Modelos de Selección Genómica para Caracteres

Tesis para optar al grado de

Magíster en Estadística Aplicada

Universidad Nacional de Córdoba

Modelos de Selección Genómica

para Caracteres Cuantitativos

basados en Marcadores Moleculares

aplicados al mejoramiento de maíz

Lic. María Valeria Paccapelo - 2015 -

Modelos de Selección Genómica para Caracteres Cuantitativos basados en Marcadores

Moleculares aplicados al mejoramiento de maíz por María Valeria Paccapelo se distribuye bajo

una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional.

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COMISIÓN ASESORA DE TESIS

Director

Dr. Julio Alejandro Di Rienzo

Co-Director

Ph. D Shengqiang Zhong

Miembros

Dr. Fernando Casanoves

Dr. Mariano Augusto Córdoba

Dr. Martín Oscar Grondona

Fecha Aprobación:

29 de Diciembre de 2015

AGRADECIMIENTOS

En este momento donde que alcancé el objetivo de finalizar mis estudios de maestría, me

siento enormemente agradecida a cada una de las personas que me acompañó de alguna de las

infinitas maneras que se puede ser parte del camino que recorrí desde que empecé este trayecto.

Gracias a mis padres, mis hermanos y abuelos por los valores que me transmitieton, por la

confianza y el apoyo para que siga creciendo.

Gracias a mis amigos de cada rincón por ayudarme a disfrutar del camino que recorrí. En

particular, gracias a esos amigos que me dio la maestría.

Gracias a Martín Grondona, porque desde múltiples roles me enseñó a hacer mi trabajo lo

mejor posible, confió en mi y me dio oportunidades para desarrollarme profesionalmente.

Gracias a Guillermo Van Becelaere por la gestión para que pueda trabajar el tema que quería,

pero sobre todo, por creer en mi y motivarme con “maestría, autonomía y propósito”.

Gracias a Julio Di Rienzo por inspirarme siendo su estudiante y por dirigirme con tanta

dedicación, por darme libertad y trabajar con tanto profesionalismo y calidez.

Gracias a mis directores y miembros del jurado por la guía y las sugerencias constructivas que

me permitieron seguir aprendiendo.

Finalmente, quiero agradecer a Advanta Semillas que apostó a mi desarrollo profesional,

brindandome el tiempo y los recursos para estudiar; a Monsanto que continuó dando soporte a

mi desarrollo, facilitando los materiales para poder realizar esta investigación y apoyandome a

que siga creciendo; al cuerpo docente y personal administrativo de la maestría que hicieron que

estudiar sea enriquecedor no sólo desde el punto profesional sino también personal.

i

RESUMEN

En la actualidad, los modelos de selección genómica (SG) han cobrado gran importancia ya

que permiten predecir los valores genéticos de los individuos en función de marcadores

moleculares (MM). La incorporación de numerosos MM en modelos de regresión conduce a

problemas de dimensionalidad y multicolinealidad. Esta tesis tuvo como objetivo evaluar seis

métodos de SG que confrontan estas dificultades (selección de variables, estimación penalizada y

la combinación de ambos) desde enfoques clásicos o bayesianos y evaluar su habilidad predictiva

para tres caracteres fenotípicos observados en 20 poblaciones de maíz (Zea mays L.). Los

resultados indican que la habilidad predictiva se vio asociada a la heredabilidad del carácter y fue

superior para los métodos penalizados, entre los que se recomienda la Regresión de Ridge vía

modelos mixtos (RR-BLUP). Este trabajo permitió analizar diferentes técnicas estadísticas

aplicadas a la SG en un contexto propio de un programa de mejoramiento genético de maíz.

PALABRAS CLAVE

Valores genéticos, métodos de estimación penalizada, métodos de estimación bayesiana,

regresión de Ridge, método LASSO.

ii

ABREVIACIONES

BLR: método de regresión LASSO Bayesiano, del inglés Bayesian LASSO Regression

BLUP: mejor predictor lineal insesgado (del inglés, Best Linear Unbiased Predictor)

BRR: método de Regresión de Ridge con enfoque Bayesiano, del inglés Bayesian Ridge Regression

CMEP: Cuadrado Medio del Error de Predicción

CV: Coeficiente de Variación

GH: Grupo Heterótico

LASSO: del inglés Least Absolute Shrinkage and Selection Operator

LR: método de Regresión LASSO con enfoque clásico

MM: Marcadores Moleculares

QTL: del inglés Quantitative Trait Loci

REML: Máxima Verosimilitud Restringida, del inglés REstricted Maximum Likelihood

RR: método de Regresión de Ridge con enfoque clásico

RR-BLUP: método de Regresión de Ridge con enfoque de modelos mixtos

SMC: método de Selección de variables y ajuste por Mínimos Cuadrados

SNP: polimorfismo de nucleótidos simples, del inglés Single Nucleotide Polymorphism

iii

INDICE

1. Introducción ……………………………………………………………………………………………………… 1

2. Objetivos …………………………………………………………………………………………………………… 8

2.1 Objetivos Generales …………………………………………………………………………………………………. 8

2.2 Objetivos Específicos ………………………………………………………………………………………………. 8

3. Materiales ………………………………………………………………………………………………………… 9

3.1. Proceso de generación de datos para selección genómica ………………………………………. 9

3.2. Datos fenotípicos …………………………………………………………………………………………………….. 14

3.3. Datos de marcadores moleculares …………………………………………………………………………… 14

4. Metodología ……………………………………………………………………………………………………… 16

4.1. Metodología para el análisis de datos fenotípicos ……………………………………………………. 16

4.2. Metodología para el análisis de datos moleculares ………………………………………………….. 20

4.2.1. Introducción a los marcadores moleculares …..……………………………………………. 20

4.2.2. Análisis de los marcadores moleculares ………………………………………………………. 24

4.3. Modelos de selección genómica ………………………………………..…………………………….………. 27

4.3.1. Selección de variables y ajuste por Mínimos Cuadrados ……………………………… 31

4.3.2. Estimación Penalizada: regresión de Ridge ………………………………………………….. 32

4.3.3. Selección de Variables y Estimación Penalizada: Regresión LASSO ………………. 37

4.3.4. Evaluación de la habilidad predictiva de los modelos ………….………………………. 41

5. Resultados ………………………………………………………………………………………………………… 43

5.1. Resultados del análisis de datos fenotípicos ………………………………………….…………………. 43

5.2. Resultados del análisis de los datos de marcadores moleculares ……………………………… 45

5.3. Aplicación de métodos de selección genómica a una población y carácter ….…………… 47

5.3.1. Aplicación de Selección de variables y ajuste por Mínimos Cuadrados (SMC) 47

5.3.2. Aplicación de Regresión de Ridge clásica (RR) ……………………………………………... 50

5.3.3. Aplicación de la Regresión de Ridge BLUP (RR-BLUP) …………………………………… 52

5.3.4. Aplicación de la Regresión de Ridge Bayesiana (BRR) ………………………………….. 54

5.3.5. Aplicación de la regresión LASSO Bayesiana (BLR) ……………………………………….. 57

5.3.6. Aplicación de la regresión LASSO (LR) ………………………………………………………….. 59

5.4. Evaluación de la habilidad predictiva de los modelos de selección genómica …………… 61

6. Conclusiones ……………………………………………………………………………………………………… 66

7. Discusión …………………………………………………………………………………………………………… 72

8. Referencias ……………………………………………………………………………………………………….. 76

9. Anexo ……………………………………………………………………………………………………………….. 84

Modelos de SG para Caracteres Cuantitativos basados en MM 1

1. INTRODUCCIÓN

El mejoramiento genético vegetal o animal es la ciencia, el arte y el negocio de mejorar los

organismos para el beneficio de los seres humanos (Bernardo, 2002). Como una ciencia, el

mejoramiento se sustenta sobre el conocimiento teórico y empírico de la genética. Como un arte,

requiere juicios subjetivos en el diseño y la implementación de un programa de mejoramiento.

Finalmente, como un negocio, necesita de inversiones de tiempo y dinero en distintos recursos

tales como: técnicos, equipamiento y materiales.

La importancia relativa del arte y la ciencia en el mejoramiento ha cambiado a lo largo del

tiempo. En los comienzos del mejoramiento, la habilidad de una persona para identificar

visualmente los individuos más deseados era la única herramienta disponible. Así, la apariencia de

un individuo o de un grupo de individuos, denominada fenotipo, determinaba si el individuo

resultaba elegido (Fehr, 1987). Algunos ejemplos de caracteres fenotípicos son: la altura y el peso

de un individuo, el rendimiento en grano de un cultivo, la resistencia a enfermedades, entre otros.

A pesar de que la apariencia visual continúa siendo parte del mejoramiento, actualmente no es la

única fuente de información y es posible planear un programa de mejoramiento con información

basada en la configuración genética, o genotipo, de un individuo.

La expresión del fenotipo de un individuo depende de dos clases de factores: ambientales y

genéticos. Mientras que el fenotipo hace referencia a la apariencia o medición de un carácter, el

genotipo comprende los genes que controlan ese carácter y el ambiente, incluye todos los

factores externos que pueden influir en la expresión de esos genes. Entre los factores ambientales

se pueden mencionar: temperatura, fertilidad del suelo y el manejo del cultivo (Fehr, 1987).

Los caracteres fenotípicos pueden ser de naturaleza cualitativa o cuantitativa. Los cualitativos

son variables fenotípicas que se registran como categorías o clases, por ejemplo: coloración del

grano, color de la flor o resistencia a cierta enfermedad. En general, este tipo de carácter suele


estar controlado por uno o unos pocos genes y se los denomina caracteres simples. Por otro lado,

los caracteres cuantitativos, se distinguen por ser variables que se miden en una escala numérica

que eventualmente puede ser continua, por ejemplo, altura de una planta, rendimiento en grano,

peso de un animal, entre otros. Muchos caracteres de interés agronómico son de naturaleza

cuantitativa y se encuentran controlados por múltiples genes de efectos pequeños y por ello

reciben el nombre de caracteres poligénicos, cuantitativos o complejos (Collard et al., 2005;

Buckler et al., 2009).

Las regiones dentro del genoma que contienen genes asociados a un carácter cuantitativo se

conocen con el nombre de QTL, del inglés Quantitative Trait Loci. La localización de tales regiones

basada únicamente en la evaluación fenotípica no es posible (Falconer y Mackay, 2001). Por lo

tanto, uno de los mayores avances en el estudio de la arquitectura genética de estos caracteres

fue conducido por el desarrollo de la genómica estructural (Falconer y Mackay, 2001; Bernardo,

2002). En particular, los marcadores moleculares (MM) son una herramienta que permite

estudiar variaciones genéticas directamente al nivel del ácido desoxirribonucleico (ADN). Los MM

tienen la ventaja de no variar con el ambiente y pueden ser observados en etapas tempranas del

ciclo de vida de un individuo. Por estas razones, desde los años 1980s, los MM han sido

ampliamente utilizados y estudiados para responder en qué medida pueden optimizar esquemas

de mejoramiento genético (Bernardo y Yu, 2007).

Los MM permiten no sólo caracterizar el genoma de un individuo sino también, la

construcción de mapas de ligamiento (Collard et al., 2005). Estos mapas pueden ser utilizados

para localizar regiones del cromosoma que contienen genes que controlan caracteres simples o

complejos. Si los MM están asociados a los QTL, se dice que se encuentran en desequilibrio de

ligamiento. Por lo tanto, tanto los marcadores localizados sobre genes como los ligados a los QTL

se pueden convertir en una herramienta molecular que ayuda en el proceso de selección de los

individuos en el mejoramiento genético.


Los primeros intentos de incorporar MM al estudio de caracteres fenotípicos de interés se

basaron en la localización o mapeo de QTL (Soller y Plotkin-Hazan, 1977; Soller, 1978). El mapeo

de QTL asume que existen unas pocas regiones del genoma que contienen genes que afectan a un

carácter. El objetivo es localizar el o los QTL en el genoma y estimar la magnitud de sus efectos

sobre el carácter. Una vez identificado un QTL, se utilizan MM flanqueantes para efectuar la

selección, proceso que se denomina selección asistida por marcadores. Esta metodología generó

importantes progresos en la selección para muchos caracteres en distintas especies. No obstante,

el impacto que ha tenido en el mejoramiento genético se vio acotado puesto que la proporción de

varianza explicada por un QTL puede ser pequeña y difícil de detectar (de los Campos et al., 2013).

Además, otro factor limitante es que requiere de una gran inversión de tiempo y recursos

económicos para generar los datos que permiten emplear esta técnica.

El desarrollo de nuevos enfoques de selección asistida por marcadores ha sido alentado por la

combinación de varios hechos. En primer lugar, hay un consenso general en que muchos

caracteres suelen ser afectados por un gran número de genes de efectos pequeños y por lo tanto,

su estudio requiere la consideración de un gran número de variantes genéticas (Lorenz et al.,

2011). Por otro lado, para el mejoramiento genético de caracteres complejos en animales y

plantas, es clave predecir los valores genéticos, es decir, cuánto se desvía cada individuo respecto

del promedio de la población a la que pertenece (Crossa et al., 2010). Finalmente, el

advenimiento de tecnologías que permiten identificar grandes cantidades de MM más

rápidamente y a menor costo, ha motivado el uso de MM a gran escala en los programas de

mejoramiento (Bernardo y Yu, 2007).

Meuwissen et al. (2001) fueron los primeros en introducir las nuevas técnicas que se conocen

como métodos de selección genómica (SG) o en inglés, Genome-Wide Selection. Su trabajo,

enmarcado dentro del mejoramiento animal, propuso la incorporación de numerosos MM en los

modelos estadísticos utilizados para estimar el valor genético de un individuo. Los autores


implementaron una idea simple pero poderosa: expresar los fenotipos sobre todos los

marcadores disponibles usando un modelo lineal. La aplicación de SG consiste de dos grandes

etapas. La primera comprende el desarrollo de un modelo basado en un conjunto de individuos

para los cuales se cuenta tanto con datos fenotípicos como con datos provenientes de una alta

densidad de MM ubicados a lo largo del genoma. En la segunda etapa, se utiliza dicho modelo con

el fin de predecir los valores genéticos de otros individuos para los cuales sólo se dispone de datos

de MM (Thomson, 2014).

En la actualidad, la SG ha ganado terreno no sólo en el mejoramiento animal (VanRaden et al.,

2009) sino también en el mejoramiento vegetal (Nakaya e Isobe, 2012). Estudios de SG en

especies vegetales fueron reportados a partir del año 2007. En Piyasatian et al. (2007) se simuló la

eficiencia de la SG en una cruza de líneas endocriadas pero sin especificar ninguna especie. El

primer estudio de simulación en una especie en particular fue el de Bernardo y Yu (2007) que

consistió en la comparación de la SG y la selección asistida por marcadores en maíz (Zea mays L.),

dando evidencia de que la primera es más efectiva. Los estudios de simulación continuaron

presentándose no sólo en maíz (Mayor y Bernardo, 2009; Bernardo, 2009) sino también en otras

especies tales como palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.) y cebada (Hordeu vulgare L.) (Wong y

Bernardo, 2008; Bernardo, 2010; Zhong et al., 2009; Jannink, 2010 y Iwata y Jannikk, 2011). El

primer trabajo empírico sobre SG fue en múltiples especies: maíz, cebada y Arabidopsis thaliana

(Lorenzana y Bernardo, 2009); en todos los casos se trataba de poblaciones biparentales.

Posteriormente, se presentaron más trabajos en trigo (Triticum aestivum L.) y en maíz (Piepho,

2009; Crossa et al., 2010; Heffner et al., 2011; Guo et al., 2012).

En general, la precisión de los métodos de SG realizados en estudios empíricos para vegetales

resultó mayor que la alcanzada en el caso de animales. Adicionalmente, en la mayoría de los

trabajos en vegetales se empleó menor cantidad de marcadores. Los estudios empíricos sobre

vegetales muestran que la SG es un método con potencial para el mejoramiento vegetal y que


puede desarrollarse con tamaños de poblaciones y cantidad de marcadores que se observan en la

práctica del mejoramiento (Nakaya e Isobe, 2013).

Dada la gran cantidad de genes intervinientes en los caracteres cuantitativos, el objetivo

principal de los métodos de SG ya no es la localización y estimación de efectos de los QTL. El

propósito es incorporar la gran cantidad de datos de MM a modelos estadísticos para lograr

predecir los valores genéticos de los individuos. Tales predicciones promueven la selección de los

mejores individuos en etapas tempranas de su ciclo de vida ya que, los MM que se pueden

observar incluso antes registrar los caracteres fenotípicos. La posibilidad de evitar la observación

del fenotipo, se traduce en una significativa reducción de tiempo y costos (de los Campos et al.,

2009).

En este sentido, uno de los mayores desafíos del mejoramiento genético basado en MM es

lograr buenas predicciones del valor genético y es aquí donde los métodos estadísticos juegan un

rol crucial. El conjunto de datos disponibles para estimar el modelo de SG incluye datos

fenotípicos de distinto nivel de agrupamiento (múltiples ambientes, repeticiones, entre otros) y

datos de MM. Si bien hay distintos tipos de MM, todos ellos pueden codificarse para

incorporarlos a los modelos estadísticos como factores (variables cualitativas) o como covariables.

Además, es posible contar con datos de pedigrí de los individuos, es decir, con información acerca

de las estructuras de parentesco entre los mismos. Se propusieron varias metodologías basadas

tanto en enfoques paramétricos como semi-paramétricos, con el fin de incorporar toda la

información mencionada en los modelos estadísticos (Gianola et al., 2006).

El presente trabajo se ocupa de la primera etapa de la SG, es decir: el desarrollo del modelo.

Así, el objetivo es evaluar distintos métodos estadísticos de SG que permitan expresar un carácter

cuantitativo en función del valor genético de los individuos basado en MM. Puntualmente, se

estudiarán métodos estadísticos paramétricos que permiten predecir los valores genéticos de los

individuos en función de los MM, empleando un modelo de regresión. La ventaja de estos


métodos es que permiten detectar marcadores que afectan significativamente al carácter

fenotípico y por lo tanto posibilitan la identificación de regiones del genoma asociadas al carácter

de interés (de los Campos et al., 2009).

Sin embargo, la incorporación de una gran cantidad de MM en un modelo de regresión puede

tener efectos no deseados. El número de variables explicativas (p), correspondientes a los MM del

modelo, generalmente llega a ser tan grande que supera al número de individuos (n), afectando

las estimaciones de los parámetros. Este fenómeno es conocido como problema de

dimensionalidad.

Otra desventaja del uso de numerosos MM en el modelo de regresión es que pueden dar

origen a problemas de multicolinealidad. El fenómeno estadístico de multicolinealidad se refiere

a la presencia de asociación lineal entre las variables explicativas en un modelo de regresión. Este

problema afecta las estimaciones de los parámetros pues, induce la sobreestimación de las

varianzas de los estimadores. En particular, la multicolinealidad puede estar presente ya que los

MM más cercanos en el mapa de ligamiento se encuentran fuertemente asociados (desequilibrio

de ligamiento).

Los modelos de SG requieren la implementación de métodos estadísticos que puedan

confrontar los problemas mencionados para obtener buenas predicciones. Entre ellos se pueden

mencionar: 1) técnicas de selección de variables, 2) procedimientos de estimación penalizada y 3)

combinación de selección de variables y estimación penalizada.

Las técnicas de selección de variables, permiten elegir sólo algunos marcadores, reduciendo

de manera notable el número de variables explicativas en el modelo. No obstante, dada la gran

cantidad de MM no es posible usar métodos automáticos de selección como lo son los métodos

de selección hacia adelante y selección paso a paso. Por esta razón, en este trabajo se

implementa la selección por marcador individual y luego, se realiza la estimación del modelo por


medio del método clásico: mínimos cuadrados ordinarios. La estimación penalizada se aborda

empleando la regresión de Ridge introducida por Hoerl y Kennard (1970). Esta metodología

penaliza los coeficientes de los marcadores comprimiendo sus estimaciones hacia el valor cero.

Finalmente, la combinación de ambas estrategias, es decir: selección de variables conjuntamente

con estimación penalizada, es abordada a través del método LASSO del inglés Least Absolute

Shrinkage and Selection Operator (Tibshirani, 1996).

La tesis se encuentra estructurada en diferentes secciones. Los objetivos se plantean en la

siguiente sección mientras que en la Sección 3 se describen detalladamente los datos, cubriendo

conceptos propios de su proceso de generación dentro del programa de mejoramiento,

describiendo las poblaciones utilizadas, los datos fenotípicos y los datos moleculares disponibles.

En la Sección 4, el foco es estudiar los métodos estadísticos comenzando por aquéllos

correspondientes al análisis de datos fenotípicos y de MM separadamente; incluyendo a su vez,

conceptos introductorios de los MM para comprender el análisis realizado. Luego, en el Apartado

4.3 se presentan los distintos enfoques de los modelos de SG correspondientes al análisis

simultáneo de los datos fenotípicos y de MM; además, en dicho apartado se presentan los

métodos utilizados para evaluar la capacidad predictiva de los modelos.. Los resultados de los

análisis son presentados en la Sección 5 y finalmente, la Sección 6 resume los resultados hallados

contrastándolos con distintos antecedentes bibliográficos y planteando futuras líneas de trabajo.


2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar distintos modelos estadísticos de selección genómica que permiten predecir la

expresión fenotípica de un carácter cuantitativo en función del valor genético de los individuos

utilizando marcadores moleculares, en el contexto de un programa de mejoramiento de maíz.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudiar metodologías estadísticas que utilicen estrategias de selección de variables y/o de

estimación penalizada para superar el problema de dimensionalidad presente en los datos de

selección genómica.

Aplicar las metodologías de selección genómica a un carácter fenotípico de una población de

maíz y evaluar la habilidad predictiva en cada caso.

Comparar las metodologías de estimación de modelos de selección genómica en términos de

su habilidad predictiva utilizando múltiples poblaciones y caracteres fenotípicos.

Estudiar si la habilidad predictiva del modelo depende de factores tales como el carácter

fenotípico, y características de la población.


3. MATERIALES

Los distintos métodos de SG se aplicaron a un conjunto de datos proveniente de un programa

de mejoramiento de maíz establecido en Estados Unidos y perteneciente a la compañía

multinacional Monsanto. Un programa de mejoramiento de maíz sigue diferentes esquemas

compuestos por procedimientos multietápicos a lo largo de varios años entre los cuales se puede

implementar métodos de SG. A continuación se presentan: 1) una breve descripción de los

procedimientos involucrados en la generación de los datos a los cuales se aplicaron los métodos

de SG en este trabajo, 2) información propia de los datos fenotípicos observados y 3) descripción

los datos de MM con que se trabajó.

3.1. Proceso de generación de datos para selección genómica

El principal objetivo de un programa de mejoramiento genético de plantas es la generación y

selección de nuevas combinaciones de genes para crear genotipos con un carácter fenotípico que

supera a los genotipos ya existentes, en un conjunto objetivo de ambientes (Chapman et al.,

2003). En el caso particular del maíz, la base de los programas de mejoramiento genético es el

desarrollo de líneas endocriadas y la evaluación del desempeño de los híbridos que se originan al

cruzar esas líneas (Hallauer et al., 1988). A continuación se describen ambos procesos.

Una línea pura o endocriada de maíz se define como una entidad genéticamente estable, que

puede producirse a través de repetidas auto-fecundaciones (Bernardo, 2002). Por otro lado, un

híbrido puede producirse por medio de: la cruza de dos líneas (híbrido simple), o de una cruza

simple con otra línea (híbrido triple) o cruzando dos híbridos simples (hibrido doble) (Bernardo,

2002). La generación originada de la cruza de dos líneas (por ejemplo línea A y línea B) se

simboliza como F1. Si cada una de las plantas F1 es auto-fecundada, se obtiene lo que se

Modelos de SG para Caracteres Cuantitativos basados en MM

denomina F2. Este proceso puede continuarse repetidamente, en términos generales

hasta lograr genotipos

línea endocriada (Figura 3.

El conjunto de individuos de una misma generación se denomina

suele hablar de poblaciones F2,

generaciones. A su vez, las poblaciones están compuestas por

conjunto de individuos

ejemplo, un planta F2 tiene

F3, todas esas plantas F3 conforman una familia por provenir de la misma planta F2.

A) Desarrol lo d e un a lendocr iada

Parental A

Nueva Línea Endocriada

Figura 3.

1°

auto

-fec

un

dac

ión

(n-1

)° a

uto

-fec

un

dac

ión


denomina F2. Este proceso puede continuarse repetidamente, en términos generales

Fn altamente homocigotos y de esta manera se logra desarrollar una nueva

(Figura 3.1.1, parte A).

El conjunto de individuos de una misma generación se denomina

hablar de poblaciones F2, …, Fn para hacer referencia a las

A su vez, las poblaciones están compuestas por familias

conjunto de individuos que tiene el mismo origen en la generación inmediatamente anterior

ejemplo, un planta F2 tiene una espiga con semillas que darán origen a


Desarrol lo d e un a l ín ea endocr iada

Parental A Parental B

F1

F2 B) Desarrol lo d e cruza

…

Fn Nueva Línea Endocriada

Probador

=

Figura 3.1.1 - Esquema simplificado de mejoramiento genético en

cruzamiento

cruzamiento

10

denomina F2. Este proceso puede continuarse repetidamente, en términos generales, n veces

altamente homocigotos y de esta manera se logra desarrollar una nueva

El conjunto de individuos de una misma generación se denomina población. Por lo tanto, se

referencia a las poblaciones de distintas

familias que representan un

que tiene el mismo origen en la generación inmediatamente anterior. Por

origen a una familia de individuos


Desarrol lo d e cruzamien to d e pru eb a

Evaluación de datos fenotípicos

↓

Híbrido

enético en maíz


Existe un procedimiento muy común para evaluar los individuos de una población en cultivos

de polinización cruzada como el maíz. El mismo consiste en realizar cruzamientos con una línea

denominada probador, diferente de las líneas parentales que dieron origen a la población (Figura

3.1.1, parte B). De esta manera, se obtiene un híbrido por cada familia de la población original y a

cada uno de esos híbridos se los denomina cruzamiento de prueba (Bernardo, 2002).

Generalmente, las líneas parentales A y B son del mismo grupo heterótico mientras que el

probador pertenece a un grupo heterótico diferente. Un grupo heterótico es un conjunto de

líneas que tienen desempeño similar cuando se cruzan con líneas de otro grupo heterótico

(Bernardo, 2002).

Específicamente, los materiales con que se contó en este trabajo consistieron de 20

poblaciones F3, 10 poblaciones por cada uno de dos grupos heteróticos utilizados en el programa:

GH1 y GH2 (Tabla 3.1.1). Cada población tuvo como origen la cruza de dos parentales

(denominados L01 a L32) y el cruzamiento de prueba fue realizado con un determinado probador

(denominados P01 a P12). El tamaño de las poblaciones varió entre 76 y 186 familias.

La Figura 3.1.2 presenta un esquema del programa de mejoramiento de maíz que genera los

datos utilizados para estimar los modelos de SG en una población F3. El proceso se inició con la

cruza de dos parentales (A y B) de un mismo GH, de donde se cosechó la semilla que conforma la

F1. Esa semilla se sembró y las plantas F1 fueron auto-fecundadas para obtener semilla que dio

origen a la población F2. Nuevamente, se procedió a la auto-fecundación, en esta instancia, de las

plantas F2. Cada espiga individual de la población F2 dio origen a semillas F3. Las semillas F3 de

una espiga individual conformaron una familia F3, compartiendo el mismo origen: la planta F2 de

donde proviene esa espiga. Por lo tanto, se obtuvieron distintas familias F3: familia_1, familia_2,

…, familia_n.


Tabla 3.1.1 – Descripción de las poblaciones F3

Población Grupo

Heterótico Origen de la

Población Probador

No. Familias

No. SNPs Evaluados

1 GH1 L01/L02 P01 181 99

2 GH1 L03/L04 P02 134 86

3 GH1 L05/L06 P03 136 92

4 GH1 L07/L01 P04 143 95

5 GH1 L01/L08 P05 184 94

6 GH1 L09/L10 P04 90 97

7 GH1 L11/L12 P04 186 100

8 GH1 L13/L14 P04 179 102

9 GH1 L15/L09 P04 182 89

10 GH1 L16/L17 P03 181 90

11 GH2 L18/L19 P06 161 86

12 GH2 L20/L21 P07 132 80

13 GH2 L22/L23 P08 177 70

14 GH2 L24/L25 P09 178 101

15 GH2 L26/L27 P06 158 92

16 GH2 L26/L23 P06 157 96

17 GH2 L28/L29 P08 184 103

18 GH2 L19/L30 P10 159 81

19 GH2 L31/L29 P11 182 101

20 GH2 L32/L18 P12 73 100

Las familias F3 fueron la unidad de estudio de este trabajo, es decir, para cada familia se

obtuvo un dato fenotípico y otro molecular. Con tal finalidad, de cada familia F3 se extrajeron dos

muestras de semilla, una que se envió al laboratorio para obtener los datos de MM y otra que se

utilizó para el desarrollo de los cruzamientos de prueba (además, se destinó semilla para

continuar con las auto-fecundaciones y así desarrollar líneas endocriadas, pero se trata de una

parte del proceso que excede el alcance de este trabajo). En el laboratorio, se realizó la extracción

de ADN de la muestra para cada familia y se obtuvieron los genotipos de un cierto número (p) de

marcadores.

Por otro lado, para el estimar el modelo de SG, fue necesario contar con datos fenotípicos de

las familias a través del desarrollo del cruzamiento de prueba que implicó cruzar cada familia F3

con un probador (P). Los híbridos obtenidos de este cruzamiento de prueba fueron sembrados en


q ambientes y se observa

analizados a través de un modelo estadístico

familia (valor genético

compuesta por el genotipo de los

la población.

Figura 3.1.2 – Esquema de mejoramiento de maíz y generación de datos fenotípicos y de MM necesarios


ambientes y se observaron los caracteres fenotípicos de interés. Los dato

analizados a través de un modelo estadístico (Sección 4.1) para resumirlos a un único dato por

(valor genético, BLUPs). Finalmente, la matriz de datos para la población F3

compuesta por el genotipo de los p marcadores y valor genético de cada una de las

Esquema de mejoramiento de maíz y generación de datos fenotípicos y de MM necesarios

para estimar el modelo de SG en una población F3.

13

os datos fenotípicos fueron

para resumirlos a un único dato por

. Finalmente, la matriz de datos para la población F3 estuvo

de cada una de las n familias de

Esquema de mejoramiento de maíz y generación de datos fenotípicos y de MM necesarios

para estimar el modelo de SG en una población F3.


3.2. Datos fenotípicos

La caracterización fenotípica de las poblaciones se realizó para cada población por separado,

siguiendo un diseño de bloques completos aleatorizados. Los bloques se corresponden con

ambientes y estos ambientes consistieron en localidades de Estados Unidos, evaluadas en mismo

año (que varía entre 2002 y 2008 según la población). Cada población fue evaluada en 4 a 8

ambientes contando con una sola repetición por ambiente. En todos los casos se midieron los

siguientes caracteres: rendimiento en grano medido en bushel/acre (Rendimiento, bu/ac), peso

hectolítirico medido en libras por bushel (Peso Hectolítrico, lb/bu) y porcentaje de humedad del

grano a cosecha (Humedad, %). Hubo casos de familias para las cuales no se encontró disponible

la evaluación fenotípica en la totalidad de los ambientes en que se pretendían evaluar.

3.3. Datos de marcadores moleculares

Los datos de MM para cada población fueron el resultado de implementar una estrategia de

múltiples etapas para reducir el costo total de los estudios de SG. La misma consistió en obtener

genotipos de una alta densidad de MM para un conjunto principal de líneas endocriadas y de

menor densidad a todas las poblaciones de individuos derivadas de ese conjunto principal (He et

al., 2015). Así, los datos moleculares para cada población, fueron el resultado de varias etapas. En

primer lugar, para las líneas parentales (L01-L32) se obtuvieron genotipos de 2.911 marcadores de

polimorfismo de nucleótidos simples (SNP del inglés, Single Nucleotide Polymorphism)

distribuidos a lo largo de todo el genoma de maíz. Para mantener la confidencialidad de los datos,

los cromosomas fueron codificados aleatoriamente con letras y, con base en la localización en el

mapa de ligamiento, a los MM se les dio un orden o posición dentro del cromosoma.


Por otro lado, y de acuerdo al esquema descripto en la Figura 3.1.2, para las poblaciones

también se obtuvieron datos moleculares pero para un número menor de SNPs, como se detalla

en la Tabla 3.1.1. Este subconjunto de SNPs se caracterizó por ser informativo o polimórfico para

los parentales de la población, es decir, que los parentales eran diferentes para ese marcador (si

los parentales fueran iguales para un MM, toda su descendencia no presentaría variabilidad para

ese MM y no arrojaría información para asociar a el carácter fenotípico sobre el cual se desea

hacer selección).

El tercer paso realizado por la empresa surge por haber implementado una estrategia para

reducir el costo total de los estudios de SG. La estrategia consistió en obtener genotipos de una

alta densidad de MM para un conjunto principal de líneas endocriadas y con menor densidad para

todas las poblaciones de individuos derivadas de ese conjunto principal (He et al., 2015). Luego,

para incrementar la cobertura del genoma alcanzada con los MM se efectuó imputación de MM

en las poblaciones. Este proceso de genotipificación e imputación fue recomendado por Jacobson

et al. (2015) en poblaciones biparentales de maíz provenientes del mismo programa de

mejoramiento de Monsanto del cual se obtuvieron los datos del presente trabajo. El método de

imputación que empleó la compañía fue el de regresión basada en los marcadores flanqueantes o

mapeo por intervalos propuesto por (Haley y Knott, 1992) y condujo a un número total de 2.800

MM, aproximadamente, en cada población.


4. METODOLOGÍA

La aplicación de métodos de SG involucró el análisis de datos fenotípicos y de MM. Así, en

esta sección se presentan en primer lugar, las metodologías propias del análisis de los datos

fenotípicos. Luego, se desarrollan los métodos para el análisis de los datos de MM. Finalmente, se

plantean los modelos de SG que combinaron ambas fuentes de información, se estudian distintos

enfoques para llevar a cabo su estimación y se describe la estrategia para evaluar y comparar su

habilidad predictiva a través de la aplicación a los datos del programa de mejoramiento de maíz.

4.1. Metodología para el análisis de datos fenotípicos

El mejoramiento genético, tanto animal como vegetal, tiene sus bases en la ciencia de la

genética cuyo principal rol es establecer los factores más importantes que afectan a diferentes

caracteres fenotípicos. Una vez que los factores principales han sido reconocidos, las

investigaciones se enfocan en la identificación de genes que tienen efectos secundarios

(Siegmund y Yakir, 2007).

En particular, la genética cuantitativa es la ciencia que se dedica al estudio de la herencia de

los caracteres de tipo cuantitativo en los individuos y las diferencias que existen entre ellos

(Falconer y Mackay, 2001). El conocimiento de la herencia de esas diferencias es de fundamental

importancia para el mejoramiento genético; de hecho esto impulsó su desarrollo. La base teórica

de la genética cuantitativa se estableció alrededor de 1920 con los trabajos de Fisher (1919),

Wright (1921) y Haldane (1932). La premisa de la cual se parte es que la herencia de las

diferencias cuantitativas se deben a causas genéticas y a que la expresión del genotipo en un

determinado fenotipo puede modificarse por acciones no genéticas (Falconer y Mackay, 2001).

Dicho de otra manera, la variación de los fenotipos es influenciada tanto por una componente


genética propia del individuo como por el ambiente al que el individuo se encuentra expuesto.

Este concepto puede verse reflejado en un modelo estadístico que se plantea a continuación.

Asumiendo que se observan n individuos en q ambientes y simbolizando �� al carácter

observado para el i-ésimo individuo (� = 1, 2,… , �) en el j-ésimo ambiente (� = 1, 2, … , �), el

modelo tiene la forma:

w�� = μ + g� + a� + δ�� (4.1.1)

dondeμ es la media general, g� es el efecto genotípico propio del i-ésimo individuo, a� es el efecto

del j-ésimo ambiente y δ�� es el error aleatorio. Se asume que los efectos de ambiente (a�),

genotipo (g�) y el error (δ��) son aleatorios, independientes y siguen una distribución normal con

media cero y varianzas σ�� , σ�

� y σ��, respectivamente. El modelo puede extenderse, incorporando

un término para contemplar la interacción entre genotipo y ambiente; sin embargo, con los

materiales disponibles para este trabajo no se puede evaluar dicho efecto.

El modelo de la Ecuación 4.1.1 se puede expresar en notación matricial como sigue:

� = �� + �� + � (4.1.2)

donde � es el vector de los datos fenotípicos, � es el vector de efectos fijos (en este caso,

simplemente la media general), � es la matriz de incidencia correspondiente a los efectos fijos, �

es un vector de efectos aleatorios (genotipo y ambiente), � es la matriz de incidencia

correspondiente a los efectos aleatorios y � es el vector de errores aleatorios. Además, el

supuesto sobre las componentes aleatorias es equivalente a la expresión:

��~N ��

�� , �

� ��

�� (4.1.3)

siendo� = �σ�� 0

0 σ�� y � = σ�

�� . Así, la varianza del vector de datos resulta:

V = V(�) = ��′ + � (4.1.4)


Searle (1992) demuestra que, siendo ( )� la inversa generalizada de una matriz, el mejor

estimador lineal insesgado de � viene dado por:

�� = (�′��)��′�� (4.1.5)

Mientras que el mejor predictor lineal insesgado (BLUP, del inglés Best Linear Unbiased

Predictor) de u resulta:

�� = �� − �� (4.1.6)

Patterson y Thompson (1971) introdujeron el método de estimación por máxima

verosimilitud restringida (REML del inglés, REstricted Maximum Likelihood) que incluye un

ajuste en los grados de libertad usados para estimar los efectos fijos ya que generalmente, las

componentes de varianza también son parámetros desconocidos que se desean estimar. En

presente trabajo, se aplicó este método de estimación usando el paquete estadístico R (R Core

Team, 2013) y empleando la función lmer de la librería lme4 (Bates, et al., 2013).

Para evaluar la bondad del ajuste del modelo, se calculó el R2 condicional de Nakagawa y

Schielzeth (2013) que contempla tanto los efectos fijos como los efectos aleatorios de un modelo.

En el caso del modelo de la Ecuación 4.1.1, todos los efectos son aleatorios y los errores se

asumen distribuidos normalmente, el R2 condicional tiene la siguiente forma:

R� =��

�

��

�� (4.1.7)

Del modelo se pueden extraer distintas estimaciones de particular interés e interpretación en

la genética cuantitativa. Por un lado, el efecto genotípico (g), conocido como el valor genético de

un individuo, representa el valor fenotípico promedio para un cierto genotipo si éste se pudiera

estudiar sobre el universo de todos los ambientes posibles a los cuales los individuos podrían

estar expuestos. Asimismo, se suele hacer referencia con el término de valor genético al desvío de

un individuo respecto la media de todos los individuos. Lograr buenas estimaciones de los valores


genéticos de los individuos para un carácter poligénico observable ayuda a realizar la selección de

los mejores individuos o genotipos dentro de una población, camada o grupo determinado (de los

Campos et al., 2009).

Por otro lado, la estimación de las componentes de varianza de las distintas fuentes de

variabilidad subyacentes en el fenotipo se transforma en otra de las herramientas utilizadas en

genética cuantitativa (Lynch y Walsh, 1998). La heredabilidad de un carácter fue definida

originalmente por Lush (1943) como la proporción de varianza fenotípica entre los individuos de

una población explicada por efectos genéticos heredables. En la actualidad, este concepto se

conoce como heredabilidad en sentido estricto y se simboliza ℎ�. Del mismo modo, surgieron

distintas definiciones o tipos de heredabilidad; en este trabajo se empleó el concepto de

heredabilidad de las medias de las familias a través de ambientes (Holland et al., 2003) cuya

estimación viene dada por la siguiente expresión:

h�� =��

��

� �⁄ (4.1.8)

siendo σ�� la componente de varianza correspondiente a los valores genéticos, σ�

� la componente

de varianza propia de los errores experimentales y q el número de ambientes.

En el presente trabajo, en cada una de las 20 poblaciones de maíz y para cada uno de los

caracteres fenotípicos rendimiento en grano (bu/ac), peso hectolítrico (lb/bu) y humedad del

grano a cosecha (%) se ajustó el modelo lineal de la Ecuación 4.1.1 con efectos aleatorios de

ambiente y de genotipo. Notar que, los individuos en el modelo de la Ecuación 4.1.1

corresponden a familias de una población. El valor genético (g�), fue utilizado en las etapas

posteriores como variable respuesta en los modelos de SG.


4.2. Metodología para el análisis de datos moleculares

4.2.1. Introducción a los marcadores moleculares

La variación genética en individuos se puede presentar en distintos niveles. En uno de los

extremos están las variantes genéticas manifestadas con efectos fácilmente distinguibles en el

fenotipo (caracteres cualitativos) como por ejemplo, el color de las flores. El otro extremo ocurre

cuando una gran parte de la variación entre individuos no da lugar a clases fenotípicas

naturalmente definidas (caracteres cuantitativos) por ejemplo, el número de granos por espiga. El

supuesto biológico detrás de la variabilidad de los caracteres cuantitativos es que su expresión

está regulada por una gran cantidad de componentes genotípicos y sus interacciones con el

ambiente. Luego, para comprender las variaciones genéticas detrás de los caracteres cuantitativos

se emplean técnicas como los MM que permiten captar las diferencias genéticas de los individuos

en el ADN para luego, estudiar la expresión de estos genotipos en distintos ambientes.

El ADN contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los

organismos eucariotas, muchos microorganismos y algunos virus. El papel principal de la molécula

de ADN es el almacenamiento a largo plazo de información necesaria para construir los

componentes de las células y las proteínas esenciales para la estructura y función de organismos.

En una noción simplificada, un gen es una secuencia distintiva de ADN que contiene todas las

instrucciones para sintetizar una proteína. En los organismos que se reproducen sexualmente

(como plantas y animales), la reproducción involucra la unión de dos gametos femenino y

masculino derivados del mismo parental o de diferentes parentales (Fehr, 1987). Por lo tanto, hay

al menos dos copias de cada gen (si tienen exactamente dos copias se los conoce como

organismos diploides) y cada copia proviene de cada uno de los organismos progenitores.

Las variaciones o secuencias alternativas de ADN son llamadas alelos y ellos producen

diferencias en la cantidad o tipo de proteína producida por un gen específico. Por ejemplo, si se


asume que existen dos alelos para

individuo puede hereda

pueden dar en el individuo

(genotipos homocigoto

El ADN se encuentra organizado en estructuras dentro de la célula llamadas

(Figura 4.2.1). Una posición específica dentro del cromosoma de llama

múltiples posiciones se denominan

estructura del ADN de doble

adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Químicamente, se ha demostrado que en

cualquier molécula de ADN, el nucleótido A solamente forma pa

forma par con la G.

Figura


dos alelos para un gen (organismo diploide), simbolizados

heredar exactamente dos alelos, las distintas combinaciones de alelos que se

individuo definen el genotipo para ese gen y sus valores posibles son: AA, BB

homocigotos) o AB/BA (genotipos heterocigotos).

ADN se encuentra organizado en estructuras dentro de la célula llamadas

Una posición específica dentro del cromosoma de llama

ltiples posiciones se denominan loci. Watson y Crick (1953) propusieron

estructura del ADN de doble hélice que está compuesto por pares de cuatro nucleótidos o bases:


cualquier molécula de ADN, el nucleótido A solamente forma par con la base T y la

Figura 4.2.1 – Esquema de ADN dentro de una célula (CRI México, s. f.)

21

, simbolizados como A y B y que un

ntas combinaciones de alelos que se

y sus valores posibles son: AA, BB

ADN se encuentra organizado en estructuras dentro de la célula llamadas cromosomas

Una posición específica dentro del cromosoma de llama locus mientras que

propusieron un modelo para la

que está compuesto por pares de cuatro nucleótidos o bases:


r con la base T y la base C solo

(CRI México, s. f.)


Las variaciones de las secuencias de ADN se pueden detectar utilizando una amplia variedad

de técnicas (Lynch y Walsh, 1998) desde la secuenciación del ADN, es decir, la determinación de la

secuencia de nucleótidos, hasta caracterizaciones menos precisas (más rápidas y menos costosas)

logradas a través de distintos tipos de MM.

Uno de los MM más utilizados en la actualidad es denominado SNP. Los SNPs, como sugiere el

nombre, identifican la variación de nucleótidos en un locus o posición específica en la secuencia

de nucleótidos del genoma. Dada la forma en que se disponen los pares de nucleótidos (A-T,C-G),

en la práctica los SNPs son típicamente bialélicos, es decir, tienen dos alelos posibles A o T por un

lado o bien, C o G por otro. Por lo tanto, los genotipos de un SNP pueden ser AA, AT/TA y TT o

bien CC, CG/GC y GG. Generalmente, estos genotipos se codifican con números, -1, 0 y 1

representando con 0 los casos heterocigotos y con -1/1 los casos homocigotos. La estructura de

los datos de MM se ejemplifica a continuación con 10 MM y 5 familias de una población:

Familia SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 SNP5 SNP6 SNP7 SNP8 SNP9 SNP10

1 1 -1 -1 -1 0 0 0 0 1 -1

2 -1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0

3 0 0 1 0 0 0 0 0 -1 1

4 0 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 -1 1

5 -1 1 1 1 0 0 0 0 -1 1

Cuando los loci se heredan de manera independiente unos con otros, es decir, no existe

asociación entre los loci, se dice que se produjo recombinación genética. Sin embargo, cuando

dos o más loci están cercanos dentro de un cromosoma, estos pueden heredarse juntos y a este

fenómeno de asociación se lo conoce como ligamiento.

La Figura 4.2.2 representa gametos recombinantes y no recombinantes originados de auto-

fecundar una F1. Específicamente, se parte de dos líneas endocriadas (Parental 1 y 2), que por su

estabilidad genética tienen genotipos homocigotos para los dos marcadores observados


(Marcador 1 y 2). Se asume que p

decir, los genotipos de ambos marcadores difieren entre los

parentales se obtiene la F1

F1 produce gametos recombinantes, es decir, aquéllos en donde el marcador 1 y el 2 se

heredaron de manera independiente

Fr) se producen gametos no recombinantes, donde hubo ligamiento entre los marcadores.

Figura 4.2.2 – Gamet

Sin embargo, con un marcador

considerando el Marcador 1

individuos. Luego del primer ciclo de auto

genotipos heterocigotos y

heterocigotos, 25% homocigoto

restante homocigotos

ciclo de auto-fecundación, las frecuencias esperadas para la población F3 son: 37.5% para los

genotipos homocigotos

Los MM permiten no sólo describir el genoma de un individuo sino también la construcción

de mapas de ligamiento

mapas dan un ordenamiento a los marcadores y pueden ser utilizados para localiz

cromosoma que contienen genes que controlan caracteres de interés. La


Se asume que para los parentales estos marcadores resultan polimórficos, es

decir, los genotipos de ambos marcadores difieren entre los parentales

parentales se obtiene la F1, que es heterocigota en ambos marcadores


heredaron de manera independiente, con una frecuencia Fr. Por otro lado, con una frecuencia (1

) se producen gametos no recombinantes, donde hubo ligamiento entre los marcadores.

Gametos parentales y recombinantes con una frecuencia de recombinación Fr.

Sin embargo, con un marcador no se identifica cada gameto, se registran

arcador 1 del ejemplo, la F1 presenta genotipos heterocigotos para todos los

uego del primer ciclo de auto-fecundación, se espera que

heterocigotos y homocigotos con frecuencias esperadas

, 25% homocigotos para el genotipo correspondiente con

para el genotipo del Parental 2 (Lynch y Walsh, 1998). Luego del segundo

fecundación, las frecuencias esperadas para la población F3 son: 37.5% para los

genotipos homocigotos correspondientes con cada parental y 25% para el

permiten no sólo describir el genoma de un individuo sino también la construcción

mapas de ligamiento, con base en el estudio de la ocurrencia de recombinaciones

mapas dan un ordenamiento a los marcadores y pueden ser utilizados para localiz

cromosoma que contienen genes que controlan caracteres de interés. La

23

ara los parentales estos marcadores resultan polimórficos, es

parentales. De la cruza de ambos

marcadores. La auto-fecundación de la


. Por otro lado, con una frecuencia (1-

) se producen gametos no recombinantes, donde hubo ligamiento entre los marcadores.

con una frecuencia de recombinación Fr.

registran los genotipos. Así,

, la F1 presenta genotipos heterocigotos para todos los

fecundación, se espera que la población F2 tenga

frecuencias esperadas: 50% de genotipos

correspondiente con el Parental 1 y el 25%

Walsh, 1998). Luego del segundo

fecundación, las frecuencias esperadas para la población F3 son: 37.5% para los

y 25% para el genotipo heterocigoto.

permiten no sólo describir el genoma de un individuo sino también la construcción

l estudio de la ocurrencia de recombinaciones (Fr). Estos

mapas dan un ordenamiento a los marcadores y pueden ser utilizados para localizar regiones del

cromosoma que contienen genes que controlan caracteres de interés. La distancia (d) en los


mapas de ligamiento se calcula usando funciones de mapeo y la unidad de medida es el

centiMorgan (cM). Una de las funciones de mapeo más utilizada es la de Haldane (1919) y viene

dada por la expresión: � = −0,5��(1 − 2��). Para más detalles de construcción de mapas de

ligamiento se recomienda Lynch y Walsh (1998) y Siegmund y Yakir (2007).

4.2.2. Análisis de los marcadores moleculares

Una forma de resumir la información de un MM observado en una población, dada su

naturaleza cualitativa, es calcular las frecuencias genotípicas, es decir, contabilizar cuántas

familias de la población F3 tienen cada uno de los tres posibles genotipos para un SNP codificados

como: -1, 0, 1. El estudio de estas frecuencias fue ejecutado en el programa estadístico R,

permitiendo realizar un control de calidad para luego poder emplear estos datos en los modelos

de SG. Si un marcador presenta un genotipo con una frecuencia mayor o igual al 90%, ese

marcador es excluido por comportarse como un marcador monomórfico y por lo tanto no

informativo. Los marcadores de las líneas parentales también se utilizan para describir cada

población en términos de la similaridad entre sus parentales. En particular se considera la

proporción de alelos compartidos entre las líneas. Si x�� representa el genotipo de una línea i para

el marcador k codificado con -1, 0 o 1, la similaridad entre una línea i y otra línea i’ usando p

marcadores viene dada por la siguiente expresión:

S�,�� = 1 −∑ ��

= 1 −∑ ��/��

� (4.2.1)

Notar que si se comparan dos genotipos homocigotos diferentes es decir, x�� = 1 y x�� = −1, el

valor �� = 2/2 = 1 significa que la proporción de alelos en que difieren ambas líneas es 1, en

otras palabras, no tienen ningún alelo común y la similaridad resulta igual a 0. Si x�� = 1 o -1 y

x�� = 0, �� = 1/2 = 0.5, es decir, el genotipo heterocigoto y un homocigoto difieren en la mitad

de los alelos. Por último, si se comparan dos genotipos iguales, �� = 0, con lo cual los individuos


no difieren en ningún alelo para ese marcador. Es importante notar que ��,�� = 1, indica completa

similaridad mientras que ��,�� = 0 sería el extremo en que las líneas no tienen ningún alelo

común.

La efectividad de la SG depende fuertemente de la densidad de marcadores requerida para

lograr las predicciones deseadas y del costo de obtener genotipos con esa densidad de MM

(Riedelsheimer y Melchinger, 2013). Los paneles de MM de alta (disponibles para las líneas

parentales) y baja densidad (disponibles para las poblaciones) fueron combinados aplicando un

método de imputación. Para cada una de las poblaciones se mide el número de SNPs con que se

evaluó genotípicamente cada población, el número de MM final luego de la imputación realizada

por Monsanto y se calcula la distribución de MM por cromosoma. Además, se calculó el

coeficiente de variación (CV) del número de MM por cromosoma para estudiar la variabilidad en

el número de MM por cromosoma.

El método de imputación para los datos de MM fue elegido por Monsanto y se trata del

método de regresión de Haley y Knott (1991) basado en la información del mapa de ligamiento y

de los marcadores disponibles. Si bien la descripción del método en si mismo excede a los

objetivos del presente trabajo, a continuación se presenta un ejemplo que dan los autores en su

publicación para comprender los principales conceptos detrás de la imputación.

Se asume que se desea imputar un marcador Z que se encuentra localizado entre dos

marcadores A y B codominantes, es decir, se pueden distinguir los genotipos heterocigotos.

Además, se asume que se desea realizar tal imputación en la generación F2 de una cruza de dos

líneas parentales que llevan alelos diferentes para los tres marcadores cuyos genotipos pueden

simbolizarse: A1A1Z1Z1B1B1 para el parental 1 y A2A2Z2Z2B2B2 para el parental 2.

La frecuencia de recombinación entre A y Z se simboliza FrA, entre Z y B, FrB y finalmente,

entre A y B: Fr. La frecuencia de recombinación puede calcularse con base en la distancia que


existe entre los marcadores utilizando el mapa de ligamiento y la función de mapeo de Haldane

(1919) que convierte las distancias medidas en cM a frecuencia.

Las frecuencias esperadas de cada genotipo pueden derivarse con base en las frecuencias de

recombinación. El gameto A1Z1B1 tiene una frecuencia esperada de (1- FrA)(1- FrB)/2 (los

marcadores A y Z no recombinan y tampoco lo hacen los marcadores Z y B) mientras que el

gameto A1Z2B1 tiene una frecuencia esperada de FrAFrB/2 (recombinan A con Z y Z con B). En

términos de genotipos, la frecuencia esperada del genotipo homocigoto A1A1B1B1 en la F2 es de

0.25(1- Fr)2 y la frecuencia esperada de los tres genotipos posibles para el marcador Z cuando los

marcadores flanqueantes tienen ese genotipo A1A1B1B1 son: 0.25*(1- FrA) 2 (1- FrB) 2, 0.25*2*(1-

FrA)(1- FrB) FrAFFrB y 0.25* FrA2FrB

2 para los genotipos Z1Z1 , Z1Z2 y Z2Z2, respectivamente. Así, el

genotipo más probable será el valor con que se impute el marcador Z.


4.3. Modelos de selección genómica

En esta sección el foco es investigar diferentes estrategias para desarrollar el modelo de SG

que incorpore los MM para predecir el valor genético (g) de los individuos. En el marco de la SG se

asume que hay múltiples QTL que afectan al carácter y no se persigue el objetivo de identificarlos.

En los modelos que se presentan a continuación se habla, en términos generales, de individuos

pero al aplicarlos a los materiales de este trabajo se debe notar que se trata en realidad de

familias de una población F3.

Generalmente, por razones computacionales no se estiman simultáneamente los efectos

ambientales y de genotipo usando los MM sobre un carácter. Por lo tanto, el desarrollo del

modelo de SG se realiza en dos etapas. La primera consta del análisis de datos fenotípicos

detallado en el Apartado 4.1, ajustando el modelo de la Ecuación 4.1.1, donde se consideran los

efectos propios del ambiente. Luego, como resultado de ese análisis se toman las predicciones

(BLUP) de los valores genéticos (g�) para ser utilizados como variable respuesta de modelos de SG

que consideran los MM. Por simplicidad, las predicciones de los valores genéticos (g�) en el rol de

variable respuesta del modelo de SG, son referenciadas simplemente como valor observado y se

simbolizan con y.

Partiendo del caso más simple, se modela la relación causal entre el valor genético y un único

MM a través de un modelo lineal de regresión simple. Específicamente, se asume que se tienen n

individuos para los cuales se dispone del genotipo de un marcador bialélico. Para un individuo i-

ésimo (i = 1, 2, … , n), se denota como (y�, x��) al par de datos valor genético y genotipo del

marcador respectivamente. Además, dado que se trata de un marcador bialélico, se supone que

los genotipos son codificados en -1, 0 y 1 (siendo 0 el genotipo heterocigoto) y por lo tanto el

modelo queda expresado como a continuación:

y� = β� + β�x�� + ε� (4.3.1)


donde β�, β� son los parámetros a estimar correspondientes a un término constante y al

coeficiente de regresión del MM y ε� es un término de error que usualmente se asume que tiene

una distribución normal con media 0 y varianza σ�.

Una forma clásica de estimar los parámetros de este modelo es a través del método de

mínimos cuadrados. El mismo determina las estimaciones de los parámetros de manera que la

suma de los residuos al cuadrado sea mínima, es decir:

�β��, β�� = argmin∑ (y� − y��)��

�� = argmin∑ �y� − β�� − β��x��

�� (4.3.2)

El modelo de la Ecuación 4.3.1 corresponde a un modelo para un único marcador, sin

embargo, se sabe que los caracteres cuantitativos dependen de múltiples QTL y se suele utilizar

un gran número de MM. Así, el modelo puede extenderse para incluir p marcadores de la

siguiente manera:

y� = β� + β�x�� + β�x�� +⋯+ β�x�� + ε� = ∑ β�x�� + ε� = �´�� + ε� (4.3.3)

donde �´� = �1, x��, x��, … , x�� es el vector de variables explicativas que incluye un 1 para

incorporar una constante al modelo y los valores x�� para � = 1,… , � reflejan los genotipos para

los MM (codificados como -1, 0 o 1) correspondientes al individuo i-ésimo, y

� = �β�, β�, β�, … , β��′ es el vector de coeficientes que contiene la constante del modelo (��) y

los coeficientes de regresión de cada marcador (��, � = 1,… , �). En forma matricial, el modelo

puede expresarse como:

� = �� + � (4.3.4)

donde � = (y�, y�,… , y�)′ es el vector correspondiente a la variable respuesta (específicamente,

en los análisis de este trabajo se trata de las predicciones de los valores genéticos y� = g��),

� = {x��}�×(��) es la matriz de variables explicativas y � = (ε�, ε�,… , ε�)′ es el vector de

términos de error.


En este caso, los parámetros también pueden estimarse a través de mínimos cuadrados, es

decir, obteniendo estimaciones de los parámetros del modelo de la Ecuación 4.3.3 que logren

minimizar la suma de los cuadrados de las diferencias entre el valor observado y el esperado, es

decir:

�� = argmin∑ (y� −y��)��

�� = argmin∑ �y� −�´��

�� = argmin�� − �� (4.3.5)

siendo ‖∙‖ la norma del vector que viene dada por la expresión ‖�‖ = �∑z��. Sobre la base

Ecuación 4.3.4 del modelo de regresión, si existe (�′�)��, la estimación del vector de parámetros

queda expresada como:

�� = (�′�)��′� (4.3.6)

Se puede demostrar que la varianza del estimador resulta igual a Var�� = (�′�)��σ�. Por lo

tanto, la varianza del estimador de un coeficiente de regresión tiene la forma�� =

��, � = 0, 1, … �, siendo �� el k-ésimo elemento diagonal de la matriz � = (�′�)�� de

dimensión (p+1) x (p+1). Es decir, la varianza se encuentra afectada por el número de MM (p) y el

número de individuos (n). La varianza del estimador de mínimos cuadrados aumenta rápidamente

a medida que lo hace el número de variables explicativas en un modelo donde el número de

observaciones (n) permanece constante.

Ahora bien, uno de los supuestos realizados en la estimación es que existe la matriz inversa de

�� lo cual no siempre es cierto. Hay dos hechos que afectan su existencia, la dimensionalidad de

los datos y la multicolinealidad de las variables explicativas. En el primero de los casos, con

dimensionalidad se hace referencia a la dimensión de la matriz ��×(��). Si p ≥ � la matriz ��

no es invertible y como consecuencia, no existe una única solución para vector de coeficientes de

regresión.


Por otro lado, si las columnas de � no son linealmente independientes (caso extremo de

multicolinealidad), la matriz � no es de rango completo en las columnas y por lo tanto tampoco

puede invertirse la matriz ��. En estos casos, dada (��)� inversa generalizada de ��, es

posible encontrar una solución para los coeficientes y, aunque esta solución no es única, las

predicciones �� = �(��)�� sí lo son por la propiedad de invarianza de �(��)�� (Searle,

1992).

En el marco de los modelos de SG, los datos utilizados se caracterizan por tener un gran

número de marcadores, que superan ampliamente a la cantidad de individuos (p >> n) y a su vez,

estos marcadores se encuentran asociados entre sí por la existencia de desequilibrio de

ligamiento (Lande y Thompson, 1990). Por lo tanto, ambos problemas de dimensionalidad y

multicolinealidad están presentes en los datos de SG y la implementación de métodos estadísticos

que puedan confrontarlos es una necesidad central para los programas de mejoramiento asistidos

por MM.

En este trabajo se presentan tres estrategias para confrontar los problemas de

dimensionalidad de la matriz � y la de presencia de multicolinealidad en el modelo. La primera

estrategia consiste en un enfoque clásico de ajuste de modelos de regresión: selección de

variables y estimación por mínimos cuadrados ordinarios. La segunda estrategia se sustenta en los

desarrollos de los métodos de estimación penalizada propuestos en el marco de la SG. La última

estrategia, es una combinación las dos anteriores y por lo tanto no solo selecciona MM sino que

además penaliza sus coeficientes. Las metodologías se desarrollan a continuación en los

Apartados 4.3.1 a 4.3.3 y asumen que la variable respuesta se encuentra centrada, es decir, no se

incluirá el término constante β�. Por lo tanto, en la Ecuación 4.3.3 el vector de coeficientes resulta

� = �β�, β�,… , β��′ y el vector de variables explicativas equivale a �´� = �x��, x��,… , x��.


4.3.1. Selección de variables y ajuste por Mínimos Cuadrados

Generalmente, para los modelos de regresión estimados vía mínimos cuadrados, idealmente

se ajustarían todos los modelos posibles con p = 1, 2, ... , n-1 variables explicativas, es decir, con

un MM, con dos MM, y así sucesivamente hasta n-1 MM. Luego, se seleccionaría aquel modelo

con mejor ajuste de acuerdo a algún criterio de bondad de ajuste (por ejemplo, criterio de Akaike,

1973). Sin embargo, cuando p es grande, ajustar todos los modelos posibles no es factible y se

debe recurrir a algún otro procedimiento de selección de MM (Bernardo y Yu, 2007).

En el presente trabajo, se aplicó uno de los algoritmos más sencillos para ajustar el modelo

por mínimos cuadrados ordinarios. El mismo consiste en estimar el modelo de regresión para

cada marcador individual, es decir, se estima por mínimos cuadrados el modelo de la Ecuación

4.3.1 para cada MM. En el ajuste de cada modelo, se obtiene una medida de asociación entre el

MM y la variable respuesta. En particular, se considera la probabilidad asociada a la prueba de

hipótesis sobre el coeficiente del MM. El gráfico del logaritmo en base 10 de esa probabilidad

asociada para cada marcador ordenado según su posición en el mapa de ligamiento permite,

además, identificar posibles regiones del genoma asociadas al carácter.

Una vez realizado el análisis por MM, se llevan a cabo sucesivos ajustes de modelos

incrementando el número de MM. Se considera en primer lugar el marcador más asociado al

carácter fenotípico, luego se contemplan los dos marcadores más asociados y así sucesivamente,

hasta llegar a un máximo número de MM en el modelo equivalente a n - 1.

A este procedimiento se lo denomina en adelante SMC (Selección de variables y ajuste por

Mínimos Cuadrados). Para cada uno de estos sucesivos ajustes a medida que se incrementa el

número de marcadores en el modelo, se obtiene la correlación entre el valor observado y el

predicho por el modelo. Esta estadística es la herramienta a utilizar para seleccionar el mejor

modelo de este enfoque.


Una de las ventajas del método SMC es que se trata de una metodología estadística clásica y

por lo tanto puede aplicarse en cualquier paquete estadístico. Además, el trabajo computacional

es inferior comparado con otras métodos de estimación que puedan involucrar algoritmos

iterativos. Sin embargo, a pesar de haber realizado selección de variables para poder superar el

problema de dimensionalidad y descartar marcadores duplicados, es factible que exista alto grado

de multicolinealidad entre los marcadores presentes en el modelo (Whittaker et al., 2000). Un

modelo sobreestimado puede exagerar fluctuaciones mínimas en los datos y generalmente tiene

una pobre habilidad predictiva (Lorenz et al., 2011).

4.3.2. Estimación Penalizada: regresión de Ridge

Los problemas de dimensionalidad y multicolinealidad son abordados por varios métodos

estadísticos que básicamente evitan el proceso de selección de variables manteniendo todos los

MM en el modelo (Piepho, 2009). Uno de esos métodos es la regresión de Ridge, introducida por

Hoerl y Kennard (1970). La misma fue aplicada por primera vez en el marco de la SG en el trabajo

de Whittaker et al. (2000).

La regresión de Ridge pretende balancear la bondad de ajuste del modelo con la complejidad

del mismo. Con tal objetivo, se define como una medida de la complejidad del modelo a la suma

de los cuadrados de los coeficientes de los MM, es decir, ∑ ��

�� y esta complejidad se penaliza a

través de una constante. Específicamente, siendo � ≥ 0 el parámetro de penalización (o

regularización) que controla la compensación entre la falta de ajuste y la complejidad del modelo,

el estimador tiene como objetivo minimizar la suma de cuadrados penalizada dada por la

siguiente expresión:

∑ (y� −�´��)��

�� + λ∑ β��

�� = ‖� − ��‖� + λ‖�‖� (4.3.7)


Luego, siendo � una matriz identidad de dimensiones � × �, se puede demostrar que el

estimador de la regresión de Ridge resulta:

�� = (�� + λ�)��′� (4.3.8)

El término de penalización es una estrategia que permite superar el problema de

multicolinealidad entre columnas de la matriz � que causa la no existencia de la matriz inversa de

��. Este estimador penalizado involucra “encogimiento”, por consiguiente evita sobreajuste del

modelo y estabiliza las estimaciones en comparación con la regresión por mínimos cuadrados

(Piepho, 2009).

El parámetro de penalización λ que determina la magnitud del encogimiento puede elegirse

siguiendo distintos criterios (Ruppert et al., 2003). A continuación se presentan tres alternativas:

Regresión de Ridge clásica (RR), Regresión de Ridge BLUP (RR-BLUP) y Regresión de Ridge

Bayesiana (BRR).

Regresión de Ridge Clásica (RR)

Este enfoque implica como primer paso, determinar cuál es el valor óptimo del parámetro de

penalización λ. Para elegirlo se emplea el método de validación cruzada de 10 iteraciones o

submuestras. El mismo consiste en dividir el conjunto de datos total con el cual se estima el

modelo en 10 submuestras. El modelo se ajusta 10 veces, excluyendo las submuestras de a una

por vez; la submuestra excluida se utiliza como conjunto de validación mientras que las restantes

9 se utilizan para la estimación del modelo. En cada iteración se calcula el Cuadrado Medio del

Error de Predicción: �� =�

�∑ (�� − ��)

�� , siendo �� la observación para el individuo i-

ésimo de la submuestra de validación, �� la predicción del individuo i-ésimo cuando la

estimación del modelo lo excluía y N el total de individuos en la submuestra utilizada para la


validación. El valor óptimo de λ es aquél que minimiza el promedio de los 10 valores de CMEP.

Para llevar a cabo esta búsqueda, se utilizó la función cv.glmnet de la librería glmnet (Friedman et

al., 2010). Una vez encontrado el parámetro de penalización óptimo, se procedió a la estimación

de los coeficientes del modelo, utilizando la función glmnet.

Regresión de Ridge BLUP (RR-BLUP)

Meuwissen et al. (2001) emplearon otra forma de estimar un valor óptimo del parámetro de

penalización en el marco de la SG. Este enfoque asume que los coeficientes de los MM son

aleatorios, con distribución normal de media 0 y varianza común ��. Se puede demostrar que el

parámetro de regularización � en la Ecuación 4.3.8 del estimador penalizado equivale al cociente

de varianzas: ��/��

� (Ruppert et al., 2003).

A esta metodología se la denomina RR-BLUP y su formulación a través de un modelo mixto

tiene como ventaja que se pueden estimar de manera directa no sólo las componentes de

varianza sino también, el parámetro de penalización usando REML.

Además, RR-BLUP permite el ajuste de un modelo más complejo que el planteado en la

Ecuación 4.3.3 ya que en un modelo mixto se pueden contemplar otras fuentes de variación

agregando efectos ya sean fijos o aleatorios.

Para la estimación del modelo RR-BLUP, se empleó el método REML a través de la función

mixed.solve de la librería de R rrBLUP (Endelman, 2011).

Regresión de Ridge Bayesiana (BRR)

La mayoría de los métodos penalizados son equivalentes a modelos bayesianos que asumen

cierta distribución a priori de los parámetros del modelo (Tibshirani, 1996). Por lo tanto, hay un


análisis bayesiano equivalente a la RR que se denomina Regresión de Ridge Bayesiana (BRR) (de

los Campos et al., 2013).

En la estadística bayesiana todos los valores desconocidos (parámetros, efectos aleatorios,

entre otros) son tratados como variables aleatorias, reflejando la incertidumbre respecto de esos

valores en una distribución de probabilidad (Sorensen y Gianola, 2002). Todo aquel conocimiento

que se tenga sobre los parámetros antes de observar los datos es representado en términos de

una distribución de probabilidad a priori, representada como �(�|�), siendo � valores

desconocidos de la distribución que se suelen denominar hiper-parámetros. Si por ejemplo, un

parámetro puede tomar cualquier valor entre 0 y 1, pero no se tiene más información al respecto,

la distribución uniforme entre 0 y 1 podría ser una propuesta para distribución a priori, siendo 0 y

1 los correspondientes hiper-parámetros. Sin embargo, si se supiera que es más probable que ese

parámetro sea próximo a 0.5, se puede asumir una distribución a priori beta con ambos hiper-

parámetros iguales a 2. La distribución beta es más informativa respecto del parámetro que la

distribución uniforme.

Además, toda la información proveniente de los datos se ve reflejada en la verosimilitud,

�(�|�,�) = ∏ �(��|�,�)�� . El concepto detrás de la estimación bayesiana es combinar el

conocimiento a priori con la información proveniente de los datos, para obtener la distribución de

probabilidad a posteriori, �(�|�,�), desde donde se realizan las inferencias.

En particular, la BRR plantea el modelo en dos niveles, el primero es al nivel de los datos y se

basa en el modelo de la Ecuación 4.3.3 pero asumiendo además que los coeficientes de los MM

provienen de una distribución normal con media 0 y varianza��, es decir, �(�|�) =

∏ ��0, ��

�� , donde ��0, ��

�� indica la función de densidad normal de la variable ��con

los hiper-parámetros de la media y varianza iguales a 0 y ��, respectivamente. El segundo nivel

del modelo BRR se refiere a las varianzas de los coeficientes de los MM y de los errores aleatorios;


se asume que las varianzas tienen distribución a priori Chi-cuadrado invertida escalada con grados

de libertad (��, ��) y parámetros de escala (��, ��). A estos últimos parámetros también se los

conoce con el nombre de hiper-parámetros pero de mayor grado (de los Campos, 2012).

La función BGLR de la librería BGLR (de los Campos y Perez-Rodríguez, 2014) se utiliza para

aplicar el método BRR con los hiper-parámetros (gl y parámetros de escala de las distribuciones

chi-cuadrado invertidas escaladas) definidos por defecto. La función BGLR emplea reglas para

asignar los valores de hiper-parámetros cuando estos no son provistos por el usuario; estas reglas

permiten obtener valores apropiados aunque no siempre resultan muy informativos (de los

Campos y Perez-Rodríguez, 2014).

Las inferencias en el marco de análisis bayesiano se basan en la distribución a posteriori de los

parámetros dados los datos�(�|�,�). Generalmente, no es posible obtener una expresión

analítica para dicha distribución a posteriori por lo tanto se emplea algún algoritmo de

aproximación. Tanto la función BLR de la librería con el mismo nombre (de los Campos y Perez-

Rodriguez, 2012) como su nueva versión BGLR utilizan el algoritmo de Monte Carlo vía Cadenas de

Markov (MCMC del inglés Markov Chain Monte Carlo) denominado Gibbs Sampler (Geman y

Geman, 1984; Casella y George, 1992) que muestrea repetidamente y calcula estadísticas

resúmenes de las distribuciones a posteriori lo cual lo convierte en un método muy demandante

computacionalmente.

Para utilizar la función BGLR se realizan 150.000 iteraciones para cada una de las poblaciones

y caracteres fenotípicos, descartando las primeras 50.000 iteraciones (valor conocido en el área

bayesiana como “burn-in”) por posibles problemas de ruido en las estimaciones iniciales. Además,

se guardan las estimaciones de los parámetros cada 10 iteraciones (valor conocido como “thin”).

Dichas estimaciones se utilizan para estudiar la convergencia del algoritmo a través de los


llamados gráficos de convergencia que consisten en representar las sucesivas estimaciones versus

el número de iteración.

4.3.3. Selección de variables y estimación penalizada: Regresión LASSO

La SG generalmente se basa en un gran número de MM no obstante, es probable que muchos

de ellos estén localizados en regiones que no afecten al carácter de interés. Por otro lado, hay

marcadores que están en desequilibrio de ligamiento con los QTL o en regiones que limitan con

genes involucrados. Esto sugiere que el modelo de la Ecuación 4.3.3 debería ofrecer diferentes

niveles de “encogimiento” a los coeficientes de los MM.

Tibshirani (1996) propuso el método de Regresión LASSO (del inglés Least Absolute Shrinkage

and Selection Operator) que combina la selección de variables y la penalización de los parámetros.

La regresión de Ridge utiliza un parámetro de penalización � ligado a la función �(�) = ∑ ��

�� =

‖�‖� que mide la complejidad del modelo. La estimación LASSO propone la función �(�) =

∑ �� para reflejar la complejidad del modelo y el estimador de � viene dado por la siguiente

expresión:

�� = argmin�∑ (y� −�´��)��

�� + λ∑ �β� �� (4.3.9)

El parámetro � se denomina parámetro de regularización que controla el impacto de la

penalización, cuanto más próximo a cero es, más se parece a la estimación por mínimos

cuadrados ordinarios mientras que cuanto mayor es �, mayor es la penalización. Sin embargo, no

debe compararse con el parámetro de penalización en la RR, pues, la función �(�) es diferente.

Ahora bien, el ajuste del modelo LASSO se lleva a cabo desde dos alternativas: Regresión

LASSO clásica (LR) y Regresión LASSO bayesiana (BLR); ambas se describen a continuación.


Regresión LASSO clásica (LR)

La solución a la Ecuación 4.3.9 admite a lo sumo tantos coeficientes de regresión no nulos

como n-1 (Park y Casella, 2008). Por ello, el enfoque clásico de la Regresión LASSO, es una

combinación de la estrategia de selección de variables y de la estrategia de penalización. En este

trabajo este enfoque clásico se implementó utilizando nuevamente la función glmnet que utiliza

un método optimización de coordenadas cíclicas descendentes (Friedman et al., 2010). La

elección del parámetro de penalización se hizo a través de validación cruzada con 10 iteraciones

utilizando la función cv.glmnet que busca minimizar el CMEP (también implementado en el caso

de RR).

Regresión LASSO Bayesiana (BLR)

De la misma manera que para la regresión de Ridge, existe una contrapartida bayesiana para

el método LASSO denominada Regresión LASSO Bayesiana (BLR). En el marco de la SG, a priori, no

hay razón por la cual el número de marcadores con coeficientes no nulos deba ser menor que el

número de individuos, hecho que ocurre en LR. Sin embargo, este problema no surge en el

enfoque bayesiano (de los Campos et al., 2009): La distribución a priori en el caso BLR es el

producto de p densidades centradas doble-exponenciales independientes, es decir,

�(�| �� ⁄ ) = ∏ (�� 2��

�⁄ ) exp(−|��| ��

�⁄ )�� .

A modo de ejemplo, se representan la distribución normal estándar, densidad utilizada como

priori para BRR, y la distribución doble exponencial con parámetro de escala igual a 1, densidad a

priori para BLR (Figura 4.3.1). Se puede observar que la distribución doble exponencial tiene

mayor masa de probabilidad en el entorno del cero (es decir, hay mayor encogimiento de los

coeficientes hacia el cero) y colas más pesadas que la distribución normal. No obstante, la


probabilidad de que los coeficientes sean iguales a cero es nula y por ello

como un método de penalización (no de selec

Figura 4.3.1 – Función de densidad normal (

distribuciones

Para la implementación de la BLR, se utiliz

nombre (de los Campos y Perez

distribuciones de colas pesadas.

densidades normales escaladas de la forma

�� es la distribución

parámetros de esta distribución. En particular, cuando

distribución marginal de los coeficientes es la distribución doble exponencial (de los Campos

al., 2013).

Un desafío de la BLR es la elección del valor

ellos es elegir un valor fijo


probabilidad de que los coeficientes sean iguales a cero es nula y por ello

como un método de penalización (no de selección de variables como es el enfoque clásico LR

Función de densidad normal (---) y doble exponencial (…) correspondientes a las

distribuciones a priori de los coeficientes de los MM en las metodologías

implementación de la BLR, se utilizó la función BGLR de la librería con el mismo

nombre (de los Campos y Perez-Rodriguez, 2012) que tienen en cuenta una propiedad de las

distribuciones de colas pesadas. Estas distribuciones pueden ser representadas como mezcla de

densidades normales escaladas de la forma �(��|�) = ∫��0,

es la distribución a priori de la varianza específica de cada marcador y

istribución. En particular, cuando �� /2� es la densidad exponencial, la

distribución marginal de los coeficientes es la distribución doble exponencial (de los Campos

Un desafío de la BLR es la elección del valor λ, para lo cual hay diferentes enfoques. Uno de

ellos es elegir un valor fijo basado y el otro es darle un enfoque completamente bayesiano, es

39

probabilidad de que los coeficientes sean iguales a cero es nula y por ello BLR se debe considerar

como es el enfoque clásico LR).

) correspondientes a las

de los MM en las metodologías BRR y BLR.

de la librería con el mismo

Rodriguez, 2012) que tienen en cuenta una propiedad de las

pueden ser representadas como mezcla de

� ��

� �� donde

fica de cada marcador y � son los hiper-

� es la densidad exponencial, la

distribución marginal de los coeficientes es la distribución doble exponencial (de los Campos et

diferentes enfoques. Uno de

es darle un enfoque completamente bayesiano, es


decir, asignar una distribución a priori al parámetro λ. Dado que, el enfoque bayesiano presentó

reiteradas veces problemas de convergencia, en el presente trabajo se aplica únicamente el

primer enfoque. Siguiendo los métodos para selección de hiper-parámetros propuestos por

(Pérez et al., 2010), el valor de λ se determina con base a la heredabilidad como: λ =

�2h� ∑ x��

�� donde h� es la heredabilidad que en el presente trabajo se estimó siguiendo la

Ecuación 4.1.1 y ∑ x��

�� = ∑ ��

�∑ x��

�� -

A modo de resumen de todo lo desarrollado en el Apartado 4.3, la Tabla 4.3.1 describe de

manera concisa todos los métodos de SG que se emplean en este trabajo. Notar que el parámetro

de penalización es llamado de manera general �, pero no son comparables ya que, difiere la

función que refleja la complejidad del modelo por ejemplo, la suma de valores absolutos de los

coeficientes en el caso de estimación LASSO o suma de los coeficientes al cuadrado en estimación

RR.

Tabla 4.3.1 – Resumen de los métodos de SG estudiados

Método de SG

Estrategia incorporación de MM

en el modelo

Método Estadístico de Estimación

Tratamiento coeficientes de

MM

Tratamiento de parámetros

desconocidos

SMC Selección de variables Mínimos Cuadrados

Ordinarios Fijos

Estimación clásica

de ��

RR Penalización enfoque

clásico Mínimos Cuadrados

Penalizados Fijos


de ��

�: valor (dentro de un rango) que minimice una

medida de bondad de ajuste

RR-BLUP Penalización enfoque

modelos mixtos Máxima Verosimilitud

Restringida Aleatorios

Estimación de �� y

�� por REML

(� = ��

�� )

BRR Penalización enfoque

bayesiano Algoritmo Bayesiano

Gibbs Sampler Priori N(0,��

� ) ��~��(��, ��)

��~��, ��

BLR Penalización enfoque

bayesiano Algoritmo Bayesiano

Gibbs Sampler Priori DE(��)

��: valor definido por el usuario

LR Selección de variables

y penalización Mínimos Cuadrados

Penalizados Fijos


de ��


4.3.4. Evaluación de la habilidad predictiva de los modelos

Con los fines de evaluar la habilidad predictiva de los distintos métodos de SG se realiza

validación cruzada, definiendo un conjunto de datos de entrenamiento que permite la estimación

de los parámetros del modelo y otro de validación con el cual se contrastan los valores predichos

y los observados.

El conjunto de entrenamiento debe ser representativo de la población que se desea evaluar

para obtener buenas predicciones. En teoría, la mejor población de entrenamiento para una

población es un subconjunto de la misma población para la cual se dispone de información de los

caracteres fenotípicos y de los MM. Por lo tanto, cada población F3 se dividió al azar en dos

conjuntos: uno de entrenamiento (75%) y otro de validación (25%). El conjunto de entrenamiento

fue utilizado para estimar el modelo de SG siguiendo las metodologías desarrolladas en los

Apartados 4.3.1 a 4.3.3. El conjunto de validación quedó conformado por individuos que no

participaron del proceso de estimación del modelo y por lo tanto se consideraron como individuos

nuevos.

La habilidad predictiva de los distintos métodos de SG se midió a través de la correlación

entre el valor observado y el valor predicho para el conjunto de validación en cada una de las 20

poblaciones y los tres caracteres: rendimiento, humedad y peso hectolítrico.

Con los fines de estudiar qué factores influyeron en la habilidad predictiva, se empleó una

estrategia similar a la aplicada en el trabajo de Asoro et al. (2011). Se ajustó un modelo donde la

variable respuesta fue la correlación entre el valor observado y el valor predicho por el modelo de

SG pero dentro del conjunto de validación y como variables explicativas se consideraron: grupo

heterótico (GH1, GH2), método de SG aplicado (SMC, RR, RR-BLUP, BRR, BLR, LR) y carácter

(Humedad, Peso Hectolítrico, Rendimiento). Además, se incorpora un efecto aleatorio por

población. Es decir, el modelo lineal mixto planteado resulta:


r�� = μ + G� +M� + F� + (GM)�� + (GF)�� + (MF)�� + (GMF)�� + δ� + ε�� (4.3.10)

donde r�� es la habilidad predictiva (correlación) en el GH t-ésimo (t = 1,2), correspondiente al

método de SG u-ésimo (u = 1,2,…, 6), del carácter fenotípico v-ésimo (v = 1,2,3), en la

población número w (w = 1,2,…20); μ es la media general de la habilidad predictiva, G�

representa el efecto del GH, M� representa el efecto del método de selección gnómica empleado,

F� es el efecto debido al carácter fenotípico analizado, luego se incorporan las interacciones

dobles de los efectos principales, la interacción de tercer orden y el efecto aleatorio de la

población (δ�) y un error aleatorio ε��. En el caso de encontrar algún factor significativo, se

procede a realizar comparaciones múltiples de las medias de los factores en cuestión utilizando el

método de Tukey (1949). Se trabaja con un nivel de significación α = 0.05.

Se reconoce que el supuesto de independencia y normalidad de los residuales del modelo

modelo lineal mixto en la Ecuación 4.3.10 puede ser violado por lo tanto, las probabilidades

asociadas no resultan exactas bajo la hipótesis nula. Sin embargo, el propósito de este ajuste no

fue probar específicamente las magnitudes de cada uno de los efectos bajo estudio sino que el

objetivo es dar una aproximación que ayude a cuantificar los factores que pueden estar afectando

a la habilidad predictiva de los modelos de SG.


5. RESULTADOS

5.1. Resultados del análisis de datos fenotípicos

Los resultados del análisis de datos fenotípicos de las 20 poblaciones de maíz para los tres

caracteres (Humedad, Peso Hectolítrico y Rendimiento) se resumen en la Tabla 5.1.1. En la misma,

se presenta para cada población F3, el número de familias y por cada carácter: número de

localidades, media, R2 del modelo mixto de la Ecuación 4.1.1 y heredabilidad.

Se observó variabilidad entre las poblaciones tanto en medidas propias de los caracteres

como en el número de familias. El número de familias por población en el GH1 varió entre 90 y

186 familias mientras que, en el GH2 varió entre 73 y 184 familias.

La humedad del grano a cosecha se midió entre 5 y 8 localidades por población. Los valores

medios de las poblaciones variaron entre 14,5% y 24,5%. En cuanto al ajuste del modelo, el R2 fue

superior a 80% en todas las poblaciones. Finalmente, la heredabilidad varió entre 54,1% y 90,9%.

El peso hectolítrico se midió entre 5 y 8 localidades por población. Los valores medios de las

poblaciones variaron entre 53,2 lb/bu y 59,3 lb/bu. En cuanto al ajuste del modelo, el R2 varió

entre 39% y 97%. Finalmente, la heredabilidad varió entre 49,9% a 81,2%.

El rendimiento en grano se midió entre 5 y 8 localidades por población. Los valores medios de

las poblaciones variaron entre 176,9 y 220,0 bu/ac. En cuanto al ajuste del modelo, el R2 varió

entre 32% y 93%. Finalmente, la heredabilidad varió entre 40,0% a 71,3%.

Para todas las poblaciones y caracteres fenotípicos, se predijeron los valores genéticos de las

familias que se emplearon luego como variable respuesta en los modelos de SG siguiendo la

Ecuación 4.3.3.

Ta

bla

5.1

.1 –

Nú

me

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milia

s, nú

me

ro d

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1

18

1

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1

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7

7,8

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5

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1

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GH

1

2

13

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2

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8

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5

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GH

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6

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1

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GH

1

4

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2

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GH

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7,1

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5

6,0

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1

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,5

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,9

GH

1

6

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6

,0

17

,2

94

%

73

,5

6

,0

56

,8

92

%

79

,7

6

,0

18

4,8

8

5%

5

4,5

GH

1

7

18

6

8,0

1

9,0

8

1%

7

9,3

7,0

5

7,7

8

4%

8

1,2

8,0

2

00

,6

86

%

59

,3

GH

1

8

17

9

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2

2,8

8

4%

7

2,8

8,0

5

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8

9%

7

9,0

8,0

1

89

,7

59

%

66

,5

GH

1

9

18

1

8,0

1

9,4

9

3%

8

4,7

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5

6,7

9

1%

5

2,7

8,0

2

01

,9

68

%

40

,0

GH

1

10

1

84

7

,0

17

,7

89

%

64

,9

7

,0

58

,9

86

%

51

,6

7

,0

18

5,5

6

0%

5

8,2

GH

2

11

1

61

7

,0

14

,5

91

%

65

,6

6

,0

55

,4

86

%

74

,8

7

,0

17

6,9

7

5%

5

5,3

GH

2

12

1

32

7

,0

22

,8

88

%

90

,9

7

,0

56

,4

39

%

54

,4

7

,0

20

9,5

3

2%

5

4,5

GH

2

13

1

77

8

,0

17

,3

92

%

54

,1

8

,0

57

,0

78

%

56

,1

8

,0

20

0,9

5

3%

5

3,0

GH

2

14

1

78

7

,0

24

,5

91

%

82

,3

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,0

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66

%

64

,0

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19

9,0

8

2%

5

2,5

GH

2

15

1

58

7

,0

17

,3

91

%

78

,7

7

,0

56

,9

62

%

63

,4

7

,0

22

0,0

6

4%

4

7,4

GH

2

16

1

57

7

,0

16

,2

93

%

66

,8

7

,0

58

,0

63

%

55

,2

7

,0

21

0,8

6

7%

5

6,8

GH

2

17

1

84

8

,0

17

,8

95

%

75

,3

8

,0

57

,9

92

%

62

,0

8

,0

20

4,0

7

4%

4

1,8

GH

2

18

1

59

7

,0

17

,3

96

%

66

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7

,0

55

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%

64

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,0

19

1,9

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4

8,0

GH

2

19

1

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8

,0

20

,2

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%

71

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6

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56

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%

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20

5,9

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0%

6

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GH

2

20

7

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2

1,4

9

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6

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5

4,9

9

7%

6

9,0

5,0

2

19

,3

82

%

51

,4


5.2. Resultados del análisis de los datos de marcadores moleculares

El análisis de la información de tipo molecular se llevó a cabo para cada una de las 20

poblaciones de maíz y los resultados se resumen en la Tabla 5.2.1. Notar que, para mantener la

confidencialidad de los datos, los cromosomas fueron codificados aleatoriamente con letras.

El número de marcadores con que se evaluaron inicialmente las familias F3 de cada población

varió entre 71 y 105 SNPs a lo largo de todo el genoma. En las poblaciones, se incrementó la

densidad incorporando marcadores imputados y alcanzando un total de 2.886 MM. Sobre este

conjunto total de MM, se realizaron los controles de calidad de datos moleculares. El número final

de MM por población se incrementó a más de 5 veces el número inicial de SNPs evaluados. El

número final de MM para el GH1 varió entre 848 y 1.178 a lo largo de todo el genoma mientras

que, en las poblaciones del GH2, varió entre 512 y 872. Se calculó la distribución de MM a lo largo

del genoma para cada población, es decir, se contabilizó el número de MM disponibles en cada

uno de los cromosomas (A-J). La distribución del número de MM por cromosoma no resultó

uniforme dentro de las poblaciones, por ejemplo, la población 17 presentó un CV superior al 5%:

en un sólo cromosoma se tuvieron 15 MM mientras que en cinco cromosomas se tuvieron más de

100 MM. En general, los cromosomas con menor cantidad de MM por población resultaron los

cromosomas B y E, mientras que los cromosomas de mayor cantidad de MM fueron: J, H e I. La

similaridad de los parentales de cada una de las poblaciones varió entre 0,60 y 0,70 en el GH1 y

entre 0,70 y 0,82 en el GH2.

Los MM finales, es decir, aquéllos evaluados más los imputados, luego de haber superado los

criterios de control de calidad, fueron la base de los modelos de SG cuyos resultados se presentan

en los dos apartados siguientes.

Ta

bla

5.2

.1 –

Nú

me

ro d

e m

arca

do

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en

otip

ad

os y

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B

C

D

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F

G

H

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1

10

2

89

8

89

5

3

62

6

6

70

9

4

11

7

11

5

11

0

12

2

2,8

6

0,6

9

GH

1

2

86

1

11

6

97

6

8

11

7

84

6

7

10

9

14

4

13

2

13

3

16

5

2,9

4

0,6

1

GH

1

3

93

8

48

5

0

76

3

1

85

2

7

11

5

90

1

20

9

2

16

2

4,9

3

0,7

0

GH

1

4

96

1

02

9

63

5

6

11

9

78

6

8

10

1

84

1

33

1

56

1

71

3

,92

0

,65

GH

1

5

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1

03

1

10

0

82

1

08

6

0

58

1

04

1

17

1

06

1

32

1

64

3

,09

0

,64

GH

1

6

98

1

13

4

10

3

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1

24

9

3

88

1

18

1

04

1

41

1

65

1

41

2

,75

0

,61

GH

1

7

10

2

11

78

9

5

91

1

46

8

0

98

1

28

8

3

12

5

14

0

19

2

3,0

0

0,6

0

GH

1

8

10

5

10

06

8

3

87

8

9

89

6

7

10

2

11

4

11

4

10

2

15

9

2,4

9

0,6

6

GH

1

9

92

1

05

3

66

7

2

11

5

94

2

8

11

2

12

1

13

9

13

3

17

3

3,9

6

0,6

4

GH

1

10

9

3

11

18

9

9

69

1

24

9

0

65

1

02

1

20

1

35

1

45

1

69

2

,96

0

,61

GH

2

11

9

2

62

4

61

4

4

54

6

4

44

7

7

62

8

0

55

8

3

2,2

4

0,7

8

GH

2

12

8

0

87

2

65

5

4

92

8

9

57

1

03

9

2

10

7

83

1

30

2

,72

0

,70

GH

2

13

7

1

58

3

67

5

2

22

6

9

51

5

9

32

1

02

8

7

42

4

,16

0

,80

GH

2

14

1

04

7

74

8

3

64

6

6

81

4

9

96

6

4

91

6

7

11

3

2,4

5

0,7

2

GH

2

15

9

4

81

2

57

4

6

85

1

03

4

7

10

3

83

5

5

11

6

11

7

3,4

7

0,7

1

GH

2

16

9

8

56

8

63

3

9

83

5

1

28

4

7

85

3

9

38

9

5

4,1

2

0,8

0

GH

2

17

1

03

8

17

7

9

40

4

8

47

1

5

11

9

10

0

11

7

11

1

14

1

5,1

4

0,7

2

GH

2

18

8

7

70

2

64

4

8

80

6

9

45

8

3

81

6

9

61

1

02

2

,44

0

,76

GH

2

19

1

02

6

55

8

2

44

5

3

69

5

1

47

8

7

72

6

2

88

2

,53

0

,77

GH

2

20

1

00

5

12

6

0

30

6

5

40

3

6

54

6

0

63

5

2

52

2

,35

0

,82


5.3. Aplicación de métodos de selección genómica a una población y carácter

En una población elegida al azar, se estimó el modelo de regresión de los valores genéticos

para la humedad en términos de los MM, empleando los datos de 100 familias que conformaron

el conjunto de entrenamiento. A continuación, se presentan los resultados de cada uno de los seis

métodos de SG, se representan los coeficientes estimados por cromosoma y se estudia la

habilidad predictiva del modelo a través de la estimación de la correlación entre los valores

observados y predichos para el conjunto de validación, compuesto por otras 34 familias de la

misma población.

5.3.1. Aplicación de Selección de variables y ajuste por Mínimos Cuadrados (SMC).

Se estimó un modelo de regresión por cada MM (Ecuación 4.3.1). Como consecuencia, se

ajustaron tantos modelos como marcadores disponibles, en este caso, resultaron 1.116 modelos.

De cada uno de esos ajustes por MM individual se tomó la probabilidad asociada (p‐valor) de la

prueba de hipótesis correspondiente al coeficiente del MM. A continuación, se representa la

asociación entre cada MM y la variable respuesta a través del valor de ‐log10(p‐valor) versus el

orden de los MM dentro de cada cromosoma (Figura 5.3.1). Valores altos ‐log10(p‐valor) ocurren

cuando un MM resultó altamente significativo para el carácter en estudio. Así, esta información

permitió identificar regiones del genoma que, se encontrarían asociadas a la humedad del grano.

Por ejemplo, en el cromosoma B, los MM que están próximos a 100 (en el ordenamiento dentro

de este cromosoma) muestran la mayor asociación con los valores genéticos correspondientes a

la humedad de grano.


Figura 5.3.1 – Asociación entre cada MM y los valores genéticos para la humedad de una población, representada por el ‐ logaritmo en base 10 de la probabilidad asociada de los coeficientes de MM versus el

ordenamiento de los MM dentro de cada cromosoma con base en el mapa de ligamiento.

La selección de variables se basó en el ordenamiento de los MM según la probabilidad

asociada (p‐valor) obtenida para cada uno de sus coeficientes. Siendo que la posición 1 la ocupó el

MM con menor p‐valor, a continuación se representa un ejemplo del ordenamiento para un

subconjunto de MM:

MM MM.A MM.B MM.C MM.D MM.E MM.F MM.B

p-valor 0,1012 0,06859 0,2419 0,2943 0,4099 0,2545 0,4060

Posicionamiento 934 929 935 936 937 920 921

Para aplicar el método SMC, se realizaron ajustes consecutivos comenzando por el modelo

con el marcador más significativo (es decir, de posicionamiento igual a 1), luego un ajuste con los

dos MM más significativos (posicionamientos 1 y 2) y así sucesivamente, se fue agregando el MM

que seguía según el posicionamiento, hasta que el número de MM en el modelo alcanzó el

número de familias en el conjunto de entrenamiento menos 1, es decir, 99. A continuación se


representa la correlación entre el valor observado y el predicho por cada uno de esos modelos

(Figura 5.3.2). Se distinguen con distintos símbolos a las correlaciones en el conjunto de

entrenamiento (círculo) y en el conjunto de validación (triángulo). La correlación en el conjunto de

entrenamiento, nunca disminuyó a medida que se incrementó el número de MM (la correlación

se mantuvo igual o aumentó). Sin embargo, ese patrón no se reflejó en el conjunto de validación,

pues a partir del modelo con 38 MM la correlación mostró una tendencia decreciente. Con menos

de 40 MM, las correlaciones se aproximaron a 0,60 en ambos conjuntos.

Figura 5.3.2 – Correlación entre valor observado y el predicho por el modelo en una población versus el número de MM selectos para incluir en el modelo de regresión múltiple. Las correlaciones para el

conjunto de entrenamiento se representan con el círculo y para el conjunto de validación con triángulo.

En la aplicación de SMC, la máxima correlación en el conjunto de entrenamiento resultó de

0,6799 con el modelo de los 94 MM que resultaron más significativos en el modelo de marcador

individual. Por otro lado, la correlación en el conjunto de validación se redujo a 0,5004.


5.3.2. Aplicación de Regresión de Ridge clásica (RR).

En la aplicación del enfoque clásico de la regresión de Ridge se utilizó un valor de penalización

(lambda) definido de antemano. El efecto que tiene el valor de lambda sobre las estimaciones del

modelo se puede visualizar en la Figura 5.3.3. La misma representa las estimaciones penalizadas

de los coeficientes de todos los MM para dos valores diferentes del parámetro de penalización

(10 y 200). Las estimaciones, en el caso del mayor valor del parámetro de penalización, variaron

en un rango aproximado de ‐0,02 a 0,02 mientras que, para el menor valor de penalización, el

rango se amplió de ‐0.,07 a 0,09. En otras palabras, a mayor parámetro de penalización, mayor

encogimiento de las estimaciones de los coeficientes de los MM hacia el cero.

Figura 5.3.3 – Visualización de la estimación penalizada de los coeficientes de todos los MM para dos valores distintos del parámetro de penalización (10 y 200) en el marco del método RR.

La selección del valor de penalización en el enfoque RR se realiza con base en el CMEP

obtenido para distintos valores del parámetro de penalización (Figura 5.3.4). En la misma se


representa la media de los CMEP en las 10 submuestras (con sus respectivas barras de error)

versus el logaritmo de lambda. El valor de lambda que minimizó el CMEP fue de 2,672

(correspondiente a 0,9828 en la escala logarítmica). Para ese valor óptimo de penalización, se

ajustó el modelo con todas las familias del conjunto de entrenamiento.

Figura 5.3.4 – CMEP obtenidos en la validación cruzada con 10 submuestras (media ± desvío estándar) cuando se empleó el modelo RR para distintos valores del parámetro de penalización (lambda).

Se obtuvieron las estimaciones de los coeficientes de cada uno de los MM, agrupadas por

cromosoma y ordenadas según la posición dentro de cada uno de ellos (Figura 5.3.5). Este gráfico

es la contrapartida del análisis por MM individual (Figura 5.3.1), permitiendo identificar posibles

regiones asociadas al carácter (por ejemplo, en los cromosoma B, C y G donde se observan ciertos

picos).

ln(Lambda)

CM

EP


Figura 5.3.5 – Estimación de los coeficientes para todos los MM del modelo correspondiente al análisis RR para la humedad del grano en una población. Los coeficientes se presentan de acuerdo al ordenamiento de

los MM dentro de cada cromosoma con base en el mapa de ligamiento.

Del ajuste se extrajeron los valores predichos y la correlación con los datos observados resultó

de 0,9007 en el conjunto de entrenamiento. Por otro lado, con las estimaciones de los

coeficientes se obtuvieron las predicciones para las familias en el conjunto de validación y la

correlación con el valor observado resultó de 0,7325.

5.3.3. Aplicación de la Regresión de Ridge BLUP (RR-BLUP).

Con los fines de aplicar el método RR‐BLUP a una población, se estimó el modelo mixto de la

Ecuación 4.3.3 con coeficientes aleatorios de los MM, se extrajeron los valores predichos de cada

uno de sus coeficientes y su correspondiente error estándar; la estandarización de los coeficientes

de los MM se ordenó según la localización dentro de cada cromosoma (Figura 5.3.6). Esta

información permitió identificar posibles regiones del genoma que se encontrarían asociadas a la

humedad del grano. Por ejemplo, las regiones delimitadas por los MM próximos a 100 (en el


ordenamiento dentro de este cromosoma) en el cromosoma B y para el cromosoma G, entre 150

y 200.

Figura 5.3.6 – Predicción de los coeficientes estandarizados para todos los MM del modelo correspondiente al análisis RR‐BLUP para la humedad del grano en una población. Los coeficientes se presentan de acuerdo

al ordenamiento de los MM dentro de cada cromosoma con base en el mapa de ligamiento.

Las estimaciones de las componentes de varianza tanto de los coeficientes de los MM como

de los residuos del modelo se encuentran en la Tabla 5.3.1 así como también el valor del

parámetro de penalización de la regresión de Ridge equivalente a este ajuste.

Tabla 5.3.1 – Estimación de las componentes de varianza de los coeficientes de los MM y de los residuos al emplear el método RR‐BLUP para la humedad de grano en una población.

Determinación del parámetro de penalización para emplear RR en forma equivalente al RR‐BLUP

Estimación de �� Estimación de ��

� � = ��/��

� ln(�)

0.001152 0.2379 206.6 5.33


Finalmente, el enfoque RR‐BLUP arrojó una correlación entre los valores predichos y los

observados de 0,9162 en el conjunto de entrenamiento mientras que, en el conjunto de

validación esta correlación fue de 0,7307.

5.3.4. Aplicación de la Regresión de Ridge Bayesiana (BRR).

La contrapartida bayesiana de la regresión de Ridge (BRR) fue aplicada con 150.000

iteraciones, de las cuales se descartaron las primeras 50.000 (burn-in). Cada 10 iteraciones (thin)

se guardó el valor de la varianza del error y de los MM (Figura 5.3.7). A partir de la iteración

50.000, la serie se observó estable, sin presencia de saltos o patrones de tendencia, con lo cual,

en lo que respecta a esta estimación de componente de varianza no fue necesario aumentar la

cantidad de iteraciones realizadas. Finalmente, con todas las iteraciones posteriores a 50.000, se

obtuvo la estimación de este parámetro: �� = 0,1966.

Asimismo, se guardó la serie de valores para la varianza del MM cada 10 iteraciones (Figura

5.3.8). A partir de la iteración 50.000, se observa que la serie se estabilizó, con lo cual no fue

necesario aumentar la cantidad de iteraciones realizadas. Finalmente, con todas las iteraciones a

posteriores a 50.000, se obtuvo la estimación de este parámetro: �� = 0,01574.


Figura 5.3.7 – Gráfico de convergencia correspondiente a la varianza residual en el método de BRR aplicado a la humedad del grano en una población. Se representan los valores de la varianza residual

muestreados cada 10 iteraciones entre las 150.000 realizadas. La línea horizontal representa la estimación final del parámetro habiendo descartado las primeras 50.000 iteraciones (burn-in).

La Tabla 5.3.2 presenta la estimación de cada una de las componentes de varianza y el

cociente entre las mismas que corresponde al parámetro de penalización si se quisiera emplear el

enfoque RR en forma equivalente a BRR; el valor de lambda en este caso, es 12,39.

Se obtuvieron las estimaciones de los coeficientes correspondientes a los MM (Figura 5.3.9).

Como posibles regiones del genoma que se encontrarían asociadas a la humedad del grano se

pueden mencionar los primeros MM del cromosoma H (posicionamiento entre 0 y 50).

La correlación entre los valores predichos y observados en el conjunto de entrenamiento

resultó de 0,9895 y en el conjunto de validación fue de 0,7040.


Figura 5.3.8 – Gráfico de convergencia correspondiente a la varianza de los MM en el método de BRR aplicado a la humedad del grano en una población. Se representan los valores de la varianza de MM


Tabla 5.3.2 – Estimación de la componente de varianza de los coeficientes de MM y de los residuos al emplear el método BRR para la humedad de una población.

Determinación del parámetro de penalización para emplear RR en forma equivalente a BRR.

Estimación de �� Estimación de ��

� � = ��/��

� ln(�)

0,01574 0,1966 12,39 2,51


Figura 5.3.9 – Estimación de los coeficientes estandarizados para todos los MM del modelo correspondiente al análisis BRR para la humedad del grano en una población. Los coeficientes se presentan de acuerdo al

ordenamiento de los MM dentro del cromosoma con base en el mapa de ligamiento.

5.3.5. Aplicación de la regresión LASSO Bayesiana (BLR).

Para la aplicación de la regresión LASSO con el enfoque bayesiano, se determinó el parámetro

de regularización con base en la heredabilidad y resultó igual a 12,94. La Figura 5.3.10 representa

la serie de los valores de la varianza del error versus el número de iteración. A partir de la

iteración 50.000 (burn-in), la serie se estabilizó y con estas iteraciones, se obtuvo la estimación del

parámetro: �� = 0,1825.

Las estimaciones de los coeficientes correspondientes a los MM se representan en la Figura

5.3.11. Con base en esta figura, se identificaron posibles regiones del genoma que se encontrarían

asociadas a la humedad del grano. Por ejemplo, en el cromosoma H, la región delimitada por los

MM que están entre las posiciones 0‐50 (en el ordenamiento dentro de este cromosoma).


Figura 5.3.10 – Gráfico de convergencia correspondiente a la varianza residual en el método de BLR aplicado a la humedad del grano en una población. Se representan los valores de la varianza residual


Figura 5.3.11 – Estimación de los coeficientes estandarizados para todos los MM del modelo correspondiente al análisis BLR para la humedad del grano en una población. Los coeficientes se presentan

de acuerdo al ordenamiento de los MM dentro de cada cromosoma con base en el mapa de ligamiento.


Finalmente, la correlación entre los valores predichos y los observados en el conjunto de

entrenamiento resultó de 0,9462 y en el conjunto de validación 0,7190.

5.3.6. Aplicación de la regresión LASSO (LR).

La elección del valor del parámetro de penalización (lambda) se basó en la Figura 5.3.12 que

representa la media de los CMEP (de las 10 submuestras del conjunto de entrenamiento) con sus

respectivas barras de error versus el logaritmo de lambda. El valor de lambda que minimizó el

CMEP fue de: 0,03145 (correspondiente a ‐3,459 en la escala logarítmica). Para ese valor de

penalización, se ajustó el modelo con todas las familias del conjunto de entrenamiento.

Figura 5.3.12 – CMEP obtenidos en la validación cruzada con 10 submuestras (media ± desvío estándar) cuando se empleó el modelo LR para distintos valores del parámetro de penalización (lambda).

Las estimaciones de los coeficientes de cada uno de los MM se encuentran representadas en

la Figura 5.3.13, agrupadas por cromosoma y ordenadas según la posición dentro de cada uno de

ellos. La selección de variables realizada se puede ver claramente en el gráfico: sólo algunos MM

tuvieron estimaciones no nulas para sus coeficientes. Esta figura muestra que en los cromosomas

ln(Lambda)

CM

EP


A, D, E, H y J fueron muy pocos los MM seleccionados mientras que los cromosomas con mayor

número de MM seleccionados son, por ejemplo B, C, F y G, dando indicios de posibles QTL para la

humedad.

Del ajuste para el conjunto de entrenamiento se extrajeron los valores predichos y su

correlación con los datos observados resultó de 0,8904. Por otro lado, el conjunto de validación la

correlación resultó de 0,6568.

Figura 5.3.13 – Estimación de los coeficientes para todos los MM del modelo correspondiente al análisis LR para la humedad del grano en una población. Los coeficientes se presentan de acuerdo al ordenamiento de

los MM dentro de cada cromosoma con base en el mapa de ligamiento.


5.4. Evaluación de la habilidad predictiva de los modelos de selección genómica

Los seis métodos aplicados detalladamente en la Sección 5.3 a una sola población y carácter,

se extendieron no sólo a los tres caracteres fenotípicos observados sino también a las 20

poblaciones de maíz; esto resultó en un total de 360 (6x3x20) análisis de SG.

Para cada población, los enfoques SMC, RR y LR requirieron de la selección de un ajuste (entre

múltiples ajustes realizados) que optimizaron algún criterio. En el caso de SMC, de los ajustes con

distinto número de MM en el modelo, se seleccionó aquel modelo que maximizó la correlación

entre el valor predicho y el observado en el conjunto de entrenamiento. En los enfoques RR y LR,

de los múltiples ajustes correspondientes a distintos valores del parámetro de penalización se

tomó aquél que minimizó el CMEP.

Las correlaciones entre los valores predichos y los observados fueron estimadas para el

conjunto de validación y resumidas a través de la correlación media ± desvío estándar según

método de SG, carácter y GH (Tabla 5.4.1). Para la humedad del grano a cosecha, el valor medio

de correlación más bajo resultó de 0,39 correspondiente al método SMC en el GH1 mientras que,

el valor máximo fue de 0,64 observado para los métodos RR, RR‐BLUP y BLR también en el GH1.

En el caso del peso hectolítrico, el valor medio de correlación mínimo fue de 0,30 para el método

de SMC en el GH1 y el máximo fue de 0,55 que correspondió a los métodos RR, RR‐BLUP y BLR, en

todos los casos en GH1. Finalmente, para el rendimiento en grano, el valor de correlación media

más bajo se presentó para el método SMC en el GH2 y resultó de 0,23 mientras que, el máximo

valor alcanzado fue de 0,44 al aplicar RR y RR‐BLUP en el GH1. Combinando ambos GH, la

estrategia de selección de variables (SMC) arrojó el mínimo valor de correlación mientras que, el

máximo valor de capacidad predictiva fue alcanzado con las técnicas de penalización: RR, RR‐BLUP

y BLR.


Tabla 5.4.1 – Media y desvío estándar de la correlaciones entre valor predicho por los modelo de SG y el valor observado en los conjuntos de validación de cada una de las 20 poblaciones de maíz,

para los tres caracteres fenotípicos observados.

Caracter Fenotípico

GH Método de SG

SMC RR RR‐BLUP BRR BLR LR

Humedad

GH1 0,39 ± 0,16 0,64 ± 0,11 0,64 ± 0,11 0,54 ± 0,12 0,64 ± 0,11 0,57 ± 0,11

GH2 0,47 ± 0,15 0,61 ± 0,10 0,61 ± 0,11 0,47 ± 0,17 0,60 ± 0,11 0,55 ± 0,16

Todos 0,43 ± 0,16 0,63 ± 0,11 0,63 ± 0,11 0,50 ± 0,15 0,62 ± 0,11 0,56 ± 0,13

Peso Hectolítrico

GH1 0,30 ± 0,21 0,55 ± 0,12 0,55 ± 0,11 0,42 ± 0,19 0,55 ± 0,09 0,44 ± 0,22

GH2 0,32 ± 0,09 0,46 ± 0,16 0,46 ± 0,16 0,35 ± 0,18 0,46 ± 0,15 0,39 ± 0,10

Todos 0,31 ± 0,16 0,50 ± 0,14 0,50 ± 0,14 0,39 ± 0,18 0,51 ± 0,13 0,42 ± 0,16

Rendimiento

GH1 0,31 ± 0,16 0,44 ± 0,17 0,44 ± 0,17 0,41 ± 0,20 0,42 ± 0,19 0,41 ± 0,16

GH2 0,23 ± 0,24 0,39 ± 0,13 0,39 ± 0,13 0,36 ± 0,16 0,38 ± 0,14 0,30 ± 0,20

Todos 0,27 ± 0,20 0,42 ± 0,15 0,41 ± 0,15 0,38 ± 0,18 0,40 ± 0,17 0,36 ± 0,18

Todos Todos 0,34 ± 0,19 0,51 ± 0,16 0,51 ± 0,16 0,42 ± 0,18 0,51 ± 0,16 0,44 ± 0,18

Se representó la correlación para el conjunto de validación versus la heredabilidad en cada

población y carácter fenotípico analizado, según los métodos de SG estudiados (Figura 5.4.1). SI

bien los R2 resultaron inferiores a 0.5, se observó una tendencia: a mayor heredabilidad, mayor

habilidad predictiva del modelo, cualquiera sea el método empleado (p‐valores < 0.01).

Por otro lado, se representa la correlación en el conjunto de validación versus la similaridad

entre los parentales de origen de cada una de las 20 poblaciones de maíz, según el método de SG

estudiado (Figura 5.4.2). No se observó ninguna tendencia clara ni asociación significativa entre la

similaridad y la habilidad predictiva del modelo.


Figura 5.4.1 – Correlación entre el valor predicho y el valor observado en el conjunto de validación de las poblaciones versus la heredabilidad del carácter por cada uno de los enfoques de SG empleados.

Figura 5.4.2 – Correlación entre el valor predicho y el observado para las familias en el conjunto de validación versus la similaridad de los parentales de las poblaciones por cada uno de los enfoques de SG

empleados.


Se presenta el análisis de varianza (Tabla 5.4.2) que resume los resultados de ajustar el

modelo de la Ecuación 4.3.10 para estudiar los efectos sobre la habilidad predictiva de los

modelos de SG, del carácter y del GH, con un nivel de significación α = 0.05. En primer lugar, se

encontró que no existe efecto significativo de la interacción triple. Además, tampoco resultaron

significativas las interacciones de segundo orden. Entre los efectos principales, los resultados

indicaron que la habilidad predictiva de los modelos de SG resultó afectada significativamente por

el método y el carácter fenotípico mientras que, no se encontró evidencia significativa de efectos

del GH al que pertenecen las poblaciones.

Tabla 5.4.2 – Análisis de la varianza del modelo mixto para estudiar efectos sobre la habilidad predictiva de los modelos de SG.

Fuente de Variación gl.num gl.den F.obs P(F>F.obs)

Método 5 306 5,33 0,0001

Caracter 2 306 6,75 0,0014

GH 1 18 0,35 0,5608

Método:Caracter 10 306 0,63 0,7904

Método:GH 5 306 0,81 0,5451

Carácter:GH 2 306 0,21 0,8092

Método: Carácter:GH 10 306 0,46 0,9171

Se realizaron comparaciones múltiples de para los dos efectos principales significativos:

carácter fenotípico y método de SG. Los resultados se presentan en la Tabla 5.4.3 y se trabajó con

un nivel de significación α = 0.05. La humedad a cosecha tuvo, en promedio, una correlación de

0,56, significativamente superior tanto a la correlación media del peso hectolítrico (0,44) y como a

la de rendimiento en grano (0,37). A su vez, estos dos últimos caracteres fenotípicos también se

diferenciaron significativamente entre sí, con lo cual, el rendimiento en grano fue el fenotipo con

peor habilidad predictiva.

Las correlaciones medias para los métodos BLR, RR‐BLUP y RR no se diferenciaron entre sí

significativamente, así como tampoco lo hicieron las correlaciones medias de los métodos BRR y

LR. Los métodos BLR, RR‐BLUP y RR fueron los de mejor habilidad predictiva (aproximadamente


0,51 en cada uno de los casos), luego siguieron los métodos LR y BRR en ese orden, con

correlaciones medias de 0,44 y 0,42, respectivamente y por último, el método de peor habilidad

predictiva resultó el de selección de variables (SMC) con una correlación media de 0,34.

Tabla 5.4.3 – Comparaciones múltiples de las correlaciones medias en el conjunto de validación para los distintos caracteres fenotípicos y métodos de SG empleados.

Factor Nivel A Nivel B Media A Media B Dif. (A‐B) E.E. Z p‐valor

Caracter Fenotípico

Humedad Peso 0,56 0,44 0,12 0,02 7,47 <0,0001

Humedad Rendimiento 0,56 0,37 0,19 0,02 11,29 <0,0001

Peso Rendimiento 0,44 0,37 0,06 0,02 3,82 0,0004

Método de SG

BLR BRR 0,51 0,42 0,09 0,02 3,61 0,0042

BLR LR 0,51 0,44 0,07 0,02 2,78 0,0609

BLR RR 0,51 0,51 0,00 0,02 ‐0,19 1,0000

BLR RR‐BLUP 0,51 0,51 0,00 0,02 ‐0,20 1,0000

BLR SMC 0,51 0,34 0,17 0,02 7,39 0,0000

BRR LR 0,42 0,44 ‐0,02 0,02 ‐0,83 0,9625

BRR RR 0,42 0,51 ‐0,09 0,02 ‐3,79 0,0021

BRR RR‐BLUP 0,42 0,51 ‐0,09 0,02 ‐3,80 0,0020

BRR SMC 0,42 0,34 0,09 0,02 3,78 0,0021

LR RR 0,44 0,51 ‐0,07 0,02 ‐2,97 0,0357

LR RR‐BLUP 0,44 0,51 ‐0,07 0,02 ‐2,98 0,0348

LR SMC 0,44 0,34 0,11 0,02 4,61 0,0001

RR RR‐BLUP 0,51 0,51 0,00 0,02 ‐0,01 1,0000

RR SMC 0,51 0,34 0,18 0,02 7,58 0,0000

RR‐BLUP SMC 0,51 0,34 0,18 0,02 7,59 0,0000


6. CONCLUSIONES

En el presente trabajo se presentaron métodos estadísticos de SG que permiten predecir el

valor genético de los individuos con base en los MM, superando las dos principales dificultades de

los modelos de SG: la dimensionalidad de los datos y la multicolinealidad del modelo. Se

abarcaron tres estrategias: selección de variables, estimación penalizada o la combinación de

ambos, desde enfoques clásicos o bayesianos. Específicamente, se estudiaron seis métodos de

SG: selección de variables y estimación del modelo de regresión por mínimos cuadrados (SMC),

Regresión de Ridge clásica (RR), Regresión de Ridge con enfoque de modelos mixtos (BLUP‐RR),

Regresión de Ridge Bayesiana (BRR), Regresión LASSO Bayesiana (BLR) y Regresión LASSO clásica

(LR).

Asimismo, los métodos se aplicaron a datos empíricos se evaluaron en 20 poblaciones

biparentales F3 correspondientes a dos GH utilizados en un programa de mejoramiento de maíz

de la compañía multinacional Monsanto. Para cada población se contaba tanto con datos

correspondientes a los caracteres fenotípicos: humedad del grano a cosecha, el peso hectolítrico y

el rendimiento en grano como con datos de MM. Las poblaciones presentaron variabilidad en

distintos aspectos: número de familias, número de SNPs evaluados, número de ambientes en que

se evaluó cada carácter, distribución de MM a lo largo del genoma.

La aplicación los distintos métodos de SG fue presentada detalladamente para una población

y un carácter en particular a modo de ejemplo. En primer lugar, la población de dividió al azar en

dos conjuntos, uno de entrenamiento (75%) y otro de validación (25%). Para cada modelo, con

base en los valores genéticos y a los datos de MM del entrenamiento, se obtuvo la estimación de

los coeficientes de MM. Con las estimaciones de los coeficientes y los datos de MM de las familias

en el conjunto de validación, se predijo su desempeño. La habilidad predictiva de cada modelo se


evaluó estimando la correlación entre el valor predicho y el observado en el conjunto de

validación.

Siguiendo un proceso similar al descripto para una población y un carácter fenotípico, la

aplicación se extendió a todas las poblaciones y caracteres cuantitativos disponibles con los fines

de evaluar y comparar la habilidad predictiva de cada método. Esta última etapa, consistió de la

estimación de un total de 360 (20 x 3 x 6) modelos. Tales estimaciones permitieron el cálculo de

las correlaciones entre valor predicho y observado de las familias en el conjunto de validación de

cada población y así se obtuvo una medida de la habilidad predictiva en cada uno de los 360

análisis.

El método SMC se basó en emplear selección de variables previo al ajuste por mínimos

cuadrados del modelo de SG con múltiples marcadores. La técnica de selección de variables

empleada fue la más sencilla, ya que se basó en la probabilidad asociada al MM en un modelo por

marcador individual. SMC resultó de aplicación simple ya que utilizó el método de mínimos

cuadrados disponible en cualquier paquete estadístico. Sin embargo, el desempeño en términos

de habilidad predictiva de SMC fue el más pobre de todos los métodos estudiados,

independientemente del carácter fenotípico o GH. La correlación media (de todos los análisis)

entre el valor predicho y el observado dentro del conjunto de validación fue de 0,34 ± 0,19, al

menos un 20% menor que los otros métodos. El método SMC no evitó que se generen problemas

de multicolinealidad en el modelo; además, para poder llevar a cabo la estimación por mínimos

cuadrados, se debió incorporar un número limitado de MM en el modelo (inferior al número de

familias) y la baja habilidad predictiva podría explicarse por el sobreajuste del modelo. Estos

resultados coinciden con las conclusiones a las que arriban Bernardo y Yu (2009), a través de

datos simulados de cruzamientos de prueba. Los autores indican que, para distintos niveles de

heredabilidad, distinta cantidad de QTL y tamaños de muestra, los métodos de SG que no

involucran la identificación de los marcadores asociados a los caracteres de interés (es decir, que


no hacen selección de variables) superan a los métodos que involucran la búsqueda de un

subconjunto de marcadores que afecten significativamente al carácter. Estos resultados

presentan a SMC como un método de baja habilidad predictiva y concuerdan con los primeros

estudios comparativos presentados por Meuwissen et al. (2001) en el marco de mejoramiento

animal y específicamente en el mejoramiento de maíz, en los trabajos de Bernardo y Yu (2007),

Mayor y Bernardo (2009) y Lorenzana y Bernardo (2009).

Los métodos de regresión de Ridge emplean el concepto de estimación penalizada. El mismo

pretende balancear la bondad del ajuste con la complejidad del modelo a través del uso de un

parámetro de regularización o penalización (�). Dentro de este enfoque, se estudiaron tres

metodologías alternativas: clásica (RR), basada en modelos mixtos (RR‐BLUP) y bayesiana (BRR).

Cada uno de ellas aborda el problema de selección del parámetro de penalización desde distintos

enfoques.

El método RR, requirió la búsqueda del valor óptimo de � que consistió en evaluar una grilla

de valores posibles de �, realizar validación cruzada con 10 submuestras para calcular el CMEP y

elegir aquél valor de � que lo haga mínimo. Este procedimiento no se encuentra disponible en

cualquier paquete estadístico, en este caso se utilizaron las funciones cv.glmnet y glmnet de la

librería glmnet (Friedman et al., 2010) en R; resultando de rápida y fácil implementación. La media

de la correlación entre el valor observado y el predicho por el modelo de SG en los conjuntos de

validación resultó: 0,51 ± 0,16.

El método basado en modelos mixtos, fue implementado a través de la función mixed.solved

de la librería rrBLUP (Endelman, 2011) en R y también resultó de fácil implementación y más

rápido que RR ya que no requiere la búsqueda del valor de penalización. RR‐BLUP, no mostró

diferencias significativas en la habilidad predictiva comparado con RR. En particular para la

humedad, la correlación media fue de 0,63 ± 0,11, valor del orden de la máxima correlación


encontrada por Lorenzana y Bernardo (2009) al aplicar RR‐BLUP en poblaciones biparentales de

maíz también provenientes de Monsanto. En cuanto al rendimiento en grano, en el presente

trabajo se obtuvo una correlación media de 0,41 ± 0,15 similar al máximo valor (0,43) encontrado

por Lorenzana y Bernardo (2009).

El enfoque BRR, se implementó utilizando la función BGLR de la librería de R con el mismo

nombre (de los Campos y Perez‐Rodriguez, 2014). Su ejecución tiene mayores desafíos, en primer

lugar, por la definición de los hiper‐parámetros de las distribuciones a priori propias de la

estimación bayesiana, en segundo lugar por el tiempo computacional que demanda el método

iterativo y en tercer lugar pero no menos importante, requiere el estudio de la convergencia de

las estimaciones de las varianzas. Se encontró que la habilidad predictiva para la contrapartida

bayesiana de la regresión de Ridge fue significativamente inferior a la habilidad predictiva de RR y

RR‐BLUP: 0,42 ± 0,18. El desempeño más pobre de BRR respecto de RR o RR‐BLUP no era de

esperar ya que, como señalan de los Campos et al. (2013), tanto RR como BRR realizan una

penalización que es homogénea a través de todos los MM, esto puede deberse a efectos en la

sdefinición de los hiper‐parámetros de las distribuciones a priori poco informativas.

De los tres enfoques de la regresión de Ridge, el RR‐BLUP es en cierta forma más fácil y

directo de implementar ya que no realiza una búsqueda del parámetro de penalización (este valor

se relaciona al cociente entre las varianzas del error y de los coeficientes de los MM) y se puede

estimar utilizando cualquier paquete estadístico que permita llevar a cabo la estimación de

modelos mixtos. De hecho, en el marco de la SG, el método RR‐BLUP es más ampliamente

aplicado (de los Campos et al., 2013). Su habilidad predictiva se destaca en distintos estudios en el

marco del mejoramiento animal (Meuwissen et al., 2001; Habier et al., 2007), con datos

simulados (Bernardo y Yu, 2007; Lorenz, 2013) y con datos reales de mejoramiento vegetal en

distintos cultivos como Heffner et al. (2011) en trigo, Zhong et al. (2009) en avena, Lorenzana y


Bernardo (2009) en arabidopsis, avena y maíz y además, específicamente para este último cultivo

Riedelshelmer et al. (2013), Jacobson et al. (2014), entre otros.

La regresión LASSO en su enfoque bayesiano (BLR) se considera como un método de

estimación penalizada ya que no asigna valores nulos a los coeficientes, es decir, no realiza

selección de variables. Se encontró que la habilidad predictiva del método BLR, no difiere

significativamente de la habilidad predictiva hallada para RR y RR‐BLUP (0,51 ± 0,16). Este

resultado se contrapone con la conclusión a la que arriban Crossa et al. (2010) en líneas de trigo

donde encuentran que el método BLR muestra mayor habilidad predictiva que el RR‐BLUP, al igual

que en el trabajo de Pérez et al. (2010) con datos simulados. Ambos trabajos establecen que el

motivo por el cual se espera que BLR se desempeñe mejor que RR‐BLUP es porque BLR no

produce una penalización homogénea a través de todos los MM, sino que permite cierta

flexibilidad. Por otro lado, Endelman (2011) establece que la capacidad predictiva del método BLR

(implementado con la función BLR de R) es equivalente a la encontrada con RR‐BLUP (usando la

función mixed.solve) en 7 fenotipos de datos de líneas de trigo; lo cual soporta no solo la

metodología empleada en el presente trabajo sino también los resultados hallados. Es importante

notar que el enfoque BLR tiene similar complejidad que BRR, en términos de selección de

parámetro de penalización, tiempo computacional y estudio de convergencia de la componente

de varianza del residual, y que entre estos dos métodos la habilidad predictiva de BLR fue

significativamente superior.

Finalmente, la aplicación del método de regresión LASSO clásico (LR), combina estrategias de

selección de variables con métodos de penalización sobre los coeficientes. La estimación vía LR es

más rápida que BLR (similar al caso de RR versus BRR) pero, al igual que BLR, no está disponible en

cualquier paquete estadístico básico. De hecho, es el método menos aplicado en SG pues

restringe el número de coeficientes no nulos en el modelo hasta un máximo equivalente al

número de familias menos 1. Este método, asume que sólo unos pocos MM afectan la variable


respuesta, lo cual puede o no ser válido para el carácter fenotípico en estudio. Con los datos

analizados en el presente trabajo, se encontró que la habilidad predictiva media para LR fue de

0,44 ± 0,18, significativamente superior a SMC, de similar desempeño que BRR y BLR pero de

inferior desempeño que RR y RR‐BLUP en los tres caracteres fenotípicos analizados.

Uno de los objetivos fue estudiar si la habilidad predictiva de un modelo de SG depende de

factores tales como el carácter fenotípico que se observa o características propias de las

poblaciones sobre los cuales se desea hacer la SG. Los resultados de la aplicación indicaron que

para la habilidad predictiva no existen efectos de interacción de tercer ni segundo orden entre

GH, carácter fenotípico y método de SG empleado. Asimismo, en este trabajo se encontró que la

habilidad predictiva de un modelo de SG para poblaciones de maíz dependió significativamente

de la metodología aplicada, siendo los métodos BLR, RR‐BLUP y RR los de mejor desempeño,

luego BRR y LR y en último lugar el método SMC. Además, se encontraron evidencias significativas

de que la habilidad predictiva del modelo depende de la carácter observado; los modelos de SG

presentaron mejor desempeño para la humedad (correlación media de 0.56), en segundo lugar

para peso hectolítrico (correlación media de 0.44) y por último para rendimiento (correlación

media de 0.37). Este ordenamiento es acorde a los valores de heredabilidad estimados, siendo la

humedad el carácter que presentó los valores más altos de heredabilidad en todas las poblaciones

(54.1% a 90.9%), peso hectolítrico con valores intermedios (49.9% a 81.2%) y por último el

rendimiento, con los valores más bajos de heredabilidad (40% a 71.3%). Estos resultados

mantienen la misma tendencia que presentan en el trabajo Jacobson et al. (2014) utilizando

únicamente el método RR‐BLUP un conjunto mayor de poblaciones de maíz de Monsanto. Por

otro lado, no se encontraron evidencias significativas de dependencia entre la habilidad predictiva

del modelo y el GH al cual pertenece la población ni con la similaridad entre los parentales que

dan origen a la población.


7. DISCUSIÓN

La aplicación de SG consiste en primer lugar, del desarrollo de un modelo basado en un

conjunto de individuos para los cuales se cuenta tanto con datos fenotípicos como con datos

provenientes de una alta densidad de MM ubicados a lo largo del genoma. Este modelo se utiliza

luego para realizar selección de otros individuos para los cuales sólo se dispone de datos de MM

(Thomson, 2014). Por razones computacionales, no fue factible el ajuste un modelo para un

carácter que contemplara simultáneamente efectos ambientales y genéticos expresados en

función de los MM. Por lo tanto, la estimación del modelo se realizó en dos etapas. La primera se

concentró en estimar los valores genéticos a través de un modelo mixto que contemplaba efectos

ambientales y genéticos, estos últimos sin incluir MM). En la segunda etapa, se estimó el modelo

de SG propiamente dicho, donde los valores genéticos fueron expresados en función de los MM a

través de un modelo de regresión lineal. Sin embargo, el método RR‐BLUP, que estuvo entre los

de mejor desempeño en este trabajo, permitiría superar esta limitante ya que emplea un modelo

mixto donde se pueden incorporar además los efectos de ambiente.

Los distintos métodos aplicados en el presente trabajo son sólo algunos de los múltiples

métodos que pueden aplicarse para llevar a cabo SG. La versión del método de SMC fue aplicada

como el escenario más desfavorable que no contempla los problemas de multicolinealidad

presente en los datos, sin embargo, debe reconocerse que esta versión puede ser optimizada

aplicando algún método de selección de variables y luego realizar ajuste por mínimos cuadrados.

En cuanto a los enfoques penalizados, existen otros métodos que resultan un compromiso entre

la penalización de Ridge y la LASSO (disponibles en la librería de R glmnet). Además, se han

implementado otros métodos en el marco de la SG tales como, BayesA, BayesC, y métodos no

paramétricos (redes neuronales, “random forest”) entre otros (de los Campos et al., 2013).


En la aplicación de los métodos de SG a una población y carácter particular, se observó que

los coeficientes de regresión estimados en cada método variaron. Por un lado, pueden variar en la

escala debido a que las funciones de las distintas librerías de R pueden centrar y/o estandarizar

tanto las variables explicativas como la respuesta. Sin embargo, los patrones dentro de cada uno

de los cromosomas variaron de un método a otro. Si bien la identificación de regiones del genoma

no es el objetivo principal de los métodos de SG, no se encontró bibliografía que estudie la

dependencia de los distintos métodos de SG y la posibilidad de identificar regiones del genoma

asociadas con el carácter de interés que señala de los Campos et al. (2009).

En la actualidad, uno de los mayores desafíos del mejoramiento genético basado en MM es

lograr buenas predicciones de los valores genéticos y para ello, la aplicación de métodos

estadísticos juega un rol crucial. La implementación de SG en la práctica implica tomar múltiples

decisiones que resultan determinantes por ejemplo, definir sobre qué caracteres fenotípicos se va

a llevar a cabo la SG, estudiando la precisión de los métodos de medición, la heredabilidad y

patrones de genes intervinientes. Otros aspectos a considerar son: la distribución eficiente de los

recursos para garantizar calidad en el proceso de SG, el tamaño (por ejemplo, número de

poblaciones, años y ambientes), la composición del conjunto de entrenamiento del modelo de SG

(para los cuales se realiza la observación delos caracteres fenotípicos y de los genotipos de los

MM para los individuos), la densidad de los marcadores, la elección del modelo, entre otros.

Todos estos factores afectan la capacidad predictiva de los métodos de SG (de los Campos et al.,

2013). Algunos factores que afectan la habilidad predictiva del modelo claramente no son

controlables. Por ejemplo, la heredabilidad del carácter sobre el cual se realiza selección, la

estructura genética, la expansión del desequilibrio de ligamiento.

Este trabajo se concentró en estudiar un aspecto controlable que afecta la habilidad

predictiva: la definición del modelo de SG a emplear Los estudios de simulación indican que la

elección del modelo depende de la arquitectura genética, es decir, del número de QTL


intervinientes, entre otros factores. En el presente trabajo se encontró que los métodos de

penalización RR, RR‐BLUP y BLR tienen la mayor habilidad predictiva entre los seis métodos

estudiados para las poblaciones biparentales de maíz analizadas. Estudios empíricos recientes

concluyen que todos los resultados anticipados por medio de estudios de simulación no son

totalmente confirmados al trabajar sobre datos reales (de los Campos et al., 2013). Por lo tanto, el

mejor modelo de SG en términos de habilidad predictiva depende de cada conjunto de datos; de

allí la importancia de realizar estudios comparativos cubriendo diferentes enfoques como los

presentados en esta tesis.

Todos los restantes factores controlables deberían ser materia de estudio a la hora de aplicar

SG. La densidad de los MM es un factor que puede incrementar la habilidad predictiva de un

modelo (Bernardo y Yu, 2007; Lorenzana y Bernardo, 2009; Heffner et al., 2011; Combs y

Bernardo, 2013). En este trabajo se disponía de un número limitado de SNPs por población y

además se tenía información de MM imputados para incrementar la densidad a través del

genoma. Podría ser de interés estudiar otros métodos de imputación como una estrategia para

mejorar no sólo la habilidad predictiva de los métodos de SG sino también como una forma de

hacer uso más eficiente de recursos Jacobson et al. (2015).

El tamaño de la muestra afecta la habilidad predictiva de cualquier modelo de regresión pues

los errores estándares de los coeficientes son menores a medida que el tamaño muestral

aumenta (de los Campos et al., 2013). En la aplicación de SG, los coeficientes de los MM son

estimados dentro del conjunto de entrenamiento. Luego, esas estimaciones son utilizadas para

predecir el desempeño de los individuos en el conjunto de validación para los cuales se dispone

de MM pero no de datos fenotípicos. En este trabajo, el conjunto de entrenamiento consistió de

una submuestra de cada población, lo cual le da la característica de ser representativo de la

población objetivo; sin embargo, el tamaño del conjunto de entrenamiento se encuentra acotado.

Una forma de incrementar el tamaño muestral podría abordarse combinando múltiples


poblaciones biparentales de acuerdo con la propuesta de múltiples autores (Schulz‐Streeck et al.,

2012; Zhao et al., 2012; Riedelsheimer et al., 2013; Jacobson et al., 2014).


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9. ANEXO

PROGRAMAS

############################################################################# # Aplicación de métodos de selección a una población y carácter particular ############################################################################# # Definiciones previas ------------------------------------------------------ # Carga de librerias: library(rrBLUP) # RR-BLUP library(BLR) # métodos de selección genómica bayesianos library(BGLR) # métodos de selección genómica bayesianos library(glmnet) # RR y BL clásicos # Objetos Cargados: > impGeno[1:5,1:5] M00009437448 M00000202568 M00009439062 M00000139270 M00000213079 00000000001 1 1 1 -1 1 00000000002 0 0 0 0 0 00000000003 0 0 0 0 0 00000000004 0 0 0 0 0 00000000005 0 0 0 0 0 > Pheno_pred[1:5,] Hum Peso Rinde [1,] -1.1043 0.4073 5.243 [2,] -0.8293 0.2987 2.717 [3,] -0.2435 -0.1347 -3.077 [4,] 0.5337 0.3968 -6.324 [5,] -1.4391 0.5760 2.055 # Definiciones para el ajuste modelos SG --------------------------------------- # Definiciones Datos X=as.matrix(impGeno) Y=as.matrix(Pheno_pred[,Traits]) N<-nrow(X) p<-ncol(X) # Conjunto Entrenamiento y Validación set.seed(1235) tst<-sample(1:N,size=round(N*.25),replace=FALSE) XTRN<-X[-tst,];dim(XTRN) XTST<-X[tst,];dim(XTRN) t=1 y<-Y[,t] yTRN<-y[-tst] yTST<-y[tst] # SMC: Selección de Variables y ajuste por mínimos cuadrados ------------------- # Regresión por marcador individual SNPestimate=numeric() SNPes=numeric() SNPt=numeric() pValues=numeric() for(i in 1:p){ fm<-lm(yTRN~XTRN[,i]) SNPestimate[i]<-summary(fm)$coef[2,1] SNPes[i]<-summary(fm)$coef[2,2] SNPt[i]<-summary(fm)$coef[2,3] pValues[i]<-summary(fm)$coef[2,4] print(paste('Fitting Marker ',i,'.',sep='')) } names(pValues)=colnames(XTRN)


One_MM_results=merge(MAP,data.frame(marker=names(pValues),pVal=pValues),by="marker") One_MM_results=One_MM_results[order(One_MM_results$"cr",One_MM_results$"pos"),] myRanking<-order(pValues) # da el ranking del MM (1= menor p-value) rbind(pValues[1:14],myRanking[1:14]) CorTRN<-numeric() CorTST<-numeric() for(i in 1:(min(p,round(.75*N)))){ tmpIndex<- myRanking[1:i] fm<-lm(yTRN~XTRN[,tmpIndex]) CorTRN[i]<-cor(yTRN,predict(fm)) bHat<-coef(fm)[-1] ; bHat<-ifelse(is.na(bHat),0,bHat) yHat<-as.matrix(XTST[,tmpIndex])%*%bHat CorTST[i]<-cor(yTST,yHat) print(paste('Fitting Model with ',i,' markers!',sep='')) } ResultsSMC=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t], maxCor_TRN=max(CorTRN),NoMkr=which.max(CorTRN), Cor_TST=CorTST[which.max(CorTRN)], meanCor_TRN=mean(CorTRN),meanCor_TST=mean(CorTST)) # RR: Regresión de Ridge Clásica ----------------------------------------------- # funcion f_lambda con TST incluido f_lambda = function(lambda, C,rhs,XTRN,yTRN,XTST,yTST) { # adds lambda to the diagonal of C (starts at 2) for(j in 2:ncol(C)){C[j,j]<-C[j,j]+lambda} CInv<-chol2inv(chol(C)) sol<-crossprod(CInv, rhs) yHatTRN<-XTRN%*%sol CorTRN<-cor(yTRN,yHatTRN) yHatTST<-XTST%*%sol CorTST=cor(yTST,yHatTST) print(c(lambda,CorTST)) print(c(lambda,CorTRN)); CorTRN } CorTRN<-numeric(); CorTST<-numeric() C0<-crossprod(XTRN) rhs<-crossprod(XTRN,yTRN) Lambda_Opt=optimize(f_lambda,c(5,5000),C=C0,rhs=rhs,XTRN=XTRN,yTRN=yTRN, yTST=yTST,XTST=XTST,tol=10,maximum=T) Lambda_Opt C<-C0 # adds lambda to the diagonal of C (starts at 2) for(j in 2:ncol(C)){ C[j,j]<-C[j,j]+Lambda_Opt[[1]] } CInv<-chol2inv(chol(C)) sol<-crossprod(CInv, rhs) yHatTRN<-XTRN%*%sol CorTRN<-cor(yTRN,yHatTRN) if (round(CorTRN,4)!=round(Lambda_Opt[[2]],4)) stop("issue with Optimize!" ) yHatTST<-XTST%*%sol CorTST<- cor(yTST,yHatTST);CorTST ResultsRR=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t],maxLambda=Lambda_Opt[[1]], maxCorr_TRN=CorTRN[1],Corr_TST=CorTST[1])


# RR-BLUP: Regresión de Ridge BLUP ----------------------------------------- #predict marker effects model=mixed.solve(y=yTRN,Z=XTRN,method="REML", SE=TRUE) model$Vu;model$Ve;model$Ve/model$Vu;log(model$Ve/model$Vu,10) lambda_RRblup=model$Ve/model$Vu; ResultsRR_BLUP=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t],lambda_RRblup=lambda_RRblup, Corr_TRN=cor(XTRN%*%model$u,yTRN)[1], Corr_TST=cor(XTST%*%model$u,yTST)[1]) # BRR: Regresión de Ridge Bayesiana ------------------------------------------ nIter=150000 burnIn=50000 thin=10 ETA=list(MRK=list(X=XTRN, model="BRR",S0=1,df0=4)) # dfb=5 by default fm_BRR<-BGLR(y=yTRN,response_type = "gaussian", ETA=ETA,nIter=nIter,burnIn=burnIn, saveAt=paste("BRR",Traits[t],pop,sep="-"),thin=thin) fm_BRR$varE ### Gráfico convergencia varE varE_serie<-scan(file=paste(paste("BRR",Traits[t],pop,sep="-"),"varE.dat",sep="")) xyplot(varE_serie~seq(1,nIter,by=thin),type="o", xlab=list(cex=1.5,label="Iteración"), ylab=list(cex=1.5,label="Var Residual"), scales=list(cex=1.5,alternating=F), panel=function(...){ panel.grid(...,h=-1,v=0,lty=2,col.line="grey") panel.xyplot(...,col=1,ylim=c(0,0.7)) panel.abline(v=50000,col=2,lty=3) panel.abline(h=fm_BRR$varE,col=2,lwd=2)}) ### Gráfico convergencia varB varB_serie<-scan(file=paste(paste("BRR",Traits[t],pop,sep="-"),"ETA_MRK_varB.dat",sep="")) varB=mean(varB_serie[(burnIn/thin+1):length(varB_serie)]) xyplot(varB_serie~seq(1,nIter,by=thin),type="o", xlab=list(cex=1.5,label="Iteración"), ylab=list(cex=1.5,label="Var MM"), scales=list(cex=1.5,alternating=F), panel=function(...){ panel.grid(...,h=-1,v=0,lty=2,col.line="grey") panel.xyplot(...,col=1,ylim=c(0,0.4)) panel.abline(v=50000,col=2,lty=3) panel.abline(h=varB,col=2,lwd=2)}) z_coef=fm_BRR$ETA$MRK$b/fm_BRR$ETA$MRK$SD.b names(z_coef)=fm_BRR$ETA$MRK$colNames lambda_BRR=fm_BRR$varE/varB;log(lambda_BRR,10) ResultsBRR=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t], lambda_BRR_BGLR=lambda_BRR, corTRN=cor(yTRN,XTRN%*%fm_BRR$ETA$MRK$b)[1], corTST=cor(yTST,XTST%*%fm_BRR$ETA$MRK$b)[1], varE=fm_BRR$varE,varBR=varBR)) # BLR: Regresión LASSO Bayesiana lambda fijo ----------------------------------- h2<-0.8369; df0<-4; K=0 for(i in 1:ncol(X)){ K<-K+var(X[,i])} lambda2_BL<-2*K*(1-h2)/h2 ETA=list(MRK=list(X=XTRN, model="BL",lambda=sqrt(lambda2_BL),type="FIXED",S0=1,df0=4)) fm_BLf<-BGLR(y=yTRN,response_type = "gaussian", ETA=ETA,nIter=nIter,burnIn=burnIn, saveAt=paste("BLf",Traits[t],pop,sep="-"),thin=10) ### Gráfico convergencia varE varE_serie<-scan(file=paste("BLf",Traits[t],pop,"varE.dat",sep="-")) xyplot(varE_serie~seq(1,nIter,by=thin),type="o", xlab=list(cex=1.5,label="Iteración"),


ylab=list(cex=1.5,label="Var Residual"), scales=list(cex=1.5,alternating=F), panel=function(...){ panel.grid(...,h=-1,v=0,lty=2,col.line="grey") panel.xyplot(...,col=1,ylim=c(0,0.4)) panel.abline(v=50000,col=2,lty=3) panel.abline(h=fm_BLf$varE,col=2,lwd=2)}) z_coef=fm_BLf$ETA$MRK$b/fm_BLf$ETA$MRK$SD.b names(z_coef)=fm_BLf$ETA$MRK$colNames varB=2*fm_BLf$varE/lambda2_BL par_DE=lambda2_BL/fm_BLf$varE;par_DE ResultsBLR=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t], lambda2_BLf=lambda2_BL, corTRN=cor(yTRN,XTRN%*%fm_BLf$ETA$MRK$b)[1], corTST=cor(yTST,XTST%*%fm_BLf$ETA$MRK$b)[1], varE=fm_BLf$varE,varB=varB)) # BL: Regresión LASSO clásica --------------------------------------------------- # seleccion de lambda para LASSO cv.glmmod <- cv.glmnet(x=XTRN,y=yTRN,family = "gaussian",alpha=1, nfolds=10, standardize=FALSE,intercept=TRUE,type.gaussian="naive") plot(cv.glmmod) best_lambda <- cv.glmmod$lambda.min fm_LASSO<-glmnet(x=XTRN,y=yTRN,family = "gaussian",alpha=1, # LASSO (alpha=0 es RR) standardize=FALSE,intercept=TRUE,lambda=best_lambda) corTRN=cor(predict(fm_LASSO,XTRN),yTRN) corTST=cor(predict(fm_LASSO,XTST),yTST) coef=coef(fm_LASSO)[-1] ResultsLASSO=cbind(Project=ID,Trait=Traits[t], lambda_LASSO=best_lambda, corTRN=corTRN, corTST=corTST))

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Modelos de Selección Genómica para Caracteres