Monitoreo in-situ y on-line de la actividad metabólica de

levaduras empleando impedancimetría

M L Zamora1,2

and C J Felice1

1 Laboratorio de Medios e Interfase, Departamento de Bioingeniería, INSIBIO-UNT, Av Independencia

1800, San Miguel de Tucumán, CC:4000, Tucumán, Argentina.

Resumen-En este trabajo se monitoreó el consumo de glucosa y sacarosa de levadura comercial

(Saccharomyces cerevisae) usando espectroscopia de impedancia no-lineal. Se utilizó una celda de

medición tripolar con electrodo de trabajo de Au, un contraelectrodo de acero inoxidable y un electrodo

de referencia de Ag/AgCl. Los resultados muestran enormes variaciones en la corriente medida,

incluyendo la fundamental, 2da y 5ta armónica. Los cambios en la corriente fundamental parecen reflejar

la velocidad con que se consume cada azúcar, de una constante de tiempo en el caso de la glucosa, y de

dos constantes de tiempo en la sacarosa. El método desarrollado posee gran potencialidad para el

monitoreo del metabolismo microbiano en fermentadores industriales.2

1. Introducción

En los procesos fermentativos a gran escala es muy importante conocer el estado metabólico de

la levadura. Actualmente se utilizan técnicas de medición de la concentración del producto, la

temperatura, el pH, la concentración del sustrato y de la concentración de levaduras [1].

La espectroscopia dieléctrica no lineal es una técnica macroscópica que se aplica a suspensiones

celulares, y permite monitorear parámetros vinculados al estado metabólico celular. Esta técnica

tuvo como punto de partida el estudio de la interacción de los campos eléctricos con enzimas de

membrana, las cuales representan un sistema no lineal que genera armónicos en la corriente de

polarización de una membrana biológica. Estos armónicos son analizados y la información

biológica es inferida [2,3].

En células eucariotas donde abundan las enzimas de membrana transportadoras (ATPasas),

estas se pueden caracterizar indicando si la enzima tiene sustrato o trabaja en condiciones de

saturación, si metaboliza todo el sustrato o si el medio es viable, y si cambia el carácter no

lineal por agregado de inhibidores [4,5].

En células procariotas donde la cadena respiratoria está en la membrana, se puede medir el

grado de síntesis de ATP y evaluar distintas vías respiratorias, así como el efecto de

bloqueantes de las mismas [6-8]. Esta técnica no necesita cuantificar el sustrato consumido o

producto generado por la enzima para estudiarla. Lo hace en forma directa a través de la

interacción de la enzima con el campo eléctrico externo, independientemente de la cantidad de

sustrato o producto.

A pesar del auge que tuvo, la técnica no prosperó lo suficiente para convertirse en un

procedimiento estándar de monitoreo en bioquímica y la producción científica en el tema ha

disminuido en los últimos años. Los principales obstáculos fueron la falta de comprensión del

fenómeno medido, la instrumentación y el análisis de las señales obtenidas, que influyeron en la

falta de repetibilidad de los resultados.

En trabajos anteriores de nuestro grupo se observaron cambios en el módulo del tercer

armónico de una suspensión de Saccharomyces cerevisiae cuando se añadió glucosa [9]. Sin

embargo es una técnica compleja y no permite monitoreo continua de la corriente. Además este

método no mide la fase u otros armónicos.

En este trabajo presentamos un método sencillo con el cual se pone en evidencia el consumo de

glucosa y sacarosa a través del monitoreo de la corriente, y los cambios producidos en el

módulo y fase, de la fundamental y las primeras 6 armónicas. Los resultados muestran que el

2 E-mail: mzamora@herrera.unt.edu.ar

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

método sirve para reflejar el consumo de azúcares en forma diferenciada, indicando retardos,

velocidad de consumo, fases de consumo y duración de los mismos.

2. Materiales y métodos

Se utilizó Saccharomyces cereviseae en polvo marca Levex. Para preparar la suspensión de

levaduras se suspendió 3,5 g del polvo liofilizado en 75 ml de solución salina de

mantenimiento. Las mediciones se llevaron a cabo en una celda tripolar, con un electrodo de

trabajo de oro, un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un contraelectrodo semiesférico de

acero inoxidable (área = 400 cm2 y volumen = 150 cm3). Todas las mediciones fueron

realizadas a 25º C.

Para las mediciones se empleó un analizador de impedancia Solartron 12508W. Se aplicó un

sobrepotencial sinusoidal de 50 mV con una frecuencia de 700 Hz, y se midieron las

componentes real e imaginaria de la corriente, incluyendo la fundamental hasta el 6to armónico.

El medio con levaduras se dejaba estabilizar 40 minutos a temperatura ambiente, y luego se

inoculaba en un primer caso con glucosa, y en un 2do caso con sacarosa. En ambos casos la

concentración de glucosa en el medio fue de 100 mM.

3. Resultados

Se observaron grandes cambios en corriente tanto en la frecuencia fundamental como en la 5ta

Armónica luego del agregado de glucosa y sacarosa. También hubo cambios similares en la 2da

armónica, pero relativamente pequeños.

Los cambios comienzan a manifestarse 8 minutos después de agregada la glucosa. Estos

desaparecen al cabo de 40 minutos volviendo al valor inicial. En la Figura 1 se observan la

curva temporal porcentual de la corriente, que refleja el consumo de glucosa. Este experimento

se repitió por triplicado y en todos los casos las curvas poseen la misma velocidad en ambas

fases de aumento y disminución.

Figura 1: Variación temporal de corriente de la componente fundamental. La flecha indica el

momento en el cual se añade glucosa.

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

0 20 40 60 80 100 120 140

Co

rrie

nte

(%

)

Tiempo (min)

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

En el otro experimento los cambios también se manifiestan a los 8 minutos de agregada la

sacarosa. Sin embargo, el transcurso temporal de la curva de corriente posee dos fases

claramente diferentes (Figura 2), siendo la primera de mayor velocidad que la segunda. Este

experimento también se realizó por triplicado y en todos los casos se observan las dos fases.

Figura 2: Variación temporal de corriente de la componente fundamental. La flecha indica el

momento en el cual se añade sacarosa

Las Figuras 1 y 2 muestran un cambio en la corriente cuando las levaduras consumen glucosa y

sacarosa respectivamente. Se realizaron tres experimentos para cada azúcar y un posterior test

estadístico no paramétrico (Kruskal-Wallis) con el objeto de determinar si la fase de

disminución de la corriente que se observa a los 8 minutos de agregar el azúcar difiere

significativamente entre los 3 ensayos. En primer lugar se ajustó una función tipo campana a

partir del promedio de los datos experimentales, luego se calcularon los residuos asociados a

cada serie experimental y finalmente se realizó el test con dichos residuos. Dado que el nivel

crítico (0.110) es mayor que 0.05, se infiere que se puede aceptar la hipótesis de igualdad de

medias poblacionales de los residuos y en consecuencia las tres series experimentales

no difieren significativamente entre sí, en el rango estudiado.

Para verificar que los cambios observados se debían a la presencia de la levadura, se realizo un

experimento que consistió en agregar la glucosa a la solución base sin levadura (Figura 3). La

concentración de glucosa en la solución fue la misma que en los experimentos anteriores.

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

0 20 40 60 80 100 120 140

Co

rrie

nte

(%

)

Tiempo (min)

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

Figura 3: Variación temporal de corriente de la componente fundamental. La flecha indica el

momento en el cual se añade glucosa.

Como se observa en la figura no se produce variación al agregarse la glucosa a la solución base

sin la presencia de levaduras, lo cual confirma que el material biológico es el responsable de los

cambios observados en las figuras anteriores. El mismo experimento se repitió utilizando

sacarosa observándose el mismo comportamiento.

Por ultimo, se realizo una medición del consumo de glucosa mediante un kit comercial (Prodigy

Autocode). Las concentraciones de glucosa y de levadura fueron las mismas que las utilizadas

en los experimentos anteriores y los resultados se muestran en la Figura 4.

El valor inicial de glucosa es 100 mM y disminuye hasta a 2 mM aproximadamente. Esta curva

coincide con la primera parte de la curva de consumo glucosa de la Figura 1, en donde también

se observa una rápida caída.

4. Conclusiones y discusión

Los resultados muestran que aparentemente el método permite monitorear el metabolismo de

los azúcares. En el caso de un azúcar simple como la glucosa, la curva temporal corresponde a

un sistema de una constante de tiempo. En el caso de la sacarosa, donde la levadura debe

descomponerla en glucosa y fructosa, las curvas temporales de corriente muestran la

superposición de dos sistemas metabólicos, permitiendo un análisis más detallado con una

tecnología muy simple.

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

0 20 40 60 80 100

Co

rrie

nte

(%)

Tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Glu

cosa

(m

M)

Tiempo (min)

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

En este trabajo se logro obtener un método para medir el consumo de glucosa por parte de

Saccharomyces cerevisae, empleando mediciones de impedancia a una frecuencia única. La

técnica se comparo con un kit comercial de consumo de glucosa, con el que se obtuvo una

curva similar a las obtenidas en las mediciones de impedancia. En este trabajo se propone un

método simple y representativo del fenómeno estudiado, el cual permite obtener resultados

fácilmente repetibles.

5. Referencias

[1]. Madrid R E and Felice C J 2005 Crit. Rev. in Biotechnology 25 1-16

[2]. Victor J and Shapley R 1980 A method of nonlinear analysis in the frequency domain

Biophys. J 29 3 459-83

[3]. Tsong R and Astumian R D 1987 Electroconformational coupling and membrane

protein function Progress in Biophysics and Molecular Biology 50 1 1-45

[4]. Woodward A M and Kell D B 1990 On the nonlinear dielectric properties of biological

systems:Saccharomyces cerevisiae Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 24 2 83-

100

[5]. Woodward A M and Kell D B 1991 Confirmation by using mutant strains that the

membrane-bound H+-ATPase is the major source of non-linear dielectricity in

Saccharomyces cerevisiae," FEMS Microbiology Letters, vol. 84, no. 1:91-95.

[6]. A. M. Woodward and D. B. Kell, (1991) "Dual-frequency excitation: a novel method

for probing the nonlinear dielectric properties of biological systems, and its application

to suspensions of S. cerevisiae," Journal of Electroanalytical Chemistry, vol. 320, no.

3:395 413.

[7]. A. M. Woodward and D. B. Kell, (1995) "On harmonic generation in nonlinear

biological systems," Biosensors and Bioelectronics, vol. 10, no. 6-7:639-641.

[8]. A. M. Woodward, A. Jones, X. z. Zhang, J. Rowland, and D. B. Kell, (1996) "Rapid

and non-invasive quantification of metabolic substrates in biological cell suspensions

using non-linear dielectric spectroscopy with multivariate calibration and artificial

neural networks. Principles and applications," Bioelectrochemistry and Bioenergetics,

vol. 40, no. 2:99-132.

[9]. E F Treo, C J Felice Non-linear dielectric spectroscopy of microbiological suspensions

BioMedical Engineering OnLine 2009, 8:19.

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011