Medios y Bioquimicas

Medios de Cultivo

y

Pruebas Bioquímicas

Cabronio 5.9

http://www.cabronio.blogspot.com/



Medios

de

Cultivo

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes parala identificación de microorganismos esobservar su crecimiento en sustanciasalimenticias artificiales preparadas en ellaboratorio.

El material alimenticio en el que crecen losmicroorganismos es el Medio de Cultivo yel crecimiento de los microorganismos esel Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de

humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de

acidez o alcalinidad.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de

medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua

hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones

no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por

aquellas que crecen en él.

Medios de Cultivo

A.- Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono,fuente de nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otroselementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucellaabortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

Clasificación de los medios de cultivo basándose en su

composición química

B.- Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevaningredientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro,extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sinsaber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estosnutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) conaditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinadosmicroorganismos (particularmente heterótrofos exigentes).

Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas.

D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento

específico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de

gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población

microbiana mixta.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando

cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como

única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar ladiscriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedadesdiferenciales de crecimiento en dichos medios.

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkeydiferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimientoóptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerterápida de las células.

Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producenácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosaen los medios de mantenimiento.

Agar-Agar

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de

microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos

nutritivos.

Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de

alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.

Agar Nutritivo

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua

destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución.

Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.

Extracto de carne 3.0

Cloruro de sodio 8.0

Agar 15.0

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

Es un medio usado para el cultivo de

microorganismos poco exigentes en sus

requerimientos nutricionales. No contiene

inhibidores del desarrollo bacteriano.

La pluripeptona es la fuente de carbono y

nitrógeno para el desarrollo bacteriano.

El agregado de cloruro de sodio permite el

enriquecimiento con sangre de carnero u otras

sustancias para facilitar el cultivo demicroorganismos exigentes.

Características del medio: ámbar claro

a medio ligeramente opalescente.

Xanthomonas campestris

Medio para propósitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerososmicroorganismos. Con la adición de sangre, el medio es útil tanto para elaislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobiosnutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, comopara la observación de reacciones de hemólisis.

También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base parapreparar el medio agar chocolate.

Base Agar Gelosa Sangre

Fórmula (en gramos por litro)

Infusión de músculo de corazón 375.0

Peptona 10.0


Agar 15.0

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

La infusión de músculo de corazón y la

peptona, otorgan al medio un alto valor

nutritivo, que permite el crecimiento deuna gran variedad de microorganismos,

aún de aquellos nutricionalmente

exigentes.

El cloruro de sodio mantiene el balance

osmótico.

El agregado de sangre al medio de

cultivo, en concentración final de 5-10

%, aporta nutrientes para el crecimiento

bacteriano, y permite detectarhemólisis.

Características del medioMedio preparado: ámbar.

Medio preparado con 5% de sangre

de carnero: rojo cereza.

Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram

negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el

desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

E.M.B. Agar


Peptona 10.0Suspender 36 g del polvo en un litro

de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su

disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 C y distribuir agitando

suavemente.

Lactosa 5.0

Sacarosa 5.0

Fosfato dipotásico 2.0

Agar 13.5

Eosina 0.4

Azul de metileno 0.065

pH final: 7.2 0.2

Fundamento

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, paraobtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias yotras especies de bacilos Gram negativos.

La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, yaquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina yazul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Grampositivas.

Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característicobrillo metálico.

Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada orosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.

Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en

C. albicans

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden

dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las

cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello

se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas.

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y

transparentes,

En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de

Salmonella y Shigella.

Resultados

Microorganismos Tipo de Colonia

Escherichia coliVerdosas con brillo metálico y centro negro

azulado

Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes

Proteus mirabilis Incoloras

Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes

Shigella flexneri Incoloras

Salmonella typhimurium Incoloras

Características del medio

Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácildesarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias

que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas

las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.


Peptona 17.0

Suspender 50 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos

hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Pluripeptona 3.0

Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 1.5


Agar 13.5

Rojo neutro 0.03

Cristal violeta 0.001

pH final: 7.1 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para eldesarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezclade sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben eldesarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción enlas colonias, y la precipitación de las sales biliares.

Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Resultados

Microorganismos Colonias

Escherichia coli Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae Rosadas mucosas

Salmonella typhimurium Incoloras, transparentes

Shigella flexneri Incoloras, transparentes

Proteus mirabilis Incoloras, transparentes

Enterococcus faecalis Diminutas, incoloras, opacas


Medio preparado: rojo púrpura

Estafilococo 110 Agar

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva deestafilococos, en base a la producciónde pigmentos, la fermentación de

manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.


Extracto de levadura 2.5

Suspender 149 g del medio en un

litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.

Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C. Verter en placas y

mezclar para dispersar el precipitado.

Tripteína 10.0

Gelatina 30.0

Lactosa 2.0

D-Manitol 10.0



Agar 15.0

pH final: 7.0 0.2

Fundamento

Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicaciónalimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidosselectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio110.

En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan losnutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato dela enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbonofermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, parainhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp.,lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos

microorganismos.

Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente,es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificaciónpresuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación demanitol e hidrólisis de la gelatina.

Resultados

Observar las características de las colonias y realizar las pruebas deidentificación de microorganismos.

1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura debromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas yen una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar elcolor desarrollado entre estas dos zonas.

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona decrecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismospermanece sin cambio.

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimientobacteriano y la zona sin inocular.

2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato deamonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Resultados

Microorganismo Pigmento Fermentación de

manitol

Hidrólisis de

la gelatina

Prueba de la

coagulasa

S. aureus + + + +

S. aureus + + + +

S. epidermidis - - + -

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Sal y Manitol Agar

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento ydiferenciación de estafilococos.

Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partirde muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materialesde importancia sanitaria.

También, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halófilasde Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, MedioMarino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.



Suspender 111 g de polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir y

esterilizar en autoclave a 118-121 C durante 15 minutos.

Pluripeptona 10.0

d-Manitol 10.0


Agar 15.0

Rojo de fenol 0.025

pH final: 7.4 0.2

Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina.

Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio;

las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante.

Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una

zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso

de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente

de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono

fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el

agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol

es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal yfermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH delmedio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.

Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o nofermentar el manitol.

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizancomo colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como coloniasrojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.

Resultados

Microorganismos Crecimiento Características de las colonias

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Excelente Amarilla

Staphylococcus epidermidis ATCC

14990Bueno Roja

Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido Inhibido

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Inhibido Inhibido

Características del medioMedio preparado: rojo

Salmonella Shigella Agar

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunasespecies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en loscuales se sospeche su presencia.


Pluripeptona 5.0

Suspender 60 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3

minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y

distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.


Lactosa 10.0

Mezcla de sales biliares 8.5

Citrato de sodio 8.5

Tiosulfato de sodio 8.5

Citrato férrico 1.0

Agar 13.5

Verde brillante 0.00033

Rojo neutro 0.025

pH final: 7.0 0.2

Fundamento

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.

La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el

desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y eldesarrollo invasor del Proteus spp.

Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácidosulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose

colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa,

crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.

La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro

debido a la formación de sulfuro de hierro.

Resultados

Microorganismos Colonias

Salmonella typhimurium Transparentes, centro negro

Shigella flexneri Incoloras

Shigella sonnei Incoloras

Proteus mirabilis Transparentes, centro negro

Escherichia coli Rosadas a rojas

Klebsiella pneumoniae Rosadas cremosas y mucosas

Enterococcus faecalisIncoloras, de muy escaso

crecimiento

Características del medioMedio preparado: rojo naranja.

A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac +

C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2SE: Pseudomona aeruginosa

Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba desensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangrepara el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.


Infusión de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado

en un litro de agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos. Calentar con agitación frecuente y hervir durante

1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a

cajas de Petri (o agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie

horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de diámetro).

Peptona ácida de caseína 17.5

Almidón 1.5

Agar 15.0

pH final: 7.3 0.1

Fundamento

El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomendó su uso en

forma rutinaria para la realización del antibiograma en medio sólido, debido

a una serie de factores :

•presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad,

•su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es

bajo,

•la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente

Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es útil para realizar las

pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Resultados

Consultar en la sección “prueba de sensibilidad a los antimicrobianos”, la

metodología apropiada.


Medio preparado: ámbar.

Chromobacterium violaceum Pseudomona aeruginosa Streptococcus pyogenes

Cerebro Corazón Infusión

Medio líquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacteriasaerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos,neumococos y otros microorganismos de difícil desarrollo.

Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se utilizaeste medio para el cultivo de hongos patógenos.


Infusión de cerebro de ternera 200.0 Suspender 37 g del polvo en un litro de

agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121 C durante

15 minutos. Los tubos que no se usen inmediatamente deberán calentarse en

un baño hirviendo para la eliminación del oxígeno retenido. Enfriar rápidamente sin agitar.

Infusión corazón vacuno 250.0

Peptona 10.0


Glucosa 2.0

Fosfato disódico 2.5

pH final: 7.4 0.2

Fundamento

Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollomicrobiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno yla peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas.

La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantieneel balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer.

Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, yaque en esta infusión desarrollan todas las especies de estreptococos exceptolos tiol y piridoxal dependientes.

Los estafilococos que crecen en esta infusión suelen dar mejores reaccionesen la prueba de la coagulasa.

Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 µg/ml de amicacina, se inhibe laflora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongospatógenos.

Resultados

Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando seanecesario, subcultivar en medios sólidos apropiados y realizar la identificaciónbioquímica.

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, sin precipitado.

Microorganismos Crecimiento

Neisseria meningitidis Bueno a excelente

Neisseria gonorrhoeae Bueno a excelente

Streptococcus pyogenes Bueno a excelente

Streptococcus pneumoniae Bueno a excelente

왼왼: uninoculated tube

왼왼: Neisseria meningitidis

왼왼왼: Strepcococcus pyogenes

Tetrationato Caldo.

Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonellaspp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia

sanitaria.


Peptona 5.0Suspender 46 g del polvo en 1 litro de

agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición. Enfriar a 45 C o menos. Agregar 20 ml de solución

iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estériles. No debe

calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede mantenerse a 4 C , dura varios meses, pero una vez

agregada la solución iodada debe usarse en el mismo día.

Sales biliares 1.0

Carbonato de calcio 10.0


pH final: 8.4 0.2

Solución iodo iodurada

Iodo 6.0

Ioduro de potasio 5.0

Agua 20.0

Fundamento

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para

el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe

metabolitos tóxicos.

La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato

(generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y salesbiliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima

tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la

flora acompañante.

Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar

40 mg/l de Novobiocina, antes de la solución iodada

Resultados

Características del medioMedio preparado: suspensión blanco lechosa.

Microorganismos Crecimiento

Salmonella typhi Escaso

Salmonella typhimurium Bueno-excelente

Salmonella enteritidis Bueno-excelente

Escherichia coli Escaso

Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recolección, transporte y preservación de muestrasclínicas aptas para exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener laviabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difícil desarrollo.


Tioglicolato de sodio 0.9 Suspender 14,1 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. Distribuir en tubos con cierre a

rosca (para evitar oxidación) llenándolos hasta 2/3 del tubo.

Esterilizar 15 minutos a 121ºC.Dejar solidificar en posición vertical.

Glicerofosfato de sodio 10.0

Cloruro de calcio 0.1

Azul de metileno 0.002

Agar 3.0

pH final: 7.4 0.2

Fundamento

Medio semisólido, no nutritivo.

Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es útil

para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de

metileno, que es el indicador de oxido reducción.

De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su

envío al laboratorio. Cooper encontró que usando hisopos impregnados con

carbón bacteriológico se recuperan en forma exitosa numerosos patógenosentéricos y respiratorios.

Resultados

Los tubos con medio de transporte

se subcultivan en medios sólidosapropiados según la muestra y el

microorganismo que se quiera

aislar. Luego de la incubación, debe

haber escasa o nula reducción de la

viabilidad de los microorganismos.


Medio preparado: ligeramente

opalescente con tonalidad azuldependiendo del grado de

oxidación.

Pruebas

Bioquímicas

INTRODUCCIÓN

Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca demanera detallada su actividad bioquímica, porque otras características no

son suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la

caracterización bioquímica de una especie.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una

sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del

cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

Además de los productos finales de los procesos metabólicos, tambiénse necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, comoocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimasintervienen, cuales son los productos intermediarios además de que sedeben reconstruir las secuencias de las reacciones bioquímicas quetienen lugar dentro de la célula.

Enterotube II

Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentospara la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentaciónde glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.


Peptona de carne 13.0

Suspender 54.8 g del polvo por litro de

agua destilada. Mezclar bien y calentarcon agitación frecuente, hervir 1 o 2minutos hasta disolución total. Llenar

hasta la tercera parte de los tubos deensayo. Esterilizar a 121 C por 15

minutos. Enfriar en pico de flautaprofundo.


Lactosa 10.0

Tripteina 10.0

Glucosa 1.0

Citrato de hierro y amonio 0.5


Rojo de fenol 0.025

Agar 15.0

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

•En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan losnutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

•La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.

•El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción deácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfurode hierro, de color negro.

•El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene elbalance osmótico. El agar es el agente solidificante.

•Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectanpor medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo enmedio ácido.

•El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el quereacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfurode hierro de color negro.

Resultados

1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismosolamente fermenta la glucosa.

2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismofermenta glucosa, y lactosa.

3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es nofermentador de azúcares.

4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que elmicroorganismo produce gas.

5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácidosulfhídrico.


Medio preparado: rojo

TSI Agar

Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.



Suspender 62,5 g del polvo por litro

de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución

total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico

de flauta profundo.

Pluripeptona 20.0


Lactosa 10.0

Sacarosa 10.0

Glucosa 1.0

Sulfato de hierro y amonio 0.2


Rojo de fenol 0.025

Agar 13.0

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona,aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano.

La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbonofermentables.

El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción deácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de ionesFe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producensulfuro de hierro, de color negro.

El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantieneel balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectanpor medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo enmedio ácido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el quereacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfurode hierro de color negro.

Características del medioMedio preparado: rojo

Resultados

Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmenteSalmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y

en la producción de ácido sulfhídrico.


Peptona de gelatina 5.0Suspender 35 g del medio

deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente,

agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución

completa. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo

vertical apto para la punción.


Glucosa 1.0

Lisina 10.0

Citrato de hierro y amonio 0.5


Púrpura de bromocresol 0.02

Agar 15.0

pH final: 6.7 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan losnutrientes para el desarrollo bacteriano.La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustratoutilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de laproducción de ácido sulfhídrico.

El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo apH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcalinizael medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.

La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que esnecesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que sonfermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio decultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de colorvioleta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.

La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento delmedio debido a la formación de sulfuro de hierro.

Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas deMorganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, elcual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizoen la superficie del medio.

Resultados

1- Decarboxilación de la lisina:

-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.

-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

2-Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del géneroProteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.

3-Producción de ácido sulfhídrico:

-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en ellímite del pico y fondo)

Características del medioMedio preparado: color violeta.

MicroorganismosColor en el pico de flauta

Color en la base del tuboEnnegrecimiento

del medio

Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo

Salmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo

Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo

Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo

Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo

Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo

Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo

Klebsiella pneumoniae Púrpura Púrpura Negativo

Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo

MIO Medio

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad,actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol.


Dextrosa 1.0

Suspender 31 g del polvo en un

litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución. Distribuir en tubos y

esterilizar 15 minutos a 121 C.


Peptona 10.0

Tripteína 10.0

Clorhidrato de L-ornitina 5.0

Agar 2.0

Púrpura de bromocresol 0.02

pH final: 6.5 0.2

Fundamento

Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia deextracto de levadura, peptona y tripteína.

Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de laenzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol.

La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustratopara la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura debromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpuray en medio ácido es amarillo.

Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimientoque difunde mas allá de la línea de inoculación.

La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio.Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo unacondición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresolvire al amarillo.

La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de laenzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje delindicador hacia el color púrpura.

El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos quecontienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego deagregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultadopositivo.

Resultados

1-Movilidad:

-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra.-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa:

-Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.

3-Prueba del indol:

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Características del medioMedio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.

SIM Medio

Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indoly de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembrosde la familia Enterobacteriaceae.


Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de agua

destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar

en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

Peptona 6.1

Sulfato de hierro y amonio 0.2


Agar 3.5

pH final: 7.3 0.2

Fundamento

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, yparticularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacteriaspara formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.

El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o deErlich, para originar un compuesto de color rojo.

Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez queproducen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepasproductoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitadonegro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio semantenga a un pH mayor a 7.2.

Resultados

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende masallá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la líneade siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea desiembra o en todo el medio.

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar elreactivo de Kovac s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Características del medioMedio preparado: ámbar.

Urea

Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a laactividad ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp.de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.


Urea 20.0

Suspender 3, 87 g del medio

deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Disolver sin calentar y esterilizar por filtración. Distribuir

en tubos pequeños estériles, entre 0,5 y 2 ml.

Fosfato monopotásico 9.1

Fosfato disódico 9.5


Rojo fenol 0.01

pH final: 6.8 ± 0.2

Fundamento

Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajocontenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas ycofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano.Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es elindicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogenoproveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoníaco y dióxido decarbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio, haciendo virar elindicador rojo fenol del amarillo al rojo.Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros géneros.

Características del medioMedio preparado: anaranjado.

Urea-

1 Uninoculated Control,

2 Proteus Vulgaris,

3 E. coli

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.


Citrato de sodio 2.0

Suspender 24,2 g del medio

deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2

minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15

minutos. Enfriar en posición inclinada.



Fosfato monoamónico 1.0

Sulfato de magnesio 0.2

Azul de bromotimol 0.08

Agar 15.0

pH final: 6.9 0.2

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y

el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son

necesarios para el desarrollo bacteriano.

Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor

enzimático.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es elindicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces deutilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única

fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de

citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento

del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en

presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser

utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatosalcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción

de citrato permeasa.

Resultados

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay

desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae Positivo Azul

S. typhimurium Positivo Azul

E. coli Negativo Verde

S. flexneri Negativo Verde

Características del medioMedio preparado: verde.

Gracias!

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