biochem. 239.. 720-72:5.

Dórnenburg H., D. Knorr. (1995) Strategies for the improvement of secondarymetabolite production in plant cell cultures. Enz. Mi.crob. Tecnno/. 17: 674-684.

Douglas P., E. Pigaglio, A. Ferrer, N G. Halfords, C. Mackintosh. (1997) Threespinach leaf nitrate reductase-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase kinasesthat are regulated by reversíble phosphorylation and/or Ca2+ ions. B/.ochem. J.325: 101 -109 .

Eisenreich W., 8. Menhard, P. J. Hylands, M.H. Zenk, A. Bacher. (1996) Studies onthe biosynthesis of taxol: The taxane carbon skeleton is not of mevalonoid origin.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93.. 643`-6436.

61

Engfelt, W.H., J.E..Shackelford, N. Aboushadi, N. Jessani, K. Masuda, V.G. Paton,G-A. Keller, S.K. Krlsans. (1997) Characterization of UT2 cells, the induction ofperoxisomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase. J. 8/.o/. Cnem.272: 24579-24587.

Enjuto M., V. Lumbreras, C. lvlarín, A. Boronat. (1995) Expression of the Arabidopsis"G2 gene, encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, isrestricted to meristematic and floral tissues. P/aní Ce// 7: 517-527.

Enjuto M., L. Balcells, N. Campos, C. Caelles, M. Arro, A. Boronat. (1994)Arab/.dops/.s lha//.ana contains two diffentially expressed 3-hidroxy-3methylglutaryl-CoA reductase genes, which encode microsomal forms of theenzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91.. 927-931.

Flores H.E., T. Ayora, M. Méndez, V.M. Loyola-Vargas. (1989) Obtención demetabolitos secundarios a partir de raíces transformadas. O.eno/.a y Oesarro//o15: 87-94.

Flores H.E., J.M. Vivanco, V.M. Loyola-Vargas. (1999) "Radicle" biochemistry: Thebiology of root specific metabolism. 7Tends P/anf Sc/'. 4: 220-228.

Friesen J. A., C. M . Lawrence, C. V. Slauffacher, V. W. Rodwell. (1996) Structuraldeterminants of nucleotide coenzyme specificity in the distinctive dinucleotidebinding fold HMG-CoA reductase from PseL/domonas meva/on/./.. B/.ochem/.sÍv35: 11945-11950.

Frimpong K. y V. W. Rodwell. (1994) Catalysis by Syrian hamster 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase. J. B/.o/. Chem. 26: 11478-11483.

Gantet P., N. lmbault, M. Thiersault, P. Doireau. (1998) Necessity of a functionaloctadecanoic pathway for indole alkaloid synthesis by Cafna/aníhus roseussuspensions cultured in an auxin-starved medium. P/aní Oe// Phys/.o/. 39: 220-225.

Gardner R., S. Cronin, 8. Leder, J. Rine, R. Hampton. (1998) Sequencedeterminants for regulated degradation of yeast 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Mo/. B/o/. Ce//.9: 2611 -2626.

Gardner, R. G., R. Y. Hampton. (1999a) A highly conserved signal controísdegradation oÍ 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase ineukaryotes. J. B/.o/. Cftem. 274: 31671 -31678.

Gardner, R. G„ R. Y. Hampton. (1999b) A `distributed degron' allows regulated entryinto the EF} degradation pathway. Embo J. 18: 5994-6004.

Gray J. C. (1987) Control of isoprenoid bioshyntesis in higher plants, en: Advances /.nBoíaní.ca/ f?esearch. Vol.14 (Callow J.A., ed.) Academic Press, London, pp. 25-91.

Ger§henzon J., R. Croteau. (1990) Regulation of monoterpene biosynthesis in higherplams, er\.. Biochemistry of the mevalonic acid pathway to terpenoids, Chap\ei 3,rowers G.H.N. and H.A. Stafford, eds.) Plenum Press, New York, pp. 99-160.

62

Godoy-Hernández G. (1997) Modificaciones del gen de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa y su influencia en la biosíntesis deisoprenoides en tabaco. Tesis de Doctorado, CINVESTAV-lrapuato.

Goldstein J.L., M. S. Brown. (1990) Regulation of the mevalonate pathway. ~aíure343: 425-430.

Goldstein J.L., M. S. Brown. (1997) The SF]EBP pathway: F`egulation of cholesterolmetabolism by proteolisis of a membrane-bound tíanscription factor. Ce// 89:331-340.

Guijarro C., L.M. Blanco-Colio, M. Ortego, C. Alonso, A. Ortiz, J.J. Plaza, C. Díaz,G. Hernández, J. Egido. (1998) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme Areductase and isoprenylation inhibitors induce apoptosis of vascular smoothmuscle cells in culture. Ci+c. f]es. 83: 490-500.

Hagedom S., 8. Kaphammer. (1994) Microbial biocatalysis in the generation of flavorand fragance chemicals. AnnL/. f]ev. MÍ.c/obi'o/. 48: 773-800.

Halford, N. G., D. G. Hardie. (1998) SNF1-related protein kinases: global regulators ofcarbon metabolism in plants? P/aní Mo/. B/.o/. 37: 735-748.

Hamill J. D., R. J. Robins, M. J. C. F]hodes. (1987) Alkaloid production by transformedroo\ cul\ures ol Cinchona ledgeriana. Planta Med. 55.. 354-357 .

Hampton R., D. Dimster-Denk, J. Rine. (1996) The biology of HMG-CoA reductase:the pros of contra-regulation, rrends B/.ocnem. Sc/.. 21 : 140-145.

Heintze A., J. Gorlach, C. Leuchner, P. Hope, P. Hagelsteln, D. Schulze-Sieberl, G.Schultz. (1990) Plastidic isoprenoid synthesis during cloroplast development.Change from metabolic autonomy to a division of labor stage. P/aní Pnys/.o/. 93:1121 -1127.

Herts R. J., A. Scháfer, M. Hesse, T. W. Baumann, A. Slusarenko. (1996) Signallingmolecules and the synthesis of alkaloids in Caíftaranmus noseL/s seedlings.Phytochemistíy 42.. 417 -422 .

Huang L. C., P. Wu, J. H. David. (1997) Cell density-dependent proliferation o( themurine bone marrow-derived stromal cell lines. É}i.olechno/. Leíí. 19: 89-92.

Huber S.C., J. L. Huber, F], W. Jr. MCMichael. (1994) Control of plant enzyme activityby reversible protein phosphorylation. /ní/. f?ev. Cyfo/. 149: 89-91.

Imbault N., M. Thiersault, P. Dupéron, A. Benabdelmouna, P. Doii.eau. (1996)Pravastatin: A tool for investigating the availability of mevalonate metabolites forprimaíy and secondary metabolism in Caíharanínus roseus cell suspensions.Physiol. Planta. 98.. 803-809.

lnstituto Nacional lndigenista. (1994) Atlas de las plantas de la medicina tradicionalmexicana Vol 111. Varios autores. lnst. Nac. lndigenista. México, D.F. p.1383.

lstvan, E. S, M. Palnitkar, S. K. Buchanan, J. Deisenhofer. (2000) Crystal structure ofthe catalytic portion of human HMG-CoA reductase: insights into regulation ofactivity and catalysis. Embo J. 19: 819-830.

lvessa N. E., D. Gravotta, C. De Lemos-Chiarandini, G. Kreibich. (1997) Functionalprotein prenylation is required for the brefeldin A-dependent retrograde transport

63

from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum. J. BÍ.o/. Chem. 272:20828-20834.

Jain, A. K., R. M. Vincent, C. L. Nessler. (2000) Molecular characterization oÍ ahydroxymethylglutaryl-CoA reductase gene from mulberry (Moms a/ba L) P/anfMol. Biol. 42.. 559-589.

Jelesko, J. G., S. M. Jenkins, M. Rodríguez-Concepción, W. Grulssem. (1999)Flegulation of tomato HMGl during cell proliferation and growth. P/anía 208: 310-318.

Ji W., C. F]. Benedict, M. A. Foster. (1993) Seasonal variations in rubber biosynthesis,3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase, and rubber transferaseactivities in Parmen/.um argeníaíum in the Chihuahuan Desert. P/aní Pnys/.o/.103: 535-542.

Keller, G-A., Ivl.C. Barton, D.J. Shapiro, S.J. Singer. (1985) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase is present in peroxisomes in normal ratVNer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82.. 770-774.

Klm K. K., H. Yamashita, Y. Sawa, H. Shibata. (1996) A high activity of 3-hydroxy-3-methylglutaíyl coenzime A reductase in chloroplasts of Sfev/.a rebaud/.anaBer\orii. Biosci. Biotech. Biochem. 60.. 685-686.

Kisakürek M.V., M. Hess. (1980) Chemotaxonomic studies of Apocinaceae,Loganiceae, and Rubiceae with reference for indole alkaloids, en: /r)do/e andB/.ogenefi.ca//y f?e/aíed A/ka/oÍ.ds. (Phillipson J.D. and M.H. Zenk, eds.) AcademicPress, London. pp.11-26.

Kondo K., K. Oba. (1986) Purification and characterization of 3-hydroxy- 3-methylglutaryl CoA reductase from potato tubers. J. B/.ocnem. 100: 967-974.

Korth K. L., 8. A. Stermer, M. K. Bhattacharyya, R. A. Dixon. (1997) HMG-CoAreductase gene families that differentially accumulate transcripts .in potato tubersare developmentally expressed in floral tissues. P/aní Mo/. B/.o/. 33: 545-551.

Kutchan T. M., A. Bock, H. Dittrich. (1994) Heterologous express.ion of the plantproteins strictosidine synthase and berberine bridge enzyme in insect cell culture.Phytochemistry 35.. 3E.B-380 .

Kush A. (1994) lsoprenoid boisynthesis: the Hevea tactory!. P/aní Ph/.syo/. B/.ochem.32: 761-767.

Kuzuyama T., S. Takahashi, M. Takagi, H. Seto. (2000a) Characterization of 1 -Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomeras,e, an enzyme involved in isopentenyldiphosphate biosynthesis, and identification of its catalytic amino acid residues.J. B/.o/. Chem. 275: 19928-19932.

Kuzuyama T., M. Takagi, S. Takahashi, H. Seto. (2000b) Cloning and chai.acterizationof 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, from Sírepíomyces sp. strainCL190, wich uses both the mevalonate and nonmevalonate pathways forisopentenyl diphosphate biosynthesis. J. Bacíerí.o/. 275: 19928-19932.

Lange, B.M., M.R. Wildung, D. Mccaskill, R. Croteau. (1998) A family oftransketolases that directs isoprenoid biosynthesis via a mevalonate-independentpathway. Pnoc. Naí/. Acad. Sc/.. USA. 95:2100-2104.

64

Lawrenpcs:u8¿mMo.;a¥.mwe.vapo°„:.,ri'kG?óoVÁ::a:gtaacs:erat(í3%5)Á:gvs:::Lst::::|::io::

Sc/.ence 268: 1758-1762.

Learned F]. M., E. L. Connolly. (1997) Light modulates the spatial patterns of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene e.xpression in Arab/.dops/.sthaliana. Plant J. 11.. 499-511.

Liscum L., J. Finer-Moore, R. M. Stroud, K. L. Luskey, M. S. Brown, J. L.Goldstein. (1985) Domain structure of 3-hydroxy-3-methylgluatryl coenzyme Areductase a glycoprotein of the endoplasmic retlculum J. BÍ.o/. Chem. 260: 522-530.

Lichtenthaler H. K., J. Scwender, A. Disch, M. Romher. (1997a) Biosynthesis ofjsoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via a mevalonate-independentpathway. FEBS Leííers 400: 271 -274.

Lichtenthaler H. K., M. Romher, J. Scwender. (1997b) Two independent biochemicalpathways for isopentenyl diphosphate and isoprenoid biosynthesis in higherplants. Physi.o/. P/aní. 101 : 643-652.

Lichtenthaler H. K., M. Romher, J. Scwender, A. Disch, M. Seemann. (1997c) Anovel independent pathways tor the biosynthesis of carotenoids, phytol andprenyl chain of plastoquinone-9 in green algae and higher plants, Pny§/.o/ogy,Bic¢hemistry and Molecular Biology of Plant Lipids. (W`ill.iams, J.P., M.U. Khan,N.W. Lem, eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. pp.177-179.

Llchtenthaler H. K. (1999) The 1 -deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of isoprenoidbyos.ir\\hes.is .in plan\s. Annu. F?ev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 50.. 47-65;

Lois, L.M., N. Campos, S.R. Putra, K. Danielsen, M. Rohmer, A. Boronat. (1998)Cloning and characterization of a gene from Escherí.cní.a co/i. encoding atransketolase-like enzyme that catalyzes the synthesis of D-1-deoxyxylulose 5-phosphate, a common precursor for isoprenoid, thiamine, and pyridoxalbiosynthesis. Proc. ~aí/. Acad. Sc/'. USA. 95: 2105-2110.

Loguercio, L, L., H. C. Scott, N. L. Trolinder, T. A. Wilkins. (1999) Hmg-coAreductase gene family in cotton (Gossyp/.um h/.muíum L.): Unique structuralfeatures and differential expression of hmg2 potentially associated with synthesisof specific isoprenoids in developing embryos. P/aní Oe// Ph}/s/.o/. 40: 750-761.

López D., C. M. Chambers, G. C. Ness. (1997) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA reductase inhibitors unmask cryptic regulatory mechanisms. A/ch. B/.ochem.B/'ophys. 343: 118-122.

Lowe C.F]. (1979) Purlfication and resolution of proteins, en: An introduction to AffinityChromeilogrixphy, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,(T.S. Work and F].H. Burdon, Gral. eds.) Elsevier/North-Holland BiomedicalPress. N.Y. pp. 428-465.

Lowe K.C., M.R. Davey, J.B. Power. (1996) Plant tissue culture: past, present andtu\ure. Plant Tiss Cult. Biotech. 2..175-186.

Loyola-Vargas V.M., M.L. Miranda-Ham. (1990) Aspects about the secondarymetabolites from plant tissue culture, en: Producíí.on of Secondary Meíabo//.Íes

65

frp.p Plant_Ti_ssue Cultures and its Biotechnological Perspectives. (L.oyolaw eiigEwsV.M., ed) CICY, Mérida Yucatán, pp. 31-79.

Loyola-Vargas V.M., M. Mendez-Zel, M. Monforte-González, M.L. Miranda-Ham.(1992) Serpentine accumiilation during greening in normal and tumor tissues ofCatharanthus roseus. J. Plant Physiol.140(2).. 213-217.

Loyola-Vargas V.M., M.L. MIíanda-Ham. (1995) Fioot culture as a source of secondarymehbolnes ol econorr\lc lmpor\ance, en: Phytochemistry of Medicinal Plants(Arnason J.T., Mata, R., Romeo, J.T. eds.) Plenum Press, New York. pp. 217-248.

l.uckner M. _(1990) G_er\era\ AspecS, Secondary Metabolism in Microorganisms, Plants,and An/.ma/s. Spírnger-Verlag, Leiptzig. pp.16-21.

Luijendijk T. J. C., L. H. Stevens, R. Verpoorte. (1998) Purification andcharacterization of stríctosidine B-D-glucosidase from Caíharaníhus roseus cellsuspension cülture§. f#aní Phys/.o/. B/.ochem. 36: 419-425.

Maldonado-Mendoza 1. E„ F]. M. Vincent, C. L. Nessler. (1997) Molecularcharacterization of three differentially expressed members of the Campíoíhecaacum/.naía 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase (HMGF}) gene family. P/aníMol. Biol. 34.. 781]90.

Maldonado-Mendoza 1. E., Ft.J. Burnett, C, L. Nessler. (1992) Nucleotide sequence ofa cDNA encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A rediictase ÍromCatharanthus ioseus. Plant Physiol.100-.1613-1614.

Mccaskill D., R. Croteau. (1995) Monterpene and sesquiterpene biosyntliesis inglandular trichomes of peppermint (Menma p/Pen.Ía) rely exclusively on plastid -deríved isopentenyl dipriosphate. P/anía 197: 49-56.

Mccaskin D., Ft. Croteau. (1998) Some caveats for bioengineering terpenoidmetabolism in plants. rrends Bi.oíecAno/. 16: 349-355.

MCGarvey D.J., R. Croteau. (1995) Terpenoíds metaboli§m. P/aní Ce// 7: 1015-1026.

Mendleta R. M., S. del Amo. (1984) Plantas medicinales del Estado de Yucatán.lNmEB-Continental, México, 428 págs.

Monfar M., C. Caelles, L. Balcell§, A. Ferrer, F.G. Hegardt, A. Boronat. (1990)Molecular cloning and charactei.ization of plant 3-hydroxy-3-methylglutaryl

epenzymp A red_uc_`_aíse. En: Biochemistry of the Mevalonic Acid Pathway tor6peno/.ds. (GHN Towers and H.A. Stafford, eds.) Plenum Press, N.Y. pp. 83-97.

MonforLe-González M., T. Ayora-Talavera, 1. E. Maldonado-Mendoza, V. M. Loyola-' Vargas. (1992) Quantitative analysis of serpentine and ajmalicine in plant tissues

of Oaíharaníhus roset/s and hyoseamine and scopolamine in root tissues ofDaíura síramon/.um by thin layer chromatography-densitometry. Ph)4ocnem.Ana/. 3: 117-121.

Moreno P.Ft.H, Ft. Van der Heijden, F]. Verpoorte. (1995) Cell and tissue cultures ofOaíharanmus roseus: A literature §urvey, 11. Updating from 1988 to 1993. P/aníCell Tiss Org. Cult. 42..1-25.

66

Narita J.0., W. Gruissem. (1989) Tomato hydroxymetHglutaryl-CoA is required early infruit development bLit not during ripening. P/aní Oe// 1 : 181 -190.

Nef C., 8. Ri'o, H. Chrestin. (1991) lnduction of catharanthine synthesis and stimulationot major indole alkaloids production by Caíharaníhus roseus cells under nongrowth altering treatment with Pym/.um vexans extracts. P/aní Ce// f}ep.10: 26-29.

Nelson A. J., P. W. Doerner, Q. Zhu , C. J. Lamb. (1994) lsolation of a monocot 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene that is elicitor-inducible.Plant Mol. Biol. 25.. 401-412.

Nohturfft A., M. S. Brown, J. L. Goldstein. (1998) Topology of SF]EBP cleavage-activating protein, a polytopi.c membrane protein wíth a sterol-sensing domain. J.B/.o/. Ohem. 273: 17243-17250.

Oba K., K. Kondo. (1986) Purification and characterizatjon of 3-hydroxy-3-methylglutaíyl-coenzyme A reductase from potato tubers. L/. B/`ochem.100: 967-974.

Parks L.W. y W.M. Casey. (1995) Physiological implications of sterol biosynthesis inyeast. Annu. F?ev. Microbiol. 49.. 49-116.

Parry R.J. (ig75) The biosynthesié ot Caínaraníhus aikaioids, en: The CaíharanínusA/ka/o/.ds (Taylor W.l. and N.F`. Farnsworth, eds.) Marcel Dekker, lnc. New York.pp.141-192.

Peffley D. M., A. K. Gayen. (1997) lnhibition of squalene synthase but not squalenecyclase prevents mevalonate-mediated suppression of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzime A reductase synthesis at a posttranscriptional level.Arch. Biochem. Biophys. 337.. 251-260.`

Peña-Di'az J., A. Montalvetti, A. Camacho, C. Gallego, L.M. Fluiz-P, D. Gonzalez-P.(1997) A soluble 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in the protozoanTrypanosoma cruzi. Biochem. J. 324.. 619-626.

Polakowski T., U. Stahl, C. Lang. (1998) Overexpression of a cytosolichydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to sqiialene accumulation jn yeast.Appl, Microbjol. Biotechnol. 49.. 66]1.

F]eddy A. F]., V.S.R. Das. (1986) Partial purificatjon and characterization of 3-hydroxy-3-methylgutaryl coenzyme A reductase from the leaves of guayule (PaMen/.L/mArgentatum). Phytochemistry 25.. 2471-24]4.

Rijhwani S. K., J. V. Shanks. (1998) Effect of elicitor dosage and exposure time onbiosynthesis of indole alkaloids by Oaíharaníus roseus hairy roots cultures.Biotechnol. Progress. `4.. 442-449.

Robins R. J., J. Payne, M. J. C. Rhodes. (1986) Cell suspension cultures of C/.richona/ec/ger/.ana 1. Growth and quinoline alkaloid production. P/anía Mec/. 3: 220-226.

Roitelman J., E. H. 0lender, S. Barnun, W. A. Dunn, R. D. Simoni. (1992)lmmunological evidence for eight spans in the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase: lmplications for enzyme degradation in theendoplasmic reticulum. J. Ce//. B/.o/. 117: 959-973.

67

F]omero-Castillo P. (1984) Biosíntesis y farmacología de los alcaloides deOaíharaníus /oseus derivados del indol. Tesis. UNAM, México.

Russell D. W. (1985) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases from pea seedlings.Metriods Enzymol.110.. 26-40.

Sasson A. (1992) Production of useful biochemicals by higher plant cell cultures:Biotechnological and economic aspects, en: B/.oíecnno/ogy Econom/.c and Soo/.a/4specís, /ssues Íor Deve/op/.ng Oounín.es (Da Silva E.J., C. F]atledge, A. Sas§on,eds.) UNESCO-Cambridge University Press. Cambridge. pp. 81-109.

Savary 8. J., D. K. Dougall. (1990) Scopolamine radio immunoassay for tissuecultures of Daíura. Phyfocnemi.síry 29: 1567-1569.

Schwender J., M. Seemann, H.K. Lichtenthaler, M. Romher. (1996) Biosynthesis ofisoprenoids (carotenoids, sterols, prenyl side-chains of chlorophylls andplastoquinone) via Í a novel pyruvate/glyceraldehyde 3-phosphate non-mevalonate pathway in the green alga Scenedesmus ob//.quus. B/.ocnem. J. 316:73-80.

Schwender J., H. K. Llchtenthaler, A. Disch, M. Romher. (1997) Biosynthesis ofsterols in green algae (Scenedesmus ch/ore//a) according to a novel mevalonate-•independén` paihweiy, Physioiogy, Biochemistry and Moiecuiar Bioiog_y of Piant

L/.p/.ds (Wimams, J. P., M. U. Khan, N. W. Lem, eds.) Kluwer Academic.Dordrecht. pp. 180-182.

SIpat A.` 8. (1982) Hydroxymethylglutaryl CoA reductase (NADPH) in the latex in Heveabrasiliensis. Phytochemistry 21.. 2613-2618.

Scopes R. K. (1994) Dye ligand chromatography, en: Pnoíe/.n Pun./Í.caí/.on, Pr/.nc/.p/esand Prací/.ce, 3rd edition, Springer-Verlag. New York. pp. 210-225.

shanks j.v., R. Bhadrá, j. Morgan, S. R¡jhwan¡, S. Van¡. ttgg8, Quant¡f¡cat¡on ofmetabolites in the indole alkaloid pathways of Caínaraníhus roseus: lmplicationsfor metabolic engineering. B/.ofechno/. B/.oeng. 58: 333-338.

Soll J., Waegemann. (1993) The protein import machinerie(s) of the outer chloroplastenvelope membrane, Abstract No. 5.4.3-2, XV /níemaí/.ona/ Boíany Oongress,Yokohama Japan, August 28-september 3 '93, Abstract vol. p 132, .

Stinson S.C. (1998) Counting on chiral drugs. Chem. Eng. News 76: 83-104.

Stearn W.T. (1975) A synopsis of the genus Catharanthus (Apocynaceae) en: 77"Camaraníhus A/ka/oÍ.ds (Taylor W.l. y N.F`. Farnsworth, eds.) Marcel Dekker,New York. pp. 9-44.

Sugden, Ch., P. G. Donaghy, N. G. Halford, D. G. Harcl]e. (1999) Two SNF1-relatedprotein kinases from spinach leaf phosphorylate and inactive 3-hydroxy-3-methylglutaíyl-Coenzyme A reductase, nitrate reductase, and sucÍose phosphatesynthase in vitro. P/aní Ph)6iol.120: 257-274.

Svoboda G.H., D.A. Blake. (1975) The phytochemistry and pharmacology ofCatharanthus roseus (L.) G. Dor`, en.. The Catharanthus Alkaloids TErylor W .1. yN.F`. Farnsworth, eds.) Marcel Dekker. New York, pp. 45-84.

68

Takagi, lvl, T. Kuzuyama, S. Takahashi, H. Seto. (2000) A gene cluster for themevalonate pathway from Sírepíomyce§ sp. Straih CL190, J. Bacíe»'o/. 182:4153-4157.

Takahashl S., T. I(uzuyama, H. Watanabe, H. Seto. (1998) A 1-deoxy-D-xyllulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the foímation of 2-c-methyl-d-erythritol4-phosphate in an altemative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95.. 9879-9884.

Teus J., C. Lui|endjjk, L.H. Stevens, R. Verpoorte. (1998) Purification andcharacterisation of strictosidine B-D-glucosidase from Oaíharaníhus rosei/s cellsuspensions cultures. P/aní Phys/.o/. B/.ochem. 36: 419425.

Tittiger, C., G. J. Blomquist, P. lvarsson, C. E. Borgeson, S. J. Seybold. (1999)Juvenile hormone regulation of HMG-F` gene expression in the barl( beetle lpsparaconfusus (Coleopteía: Scolytidae): implication (or male aggregationpheromone biosynthesis. Cell. Mol. Life Sci. 55: 121-127.

Tormanen C. D., W. L. Redd, M. V. Srikantaiah, T. J. Scallen. (1976) Purification of3-hydíoxy-3-methylglularyl coenzyme A reductase. B/.ochem. Bh/.ophys. f?es.Oommun. 68: 754-762.

Turner J. E., C. G. Minkoff , K. H. Manln, Fl. Misra, K.1. Swenson. (1995) Oocyteactivation and passage through the metaphase/anaphase transition of themeiotic cell cycle is blocked in clams by inhibitors of HMG-CoA Íeductaseactivity. J. Ce// B/.o/. 128: 1145-1162.

Vagelo§ P.R. (1991 ) Are prescription drug prices high?. Sc/.ence 252: 1080-1084.

Vallet S. M., H. 8. Sanchez, J. M. Rosenfeld, T. F. Osborne. (1996) A direct role forsterol regulatory element binding protein in activation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene. J. 8/.o/. Chem. 271 : 12247-12253.

Van der Heijden R., V. de Boer-Hluipá, R. Verpoorte, J. A. Duine. (1994) Enzymesinvolved in the metabolism of 3-hydroxy-3methylglutaryl-coenzyme A reductase•ir\ Catharantnus roseus. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 38.. 345-349.

Van der Heijden R., R. Verpoor[e. (1995) Metabolic enzymes of 3-hydroxy-3melhvlglu\aryl-coenz:yme A .in Cathaíanthus roseus. Plant Cell Tiss. Org. Cult.43: 85-88.

Van Tegelen L. J. P., P. R. H. Moreno, A. F. Croes, R. Verpoorte, G.J. Wullems.(1999) Purjfication and cDNA cloning ot isochorismate synthase from elicited cellculiures ol Catharantnus roseus. Plant Physiol.119.. 705-712.

Vázquez-Floia F., 0. Moreno-Valenzuela, M.L. Miranda-Ham, J. Coello-Coello, V.M.Loyola-Vargas. (1994) Catharanthine and ajmalicine synthesis in Caít}aranlhusrioseus hairy root cultures medium optimization and elicitation. P/aní Oe// r/.ss.om. cult. 38.. 273-279.

Verpoorte R., R. Van der Heijden, J. Schrlspsema. (1993) Plant cell biotechnology forthe production of alkaloids: present statLis and prospects. J. ~aí. Prod. 56: 186-2!fJí' .

Verpoorle R., R. Van der Heijden, P.R.H. Moreno. (1997) The alkaloids, Vol. 49(Cordell G.A„ ed.) Academic Press, San Diego. pp. 221-299.

69

Verpoorle R., R. Van der Heijden, H.J.G. ten Hoopen, J. Memelik. (1998) Metabolicengineering for the improvment of plant secondary plant metabolite production.Plant Tiss. Cult. Biotech. 4.. 3-20.

Vógeli U., J. Chappell. (1988) Induction of sesquiterpene cycla§e and suppression ofsqualene synthetase activities in plant cell cultures treated wjth fungal elicitorP/aní Physí`o/. 88: 1291 -1296.

Vóllack K. U., 8. Dittrich, A. Ferrer, A. Boronat, T. J. Bach. (1994) Two radishgenes for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase isozymes complementmevalonate auxotrophy in a yeast mutant and yield membrane-bound activeenzyme. J. Plant Physiol.143.. 4]9-48] .

Weissenborn D.L., C.J. Denbow, M. Laine, S.S. Lang, Z.Yang, X. Yu, C.L. Cramer.(1995) HMG-CoA reductase and terpenoid phytoalexins: Molecular specializationwithin a complex pathway. Pnysí.o/. P/aní. 93: 393-400.

Wltitsuwannakul R., D. Wititsuwannakul P. Suwanmanee. (1990) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase from the latex of Hevea bras/.//.ens/.s,Phyfochemí.síry 29: 1401 -1403.

Yamamoto A., S. ltoh, K. Hoshi, K. lchihara. (1995) lnhibition of cholesterol synthesisGx v/.vo and /.n v/.vo by fluvastatin, a new inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase. Expen.ení/.a 51 : 223-226.

Yoshikawa T., T. Furuya. (1987) Saponin production by cultures of Panax g/.nseng withAgrobacterium rhizogenes. Plant Cell F}ep. 6.. 449-458.

Zeidler J. G., H. K. Lichlenlhaler, H. U. May, F. W. Lichtenthaler. (1997) lsisopropene emitted by plants synthesized via the novel isopentenylpyrophosphate pathway?. Z. Waíu#o/scn. 52 C: 15-23.

70

Cap,'tulo 2

2 Materiales y métodos

2.1 IVIATEF`lAL BIOLÓGICO

El material biológico utilizado fueron raíces de C. noseus obtenidas mediantetransformación con Agrobac{e/Í.um r/.zhogenes. Las raíces se mantuvíeron en medio 85

(Gamborg eí a/.,1968) a la mitad de su fuerza iónica y con vitaminas (Ác. nicotínico,Piridoxina y Tiamina) 3°/o de sacarosa, a pH 5.7 y esterilizado en autoclave`durante un

período de 15 minutos a 1 kg/cm2. El inóculo inicial fue de 0.5 g de rai'ces de 14 díasde, edad en 100 mL de medio de cultivo comenidos en matraces de 250 rriL ymantenido bajo condiciones de oscuridad, a 100 rpm de agitación y a 25°C.

2.2 PREPARACIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTIC0 MICROSOMAL

La metodología empleada se basó en la de Bach ef a/., (1986), modificada por Galaz-Avalos (1996). En general, la mayoría de los pasos para obtener el extracto enzimáticomicrosomal se llevaron a cabo a 4°C. Un gramo de raíces transformadas de C. roseusse congeló con nitrógeno líquido, se maceró en un mortero y se homogeneizó en un

::tTaocgc:ónne'á::,oern::8án|'CooJLo'it:óÉ)Dir,a2:eo2m#'a:t::ccaor:s2a,m5Lmd;3:##2:d5ormd;de DTT, 5 /g/mL de leupeptina, 1 mM`de PMSF (10 4L inhibidoí/mL de solucíónamortigiiadora) y amortiguador de fosfatos 100 mM, pH 7.5. El homogeneizado se filtróen gasa y se centriíugó a 1000 x g durante 10 minutos. La pastilla resultante de lacentrifugación anterior se deshechó y el sobrenadante se centrifugó a 100,000 x gdurame 45 minutos, el sobrenadante resultante de ésta centrifugación se deshechó y ala pastilla microsomal se le agregaron 200 /L de amortiguador de extracción con 50mM de DTT. Posteriormente la muestra se congeló a -20°C, para favorecer la rupturade la membrana y así facilitar la posterior solubilización de las proteínas\membranales,cuando la muestra fuera descongelada.

2.3 IVIETODOLOGÍA DEL ENSAYO ENzllvIÁTICO

El ensayo de la actividad utilizado en este trabajo se realizó siguiendo la metodologíade Chappell eí a/., (1995) que inicia con la adición de 5 /L del extracto enzimáticomicrosomal (11-18 /g de proteína microsomal) a 17 4L de la mezcla de reacción quecontiene 5 vL de DIT 5 mM, 5 /L de Í3-NADPH 3 mM, 5 /L de amortiguador defosfatos 100 mM a pH 7.5, más 2 /L de 14C-HMG-CoA por volumen de ensayo (0.334mol/mL, 59.9 mcvmmol). Finalmente, se afora a un volumen final de 26 AL con aguadesionizada. Se incuba a 30°C durante 5 minutos, parando la reacción con la adjciónde 5 /L de Hcl 6N y para lactonizar el producto formado, se le agregan 5 4L demevalonato lactona a concentración de 1.0 mg/mL y posteriormente la mezcla anteriorse incuba por un peri'odo de 15 minutos a 18-20°C. Luego, para sepai.ar el producto, seadicionan 125 AL de solución amortiguadora de fosfato de potasio saturado y 300 /L deacetato de etilo a cada tubo de ensayo, se homogeneiza durante 3 minutos en un

71

vórtex y se centrifuga durante 2 minutos a 14,000 rpm para separar las fases yprecipitar la píoteína. Se toman 150 /L de la fase superior correspondiente al acetatode etilo y se transfiere a un vial de centelleo, se le adicionan 5 mL de li'quido decenlelleo EcoLume (lcN) y se realiza el conteo del producto marcado radiactivamenteen cuentas por minuto (cpm) en un espectrofotómetFo de centelleo (Beckman LS3801 )durante un tiempo de 5 minutos.

2.4 DETEF"lNACIÓN DE LAS PFtoTEl'NAS

El monitoreo de la protei'na total durante el proceso de purificación se realizó porespectrofotometría a 280 nm.

La determinación de la protei'na soluble se hizo mediante el método de Peterson(1977). Se realizó una curva patrón con albúmina sérica bovina (Fracción V, Sigma) (10a 100 /g). El ptocedimieRto que se siguió, tanto para la cuwa de calibración como parael ensayo de las muestras de extracto enzimático de raíces transformadas de C.roseus, fue el siguiente:

1. Se prepara una solución acuosa de albúmina sérica bovina (fracción lv) a unaconcentración de 1 mg mL-'.

2. Para elaborar cada punto de la curva, se toman de 100 a 1000 /L de lasolución anterior y se afora a 1 mL con agua destilada.

3. Para el caso del extracto enzimático, se toma el 10 % de la cantidad que seusó para la solución amortiguadora de extracción y se afora a 1 mL con aguadestilada; para preparar el blanco se utiliza agua destilada y se realiza lamisma operación que para el extracto enzimático.

4. Adicionaro.1 mL de sDs al o.i5°/o.

5. Agitar y dejar reposar l0 minutos a temperatura ambiente.

6. Agregar 0.1 mL de ácido tricloracético al 72°/o (PW) frío.

7. lncubaí 15 minutos en bañode hielo.

8. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante l5 minutos.

9. Desechar el sobrenadante y resuspender el precjpitado en 1 mL de aguadestilada.

10. Añadir 1 mL del i.eactivo A recién preparado y dejar reposaí 10 minutos atemperatura ambiente.

11. Adicionar 0.5 mL del Íeactivo de Folin (reactivo 8).

12. Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

13. Leer a absorbencia ®n un espectrofotómetro a 750 nm.

72

Preparacíón de los reactivos A y 8.

Fleactivo A. Mezclar volúmenes iguales de:

1. Cobre-tartrato-carbonato (CTC). A una solución de Na2C03 al 10% (p/v) seañade CuS04 hasta una concentración de 0.1 °/o (p/v) y KNac4H406. 4H20hasta O.2°/o (p/v).

2. SDS al 10%.

3. NaoHO.8N.

4. Agua destilada.

Fleactivo 8:

1. Fleactivo de Folin-Gocalteau (1927) (1 :6),

La curva de calibración se obtuvo graficando el logaritmo de la concentración dealbúmina (10-100 /g) contra el logaritmo de la absorbencia a 750 nm.

2.5 PROTOCOLO PARA LA PURIFICACIÓN DE LA HMGR

2.5.1 Solubilizsc¡ón de la enzima

El método empleado se basó en el reportado por Bach eí a/., (1986) y que se modificóen el píesente trabajo:

1. Se extrajeron 100 g de raíces transformadas de C. noseus de s días de edaden cultivo. Se obtuvo el extracto enzimático microsomal de acuerdo almétodo de extracción ya mencionado (2.2).

2. La pastilla microsomal obtenida en la centrifugación se resuspendió con dosvolúmenes del amortiguador de solubilización (consistente en fosfatos depotasio 100 mM, pH 7.5, 5 mM de EDTA, 10 mM de DTT, 5 /g/mL deleupeptina y 1 mM de PMSF, los inhibidores se agíegaron a 10 4L/mL desolución amortiguadora), y un volumen de solución al 6°/o de detergente BrijW-1.

3. La mezcla anterioi. se incubó a 35°C durante 30 minutos.

4. Se añadió un volumen de glicerol y se centrifugó a 190,000 x g durante 1 h.

5. La pastilla se resuspendió con amortiguadoí de solubilización y se centrifugónuevamente a 190,000 x g durante 1 h.

6. Los sobrenadantes se juntaron se les midió el volumen total y se tomaronali'cuotas a las cuales se les cuantificó proteínas y actividad de HMGF`.

73

7. El resto de la muestra se filtró mediante un aparato de filtración swinnex-25(Millipore) con membrana de nitrocelulosa tipo HA de 0.45 mm de diámetro yde 45 /m el tamaño del poro (Millipore) y se desgasificó de la siguientemanera: se colocó la muestra en una jeringa de 3 Ó 10 mL, según el volumenfinal de la mue§tra, y se tapó con un pedazo de papel encerado; se hizopresión con el dedo i'ndice sobre la boca de la jeringa en tanto se tiraba delémbolo de la jeringa, para crear el vaci'o necesario para separar la fasegaseosa de la muestra Iíquida, posteriormente §e dejó de hacer presión conel dedo sobre la boca de la jeringa para permitir la salida de la fase gaseosarecién extraída; este procedimiento se realizó hasta extraer toda la fasegaseosa posible.

2.5.2 Procedimiento croma.ográfico.

1. Para cada caso se determinó con anterioridad la conductMdad delamortiguador a usar, que debe ser de 9.3 ms, así como el de la muestra aaplicar, que debe ser de 3.2 ms, para evitar que por la diferencia deconductividade§ no existiera una adecuada interacción entíe la proteína y lamatriz de la resina sefarosa azul Fast Flow (Pharmacia).

2. La muestra (sobrenádante de igo,ooo x g) fiitrada y degasificada, como seexplica en la sección 2.5.1, se aplicó a una columna de afinidad del tiposefarosa azul de 19 mL de volumen vacío,12.5 cm de largo y 1.5 cm dediámetro, montada y conectada a un FPLC (sistema semiautomatizado parala Cromatograf ía Líquida Flápida de Protei'nas) y previamente equilibrada con57 mL de solución amortiguadora de afinidad consistente en 50 mM defosfatos de potasio, 5 mM de EDTA, 0.1°/o de Brij W1, 10 mM de DTT, 0.5mM de PMSF, ajustado a pH 7.5. La velocidad de flujo fue de 0,7 mLJmin.,recolectándose fracciones de 3 mL A la columna se le aplicó soluciónamortiguadora de afinidad hasta que el detector de UV re.gistró i!na líneabase e'n el graficador, posteriormente la proteína unida a la matriz de laresina fue elui'da con un cambio instantáneo de concentración de Kcl de 0.0a 1.0 M. A las fraccione§ obtenidas, se les cuantificó la actividad de HMGF]por el método descrito en la sección 2.3 y se les cuantificó la concentraciónde proteínas.

2.6 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Se realizó electroforesis de una dimensión en gel di§continuo de poliacrilamida, bajocondiciones d®snaturalizantes con medidas de 14X14 cm, a una intensidad do corrientede 50-60 mA durante 3-4 horas a 4°C, como §e establece en el método de Laemmli(1970). Con el fin de observar como cambia el periil de bandas correspondiente a lasprotei'nas a lo largo del proceso de extracción, de solubilización y de cromatografía enla columna de sefarosa azul, las muestras se aplicaron de acuerdo con el orden

74

siguiente: marcadores de peso molecular; extracto crudo después de centrifugar a 1000x g; sobrenadante después de centrifugar a 190,oo0 x g;. carriles quo contienen lasfracciones que presentaron actividad para la HMGR.

Cuadro 12. Preparación del gel discontinuo de poliacrilamida

Gel de separación

Acrilamida: bisacrilamida 3o:o.8°/o 10mL

Agua` destilada 10.7 mL

1.5 M Tíis-Hcl pH 8.8 7.5 mL

SDS 10% 0.3 mL

1 % persulfato de amoni.o 1.5 mL

TEMED 30 L'L

Gel de concentración 4°/o

Acrilamida: bisacrilamida 30:0.8% 1.3 mL

0.5 M Tris-Hcl pH 6.8 2.5 mL

SDS 10% 1 00 wL

Agua destilada 5.64 mL

1 % persulfato de amonio 0.5 mL

TEMED 10HL

2.7 REVELADO CON PLATA PARA PROTEI'NAS CON GELES

La detección de las bandas de proteínas en el gel se llevó a cabo mediante el empleode la metodología modificada de Wray eí a/., (1981 ) y que se describe a continuación:

1. Una vez terminada el desari.ollo de la electroforesis, el gel se colocó en uncontenedor de plástico y se agregó solución de metanol al 50°/o hasta que elgel quedó cubierto, el recipiente se puso en un orbitador horizontal y cadahora se cambió la solución metanólica hasta completar 3 rioras.

2. Posteriormente el gel se lavó con agua desiónizada, durante 15 minutos ohasta hidratai.lo.

3. El gel se lncubó durante 30 minutos con solución de plata amoniacal en laobscuridad. Preparac/.Ón de /a sa/ de p/aía (preferentemente en la oscuridad):disolver 0.1 g de nitrato de plata en 1 mL de agua desionizada. Preparar por

75

separado, 0.38 mL de hidíóxido de amonio (grado areactívo) más 0.48 mL dehidróxido de sodio 1.0 M, y añadir agua desionizada hasta 5 mL. Añadir lasolucíón de nitrato de plata poco a poco, agitando homogéneamente (paraevitar que la plata precipite). Completar con agua desionizada r`asta 25 ml

4. El gel se lavó tres vece§ con agua desionizada, un minuto en cada ocasión.

5. El gel se reveló, por inmersión, con la siguiente mezcla: 50 mL de aguadesionizada, 25 /L de formaldehído,12 /L de ácido cítrico 1 M (conservadoen congelación). El gel se mantuvo en inmersión hasta que el fondo delmismo comenzó a oscurecer.

6. La reacción se detuvo con la adición de una solución al 7°/o de ácido acéticoal momento que comenzaron a aparecer las bandas en el gel.

7. Al momento en el qiie el fondo del gel comenzó a adquirir una tonalidadamarillenta, se cambió la solución de ácido acético por una solución fijadorade metanol al 50°/o.

8. Hecho lo anterior, el gel se puede mantener en la solución metanólica al 50°/opor tiempo indefinido a 4QC o para su mejor conservación se puededeshidratar por medio de vaci'o.

2.8 PROTOCOLO DE ACOPLAMIENTO DEL HMG-COA A LA RESINA DEAFINIDAD MEDIANTE LA CARBODllMIDA.

Este protocolo se basó en lo reportado en el folleto técnico de Pharmacia sobrecromatografía de afinidad (1983).

1. La suspensión comeícial (Sigma) de la resina hexil-sefarosa se homogenizóperiectamente y luego se tomaron 0.5 mL (2 mL de suspensión contienenaproximadamente 1 mL de la resina).

2. La resina se lavó con agua destilada, con el objeto de eliminar el Nacl.

3. Se prepararon 2 mL de una solución acuosa de HMG-CoA a unaconcentración de 2 /moles.

4. Se añadió 1 mL de la solución de HMG-CoA al volumen de resinaanteriormente preparado (0.5 mL) y se ajustó el pH entre 4.5 y 6.0, conNaoH I M.

5. La solución anterior se mezcló suavemente y a temperatura ambiente y seañadieron 28.7 Ag de la carbodiimida en polvo.

6. El valor del pH se mantuvo entíe 4.5 y 6 durante 1 hora con NaoH I M.Después de este período de tiempo ya no hubo cambios en el pH.

7. La solución se dejó reposar durante 24 horas con el fin de que la reacciónonti.e la HMG-CoA y la resina se lleve a cabo.

76

8. La resina se lavó con agua destilada y esterilizada por filtración tíavés de unamembíana de nitrocelulosa con poi.o de 0.45 /m, y se la agregó soluciónamortiguadora de afinidad, consistente en 50 mM de fostatos de potasio, 5mM de EDTA,10 mM de DTT, 0.1°/o de deteígente brij W1, ajustado a pH de7.5, con el objeto de equilibrarla y dejarla preparada para emplearla másadelante, posteriormente la resina se almacenó a 4QC, hasta el momento deSu uSO.

9. El funcjonamiento de la resina se probó mediante la aplicación de extractoenzimático obtenido como se explica en la sección 2.2. Se dei.Ó interaccionarla resina con el extracto por un período de 40 minutos. La píoteína que seunió a la resina se eluyó empleando 10 mL de solución amortiguadora deelución consistente en 50 mM de fosfatos de potasio, 1 mM de EDTA, 10 mMde DTT, 1 M de Kcl. 3 mM de NADPH+H+.

2.9 ESTABILIDAD DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA HMGF] A DIFEFtENTESNIVELES DE TEMPEF]ATUF]A DURANTE SU ALMACENAMIENTO POR 30 DÍAS

Para saber si la actividad enzimática de la HMGF} permanecía estable o se perdíadurante un período de almacenamiento prolongado se realizó el diseño experimental yque se muestra en la figura 20.

77

= Alícuota

Figura 19. Diagrama de flujo del diseño experimental

78

2.10 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bach T.J., D. H., Rogers, H., F]udney. (1986) Detergent-solubilization, purification, andcharacterization of membrane-bound 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme Areductase from radish seedlings. Eur. J. B/.ocnem.154: 103-111.

Chappell J., F., Wolf, J., Proulx, R., CuelLar, C., Sanders. (1995) Is the reactioincatalyzed by 3-hidroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase a rate limitingstep for isoprenoiid biosynthesis in plants?. P/aní Physí.o/.109: 1-7.

Folin 0., Ciocalteau V. (1927) Tyrosine and tryptophan determination in proteins. J.Biol. Chem. 73.. 62]-650.

Galáz-Áva]os F`.M. (1996) Estudios sobre la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril CoAreductasa eri raíces transformadas de _Camaranínus roseus. Tesis de Maestría,lnstituto Tecnológico de Mérida.

Gamborg O.L. (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean rootcells. Exp. Ce// f?es. 50: 151 -158.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4. Naíu/e. 227: 680-685.

Peterson G. L. (1977) A simplification of the protein assay method of Lowry et al wichis more generally applicable. Ana/. BÍ.ochem. 83: 346-356.

Pharmacia Flne Chemicals (1983) Affinity chromatography, principles and methods.Pharmacia Fine Chemicals AB, box 175 S-75104 Uppsala 1 Sweden, pp.18-24.

Wray, W., T., Boulikas, V.P., Wray, Ft., Hancock. (1981) Silver staining of proteins inpolyacrylamide gels. Ana/. B/.ocnem. 118: 197-203.

79

Capítulo 3

3 Resultados y discusión

3.1 CUANTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SOLUBLES TOTALES

Con el fin de cuantificar las proteínas durante los procesos que se llevaron a cabo serealizó una curva esiándar. Dado qiie el ditiotreitol y el EDTA se encuentran píesentesen las soluciones amorliguadoras de extracción y resuspensión de la pastillamicrosomal, se decidió utilizar el método de Peterson (1977), el cual a diferencia deotros métodos de cuantificación no presenta el inconveniente de sufrií interferenciasdebido a los compuestos antes mencionados.

En la gráfica de la figura 20 se aprecia una curva estándar de albúmina para ladeterminación de proteínas.

08 1.0 1.2 1.4 1,6 1.8 2.0

Log do q de proteínas

Figur8 20. Curva estándar de albúmina §érica bcMna, elaborada mediante el método de Peterson(1977).

3.2 VALIDACIÓN DEL MÉTOD0 PARA LA CUANTIFICAclóN DE ACTIVIDADENZIMÁTICA DE LA HMGR

Para validar el método de cuantificación de la actividad de HMGR, se buscó lalinealidad en la formación de mevalonato respecto al tiempo de la reacción enzimática,asi' como la respuesta lineal de la velocidad respecto al volumen (cantidad de proteína)del extracto enzimático empleado. Se emplearon dos blancos, uno sin extracto y otrosin NADPH en la mezcla de reacción.

Cuando se examinó la linearidad de la reacción en función de la cantidad de proteína(volumen de extracto empleado), la formación de mevalonato fue lineal hasta los 9 /L

81

de extracto enzimático (32.4 4g de proteína) (Figura 21A). Con respecto al tiempo de lareacción enzimática la formación de mevalonato fue lineal hasta los i5 minutos de lareacción a una concentración de 32.4 /g de protei'na (Figura 218).

De manera que los parámetros que se eligieron fueron 10 minutos de reacciónenzimática, con 9 /L (32.4 /g de proteína) del extracto enzimático.

0 7 14 21 28 35

/g de proteína

01 3 5 7 10 1315

Tiempo (minutas)

Flgura 21. Validación del método para medir la actMdad enzimática de la HMGF} de raícestranslormadas de 0. roseus d® 8 di.as cle cultivo. A) En función de la concentracjón de pro`eína delextracto enzimático microsomal y a un tiempo de reacción de 5 minutos. 8) En fiinción del tiempo de lareacción enzimática y a una concentración de proteínas del extracto de 32.4 /g .

3.3 ESTUDlos DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTABILIDADDE LA ACTIVIDAD DE LA HMGR

Durante el proceso de purificación de una enzima membranal existe un problemaconstante, lo cual tiene que ver con la extracción de la enzima de su medio ambientecelular, este hecho la somete a una variedad de condiciones y procesos queposteriormente pueden causar la pérdida de su actMdad catali'tica o la alteración de suestructura. Algunas de esas situaciones son: la dilución, exposición a proteasas, aloxígeno, a metales pesados, así como cambios en las condiciones físicas, como porejemplo el congelamiento y descongelamiento, por ello deben tomarse todas lasprecauciones necesarias para evitar que la actividad catalítica de la enzima sufra undeterioro considerable (Deustcher, 1990).

Dado el carácter membranal de la HMGF` y a lo expuesto anteriormente fue necesariodeterminar a que temperatura y durante cuánto tiempo podri'a §er estable la actividadde la enzima HMGR, por 1o que se planeó un primer experimento, con el doblepropósito de conocer el grado de pérdida de la actividad de la enzima a la temperaturade trabajo usual (4°C) y a la temperatura de almacenamiento comúnmente utilizadacuando se trabaja con enzimas membranales (-80°C).

El experimento se diseñó como se muestra en la figura 19 de la sección 2.9 del capi'tulo2 y el proceso de extracción se llevó a cabo como se describe en la sección 2.2 del

82

mismo capítulo. A parlir de 5 gramos de raíces transformadas de C. ros6us seobtuvieron 800 /L de extracto microsomal, el cual se dividió en alícuotas de 60 4L(O.217w de proteína) para facilitar la toma de muestras on los días preestablecidos,todas las alicuotas se almacenaron a las temperaturas preestablecidas. La medición dela actividad enzimática por el método de Chappew ei a/. (1 995) f ue el parámetro con elque se registró la estabilidad de la HMGF` durante los 30 días.

Los resultados obtenidos (Figura 22) muestran, la evidente pérdida de aciividadenzimática de la HMGR, desde las primeras horas del experimento en el caso deltratamiento a 4°C; sin embargo, en el caso del tratamienü a -80ac se registró uncomportamiento que es interesante: la ac{Mdad aumentó durante los primeros 2 díasde almacenamienio. Este hecho podri'a atribuir§e a la posible existencia de un inhibidorde tipo protei'nico (proteasa) de esta enzima que se descomponga al congelarse .1material,puesadiferenciadeloqueocurrecuandosecongelaalatemperaluradelN2li'quido, a -8o°C el congelamienio no es instantáneo lo cual provoca el aumento do laconcentración de`sales y protei'nas en la solución, que a su vez da lugar a un cambiodráslico del pH, esto podría ser la causa de que la actividad de las proteasas se anule.Esto no es inusual, ya que existen numerosas proteínas que so sabe pierden suactividad cuando son congeladas (Ostrove,1990b; Scopes,1994a).

2 4 6 8 1012141618 20 22 24 26 28 30

Tiempo (días)

Flgura 22. Determinación de la estabmdad do la aotividad de la HMGR almaoenada a 4 y .80.C,utilizando 5 g de raícos translormadas de 0. roseus.

Para conocer con más exactitud el grado de pérdida de la actMdad enzimática do laHMGR a 4°C, se realizó un segundo experimento en el que se disminuyó el rangoanteriormente usado de días al de horas. A partm de 4 grarnos de raíces transtormadasde C. roseus §e obtuvieron sOO pL de extracto microsomal, el cual se dividió enalícuotas de 200 AL (0.723 Ag de proteína) para facilitar la toma de muestras almomento de medh la actividad de HMGR, todas las alicuotas se almacenaron a 4°C(Figura 29). Los resultados obtenidos mue§ti.an que la actividad enzimática disminuyó

83

en un 22% a las primera§ 24 horas y para las siguientes 24 hora§ ya sólo quedaba el1.5 °/o de la actividad i.nicial. Esta Íápida pérdjda de la actividad es un inconvenientemuy importante para reali.zar cualquier proceso de puri.ficació" aunque es algo usualque en un proceso de purificación la acti.vidad inicial disminuya hasta en un 50%, Iaspérdidas más allá de este valor ya resultan contraproducentes (Deu§tcher, 1990).

171.66

0 24 36 48 72

"empo (rio ras)

Flgura23.Efeotodeialmacenamiem)a4°CsobrelaactividadenzimáticadelaHMGR,utilizando4gderaíces lranstormadas de C. roseus. Cada punto corresponde a tres repeticiones.

Hasta ese momento se había estLidiado la estabilidad de la actMdad de HMGR sinllegar hasta el proceso de solubilización. Se decidió entonces avanzar hasta eseproceso con el fin de determinar si, después de solubilizar a la HMGR de su sitiomembranal, su actividad catalítica se manteni'a estable a 4°C y por cuanlo tiempo, dadoque la solubilización es el paso previo al proceso cíomatográfico, al cual se debe llegarcon la mayor cantidad de actívidad enzimática posible.

En la figura 24 se observa una disminución en la pérdida de la actividad de la HMGF}del 22% en las primeras 24 horas y de 23°/o a las 36 horas, Io cual puede deberse alefecto benéfico de la presencia del glicerol y/o a que el proceso de solubilizacióneliminó algún o algunos inhibidores o proteasas todavi'a pre§entes. Con esto§resultados queda claro que se disponen de alrededor de 3648 horas para realizar elproceso completo de la purificación de la HMGFl sin tener una pórdida con§iderable dela actividad enzimática, Io cual es similar a 1o empleado por Bach para la purificaciónde la HMGF] de plántulas de f?aphanus saí/.ws (comunicación personal).

84

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (horas)

Flgura 24. Solubilización de la HMGFl de raíces `ransformadas de C. rosóus con el fin d® estabilizarlapor períodos más largos.

En otros trabajos también se ha estudiado la estabilidad de la HMGF}, tanto puía comosemipura o incluso en el extracto microsomal, bajo difeíentes condiciones dealmacenamiento, y los resultados obtenidos al respecto han sido variados, por ejemplose ha visto que la HMGF] purificada de parénquima hepático de rata es sensible al frío(Brown ef a/.,1973) o al calor (Kennelly eí a/„ 1983); no obstante, Beg y Breweí, (1981 )hallaron que la enzima pura almacenada con 50°/o de glicerol a -70°C, fue e§tabledurante un período de entre 3 y 6 meses. Por su parte Sipat, (1982) encontró que laobtención del extracto enzimático a partir del látex de Hevea brasí.//.ens/.s, realizada atemperatura ambiente, provocó una disminución en la actividad de la HMGF} de hastael 94°/o, respecto al mismo proceso, pero realizado enteramente a O-4°C. Asimismoencontró que la HMGF` de una fracción ultracentrifugada del látex de Hevea óras/.//.ens/.sse mantuvo estable después de 5 horas de estar en hielo, esto a pesar de que no seagregó ningún elemento protector como DTT, glutatión o B-mercaptoetanol. Cuandoesa fracción fue almacenada a -15°C, la actividad enzimática de la HMGFl disminuyóen un 30% las primeras 24 horas y llegó al 50°/o después de una semana; no ob§tantela actividad residual se mantuvo a un nivel todavía laborable, aunque Hepper y Audley,(1969) indicaron que en sus preparaciones obtenidas también de látex de Heveabras/.//.ensí.s, la HMGF` fue lábil aún cuando se almacenó a -10°C y que esta pérdida dela actividad se corrige con el empleo de glutatión y cisteína.

En tanto que F`ussell, (1985) menciona que la mejor manera de almacenar unapreparación microsomal obtenida de plántulas de P/.sum sari.wm, es a -20°C agregandopreviamente 25 mM de DTT y 50°/o de gl.icerol; este último previene el congelamiento ypermite realizar muestreos posteriores del nivel de actividad enzimát.ica de la HMGFl,sin descongelamiento, mientras que la concentración de DTT mantiene estable laactividad, por lo menos durante una hora a 30°C.

85

Bach eí a/., (1986,1990) sostjenen que la actividad injcial de la HMGR de plántulas defiaphanw safi.ws es estabilizada cuando se almacena a 0°C, y que también es miiyestable a temperatura ambiento (25°C).

En resumen la estabilidad de la actividad enzimática de la HMGFl es dependiente de lapresencia de compiiestos tioles reducidos y de una concentración adecuada de gliceroly depende de la fuente de donde es obtenida.

3A VAF]IACIÓN DE LA ACTIV]DAD A LO LARGO DEL PF]OCESO DEEX"ACCIÓN/SOLUBILIZAC[ÓN.

La estabilidad de la HMGR durante el proceso de extracción y solubilización es muyimportante, pues e§ necesario llegar hasta el proceso cromatográfico con la mayorcantidad de actividad enzmática posible con el fin de obtener buenos rendimientos. Porconsiguiente, es indispen§able conocer cómo se modifica la actividad de la HMeFR a lolargo del proceso de extracción/solubilización, con el objeto de determinar con quéactividad total de la enzima se inicia el proceso cromatográfico de purifícación. Paraello, se realizaron mediciones a lo largo de todo el proceso de extracción, liasta elmomento de obtener el extracto soluble que se empleará en el proceso cromalográfico(Figura 25).

Cada proco§o de extracción y medición de la actividad de HMGR se llevó a cabo comose describe en el capítulo 2. Las etapas del proceso de extracción/solubilizaciónanaljzadas fueron:

• La pastílla microsomal obtenida después de centrifugar a 100,000 x g y

posteriormente resuspendjda,

• La resuspensión anterior después de aplicar detergente brij Wi al 6°/o p/v,

• La resuspensión después de incubarla (25°C x 30 min.) y agregarle 20°/o de glicerol.

• El sobrenadante posterior a la centrifugación a l45,000 x g.

86

0.00

_st SS§g* SffS `SEúpa

Figura 25. Variación de la actividad de la HMGF` de raíces transtormadas de C. Jos6us a lo largo delproceso de extracción/solubilización.

Para comprobar la efectividad del proceso de solubilización, en un experimentoposterior se determinó la actividad de HMGR tanto en el sobrenadante como en lapastilla de la última centrifugación (145,000 x g) con el tin de verificar qué cantidad deactividad enzimática de la HMGF} se lograba recuperar en el sobrenadante después derealizada la solubilización, dado que el sobrenadante se utiliza para el procesocromatográfico (Figura 26).

Figura 26. F`ecuperación de la actividad de HMGR de raíces transformadas de C. roseus en elsobrenadante después de centrifugar a 145,000 x g.

87

Los resultados obtenidos (Figs. 25 y 26) indicaron, que si bien por un lado, la actividadtotal de la HMGF` presentó una disminución que puede considerarse normal entre unaetapa y otra, por el otro, iina parte importante de la actividad de la HMGF¡ (53°/o)permaneció en la pastilla y no §e solubilizó, a diferencia de lo repor(ado por Bach eí a/.,(1986; 1990) en f?aphanus saí/'ws y Wititsuwannakul eí a/., (1990) en Heveabras/.//.ens/.s, quienes obtuvieron más del 90% de recuperación de la actividad total deHMGF] después de solubilizaí.

Por lo tanto el siguiente paso fue mejorar el proceso de extracción/solubilización de laHMGR de rai`ces transformadas de 0. roseus, con el objeto de llegar al procesocromatográfico con la mayor parte de la actívidad enzimática inicial.

3.5 ESTANDARJZACION DE UN PROCEDIMIENT0 PAF]A LA SOLUBILIZACIÓNDE LA ENZIMA HMGR

Debido a que la HMGF` es una enzima membranal, su purificación ha sido muycomplicada (especialmente en las plantas). Hasta el momento se han utilizadodiferentes metodologías para lograr extraerla de la membrana sin afectar la actividadcatali'tica; entre ellas, se encuentran el congelamiento-descongelamiemo, el uso cledetergentes, las Íncubaciones dentro del rango de los 30 a los 37°C, el uso dehomogenizadores del tipo Potter-Elvejhem, la aplicación de tripsina y por supuesto, Iascombinaciones de uno o más de los métodos enlistados (Tomanen eí a/., 1976; Beg yBrewer,1981; Bach eí a/.,1986; Kondo y Oba,1986; Bacli eí a/.,1990; Dale eí a/.,1995).

Se evaluaron los siguientes parámetros, tomando como base el protocolo diseñado porBach eí a/., (1986) para la purificación de la HMGR de plántulas de f]aphanus saí/.vus:

• Uso de un sonicador a diferentes tiempos.

• Uso de un homogenizador de teflón, tipo Potter-Eveljhem, a diferentes tiempos.

• Uso de díferentes temperaturas de incubación.

• F]esuspensión de la pastilla de 190,000 x g y su posterior centrifugación al mismovalor de 9.

• Uso de diferentes concentracíones del detergente no iónico Brij W1.

3.5.1 Uso del sonlcador

La sonicación es un herramienta empleada en la solubilización de proteínasmembranales (Mae§hima,1992; Savolainen,1992; Odaíra y Maeshima,1994; Vey eía/„ 1996), como es el caso de la HMGF}.

El experimento consistió en la obtención de un exti.acto microsomal de acuerdo con elprotocolo empleado por Bach eí a/„ (1986). Cada pastilla se sometió al proceso desolubilización de la siguiente manera, se obtuvo el extracto enzimático microsomal

88

como se explica en la secc.ión 2.2, a continuación se le agregó un volumen de soluciónal 6% p/v de detergente Brij W-1; posteriormente las pastillas se sometieron aditerentes tiempos de sonicación al 10% de la potencia de salida del aparato (30", 60",90", 3', 5' a 25°C y 3' a 4°C), después se añadió un volumen de glicerol y se centrifugó(190,000 x g,1 hora), enseguida se midió la actividad enzimática de la HMGF` de cadasobrenadante y pastilla de la última centrifugación con el fin de verificar si la mayorparte de la actividad se encontraba en el sobrenadante y con ello comprobar laefectividad del proceso de solubilización.

En la figura 27 se observan las seis alícuotas de extracto enzimático que se sometierona los diferentes tiempos de son.icaclón. Los ti.atamientos 1 y s corresponden a lostestigos, el 1 al primer testigo, el cual es la actividad específica .inicial proveniente de la

pastilla de 100,000 x g, y el 8, al segundo testigo que consiste en el proceso desolubilización utilizado (incubación con solución al 6°/o p/v de detergente brii Wl a 25°Cdurante 30 m.inutos). Posteriormente se realizaron las mediciones correspondientes a laact.iv.idad enzimática de la HMGFl, en cada sobrenadante y pastilla posteriores a lacentíifugación a 190,000 x g, con 9 vL de extracto microsomal y 10 minutos dereacción. De acuerdo con los resultados obtenidos de este experimento y mostrados enla gráf.ica de la figura 27, se puede concluir que la sonicación no es un métodoadecuado dada la poca recuperación de act.ividad enzimát.ica de HMGR en elsobrenadante, en cualquiera de los tratamientos aplicados.

E2ZZZ] Sobrenadante

D Past,lla

1 -Testigo 12 . 30 seg. scmicack)n3-60seg- -4.-90 seg. .5 - 3 min saiicack5n6-5mln. "7-3mn .8.-Tesügo 2

(40C)

012345678

Tratamientos

Figiira 27. Recuperación de la actividad de HMGR de raíces transformadas de C. roseL6 en elsobrenadante después de aplicar dilerenie§ (iempos de sonicación duran`e el proceso de solubilización

89

3.5.2 USo de un homogenelzador de teflón mecanizado

Esta es una de las herramientas más empleadas para efectuar la solubjlizaci.Ón deenzimas que se encuentran integíadas a la membrana, dado que es un método suave ya que la punta del pistilo está recubierta de teflón cuyas propiedades antiadherentes lohacen ideal para trabajar con membranas lipídicas. El único inconveniente quepresenta es la formación de espuma, Io cual podri'a inaciivar a la enzima de interés.Además se exploró el efecto de la congelación de la pastilla de 100,000 x g, antes desometerla a la solubilización, dado que este cambio físico se utilizó en otros protocolosde extracción de HMGF` (Bach eí a/. ,1986,1990; Wi.titsuwannal(ul eí a/. ,1990).

El experimento consistió en la obtención de un extracto microsomal de acuerdo con elprotocolo empleado por Bach ef a/., (1986) para la purificación de la HMGR deplántulas de f?ap^a"s saí/.vus. La pastilla resultante de la centrifugación a 100,000 x gse resuspendió en dos volúmenes del amortiguador de solubilización (ver composiciónen la sección 2.5.1), y un volumen de solución al 6% p/v de detergente brij W-1; lasolución anterior se djvidió en cinco alícuotas, tres testigos: Testigo 1, pastílla de100,000 x'g sin congelar previo a la resuspensión; testigo 2, pastilla congelada previo ala resuspensión; testigo 3, pastilla de 100,000 x g, congelada previo a la resuspensión+ bríj W1 6°/o + incubación 35°C x 30'. Y dos tratamientos que se sometieron a 2.5 y 5minutos de homogenización, paía luego incubar a 35°C durante 30 minutos, de§puésse añadió un volumen de glicerol y se centrifugó a 190,000 x g durante una hora,enseguida se midió la actividad enzimática de la HMGR de cada sobrenadante ypastilla de la última centrifugación con el fin de verificar la efectividad del procesosolubilizador (Figura 28).

012345

Tratamjentos

Flgui'a 28. Recuperación de la actividad de HMGR de Íaíce§ transtormadas de C. rosem en elsobronadante después de solubilizar con un homogenizador de teflón a diferentes tí®mpos.

Los resultados obtenidos de usar el homogenizador de teflón para solubilizar laactividad enzimática de la HMGF` de raíces transformadas de 0. roseus, fueron

90

iifá::'t::mao,ow:t?tt:unJdaon::k:;r:::r,:b,al,8Soc,o:t,TZT::nphoorme!eg::,`zoaáaonrtodeBiecfTÓ:',:p'ó

i¡ozoe.rgnyáJa:d::?v,::d:Í3s;,:ir,:#ao::t::;Í;:o:,uh:e:áz;gsá:#b#a:::á?el::n3'3a:%i::e:mp,::rea:cáó:l:ddáeítotal inicial.

::,::,tauvuon:?er::;:t,adc:óTuyyabcTi:::,::nd:,teás:,3:,37oPouo,osd:n,áaa?:fvfi,d¥ieni':,ái,gdueraH2MSGS3enelsobrenadanteposterioralacentrifugacióna190,000xg,mientíasqueonlosdostratamiento§nohubocambiosimporlantesenlaproporción,esdecübastósometeralextracto microsomal previamente congelado a una incubación de 35°C duranb 30minutos con la solución al 6°/o p/v del detergente no iónico brij W-1 para obtener unresultado de esta i'ndole. Anteriormente, Bach eí a/., (1986) demostraron que laactMdad relativa de la HMGR de f]apnanus saM aunientó casi hasta 200°/o, enpresenciadelmenc.ionadodetergenteaunaconcentraciónfinalde2.67%.

3.5.3Usodedlferentes.emperaturasdelncubación

:xapdeo,,i,.:3;,apz?,oardeát,:zramd,:a,lae:eemx3:::Tuer:todeaT;:rJ3ra::óenccáora3c:a?'áeseobrteuaJ::fauelmeior rendimienb de recuperación de la enzima HMGR en el sobrenadane de190,000x 9.

:,aáior,::,:f:reet:,:paedr:mpeo,t3,agfme,rao,.:i,3gt6u,VoL:np:s#actr:sT,#ieoTea',::eancturi?:?:c:::

:ot#os:c:óxnge:e,áesseucscF::d2:5etn,,dyo:nv:,á,T:::sddee::,Tc:3Lg:fgogor:,evsdo:udb:í,:ragc:#etvb:,:W-1; de la solución anterior se hicieron alicuotas y se sometieron a diferente§t:e;í¡;:¡ó:ukr:::::j:Fe::;¡o:::ebc¡¡;:ó:ííj§é;c;e;n;tr3:f:;,§:a;{#yg,ío5§;;xca:::n;%2:r;e:t;;¡Te¡;f¡;or;;:j::r§;;,§ff:¡

efectividad del proceso solubilizador.

Losresultadosdeesteexperimentosepresentanenlagráficadelafigura29.Como§e

::id::ópa,p:r::a:;:a:sJ,:.,a:;¡;::;iuet.:;!,::eac!uFi;:ia::2siAu,:,'fe:n::t;en:::a:sun:d:,,;:::ieuaspy::ra;c:ó:n:ádt::i;probadas (Figura 298).

91

20 25 30 35 40 45

Temperatura (°c)20 25 30 35 40 45

Tem peratu ra (oC)

Figura 29. Etetio de la temperalura de incubación sobre la reouperación de las protei'nas (A) y de laactividad de HMGFi de rai'ces tíansformadas de 0. Joseus en el §obrenadan{e (8), a diferente§ tiempo§predoterminados durante 30 minutos.

Los resultados obtenjdos en este experimento son semejantes a los de otros protocolosde solubilización de la HMGR; por ejemplo, en el caso de dos protocolos distinlos parala solubilización de la HMGF} de hepatocitos de rata se aplicó la incubación a 37°C, contiempos de 30 minutos y 1 hora; en ambos casos (ue posible recuperar el 100% de laactividad enzimática microsomal, una vez concluido el proceso (Edwards eí a/„ 1979;Beg y Brewer,1981). En el caso de la HMGF¡ de células vegetales, tambíén se haempleado exitosamente este recurso; aunque, de manera un poco djferente. Tanto enSo/anum fuberiosum (Kondo y Oba, 1986), como en fiaphanus saf/.vus y Zea mays(Bach eí a/., 1986, 1990), así como en Hevea Ófias/.//.ens/.s (Witilsuwannakul eí a/.,1990). se aplicaron incubaciones a 37, 35 y 30°C y a tiempos de 15, 20, 25 y 30minutos, lodo ello dependíendo de la etapa del protocolo de solubilización empleado.lndependientemente de las condiciones estudiadas en cada protocolo, la efectividadfue alta, dado que el porcentaje de recuperación de la actividad enzimática membranalen el sobrenadante fue mayor al 90°/o en todos los casos una vez concluido el procesode solubilización.

En este estudio la efectividad de la recuperación fue del 50%, dado que la mitad de laactividad de HMGR se recuperó en el sobrenadante de 190,000 x g, por lo tanto pararecuperar la actMdad enzimática restante de la pasti.lla de 190,000 x g, se decjdiórecentrífugar al mismo valor y resuspender la pastilla anterior de 190,000 x g.

3.5.4 Resuspensión y recen.rifugación de la pastllla de 190,000 x g

Para realizar el experimento primero se obtuvo un extracto microsomal basado en elprotocolo empleado por Bach eí a/„ (1986) al que se le incluyeron lo§ parámetrosdeterminados en este trabajo. La obtención del extracto enzimático microsomal y suposterior solubilización se explican con detalle en las secciones 2.3 y 2.5.1.

92

Para medú la actividad enzimática de la HMGF`, asi' como, la concontración de las

!;o?tt::í;:iÉi:eí::n:a:;;e:::d:iasáoebcEe:::ia:f;:ssúgn:e,:e:nndí:csap::,:,l,í:gahcá3?ae§r='ugpoe,roaodooxgn„En la gráfica de la figura 30 se muestra que la combinación de los diferentes

paa;ástTv::r:3::tz::,?t:£o;:c:o3:t::íadbeat:ffMmGOÉodseaí#Cceusair:Snsp,:r#d::,á:i"á,CjósnGfse,

3:::g3,ae::,¿eá:Speenn:lóann,y.r:f:,:r:f#rcá:rófed:a,ap3S;:üfd:gd`eg#oGORxegni'an:;á¢l:Xdel sobrenadante, dado que la actividad enzimática microsomal total recuperada, m

:inT:aar,eas,:evpeognea,::ese:notcr::nt,r.abai,::r:eentpai:ifáceacá:tTviddeaáaeTZMfái,caa?:#::aáua:nq`::en este trabajo fue del "/o (Edwards ef a/.,1979; Beg y Brew 198ti Bach eí at1986: Kondo y Oba,1986; Bach eí a/.,1990; Wititsuwannakul eí a/.,1990).

Fraccione§

;:g¡u::r,i,oÍ:3.:;eá.:,3::,:aá::cní:,:1,,i#Vf:pdgTf,í;:i::,:.:'::,í,',;:,í,,:s:9toa:,!::t,o:p:a::::nt:,:rant::::Si,;rá:i:::n'::(pl90k x g) pastilla do 190,000 x g.

93

3.6 CONCENTRACIÓN DEL DETERGENTE Dul]ANTE EL PROCESOCROMATOGRÁFICO

La presencia del detergente brij Wl en las soluciones amor[iguadoras usada§ duranteel proceso de cromatografía, permite que la HMGR permanezca soluble y puedareaccionar con la matriz de la resina de la columna, además tiene la ventaja que nointeriiere con la lectura de la ab§orbencia a 280 nm, que es el valor el que se regi.stró laelución de las proteínas duram8 Ia cromatografía Iíquida; sin embargo, este detergenteprecipita a temperaturas inferiores a 18°C, por lo que se decidió realizar unexpeíimento para determinar a que concentración no se formaba el preci'pitado y usaresa concenlración a fin de evitar que el desempeño de la columna se viera afectadodurante el proceso cromatográfico.

Se preparaíon 7 muestras de solución amortiguadora con diferente concentración deldetergente; cada mue§Ira se conservó a 4°C durante una hora, e§to con el objeto deimitar las condiciones de trabajo a las que se usaría la columna, pasado el tiempoestablecido se evaluó visualmente la formación del precipitado.

Como se observa en los resultados mostrados en el cuadro 13, a partir de laconcentracjón de 0.5% el detergente precipita. Como cabía la posibilidad de quetodo el detergente se hubiera precipitado se decidió dejar las muestras con 0.05 y 0.1A,,r®h+^ ,,-- L,-i_ _Jí_ L__._ '_ _durante una hora más, bajo las mismas condiciones, para luego centrifugarlas a 3,000

_ _,_` _ ---- `.__-``_---" `,.\,+, , \J. , 'lJ

r.p.m. durame 5 minutos. El resultado fue que no hubo precipitado alguno, por lo que elrango de 0.05 a 0.1% es adecuado para emplear en la solución amortiguadora con laque se equilibíará la columna de sefarosa azul.

3.7 ELUCIÓN DE LA HMGR DE UNACOLUMNA DE SEFAROSA AZUL

La columna de sefarosa azul contiene al colorante Cibacron Blue F3G-A, desarrolladopor la compañía sueca Pharmacia Fine Chemicals en los años sesenta (Scopes,1994c). Este colorante tiene la panicularidad de guardar semejanzas con la estructuradel anillo planar y con los grupos cargados negativamente del nicoti'n adeníndinucleótido (NAD+) lo ciial le permite unirse a protei'nas que contienen un sitio deunión para di'nucleótidos ("dínucleotide fold") (Tormanen ef a/„ 1976; Lowe, 1979a;

94

Scopes,1994c). En el caso de la HMGR este sitio es primordial para la unión delNADPH,quedesempeñaelpapeldecoenzimadurantelareaccióncatalítica.

:::?:á;:dparg:e:hm::::;:á:FP;[,£a::Óans,dÉroetg,rna:l:u:dnz:Tráot::t:;rá;:);arona4€Lacromatografíalíquidarápidadeprotei'nas,desarrolladaporlacompañi'aPharmacia,permiti3desarrollarunaampliavariedaddetiposdecromatografía(intercamiónico,cromatoenfoque, permeación en gel, interacción hidrofóbica, fase reversa, afinidad,etc.)demanerabiológicamentecompatible,estosignificaqueunequipoparaFPLCnoutiliza altas presiones en las columnas, ni disolventes orgánicos, y se puede aplicar

3:::o,:ánet:8:dtp::,cT,ua:;t:anteL3ro::::::,rdpeeLm:tneer:ea,úzea:uc::Tf:tromg::[áansy;Íoqu::t:vs,d:3biológica no se vea afectada.

Para la extracción y solubilización de la HMGR se siguieron los protocolos de§critos enla§secciones2.2y2.5.1;elprocesocromatográficoserealizócomoestádescritoenlasección 2.5.2.

El periH de elución obtenido se muestra en la figura 31 Como puede apreciarse seobtiene un pico de actividad que eluyó a lo largo de la aplicación de la soluciónamortiguadoradeelucióncon1MdeKcl,ademáseluyóunsegundopicodeactividadposterioralaaplicacióndelKcl1Mydemenormagnitudqueelprimero.

300

200

100

0o 1o 20 30 40

No. de tracción

::Tuu:ana3á;::;::oS:ad=u?,(uBC,,uóen-sdeepi:r:sM=:Ld-:Br,aí-trans,--deo'-"atravésde"

95

Los aspectos cuantitativos de este proceso se muestran ep el cuadro 14.

Cuadro 14. Proceso de puriíicación de a HMGF] a i)anir de una columna de sefarosa az 1Etapa Vol. To'. Pro,. To'. Acrit+gE,S#i.rt Act. Tot. Veces do

uRendlmiento

(mL) (mg) (pka') Purlf]cación(#) (%)

Extracto solubleinvectado8 35.78 1 .458 52.18 1 100

Columna desefarosaazul(fracción26)0.5 0.132 7.671 1.012 5.261 1.93

El grado de purificación alcanzado en este trabajo, mediante la columna de sefarosaazul, fue de 5.261 veces a parlir del extracto enzimático solubilizado que se inyectó a lacolumna. Este valor contrasta con lo reportado en otros trabajos en los que se puríficó ala HMGF¡ a partir de fuentes vegetales con protocolos que incluyen el uso de unacolumna a base de matrices de colorante azul, como es el caso de Bach ef a/., (1986)quienes lograron 20 veces de purificación a parlir del extracto solubilizado de plántulasde fiapnanus sar/.ws, en tanto que Wititsuwannakul ef a/., (1990) consíguieron 44.5veces de purificación a partir del extracto solubilizado de la resina de HeveaÓ/as/.//.ens/.s; para el caso de la HMGF} purificada, a partir de extractos solubilizadosobtenídos de hepatocitos de rata y de pollo, Beg y Brewer, (1981) alcanzaron 252veces de purificación para el primer caso, mientras que Tormanen ef a/., (1976)consiguieron 16 veces para el segundo caso. Sin embargo, las diferencias pueden serexplicadas con base en el conlenido de protei'na de las muestras empleada§, es decií,que a menor cantidad de protei'na presente la muestra menos veces de purificación seobt®ndi.án.

3.8 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-DODECIL SULFATO DESODIO (PAGE€DS)

Para delerminar el grado de pureza de una protei'na existen diferentes métodos quepueden utilizar§e para detoctar la presencia de impurezas en una muestra(cromatografía, electroforesis, sedimentación). Cada método basa su aplicación enpropiedades fi'§icas diferenles de las proteínas en estudio. La forma más sencilla ycomúnmente usada para determinar la pureza de una protei'na e§ i.ealizar varios pasosde fraccionamiento y posteriormente demostraí.que se detecta la píesencia de un solocomponente, lo cual indica el criterjo para la pureza de una proteína

Posterior a la cromatografi'a líquida en columna, se llevó a cabo una electroíoresis enSDS de las fracciones con mayor actMdad de HMGF} correspondientes al procesomostrado en el cromatograma de la figura 31. Se aplicaron 40 4g de protei`na por carrila un gel de PAGE-SDS. También se analizó, bajo las misma§ condiciones, el patrón deproteínas del extracto crudo y del extracio ya §olubilizado previo a su inyección a lacolumna.

96

Comopuedeapreciarseenlafigura32,IasbandasDyEcorrespondientesalasfracciones

27(D)y28(E)delaelucióndelacolumnadesefarosaazul,seobtuvounimportantegrado

de purificación, ya que sólo se ven unas pocas bandas de proteína. Las bandas más

prominentesselocal.izan,entrelaovoalbúmina(52,000)ylaanhidrasacarbónica(36,800),

las cuales corresponden al peso molecular (50 kDa) de las subunidades de la enzima

previamente reportadas (Bach ef a/., 1986; Kondo y Oba, 1986; Wititsuwannakw ef a/.,

1990., Dale eí a/„ 1995).

Fosft]rilasa 8107,000 --

AU}úmma serica bovina 76,000 -#

Ovoalbúmina52,000 - ,Anhidrasacarl)Ó"ca 36,800 - *

lmbidorde tripsina 27,200 -Lisozima l9,000 -"t

DE

HFú -HMGR

Efg.:::,,a3f;HaF:;ong;:fí::"g:,,i:.3:e::r3,f:rí3)sM:,ecsanda.t:er:'ázea::es.dme:F?r::',i:ríiB!ee:x.t;anc_tg_?lu,g.;

!::;t:e:;';adT;d.:ac:?b::no::i::f:o:p::a:3saa?ee::e:;:n:á:s:v::;sid:e:jíigus:ági-,vá,'hiráíiia:ro'ri:jóooonod,:ntge,a`?!fracción27;(E)carrilcorrespondientealafracción28.

97

3.9 ELABORACIÓN Y PRUEBA DE UNA F]ESINA DE AFINIDAD DEL TIPO HMG-C OA-HEXIL-SEFAROSA

Se decidió elaborar y probar una segunda resina de afinidad, con el fin de establecerlacomo segundo paso de purificación. Para ello, se preparó una resina de afinidad quetiene unido al sustrato de la enzima (HMG-CoA), mediante un enlace peptídico entre elgrupo amino primario del residuo de ADP de la CoA y el grupo carboxilo del brazoespaciadoí de 6 carbonos. Este tipo de resjna permitiría una cromatograf ía másespecífica aún, que aquella que empleó la resina sefarosa azul.

Las pruebas realízadas se basaron tanto en el folleto técnico de Pharmacia sobrecromatografi'a de afinidad (1983), como en las sugerencias de Ostrove (1990a) y Lowe(1979b):

• Obtener una cLirva de calibración con cinco puntos de concentracjón de HMG-CoA

para leerse a 280 nm, con el objeto de determinar la efici.encia del protocolo depegado entre el HMG-CoA y la resina (Figura 33).

• Determinar cual es el tiempo de interacción necesario entre el extracto enzjmático yla resina de afinidad para que la HMGR pueda unirse (Figura 34).

De acuerdo con los resultados obtenidos (Figuras 33 y 34),104 nmoles de HMG-CoAson suficientes para preparar 500 /L de resina de afinidad, y bastan 40 minutos deinteracción entre la resina y el extracto, para que la HMGF] (entre otras enzimaspresentes) reconozca al sustrato y se le una.

Después de estas pruebas, se procedió a realizar un ensayo de elución en lote, paraello, primero se obtuvo un extracto enzimático de HMGR a partír de 20 g de raícestransformadas de C. roseus, mediante el método de extracción y solubilización descritoanteriormente. Se midió la actividad inicial de la HMGF} en el extracto recién obtenido yposteriormente se agregó 1 mL de este extracto a 1 mL de gel de afinidad previamentepreparado. Se colocó en agitación suave a 4°C durante 40 min. luego de los cuales seeluyó la enzima de la resina de afinidad, medíante amoniguador de elución (consistenteen una solución de NADPH 3 mM, Kcl 1 M, DTT 10 mM y PMSF 0.5 mM) se realizaron10 eluciones de 1 mL cada una, posteriormente se tomaron las alicuotascorrespondiente para determinar la actMdad enzimática de la HMGF] y la concentraciónde protei'nas.

98

HMG-CoA tmM|

;;:u::r;:3.3m::d:ee:i:::d::t,:;r:as:i::::a:ba::rosE:8rn:,;;;;ÓeLn,da:,:TurT:::coifr,:pa:drL:eLeial::e:a:iínu::m:É;eeá:i:::::t:n,:

0 4o 80 120

Tiempo (minutos)

Fm 34. Unión de la HMGR de raíce§ transformadas de C. roseüs a la resina de afinidad. EI `iempocerominu`osindicalacantidaddeactividadenzimáticaenelex`racti)antesdeponerseencontacúconla resina de at`in¡dad.

99

El resultado obtenido mostró que toda la actividad se concentró en la primera fraccióndel lavado, lo que indica que no hubo unión de la enzima a su sustrato (Cuadro 15).

Cuadro 15. Elucjón en lotresinadeatinidaddeltiDo e de la HMGB a pariir de unadoHMG-CoA-hex¡l-sefarosa.

Antes de lavar

Mevalonato (cpm)

177

Lavado No.

1 211

2 533 314 265 06 187 08 289 010 16

De acuerdo a los datos obtenidos y presentados en los cuadros 15 y 16, la resina deafinidad HMG-CoA-hexil-sefarosa aún no está lísta para Lisarse, de manera que seránecesario afinar los detalles correspondientes a su preparación, sobre todo en loconcerniente a la unión entre el gel (hexil-sefarosa) y el sustrato (HMG-CoA).

100

3.10 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bach T.J., D. H. Rogei.s, H. Rudney. (1986) Detergent-solubilization, puriftcation, andcharacterization of membrane-bound 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym Areductase from radi§h seedlings. Eu/. J. B/.ochem.154: 103-111.

Bach T.J., A. Motel, T. Weber. (1990) Some properlies of enzyme§ involved in the

#!:,th:e:s:sE,o:cnhds:T:!?d:o:,,:3:?#,v:2,-:hny,:,rgnTá;;:r;#sh:y:t:;#kgnpnop7d::T2o:e:Beg Z. H., H. 8. Brewer Jr. (1981) Regulation ot liver 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA

reductase. Curr. Top. Ce//. fieg. 20: 139-184.

Brown M.S., S.E. Dana, " Dietschy, m Slperstein (1973) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Solubilization and purification of a cold-sensitive microsomal enzyme. J. B/.o/. Onem. 248: 4731 -4738.

Dale S., M. Arró, 8. Beoei.ra, N. G. Morrice, A. Boronat, D. G. Hardie, A. Ferrer.

8:Á5r)e3::tt::'ea'(:s%i:?is'¡#iit::t:'#ag,%:pa:?s°Í'h8;,.:%da|°a%:t::tchtxj3|#phosphorylation at Ser577 by Brass/.ca o/eracea 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoAreductase kinase. Eur. J. Bi.ochem. 233: 506-513.

Deustcher M. P. (1990) Maintaining protein stability. Melhods Enzymo/.182: 83-92.

Edwards P.A., D. l.mongello, A.M. Fogelman (1979) J. L/.p/.d fies. 20: 40-46.

11epper C. W Audley B.G. (1969) The biosynthesis ol rubber from Í}-hydroxy-B-methylglutaryl-coenzymeAinHeveaO/asi.//.ensi.slatex.B/.ocnem"14:379-386.

Konelly P. J., K.G. Brand.. V. W. RodweM (1983) 3-hydroxy-3-methylglularyl-CoAreductase: Solubilization in the presence of proteolytic inhibitors, paitialpurification, and reversible phosphorylation-dephosphorylation. B/.ochem/.sfoí22:2784-2788.

Kondo K., K. Oba. (1986) Purification and chaíacterization of 3-hydroxy- 3-methylglutarylCoAreductasefrompolatotubers.J.B/.ocnem.100:967-974.

Lowe:ft?óÁ,ag,33:#':,,icaaj;o:,:n,dt;sc:,;,t;oune:',npr;,'oe;:se,me,.:;;na;nár#oi::%;oBíoff#?

q.S. Woík, R.H. Burdon, Gral. Eds.) Elsevier/North-Holland Biomedical Press.pp. 428-465.

L°We:C:.::h.nÉít::)::::)e:%r;##H;::Íin:ddg:/£:tdJÍ#::o:gs%t(:Tg:ap*y¿rk:nR±a%°uTd`:#

101

Maeshima M. (1992) Characterization of the major integral protein of vacuolarmembrane, P/aní Pnys/.o/. 98: 1248-1254.

Odaira M., M. Maeshima. (1994) Characterization of proteins of nuclear envelopesprepared from mung bean hypocotyls. P/aní Oe// Ph)ts/.o/. 35: 283-290.

Ostrove S. (1990a) Affinity chromatography: general methods, Meíhods Enzymo/. 182:87.

Ostrove S. (1990b) Maintaining protein stabjli.ty, Meíhods Ehzymo/.182: 357-371.

Petei.son G. L. (1977) A simplification of the protein assay method of Lowry ef a/whichis more generally applicable. Ana/. B/.ocnem. 83:346-356.

Pharmacia Fine Chemicals (1983) Affinity chromatography, principles and methods.Pharmacia Fine Chemicals AB, box 175 S-75104 Uppsala 1 Sweden, pp.18-24.

Russell D. W. (1985) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductases from pea seedlings.Methods Enzymol. 110.. 26AO.

Savolalnen H. (1992) A simple method for detecting protein antigens in flour, B/.ochem.Mol. Biol. Intnatl. 26:1101-1104.

§Cope§..P._K.:}!99±e).The r`a.w r`a+€r.ial, e.n= Protein Purification, principies and practice,3rd edition, Springer-Verlag, New York. p. 25.

Scopes R. K. (1994b) Stabilizing factors for enzymes and other proteins, en: Proíe/.nPun.//.caí/.on, prí`nc/P/es and prací/.ce, 3rd edition, Springer-Verlag, New York. pp.3 1 7-324 .

Soopes Fl. K. (1994c) Dye ligand chromatography, en: Profe/.n Pu//.Íi.caí/.on, pr/.nc/.p/esand prací/.ce, 3rd edition, Springer-Verlag, New York. pp. 210-225.

Sipat A. 8. (1982) Hydroxymethylglutaryl CoA reductase (NADPH) in the latex in Heveabrasiliensis, Phytochemistry. 21.. 2613-2618.

Tormanen C. D., W. L. Redd, M. V. Srikanlaiah, T. J. Scallen. (1976) Purification of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. B/.ocnem. Bhí.ophys. f]es.Commun. 68: 754-762.

Vey M., S. Pilkuhn, H. Wille, R. Nixon, S.J. DeArmond, E.J. Smart, R.G.W.Anderson, A. Taraboulos, S.B. Prusiner (1996) Subcellular colocalizalion ofthe cellular and scrapie prion proteins Ín caveolae-Iike membranous domains,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93..14945-14949.

Wititsuwannakul R., D. Wititsuwannakul P. Suwanmanee. (1990) 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase from the latex of Hevea tiras/./i.ens/'s,Phyfochemt.slv. 29: 1401 -1403.

102

Capítulo 4

4 Conclusiones y perspectivas

4.1 CONCLUSIONES

Como se mencionó durante el capítulo correspondiente a los antecedentes sobre la§purificaciones realizadas, Ia HMGR de plantas es una proteína que ha §ido muy difbwde purificar, debido a los problemas inherentes a su caracteri'stica membranal y a supoca estabilidad. Sin embargo en este trabajo se realizaron avances imporlantes en loque se refiere a la extracción, solubilización y estabilización de la enzima a partir derai'ces transformadas .de 0. roseus.

Para solubilizar la HMGR se ensayaron vario§ métodos así como sus combinaciones yse obtuvieron los mejoíes resultados con la utilización de detergente no iónico brij Wlal 6°/o (p/v), y una incubación del extracto enz.imático a 35°C duíante 30 minutos y unadoble centrifugación a 190,000 x g. Estas acciones permitiem recuperar el 100°/o de laactividad enzimática en el sobrenadante, a partir de la pastílla obtenida despuós decentrifugar a 100,000 x g.

El empleo de la columna de afinidad del tipo sefarosa azul, en este trabajo permitiópurificar 5.26 veces la HMGR a partir del extracto enzimático §olubilizado que seinyectóalacolumna,estolaconvierteenunaopciónadecuadaparaeliminarunprimergranlotedeproteínasnodeseablesyobtenerasi'fraccioneslosuficientementelimpiaspara aplicarse a una columna de alinidad con el sustTato de la enzima acoplado o unacolumna de intercambio iónico, o una columna de cromatoenfoque.

La realización de una eleclrotoresis en un gel desnaturalizante, permitió obtener undatc importante acei.ca del peso molecular de las subunidades de la HMGR de C.roseuspuestoqueseencuentraentrelosvalore§reportadosenotrostrabajosparalassubunidades de la enzima (4 subunidades de 50 kDa).

Para la preparación de una resina de afinidad del tipo HMG-CoA-hexil-sefarosa, seencontró que 104 moles de HMG-CoA son suficientes para preparaú 500 /L de resinade afinidad y que bastan 40 minutos reacción entre la hexil setarosa y el HMG-CoApara que la unión entre ambos se consolide.

103

4.2 PERSPECTIVAS

Chappell, (1995), ha propuesto la segregación fi'sjca de diferentes isoformas de HMGRenlamembranadelreti'culoendoplásmicoylasubcompariamentalizacióndelasi'ntesisde los isoprenos en las plantas. Aunado esto al hallazgo de una vi'a altema de siíntesis

Í,ech;eonpt'hea|:::,n:,?,s,pds:;:sLá:í:sg:e,:eges:x|uúoGS3f:suf::,r,aís3::::::rd:,átb,:::ó6riaspciado§ con la expresión de compuestos isoprénicos específicos. Aparentementeestas isóformas son aclivadas de acuerdo a programas celulares específicos y estáncompar[amentalizadas en rutas paralelas. (Korth eí a/., 1997; Mccask" y Croteau,1998). La disponibilídad de la HMGR pura, brinda la oporlunjdad de estudiar suregulación en el ámbito metabólico y comprobar si efectivamente exi§ten canalesmetabólicos,paralocuallaingeniori'ametabólicaseri'ademuchautilidad(Figura35).

La puríficación a homogeneidad de la HMGR se conseguiri'a mediante el empleo de

las siguientes herramíentas bioqui'micas:

• Empleo de la solubilización con detergente mediante el protocolo aqui' pÍopuesto.

• Uso de una columna de sefarosa azul.

• Aplicar lo obtenído en la columna anterior a una columna de afinidad del tipo HMG-CoA-hexil-sefarosa.

• Utilización de una columna de intercambio iónjco.

• Para constalar el grado de pureza alcanzado tendri.an que realízarse electroforésisen geles disocianto§.

104

Figura35.ModeloparalosprobablescanalesmetabólicosdelosproductosdelaolasHMGRpresentesenlasraícestransformadasdeC. roseus.

4.3 REFERENCIAS BIBLloGRAFICAS

Chappell J. (1995) Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid biosyntheticpa+hwíiy ir` plams. Annu. Flev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46.. 521-547.

Korth K. L,, 8. A. Stermer, M. K. Bhattacharyya, F]. A. Dixon. (1997) HMG-CoAreductase gene families that differentially accumulate transcripts in potato tubersare developmentally expressed in floral tissues. P/aní Mo/. B/.o/. 33: 545-551.

Lichtenthaler H.K., J. Schwender, A. Dlsch, lvl. Rohmer. (1997) Biosynthesis ofisoprenoids in higher plant chloroplasts proceeds via a mevalonate-independentpathway. FÉBS Leííe/s 400: 271 -274.

Schwender J., M. Seemann, H.K. Lichtenthaler, M. F`ohmer. (1996) Biosynthesis ofisoprenoids (carotenoids, sterols, prenyl side chains of chlorophylls andplastoquinone) via a novel pyruvate/glyceraldehyde 3-phosphate non-mevalonate pathway in the green alga Scenedesmus ob//.quus. BÍ.ochem. J. 316:73-80.

Mccaskill D., R. Croteau. (1998) Some caveats for bioengineering terpenoidmetabolísm in plants. 7tends B/.oíechno/. 16: 349-355.

106

5ECICY

CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A.C.