EPIFLUORESCENCIAEPIFLUORESCENCIA

                                                                                                            

EL EQUIPOEL EQUIPO

LOS FILTROSLOS FILTROS

¿QUE ES?¿QUE ES?

Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.molécula fluorescente utilizada.

Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de Los colorantes fluorescentes utilizados para la tinción celular son detectados con ayuda del microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente fluorescencia. Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al excitar al fluorocromofluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) , antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.fluorocromo.

En la imagen se muestra el esquema de funcionamiento de un microscopio de epifluorescencia, en el que la luz En la imagen se muestra el esquema de funcionamiento de un microscopio de epifluorescencia, en el que la luz incide sobre la preparación a través de las lentes del objetivo. Este microscopio, de gran poder de resolución incide sobre la preparación a través de las lentes del objetivo. Este microscopio, de gran poder de resolución tiene que tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la luz ultravioleta. En el esquema se sitúan los tres tiene que tener objetivos de cuarzo para permitir el paso de la luz ultravioleta. En el esquema se sitúan los tres elementos característicos del microscopio de fluorescencia : elementos característicos del microscopio de fluorescencia :

primer filtro de corte o filtro de excitación. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En primer filtro de corte o filtro de excitación. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) el esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)

espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la propiedad de reflejar la luz de espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra. luz verde emitida por el fluorocromo presente en la muestra.

segundo filtro de corte o filtro de emisión. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En segundo filtro de corte o filtro de emisión. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caos deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. este caos deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.

En el esquema los filtros que se han indicado serían los que emplearíamos la fluorescencia asociada al En el esquema los filtros que se han indicado serían los que emplearíamos la fluorescencia asociada al isotiocianato de fluoresceína, molécula fluorescente ampliamente utilizada en microscopía de fluorescencia isotiocianato de fluoresceína, molécula fluorescente ampliamente utilizada en microscopía de fluorescencia acoplada a anticuerpos. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los acoplada a anticuerpos. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos . diferentes fluorocromos .

La fluorescencia es La fluorescencia es

La fluorescencia es el fenómeno óptico que ocurre cuando la luz es absorbida por una sustancia -cuando se encuentra expuesta a radiaciones ultravioletas, rayos catódicos o rayos x-, creando así una excitación molecular que hace que dicho material re-emita la luz en una longitud de onda mayor a la longitud incidente.   Así, las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. La tinción molecular se basa en la utilización de colorantes fluorescentes, los cuales son detectados gracias al microscopio de fluorescencia. Este tipo de microscopía se fundamenta en el uso de filtros. El primer filtro selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. El microscopio fluorescente para epifluorescencia. La técnica de fluorescencia para microscopia con epiiluminadores (iluminador episcópico) está basada en la adaptación del iluminador vertical. La luz incide sobre la muestra a través de las lentes del objetivo, que permiten el paso de la luz ultravioleta exentos de tensión molecular.

FILTROS Y TIPOSFILTROS Y TIPOS

Filtros espectros imagen WU Se detecta la emisión de DAPI pero no la de FITC por su baja excitación. WIBSe detecta la emisión de FITC pero no la de DAPI pues no es excitado. FITC & DAPI El filtro de dos bandas FITC y DAPI permite la correcta excitación y detección simultánea de FITC y

DAPI. Colección de espectro e imagen

EL MICROSCOPIO PARA EPIEL MICROSCOPIO PARA EPI

El microscopio para epifluorescencia consta de los siguientes elementos:El microscopio para epifluorescencia consta de los siguientes elementos: 1-1- Una fuente de luz lampara halogena, iluminacion led que debe emitir la mayor cantidad de luz Una fuente de luz lampara halogena, iluminacion led que debe emitir la mayor cantidad de luz

ultravioleta,ultravioleta, 2-2- El microscopio El microscopio 3-3- Un sistema de filtros. Un sistema de filtros. El sistema de filtros y el espejo dicroico son elementos característicos del microscopio de El sistema de filtros y el espejo dicroico son elementos característicos del microscopio de

fluorescencia:fluorescencia: 1.1. Filtro de excitación: diseñado para dejar pasar sólo aquellas longitudes de onda que se Filtro de excitación: diseñado para dejar pasar sólo aquellas longitudes de onda que se

excitan con la fluorescencia excitan con la fluorescencia 2.2. Espejo dicroico: componente óptico que separa la luz de excitación de la fluorescencia. Espejo dicroico: componente óptico que separa la luz de excitación de la fluorescencia.

Debido a su diseño, tiene la propiedad de reflejar selectivamente la longitud de onda más corta, Debido a su diseño, tiene la propiedad de reflejar selectivamente la longitud de onda más corta, excitando la radiación y trasmitiendo la longitud de onda más larga, fluorescente.  excitando la radiación y trasmitiendo la longitud de onda más larga, fluorescente. 

3.3. Filtro de barrera: es el último componente de un cubo fluorescente, que transmite la emisión Filtro de barrera: es el último componente de un cubo fluorescente, que transmite la emisión fluorescente de las longitudes de onda a la vez que bloquea las longitudes de onda de fluorescente de las longitudes de onda a la vez que bloquea las longitudes de onda de excitación. Estos filtros son vidrios de color o filtros de interferencia que poseen propiedades de excitación. Estos filtros son vidrios de color o filtros de interferencia que poseen propiedades de transmisión de filtrado. Además, previenen que la luz de excitación alcance el ojo del transmisión de filtrado. Además, previenen que la luz de excitación alcance el ojo del observador. observador.

4.4. Lámpara de mercurio: consiste de dos electrodos sellados dentro de un bulbo de vidrio en alta Lámpara de mercurio: consiste de dos electrodos sellados dentro de un bulbo de vidrio en alta presión, el cual contiene mercurio. Cuando la fuente de poder se enciende, un pulso de alto presión, el cual contiene mercurio. Cuando la fuente de poder se enciende, un pulso de alto voltaje es enviado hacia los electrodos, ionizando el gas en el bulbo, generando así la ignición voltaje es enviado hacia los electrodos, ionizando el gas en el bulbo, generando así la ignición de la lámparade la lámpara..

EL MICROSCOPIO PARA EPIEL MICROSCOPIO PARA EPI

Los filtrosLos filtros Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos. Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos.

Para una adecuada observación del fenómeno, es de gran importancia seleccionar el conjunto de filtros Para una adecuada observación del fenómeno, es de gran importancia seleccionar el conjunto de filtros apropiado para la observación.apropiado para la observación.

Es posible distinguir entre tres grandes tipos de filtros, los longpass, los bandpass, y los shortpass.Es posible distinguir entre tres grandes tipos de filtros, los longpass, los bandpass, y los shortpass. Los filtros longpass sólo permiten el paso de longitudes de onda que están por encima de un Los filtros longpass sólo permiten el paso de longitudes de onda que están por encima de un

determinado valor, evitando, pues, que la luz de longitudes de onda menor pase. Estos filtros se deben determinado valor, evitando, pues, que la luz de longitudes de onda menor pase. Estos filtros se deben utilizar cuando la técnica requiera una emisión máxima, y no sea necesaria la diferenciación espectral. utilizar cuando la técnica requiera una emisión máxima, y no sea necesaria la diferenciación espectral.

Por otra parte, los filtros bandpass sólo permiten el paso de la luz de un rango determinado de longitud Por otra parte, los filtros bandpass sólo permiten el paso de la luz de un rango determinado de longitud de onda. Estos filtros son útiles para observar un determinado tinte en un espécimen de múltiples tintes.de onda. Estos filtros son útiles para observar un determinado tinte en un espécimen de múltiples tintes.

Por último, los filtros shortpass se definen por su capacidad de transmitir una banda espectral estrecha Por último, los filtros shortpass se definen por su capacidad de transmitir una banda espectral estrecha de longitud de onda corta, bloqueando las ondas de radiación largas; es decir que dejan pasar el de longitud de onda corta, bloqueando las ondas de radiación largas; es decir que dejan pasar el espectro por debajo de un valor determinado bloqueando al espectro sobre dicho valor.espectro por debajo de un valor determinado bloqueando al espectro sobre dicho valor.

Características técnicas:Características técnicas: Este equipo posee un sistema excepcional que mejora los análisis con técnicas de fluorescencia, Este equipo posee un sistema excepcional que mejora los análisis con técnicas de fluorescencia,

permitiendo observar imágenes con extraordinaria claridad y gran contraste. permitiendo observar imágenes con extraordinaria claridad y gran contraste.

Combinando la óptica del microscopio con un único diseño para epifluorescencia, se obtiene un brillo y Combinando la óptica del microscopio con un único diseño para epifluorescencia, se obtiene un brillo y una definición óptima en un amplio campo visual. una definición óptima en un amplio campo visual.

El microscopioEl microscopio

Así, el microscopio para epifluorescencia c se convierte en una invaluable herramienta de investigación, debido a las Así, el microscopio para epifluorescencia c se convierte en una invaluable herramienta de investigación, debido a las ventajas que presenta que no se encuentran en otro microscopio óptico. Este equipo cumple normas ce, iso9001 e ventajas que presenta que no se encuentran en otro microscopio óptico. Este equipo cumple normas ce, iso9001 e iso14001. iso14001.

Su sistema de epifluorescencia es intercalable entre estativo y cabeza, y está compuesto por un alojamiento para 3 filtros Su sistema de epifluorescencia es intercalable entre estativo y cabeza, y está compuesto por un alojamiento para 3 filtros interferenciales (dos opcionales) y un paso de luz libre, deslizable con anclaje en la posición seleccionada; cañón y interferenciales (dos opcionales) y un paso de luz libre, deslizable con anclaje en la posición seleccionada; cañón y caja de lámpara donde se halla el diafragma de campo centrable. Posee un portafiltros deslizable para alojamiento caja de lámpara donde se halla el diafragma de campo centrable. Posee un portafiltros deslizable para alojamiento de filtros accesorios. de filtros accesorios.

Además, la caja de la lámpara posee una lente condensadora de difusión, y el alojamiento de la lámpara hbo 100 (alta Además, la caja de la lámpara posee una lente condensadora de difusión, y el alojamiento de la lámpara hbo 100 (alta presión de hg) tiene incorporado los correspondientes comandos para su centrado y ajuste. Posee un filtro de presión de hg) tiene incorporado los correspondientes comandos para su centrado y ajuste. Posee un filtro de barrera, objetivo con luz para centrar el sistema, y filtro interferencial de excitación para fitc. Tiene un sistema de barrera, objetivo con luz para centrar el sistema, y filtro interferencial de excitación para fitc. Tiene un sistema de alimentación con switch, un pulsador de ignición y un cuenta horas digital seteable. alimentación con switch, un pulsador de ignición y un cuenta horas digital seteable.

Además, cuenta con un equipo para epifluorescencia invertido (ae 30), el cual combina las ventajas del sistema de Además, cuenta con un equipo para epifluorescencia invertido (ae 30), el cual combina las ventajas del sistema de epifluorescencia con las de un microscopio invertido.epifluorescencia con las de un microscopio invertido.

Preparado de inmunofluorescencia: técnica para campilobacterosis genitalPreparado de inmunofluorescencia: técnica para campilobacterosis genitalEl término conjugado, de uso corriente en los laboratorios, se refiere, en este caso, a la fracción gamaglobulina de un El término conjugado, de uso corriente en los laboratorios, se refiere, en este caso, a la fracción gamaglobulina de un

suero hiperinmune anti campylobater fetus venerealis, marcada con un colorante fluorescente: isotiocianato de suero hiperinmune anti campylobater fetus venerealis, marcada con un colorante fluorescente: isotiocianato de fluoresceína.fluoresceína.

Acondicionamiento y uso del conjugado:Acondicionamiento y uso del conjugado:El conjugado se encuentra en estado puro y liofilizado desde su elaboración. Por lo tanto lo primero que tiene que hacer El conjugado se encuentra en estado puro y liofilizado desde su elaboración. Por lo tanto lo primero que tiene que hacer

es reconstituirlo con 1 ml de agua destilada estéril (provista en el kit) y fraccionarlo colocando 100 μL en cada vial es reconstituirlo con 1 ml de agua destilada estéril (provista en el kit) y fraccionarlo colocando 100 μL en cada vial provisto. Luego debe colocar todos los viales menos uno en el freezer. Con los 100 μL que ha dejado sin congelar, provisto. Luego debe colocar todos los viales menos uno en el freezer. Con los 100 μL que ha dejado sin congelar, debe hacer la titulación correspondiente para el microscopio en uso. Una vez titulado lleve el conjugado a la dilución debe hacer la titulación correspondiente para el microscopio en uso. Una vez titulado lleve el conjugado a la dilución de trabajo y conserve durante su uso entre 4 a 8º C. de trabajo y conserve durante su uso entre 4 a 8º C.

Cuando necesite descongelar otro vial, conteniendo 100 μL del conjugado puro, llévelo directamente a la dilución de Cuando necesite descongelar otro vial, conteniendo 100 μL del conjugado puro, llévelo directamente a la dilución de trabajo obtenida y úselo sin volver a congelar.trabajo obtenida y úselo sin volver a congelar.

DESCRIPCION DEL DESCRIPCION DEL MICROSCOPIOMICROSCOPIO

EL EQUIPO LED EPIEL EQUIPO LED EPI

MONTAJE DE LA LAMPARAMONTAJE DE LA LAMPARA

FluorocromosFluorocromos

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando captan (son excitados) por un fotón incidente de una longitud de onda onda determinada cuando captan (son excitados) por un fotón incidente de una longitud de onda característica. Por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína tiene un máximo de absorción a 490 característica. Por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína tiene un máximo de absorción a 490 nm y un máximo de emisión a 520 nm. nm y un máximo de emisión a 520 nm.

Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la Uno de los problemas de la utilización de fluorocromos en microscopía de fluorescencia es la pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas pérdida de ésta debido a las grandes intensidades de luz empleadas. Las muestras empleadas en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la en esta técnica no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Una muestra que ha perdido parte de la desaparición de la fluorescencia ('fluorescence fading'). Una muestra que ha perdido parte de la fluorescencia presenta regiones 'oscuras' (como en el ejemplo). Se han desarrollado métodos fluorescencia presenta regiones 'oscuras' (como en el ejemplo). Se han desarrollado métodos que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan :que permiten reducir este efecto, entre ellos destacan :

el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents')el uso de reactivos protectores de la fluorescencia ('antifading reagents') el uso de fluorocromos con poco 'fading'el uso de fluorocromos con poco 'fading' el empleo de luz de excitación de menor intensidadel empleo de luz de excitación de menor intensidad la reducción de la concentración de oxígeno en el espécimenla reducción de la concentración de oxígeno en el espécimen el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para el direccionamiento del 100% de la luz hacia el dispositivo de registro (cámara, película,...) para

reducir al máximo el tiempo de exposición.reducir al máximo el tiempo de exposición. el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la el empleo de mecanismos de medición de la exposición óptima (automática) para reducir la

iluminación al máximoiluminación al máximo....

FluorocromosFluorocromos

Los reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha Los reactivos 'antifading' son moléculas que aportan al fluorocromo aquellos electrones que ha perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben perdido por la emisión fluorescente. Se trata de moléculas donadoras de electrones que deben encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo. Además son encontrarse para ser efectivas en estrecha vecindad a las moléculas de fluorocromo. Además son específicas de fluorocromo pues los electrones que pueden donar sólo serán donables si se específicas de fluorocromo pues los electrones que pueden donar sólo serán donables si se encuentran en niveles de energía ligeramente superiores a los propios del fluorocromo en reposo. A encuentran en niveles de energía ligeramente superiores a los propios del fluorocromo en reposo. A continuación se muestran dos esquemas en los que se aprecia el efecto protector de dos continuación se muestran dos esquemas en los que se aprecia el efecto protector de dos 'antifading' sobre dos fluorocromos.'antifading' sobre dos fluorocromos.

Estabilidad de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en Estabilidad de la fluorescencia de la fluoresceína (FITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado citokeratinas con FITC con y sin P- fenilenediamina. Estabilidad de la las que se han detectado citokeratinas con FITC con y sin P- fenilenediamina. Estabilidad de la fluorescencia de la rodamina (TRITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han fluorescencia de la rodamina (TRITC) medida sobre preparaciones de PtK2 en las que se han detectado microfilamentos con faloidina-TRITC con y sin n- propil galeato.detectado microfilamentos con faloidina-TRITC con y sin n- propil galeato.

Los reactivos antifading más empleados son los siguientes :Los reactivos antifading más empleados son los siguientes : p- fenilenediamina. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la p- fenilenediamina. Es el reactivo más efectivo para la conservación de la fluorescencia de la

fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El fluoresceína (FITC). También efectivo para la rodamina. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El reactivo se tiñe de blanco cuando se expone a la luz. Se ha de conservar en la oscuridad. El contacto con la piel es extremadamente peligroso.contacto con la piel es extremadamente peligroso.

DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octano). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p- DABCO (1,4-diazabiccyclo-2,2,2-octano). Muy efectivo para la fluoresceína, aunque menor que la p- fenilenediamina. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico. fenilenediamina. Es menos sensible a la luz y es mucho menos tóxico.

n- propil galeato. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la n- propil galeato. Es el agente más efectivo para la rodamina, aunque también es efectivo para la fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.fluoresceína. Se emplea al 0.1% en glicerol/PBS.

2- mercaptoetilamina. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñidas 2- mercaptoetilamina. Se emplea para la observación de cromosomas y muestras de DNA teñidas con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en con ioduro de propidio (PI), naranja de acridina (AO) o cromomysin A3. Se emplea al 0.1 mM en Tris-EDTATris-EDTA

El microscopio Primo Star iLED ya está disponible con tres accesorios de fluorescencia adicionales que permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y Rhodamine/Cy 3. De este modo puede emplearse un microscopio de LED para aplicaciones de fluorescencia simple en la formación, en procedimientos habituales y en investigación básica. Este dispositivo es especialmente robusto y fácil de usar, y ofrece una sobresaliente relación precio/rendimiento, gracias en gran medida a la fuente lumínica económica, duradera y de gran ahorro energético que ofrecen los LED.

Especialmente en el caso de la formación, la excitación de fluorescencia mediante la iluminación por LED resulta muy útil al no ser necesario contar con períodos de calentamiento o refrigeración, a diferencia de lo que ocurre con la excitación producida mediante lámparas de vapor de mercurio. Además, ya no es necesario reajustar las lámparas de excitación, por lo que el usuario puede comenzar a trabajar en el mismo momento en que se enciende la fuente de iluminación. El accesorio de fluorescencia del iLED cuenta con unos prácticos adaptadores oculares que permiten efectuar labores de microscopia de fluorescencia aunque no se esté en un cuarto oscuro (por ejemplo, en un auditorio). El microscopio dispone de una palanca que permite pasar de un uso de campo claro a uno de fluorescencia.

CONTRASTE DE FASE + EPICONTRASTE DE FASE + EPI

Técnica estructura de los grupos ópticos imagen Contraste de fases + epifluorescencia La imagen superior corresponde a la imagen de fluorescencia, la segunda a la de contraste de fases y la tercera a la combinada. .

Técnicas de análisisTécnicas de análisis

En la técnica de epifluorescencia se tomó un volumen entre En la técnica de epifluorescencia se tomó un volumen entre 4 y 5 mL de cada muestra durante cada medición, se pasó 4 y 5 mL de cada muestra durante cada medición, se pasó por un filtro de 0,45 mm para separar las partículas más por un filtro de 0,45 mm para separar las partículas más grandes, y se procedió a fijar con formol al 40% hasta grandes, y se procedió a fijar con formol al 40% hasta obtener un volumen final del 2% de formol. Luego se obtener un volumen final del 2% de formol. Luego se tiñeron las células con 4 a 5 gotas de DAPI (4´,6- diamino-2-tiñeron las células con 4 a 5 gotas de DAPI (4´,6- diamino-2-fenilindol) durante 10 min, se filtró la muestra al vacío en fenilindol) durante 10 min, se filtró la muestra al vacío en filtros de policarbonato negro de 0,22 mm y posteriormente filtros de policarbonato negro de 0,22 mm y posteriormente se realizaron los contajes bacterianos directamente al se realizaron los contajes bacterianos directamente al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se observaron microscopio de fluorescencia. Las bacterias se observaron de color blanco sobre un fondo negro, ya que el DAPI se de color blanco sobre un fondo negro, ya que el DAPI se incorpora al material genético de la célula, emitiendo incorpora al material genético de la célula, emitiendo fluorescencia al excitarse en presencia de luz ultravioleta fluorescencia al excitarse en presencia de luz ultravioleta (365 nm) (Porter y Freig 1980).  (365 nm) (Porter y Freig 1980). 

Tinción de epifluorescencia

Tinción de epifluorescencia. Se trata de una técnica de tinción empleada para el recuento de microorganismos y para estimar su tipo de metabolismo. Cuando las células se encuentran en fase exponencial de crecimiento, se tiñen de color naranja, al alcanzar la fase estacionaria, algunas comienzan a aparecer de color verde, indicativo de una parada en la síntesis de proteínas.

 Preparación de la muestra Se toma una muestra de 2ml de un cultivo y se añade formalina al 40% para obtener una disolución final de

formalina al 2%. A continuación se agita durante 2 min. para evitar la agregación celular.  Ejemplo: suponiendo una muestra de 3 ml, para conseguir la disolución final al 2% se opera de la siguiente

manera: 3 ml · 2% = x ml · 40%,

siendo x el volumen de formalina al 40% que hay que añadir a los 3 ml de muestra ..

Preparación del naranja de Preparación del naranja de acridinaacridina

Preparación del naranja de acridinaPreparación del naranja de acridina Naranja de acridina, 0.025gNaranja de acridina, 0.025g. . Agua ultra pura 1000ml Agua ultra pura 1000ml , , formaldehído 60ml formaldehído 60ml

Se coloca un disco de celulosa sobre el filtro de vidrio de un kitasatos, con cuidado de que quede bien centrado, y se humedece Se coloca un disco de celulosa sobre el filtro de vidrio de un kitasatos, con cuidado de que quede bien centrado, y se humedece con una o dos gotas de agua destilada. Hacer vacío durante 1 ó 2 segundos para que el disco quede bien adherido al filtro con una o dos gotas de agua destilada. Hacer vacío durante 1 ó 2 segundos para que el disco quede bien adherido al filtro de vidrio. Sobre el filtro de celulosa se coloca el filtro teñido con Negro Irgalam (Millipore) teniendo cuidado de dejar la cara de vidrio. Sobre el filtro de celulosa se coloca el filtro teñido con Negro Irgalam (Millipore) teniendo cuidado de dejar la cara más brillante hacia arriba. A continuación se coloca el embudo metálico de la unidad de filtración y se asegura con una más brillante hacia arriba. A continuación se coloca el embudo metálico de la unidad de filtración y se asegura con una pinza. Se añade el Naranja de acridina (2ml) teniendo cuidado de que no se filtra por sí solo, lo que indicaría que el embudo pinza. Se añade el Naranja de acridina (2ml) teniendo cuidado de que no se filtra por sí solo, lo que indicaría que el embudo y la pinza no están bien colocadas. A continuación se añade una alícuota de 200 µl de y la pinza no están bien colocadas. A continuación se añade una alícuota de 200 µl de la muestra fijada con formalina al 2%, repartiéndose bien la muestra por todo el colorante, retomando varias veces con la misma punta de manera que no quede muestra en la misma. Esperar 2 minutos y filtrar a presión moderada; si el filtrado es demasiado lento es de suponer que el número de células será superior a las 20-40 que se deben ver al microscopio en un campo. Cargar una jeringa con agua destilada y colocar un filtro Millipore 0,22µm; este agua se utiliza para realizar tanto los lavados de la muestra como posibles diluciones. Se realizan tres lavados con agua destilada filtrada por filtros millipore 0,22µm (5 ml por lavado). Entre lavado y lavado es necesario desconectar la bomba de vació. Sobre un portaobjetos se coloca una gota de aceite de inmersión Nikon de baja fluorescencia y se extiende con un cubre que sólo se utilizará con tal fin. Sobre el aceite se coloca cuidadosamente el filtro de Negro irgalam asegurándose de que el filtro de celulosa queda sobre el de vidrio, ya que éste es reutilizable. A su vez se añade otra gota de aceite sobre el filtro de Negro irgalam y encima se coloca un cubre apretando con suavidad para que el aceite se distribuya homogéneamente. Además se añade otra gota de aceite sobre el cubre. La muestra está lista para ser observada por el microscopio. Se utiliza para ello un objetivo de inmersión 100 X. Si se observan pocas bacterias en un primer recuento, se puede primero filtrar la muestra, y luego  añadir 1ml de naranja de acridina. Se espera 2 minutos y posteriormente se realizan tres lavados con 1ml de agua destilada filtrada. Tras el conteo del número de células observadas en 20 campos de visión se realiza la siguiente operación:

células/ml =  (X · F · D)/V  Donde: X: número medio de células por campo;

    F: factor de corrección del microscopio (nº de campos por filtro);     D: dilución de la muestra, y,     V: volumen de la muestra.

MétodoMétodo para vinos con naranja de acridinapara vinos con naranja de acridina

Preparación del reactivo:Preparación del reactivo: Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en ebullición 10 minutos, y Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en ebullición 10 minutos, y

se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estéril.se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estéril. Técnica:Técnica: Tomar 40 ml de vino si es de línea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo de la jeringa un Tomar 40 ml de vino si es de línea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo de la jeringa un

portafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de poliamida, filtra la muestraportafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de poliamida, filtra la muestra Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm con una membrana de Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm con una membrana de

0,22 micrones de poro estéril.0,22 micrones de poro estéril. En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presión en la jeringa para que En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presión en la jeringa para que

pase el colorante a través de los dos filtros con sumo cuidado.pase el colorante a través de los dos filtros con sumo cuidado. Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante.Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante. Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rápido y una vez ocurrido esto colocar Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rápido y una vez ocurrido esto colocar

sobre un portaobjetos.sobre un portaobjetos. Agregar sobre la membrana aceite de inmersión de alta calidad, veremos que la membrana se transparenta, Agregar sobre la membrana aceite de inmersión de alta calidad, veremos que la membrana se transparenta,

colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra gota de aceite de inmersión.colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra gota de aceite de inmersión. Asegurar una correcta inmersión de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la lectura de 10 Asegurar una correcta inmersión de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la lectura de 10

campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro.campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro. Resultados:Resultados: En vasija < 400 levaduras y < 600 bacterias por litros y en botella es de < 100 levaduras y < 200 bacteriasEn vasija < 400 levaduras y < 600 bacterias por litros y en botella es de < 100 levaduras y < 200 bacterias Las levaduras y bacterias se tiñen de color anaranjado brillante sobre un fondo negro, verde claro o Las levaduras y bacterias se tiñen de color anaranjado brillante sobre un fondo negro, verde claro o

amarilloamarillo

MUCHAS GRACIAS POR SU MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIONATENCION

ALEJANDRO CANGIALEJANDRO CANGI

AGOSTO 2010AGOSTO 2010

MAG SRLMAG SRL