S145 Infectio. 2010; 14(S2): S145-S158Deteccin e identifcacin de
Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los mtodos
convencionales a las pruebas molecularesREVISIN DE TEMADeteccin e
identifcacin de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los
mtodos convencionales a las pruebas molecularesCsar O. Muoz1, Luz
E. Cano1, Angel Gonzlez1 Detection and identifcation ofthe fungal
pathogen Histoplasma capsulatum: from conventional to molecular
methodsCorrespondencia:Angel Gonzlez, Grupo de Micologa Mdica y
Experimental, Corporacin para Investigaciones Biolgicas (CIB),
Carrera 72A # 78 B 141, Medelln, Colombia. Tel.: 057-4-441 08 55
ext 206; Fax: 057-4- 441 55 14.Direccin electrnica:
[email protected]: 03/08/2010; Aceptado:
17/11/20101Grupo de Micologa Mdica y Experimental, Corporacin para
Investigaciones Biolgicas (CIB), Escuela de Microbiologa,
Universidad de Antioquia, y Escuela de la Salud, Universidad
Pontificia Bolivariana (UPB), Medelln, Colombia.Resumen
Lahistoplasmosis,micosissistmicayendmica en una amplia zona de las
Amricas, es causada por el hongo dimrfco Histoplasma capsulatum.
Tradicionalmente, el diagnstico de esta entidad se realiza por
mtodos microbiolgicos directos y biopsias que emplean una variedad
de coloracio-nes especiales tales como Wright, Giemsa y plata
metenamina,entreotras,ascomoporcultivo; este ltimo representa el
estndar de oro. Se em-plean, igualmente, mtodos indirectos que
inclu-yen la deteccin de anticuerpos y antgenos. Los valores de
sensibilidad y especifcidad en ambos mtodos son variables, y los
resultados dependen, a su vez, de la forma clnica de la enfermedad
que presente el paciente y de su estado inmune.
Recientemente,labiologamolecularhaper-mitidointroducirnuevasherramientasquehan
sido utilizadas para la deteccin e identifcacin de H.capsulatum,
una de ellas es la PCR anidada que se caracteriza por sus altos
niveles de sen-sibilidadyespecifcidad.Deigualforma,estas tcnicas
moleculares han permitido realizar an-lisisevolutivos, estudios de
diversidad gentica yunsinnmerodeestudiosdeepidemiologa
molecular,apartirdeloscualessehalogrado
recopilarinformacinvaliosasobrelavariabili-dad gentica de este
microorganismo. Enestarevisinsedescribenlosmtodosde laboratorio
convencionales y las tcnicas
mole-cularesmsempleadasparaeldiagnsticode la histoplasmosis; as
como tambin algunas de sus aplicaciones en la epidemiologa y
biologa molecular de este
hongo.Palabrasclaves:Histoplasmacapsulatum,
Histoplasmosis,Diagnstico,Tcnicasconven-cionales, Diagnstico
molecular.AbstractHistoplasma capsulatum is the causative agent of
histoplasmosis, a systemic and endemic mycosis S146 ASOCIACIN
COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA INFECTIOMuoz C, Cano L, Gonzlez
Awidely distributed in the Americas. Diagnosis of
histoplasmosisistraditionallyaccomplishedby means of direct
preparations and biopsies stained
byespecialmethods,aswellasbyisolationof
fungusinculture;thelatterisconsideredthe
goldstandard.Indirectmethods,including
immunologicalteststodetectantibodies
and/orantigens,arealsovaluable;bothdirect
andindirectmethodspresentsensitivityand
specifcityrangesthatvarydependingonthe
clinicalformofthediseaseandtheimmune
statusofthehost.Recently,molecularbiology
hasallowedimplementingnewtoolsto
detectandidentifyH.capsulatum,andseveral
moleculartests,suchasnested-PCR,arebeing used for the diagnosis of
histoplasmosis, and so provide high sensitivity and specifcity
values. In addition, these molecular techniques have made it
possible to perform evolution analysis, genetic diversity research,
and molecular epidemiology, thuscompilingvaluableinformationonthe
genetic variability of this microorganism.
Inthisreview,theconventionalandmolecular
methodsemployedforthediagnosisofhisto-plasmosis have been
described, as have some of
theapplicationsofthesemoleculartechniques to this fungal pathogens
epidemiology and mo-lecular
biology.Keywords:Histoplasmacapsulatum,Histo-plasmosis,Diagnosis,Conventionaltechniques,
Molecular diagnosis.IntroduccinLa histoplasmosis, una micosis
sistmica y endmi-ca en una amplia zona de las Amricas, es causada
por la inhalacin de las partculas infectantesdel
hongodimrfcotrmicoHistoplasmacapsula-tum. En la naturaleza, este
hongo crece en forma flamentosa, pero una vez ingresa a los tejidos
del hospedero, se convierte en levadura (1-5). El
dimor-fsmo,consideradounfactordevirulencia,esde
particularinterspuestoqueesnecesariotanto para su adaptacin a los
tejidos como para el de-sarrollo de la enfermedad; as mismo,le
permite al microorganismo adaptarse a diferentes
condicio-nesambientalesgraciasalaexpresindegenes
especfcos,cuyosproductossoncrticospara
susupervivenciaylacolonizacin (5-7).Laforma
miceliardeH.capsulatumessaprofta-geoflica, y generalmente, se
encuentra en recintos o am-bientes cerrados(minas, cuevas, pozos,
casas o construcciones abandonadas), as como en espa-cios abiertos
contaminados con excretas de mur-cilago y de aves (ricos en
nutrientes necesarios para su crecimiento) (6-10).La dispersin area
de la fase miceliar de H. cap-sulatum es de gran importancia en la
disemina-cin a nuevos ambientes. Se ha establecido que las
infecciones ocurren a travs de la creacin de aerosoles que
contienen las partculas infeccio-sas, que al ser inhaladas por el
hospedero la ini-cian y en ciertos casos llevan al establecimiento
de la enfermedad (10,11). De igual manera, algunos animales como
aves y murcilagos pueden con-tribuir a la diseminacin de las formas
infeccio-sas en la naturaleza (12,13).Inicialmente, se tenan
descritas tres variedades paraestehongo:var.capsulatum,patgeno para
humanos en Amrica; var. duboisii, patge-no para humanos en frica; y
var. farciminosum, patgeno para equinos (10). Actualmente, gracias
alosestudiosdeepidemiologamolecular,ya
nosehabladevariedadessinodecladosy
paraH.capsulatumsehanidentifcadohastael
momentoochodiferentesqueserndescritos ms adelante (14).En relacin
con los cuadros clnicos de la
histo-plasmosis,stospuedenvariardependiendo
delestadoinmunedelhospedero,laedad,el
tamaodelinculoinhaladoylapresenciade
daosestructuralespulmonarespreviosque
puedapresentarelpaciente,comoeselcaso de la enfermedad pulmonar
obstructiva crnica (EPOC) (15).S147 Infectio. 2010; 14(S2):
S145-S158Deteccin e identifcacin de Histoplasma capsulatum por el
laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas
molecularesEnunhospederonormalydependiendodel
tamaodelinculo,laprimoinfeccinpuede ser asintomtica si es pequeo;
por el contrario, siesmasivo,puededesarrollarseunainfeccin aguda
severa, la que generalmente cursa con un
periododeincubacindeunaatressemanas.
Lainfeccinagudasuelemanifestarseconsn-tomas que simulan una gripe o
una neumonitis aguda, y puede acompaarse de adenomegalias
yartralgias,entreotrossntomas;sinembargo,
muchospacientesserecuperanespontnea-menteenpocosdasosemanasyquedan
lesionescalcifcadascomosecuelapulmonary extrapulmonar (10,15-17).En
el caso de pacientes con deterioro moderado de su estado inmune
(edad avanzada, desnutri-cin,diabetes,alcoholismo,tratamientoscon
corticosteroides,enfermedadesmalignas,entre otros) se observan
formas diseminadas crnicas
quesemanifestanporsntomasgenerales,le-sionescutneasulceradasolcero-vegetantes
en mucosas, hepato-esplenomegalia, infltrados pulmonares e
insufciencia suprarrenal
(10,15-17).Lasformasdiseminadasagudassepresentan generalmente en
pacientes con deterioro grave
desuinmunidadcelular:leucemia,linfomay,
especialmente,sndromedeinmunodefciencia
adquirida(sida).Enestospacientespredomi-nan las manifestaciones
generales como febre,
prdidadepeso,sntomasdigestivos,respira-torios,neurolgicos,seos,lesionescutneasy
mucosas,hepato-esplenoyadenomegalias.En algunos casos el progreso
de la enfermedad es rpido: va de horas a das
(10,15-24).Enpacientesinfectadosconelvirusdelain-munodefcienciahumana(VIH),originariosde
regiones endmicas para la micosis, la histoplas-mosis presenta
tasas que oscilan entre el 2 y el 5%, pero pueden llegar hasta un
25% en el caso de epidemias (25,26). Estos pacientes son propen-sos
a desarrollar formas diseminadas agudas, en las que los hallazgos
ms frecuentes son febre, prdidadepesoysntomasconstitucionales,
acompaadosenunaproporcinimportante por pancitopenia, compromiso
suprarrenal (80% en autopsias) y lesiones en piel y mucosas. El
sis-tema nervioso central est comprometido entre un 10 y un 25% de
los pacientes. En ausencia de
tratamiento,laenfermedadesrpidamentefa-tal, en das o semanas, pero
la muerte logra dis-minuirse por debajo del 25% con la instauracin
de una terapia antimictica oportuna (18-26). En Colombia, a pesar
de que la histoplasmosis es una de las micosis ms frecuentes, su
incidencia real e impacto en la salud pblica no son muy cla-ros,
dado que no es una enfermedad de notifca-cin obligatoria. Los pocos
datos que se conocen han sidoreportados por Ordoez y
colaborado-res1997 (27),quienesdescribieronlosresultados
deunestudiodedocebrotesepidmicosde
histoplasmosisocurridosenseisdepartamentos colombianos del rea
andina. En este estudio, las pruebas serolgicas realizadas en 332
individuos que estuvieron expuestos a los focos de infeccin
determinaronque11deellosconstituyeron
casosndicedehistoplasmosisaguda;estosin-dividuos presentaron
sntomas respiratorios, y en algunos casos se logr visualizar y
aislar el agente etiolgicodemuestrasclnicas.Adicionalmente, en 140
(42%) de los 321 individuos restantes las pruebas serolgicas fueron
positivas (27).
EnotrotrabajodesarrolladoporelgrupoCo-lombianoparaelestudiodelahistoplasmosis,
conformadoporelgrupodeMicrobiologadel
InstitutoNacionaldeSalud(INS)ylaCorpora-cinparaInvestigacionesBiolgicas(CIB),el
cualdiseen1996unaencuestanacionalde
vigilanciaconbaseenlaspautasestablecidas
porelcomitEuropeodeMicologaMdica; hastaelao2008sehabananalizado434
encuestasdepacientesdiagnosticadosconla
micosisentre1992y2008,provenientesde20
departamentosdelpas.Enesteestudiosere-port un predominio de adultos
(96,1%) de sexo masculino(77%),conunaedadpromediode 38,4 aos; y en
la poblacin de pacientes adultos el 70,5% tena co-infeccin con el
VIH (28).S148 ASOCIACIN COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA
INFECTIOMuoz C, Cano L, Gonzlez
APorotraparte,eldiagnsticodeestamicosis se realiza tradicionalmente
por mtodos micro-biolgicosconvencionalescomoelcultivo,las biopsias
y los exmenes directos utilizando una variedad de coloraciones
especiales; tambin se hace el diagnstico por mtodos inmunolgicos
que detectan la presencia de anticuerpos o ant-genos especfcos
(3,10,16,17,29). A pesar del aumento signifcativo en el nmero
deindividuosinfectadosconelVIH,loqueha incrementado la incidencia
de muchas enferme-dadesinfecciosas,entreellaslahistoplasmosis,
ennuestromediosesiguenutilizandoherra-mientasconvencionalesparaeldiagnsticode
estamicosis.Dichastcnicas,ademsdehacer
arduoydemoradoeldiagnstico,presentan
valoresdesensibilidadyespecifcidadmuyva-riables, lo que difculta an
ms el dictamen. Recientemente, la biologa molecular ha permitido
implementarherramientasmolecularesquehan
sidodegranutilidadparaelestudioeidentif-cacindediversoshongospatgenos
(13,30-32).En laactualidad,estastcnicasmoleculareshacen
posibleeldiagnsticodemuchasenfermedades
infecciosasconaltosnivelesdesensibilidadyde especifcidad
(33-42).Adems,estasmetodologas
hanpermitidorealizarestudiosdediversidad
gentica,anlisisevolutivosyunsinnmerode estudios epidemiolgicos que
han arrojado infor-macin valiosa sobre la gran variabilidad gentica
que presenta H.capsulatum (14, 30-33,43).Con el objetivo de
ilustrar a la comunidad m-dicayalosprofesionalesdelreadelasalud
sobre los diferentes mtodos diagnsticos para
confrmarlasospechaclnicadelahistoplas-mosis, hemos preparado esta
revisin de tema que se enfocar en los aspectos ms relevantes de las
tcnicas convencionales e inmunolgicas empleadas para el diagnstico
de esta micosis. Tambinserevisanlosnuevosacercamientos
metodolgicosreportadosenlaliteraturaque
buscanimplementareldiagnsticomolecular
comopruebaregularmenteempleadaparala
determinacindelahistoplasmosis,ylautili-daddeestaspruebasenalgunosestudiosde
epidemiologa.Deteccin e identificacin de H. capsulatum utilizando
tcnicas convencionales: Estas tcnicas pueden ser clasifcadas en: A)
m-todosdirectosomicrobiolgicos,enloscuales se visualiza o se asla
directamente el microorga-nismo, y B) mtodos indirectos o
inmunolgicos,
enloscualessedetectananticuerposproduci-dosporelpacientey/oantgenosomolculas
derivados del microorganismo (3,10,17,29,44,45).A. Mtodos
microbiolgicos o directos:A.1. Exmenes en fresco y coloraciones
especiales: Enelcasodelahistoplasmosis,elexamenen fresco
(observacin de la muestra directamente entre lmina y laminilla con
o sin KOH) o examen directoapartirdemuestrasclnicas,notiene mucho
valor debido a que el microorganismo se encuentra en el nivel
intracelular y es de un ta-mao muy pequeo (2-4 m), lo que difculta
su observacin en el microscopio (15). No obstante,
lascoloracionesespecialestalescomoWright,
Giemsa,elcidoperydicodeSchiff(PAS)yla plata metenamina o Grocott,
realizadas a partir de muestras respiratorias [lavados
broncoalveo-lares (LBA) y esputos inducidos (EI)], biopsias de
tejido, raspados de lesiones en piel y extendidos de mdula sea, se
usan con frecuencia para el diagnstico de esta micosis. La
observacin microscpica de estas tinciones
permitevisualizarlaslevadurasintracelulares,
localizadasenelcitoplasmademacrfagosy clulas fagocticas del sistema
inmune. Con co-loracioneshematolgicas(WrightoGiemsa)se tien de
manera parcial y aparecen rodeadas de un halo claro (falsa cpsula)
(Figura 1A); con tin-ciones especfcas para hongos como Grocott se
observanlevaduraspequeasdecolormarrn oscuro por la precipitacin de
los iones de plata (Figura 1B).S149 Infectio. 2010; 14(S2):
S145-S158Deteccin e identifcacin de Histoplasma capsulatum por el
laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas
molecularesEstos mtodos basados en tinciones presentan
unasensibilidadinferioral50%yunaamplia
variabilidadquedependedelaformaclnica de la micosis y de la
experiencia del observador (tabla1).Adicionalmente,laslevadurasdeH.
capsulatumsonpotencialmenteconfundidas
yerrneamenteidentifcadasconotrosmicro-organismos,entrelosqueseincluyenCandida
spp.,Penicilliummarneffei,Leishmaniaspp.,
Pneumocystisjirovecii,Cryptococcusneofor-mans,BlastomycesdermatitidisyLeishmania
spp, adems de artefactos (3,10,17,27,44-46). Por ello, las
coloraciones especiales no deben ser
utilizadascomonicaherramientaparaeldiag-nsticodeestamicosisdebidoalaprobabilidad
de un diagnstico errneo ocasionado por el alto nmero de falsos
positivos o negativos; por esto, generalmente, se recomienda que
las coloraciones se acompaen del cultivo
(3,10,17,29,44-46).A.2.CultivosparaelaislamientodeH.capsula-tum:
para realizar este tipo de pruebas, el labo-ratorio clnico debe
estar equipado con cmaras de bioseguridad nivel II-III y personal
de labora-torio capacitado en la manipulacin del hongo, debido a
que los cultivos de H.capsulatum, en su fase miceliar, permiten la
generacin de micro-conidias (partculas naturalmente
infectantes).Los medios de cultivo usualmente utilizados en
loslaboratoriosdemicologaparaaislareste
hongoson:elagardeinfusindecerebroy
corazn(BHIdelinglsbrainheartinfusin)
conunafuentedesangre(generalmentede
carnero)msantibiticosyciclohexamida,yel
Sabourauddextrosaagarmscicloheximiday
cloramfenicol(Mycosel,BBL).Enestosmedios, la cicloheximida inhibe
el crecimiento de hongos saprofticos contaminantes mientras que los
an-tibiticos frenan el desarrollo de bacterias. Figura 1. Aspecto
micro y macroscpico de H. capsulatum. A) Blastoconidias
intracelulares compatibles con H. capsulatum en una muestra clnica
de un lavado broncoalveolar coloreada con la tincin de Wright
(aumento 1000X); B) Blastoconidias compatibles con H. capsulatum en
una biopsia de piel coloreada con la tincin de Grocott (aumento
400X); C) Aspecto macroscpico de las colonias de H. capsulatum en
cultivo a temperatura ambiente (18-24oC) de una muestra clnica
respiratoria (correspondiente a un cultivo incubado por seis
semanas); D) Macroconidias tuberculadas caractersiticas de H.
capsulatum obtenidas de cultivo a temperatura ambiente (18-24oC),
tratadas con azul de lactofenol (aumento 400X).S150 ASOCIACIN
COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA INFECTIOMuoz C, Cano L, Gonzlez
ALa identifcacin del hongo se hace con base en
lascaractersticasmacroymicroscpicasdelas colonias. A temperatura
ambiente (por debajo de 24oC) H. capsulatum se comporta como un
moho decrecimientolento,deaparienciaalgodonosa,
colorblancoobeige.Algunascoloniaspueden ser granulares o
pulverulentas (fgura 1C); al
mi-croscopioseobservanhifasseptadas,delgadas, hialinas; la
esporulacin se basa en la produccin
demicroconidiasymacroconidiastuberculadas; las primeras miden de
dos a cinco micras; las se-gundas son muy caractersticas y son la
base de identifcacin de gnero y especie (fgura 1D). Los cultivos
presentan tambin valores de sensibi-lidad variable que dependen de
la forma clnica de la micosis y pueden alcanzar hasta un 85% de
sen-sibilidad en los casos de histoplasmosis pulmonar crnica y
diseminada (tabla 1) (3,10,16,17,25,44-46). Estos cultivos tienen
varias limitaciones entre las que se cuentan resultados falsos
negativos en el 20% de
loscasosdehistoplasmosisdiseminadayhas-tadel50%enlosdehistoplasmosispulmonar
crnica (3,29);lasensibilidadesmsbajaenpa-cientes con formas agudas
y leves de la micosis. Adems, este microorganismo es de crecimiento
lento,puesrequiriereentretresyseissemanas para su aislamiento en
los medios de cultivo an-tes descritos (3,10,17,25,44-48).
A.3.Hemocultivoporlisiscentrifugacin:enlos
ltimosaossehavenidodesarrollandoun
mtodoparaelaislamientoeidentifcacinde
H.capsulatumapartirdemuestrasdesangre,
denominadomtododelisis-centrifugacin,en
elcuallasangreextradaseponeencontacto con sustancias lticas, como
la saponina, que des-truyen los eritrocitos y los leucocitos y
liberan en el medio las levaduras intracelulares.
Actualmen-teesconsideradocomoelmtododeeleccin para el aislamiento
de este hongo. Sin embargo, aunque ha mostrado resultados
promisorios para eldiagnsticodeestamicosis,sonanpocos los
laboratorios que lo han implementado como prueba de uso regular
debido a que es laboriosa y difcil de estandarizar
(3,10,16,29,46,47). B. Mtodos indirectos o tcnicas
inmunolgicas.Muchas de estas tcnicas se basan en la detec-cin de
anticuerpos (Acs) contra el hongo pro-ducidos por el hospedero o de
antgenos espe-cfcosdelmicroorganismo,ysuanlisispuede ser
cuantitativo o cualitativo. Entre las principa-les pruebas
inmunolgicas encontramos:B.1.Fijacindecomplementoeinmunodifusin
engel-agar:pormuchasdcadaslaspruebas serolgicas ms ampliamente
utilizadas para la deteccin de anticuerpos contra H. capsulatum
hansidolafjacindelcomplemento(FC)yla inmunodifusin en gel-agar
(ID). La primera es una prueba inmunolgica que busca detectar y
medir la presencia de Acs fjadores de comple-mento especfcos contra
el hongo, presentes en elsuerooenellquidocefalorraqudeodelos
individuos infectados. Para realizar esta prueba se utilizan
antgenos obtenidos tanto de la for-ma de micelio (histoplasmina)
como de la leva-dura (completa). Los ttulos de Acs entre 1:8 y
1:16sonconsideradossugestivosdeunposible contacto con el hongo;
mientras que ttulos de Acs mayores a 1:32 se consideran indicativos
de unahistoplasmosisactiva (16,29,44).Porsuparte, la prueba de ID
en gel-agar permite identifcar dosbandasdeprecipitado,denominadasHy
M, que corresponden al reconocimiento de Acs especfcos contratales
antgenos presentes en elsuerodepacientesconhistoplasmosis.Los
antgenosHyMsonglicoprotenasquesue-Tabla 1. Porcentajes de
sensibilidad de las pruebas de laboratorio empleadas en el
diagnstico convencional de la histoplasmosis de acuerdo con la
forma clnica de la micosis.HPA: Histoplasmosis pulmonar aguda, HPC:
Histoplasmosis pulmonar crnica, HPD: Histoplasmosis progresiva
diseminada; Ag: Antgeno* Wright, Giemsa, Plata metenamina. *
*Inmunodifusin y fjacin del complementoInformacin adaptada de las
referencias 3,29,45.Pruebas de laboratorio HPA HPC HPDColoraciones
especiales* 10 17-40 43Cultivos 15 50-85 50-85Serologa** 95 90-100
70-80ELISA (deteccin de Ag) 25-75 15-22 92S151 Infectio. 2010;
14(S2): S145-S158Deteccin e identifcacin de Histoplasma capsulatum
por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas
moleculareslenserliberadasencultivosdeambasformas,
miceliarylevaduriforme.ElantgenoHtiene homologa con una
-glucosidasa y; se detecta hasta en el 10% de los casos y cuando
est pre-sente indica una infeccin activa. El antgeno M tiene
homologa con una catalasa y se identifca
enelsuerodeaproximadamente80%delos
pacientes;sinembargo,laIDnopermitedife-renciarunainfeccinrecientedeunapasada,
dado que los Acs contra este antgeno pueden persistir por meses y,
hasta aos, despus de la primo-infeccin (10,16,29,44).La
sensibilidad y la especifcidad de ambas
prue-basenladeterminacindeAcscontraH.capsu-latum dependen de la
forma clnica de la micosis (15). Es as como se ha reportado que la
FC y la ID son positivas aproximadamente entre el 90-100%
delospacientesconhistoplasmosispulmonar
crnica,yentreel70-80%delospacientescon
histoplasmosisdiseminada(tabla1) (3,10,16,26,44-46). Aunque la
prueba de FC presenta una sensibilidad ms alta en comparacin con la
ID, esta ltima es mucho ms especfca independientemente de la forma
clnica de la histoplasmosis (tabla 2).
tadospositivospuedendeberseainfecciones anteriores y sugerir,
incorrectamente, una histo-plasmosis activa en pacientes con otra
infeccin (los anticuerpos anti-precipitina M se mantienen
hastapordosaos),y4)puedenocurrirreac-ciones cruzadas en el 40% de
los pacientes con otrasmicosistalescomoparacoccidioidomico-sis,
blastomicosis y aspergilosis
(3,10,16,17,44-46).B.2.ELISAdirectaeindirectaparadeteccinde
anticuerpos:losmtodosinmuno-enzimticos
paraladeteccindeAcscontraH.capsulatum
hansidopocoutilizadosdebidoaladifcultad para su estandarizacin y a
su difcil interpreta-cin;adems,presentanaltareaccincruzada cuando
se utilizan sueros de pacientes con otras
enfermedadesmicticastalescomoparacocci-dioidomicosis,blastomicosis,aspergilosis,can-didiasisycoccidioidomicosis,loqueafectasu
sensibilidadyespecifcidad (3,16,29,49).Guimaraes ycolaboradores
(50)desarrollaronunensayo inmuno-enzimticoenelqueutilizaroncomo
antgenolahistoplasminadeglicosilada,conel cual se obtuvieron altos
valores de sensibilidad (92%), especifcidad (96%) y efciencia
(95%).B.3. Deteccin de antgenos: el uso de las tcnicas de
radioinmunoensayo (RIA) y ELISA y el empleo
deAcspoliclonaleshanpermitidodetectar,en pacientes con
histoplasmosis, la presencia de ant-genos de tipo polisacrido en
muestras de fuidos
corporalescomoorina,suero,lavadosbroncoal-veolaresylquidocefalorraqudeo
(3,10,16,17,29,49,51-54). Estastcnicassonunaherramientaimportante
nosloparaeldiagnsticodelahistoplasmosis,
sinoparaelseguimientodelospacientesyla determinacin de su respuesta
al tratamiento. De igual forma, son fundamentales para el
diagnsti-co de la micosis en pacientes con algn grado de
inmunosupresin,principalmentepacientescon sida, debido a que en
ellos la produccin de Acs se encuentra disminuida
(55).Enloscasosdehistoplasmosisdiseminada,
ladeteccindeantgenospermiterealizarun
diagnsticotemprano,inclusoantesdequeel Tabla 2. Comparacin de la
sensibilidad y especifcidad de las pruebas serolgicas utilizadas
para el diagnstico de la histoplasmosis.Informacin adaptada de las
referencias 3 y 45PruebasSensibilidad (%)Especifcidad (%)Fijacin de
complemento- Antgeno fase levadura- Antgeno fase
micelio94,372,870-8070-80Inmunodifusin:- Banda M- Banda H76239595No
obstante, ambas tcnicas presentan algunas
limitaciones,entrelasquesemencionan:1)
requerimientodedosaseissemanasparaque un individuo produzca Acs
despus de haber
es-tadoexpuestoalhongo;2)enpacientesinmu-nosuprimidos,
especialmente aquellos con sida,
sepresentannivelesdesensibilidadmuybajos debido a la disminucin en
la produccin de Acs que caracteriza este sndrome; 3) algunos
resul-S152 ASOCIACIN COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA INFECTIOMuoz
C, Cano L, Gonzlez Amicroorganismoseasleencultivo.Adems,
estapruebasueledarpositivamuchoantes
delaaparicindelosAcs,comoeselcasode
lahistoplasmosispulmonaraguda,loquela
convierteenunaherramientarelevantepara eldiagnsticodeestamicosis
(3,10,16,17,29,46,49). Aunque la sensibilidad de la ELISA en la
detec-cin de antgenos presenta valores altos (hasta
del90%enlasdiferentesformasclnicasdela histoplasmosis), sta depende
en gran parte del tipo de muestra utilizada. Se sabe que muestras
como la orina son ms sensibles que el suero o el plasma
(3,10,17,29,46,49).
Latabla3resumealgunosvaloresdesensibili-dadenladeteccindeantgenosdepacientes
conhistoplasmosisdiseminada.Ademsde presentar reaccin cruzada con
otras entidades tales como paracoccidioidomicosis, blastomico-sis y
peniciliosis, la deteccin de antgeno tanto en orina (antigenuria)
como en suero (antigene-mia) pueden presentar falsos positivos
debido a diversos factores como la presencia de Acs IgG
humanosinespecfcosyelfactorreumatoide.
Tambinpuedenmostrarseresultadosfalsos
negativosdebidoaunacargafngicabajaal momento de la toma de la
muestra o al uso de antifngicos (3,16,29,56).Adicionalmente, se han
desarrollado otras tcnicas deELISAqueutilizanAcsmonoclonalesparala
deteccin de antgenos circulantes especfcos del hongo, y tienen una
alta sensibilidad y especifci-dad por lo cual permiten, adems, el
seguimiento delospacientesantesyduranteeltratamiento. Igualmente,
son varios los reportes sobre la estan-darizacin de nuevas pruebas
del tipo ELISA que buscanmejorarlasensibilidadylaespecifcidad;
infortunadamentenoestnandisponiblesen nuestromedio
(55,57-63).LapruebabasadaenRIA
paradetectarantgenoensueroyorinadeindi-viduos infectados, presenta
una alta sensibilidad y especifcidad (61); sin embargo, requiere de
un equi-po sofsticado y est disponible solo en los labora-torios de
tercer y cuarto nivel de
complejidad.Recientementesedesarrollunatcnicade ELISA de captura
que al utilizar Acs policlonales permite la deteccin de antgenos de
H. capsu-latumenmuestrasdeorinadepacientescon
sidaehistoplasmosisdiseminadaprogresiva,
conunasensibilidadyespecifcidaddel81%y
del96%,respectivamente.Lomsimportante
deestatcnicaesquesetratadeunaprueba de laboratorio sencilla que
puede ser fcilmen-teimplementadaenlaboratoriosconrecursos limitados
(64).Actualmente,nuestrogrupose encuentra en el proceso de
validacin e imple-mentacin de esta tcnica. Tcnicas moleculares para
el diagnstico de H. capsulatum:Enlosltimosaos,labiologamolecularha
ofrecido potentes herramientas para el diagns-tico de muchas
infecciones ocasionadas no slo por hongos patgenos sino por otras
clases de microorganismos,talescomobacterias,virusy parsitos. Estas
tcnicas moleculares, basadas en su mayo-ra, en la PCR o en
modifcaciones de sta,
inclu-yen:laamplifcacinaleatoriadepolimorfsmos
deDNA(RAPD-delinglsRandomAmplifca-tionofPolymorphicDNA),ladeterminacinde
polimorfsmosenlalongituddefragmentosde Tabla 3. Histoplasmosis
progresiva diseminada: porcentajes de sensibilidad de las pruebas
serolgicas y deteccin de antgenos en muestras de pacientes
inmunocompetentes, con el sindrome de inmunodefciencia adquirida
(sida) u otro tipo de alteracin inmunolgica.Prueba Estado inmune de
los pacientesInmunocompetente Sida
Otra*SerologaIDFC71-10085-9758-6060-7057-7760-79Deteccin de
AgAntigenuriaAntigenemia806795868260Ag: Antgeno; ID: Inmunodifusin;
FC: Fijacin del complemento*Pacientes con cncer u otras
malignidades hematolgicas, transplantados de rganos slidos o que
reciben terapias inmunosupresoras.Reproduccin con autorizacin de
Trends in Microbiology(29).S153 Infectio. 2010; 14(S2):
S145-S158Deteccin e identifcacin de Histoplasma capsulatum por el
laboratorio: de los mtodos convencionales a las pruebas
molecularesrestriccin (RFLP - del ingls Restriction Fragment Length
Polymorphism), la reaccin en cadena de
lapolimerasaentiempo(qRT-PCR-delingls Real Time Polymerase Chain
Reaction) y la PCR anidada(nested-PCR).Estosmtodosofrecen
unaimportantealternativaparaeldiagnstico rpido de las afecciones
ocasionadas por diferen-tes tipos de microorganismos
(35,37,41,42,44,65).Sonvarioslosinformessobrelautilizacinde
herramientas moleculares para el diagnstico de la histoplasmosis,
los cuales estn basados en la amplifcacin de una variedad de genes
blanco
delmicroorganismo,cuyosvaloresdesensibi-lidadyespecifcidadsonvariables(69-100%y
77-100%,respectivamente),yquetambinde-pendendelosoligonucletidosutilizadospara
la amplifcacin (tabla 4). Es as como en el 2001, Bialek y
colaboradores (66) reportaron el desarrollo de una nueva prueba de
PCR anidada que amplifca la subunidad pequea del RNA ribosomal
(rRNA) aplicada al diagnsti-co en un modelo experimental de
histoplasmosis. En este trabajo se demostr que, en comparacin con
los cultivos, esta prueba era estadsticamente ms sensible para
detectar el microorganismo, y positiva en presencia de tan solo
cinco levaduras enlamuestraprocesada;adicionalmente,era mucho ms
rpida que los cultivos (1 vs. 21 das, aproximadamente) (66).
Posteriormente, este mis-mogrupoevaludospruebasdePCRanidada
paraladeteccindeDNAdeH.capsulatumen muestras de tejido humano
utilizando un nuevo gen blanco denominado Hc100 que amplifcaba
unasecuenciadelgenquecodifcaparauna
protenade100-kDa,nicayespecfcadeH. capsulatum, descrita y
caracterizada previamente (67, 68). Este estudio demostr que ambas
pruebas de PCR anidada eran capaces de detectar H.
cap-sulatumenmuestrasdetejidohumanofjadoy
embebidoenparafnaconlmitesdedeteccin
similares;sinembargo,laespecifcidadparala
Hc100-PCRfuedel100%,encontrasteconla Tabla 4. Genes blanco y
secuencias de los oligonucletidos utilizados para el diagnstico
molecular de la histoplasmosisGen/Tipo de PCR Sequencia del
PrimerTamao delproducto (bp)Sen/Esp (%) Referencia1. 18S rRNA /PCR
anidada5-GTT AAA AAG CTC GTA GTT G-3 5-TCC CTA GTC GGC ATA GTT
TA-35-GCC GGA CCT TTC CTC CTG GGG AGC-35-CAA GAA TTT CAC CTC TGA
CAG CCG A-342923189/77 672. Protena 100-kDa/PCR anidada 5-GCG TTC
CGA GCC TTC CAC CTC AAC-35-ATG TCC CAT CGG GCG CCG TGT AGT-35- GAG
ATC TAG TCG CGG CCA GGT TCA-35- AGG AGA GAA CTG TAT CGG TGG CTT
G-339121069-100/90-100 67,69,70,793. 100kDa /PCR-EIA5-CGC AGT TTT
CCG TGC AGA A-3 5-CCA CAG CAT CAC GGA GGT ATT-399 7/100 764.
Antgeno M /PCR 5- ACA AGA GAC GAC GGT AGC TTC ACG-35- GCG TTG GGG
ATC AAG CGA TGA GCC-3111 100/100 715. Antgeno M / PCR 5-CGG GCC GCG
TTT AAC AGC GCC-35- ACC AGC GGC CAT AAG GAC GTC-3279 100/100 716.
Antgeno H /PCR - semi-anidada5-GCG GGG TTG GCT CTG CTC T-35-TTG GAA
ACC CCG GGC TTG-35-TCA TAG TAG GCT GTT CAC CCC CG-3330 No reportada
727. ITS-rRNA /PCR anidada*5-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-35-TCC
TCC GCT TST TGS TST GC-3308 100 748. ITS1-rDNA / RT-PCR**5-CCA CCC
TTG TCT ACC-35-GGA ACC AAG AGA TCC GT-3182 78-100/100
75,78*Combinado con: A (5-CAC GCC GTG GGG GGC TGG GAG CCT-3 y 5-CGG
TGT CCC CGG CGG ACA CGG GCC C-3), B (5-GGG CCC GTG TCC GGG GAC ACC
GG-3 y 5-CCC GGA ATA TCC AGG GGG CGC AA-3), y C (5-TGA TTG GCG
TCTGAGCAT G-3 y 5-ATG GTG GGC RGGAGCCGGCC-3).**Combinado con las
sondas FRET: HC1-Fluos 5- GTC GGT GAA CGA TTG GCG T-3 y HC1-Red 5-
LCRED640-GAG CAT GAG AGC GAT AAT AAT CCA GT-3.S154 ASOCIACIN
COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA INFECTIOMuoz C, Cano L, Gonzlez
Apresencia de falsos positivos revelados por la PCR
dirigidaaamplifcarlasecuencia18SdelrRNA
(77%);adems,estapruebadeHc100-PCRfue til para el diagnstico de
histoplasmosis disemi-nada en un paciente con sida (69).
Trabajosrecientementerealizadospornuestro
grupohanpermitidovalidareimplementarla Hc100-PCR para la
identifcacin de H.
capsula-tumendiversosmuestrasclnicasqueincluye-ron especmenes
respiratorios, biopsias y fuidos corporales. Esta prueba molecular
present una sensibilidaddel100%yunaespecifcidaddel 92,4% con
respecto a controles negativos y del
95,2%cuandoseutilizaronmuestraspositivas para otras micosis (70).En
otros estudios se han empleado como genes
blancoaquellosquecodifcanparalosantge-nosHyM,ylosespaciadoresdetranscriptos
internos(ITS-delinglsInternalTranscribed Spacer) de los genes que
codifcan para el RNA ribosomal (rRNA). Estas pruebas fueron
altamen-te sensibles y especfcas para el diagnstico de la
histoplasmosis al compararlas con las tcnicas
tradicionales.Estosugierequeeldiagnstico molecular, utilizando como
blanco los genes an-teriormentemencionados,seradegranayuda para
detectar la infeccin por H. capsulatum de manera rpida y efcaz
(71-74).As mismo, Buitrago y colaboradores (75),
realiza-ronestudiosdereproducibilidad,sensibilidady
especifcidaddeunaqRT-PCRqueamplifcaba
unasecuenciaITSdelosgenesdelrRNAdeH. capsulatum. La tcnica se valid
con 22 muestras provenientesde14pacientesconhistoplasmo-sis,
previamente confrmada por cultivo, examen
histolgicooserologapositiva,incluyendoel cuadro clnico y los
antecedentes epidemiolgi-cos. En este trabajo se encontr un
coefciente de variacin del 3%, en las concentraciones mayores de
DNA empleado (10ng y 200fg), y del 35% en
lasconcentracionesmasbajas(10fga1fg).La sensibilidad y la
especifcidad de la qRT-PCR fue-ron del 78,3% y del 100%,
respectivamente (75).Enlosltimoscincoaos,seencuentranenla
literatura varios reportes que buscan mejorar la
sensibilidad,especifcidad,efcienciayefcacia
delaspruebasmolecularesparaeldiagnstico
delahistoplasmosisendiferentesmuestras
clnicas,principalmenteespecmenesrespirato-rios (LBA, LB y EI),
biopsias y lquidos corporales
(lquidocefalorraqudeo,sangretotal,orina);y tambin se han utilizado
cultivos del hongo para la obtencin del DNA. La mayora de las
pruebas quesevienendesarrollandoyestandarizando
incluyenlasdePCRanidadayPCRentiempo
real,quealcanzanvaloresdesensibilidady
especifcidadqueoscilanentre90%y100%, respectivamente (70,
75-80).Aplicaciones de los mtodos moleculares en la epidemiologa de
la histoplasmosis:Adicionalmente,coneladvenimientodelas
tcnicasmoleculareshasurgidolaepidemio-logamolecular,lacualhapermitidoavances
importantestantoenlalocalizacindenuevas
zonasendmicascomoenelconocimiento
delarelacinpaciente-fuentedeinfeccin.La
aplicacindelastcnicasmoleculareshaposi-bilitado la identifcacin de
distintas fuentes de infeccin y la determinacin de una relacin
ge-notpica entre aislamientos clnicos de pacientes
procedentesdelasdiferentesregiones,loque
hacontribuidoalreconocimientodereas endmicas (13,30,32,43,81).Por
estas tcnicas se ha demostrado que H. cap-sulatum posee de 4 a 7
cromosomas, y que el ta-mao del genoma vara entre 23 y 32 Mb (44).
Por otrolado,anlisisporRFLPdelDNAmitocon-drial y ribosomal, as como
del gen que codifca para una protena especfca de la fase levadura
(yps-3), haba agrupado inicialmente a H. capsu-latum en seis clases
que se correlacionaban con la distribucin geogrfca y la virulencia
del hon-go; interesantemente, aislamientos provenientes
deregionesespecfcasdeAmricadelSurse caracterizaban por producir
lesiones en piel (81). Adicionalmente, se han descrito tres
marcadores multiallicosconlacaractersticadeserhiper-S155 Infectio.
2010; 14(S2): S145-S158Deteccin e identifcacin de Histoplasma
capsulatum por el laboratorio: de los mtodos convencionales a las
pruebas molecularesvariables,altamentepolimrfcosycontener
secuencias altamente repetitivas, adems de ser conservadas
(microsatlites), los que han resul-tado tiles para tipifcar y
determinar niveles de variacingenticadediferentesaislamientos
provenientesderegionesdeEstadosUnidosy otros pases (81).Como se
describi al inicio de esta revisin, has-ta hace poco se tenan
descritas tres variedades
paraH.capsulatum(var.capsulatum,var.du-boisii, y var. farciminosum)
(10); no obstante, a la fecha se han identifcado ocho clados
diferentes, asaber:(i)Norteamericanoclase1;(ii)Norte-americano
clase 2; (iii) Latinoamericano grupo A; (iv) Latinoamericano grupo
B; (v) Australiano; (vi) Pases Bajos (con la controversia si puede
incluir aislamientosdeIndonesia);(vii)Euroasiatico,y (viii)
Africano (14).Conclusiones Debidoalaaltatasademorbi-mortalidadque
presenta la histoplasmosis y al difcil manejo
te-raputico,sehacenecesariodesarrollarnuevas herramientas que
permitan hacer un
diagnsti-comsrpidoyoportuno.Estasnuevasmeto-dologasmolecularesparaeldiagnsticodela
micosis han sido bien descritos y las pruebas son razonablemente
sensibles y especfcas; y estn implementadas en varios laboratorios
del mun-do.EnColombia,elLaboratoriodeMicologa
MdicayExperimentaldelaCorporacinpara
InvestigacionesBiolgicas(CIB)deMedelln,
havenidoimplementandoestasmetodologas enlosltimosaos
(70)yofrecedentrodesu portafoliodeserviciospruebasmoleculares
paraeldiagnsticodestayotrasmicosis.
Adicionalmente,yenconjuntoconlaRedIbe-roamericanadeDiagnsticoMoleculardelas
MicosisEndmicas,OportunistasyEmergentes (Red Micomol), se viene
realizando una serie de talleres cuyo objetivo es tratar de hacer
la trans-ferenciatecnolgicadeestasmetodologasa otros laboratorios
de la ciudad y del pas (http://www.micomol-cyted.org). Por lo
tanto, creemos queenpocosaosestasmetodologaspodrn ser ofrecidas por
otros laboratorios y tener una coberturamsampliayundiagnsticodela
histoplasmosismsoportuno.Noobstante,es
importanteanotarqueelsistemadesaludco-lombiano no incluye este tipo
de metodologas diagnsticasenelPlanObligatoriodeSalud (POS), por lo
que su cobertura es an muy baja en nuestro medio.
Porotrolado,alreconocerlaslimitaciones
presentadasporlastcnicasconvencionales,
queincluyenprincipalmentelavariabilidaden
losvaloresdesensibilidadyespecifcidad,as como el tiempo tan
prolongado requerido para elaislamientodelagenteetiolgioporcultivo
(dos a seis semanas), y en el caso de las pruebas serolgicas el
tiempo que se requiere para que
unindividuoproduzcaanticuerposespecfcos
contraelhongo(dosacuatrosemanas);se
sugiereimplementarestasnuevasalternativas
diagnsticasbasadasenmtodosmoleculares, hecho que quizs permita un
ms rpido y cer-tero diagnstico que, a su vez, lleve a instaurar un
tratamiento oportuno logrando as disminuir las tasas de
morbi-mortalidad que acarrea esta micosis. Es importante anotar que
con la imple-mentacin de estas nuevas metodologas mole-culares no
se pretende reemplazar los mtodos
convencionales.Porelcontrario,setratade
complementaryampliarlabateradepruebas existentes para realizar un
diagnstico ms pre-ciso y
oportuno.Adicionalmente,laimplementacindeestashe-rramientasmolecularespodraserdeutilidaden
estudiosepidemiolgicosyenlacaracterizacin
dezonasendmicas.Enestesentido,estudios
detipifcacinmoleculardeH.capsulatumysu
asociacinconalgunascaractersticasepidemio-lgicasdepacientesconhistoplasmosisseestn
realizando en nuestro
laboratorio.Finalmente,queremossugerirunalgoritmo
diagnstico(fgura2)queleseramuytilal cuerpo mdico para pacientes con
sospecha cl-S156 ASOCIACIN COLOMBIANA DE INFECTOLOGA REVISTA
INFECTIOMuoz C, Cano L, Gonzlez Anica de histoplasmosis, porque le
puede ayudar a defnr las pruebas de laboratorio que le permi-tan
confrmar su impresin diagnstica:1)Defnir si el paciente es un
hospedero normal o con algn tipo de alteracin inmunolgica.2)Si es
un hospedero normal, ser por ende in-munocompetente; por el
contrario, el hospe-dero podra presentar defectos en su sistema
inmune (por ejemplo sida) o defectos
estruc-turales(porejemplocavidadespulmonares, EPOC, etc).3)Defnir
con lo anterior la posible forma clnica de la micosis que presente
el paciente.4)Elegir las pruebas de laboratorio adecuadas, teniendo
en cuenta la sensibilidad para con-frmar el diagnstico.De esta
manera, el mdico podr decidir cual(es) prueba(s) de laboratorio le
ordena al paciente en particular para as poder confrmar la sospecha
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Reyes-MontesM,delValleMB,ZigaG.Geographicaldistributionof
geneticpolymorphismofthepathogenHistoplasmacapsulatum Figura 2.
Algoritmo propuesto para el diagnstico de la
histoplasmosis.Paciente con sospecha clnica de
histoplasmosis:Hospedero NORMAL Hospedero
ANORMALInmuno-competenteDefecto estructuralDefecto inmunePosible
forma clnica de histoplasmosisPulmonar agudaPulmonar crnicaPulmonar
diseminadaPruebas de laboratorio (y su sensibilidad) para confrmar
el diagnstico de acuerdo al tipo de paciente y forma clnica de la
micosisFC 95%ID 95%FC 100%ID 100%PCR 100%Cultivo 50-85%Tinciones
17-40%Antigenuria 15-22%PCR 100%Antigenuria 95%Cultivo 50-85%FC
60-70%ID 58-60%Tinciones 43%1234S157 Infectio. 2010; 14(S2):
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